UNIVERSITE MOHAMMED V - AGDAL

FACULTE DES SCIENCES – RABAT

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire

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Université Mohammed V - Agdal • Faculté des Sciences B.P. 1014 - Rabat -MAROC

Filière SVI - Semestre 5

Module de Biologie Moléculaire

Polycopié de Travaux pratiques

Biologie Moléculaire

Extraction et digestion de plasmides

D’Escherichia coli

Pr. Leila MEDRAOUI

Pr. Laila SBABOU
Pr. Bouchra BELKADI

Année Universitaire : 2022 – 2023

Polycopié de Biologie Moléculaire SVI S5
I- Généralités
Les études de biologie moléculaire sont le plus souvent anticipées par des techniques de base.
Les principales techniques utilisées couramment sont :
- Les extractions des acides nucléiques
- Les digestions enzymatiques par les enzymes de restriction
- Les électrophorèses sur gel

I-1- Extraction d’ADN

L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières étapes dans la plupart
des études de biologie moléculaire.
L’extraction d’ADN est une technique expérimentale permettant d’isoler l’ADN de cellules
ou de tissus. L’ADN ainsi extrait peut être utilisé pour des expériences de biologie
moléculaire, telles que la PCR, le séquençage ou le clonage.
Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction d’ADN, le choix de la
technique la plus adéquate repose généralement sur un certain nombre de critères tels que :
l’ADN cible, le matériel de départ (bactérien, végétal ou animal), l’application en aval (PCR,
clonage…). Néanmoins, ces différentes méthodes d’extraction d’ADN suivent
approximativement le même schéma de principe :
- La lyse cellulaire : consistant éventuellement en une rupture mécanique (broyage ou
lyse hypotonique) suivie d’un traitement chimique (lyse par des détergents qui vont
disperser les bicouches lipidiques des membranes et dénaturer les protéines).
- L’élimination des protéines et des autres acides nucléiques (ARN…) : le procédé
classique est l’utilisation de couple phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent
agent dénaturant des protéines, il permet de séparer efficacement les protéines et les
acides nucléiques. Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non
miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par
centrifugation. Seule la phase aqueuse qui contient les acides nucléiques sera
récupérée.
- La précipitation de l’ADN par l’alcool : les acides nucléiques peuvent être finalement
récupérés sous forme de culot solide obtenu après précipitation par centrifugation de la
phase aqueuse additionnée d’éthanol ou d’isopropanol. L’ADN est suspendu et
conservé dans un tampon d’hydratation (le plus souvent du Tris EDTA).

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Différentes variantes sont utilisées suivant que l’on cherche à extraire l’ADN génomique (issu
du ou des chromosomes des cellules analysées) ou de l’ADN plasmidique (provenant de
plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes).

I-2- Digestion enzymatique

Une endonucléase de restriction est une enzyme qui coupe un fragment d'ADN au niveau
d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Elle permet de
fragmenter l'ADN en segments de taille réduite ou de le couper à tel ou tel site désiré. Chaque
enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique.
Les enzymes de restriction sont utilisées pour établir une carte de restriction de toute molécule
d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction
le long de cette molécule. La "digestion enzymatique" de l’ADN par de telles endonucléases
produit différents fragments dont la taille est déterminée par électrophorèse. L’agencement de
tels fragments permet d’établir la carte de restriction.

I-3- Electrophorèse des acides nucléiques

L’électrophorèse est une technique qui permet de séparer des molécules dans un gel donné en
fonction de leur taille et de leur conformation (linéaire, CCC, OC) sous l’effet d’un champ
électrique (les acides nucléiques sont chargés négativement). Cette technique peut être utilisée
pour séparer des molécules d’ADN ou d’ARN en utilisant un gel d’agarose (un polymère de
sucres ou polysaccharide, à base d’agar purifié) ou de polyacrylamide (le choix du gel et de sa
concentration dépend de la taille des molécules à séparer)
Dans un gel d’agarose la séparation des ADN s’effectue à travers la matrice et dépendent de :
(i) la taille du fragment: les molécules de plus petite taille se déplacent plus
rapidement et migrent plus loin que les molécules de taille supérieure,
(ii) de la conformation : les molécules plasmidiques circulaires covalemment
fermées (CCC) migrent plus loin que les molécules linéaires qui à leur tour
migrent plu loin que les molécules circulaires ouvertes (OC).
La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse est effectuée en
faisant migrer des marqueurs de poids moléculaire en parallèle avec les échantillons à
analyser. Le choix des marqueurs adéquats est important.
Les applications de l’électrophorèse sur gel d’agarose sont multiples. Elle permet de
déterminer la taille de fragments d’ADN après une digestion par des enzymes de restriction et
donc de dresser la carte de restriction d’une molécule d’ADN, ou encore d’analyser un ADN

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après une amplification par PCR, ou de mettre en évidence la présence de molécules
plasmidiques, etc.…
La détection ou la révélation de l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux
rayons UV après coloration au bromure d’éthidium (BET).
L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20-
25 kb (20000-25000 pb). Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires
de bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

II- Objectifs du TP

Ce TP a essentiellement pour buts de se familiariser avec les techniques de base de la biologie

moléculaire suivantes :
- L’extraction d’ADN à partir de bactéries par une technique simple et rapide,
- L’électrophorèse sur gel d’agarose,
- L’analyse du contenu plasmidique d’une bactérie.
Le TP comprend 3 séances :
Séance I : Extraction d’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne d’E. coli
simple et E. coli pUC18
Ainsi à partir d’une culture bactérienne d’E. coli, une mini-extraction d’ADN plasmidique
sera effectuée en utilisant la méthode de la lyse alcaline. Cette technique permet de récupérer
une grande quantité d’ADN plasmidique peu contaminé par de l’ADN génomique, des
protéines ou d’autres composants bactériens.
Séance II : Digestion des ADN extraits par des enzymes de restriction et migration sur
gel d’agarose
L’ADN plasmidique obtenu est suffisamment pur pour être digéré par des enzymes de
restriction qui réalisent des coupures de l’ADN au niveau des séquences qui leur sont
spécifiques.
L’ADN issu des différents traitements enzymatiques sera soumis à une électrophorèse sur gel
d’agarose, ce qui permettra d’évaluer la taille des plasmides étudiés et de confirmer ou
d’infirmer la présence d’inserts dans les plasmides.
Séance III : Analyse du contenu plasmidique

Après digestion enzymatique des ADN plasmidiques extraits et migration sur gel d’agarose,
l’analyse des plasmides sera réalisée en termes de types, formes et tailles de plasmides.

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III- PARTIE PRATIQUE
III- 1. Matériels et solutions
- Matériel biologique :
• Deux cultures bactériennes d’E. coli
- E. coli hébergeant le plasmide pUC 18
- E. coli ne contenant aucun plasmide.
• Un plasmide natif pur pUC18

- Réactifs et solutions :

- Milieu LB liquide
- Solution 1 (2ml) : Tris-HCL 50mM pH 8, EDTA 10 mM
- Solution 2 (2ml) : NaOH 0.2 M, SDS 1%
- Solution 3 (2ml) : Acétate de potassium 3 M pH 5.5
- Isopropanol (5ml)
- Ethanol 70% (v/v) (5ml)
- Enzymes de restriction: EcoR I (10 U/µl), Hind III (10 U/µl)
- RNAase A à 20 mg/ml (2µl)
- Tampon de charge
- TBE 1X : (Tris borate 8.9m M, EDTA 0.2 mM)
- TE (Tris 10mM, EDTA 1mM)
- Solution de Bromure d’Ethidium (Bet) pour la révélation.

III- 2. Lyse des bactéries et extraction des plasmides

Le milieu de culture est d’abord éliminé par centrifugation. Le culot de bactéries est ensuite
suspendu dans la solution I, qui contient du Tris et de l’EDTA. L’EDTA chélate les cations
métalliques divalents ce qui déstabilise la membrane bactérienne et inactive les DNAases.
Les bactéries sont ensuite lysées dans la solution 2. Cette solution contient de la soude
(NAOH 0.2 M) ainsi que du SDS, qui est un détergent. Les parois bactériennes sont
fragilisées à pH basique. De plus, à pH basique, les deux brins de l’ADN se séparent. Le
chromosome bactérien très fragile, se casse en grands fragments, mais les deux brins des
plasmides, beaucoup plus petit, restent circulaires et donc demeurent associés.
La solution 3, constituée d’acétate de potassium (3M) à pH 5.5 permet aux brins d’ADN de se
ré-apparier de façon complémentaire. L’ADN plasmidique se renature très vite car les brins
n’avaient pas pu se séparer l’un de l’autre et reste en solution. Alors que la renaturation de
l’ADN génomique nécessite plus de temps et finalement ne peut avoir lieu car ses fragments
d’ADN simple brin précipitent sous l’effet de la forte concentration en sels. Le SDS, est lui
aussi éliminé par précipitation.

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L’ADN plasmidique est finalement précipité par addition d’isopropanol ou d’éthanol. Ces
alcools mobilisent l’eau du milieu ce qui diminue la solubilité de l’ADN. Les charges
négatives portées par les phosphates de l’ADN sont neutralisées par les ions potassium
ajoutés lors de l’extraction.

Protocole expérimental
Récupération et lavage des cellules :

- Transvaser 1.5 ml de suspension bactérienne (culture de 24h) dans un microtube stérile

(Tube Eppendorff)
- Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes
- Eliminer le surnageant
- Ajouter 1.5 ml de suspension bactérienne
- Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes
- Eliminer le surnageant
- Remettre le culot en suspension dans 300 µl de solution 1
Lyse des cellules :

Ajouter 300 µl de solution 2 préparée extemporanément

Laisser agir 5 minutes au plus. La solution devient très visqueuse.

Purification de l’ADN plasmidique :

- Ajouter 300 µl de solution 3 pour réaliser la précipitation de l’ADN chromosomique

dénaturé par la soude et des protéines complexées par le SDS (détergent)
- Mélanger par retournements successifs, délicatement, 6 à 10 fois. Observez la
précipitation des débris bactériens et de l’ADN chromosomique.
- Placer les tubes dans la glace pendant 10 minutes
- Centrifuger 10 minutes à 12 000 g à température ambiante
- Récupérer le surnageant dans 2 nouveaux microtubes : noter le volume v (=450 µl)
- Ajouter 2v d’éthanol absolu à –20°C (900 µl) et placer à –20°C pendant 30 minutes
pour précipiter l’ADN plasmidique
- Centrifuger 15 minutes à 12 000 g et à 4°C
- Eliminer le surnageant
- Ajouter 500 µl d’éthanol à 75% pour rincer le culot par inversion
- Centrifuger 5 minutes à 12 000 g et à 4°C
- Eliminer le surnageant en veillant à ce que le culot reste collé au fond du tube
- Sécher le culot quelques minutes à 37°C pour éliminer l’éthanol
- Remettre le culot en suspension dans 10 µl de TE stérile pH 8 et garder à 4°C.
- Bien suspendre le culot d’ADN dans le TE en tapotant le microtube jusqu’à dissolution
complète du culot.
Récupérer les contenus des deux microtubes dans un seul microtube pour avoir 20 µl de
solution d’ADN.

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III-3 Digestion des ADN plasmidiques

Action de la RNAase et des enzymes de restriction : vous disposez de 2 enzymes de

restriction à 10 U/µl et de la RNAase A à 20mg/µl.
Préparer 6 microtubes / binôme et ajouter dans l’ordre les volumes (en µl) suivants :

Microtubes
Réactifs en µl Effet RNAase EcoR 1 Hind III
C1 T1 C2 T2 C3 T3
Tampon 10X _ - - 2 0 2
ADN 10 10 10 10 10 10
ARNase - 2 2 2 2 2
EcoRI - - - 1 - -
Hind III - - - - - 1
H2O stérile 10 8 8 5 8 5
C= Contrôle non digéré ; T= Test avec l’action de l’enzyme de digestion

- Mélanger brièvement et centrifuger à 4000 g pendant quelques secondes pour collecter le

liquide au fond des tubes.
- Placer à l’incubation pendant 1 H à 37°C.

Attention ! Les enzymes de restriction sont fragiles et coûtent très cher. Pour les préserver au
maximum, elles sont conservées à -20°C et manipulées dans la glace. Elles sont ensuite
immédiatement replacées au congélateur.

III-4 Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose

Préparation du support de migration (gel d’agarose) :

- Dans un bécher, préparer de l’agarose à 1% (1g / 100 ml) dans du tampon de migration
(TBE 1x) ;
- Placer au four à micro-ondes jusqu’à ébullition et obtention d’une phase homogène
(limpide)
- Laisser refroidir jusqu’à ce qu’il soit possible de tenir le bécher dans la main et
l’agarose encore liquide (environ 50°C),
- Placer les « peignes » dans les supports de gel. Veiller à ce que les puits ne perforent
pas complètement le gel. Couler l’agarose toujours liquide sur le support horizontal ;
- Laisser refroidir et polymériser, prise du gel
- Retirer les peignes délicatement
Préparation des échantillons à faire migrer :
Les échantillons d’ADN doivent être mélangés avec un tampon de charge avant de les
déposer dans les puits d’agarose pour la migration par électrophorèse.

- Pour chaque échantillon d’ADN plasmidique (contrôle ou test) ajouter le tampon de

charge (concentré 5X).

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 - Pour les 20 µl d’échantillon d’ADN, ajouter 5 µl de Tampon de charge.
- Marqueur de taille de poids moléculaire : 5 µl Marqueurs + 1,25 µl de tampon de
charge.

Remarque : Certains composants du tampon de charge comme le glycérol, le ficoll ou le

saccharose, ont la propriété d’augmenter la densité de la solution d’ADN et lui
permettent de rester dans les puits. Le tampon de charge utilisé contient deux colorants :
- Un colorant bleu de bromophénol qui migre avec les fragments de 3 à 5 Kb de taille.
- Un colorant jaune qui migre plus rapidement que les fragments de tailles inférieures à
50pb.

Dépôts et migration :
- Remplir la cuve d’électrophorèse avec du tampon TBE 1X
- Immerger le gel et son support dans la cuve, les extrémités sans bordure (et les puits)
face aux électrodes. Veuillez à ce que les puits soient du côté du pôle négatif.
- Déposer directement la totalité des échantillons préparés dans les puits, en y insérant
très délicatement la pointe de la pipette automatique.
- Déposer le marqueur de taille moléculaire. Faire migrer le gel en appliquant 100 V
pendant environ 1H30 à 2H.

Visualisation :

Enlever le gel du support et le mettre dans un bain de bromure d’éthidium (BET)

pendant 5 min puis rincer dans un bain d’eau. Le BET est un intercalant à fluorescence
rouge-orange quand il est soumis à des rayons ultraviolets. Sa fluorescence est
augmentée lorsqu’il est lié à de l’ADN double-brin, c’est pourquoi on l’utilise de façon
courante pour visualiser le résultat d’une électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose.
Placer le gel sur la plaque UV.
Prendre une photo avec une caméra et sauvegarder l’image dans l’ordinateur lié à la
caméra.

ATTENTION :

1) Le bromure d’éthidium se liant à l’ADN est hautement mutagène et donc

cancérigène, par contact seulement : il est donc absolument INTERDIT de
manipuler sans gants.

2) Les UV peuvent causer de très graves brûlures aux yeux notamment, ils sont
également mutagènes et donc potentiellement cancérigènes du fait de leur
absorption par l’ADN et des modifications qu’ils peuvent lui causer. Ils sont par
contre très peu pénétrants et sont arrêtés par le verre, le plexiglas, l’eau, etc. Il est
donc OBLIGATOIRE de fermer la plaque de protection de la table à UV et
d’utiliser des gants pour manipuler les gels.

Exploitation des résultats :

- Annoter les échantillons analysés et discuter leur conformation,

- Tracer la courbe de distance de migration en fonction du log10 du poids moléculaire
de l’ADN,
- Déterminer la taille des bandes obtenues,
- Donner la carte de restriction du plasmide testé.
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IV- Exercice d’application :

1- Faire une interprétation globale de la figure 1.

Figure 1 : Electrophorèse des ADN extraits sur gel d’agarose 1%

pendant 3h à 150 V.

2- Tracer sur papier semi-logarithmique le graphe D = log PM

3- Déterminer la taille en pb du plasmide étudié.
4- Déterminer la taille des fragments du plasmide révélés au puits 3
5- Déterminer le nombre de sites de restriction Hind III portés par l’ADN plasmidique.

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Exemple de courbe étalon du Log10 du PM des bandes en fonction de la distance parcourue.

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V- Annexe :

Figure 2 : Carte de restriction du pUC18

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