République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Faculté des Sciences

Département de Biologie
Laboratoire de Microbiologie Appliquée

THÈSE DE DOCTORAT
Présenté par : Mami Anas
Pour L’obtention du Diplôme de Doctorat
Spécialité : Microbiologie Appliquée

Recherche des bactéries lactiques productrices de bactériocines à large

spectre d’action vis-à-vis des germes impliqués dans les toxi-infections
alimentaires en Algérie

Devant les membres du jury:

Président : Mr. SENHADJI R. Professeur Univ. Oran

Directeur : Mr. KIHAL M. Professeur Univ. Oran
Examinateur : Mr. HENNI J.E Professeur Univ. Oran
Mr. MOUSSA BOUDJAMAA B. Professeur Univ. Tlemcen
Mr. ABBOUNI B. Professeur Univ. S. B. A.
Mr. KERFOUF A. Professeur Univ. S. B. A.

2012/2013
 Louanges à Allah, seigneur de l’univers ; Que les salutations d’Allah soient
sur son messager qu’il a envoyé en qualité de miséricorde universelle, ainsi
que sur ses compagnons et ses frères jusqu’à la résurrection.

Dédicace
Je dédie ce travail À la mémoire de mes très chers grands parents qui aurait été fière de ma
réussite. (Lah yerhamhoume inchalah).

A mes parent qui ont été toujours à mes cotés pour me soutenir et me donner le courage pour
terminer mes études.
Merci beaucoup Papa et Maman je vous aime beaucoup.
Lah ykalikoume liya.

A mes frères Mohammed amine qui m’a beaucoup aidé dans la vie et ma soutenue, a Mounir et
au benjamin Yassine.

A toute la famille Mami, Ouali-Chaouche et sans oublié la famille Guezza.

Un merci particulier a Nawal qui est toujours la dans le meilleure et le pire (merci nawel).

A tous mes amis Farid Bennabi, Mimoun Merabet, Ali Azouz, Ali Kheraze, Fethi,
Fethi la couleur, Mohammed, Tarik, Nesredinne et Benmerine et tous mes autres amis.

A Mr. Hadaji Miloud, Mr. Guessas Bettache et Mr. Sahraoui Toufik de m’avoir apporté tout
L’aide possible pendant toute la durée de mon travail.

Je ne peux oublier la famille Saidi en particulier mes beau parent, et leur enfant Ilhem, Hafsa et
Abdelmalek.

Le plus Grand merci Dédicace à une personne Chère à mon cœur ma Femme "Soumia" qui m’a
beaucoup soutenue et ca depuis mon magister Merci et mille Merci.
La cerise sur le Gâteau C’est la personne qui a donné un sens à ma vie et qui illumine de tous
sont éclat ma vie ma petite et très chère fille Nihel Serine.

Enfin A mon très cher pays «L’Algérie», j’espère pouvoir être à la hauteur pour lui rendre tous
ce qu’il m’a donnés et plus. Inchalah
 Au terme de ce travail je remercie
Monsieur KIHAL Mebrouk, Professeur et Directeur du Laboratoire de Microbiologie
Appliquée de la Faculté des Sciences à l’université d’Oran. Quoique je dise, les mots ne
sauraient exprimer ma profonde gratitude pour avoir dirigé cette thèse et pour m'avoir encadré
pendant mes études supérieures. Ses encouragements et sa patience m’ont beaucoup aidé à
surmonter toutes les difficultés. Je le remercie vivement d’avoir suivi et orienter ce travail.

Monsieur SENHADJI Rachid, Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université

d’Oran, pour ses encouragements, ses remarques précieuses et d’avoir accepté de présider ce
jury, qu’il trouve ici l’expression de mes meilleures considérations.

Monsieur HENNI Djamel Eddine, Professeur en phytopathologie au Département de

Biologie, Faculté des Sciences de l’Université d’Oran, pour sa disponibilité, ses encouragements
et pour avoir accepté de juger cette thèse.

Monsieur MOUSSA Boudjamaa Boumediene, Professeur en microbiologie à l’Université

Abou Bakr Belkaid de Tlemcen pour sa disponibilité, sa gentillesse et d’avoir accepté de juger
cette thèse.

Monsieur ABBOUNI Bouziane, Professeur à l’Université Djilali Liabes de Sidi Bel-

Abbés, pour sa fraternité, sa disponibilité et pour avoir accepté de juger cette thèse.

Monsieur KERFOUF Ahmed, Professeur à l’Université Djilali Liabes de Sidi Bel-Abbés,

pour sa fraternité, sa disponibilité et pour avoir accepté de juger cette thèse.

Tous mes collègues de l’université d’Oran, en particulier le personnel du Département de

Biologie. Et mes collègues chercheurs du Laboratoire de Microbiologie Appliquée de
l’université d’Oran.

Je remercie beaucoup Mes parents pour leur aide, compréhension, soutien moral,
encouragements et surtout leur patience pour la réalisation de ce modeste travail.

Je remercie l'équipe du Laboratoire centrale du CHU d’ORAN, en particulier chef service

du Laboratoire centrale Madame Belkoucha de m’avoir apporté tout L’aide possible pour
arriver à ses résultats satisfaisants.
 Liste des Figures

N° Titre Page
1 Morphologie de la race de chèvre Arabia. 8
2 Morphologie de la race de chèvre Makatia. 9
3 Morphologie de la race de chèvre Kabyle. 9
4 Morphologie de la race de chèvre du M’zab. 9
5 Différente forme microscopique de bactéries lactiques obtenues au laboratoire de 15
microbiologie appliquée de l'université d'Oran.
6 Aspect morphologique de Lactobacillus acidophilus (A), Lactobacillus helveticus (B) et 26
Lactobacillus casei (C) observées au microscope électronique (G×6000).
7 Voie de biosynthèse de la reutérine. 34
8 Aspect morphologique de la souche de Staphylococcus aureus observée au microscope 39
électronique.
9 Escherichia coli observés au microscope électronique (Gx10000). 39
10 Observation au microscope électronique de Salmonella typhi et Salmonella infantis 40
(Gx10000).
11 Modèle d'interaction pour la bactériocine de la classe IIa avec la membrane des cellules 52
ciblent. (a) structure de la bactériocine. (b) positionnement de la bactériocine par des
récepteurs (présumée) de reconnaissance, interactions électrostatiques et hydrophobes.
(c) attachement de la bactériocine avec le site cible. (d) l'agrégation et la formation des
pores hydrophobes.
12 Structure de la nisine A et de la nisine Z. 55
13 Modèle de formation d’un pore transmembranaire par la nisine. 57
14 Prélèvement des échantillons du lait à partir des chèvres de la race Arabia de la ville Es- 59
Senia de la région d'Oran.
15 Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées. 61
16 Indique le schéma général de différentiation des genres appartenant aux bactéries 64
lactiques.
17 Schéma général dichotomique d’identification rapide des streptobacilles. 64
18 Indique le schéma d’identification dichotomique rapide pour lactobacilles 65
hétérofermentatif.
19 Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances antimicrobienne. (a) 68
méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits.
20 Montre les Instruments pour la mesure de l’acidité dornic titrable. 71
21 Résume les différentes étapes de la cinétique d’acidification et de croissance au dépend 72
du temps.
22 Aspect lenticulaires de couleur blanche des colonies des bactéries lactiques sur milieu 77
MRS solide après incubation à 30°C pendant 24 h.
23 Aspect microaérophiles des cultures pures des bactéries lactiques sur milieu MRS liquide 77
après incubation à 30°C pendant 24h.
24 Aspect morphologique cellulaire des cultures pures des isolats (Lb.58 et Lb.68) 78
appartenant au genre Lactobacillus.
25 Le test du type fermentaire des différentes souches de Lactobacillus sp. sur milieu MRS 79
glucose contenant une cloche de Durham, Le témoin négatif milieu MRS stérile (tube1)
et le témoin positif (dégagement du gaz) culture de Leuconostoc mesenteroides (tube 7).
26 Profil fermentaire des sucres de la souche (A) Lb.58 et (B) Lb.68, le virage de 81
l’indicateur de pH au jaune indique une réaction positive.
27 Les interactions entre les isolats des bactéries lactiques du genre Lactobacillus 86
(SoucheLb.58 et Lb.68) sur milieu solide tamponné (la zone claire autour des colonies
indique une inhibition de la souche test.
28 L'action des enzymes protéolytiques et le traitement thermique sur l'apparition des zones 89
d'inhibition en présence de Staphylococcus aureus (1: α-chymotrypsine; 2: Substance de
la Souches; 3: Traitement thermique 100°C; 4: Trypsine).
29 Matrice de similitude entre les cinq souches lactiques étudiées. 93
30 Représentation graphique du coefficient SSM entre les cinq souches lactiques. 93
31 Test de fermentation des hydrates de carbone sur galerie API 50 CHL des souches Lb.58 94
et Lb.68.
32 Résultats des tests technologiques des cinq souches de Lactobacillus. 95
33 L'activité antimicrobienne vis-à-vis de Staphylococcus aureus ATCC 25923 par 96
l'apparition des zones claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A
et en milieu tamponné B.
34 Illustre l'activité antimicrobienne vis-à-vis Escherichia coli ATCC 25922 par l'apparition 96
des zones claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A et en milieu
tamponné B.
35 Illustre l'activité antimicrobienne vis-à-vis de Bacillus sp. Par l'apparition des zones 97
claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A et en milieu tamponné
B.
36 Variations de l'acidité et du pH en fonction du temps et différentes températures de Lb. 103
plantarum (Lb.58).
37 Dénombrement des colonies de Lactobacillus plantarum sur milieu MRS solide après 105
incubation à 30°C pendant 24h.
38 Effet de la température d’incubation sur la croissance de Lactobacillus plantarum en 107
milieu MRS.
39 Changement de la vitesse de croissance () de Lactobacillus plantarum et le temps de 107
génération (▲) en fonction de la température d’incubation.
40 Résultats de la mesure de cinétique de croissance DO et l'évolution du pH de Lb. 108
plantarum incubée à 20°C.
41 Résultats de la mesure de cinétique de croissance (DO) et l'évolution du pH de Lb. 109
plantarum (Lb.58) incubée à 30°C.
42 Résultats de la mesure de cinétique de croissance (DO) et l'évolution du pH de Lb. 110
plantarum (Lb.58) incubée à 37°C.
43 Résultats de la mesure de cinétique de croissance (DO) et l'évolution du pH de Lb. 111
plantarum (Lb.58) incubée à 44°C.
44 Evolution de la cinétique de croissance et d'acidité de Lb. plantarum (Lb.58) dans un 113
milieu MRS modifié (+Maltose et mannose), En fonction du temps et des températures.
45 Evolution du pH du milieu de croissance de Lactobacillus plantarum en présence de la 115
glycine et l’as arginine comme source d’acide aminé dans le milieu MRS, incubé à quatre
différentes températures 20°C, 30°C, 37°C et à 44°C.
46 Croissance de Lactobacillus plantarum en présence de la glycine et l’as arginine comme 115
source d’acide aminé dans le milieu MRS, incubé à quatre différentes températures
20°C, 30°C, 37°C et à 44°C.
47 Evolution du dénombrement en fonction du temps pour culture pure et mixte de la 117
souche inhibitrice Lb. plantarum et Staphylococcus aureus.
48 Evolution du Staphylococcus aureus (souche test) et Lb. plantarum (souches inhibitrices) 118
en culture pure.
49 Evolution du Staphylococcus aureus (souche test) avec Lb. plantarum (souches 118
inhibitrices) en culture mixte.
50 Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum chauffé à 100°C pendant 10 min sur la croissance 119
de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a différentes dilutions.
51 Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum sur la croissance de Staphylococcus aureus a 119
différentes dilutions.
52 Quelques résultats du test de l’étude de la sensibilité des souches Lactobacillus aux 121
antibiotiques.
 Liste des tableaux
N° Titre Page
1 Composants des laits de différentes espèces. 4
2 Composition en acides aminés des protéines du lait de chèvre. 5
3 Composition en lipides des laits de différentes espèces. 5
4 Composition moyenne du lait en éléments minéraux majeurs de différentes espèces. 6
5 Composition moyenne du lait en principaux oligo-éléments indispensables aux 6
différentes espèces.
6 Composition vitaminique du lait de différentes espèces. 6
7 Concentration en nucléotides du lait de différentes espèces en µmol/100ml. 7
8 Les souches lactiques de la race Arabia. 10
9 Les souches lactiques de la race kabyle. 10
10 Rôle de quelques espèces de Lactobacillus utilisés en industrie. 19
11 Critères technologiques de sélection des bactéries lactiques fournis par les fiches 19
techniques.
12 Principales utilisations des bactéries lactiques en agro-alimentaires. 21
13 Classification des lactobacilles. 25
14 Principales espèces et sous espèces de lactobacilles utilisées en industrie laitière. Lb. : 26
Lactobacillus.
15 Caractéristiques physiologiques de quelques espèces de Lactobacillus utilisés en 26
industrie.
16 Critères différentiels des trois groupes de Lactobacillus. 26
17 Utilisations commerciales et effets bénéfiques de quelques souches de Lactobacillus 28
probiotique.
18 Composés antimicrobiens (LMM) produits par les bactéries lactiques. 36
19 La microflore du lait cru de vache. 38
20 Aliments suspectés et agents responsables. 41
21 Caractères bactériologiques de Bacillus cereus. 41
22 les classes des bactériocines produites par les bactéries lactiques. 49
23 Exemples des bactériocines produites par Lactobacillus plantarum. 50
24 Les principales bactériocines produites par certaines espèces de bactéries lactiques 53
letterature.
25 Agent antimicrobien utilisés dans ce test. 74
26 Critères morphologiques, le gram et le test de la catalase des huit isolats présumés des 78
bactéries lactiques isolées de lait cru de chèvre.
27 Résultats du test du type fermentaire sur milieu glucosé et sur milieu gluconate pour 79
déterminer les souches hétérofermentaires facultatives.
28 Représente les résultats du test de l’arginine déshydrogénase (ADH) des isolats retenus. 80
29 Croissance à différentes températures et la thermorésistance des isolats retenus. 80
30 Profil fermentaire des sucres par les huit isolats de Lactobacillus sp. 81
31 Résultats de l’identification des espèces. 83
32 Les interactions entre les différentes souches retenues, les souches ensemencées en 86
touches sont des bactéries (en colonnes), les souches test (bactéries lactiques) sont
ensemencées en surfaces, le diamètre de la zone d'inhibition est mesuré en (mm) dans le
milieu de culture (milieu tamponné).
33 La production de peroxyde d'hydrogène par les différentes souches retenues. 87
34 Révèle l'action des enzymes protéolytiques et le traitement thermique sur l'activité 88
antimicrobienne des extraits bruts sur la croissance de Staphylococcus aureus.
35 Utilisation des hydrates de carbone par les souches dans une API 50 CH. 92
36 Résultats des tests technologiques des cinq souches de Latobacillus thermorésistance, 96
production d’acetoïne et de dextrane, utilisation du citrate et l'hydrolyse de la caséine du
lait.
37 Résultats des interactions entre les souches de bactéries lactiques et les souches 97
pathogènes, En mesurant le diamètre de la zone d’inhibition en mm (A: Milieu non
tamponné; B: Milieu tamponné).
38 Résultats des tests d’interaction sur milieu MRS pH 6,2 (A) et MRS tamponné (B) 98
(en mm).
39 Les variations de l'acidité et pH en fonction du temps et températures en milieu lait 102
écrémé.
40 Le dénombrement en log (UFC/ml) chez Lactobacillus plantarum en fonction du 105
temps et de la température.
41 Le taux de de croissance (µ) et le temps de génération (G) chez Lactobacillus 106
plantarum a différentes températures d’incubation.
42 Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum incubée à 20°C. 108
43 Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58) incubée 109
à 30°C.
44 Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58) incubée 110
à 37°C.
45 Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58) incubée 111
à 44°C.
46 Evolution de la cinétique de croissance et d'acidité de Lb. plantarum (Lb.58) dans un 113
milieu MRS modifié, En fonction du temps et des températures.
47 Les variations de la densité optiques et le pH de Lb. plantarum (Lb.58) dans un milieu 114
modifié en acides Aminés.
48 Cinétique de croissance, d’acidification et de production d’acide lactique dans le lait 117
écrémé à 37°C, en culture seule et en culture mixte des souches Lactobacillus
plantarum (Lb.58) et Staphylococcus aureus ATCC 25923.
49 Révèle le (µ) et le temps de génération (G) pour les souches en culture pure et en 118
culture mixtes avec la souche de Staphylococcus aureus.
50 Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) sur la croissance de Staphylococcus 119
aureus.
51 le taux de mortalité en pourcentage de Staphylococcus aureus traité avec l’extrait brut 120
de la souche Lb. plantarum (Lb.58).
52 Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques des lactobacilles étudiés. 122
 Résumé
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs
dans les aliments fermentés. Ces bactéries ont un rôle dans la préservation des aliments, la
prévention d’empoisonnement, l’augmentation de la valeur nutritive et l’amélioration de la
qualité organoleptique des aliments. Les espèces de bactéries lactiques sont présentes dans
une grande variété d'aliments, le lait fermenté, les yaourts, les fromages et les produits
carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt commercial ou scientifique y sont
couramment isolées. La contamination des aliments par des germes pathogènes, est un
problème majeur pour le consommateur pendant la période estivale où les intoxications
d'origine alimentaire apparaissent. Pour lutter contre ces germes impliqués dans ces
intoxications, 08 souches de lactobacilles ont été isolées et identifies à partir du lait cru de
chèvre dans les régions ouest d’Algérie, qui appartiennent essentiellement aux espèces
dominantes suivantes (Lb. plantarum (Lb.58), Lb. plantarum (Lb.68), Lb. casei (Lb.13), Lb.
rhamnosus (Lb.54 et Lb.52), Lb. paracasei subsp. paracasei (Lb.55), Lb. sakei subsp. sakei
(Lb.21), Lb. plantarum (Lb.22). L’étude des interactions a révélé la capacité élevée de la
souche Lb. plantarum (Lb.58) à inhiber Staphylococcus aureus, cette dernière à un
caractère atypique de croissance à 45°C. Les résultats des tests technologiques de cette
souche sont satisfaisants pour une utilisation industrielle: elle est thermorésistante,
produit des arômes et possède une activité protéolytique. Cependant, elle ne produit pas du
dextrane sur milieu MSE. La meilleure température de croissance pour la souche Lb.
plantarum (Lb.58) était à 37°C. Elle possède la meilleure activité antibactérienne, elle a
inhibée toutes les souches étudiées. La plus grande activité inhibitrice a été obtenue contre
les souches de S. aureus. En culture mixte, la croissance de S. aureus ATCC 25923 avec
Lb. plantarum (Lb.58) a été évaluée sur milieu lait. Après 9 h d’incubation la croissance de
S. aureus commence à diminuer. Après 24 h d’incubation, cette décroissance atteint 1.64
Log ufc/ml. Après 48 h d’incubation le nombre de S. aureus été inférieur à 10 cellules.
Aucune croissance n’a été observée après 72 h d’incubation toutes les cellules de S. aureus
sont lysées. La cause de cette inhibition de Staphylococcus aureus est la substance de
nature protéique produite par Lb. plantarum (Lb.58). Un comportement différent de la
souche Lb.58 vis-à-vis des 33 antibiotiques, elle est sensible à 50% des antibiotiques
choisis. L’étude sur les interactions entre Lb.58 et les autres bactéries conduit à la
possibilité d’exploiter les potentialités de cette souche pour développer un levain lactique
local capable de lutter contre les germes indésirables.

Mots clés: Bactéries lactiques, lait de chèvre, caractérisation phénotypique, Lactobacillus

plantarum, Staphylococcus aureus, culture mixte, Cinétique de croissance, propriétés
technologique, Résistance aux antibiotiques.
 Abstract
Lactic acid bacteria are used for several centuries as protective agents in fermented foods.
These bacteria have a role in food preservation, poisoning prevention, increased nutritional
value and improvement of organoleptic quality of food. They are present in a wide variety
of foods, fermented milk, yogurt, cheese and fermented meat products. Thus, different
strains of commercial or scientific interest are commonly isolated. Food contamination by
pathogens is a major problem for the consumer, especially in the summer when food
poisoning is common. To fight against these pathogens involved in these poisonings, 08
Lactobacillus strains were isolated and identified from raw goat's milk in the western
regions of the country, mainly distributed (Lb. plantarum (Lb.58), Lb. plantarum (Lb.68) ,
Lb. casei (Lb.13), Lb. rhamnosus (Lb.54, Lb.52), Lb. paracasei subsp. paracasei (Lb.55),
Lb. sakei subsp. sakei (Lb.21) and Lb. plantarum (Lb.22). Interaction studies have revealed
the ability of strain Lb. plantarum (Lb.58) to inhibit Staphylococcus aureus; this last one
has an atypical growth at 45°C. The results of technological tests of the strain are
satisfactory for industrial use; it is heat resistant, produces aromas and possesses
proteolytic activity. However, it doesn’t produce dextran on MSE's medium. Best growth
temperature for strain Lb. plantarum (Lb.58) was 37°C. The strain Lb. plantarum (Lb.58)
has the best antibacterial activity, it inhibited all studied strains and it has the highest
inhibitory activity against strains of S. aureus. In mixed culture, the growth of S. aureus
ATCC 25923 with Lactobacillus plantarum (Lb. 58) was evaluated on milk medium. 9h
after incubation the growth of S. aureus begins to decrease. 24h of incubation later, this
decrease reaches 1.64 log ufc/ml. After 48 h of incubation the number of S. aureus cells
was less than 10. At 72 h of incubation all S. aureus cells are lysed. The various tests
indicate that the proteinaceous nature of the substance produced by (Lb.58) involved in the
inhibition of Staphylococcus aureus. Lb.58 strain behavior was evaluated with 33
antibiotics and has shown sensitivity to 50% of them. This study on interactions between
Lb.58 strain and the other bacteria strains leads to the possibility of exploring Lb.58
potentials to develop a local starter able to inhibit undesirable bacteria.

Keywords: Lactic acid bacteria, goat milk, phenotypic characterisation, Lactobacillus

plantarum, Staphylococcus aureus, mixed culture, growth kinetics, technological
properties, resistance to antibiotics.
 ‫اﻟﻤﻠﺨﺺ‬
‫ﺗﺴﺘﻌﻤﻞ ﺑﻜﺘﯿﺮات اﻟﻠﺒﻦ ﻛﺒﺎدءات ﻓﻲ اﻟﻸﻏﺪﯾﺔ اﻟﻤﺘﺨﻤﺮة‪ .‬ھﺬه اﻟﺒﻜﺘﯿﺮات ﻟﮭﺎ دور ﻓﻌﺎل ﻓﻲ ﺣﻔﻆ اﻻﻏﺪﯾﺔ واﻟﻮﻗﺎﯾﺔ ﻣﻦ‬
‫اﻟﺘﺴﻤﻢ‪ ،‬زﯾﺎدة اﻟﻘﯿﻤﺔ اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ وﺗﺤﺴﯿﻦ اﻟﺨﺎﺻﯿﺔ اﻟﻤﺪاﻗﯿﺔ ﻟﻸﻏﺬﯾﺔ‪ .‬ﺗﻮﺟﺪ ھﺬه اﻟﺒﻜﺘﯿﺮات ﻓﻲ اﻧﻮاع ﻛﺜﯿﺮة ﻣﻦ اﻻﻏﺪﯾﺔ ﻣﺜﻞ‬
‫اﻟﺤﻠﯿﺐ اﻟﻤﺨﻤﺮ‪ ،‬اﻟﯿﺎﻏﻮرت‪ ،‬اﻻﺟﺒﺎن و اﻟﻠﺤﻮم اﻟﻤﺘﺨﻤﺮة‪ .‬إن ﺗﻠﻮث اﻷﻏﺬﯾﺔ ﻣﻦ طﺮف اﻟﺒﻜﺘﺮﯾﺎ اﻟﻤﻤﺮﺿﺔ ھﻮ ﻣﺸﻜﻞ ﻛﺒﯿﺮ‬
‫ﻟﻠﻤﺴﺘﮭﻠﻚ أﺛﻨﺎء ﻓﺼﻞ اﻟﺼﯿﻒ أﯾﻦ ﺗﻼﺣﻆ اﻟﺘﺴﻤﻤﺎت اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ‪ .‬ﺗﻢ ﻋﺰل ﻣﺨﺘﻠﻒ اﻟﺴﻼﻻت اﻟﺒﻜﺘﯿﺮات ﺑﻄﺮق ﻣﯿﻜﺮوﺑﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺎ‬
‫ﻓﻲ اﻟﻤﺨﺒﺮ‪ .‬ﻟﻤﺤﺎرﺑﺔ ھﺪه ﺑﻜﺘﯿﺮات اﻟﻤﺴﺒﺒﺔ ﻟﻠﺘﺴﻤﻤﺎت اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ ﺗﻢ ﻋﺰل ‪ 8‬ﺳﻼﻻت ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺔ ﻣﻦ ﺟﻨﺲ ‪Lactobacillus‬‬
‫ﻣﻦ ﻋﯿﻨﺎت ﺣﻠﯿﺐ اﻟﻤﺎﻋﺰ اﻟﻨﯿﺊ ﻣﻦ اﻟﻤﻨﺎطﻖ اﻟﻐﺮﺑﯿﺔ ﻟﻠﺠﺰاﺋﺮ‪ .‬ﺗﻨﺘﻤﻲ ھﺬه اﻟﺴﻼﻻت إﻟﻰ اﻷﻧﻮاع اﻟﺘﺎﻟﯿﺔ‪:‬‬
‫)‪Lb. plantarum (Lb.58‬‬
‫)‪Lb. plantarum (Lb.68‬‬
‫)‪Lb. casei (Lb.13‬‬
‫)‪Lb. sakei subsp. sakei (Lb.21‬‬
‫)‪Lb. rhamnosus (Lb.54, Lb .52‬‬
‫)‪Lb. paracasei subsp. paracasei (Lb.55‬‬
‫)‪Lb. plantarum (Lb.22‬‬

‫إن دراﺳﺔ ظﺎھﺮة اﻟﺘﻀﺎد ﺑﯿﻦ ھﺬه اﻟﺒﻜﺘﯿﺮات واﻟﺒﻜﺘﯿﺮات اﻟﻤﻤﺮﺿﺔ‪ ،‬ﻛﺸﻒ ﻋﻦ اﻟﻜﻔﺎءة اﻟﻜﺒﯿﺮة ﻟﻠﺴﻼﻟﺔ ‪Lb.plantarum‬‬
‫‪ Lb.58‬ﻟﺘﺜﺒﯿﻂ ‪ .Staphylococcus aureus‬ھﺬه اﻷﺧﯿﺮة ﻟﮭﺎ ﺧﺎﺻﯿﺔ ﻻﻧﻤﻄﯿﺔ ﻟﻠﻨﻤﻮ ﻋﻨﺪ درﺟﺔ ‪° 45‬م‪.‬‬
‫إن ﻧﺘﺎﺋﺞ اﻻﺧﺘﺒﺎرات اﻟﺘﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺔ ﻟﮭﺬه اﻟﺴﻼﻟﺔ ھﻲ ﻛﺎﻓﯿﺔ ﻻﺳﺘﻌﻤﺎﻟﮭﺎ ﻓﻲ اﻟﺘﻄﺒﯿﻘﺎت اﻟﺼﻨﺎﻋﯿﺔ‪ ،‬ﻓﮭﻲ ﻣﻘﺎوﻣﺔ ﻟﻠﺤﺮارة‪ ،‬ﺗﻨﺘﺞ‬
‫ﻧﻜﮭﺎت و ﻟﮭﺎ ﺧﺎﺻﯿﺔ ﻧﺸﯿﻄﺔ ﻓﻲ اﻟﺘﺤﻠﯿﻞ اﻟﺒﺮوﺗﯿﻨﻲ و ﻟﻜﻦ ﻻ ﺗﻨﺘﺞ ﻣﺮﻛﺒﺎت ﻟﺰﺟﺔ ‪ dextrane‬ﻋﻠﻰ وﺳﻂ ﻏﺪاﺋﻲ ‪.MSE‬‬
‫إن أﻗﺼﻰ ﻧﻤﻮ ﻟﮭﺪه اﻟﺴﻼﻟﺔ ھﻲ ‪°37‬م ‪ .‬ﻛﻤﺎ أن ﻟﺪﯾﮭﺎ أﻓﻀﻞ ﻧﺸﺎط ﺗﻀﺎد ﺑﻜﺘﯿﺮي ﺑﺤﯿﺚ أﺛﺒﻄﺖ ﻧﻤﻮ ﺟﻤﯿﻊ أﻧﻮاع اﻟﺒﻜﺘﯿﺮات‬
‫اﻟﻤﻤﺮﺿﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﻢ دراﺳﺘﮭﺎ‪ .‬إن أﻛﺒﺮ ﻧﺸﺎط ﺗﺜﺒﯿﻄﻲ ﻟﻮﺣﻆ ﺿﺪ ﺳﻼﻟﺔ ‪ .S. aureus‬ﻓﻲ اﻷوﺳﺎط اﻟﻤﺨﺘﻠﻄﺔ‪ ،‬ﻋﻨﺪ دراﺳﺔ‬
‫ﻧﻤﻮ‪ S. aureus ATCC 225923‬ﻣﻊ )‪ Lb. plantarum (Lb.58‬ﺗﻢ اﺳﺘﻌﻤﺎل وﺳﻂ ﺣﻠﯿﺐ‪ .‬ﺑﻌﺪ ‪ 9‬ﺳﺎﻋﺔ ﻣﻦ‬
‫اﻟﺘﺤﻀﯿﻦ ﺑﺪأ ﯾﺘﻨﺎﻗﺺ ﻧﻤﻮ ‪ ،S. aureus‬و ﺑﻌﺪ ‪ 24‬ﺳﺎﻋﺔ ﻣﻦ اﻟﺘﺤﻀﯿﻦ اﻟﺘﻨﺎﻗﺺ ﺣﯿﺚ ﺑﻠﻎ ﻟﻮ‪ 1.64‬وﻣﻢ‪/‬ﻣﻞ‪ .‬و ﺑﻌﺪ ‪48‬‬
‫ﺳﺎﻋﺔ ﻣﻦ اﻟﺘﺤﻀﯿﻦ ﻋﺪد ‪ S. aureus‬اﺻﺒﺢ أﻗﻞ ﻣﻦ ‪ 10‬ﺧﻼﯾﺎ‪ .‬و ﻟﻢ ﯾﻼﺣﻆ أي ﻧﻤﻮ ل ‪ S. aureus‬ﺑﻌﺪ ‪ 72‬ﺳﺎﻋﺔ ﻣﻦ‬
‫اﻟﺘﺤﻀﯿﻦ وﻛﻞ اﻟﺨﻼﯾﺎ ﺗﺤﻠﻠﺖ‪ .‬إن ﺳﺒﺐ ھﺬا اﻟﺘﺜﺒﯿﻂ ھﻲ ﻣﺎدة ذات طﺒﯿﻌﺔ ﺑﺮوﺗﯿﻨﯿﺔ أﻧﺘﺠﺖ ﻣﻦ طﺮف ‪Lb. plantarum‬‬
‫)‪.(Lb.58‬‬
‫ﻛﻤﺎ أن اﻟﺴﻼﻟﺔ ‪ Lb.58‬ﻟﮭﺎ ﺳﻠﻮك ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺿﺪ ‪ 33‬ﻣﻀﺎد ﺣﯿﻮي وھﻲ ﺣﺴﺎﺳﺔ ل ‪ 50%‬ﻣﻦ اﻟﻤﻀﺎدات اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ‬
‫اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﺔ‪ .‬إن دراﺳﺔ اﻟﺘﻀﺎد اﻟﺒﻜﺘﯿﺮي ﺑﯿﻦ ھﺬه اﻟﺴﻼﻟﺔ و ﺑﻜﺘﯿﺮات أﺧﺮى ﺗﺪﻟﻨﺎ ﻋﻠﻰ إﻣﻜﺎﻧﯿﺔ اﺳﺘﻐﻼل ھﺬه اﻟﺴﻼﻟﺔ ﻟﺘﻄﻮﯾﺮ‬
‫ﺑﺎدﺋﺎت ﻟﺒﻨﯿﺔ ﻣﺤﻠﯿﺔ ﻗﺎدرة ﻋﻠﻰ ﻣﻘﺎوﻣﺔ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎت ﻏﯿﺮ اﻟﻤﺮﻏﻮب ﻓﯿﮭﺎ ﻓﻲ اﻟﻤﻨﺘﻮﺟﺎت اﻟﺤﻠﯿﺐ واﻟﻤﻮاد اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ اﻟﻤﺨﻤﺮة‪.‬‬

‫ﻛﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺎﺗﯿﺢ‪ :‬ﺑﻜﺘﯿﺮات اﻟﻠﺒﻦ‪ ،‬ﺣﻠﯿﺐ اﻟﻤﺎﻋﺰ‪ ،‬اﻟﺨﺼﺎﺋﺺ اﻟﻈﺎھﺮﯾﺔ‪S. aureus،Lactobacillus plantarum ،‬‬
‫اﻟﻤﺰارع اﻟﻤﺨﺘﻠﻄﺔ‪ ،‬ﺣﺮﻛﯿﺔ اﻟﻨﻤﻮ‪ ،‬اﻟﺨﺼﺎﺋﺺ اﻟﺘﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺔ‪ ،‬ﻣﻘﺎوﻣﺔ اﻟﻤﻀﺎدات اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ‪.‬‬
 Abréviations
°C : degré Celsius. LDH: le lactate déshydrogénase
°D : degré dornic LMA: Laboratoire de Microbiologie Appliquée
(Université d’Oran)
µg: microgrammes Mal: Maltose
ADH: arginine dihydrolase. Man: Mannitol
ADN: acide désoxyribonucléique. Mb: Méga base.
ADNr /ARNr : ADN ou ARN ribosomal. Mél: Melibiose
Ara: Arabinose mg: milligramme.
ARN : Acide Ribonucléique min: minute
ATCC: American Type Culture Collection. MRS 5, 4: milieu MRS à pH 5,4
B: Bacillus. MRS: Milieu de Man, Rogosa and Sharpe(1960)
Cel: Cellobiose MRS-BCP: Milieu MRS additionné de Pourpre
de Bromocrésol.
CO2 : Dioxyde de carbone mM: milli-molaire
Do: densité optique. nm: nanomètre.
Fru: Fructose Nip+: produit la nisine
G+C: le ratio guanine + cytosine. pH: potentiel d'hydrogène
Gal: Galactose PM: poids moléculaire
h: heure Raf: Raffinose
KDa: Kilodalton Rib: Ribose
Kpb: Kilo paire de base S. aureus : Staphylococcus aureus
L : Listeria. Sac: Saccharose
Lac: Lactose Subsp. : sous-espèce
Lb: Lactobacillus ufc : unité formant colonie
LbG: Lactobacillus isolée du lait de chèvre
 Sommaire

Table des matières

Liste des tableaux ………………………………………………………………………….
Liste des figures…………………………………………………………………………….
Abreviations………………………………………………………………………………..
Intoduction ______________________________________________________________ 1
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Le lait de chèvre : ______________________________________________________ 3
1.1 Définition générale du lait :______________________________________________________ 3
1.2 Les différents composants du lait : ________________________________________________ 4
1.2.1 L’eau : __________________________________________________________________ 4
1.2.2 Les glucides : ____________________________________________________________ 4
1.2.3 Les protéines :____________________________________________________________ 4
1.2.4 Les Lipides : _____________________________________________________________ 5
1.2.5 Les minéraux : ___________________________________________________________ 5
1.2.6 Les Vitamines :___________________________________________________________ 6
1.2.7 Les nucléotides: __________________________________________________________ 6
1.3 La microflore du lait:___________________________________________________________ 7
2. Les races caprines Algériennes: __________________________________________ 8
3. Les souches lactiques des différentes races de chèvre: _______________________ 10
4. L’intérêt du lait de chèvre: _____________________________________________ 10
5. Les anomalies de la qualité du lait de chèvre : _____________________________ 11
6. Les bactéries lactiques : ________________________________________________ 12
6.1 Définition :__________________________________________________________________ 12
6.2 Propriétés générales :__________________________________________________________ 12
6.3 Origine des bactéries lactiques : _________________________________________________ 13
6.4 Génétique des bactéries lactiques ________________________________________________ 14
6.5 Classification des bactéries lactiques : ____________________________________________ 14
6.5.1 Classification classique : __________________________________________________ 14
a) Les caractères morphologiques : ______________________________________________ 15
b) Les caractères physiologiques et biochimiques : __________________________________ 15
c) Les caractères immunologiques : ______________________________________________ 15
d) Les caractères structuraux :___________________________________________________ 16
7. Exigences nutritionnelles des bactéries lactiques : __________________________ 16
7.1 Exigence en vitamines :________________________________________________________ 16
7.2 Exigences en sources azotées : __________________________________________________ 16
7.3 Influence des cations: _________________________________________________________ 16
8. L’intérêt des bactéries lactiques: ________________________________________ 17
8.1 L’aspect Médical: les probiotique: _______________________________________________ 17
8.2 L’aspect technologique : les levains ______________________________________________ 18
9. Critères de sélection de souches pour l’élaboration des ferments : _____________ 22
9.1 Activité acidifiante : __________________________________________________________ 22
9.2 Activité protéolytique : ________________________________________________________ 22
9.3 Pouvoir aromatisant et pouvoir gazeux : __________________________________________ 23
9.4 Résistance aux bactériophages : _________________________________________________ 23
9.5 Activité bactériostatique : production de bactériocines : ______________________________ 23
9.6 Résistance aux antibiotiques : ___________________________________________________ 23
10. Les lactobacilles : _____________________________________________________ 24

I
 Sommaire

Caractéristiques générales : ____________________________________________________ 24

10.1 Sous genre Lactobacillus homofermentaires : Streptobacterium _______________________ 24
10.2 Sous genre Lactobacillus hétérofermentaires : Betabacterium. _________________________ 24
10.3 Sous genre lactobacilles obligatoirement homofermentaires :__________________________ 25
11. Utilisation des lactobacilles en industrie laitière : ___________________________ 27
12. Composés antimicrobiens produits par les bactéries lactiques : _______________ 28
12.1 Acides organiques : ___________________________________________________________ 29
12.2 Acides gras : ________________________________________________________________ 31
12.3 Peroxyde d'hydrogène : ________________________________________________________ 31
12.4 Dioxyde de carbone (CO2) : ____________________________________________________ 32
12.5 Composants aromatiques : _____________________________________________________ 33
12.5.1 Diacétyle : ______________________________________________________________ 33
12.5.2 Acétaldéhyde ___________________________________________________________ 33
12.5.3 Reutérine :______________________________________________________________ 34
13. Les interactions entre les souches de bactéries lactiques : ____________________ 34
13.1 Les phénomènes d’antagonisme : ________________________________________________ 35
13.2 Les phénomènes de stimulation : ________________________________________________ 36
14. Les causes de la contamination du lait : ___________________________________ 37
15. Presentation des souches pathogenes _____________________________________ 38
15.1 Staphylococcus aureus : _______________________________________________________ 38
15.2 Escherichia coli :_____________________________________________________________ 39
15.3 Salmonella :_________________________________________________________________ 40
15.4 Bacillus : ___________________________________________________________________ 41
16. Propriétés inhibitrices des bacteries lactiques :_____________________________ 42
16.1 Choix de microorganismes : ____________________________________________________ 42
16.1.1 Résistance aux conditions rencontrées au cours du transit digestif : ________________ 42
16.1.2 Colonisation du tractus digestif et adhésion aux cellules intestinales : ______________ 42
16.2 Activités antimicrobiennes : ____________________________________________________ 43
16.3 Viabilité et stabilité des microorganismes : ________________________________________ 43
17. Définition des interactions :_____________________________________________ 43
17.1 Les acides organiques : ________________________________________________________ 44
17.2 Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) : _______________________________________________ 46
17.3 Le dioxyde de carbone (CO2) : __________________________________________________ 46
17.4 Le diacetyl (C4H6O2) : _________________________________________________________ 47
17.5 La reutérine : ________________________________________________________________ 47
18. Bactériocines :________________________________________________________ 47
18.1 Classification des bactériocines _________________________________________________ 48
18.2 Bactériocines de Lactobacillus plantarum : ________________________________________ 50
18.3 Mode d’action des bactériocines_________________________________________________ 50
18.3.1 Les lantibiotiques : _______________________________________________________ 50
18.3.2 Les bactériocines de classe II :______________________________________________ 51
18.3.3 Les bactériocines de classe III ______________________________________________ 51
19. Biopréservation des produits laitiers : ____________________________________ 53
20. Model type de bacteriocine : La nisine____________________________________ 54
21. Possibilité d’utilisation dans les produits laitiers : __________________________ 58

II
 Sommaire

MATERIELS ET METHODES
1. Provenances des échantillons : ________________________________________________ 59
2. Provenance des bactéries pathogènes :__________________________________________ 59
3. Isolement des bactéries lactiques: ______________________________________________ 59
3.1 Préparation des suspensions de dilution ___________________________________________ 60
3.2 Purification des isolats de bactéries lactiques_______________________________________ 60
3.3 Conservation des isolats _______________________________________________________ 60
3.3.1 La conservation à court terme : _____________________________________________ 60
3.3.2 La conservation à long terme : ______________________________________________ 60
4. Tests d’orientation pour l’identification des bactéries lactiques : ____________________ 61
- De la mobilité, du test de catalase et du type fermentaire. ________________________ 61
4.1 Identification des souches de bactéries lactiques : ___________________________________ 61
4.1.1 Étude macroscopique : ____________________________________________________ 61
4.1.2 Étude microscopique: _____________________________________________________ 61
4.1.3 Coloration de Gram : _____________________________________________________ 62
4.2 Critères physiologiques ________________________________________________________ 62
4.2.1 Test du NaCl et du pH : ___________________________________________________ 62
4.2.2 Test des températures de croissance et de thermorésistance :______________________ 62
4.3 Critères biochimiques _________________________________________________________ 62
4.3.1 Test de la catalase :_______________________________________________________ 62
4.3.2 Etude du métabolisme azoté (recherche de l’arginine déhydrolase (ADH)) : _________ 63
4.4 Etude du profil fermentaires : ___________________________________________________ 63
4.5 Identification de l'espèce par galerie API 50 CHL: __________________________________ 65
4.6 Caractérisation technologique :__________________________________________________ 66
4.6.1 Etude de la thermorésistance : ______________________________________________ 66
4.6.2 Production des composés aromatiques : ______________________________________ 66
4.6.3 Production de dextrane :___________________________________________________ 66
4.6.4 Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose): _______________ 66
4.6.5 Etude de l’activité protéolytique : ___________________________________________ 66
5. Mise en évidence des inhibitions inter bactériennes : ______________________________ 67
5.1 La méthode directe : __________________________________________________________ 67
5.2 La méthode indirecte : _________________________________________________________ 67
6. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur : ______________________________ 67
6.1 Inhibition due à la production d’acides organiques:__________________________________ 68
6.2 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène: __________________________________________ 68
6.3 Recherche de substances inhibitrices de nature protéique: ____________________________ 68
6.4 Recherche de phages lysogènes _________________________________________________ 69
7. Dosage de l’acidité dornic:____________________________________________________ 69
8. L’étude du l’effet du pH sur l’évolution de la croissance et d’acidité de Lactobacillus
plantarum (Lb.58 et Lb.68):_____________________________________________________ 70
9. Mesure de la croissance : _____________________________________________________ 70
10. L’étude du l’évolution de la croissance et d’acidité des deux souches au dépend du sucre
et l’acide aminé du milieu:______________________________________________________ 73
11. La détermination de la sensibilité aux antibiotiques: _____________________________ 73
12. Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) sur la croissance de S. aureus : _______ 75
RESULTATS ET DISCUSIONS
1. Dénombrement et isolement des bactéries lactiques du lait cru de chèvre : ___________ 76
2. Recherche des souches lactiques productrices de substances antimicrobiennes: _______ 76
3. Résultats de l’identification des isolats : ________________________________________ 77

III
 Sommaire

3.1 Le type fermentaire: __________________________________________________________ 79

3.2 Le test de l'ADH : ____________________________________________________________ 79
3.3 Croissance à 15 et 45°C et la thermorésistance : ____________________________________ 80
3.4 Profil fermentaire : ___________________________________________________________ 80
4. La mise en évidence d'interaction entre bactéries lactiques en milieu tamponné :______ 83
4.1 Production de substance antimicrobienne : ________________________________________ 83
4.2 Inhibitions entre les bactéries lactiques : __________________________________________ 84
5. Recherche de la nature de l’agent inhibiteur : ___________________________________ 84
5.1 Effet de la production d’acides : _________________________________________________ 85
5.2 Production de peroxyde d'hydrogène : ____________________________________________ 86
5.3 La production de phage lysogène: _______________________________________________ 87
5.4 L’effet des enzymes protéolytiques sur la substance inhibitrice:________________________ 88
6. Identification par galerie API 50 CHL : ________________________________________ 91
7. Les souches tests : __________________________________________________________ 94
8. Apptitudes technologiques des souches : ________________________________________ 95
9. L’action des lactobacilles sur la croissance de Staphylococcus aureus, Bacillus sp. et E. coli
sur milieu solide non tamponnée et tamponnée : ___________________________________ 96
10. Interactions bactériennes : __________________________________________________ 98
10.1 L’antagonisme bactérien des souches Lactobacillus plantarum (Lb.58, Lb.68) :___________ 98
10.1.1 Inhibition des souches Staphylococcus aureus : ________________________________ 98
a) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 25923 par les souches
Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68):___________________________________________ 98
b) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 29213 par les souches
Lactobacillus plantarum (58 et 68): ________________________________________________ 99
c) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 43300 par les souches
Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68):___________________________________________ 99
10.1.2 Inhibition de la souche Listeria ivanovii ATCC 19119 :__________________________ 99
10.1.3 Inhibition de la souche Escherichia coli ATCC 25922: _________________________ 100
10.1.4 Inhibition de la souche Klebsiella pneumoniae :_______________________________ 100
10.1.5 Inhibition de la souche Acinetobacter calcoaceticus : __________________________ 100
10.1.6 Inhibition de la souche Pseudomonas aeruginosa : ____________________________ 100
10.1.7 Inhibition de la souche Salmonella enterica : _________________________________ 101
10.1.8 Inhibition de la souche Bacillus sp. : ________________________________________ 101
10.1.9 Inhibition de la souche Lactobacillus plantarum Lb.58:_________________________ 101
10.1.10 Inhibition de la souche Lactobacillus plantarum Lb.68:_________________________ 101
11. Cinétique d'évolution de l’acidité (pH et D°) et Etude du pouvoir coagulant du lait
écrémé de Lactobacillus plantarum a différentes températures d’incubation : __________ 101
12. Cinétique de croissance dans le milieu MRS à différentes températures d’incubation: 105
13. Résultats de la cinétique de croissance de Staphylococcus aureus (ATCC 25923) en
culture pure et mixte à 37°C : __________________________________________________ 116
14. Effet de l’extrait brut de Lactobacillus plantarum sur la croissance de Staphylococcus
aureus : 118
15. Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques des lactobacilles étudiés : 120
Discussion générale _____________________________________________________ 123
Conclusion Générale ____________________________________________________ 131
Bibliographie __________________________________________________________ 133
Annexe _______________________________________________________________ 161

IV
 Introduction Générale

INTODUCTION
En Algérie il y a une spécialisation des zones agroécologiques en matière d’élevage.
L’élevage bovin reste cantonné dans le Nord du pays avec quelques incursions dans les autres
régions. Les parcours steppiques sont le domaine de prédilection de l’élevage ovin et caprin
avec plus de 24 millions de têtes qui y vivent entraînant une surexploitation de ces pâturages.
Les ovins prédominent et représentent 80 % de l’effectif global (19,3 millions de têtes) avec
plus de 10 millions de brebis. L’élevage caprin vient en seconde position (4,7 millions de
têtes) (14 %) comprenant 50 % de chèvres. Il se trouve concentré essentiellement dans les
zones montagneuses, les hauts plateaux et les régions arides (Badis, 2004; Badis et al., 2004a;
Badis et al., 2004b; Badis et al., 2006 et Guessas, 2007).
La recherche sur les bactéries lactiques, qui ont un rôle dominant dans la production de
beaucoup de produits laitier fermentées, a continué à avancer à une vitesse très
impressionnante vers la fin du 20ème siècle, la capacité de manipuler et de contrôler ces
microorganismes a atteint maintenant un niveau considérable (Caplice et Fitzgerald., 1999).
Depuis l'époque de Louis Pasteur et Robert Koch, il y a eu un besoin essentiel
d'identification scientifique pour contrôler les micro-organismes de l’environnement. En plus,
la découverte de la pénicilline par Alexander Flemming en 1929 a ouvert la porte pour l’usage
thérapeutique des antibiotiques dans le domaine médical et vétérinaire afin de lutter contre les
microorganismes pathogènes. D’autres agents chimiques de conservation et additifs
alimentaires ont des propriétés antimicrobiennes.
Actuellement, les scientifiques exploitent les interactions microbiennes des bactéries
lactiques pour réduire d’une façon considérable la présence des microorganismes indésirables
et nuisibles. En plus de l’effet protecteur de l’acide lactique, l’acide acétique, le diacetyle et le
peroxyde d’oxygène, la découverte des bactériocines a donné un élan pour le développement
d’aliments de qualité sanitaire meilleure.
Des efforts considérables ont été consacrés au cours de ces cinquante dernières années
pour affermir la compréhension de la physiologie, de la biochimie et de la génétique des BL
(Collins et al., 1989; Berthier et Erlich., 1999; Bolotin et al., 2001; Bourel et al., 2001;
Axelsson, 2004; Marroki et al., 2010 et Djadouni et Kihal., 2012). Toutes ces recherches ont
permis aux microbiologistes et aux industriels de choisir les meilleures souches et d'améliorer
le rendement de la productivité, la qualité, et la sécurité des produits finis.
La caractérisation des BL a favorisée le développement de souches bactériennes définies,
connues sous le nom de levains ou de culture starter. Elles remplacent de plus en plus les

1
 Introduction Générale

mélanges non définis traditionnellement employées en industrie laitière (Crow et al., 1993;
Desmazeaud et Cogan., 1996 et Fitzsimmons et al., 1999).
Les ferments lactiques jouent un rôle technologique fondamental en transformation laitière
et la recherche de nouvelles souches possédant des activités biologiques particulières sont en
pleine expansion dans le secteur de l’industrie laitière (Bredholt et al., 2001; Brillet et al.,
2005; Drici et al., 2009 et Boumahira et al., 2011).
Ces dernières années, l'intérêt de l’emploi de la bactériocine et ou tout autre BL
productrice de substances inhibitrices pour des applications de bio-préservation a suscité
beaucoup de recherches (Schillinger et Lücke, 1989; Budde et al., 2003; Jacobsen et al., 2003;
Vermeiren et al., 2004; Guessas, 2007 et Saidi, 2007 ).
A l'intérieur d'équipes de recherche structurées et multidisciplinaires, les chercheurs
s'intéressent particulièrement à la production de bactériocine, agents antimicrobiens naturels,
et de polysaccharides exo-cellulaires par les bactéries lactiques. Ces derniers travaillent sur
l'isolement et la caractérisation génétique et moléculaire des souches sur la production de bio-
ingrédients alimentaires par fermentation de milieux laitiers et sur l'exploitation des souches
en transformation laitière (Deegan et al., 2006).
La production d’acides organiques et d’autres composés antimicrobiens, telles que les
bactériocines, jouent un rôle majeur dans la conservation des produits laitiers fermentés et
contribuent à l’inhibition des germes contaminants (Benhammouche, 2005; Guessas et al.,
2006 et Saidi, 2007).
Nous poursuivons les travaux de recherche dejà entamés par l'équipe du laboratoire de
microbiologie appliquée du département de biologie faculté des sciences de l'université
d'Oran. La recherche des bactéries lactiques productrices de substances antimicrobiennes
isolées du lait cru de chèvre d'Algérie est un axe que nous avons choisi pour enrichir la
collection du laboratoire LMA et pour comprendre les mecanismes d'action des ces bactéries
bactériocinogènes en milieu artificiel du laboratoire et dans le milieu naturel le lait.
Notre objectif consiste a la recherche de nouvelles souches de bactéries lactiques du genre
Lactobacillus capable de produire des substances antimicrobiennes a partir du lait cru de
chèvre de la region ouest Algerien. L'interet de cette étude est donc l'isolement des souches de
bactéries lactiques productrices de substances antimicrobiènnes type bactériocine et de
pouvoir identifier correctement l'agent et la substance active.

2
 Synthèse bibliographique

1. Le lait de chèvre :
Le lait de chèvre est blanc mât, due à l'absence de B-carotène. Contrairement au lait de
vache, il a une odeur assez neutre. Parfois en fin de lactation, une odeur caprine apparait et
après stockage au froid pour acquérir une saveur caractéristique (Goursaud, 1985).
 Sa composition chimique varie selon l'espèce, condition d'environnement, et stade de
lactation (Kihal et al., 1999).
 La composition chimique joue un rôle important sur son aptitude à l'acidification par les
ferments lactiques et notamment l'influence des sels minéraux (Masle et Morgan, 2001).
 La densité du lait de chèvre est comparable à celle du lait de vache : avec une densité
moyenne de 1031,05 à 15°C. Le point de congélation du lait de chèvre est environ 0,04 °C
inférieur à celui de la vache (Bonassi et al., 1998), le lait de chèvre présente une très grande
conductivité électrique par rapport a celui de la vache.
 Le contenu en azote non protéique dans le lait de chèvre est plus élevé par apport au lait
de vache, le contenu des protéines coagulables et caséines est faible 70,9% comparé à 77,8%
(Grappin et al., 1981).
 Les caséines représentent la partie la plus importante des protéines du lait, elles
constituent environ 70% des matières azotés coagulables et sont représentées sous forme de
micelles (Corcy, 1991).
 Dans la majorité du lait de mammifères, le lactose représente la principale forme de
glucides, qui sont présents sous forme de glycoprotéines et de glycolipides ayant des
propriétés fonctionnelles spécifiques (Chakroun et al., 1998).
 Le lait de chèvre est faible en éléments minéraux de (5 à 8 mg/100). Certains de ces
éléments son important sur le plan technologique (calcium et phosphate de calcium) en
particulier dans les phénomènes de coagulation, les équilibres salins, dans la stabilité du lait à
la chaleur et dans l'aptitude à l'ultrafiltration (Le Men, 1985).

1.1 Définition générale du lait :

Le lait est un liquide physiologique complexe sécrété par les mammifères et destiné à
l’alimentation du jeune animal naissant. L’origine de ses constituants est à la fois la synthèse
réalisée au sein des cellules mammaires, à partir d’éléments sanguins tels que les acides gras
et triglycérides, les protéines provenant d’acides aminés et le lactose provenant du glucose et
de la filtration sélective de certains composants sanguins (sels minéraux). L’une des
caractéristiques nutritionnelles majeures du lait est qu’il représente la source unique de
nutriments qui doit satisfaire des besoins importants de croissance de l’organisme. L’intérêt
provient de la qualité des ses protéines, de ses lipides et de ses vitamines, en particulier, sa

3
 Synthèse bibliographique

richesse en calcium. La composition du lait varie beaucoup d’une espèce à l’autre et reflète
les besoins nutritionnels spécifiques de chaque espèce. Il existe, cependant ; des similitudes
dans la composition des laits d’une même espèce (Mahé, 1996).

1.2 Les différents composants du lait :

La composition du lait varie d’une espèce animale à une autre le tableau 1 donne la
composition chimique des différents mammifères.
Tableau 1: Composants de lait de différentes espèces (Alais, 1984 et Amiot et al., 2002)
Eléments en g/l Vache Chèvre Brebis Chamelle
Eau 900-910 900 860 902
Extrait sec total (EST) 125-135 140 190 140
Matières grasses 35-45 45-50 70-75 46
Matières protéiques 30-36 35-40 55-60 36
Caséines 27-30 30-35 45-50 28
Protéines solubles 4-5 6-8 8-10 8
Matières minérales 7.5-8.2 8-10 10-12 7.2
Lactose 40-50 40-45 45-50 50

1.2.1 L’eau :
Elle forme une solution vraie avec les glucides, les minéraux, une solution colloïdale avec
les protéines hydrophiles, une suspension colloïdale avec les micelles de caséines et une
émulsion avec les matières grasses. Le lait de chèvre est constitué de 87% d’eau (Amiot et al.,
2002).
1.2.2 Les glucides :
Le lactose est le glucide le plus important du lait, d’autres glucides peuvent provenir de
l’hydrolyse du lactose (glucose, galactose). Certains glucides peuvent se combiner aux
protéines, formant des glycoprotéines ou peuvent se trouver sous forme libre (Amiot et al.,
2002).
1.2.3 Les protéines :
On les classe en deux catégories, d’après leur solubilité dans l’eau :
- les caséines : (α-S1B, α-S2A, β-A2, K) qui sont en suspension colloïdale se
regroupent sous forme de micelles.
- Les protéines de sérum : (bêta-lactoglobuline, alpha-lactalbumine) qui se retrouvent
sous forme d’une solution colloïdale.
L’analyse de la composition en acide aminé des proteines du lait de chèvre faite par le
chercheur Mahé en 1996, a révélé que la concentretion d’Acide glutamique est la plus élevé
(209 mg/g). En revanche celle de la Cystéine elle est de 9 mg/g.

4
 Synthèse bibliographique

Tableau 2: Composition en acides aminés des protéines du lait de chèvre (Mahé, 1996)
Acides aminés Quantités mg/g
Histidine 26
Isoleucine 48
Leucine 96
Lysine 80
Méthionine 25
Cystéine 09
Phénylalanine 47
Tyrosine 38
Thréonine 49
Tryptophane 49
Valine 61
Glycine 18
Arginine 29
Proline 106
Acide aspartique 75
Acide glutamique 209
Alanine 34
Sérine 49

1.2.4 Les Lipides :

Les lipides du lait se composent principalement de triglycérides, de phospholipides et
forment une émulsion.
Le lait de chèvre est pauvre en carotène et donc, peu coloré par rapport aux autres laits, il
est plus riche en acides gras à 10 atomes de carbone et présente un pourcentage plus élevé de
petits globules gras que le lait de vache, il ne contient pas d’agglutinines et présente une
activité lipasique plus faible que le lait de vache (Chilliard, 1987).

Tableau 3: Composition en lipides des laits de différentes espèces (Chilliard, 1987).

Composants (%) chèvre vache Humain
Triglycérides 95 98 97
Glycérides partielles 3 0.5 1
Cholestérol 0.4 0.3 0.6
Phospholipides 1 0.9 1.1
Acides gras libres 0.6 0.4 0.5
1.2.5 Les minéraux :
Ils prennent la forme de sel, de base et d’acide mais les deux formes principales sont les
sels ionisés solubles dans le sérum et les micelles. Les éléments basiques majeurs comme le
calcium, le potassium, le magnésium et le sodium forment des sels avec les constituants
acides que sont les protéines, les citrates, les phosphates et les chlorures, en outre le calcium,
le magnésium, les citrates et les phosphates se trouvent sous forme colloïdale dans les
micelles de caséines (Amiot et al., 2002).

5
 Synthèse bibliographique

Tableau 4: Composition moyenne du lait en éléments minéraux majeurs de différentes

espèces (Gueguen, 1996).
Composants mg/l Chèvre humain vache brebis
Calcium 1260 320 1200 1950
Phosphore 970 150 920 1500
Potassium 1900 550 1500 1400
Sodium 380 200 450 460
Chlore 1600 450 1100 1100
Magnésium 130 40 110 180

Tableau 5: Composition moyenne du lait en principaux oligo-éléments indispensables aux

différentes espèces (Gueguen, 1996).
Composants µg/l chèvre humain vache brebis
Zinc 3400 3000 3800 5000
Fer 550 600 460 700
Cuivre 300 360 220 400
Manganèse 80 30 60 90
Iode 80 80 70 100
Sélénium 20 20 30 30
1.2.6 Les Vitamines :
Elles sont réparties en deux classes : les vitamines hydrosolubles et les vitamines
liposolubles. En remarque que le lait de chevre est povre en carotène et B9 acide folique
(Amiot et al., 2002).
Tableau 6: Composition vitaminique du lait de différentes espèces (Jaubert, 1996).
Composants pour 100 g chèvre vache Humain
Vitamines liposolubles
A rétinol mg 0.040 0.035 0.060
Carotène mg 0 0.021 0.025
Vit D µg 0.06 0.08 0.055
E tocophérol mg 0.04 0.11 0.23
Vitamines hydrosolubles
B1 thiamine mg 0.05 0.04 0.02
B2 riboflavine mg 0.14 0.17 0.035
B3 niacine mg 0.27 0.09 0.16
B5 acide pantothénique mg 0.31 0.34 0.18
B6 pyridoxine mg 0.05 0.04 0.01
B8 biotine µg 2 2 0.7
B9 acide folique µg 1 5.3 5.2
B12 cobalamine µg 0.06 0.35 0.04
Acide ascorbique mg 1.3 1 4

1.2.7 Les nucléotides:

Indépendamment de l’espèce, la composition en nucléotides du lait dépend du stade de
lactation, les concentrations les plus élevées sont dans le colostrum et maximales de deux
jours après la mise bas. Le lait de chèvre se caractérise par la part prépondérante des dérivés
d’uridine (Jaubert, 1996).

6
 Synthèse bibliographique

Tableau 7: concentration en nucléotides du lait de différentes espèces en µmol/100ml

(Jaubert, 1996).
Nucléotides Chèvre vache humain
1-2 j 2 mois 1-2 j 2 mois 2j 1 mois
AMP 4,7 6,7 6,2 2 4 2,1
GMP 0,3 0,2
CMP 6,5 5,4 5,3 1,9 5,5 2
UMP 53,8 19,2 39 14,5 1,7 1,1
UDPG 60,7 19,6 36,2 1,4 0,9
UDPG a 58 17,2 32 1,4 1
Acide orthique 6,3 10,2 7,4 26,8

1.3 La microflore du lait:

Les micro-organismes du lait sont répartis en deux grandes classes :
 La microflore indigène ou originelle: ensemble des micro-organismes retrouvés
dans le lait à la sortie du pis, ces micro-organismes dépendent de l’alimentation, de
la race et d’autres facteurs. Les genres dominants en sont principalement des micro-
organismes mésophiles (Micrococcus sp., Lactobacillus, Streptococcus ou
Lactococcus et les bactéries à Gram négatif) (Lamontagne et al., 2002).
 La microflore contaminante: Ensemble des micro-organismes ajoutés au lait de la
récolte jusqu’à la consommation, elle peut se composer d’une flore d’altération qui
causera des défauts sensoriels ou qui réduira la durée de conservation des produits
et d’une flore pathogène, capable de provoquer des malaises chez les personnes qui
consomment ces produits laitiers (Lamontagne et al., 2002).
1- La microflore d’altération: Responsable de diverses dégradations du produit au
niveau du goût, de l’arôme, de l’apparence ou de la texture. Par exemple, texture
visqueuse à la surface du fromage, présence de longs filaments dans le lait, caillage
du lait, production de mauvaises odeurs (soufrée, ammoniacale, fruitée et atypique)
dues à certaines activités métaboliques telles que la protéolyse ou la lipolyse et
gazéification du lait provoquant des trous involontaires ou des gonflements durant
l’affinage du fromage. Tout ceci réduit la vie de tablette du produit laitier. Les
principaux micro-organismes d’altération sont: Pseudomonas sp., Proteus sp.,
coliformes, principalement E. coli, Enterobacter, les sporulés, tels que Bacillus sp.,
Clostridium et certaines levures et moisissures.
2- La microflore pathogène: sa présence dans le lait est due à l’animal, à
l’environnement ou à l’homme. Les bactéries pathogènes sont responsables des
affections reliées à la santé des manipulateurs et des consommateurs.

7
 Synthèse bibliographique

On en retrouve deux genres :

 Les bactéries infectieuses: qui doivent être vivantes dans l’aliment lors de sa
consommation pour agir. Une fois ingérées, elles dérèglent le système
digestif. Apparaissent alors divers symptômes connus, tels que la diarrhée,
les vomissements, les maux de tête et même la mort, dans certains cas
extrêmes. Il s’agit de Salmonella sp., E. coli 0157 :H7, Listeria
monocytogenes, Clostridium perfringens, Brucella et Campylobacter sp.
(Lamontagne et al., 2002).
 Les bactéries toxinogènes: qui produisent une toxine dans l’aliment et c’est
cette toxine qui rend le consommateur malade. Il n’est donc pas suffisant de
détruire la bactérie pour éviter l’incidence de la maladie. De plus certaines
toxines sont très résistantes aux traitements thermiques, tels que la
pasteurisation et même la stérilisation, dans certains cas. Il s’agit de
Staphylococcus sp. et Clostridium botulinum (Lamontagne et al., 2002).
2. Les races caprines Algériennes:
Le cheptel caprin en Algérie est estimé à environ 2,5 millions de têtes, il est concentré
généralement dans les zones difficiles et les régions défavorisées de l’ensemble du territoire :
steppes, régions montagneuses et oasis. Il peut être aussi présent dans les exploitations
agricoles de régions plus favorables comme les hautes plaines, les plaines intérieures et les
piémonts des montagnes du Nord du pays (Abdelguerfi, 2003).
L’élevage caprin, en Algérie, vient en seconde position, après l’élevage ovin, et représente
13% du cheptel total, avec 50% de chèvres (Nedjraoui, 2002).
Quatre races principales sont recensées :

 La chèvre Arabia: race domestique localisée dans la région de Laghouat subdivisée en

deux sous types, l’un sédentaire et l’autre, transhumant, comparativement au type
transhumant, le type sédentaire possède des poils plus longs , 14 à 21cm contre 10 à
17cm pour le type transhumant.

Figure 1 : Morphologie de la race de chèvre Arabia.

8
 Synthèse bibliographique

 La chèvre Makatia: localisée dans les hauts plateaux et le Nord de l’Algérie, elle est
utilisée principalement pour la production de lait et de viande, appréciée aussi pour sa
peau, c’est une race de grande taille et de couleurs variées.

Figure 2: Morphologie de la race de chèvre Makatia.

 La chèvre Kabyle: de petite taille, elle peuple abondamment les massifs montagneux,
de la Kabylie, des Aurès et du Dahra. Son poil est long, de couleur généralement brun-
foncé, parfois noire, la tête de profil courbée est surmontée de cornes.

Figure 3: Morphologie de la race de chèvre Kabyle.

 La chèvre du M’zab: chèvre principalement laitière, appelée également Touggourt,

elle est originaire de M’tili, dans la région de Ghardaïa mais peut toutefois être trouvée
dans toute la partie septentrionale du Sahara. L’animal est de taille moyenne (65cm),
son corp allongé, droit et rectiligne, sa tête est fine et cornée, alors que sa robe présente
trois couleurs, le chamois dominant, le blanc et le noir (Abdelguerfi, 2003).

Figure 4: Morphologie de la race de chèvre du M’zab

9
 Synthèse bibliographique

3. Les souches lactiques des différentes races de chèvre:

Les premiers travaux sur les bacteries lactiques ont été realiser par badis et collaborateurs
en 2004. Ils ont montré que le lait cru de chèvre presente un ecosysteme favorisable aux
developement de 6 genres de bacteries lactiques (Tableau 8 et 9). Les éspèces de
Lactobacillus et de Lactococcus domminent cette microflore lactique (Badis et al., 2004a;
Badis et al., 2004b; Badis et al., 2005; Badis et al., 2006).
Tableau 8: Les souches lactiques de la race Arabia (Badis et al., 2005)
Lactobacillus Streptococcus Lactococcus Leuconostoc Weissella Pediococcus
Lb. helveticus Streptococcus Lc. lactis biovar. Ln. lactis Weissella para- P. damnosus
thermophilus diacetylactis mesenteroïdes
Lb. plantarum Lc. lactis subsp. Ln. Pseudo- P. acidilactici
lactis mesenteroïdes
Lb. casei subsp. Lc. lactis subsp. Ln. mesenteroïdes P. parvulus
rhamnosus cremoris subsp. dextranicum
Lb. delbrueckii Lc. plantarum Ln. amylibiosum
subsp. lactis
Lb. brevis
Lb. casei subsp.
casei
Lb. acidophilus
Lb. animalis
Lb. amylophilus

Tableau 9: Les souches lactiques de la race kabyle (Badis et al., 2005).

Lactobacillus Streptococcus Lactococcus Leuconostoc Weissella Pediococcus
Lb. delbrueckii Streptococcus Lc. lactis subsp. Ln. lactis Weissella para- P. damnosus
subsp. thermophilus lactis mesenteroïdes
Bulgaricus
Lb. helveticus Lc. subsp. Ln. mesenteroïdes
Hordniae subsp. cremoris
Lb. casei subsp. Lc. lactis subsp.
rhamnosus Cremoris
Lb. brevis Lc. Plantarum
Lb. casei subsp. Lc. Graviae
casei
Lc. Raffinolactis
4. L’intérêt du lait de chèvre:
La chèvre, de par son origine, son anatomie, sa physiologie et ses caractéristiques
comportementales représente une ressource sous-estimée qui en même temps a un grand
potentiel pour une augmentation de la production du lait (Seifu, 2007).
Des efforts pour le développement du cheptel bovin sont déployés, mais ce n’est pas le cas
pour les autres espèces laitières, chèvres, brebis, chamelles, pourtant mieux adaptées à nos
conditions agro-climatiques (Ramet, 1993).
Par ailleurs, le lait de chèvre possède une qualité nutritionnelle importante : sa digestibilité,
Haenlein et Caccese (1984) ont suggéré que le fort pouvoir tampon du lait de chèvre serait
utile dans le traitement des ulcères gastriques, Haenlein (1993) a démontré que les protéines

10
 Synthèse bibliographique

du lait de chèvre sont digérées plus facilement et ses acides aminés sont absorbés de façon
plus efficace que ceux du lait de vache, Haenlein (1998) a relevé que le lait de chèvre, une
fois acidifié, pourrait former un caillé plus doux et plus friable, donc, il peut être attaqué plus
facilement et plus rapidement par les protéases de l’estomac, il peut présenter un avantage
pour les gens souffrant de désordres gastro-intestinaux et d’ulcères.
Jeannes (1980) a démontré que le lait de chèvre contenait une concentration adéquate
d’acides gras essentiels pour les enfants comme le lait de vache, mais dans des quantités
légèrement supérieures pour certains spécimens. Juarez et Ramnos (1986) ont mis en évidence
le fait que le lait de chèvre a de plus grandes quantités de petites molécules grasses que le lait
de vache, de son coté, Devendra (1975-1980) a souligné l’existence dans le lait de chèvre
d’acides gras à chaînes de courtes et moyennes longueurs (4 à 12 carbones), dans une
proportion élevée (20%) par rapport au lait de vache qui n’en contient que 10 à 20%. Ceci
peut contribuer à une meilleure digestibilité car les lipases attaquent les liaisons des acides
gras à courte chaîne plus facilement qu’elles ne le font avec des chaînes longues, comme l’a
décrit Jenness (1980).
De plus, Park (1994) a indiqué que les acides gras sont largement utilisés dans le traitement
des patients souffrant de désordres divers liés à l’absorption, grâce à leur capacité
métabolique unique à fournir de l’énergie, un cholestérol sanguin plus bas, à inhiber et limiter
le dépôt de cholestérol dans les tissus et entraîner la dissolution des cholestéroloses.
Haenlein (1988) a démontré que le lait de chèvre convient à l’enfant qui lui procure
vitamines A et niacine et il lui fournit également une grande quantité de thiamine et de
riboflavine (Seifu, 2007).
5. Les anomalies de la qualité du lait de chèvre :
 Anomalies d’origine physiologique :
Les principales anomalies d’origine physiologique concernent la présence de colostrum ou de
laits de fin de lactation. Les laits qui se caractérisent, en particulier, par une concentration
anormale d’éléments par ailleurs normaux, présentent des risques qui sont essentiellement de
nature technologique et ne constituent pas des produits dangereux pour le consommateur
(Perrin, 1996).
 Anomalies d’origine pathologique :
Un certain nombre de germes infectieux peuvent être transmis par le lait : Brucella, bacille
de la tuberculose, Chlamydia, Coxiella (fièvre Q), Salmonella, Listeria, Staphylocoques
(mammites). D’autres anomalies peuvent être d’origine chimique: dues à la présence
d’antibiotiques, d’antiseptiques ou de pesticides (Perrin, 1996).

11
 Synthèse bibliographique

6. Les bactéries lactiques :

6.1 Définition :
Avant le vingtième siècle, le terme bactéries lactiques (Lactic acid bacteria) a été utilisé
pour signifier les organismes du lait acidifié (Milk-souring organisms). Significativement, la
première culture pure de ces bactéries était celle de Bacterium lactis (probablement
Lactococcus lactis), obtenu par Lister (1873). Des progrès important dans la classification de
ces bactéries ont été apparus quand les similarités entre les bactéries du lait acidifié et les
autres bactéries productrices d’acide lactique étaient reconnues (Axelsson, 2004).
Les bactéries lactiques sont généralement associées aux habitats riches en nutriments,
comme divers produits alimentaires (lait, viande, boisson, végétaux), mais d’autres sont aussi
membres de la flore normale de la bouche, l’intestin et le vagin des mammifères (Salminen,
2004 et Carina Audisio et al., 2010). La monographie d’Orla-Jensen (1919) constitue la
référence pour l’étude des bactéries lactiques. Orla Jensen utilise les caractéristiques suivantes
comme base de classification: morphologie (cocci ou bâtonnets, formation tétrade), mode de
fermentation du glucose (homo ou hétérofermentation), la croissance à certaines températures
cardinales (ex: 10°C et 45°C), les types de sucres utilisés. Ces caractéristiques sont toujours
très importantes dans la classification des bactéries lactiques (Stiles et Holzapfel, 1997; Carr
et al., 2002 et Axelsson, 2004).

6.2 Propriétés générales :

D'une façon générale le groupe se compose de bactéries sous forme, de coques ou de
bâtonnets à Gram positifs, non sporulant, et produisent l'acide lactique comme produit final
principal pendant la fermentation des carbohydrates (Kandler, 1983).
Les BL sont, selon la voie qu’elles empruntent pour fermenter les hexoses,
Homofermentaires ou hétérofermentaires.
La voie de la glycolyse (Embden-Meyerhof-Parnas), ayant pour produit final principal
l'acide lactique ou la voie 6-phosphogluconate/phosphokétolase (6-pg/pk) (Schleifer et
Ludwig, 1995) Ayant pour résultat l'acide lactique, l'anhydride carbonique et l'éthanol (acide
acétique).
Cependant, quelques espèces sont considérées comme hétérofermentaires facultatifs.
Concernant la fermentation des hexoses, ces espèces sont homofermentaires, mais dans
certaines conditions (par exemple si la source disponible de carbone est un pentose), elles
induisent la voie 6-pg/pk, ayant pour résultat la fermentation hétérolactique (Axelsson, 2004
et Jozala et al., 2005).

12
 Synthèse bibliographique

Les BL sont trouvées dans diverses niches écologiques, tel que le lait, ainsi que certaines
nourritures, la bouche, les régions gastro-intestinales et urogénitales des humains et des
animaux (Lopez-Diaz et al., 2000; Navarro et al., 2000; El Shafei et al., 2000 et Mathara et
al., 2004). Elles constituent aussi la flore microbienne dominante responsable de la
fermentation des céréales et des plantes fourragères ensilées (Carr et al., 2002 et Kotelnikova
et Gelfand, 2002). Même si elles se développent dans une variété d'habitats, elles exigent des
carbohydrates fermentescibles, des acides aminés, des acides gras, des sels et des vitamines
pour leur croissance (Shihata et Shah, 2000; Björkroth et Holzapfel, 2003 et Hammes et
Hertel, 2003).
Les souches sont généralement faiblement protéolytiques et lipolytiques et exigent des
acides aminés, des purines, des pyrimidines et des vitamines pour leur croissance (Stamer,
1976; Cogan et Hill, 1993 et Jay, 1996).
Les bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières peuvent être divisées en
deux groupes sur la base de leur croissance optimale (Bissonnette et al., 2000). Les bactéries
mésophiles avec une température optimum de croissance entre 20°C et 30°C et les
thermophiles entre 30°C et 45°C. Alors que la majorité de souches se développent à pH 4,0-
4,5, certaines sont en activitées à pH 9,6 et d'autres à pH 3,2 (Jozala et al., 2005).
L'acide lactique produit peut être sous deux formes stéréoisomèriques, L moins
Fréquemment, D ou un mélange des deux (Who, 1974).
6.3 Origine des bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques ont été isolées dans de nombreux milieux naturels végétaux,
animaux et humains ; certains espèces semblent adaptées à un environnement spécifique et ne
semblent guère se retrouver ailleurs que dans leur habitat naturel. Grace à leur souplesse
d’adaptation physiologique, les BL peuvent coloniser des milieux très différents du point de
vue physico-chimique et biologique (de Roissard et Luquet, 1994).
Selon Desmazeaud (1992), les espèces du genre Streptococcus, Lactococcus et
Leuconostoc se rencontrent plutôt chez les hommes, ainsi que chez les animaux. Dans le
domaine laitier, elles existent en quantité considérable, les espèces du genre Lactobacillus
sont encore plus répondues dans la nature, par exemple, on les trouve sur les végétaux ou elles
assurent l’acidification de l’ensilage, on les trouve aussi dans l’intestin des animaux et de
l’homme. Elles sont également isolées des cavités naturelles de l’organisme (cavités buccales
et vaginales) (de Roissard et Luquet, 1995).

13
 Synthèse bibliographique

6.4 Génétique des bactéries lactiques

Le matériel génétique des bactéries lactiques est organisé en deux structures: le
chromosome, long filament d’ADN très replie sur lui-même, et les plasmides, petites
molécules circulaires d’ADN indépendantes du chromosome, pouvant se répliquer de façon
autonome. Les plasmides peuvent être perdus spontanément par la bactérie dans les conditions
de milieu défavorables (température élevée, privation nutritionnelles) ou éliminés par des
traitements chimiques. Cette possibilité de perdre spontanément des plasmides explique
l’instabilité des propriétés technologiques, due a l’apparition de variantes ayant perdu certain
gènes et donc certaines fonctions métaboliques Ainsi, la perte du plasmide codant pour la
protéase de paroi rend les bactéries peu protéolytique, et entraine une croissance ralentie des
germes et une acidification faible du lait.
D’autres caractères technologiques sont également codés par des gènes portés par des
plasmides la capacité à utiliser le lactose, le métabolisme de précurseurs d’aromes, la
production de la nisine chez certaine souches, des résistances aux bactériophages
(Stackebrandt et Teuber, 1988 et Kandler et Weiss, 1986).

6.5 Classification des bactéries lactiques :

Le groupe des bactéries lactiques a été systématique, ensuite plusieurs travaux dans ce
domaine ont été repris par (Orla-Jensen, 1919; collin et al., 1987; collin et al.,1993; Davies et
Law, 1984; Gilliland, 1995; Stiles et Hotzapfel, 1997; Sneath et al., 1986; Leveau et Bouix,
1983 et cité dans de Roissard et Luquet,1994) dont le classement est complété par la
classification moderne qui a permis de distinguer différents genres.
6.5.1 Classification classique :
Orla-Jensen (1991), a proposé une classification fondée sur les caractères morphologique,
biochimique et physiologique (Température de croissance, mode de fermentation du glucose
et la forme de l’acide lactique produit). Il a travaillé sur le genre Lactobacillus avec sa
structuration en Thermobactérium, Streptobactérium et Bétabactérium correspondant aux trois
groupes actuels des Lactobacilles. Homofermentaires strictes, hétérofermentaires facultatifs et
hétérofermentaires strictes.
Les groupes des homofermentaires sont formés de trois sous-groupes:
 Streptobacterium.
 Thermobacterium.
Les groupes des hétérofermentaires sont formés également de trois sous groupes :
 Bifidobacterium.
 Betabacterium.

14
 Synthèse bibliographique

 Betacoccus (Gournier Château et Larpent, 1994).

Selon Sneath et al., (1986), les bactéries lactiques sont regroupées suivant une taxonomie
basée sur :
a) Les caractères morphologiques :
 La forme : des cellules microbiennes représentent souvent un caractère distinctif de
l’espace et du genre bactériens (coques ou bâtonnets).

Figure 5: différente forme microscopique de bactéries lactiques obtenues au laboratoire de

microbiologie appliquée de l'université d'Oran par Saidi (2005). De gauche – droite, Diplocoques
(Leuconostoc sp.), (Lactobacillus sp.), streptocoques et diplocoques (Lactococcus lactis sp.)

 Le diamètre cellulaire : est un caractère plus stable que la longueur cellulaire.

 La mobilité: est une caractéristique rare chez les bactéries lactiques qui sont
généralement non mobiles, sauf dans certains cas ou elles possèdent des flagelles
péritriches.
 La sporulation: toutes les bactéries lactiques sont non sporulées.
 La présence d’inclusions cellulaires, corpuscules métachromatiques ou de volutine,
est un caractère distinctif de certaines espèces du genre Lactobacillus
homofermentaires strict.

b) Les caractères physiologiques et biochimiques :

Regroupent : La quantité et la configuration de l’acide lactique produit, la température de
croissance minimale, optimale et maximale, la tolérance à l’oxygène et au chlorure de
sodium, production de gaz et d’arome, la production d’ammoniaque à partir de l’arginine, la
capacité d’hydrolyser l’esculine ou de résister aux sels biliaires et à différentes valeurs de pH
(Luquet et de Roissard, 1994).

c) Les caractères immunologiques :

La réaction immunologique se traduit par l’agglutination des cellules bactériennes ou par la
précipitation à l’interface antigène-antisérum (de Roissard et Luquet, 1994).

15
 Synthèse bibliographique

La sérologie a été utilisée pour la classification et l’identification des Streptocoques,

depuis que Lancefield (1933), propose les premiers groupements. Les groupes sérologiques
comme le cas des streptocoques lactiques qui sont rangés dans le groupe sérologique N.
d) Les caractères structuraux :
 L’analyse de ces composes cellulaires est entrain de devenir un instrument essentiel
non seulement pour la classification mais aussi pour l’identification des bactéries.
 Les recherches chimiotaxonomiques réalisées sur les bactéries ont contribue de
façon fondamentales à expliquer les relations génétiques intra et inter spécifiques.

7. Exigences nutritionnelles des bactéries lactiques :

Les bactéries lactique sont très exigeantes du point de vue nutritionnelle Elles
requièrent plusieurs substrats complexes azotés, phosphatés et soufrés mais aussi des facteurs
de croissances comme les vitamines et les cations (Desmazeaud, 1983).

7.1 Exigence en vitamines :

Vis-à-vis des vitamines, toutes les espèces de lactobacilles présentent une exigence
absolue pour le pantothénate de calcium (Vitamine B5) et la riboflavine (vitamine B5) (Sauf
pour Lb, revis qui nécessite la thiamine -vitamine B1 et l’acide folique), de plus Lb. lactis, Lb.
bulgaricus et Lb. acidophiles exigent la cobalamine (vitamine B12), Lb. helverticus exige la
pyridoxine (Vitamine B6), Lb. acidophiles l’acide folique, Lb. casei la pyridoxine et l’acide
folique. Les lactocoques ont une exigence en niacine et en acide pantothénique Les
streptocoques thermophiles ont une exigence absolue en acide pantothéniques et en
riboflavine leur croissances est stimulées par la thiamine et la niacine la biotine et la
pyridoxine (Luquet et de Roissard, 1994).

7.2 Exigences en sources azotées :

Chez certaines souches des lactocoques, la production d’acide dans le lait peut être
stimulée par le mélange, adénine, guanine, uracile et xanthine Dans les milieux synthétiques,
les lactobacilles exigent la présence d’adénine, de cytosine, de désoxyguanosine, de guanine,
de thymidine et d’uracile (Law et Kolstad, 1988).

7.3 Influence des cations:

La supplémentassion du lait avec 1 à 2,1 mM en ions Mg++ permet la stimulation de la
croissance de ce thermophiles et Lactococcus lactis et un meilleur taux du servie, cet ion
serait indispensable pour la croissance de Lb. helverticus et essentiel pour celle de Lb. lactis et
Lb. delbrueckii.

16
 Synthèse bibliographique

Le manganèse à lui aussi des effets biologiques importants chez les bactéries lactiques le
manganèse est nécessaire à :
 La structure et fonctionnement des enzymes, dont l’ARN polymérase.
 La détoxication des cellules mises en présence de l’oxygène.
 Le potassium joue un rôle important dans la régulation du pH intracellulaire Cet ion
est exigée pour la croissance de Lb. helvertcus, En. faecalis et Lb. casei.
 Le sodium, quant à lui, exerce un effet sélectif sur les différentes espèces de
bactéries lactiques (Luquet et de Roissard ; 1994).

8. L’intérêt des bactéries lactiques:

8.1 L’aspect Médical: les probiotique:
Ce sont Metchnikoff et Tissier qui ont été les premiers à avancer dans leurs travaux des
propositions scientifiques au sujet de l’utilisation probiotique des bactéries (Lilly et Stillwell,
1965).
L’expression « probiotique » dérive de deux mots grecs ; « pro » et « bios » qui signifient
en faveur de la vie, ce sont des préparations microbiennes vivantes utilisées comme additifs
alimentaires et qui ont une action bénéfique sur l’hôte en améliorant la digestion et l’hygiène
intestinale. Chez les animaux d’élevage, ces produits favorisant le mécanisme biologique
naturel peuvent être une bonne alternative à l’emploi des antibiotiques qui ont été longtemps
utilisés pour améliorer les performances zootechniques et sanitaires de ces animaux mais dont
l’une des conséquences néfastes a été l’apparition de l’antibiorésistance.
Chez l’homme, ces bactéries jouent un rôle inhibiteur contre les bactéries pathogènes et
améliorent la digestion.
L’effet bénéfique est du à plusieurs mécanismes :
 La production d’acides organiques (acide lactique, acétique), de peroxyde
d’hydrogène, et de bactériocines limitent le développement des entérobactéries.
 Certaines souches ont la capacité de déconjuguer les sels biliaires qui sont alors
plus inhibiteurs sur le développement des bactéries pathogènes que les formes
conjuguées.
 Les souches peuvent inhiber l’implantation des germes pathogènes par compétition.
 pour l’adhésion aux cellules intestinales, ce qui permet une colonisation rapide et
dirigée du tube digestif.
 Ces bactéries peuvent réduire l’absorption de substances toxiques (ammoniac,
amines, indole) et peuvent ainsi diminuer les biotransformations des sels biliaires et
des acides gras en produits toxiques.

17
 Synthèse bibliographique

 Les probiotiques peuvent également produire des métabolites susceptibles de

neutraliser « in situ » certaines toxines bactériennes.
 Les probiotiques peuvent stimuler l’activité enzymatique de micro-organismes
endogènes permettant ainsi une meilleure assimilation des aliments.
 Ils peuvent stimuler les cellules du système immunitaire et favoriser la production
d’anticorps qui inhibent ainsi les bactéries pathogènes à la surface des muqueuses
intestinales.
 Certaines souches peuvent posséde une activité anti-cancérigène dont les propriétés
peuvent se répartir en deux catégories :
1- la prévention de l’initiation d’un cancer, soit en détruisant des substances Pré-
cancérigènes présentes dans l’organisme, soit en inhibant les bactéries présentes
dans le tractus digestif, productrices d’enzymes catalysant la conversion de
substances cancérigènes.
2- la suppression de cellules tumorales, soit directement, soit de façon Indirecte, en
favorisant l’activité des macrophages qui sont impliqués dans la destruction des
cellules tumorales.
 Les Lactobacilles excrètent la beta-galactosidase, souvent déficiente dans le tractus
digestif de l’hôte et facilite donc la digestion du lactose (Larpent, 1997).
8.2 L’aspect technologique : les levains
 Acidification par production d’acide lactique.
 Texturation par libération d’exopolysaccharides (yaourts).
 Production d’arômes (acétaldéhyde) (fromages).
 Amélioration des propriétés digestives (Bifidobacterium) (Branger et al.,
2007).
Ils possèdent un pouvoir inhibiteur vis-à-vis des micro-organismes pathogènes ou
d’altération (Larpent, 1997), Leur rôle dans la production des fromages est d’abord la
fermentation du lactose en acide lactique et donc l’acidification du lait pour obtenir le caillé (à
partir d’un pH inférieur à 4.6). D’autre part, les espèces de Lactobacillus comme
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus
thermophilus sont pour la plupart, des espèces homofermentaires. Du fait de leur métabolisme
particulièrement diversifié, elles participent de façon plus importante que les streptocoques
lactiques à la production d’arômes. Leur rôle est essentiel au cours de l’affinage des fromages
car leur concentration au cours de cette étape est forte par rapport à leur concentration dans le
lait et le caillé (Leyral et Vierling, 2007).

18
 Synthèse bibliographique

Tableau 10: Rôle de quelques espèces de Lactobacillus utilisés en industrie (Lamontagne et

al., 2002).
Espèces Emploi en industrie Rôle
Lb. bulgaricus Yogourt – fromage Acidification en cours de production protéolyse en
(mozzarella…) cours de maturation libération du galactose pour le
brunissement production d’arômes et de
polysaccharides (yogourt).
Lb. helveticus Fromages (suisse, Acidification en cours de production prévention de
mozzarella…) l’amertume (peptidase).
Lb. casei Yogourt - fromage Un peu d’acidification en cours de production
(cheddar…) contribution au caractère probiotique.
Lb. acidophilus Yogourt- lait acidophile Acidification en cours de production contribution
au caractère probiotique.
Lb. kefir Kéfir Acidification en cours de production

En industrie, on utilise les levains. Comme les bactéries doivent se multiplier et atteindre
des populations de l’ordre de 105 à 106 cellules/ml pour déclencher le processus fermentaire
désiré, on ajoute le levain, ce qui évite l’attente de la phase de multiplication et prévient le
développement d’autres micro-organismes d’altération (Montel, 2005).
Ces levains sont généralement des cultures mixtes et non des cultures pures, à cause des
bactériophages. Deux types de ferments sont disponibles :
 Ferments mixtes : mélanges non déterminés, provenant généralement de cultures
repiquées de façon traditionnelle, moins sensibles aux phages mais plus difficiles à
uniformiser.
 Ferments définis : souches mélangées dans des proportions précises, il convient de
connaître, outre les caractéristiques de chaque souche, les interactions positives
(comme l’association Streptococcus thermophilus/ Lb. bulgaricus dans le yogourt)
et négatives pour cause d’antagonisme (Lamontagne et al., 2002).

Tableau 11: Critères technologiques de sélection des bactéries lactiques fournis par les fiches
techniques (Lamontagne et al., 2002).

Propriétés de fermentation Résistance/sensibilité autres

Dilution des sucres (homo /hétérofermentation Bactériophages Nomenclature
Ermentation du citrate/production d’arômes NaCl Comportement
symbiotique (cultures
mixtes)
Production de gaz Température (cuisson) Coût
Vitesse d’acidification Phosphates (milieux de culture) Qualité microbiologique
Activité proteinolytique et peptidolytique pH inhibiteur (suracidification lors
de l’entreposage du yogourt)
Production de saccharides Oxygène
Production de bactériocines ou d’autres
inhibiteurs de micro-organismes indésirables
Acidité titrable ou pH indiquant la fin de la
fermentation

19
 Synthèse bibliographique

Les ferments lactiques du genre Lactococcus et Leuconostoc sont mésophiles (leur

croissance optimale se situe entre 25°C et 45°C), un certain nombre de cultures (Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus et
Bifidobacterium) sont dites thermophiles car leur température optimale de croissance se situe
entre 37°C et 47°C.
Connaître la caractéristique du comportement d’une culture selon la température est
cruciale en technologie laitière. La température sert à contrôler les vitesses d’acidification et
constitue un outil important dans la gestion de l’équilibre des flores (Lamontagne et al.,
2002).
Un inconvénient des bactéries lactiques, au niveau industriel, est d’ordre génétique ; à
l’exception des Streptocoques thermophiles, elles possèdent des protéinases liées aux parois
qui les rendent capables d’utiliser les oligopeptides et les protéines du lait. La température, le
pH et la concentration en ions calcium interviennent pour réguler la liaison de la protéinase à
la paroi cellulaire. Les gènes des protéinases ne sont pas situés sur le chromosome bactérien
mais sur des petits fragments d’ADN ou plasmides, qui peuvent être perdus quand les cellules
se divisent en cours de croissance, d’où une instabilité d’autant plus forte que d’autres
caractères technologiques sont aussi codés par des gènes portés par des plasmides (hydrolyse
du lactose, métabolisme du citrate…etc). Pour l’avenir, il faut stabiliser ces caractères
d’acidification, de protéolyse ou de production de composés d’arômes par intégration dans le
chromosome bactérien des gènes portés par les plasmides (Martinet et Houdebine, 1993).
En dépit des progrès récents en technologie et des concepts d’assurance-qualité,
l’application des pratiques d’hygiène dans les ateliers de production de certains produits
alimentaires en Afrique s’est montrée insuffisante pour assurer l’absence des bactéries
d’altération et pathogènes dans le produit final.
Cette problématique a donc incité les chercheurs à développer de nouvelles technologies,
notamment celles qui utilisent des agents biologiques pour réduire les contaminations. Les
bactéries lactiques productrices de bactériocines représentent un modèle de choix pour réaliser
cet objectif (Thonart et al., 2009).

20
 Synthèse bibliographique

Tableau 12: Principales utilisations des bactéries lactiques en agroalimentaires (Caplice et

Fitzgerald 1999 et Ross et al., 2002).

Produits Pays Microorganismes Substrats

Pain
Pain International Saccharomyces cerevisiae, autres levures, Blé, riz et autres céréales
et BL.
San Francisco Lb. sanfrancisco Farine de blé
Produits végétaux
Bongkrek Indonésie Rhizopus oligosporus Noix de coco
Gari Afrique de Corynebacterium manihot, autres levures, Racines de manioc
l’ouest et BL (Lb. plantarum, Streptococcus spp.)
Idli Sud de l’Inde BL (Ln. mesenteroides, E. faecalis) Riz et black gram dhal
Torulopsis, Candida, Trichosporon
pullulans
Kenkey Ghana Inconnu Mais
Kimchi Corée BL Choux, végétaux, noix
Mahewu Afrique du sud BL Mais
Ogi Nigeria BL, Cephalosporium, Fusarium, Mais
Aspergillus, Penicillium spp.,
Saccharomyces cerevisiae, Candida
mycoderma, C. valida, ou C. vini
Sauce de soja Japon, Chine, Aspergillus oryzae ou A. soyae, Soja et blé
Philippines Lactobacillus, Zygosaccharomyces rouxii
Tempeh Indonésie Rhizopus oligosporus Soja
Nan Inde Saccharomyces cerevisiae, BL. Farine
Olives Méditerranée Ln. mesenteroides, Lb. plantarum Olives vertes
Choucroute Europe Lc. lactis, Ln. mesenteroides, Lb. (brevis, Choux
plantarum, curvatus, sake)
Sauce de soja Lactobacillus sp., Aspergillus oryzae et Soja et blé
soyae et Zygosaccharomyces rouxii
Légumes Enterococcus (mundtii, faecium), légumes
Lactococcus (cremoris, lactis),
Pickles Pediococcus, Lb. plantarum Concombres
Bière Saccharomyces cerevisiae, BL Orge, houblon
Vin Oenococcus oenos Raisin
Sake Lb. sake, Lb. homohiochi, Riz
Ln. mesenteroides
Produits laitiers
Fromages International Lc. lactis, Sc. thermophilus, Lb. shermanii Lait de vache, chèvre ou
et Lb. bulgaricus, Propionibacterium brebis
shermanii, Penicillium spp.
Lait fermenté Lb. acidophilus Lait de vache
cheddar Lc. (cremoris, lactis) et Leuconostoc Lait
Suisse Lb. (delbrueckii, bulgaricus, helveticus) Lait
Yoghurt International S. thermophilus, Lb. bulgaricus Lait
Képhir Lactococcus, levure, Lb. kefir (et autres) Lait de vache, de jument
ou de chèvre
Produits carnés et de la pêche
Viandes et Europe (Sud et BL (Lactobacillus, Pediococcus), Viandes de bœuf, porc et
Saucisses Centre, U.S.A. Staphylococcus, autres BL volailles
fermentées
Poissons Lb. (plantarum, casei), Cb. (piscicola, et Poisson
divergens)
Izushi Asie Ln. mesenteroides, Lb. plantarum Poisson, riz, légumes

21
 Synthèse bibliographique

Traditionnellement, les fermiers et les bergers ont fait le fromage à partir du lait cru de
vaches, de chèvres ou de brebis sur une petite échelle, en utilisant les bactéries lactiques
naturelles. Des cultures de ces bactéries ont été produites en incubant le lait ou petit lait à
partir de la veille dans des conditions spécifiques. Aujourd'hui, cette manière traditionnelle de
produire le fromage est toujours présente dans beaucoup de pays européens méditerranéens et
méridionaux; ces fromages sont généralement appelés «artisanaux» (Cogan et al., 1997). Il
n’est pas étonnant de découvrir que les produits fermentés traditionnels des pays subtropicaux
hébergent principalement des bactéries thermophiles, tandis que les produits avec les bactéries
mésophiles proviennent des pays européens nordiques (Wouters et al., 2002). Elles ont été
traditionnellement employées en tant que biopréservateur des produits alimentaires. La
biopréservation se rapporte à la durée de conservation prolongée et la sucurité augmentée des
nourritures obtenues en employant la flore microbienne normale ou supplémentaire et leurs
produits antimicrobiens.
L'utilisation des procédés de fermentation a augmenté durant ces dernières années et inclus
maintenant beaucoup de types d'alimentation que ce soit pour les humains ou les animaux
(Ross et al., 2002 et Schnürer et Magnusson, 2005).

9. Critères de sélection de souches pour l’élaboration des ferments :

Cette sélection s’effectue selon des critères technologiques, les principales fonctions des
ferments étant la production d’acide de gaz et d’arome, la protéolyse, la lipolyse et
l’inhibition de bactérie indésirables. La caractérisation technologique se fait donc sur les
critères suivants :
9.1 Activité acidifiante :
L’acidification et le rôle principal des bactéries utilisées comme ferments celle-ci a différents
buts :
 La coagulation du lait (en facilitant l’action de l’enzyme de la présure) et
l’augmentation de la synérèse du caillé.
 La participation aux propriétés rhéologiques du produit final.
 L’inhibition de la croissance des bactéries nuisibles (Larsen et Anon, 1989 et 1990).
9.2 Activité protéolytique :
Les bactéries lactiques possèdent des protéinases, des peptidasesnécessaire à la dégradation
des protéines du lait en peptides et acides aminés. Ceux- ci peuvent alors être transformés en
alcools et en acides. Cette activité protéolytique intervient de ce fait sur le rendement
fromager, la texture et la saveur typique du fromage et par conséquent sur les caractéristiques
du produit final (Chahbal et al., 1991 et 1993).

22
 Synthèse bibliographique

Dans les fromages, l’activité des enzymes protéolytiques des bactéries lactiques est
fondamentale car elle va participer à la formation du gout ou des aromes : la protéolyse due
aux bactéries lactiques va surtout conduire à des peptides court et à des acides aminés libres
Ces derniers sont des précurseurs pour de nombreux produits d’aromes. En effet, la
méthionine peut conduire à des composés soufrés caractéristiques. Ceci après leur dégradation
par la flore d’affinage (Schirch et al., 1985 et Ott et al., 1997).
9.3 Pouvoir aromatisant et pouvoir gazeux :
Certaines bactéries lactiques sont capables de produire des composés d’aromes qui participent
aux qualités organoleptiques des fromages. La plupart des composés d’arome sont issus du
métabolisme du citrate : l’acétoïne et le diacétyle sont les plus importants (Tamime, 1990).
9.4 Résistance aux bactériophages :
Les phages, virus des bactéries, sont des parasites obligatoires. Ils constituent l’une des
principales causes de perturbation de l’acidification du lait par les bactéries lactiques. Il est
nécessaire que les bactéries lactiques composant les ferments ne soient pas toutes sensibles
aux mêmes phages pour diminuer les risques d’accidents de fabrication.

9.5 Activité bactériostatique : production de bactériocines :

Les bactériocines, telles que la nisine ou la pédiocine, sont des molécules de nature protéique
dont l’action bactériostatique est spécifique de quelques espèces bactériennes. Ces substances,
élaborées par certaines bactéries, inhibant ainsi la croissance de différentes souches de
bactéries pathogènes (Listeria et Clostridium), contribuant aussi à la préservation de
l’équilibre microbien et organoleptique du fromage. Les bactéries lactiques produisent des
substances antimicrobiennes de nature protéique appelées bactériocines Cette caractéristique
est utilisées industriellement pour la destruction des bactéries indésirables et pathogènes dans
la fabrication d’aliment comme la nisine produite par les lactocoques dirigée contre Bacillus
et Clostridium, la plantaricine et la sakacine produites toutes les deux par les lactobacilles
actives sur E. coli, Listeria et certaines levures (Nes et al., 1996).
9.6 Résistance aux antibiotiques :
La présence d’antibiotiques dans le lait (pénicilline, vancomycine…etc) peut être due au
traitement des immunités. La plupart des bactéries y sont sensibles. Mais, de plus en plus on
voit l’émergence de souches résistantes à ces antibiotiques, surtout dans le genre
Enterococcus. Il n’est pas souhaitable de sélectionner, dans la composition des ferments, des
souches résistantes aux antibiotiques, car, ingérées par l’homme, elles sont susceptibles de
transférer ces caractères aux autres bactéries du tube digestif. De plus, l’augmentation de
l’ingestion d’antibiotiques par l’homme peut entrainer des risques d’allergies.

23
 Synthèse bibliographique

Enfin, des bactéries résistantes aux antibiotiques peuvent avoir, en plus, perdu certaines de
leurs caractéristiques originelles.

10. Les lactobacilles :

Caractéristiques générales :
Les bactéries du genre Lactobacillus ont des aspects variés allant du bacille long et fin au
coccobacille en passant par la forme bâtonnet court ou légèrement flexueux. Ils sont Gram
positif, non sporulés, fréquemment associés en chaînettes et habituellement immobiles. Les
lactobacilles se montrent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques
(Siegumfeldt et al., 2000). Cette différence pourrait s’expliquer par un pH optimal plus faible
pour l’enzyme chargée de réguler le pH intracellulaire (translocation de protons par une
ATPase) chez les lactobacilles (Nannen et al., 1991). Le métabolisme des sucres chez
Lactobacillus est hétéro- ou homofermentaire.

10.1 Sous genre Lactobacillus homofermentaires : Streptobacterium

- Lactobacillus casei : Les cellules de cette espèce sont des bâtonnets courts, soit isolés ou par
paires, soit assemblés en plus ou moins longues chaines (jusqu’à 100 éléments). Ils troublent
les milieux de façon homogène, le sédiment étant volumineux; de l’acide L (+) Lactique est
formée, cette espace contient deux variétés : Lactobacillus casei var- casei : espace type
Lactobacillus casei var- fusiformis. La morphologie est variable : Les cellules sont en parties
cylindriques, partie fusiformes, leur donnant une forme de citron. Les cellules sont isolées ou
en courtes chainettes.

- Lactobacillus plantarum : ce sont des bâtonnets courts, coccoides, isolés ou en paires, qui
forment les isomères de l’acide lactiques DL.

- Lactobacillus coryniformis : Les cellules sont courtes, généralement quelque fois longues
de 8µ, isolées ou groupées en courtes chaines (8 éléments); elles ont tendance à se grouper en
amas. On distingue deux variétés : Lb. coryniformis var. coryniformis et Lb coryniformis var.
torquens.

10.2 Sous genre Lactobacillus hétérofermentaires : Betabacterium.

Ce sous genre comprend l’ensemble des Lactobacillus isolés en brasserie comme Lb.
pastorianus.

24
 Synthèse bibliographique

Lactobacillus brevis : ils sont présentent sous la forme de bâtonnets assez allongés
(quelques fois leur longueur atteint 100µ), isolés ou en paires, présentant des formes en V
caractéristiques, ne forment pas de chaines. Cette espèce fermente vigoureusement avec
dégagement de CO2, le glucose, le maltose et l’arabinose, elle forme l’acide DL lactique.

Tableau 13: Classification des lactobacilles (Kandler et Weiss in : Sneath et al., 1986)

Les groupes Caractéristiques Les complexes Exemple : espèces et sous-espèces

Groupe I Homofermentaires strict Lb. delbrueckii Trois sous-espèces :
fermentent les hexoses par voie delbruckii, lactis, bulgaricus
E.M.P, ne fermentent ni Lb. acidophilus Lb. acidophilus, Lb.heverticus Lb.
gluconate ni les pentoses. amylovorus, Lb.crispatus, Lb.
gassaeri, Lb. gallinarum, Lb.
johnsonii
Autres espèces Lb. intestinalis, Lb. jonsonii,
Lb.aviarius, Lb. hamsteri
Lb. kefiranofaciens, Lb. mali, Lb.
acetotolerans,
Lb. ruminus, Lb. vitulinus.
Groupe II Hétérofermentaires facultatifs, Lb. plantarum Lb. plantarum, Lb. pentosus et Lb.
fermentent les hexoses par agilis
E.M.P et les pentoses Lb. casei Lb. casei, Lb. paracasei, Lb.
rhamnosus.
Lb.bavaricus Lb. bavaricus, Lb. curvatus, Lb. sake
Autres espèces Lb.uli, Lb.graminis.
Groupe III Hétérofermentaires stricts Lb. fermentum Lb.fermentum, Lb.cellobiosis,
fermentent les hexoses et les Lb.reuteri et Lb.vavaginalis.
pentoses. Lb. brevis Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. kefir Lb.
hilgardii, Lb. collinoides Lb. oris, Lb.
sanfrancisco Lb. malfermentans.
Autres espèces Lb. fructivorans, Lb. suebicus, Lb.
bifermentans (seule espèce capable,
selon le pH, de dégrader le glucose en
acide acétique).

Lactobacillus buchneri : c’est une espèce caractérisée par son polymorphisme marqué: les
cellules sont isolées, ou en paires, ou en courtes chainettes, les dimensions sont très variables,
elles forment l’acide lactique.

10.3 Sous genre lactobacilles obligatoirement homofermentaires :

 Thermobacterium :
Les hexoses sont fermentés exclusivement par la voie d’Embden-Meyerhoff en acide
lactique, les pentoses et les gluconates ne sont pas assimilés (Apria, 1979).

25
 Synthèse bibliographique

Tableau 14 : Principales espèces et sous espèces de lactobacilles utilisées en industrie

laitière. (Lb. : Lactobacillus). (Kandler et al., 1986)

Croissance
Espèces Fermentation du
A 15°C A 45°C
lactose

Lb. helveticus - +
Lb. delbruekii subsp. bulgaricus - +
Lb. delbruekii subsp. lactis - + Thermophile
Lb. acidophilus Homofermentaire - +
Lb. casei + -
Lb. plantarum + -
Lb. kefiri + - Mésophile
Lb. brevis Hétérofermentaire + -
Lb. fermentum - + Thermophile

A B C

Figure 6: Aspect morphologique de Lactobacillus acidophilus (A), Lactobacillus helveticus

(B) et Lactobacillus casei(C) observées au microscope électronique (G×1250) (Kandler et al.,
1986)

Tableau 15: Caractéristiques physiologiques de quelques espèces de Lactobacillus utilisés en

industrie (Lamontagne et al., 2002)

espèces pH optimal de Température Température Activité de

croissance optimale de maximale de l’eau (Aw)
croissance croissance
Lb. helveticus 5.5 – 6 43 – 46 52 -
Lb. casei - 30 – 37 < 45 -
Lb. acidophilus 5.5 – 6 - - -
Lb. bulgaricus 5.5 - 6 43 – 46 52 0.95
Lb. kefir - 30 45 -

Tableau 16: Critères différentiels des trois groupes de Lactobacillus (Larpent, 1997)
Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium
ADH - +/- +
Glucose (gaz) - - +
Glucosides +/- + -
Gluconates (gaz) - + +
Aldolase + + -
Pentoses - +/- +/-
Thiamine - - +
Acide lactique DL ou L D ou DL DL
G+C% 34.7 – 50.8 33 – 46.4 35 – 53.4

26
 Synthèse bibliographique

11. Utilisation des lactobacilles en industrie laitière :

Parmi le genre Lactobacillus, la sous espèce bulgaricus, indispensable à la préparation du
yaourt selon la définition du Codex Alimentarius de 2003, est la plus utilisée en industrie
laitière. A titre d’exemple, la production européenne de yaourts a atteint près de 2 millions de
tonnes en 1997 pour 6.34 millions de tonnes de fromages (tous types confondus). Pour
quelques pays, dont la Finlande, la Suède et la Bulgarie, la proportion de yaourts est
supérieure à celle des fromages. En fromagerie, les lactobacilles sont généralement utilisés
pour la préparation de pâtes dures ou semi-dures typiques des fromages suisse et italien.
Jusque dans les années 80, quelques espèces de Lactobacillus étaient considérées comme des
contaminants (ou NSLAB pour Non-Starter Lactic Acid Bacteria) (Tab 17). Dans les années
1990, plusieurs auteurs ont démontré que ces espèces participaient à l’affinage des fromages
par leur activité protéolytique, et la formation d’arômes qui en résulte (Lane et al., 1996).
Cependant, l’arrivée des techniques de traitement du lait de fromagerie, telle que la
pasteurisation basse température couplée à la microfiltration, a contribué à une diminution
significative dans le lait de ces NSLAB. Cette constatation a incité les producteurs de
ferments fromagers à développer et commercialiser de nouvelles cultures, dites auxiliaires,
contenant des souches de Lactobacillus capables d’accentuer et d’accélérer l’affinage des
fromages (El Soda et al., 2000). Les mécanismes enzymatiques impliqués dans l’activité
protéolytique des lactobacilles sont moins documentés que ceux de Lc. lactis sp. Toutefois,
les voies métaboliques empruntées par ces deux genres bactériens semblent relativement
proches (Pritchard et al., 1993). La protéolyse est cependant plus prononcée pour les
lactobacilles (Marilley et al., 2004). Ces dernières années, de nombreuses études ont été
menées sur le caractère probiotique des souches de bactéries lactiques.
La définition d’un probiotique, proposée par Guarner et al., (1998), est la suivante : tout
microorganisme vivant qui, une fois ingéré en certaine quantité, exerce des effets bénéfiques
sur la santé au-delà des fonctions nutritionnelles de base. Un groupe majeur constitué de 12
espèces de Lactobacillus figure parmi les bactéries considérées comme probiotiques
(Holzapfel et al., 2001). De nombreux produits alimentaires et préparations contenant des
souches probiotiques de Lactobacillus sont commercialisés (Tab17). Les souches probiotiques
commerciales sont majoritairement véhiculées à travers les produits laitiers (Tab 17).

27
 Synthèse bibliographique

Différentes raisons peuvent expliquer ce choix pour le consommateur (Heller, 2001):

 les produits laitiers fermentés sont perçus comme bénéfiques pour la santé.
 les consommateurs sont habitués au fait que les produits fermentés contiennent des
microorganismes vivants.
 les probiotiques utilisés comme agent de fermentation combinent les images
positives probiotique et fermentation.
 l’image bénéfique pour la santé des produits de type yaourt facilite la
recommandation d’une consommation quotidienne. D’un point de vue
technologique, les procédés utilisés pour la préparation des produits laitiers
fermentés sont déjà optimisés pour permettre la croissance des microorganismes
nécessaires à la fermentation. Par conséquent, la technologie existante ne nécessite
pas de changements majeurs afin de garantir la survie des probiotiques dans le
produit.
Tableau 17: Utilisations commerciales et effets bénéfiques de quelques souches de
Lactobacillus probiotique (Prioult, 2003).

Souches Produits Effets observes chez l’humain

Lactobacillus rhamnosus (GG) Yaourts à boire Prévention des allergies
Yaourts Traitement des allergies
Capsules Stimulation de la production d’IL-10,
Diminution de l’incidence des diarrhées
Diminution des diarrhées à rotavirus
Lactobacillus johnsonii (La1) Yaourts à boire Inhibition du développement
(Lj1) Yaourts d’Helicobacter pylori, Stimulation de
l’activité phagocytaire.
Lactobacillus casei (Shirota) Yaourts à boire Augmentation de l’activité des cellules NK,
Laits fermentés Diminution des diarrhées à rotavirus.
Lactobacillus acidophilus Laits fermentés Diminution des diarrhées infantiles, Facilite
(NCFM) Yaourts la digestion du lactose
Formules infantiles
Capsules
Lactobacillus plantarum (229v) Jus de fruits Prévention des maladies cardiovasculaires
Lactobacillus casei (DN-114 001) Yaourts à boire Stimulation de la production d’IgA
Diminution de l’incidence des diarrhées
12. Composés antimicrobiens produits par les bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques produisent divers composés tels que les acides organiques, le
diacétyle, le peroxyde d'hydrogène, le CO2 et/ou les bactériocine pendant les fermentations
lactiques (Talarico et Dobrogosz, 1989; Lindgren et Dobrogosz, 1990; Piard et Desmazeaud,
1991; Anderssen et al., 1998; Sholeva et al., 1998; Ouwehand, 1998; Zhennai, 2000; Oyetayo
et al., 2003 et Deegan et al., 2006).
Les mécanismes antimicrobiens spécifiques des bactéries lactiques exploitées dans la
biopréservation des nourritures incluent la production des acides organiques, du peroxyde

28
 Synthèse bibliographique

d'hydrogène, de l'anhydride carbonique, du diacétyle, des antimicrobiens à large spectre tels

que la reutérine et la production de bactériocines (de Vuyst et Vandamme, 1994 b; Stiles,
1996; Jacobsen et al., 2003 et Vermeiren et al., 2004).
Les composés antimicrobiens produits par les BL peuvent empêcher la croissance des
bactéries pathogènes; contaminants possibles des produits fermentés (Smith et Palumbo,
1983; Andersson, 1986; Adams et Hall, 1988; Raccach et al., 1989; Berry et al., 1995; Cintas
et al., 1998; Gill et Halley, 2003 et Guessas et al., 2006).
12.1 Acides organiques :
L'acide lactique est le métabolite principal des BL causant la réduction du pH qui inhibe
largement de microorganismes (Eklund, 1989 et Schnürer et Magnusson, 2005). La forme non
dissociée et plus hydrophobe de l'acide se répand au-dessus de la membrane des cellules et se
dissocie à l'intérieur de la cellule, libérant les ions H+ qui acidifient le cytoplasme (Piard et
Desmazeaud, 1991). En plus de l'effet du pH, l'acide non dissocié fait chuter le gradiant
électrochimique de proton, entraînant la bactériolyse et finalement la mort des bactéries
sensibles (Eklund, 1989).
Les BL hétérofermentaires produisent en plus, de l'acide acétique qui possède un plus haut
pKa que l'acide lactique, ont donc une proportion plus élevée d'acide non dissocié à un certain
pH semblable avec l'acide lactique. Les acides acétiques et propioniques agissent l'un sur
l'autre sur les membranes de cellules pour neutraliser le gradiant électrochimique de proton,
mais l'effet de l'acide acétique et propioniques dépend souvent de la diminution du pH
provoqué par l'acide lactique (Eklund, 1989).
L'acide propionique réduit la croissance fongique, particulièrement à un pH inférieur, et
affecte les membranes fongiques aux valeurs de pH en dessous de 4,5. L'acide propionique et
acétique empêchent également l’assimilation d'acide aminé (Freese et al., 1973 et Eklund,
1989).
L'acide lactique produit pendant la croissance des BL et l'acétate de sodium contenu dans
le MRS (de Man et al., 1960), peuvent avoir des effets antifongiques synergiques (Cabo et al.,
2002).
De toute façon, les effets inhibiteurs des acides organiques tels que l'acide lactique,
acétique et propionique continueront à compliquer des études sur des effets antimicrobiens
des BL, à moins que d'autre purification et caractérisation rigoureuses des substances soit
appliquée (Magnusson et Schnürer, 2001; Magnusson et al., 2003 et Schnürer et Magnusson,
2005).
La fermentation par les BL est caractérisée par l'accumulation d’acides organiques qui
s’accompagne d'une réduction du pH (Gould, 1991 et Podolak et al., 1996).

29
 Synthèse bibliographique

Les niveaux et les types d'acides organiques produits pendant les fermentations dépendent
de l'espèce, de la composition du milieu et des conditions de croissance (Lindgren et
Dobrogosz, 1990).
Le pH bas externe cause l'acidification du cytoplasme des cellules, alors que l'acide non
dissocié étant lipophile, peut se répandre passivement à travers la membrane (Kashket, 1987).
L'acide non dissocié agit en effondrant le gradient électrochimique de proton, ou en
changeant la perméabilité de la membrane des cellules (Smulders et al., 1986 et Earnshaw,
1992).
L'effet inhibiteur spécifique des acides organiques est généralement attribué à leur forme
dissociée et non dissociée. Cette forme pénètre librement dans la cellule où elle s'ionise ce qui
provoque un abaissement du pH interne et le blocage de certains mécanismes de transport
(Parente et al., 1994). Dans le cas de l'acide lactique, les concentrations en acide non dissocié
nécessaire pour provoquer une inhibition sont pour les levures, les Enterobacteriaceae et les
Microccocaceae de l'ordre 1 mM; pour les moisissures de 3 mM; et pour les Bacillaceae de 4
Mm (Baird-Parker, 1980 et Adams et Hall, 1988).
L'acide lactique est le métabolite principal de la fermentation des BL où il est en équilibre
avec ses formes dissociée et non dissociées, et l'ampleur de la dissociation dépend du pH. A
pH bas, une grande quantité d'acide lactique est sous la forme non dissociée, et elle est
toxique à beaucoup de bactéries, champignons et levures (Podolak et al., 1996).
Cependant, le comportement des différents micro-organismes vis-à-vis de l'acide lactique
varient considérablement. L’acide lactique à pH 5,0, a un effet inhibiteur contre les bactéries
sporulées mais il est inefficace contre les levures et les champignons (Woolford, 1975).
L'antagonisme est censé résulter de l'action des acides sur la membrane cytoplasmique
bactérienne qui interfère l'entretien du potentiel de membrane et empêche le transport actif
(Sheu et al., 1972; Eklund, 1989 et de Vuyst et Vandamme, 1994 a), et peut être négocié par
l'acide dissocié et non dissocié (Cherrington et al., 1991).
Les stéréoisomères de l'acide lactique diffèrent également dans l'activité antimicrobienne,
l’acide lactique L étant plus inhibiteur que l’isomère D (Benthin et Villadsen, 1995).
Les bactéries hétérofermentaires produisent des quantités d'acide organique autre que
l'acide lactique. Les leuconostocs, et les lactobacilles hétérofermentaires produisent autant
d'acétate que de lactate (Kandler, 1983).
L'acide acétique est fortement inhibiteur pour les nombreux microorganismes et la
présence simultanée d'acide lactique pourrait avoir un léger effet de synergie. L'acide acétique
également agit en synergie avec l'acide lactique; l'acide lactique diminue le pH du milieu,
augmentant de ce fait la toxicité de l'acide acétique (Adams et Hall, 1988).

30
 Synthèse bibliographique

Les bactéries nocives et pathogènes ne peuvent pas se développer dans un environnement

acide. Ainsi le pH minimum de croissance peut varier d'une bactérie à une autre. Dans les
produits fermentés, la baisse du pH dépend de la concentration en substrat fermentescible.
Elle est limitée par le pouvoir tampon du milieu et par le pH minimum toléré par les ferments.
Le pH atteint dans certains de ces produits (yaourt, pH:4; saucisson sec, pH 4,5 à 5,3) suffit
à éliminer certains contaminants (Huang et al., 1986).
Les acides acétiques et propioniques produits par les BL par les voies hétérofermentaires,
peuvent agir sur les membranes, et causent l'acidification intracellulaire et la dénaturation des
protéines (Huang et al., 1986).
Ils ont un effet antimicrobien plus fort que l'acide lactique dus à leurs valeurs plus élevées
de pKa (acide lactique 3,08, acide acétique 4,75, et acide propioniques 4,87), et un
pourcentage plus élevé d'acides non dissociés à un pH donné (Earnshaw, 1992).
L'acide acétique est plus inhibiteur que l’acide lactique et l’acide citrique envers Listeria
monocytogenes (Richards et al., 1995), et envers la croissance et la germination de Bacillus
cereus (Wong et Chen, 1988).
12.2 Acides gras :
Dans certaines conditions, quelques lactobacilles et lactocoques possédant des activités
lipolytiques peuvent produire des quantités significatives d'acides gras, par exemple dans la
fermentation du lait fermenté (Rao et al., 1984) et des saucisses sèches (Sanz et al., 1988).
L'activité antimicrobienne des acides gras a été identifiée pendant plusieurs années. Les
acides gras insaturés présentent une activité contre les bactéries à Gram+, et l'activité
antifongique des acides gras dépend de la composition, de la concentration, et du pH du
milieu (Gould, 1991).
12.3 Peroxyde d'hydrogène :
En général, les bactéries lactiques sont capables de transformer l’oxygène moléculaire (O2) en
super oxyde excité (O2*), en peroxyde (H2O2) ou en eau (H2O). Ces réactions sont catalysées
par des enzymes spécifiques généralement en présence d’un substrat à oxyder. Ces enzymes
ont été trouvées chez des souches de Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc
et Pediococcus (Condon, 1987).
Le peroxyde d'hydrogène est produit par les BL en présence de l'oxygène sous l'action de
la flavoprotéine oxydase du nicotinamide adénine hydroxyperoxydase dinucléotide (NADH).
L'effet antimicrobien de H2O2 peut résulter de l'oxydation des groupes sulfhydriliques
causant la dénaturation d'un certain nombre d'enzymes, et de la peroxydation des lipides de
membrane; de ce fait provoque l'augmentation de la perméabilité de la membrane (Kong et
Davison, 1980).

31
 Synthèse bibliographique

H2O2 peut également agir comme précurseur pour la production de radicaux libres
bactéricides tels que le superoxide (O2) et radicaux d'hydroxyle (OH) qui peuvent
endommager l'ADN (Byczkowski et Gessner, 1988).
Dans le lait cru, H2O2 active le système de lactoperoxydase produisant le hypothiocyanate
(OSCN-, des oxyacides plus élevés (O2SCN- et O3SCN- et produits intermédiaires d'oxydation
qui sont inhibiteurs à une gamme étendue de bactéries à Gram+ et à Gram- (Reiter et Härnulv,
1984 et Conner, 1993). H2O2 peut s'accumuler et devenir inhibiteur pour quelques
microorganismes (Condon, 1987). Cette accumulation résulte d'un déséquilibre entre les
moyens de synthèse et de dégradation.
Le peroxyde d'hydrogène peut aussi activer le système lactoperoxydase avec la formation
de l'hypothiocyanate et d'autres agents antimicrobiens (de Vuyst et Vandamme, 1994 b). L'ion
hypothiocyanate est un très puissant antimicrobien qui agit aussi bien sur les bactéries à
Gram+ que sur les bactéries à Gram-.
La production de H2O2 par Lactobacillus et Lactococcus inhibe la croissance de
Staphylococcus aureus, de Pseudomonas sp. et de divers microorganismes psychrotrophes
(Davidson et al., 1983). L'inhibition est négociée par l'effet d'oxydation fort sur des lipides de
membrane et des protéines cellulaires (Morris, 1976 et Lindgren et Dobrogosz, 1990).
Le peroxyde d'hydrogène peut également activer le système lactoperoxydase du lait frais
avec la formation de l’hypothiocyanate et d'autres agents antimicrobiens (Reiter et Härnulv,
1984; Pruitt et al., 1986 et Condon, 1987).
La quantité de peroxyde d'hydrogène produite par les bactéries lactiques dépend en grande
partie de la souche et la disponibilité de l'oxygène (Helander et al., 1997).
12.4 Dioxyde de carbone (CO2) :
Il est principalement produit par les BL hétérofermentaires. Le mécanisme précis de son
action antimicrobienne est toujours inconnu. Cependant, le CO2 peut jouer un rôle
antimicrobien en créant un environnement anaérobique, qui empêche les décarboxylations
enzymatiques, et l'accumulation de CO2 dans le milieu peut causer un dysfonctionnement de
la perméabilité (Eklund, 1984).
Le CO2 peut aussi empêcher la croissance de beaucoup de microorganismes de
détérioration, particulièrement les bactéries psychrotrophes à Gram- (Farber, 1991 et
Hotchkiss et al., 1999). Le degré d'inhibition par le CO2 varie considérablement selon les
espèces. Un taux de CO2 de 10% pourrait diminuer la population bactérienne de 50%
(Wagner et Moberg, 1989), et entre 20 et 50%, il a une forte activité antifongique (Lindgren et
Dobrogosz, 1990).

32
 Synthèse bibliographique

12.5 Composants aromatiques :

Certaines bactéries lactiques sont capables de produire des composés d’arômes qui
participent aux qualités organoleptiques des fromages. La plupart des composés d’arôme sont
issus du métabolisme du citrate: l’acétoïne et le diacétyle sont les plus importants.
12.5.1 Diacétyle :
Il est produit par des souches de Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis par la
fermentation du citrate (Lindgren et Dobrogosz, 1990 et Cogan et Hill, 1993). Il est
responsable de l'arome et de la saveur du beurre et de quelques autres produits laitiers
fermentés. Les niveaux sensoriels acceptables du diacétyle sont de 2 à 7 μg/ml (Earnshaw,
1992).
Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc, de Lactococcus,
de Pediococcus et de Lactobacillus peuvent produire le diacétyle bien que la production soit
réprimée par la fermentation des hexoses (Cogan, 1986). Son utilisation pratique en tant que
conservateur est limitée.
Cependant, le diacétyle peut agir synergiquement avec d'autres facteurs antimicrobiens
(Jay, 1992) et contribuer aux systèmes combinés de conservation en nourritures fermentées.
Les bactéries à Gram- sont plus sensibles au diacétyle que les bactéries à Gram+; 200 μg/ml et
300 μg/ml respectivement (Jay, 1982). Une concentration de 344 μg/ml a empêché la
croissance des souches de Listeria, Salmonella, Yersinia et Escherichia coli. L'effet
antimicrobien du diacétyle a été connu depuis les années 30. Il empêche la croissance des
bactéries à Gram- en affectant l'utilisation de l'arginine (Jay, 1986).
Le diacétyle a été démontré pour être un antimicrobien efficace contre un éventail de
bactéries Gram négatives et Gram positives, bien que les bactéries lactiques soient
généralement résistantes (Gill et Halley, 2003). Les quantités de diacétyle produites par Lc.
lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis varient de 0,07 à 3,72 ppm (Burrow et al., 1970).

12.5.2 Acétaldéhyde
Chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, l'action d'une thréonine aldolase, clive la thréonine
en acétaldéhyde et en glycine. L'acétaldéhyde à une concentration de 10 à 100 ppm empêche
la croissance de Staphylococcus aureus, de Salmonella typhimurium et d’E. coli dans les
produits laitiers (Piard et Desmazeaud, 1991).
Les quantités d'acétaldéhyde produites par les lactocoques oscillent entre 2,60 et 6,50
mg/ml (Bottazzi et Dellaglio, 1967). La contribution de l'acétaldéhyde à la biopréservation est
mineure puisque le seuil de saveur est beaucoup inférieur aux niveaux qui sont considérés
nécessaires à l'inhibition des microorganismes (Kulshrestha et Marth, 1974).

33
 Synthèse bibliographique

12.5.3 Reutérine :
La reutérine est produite par Lactobacillus reuteri, une espèce hétérofermentaire dont la
niche écologique est l'appareil gastro-intestinal des humains et des animaux (Axelsson et al.,
1989). La reutérine est formée pendant la croissance anaérobique de Lb. reuteri par l'action de
la glycérol déhydratase (Fig. 7) qui catalyse la conversion du glycérol en reutérine (Talarico et
al., 1988). La reutérine est produit pendant la phase stationnaire de Lactobacillus reuteri dans
un milieu contenant du glucose et du glycérol ou du glycéraldéhyde. Elle a été chimiquement
identifié pour être le 3-hydroxypropanal (α- hydroxypropionaldéhyde), un composé fortement
soluble à pH neutre qui est en équilibre avec ses formes dimères monomériques et cycliques
hydratées (Axelsson et al., 1989, Talarico et Dobrogosz, 1989).
La reutérine montre un large spectre d'activité antimicrobienne contre certaines bactéries à
Gram+ et à Gram-. Les organismes de détérioration sensibles à la reutérine comprennent
Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, et Trypanosoma
(Axelsson et al., 1989).
13. Les interactions entre les souches de bactéries lactiques :
Lorsque les bactéries lactiques sont utilisées en cultures mixtes pour la fermentation du
lait, des interactions entre les différentes souches se manifestent. Ces interactions sont
généralement classées en deux groupes : l’antagonisme et la stimulation. Les points suivants
ne se veulent pas une liste exhaustive des interactions rencontrées lors de la fabrication
fromagère mais un résumé des principales observations résultant de l’association de bactéries
lactiques dans un même levain (Grattepanche, 2005).
CH2OH

Glycérol CHOH

CH2OH

Glycérol déhydratase

OH
OH
COH

HCOH O
O
CH2

CH2 OH
CH2
Forme hydratée 3-Hydroxypropanol Dimère cyclique
CH2OH

Figure 7 : Voie de biosynthèse de la reutérine (Talarico et al., 1988).

34
 Synthèse bibliographique

13.1 Les phénomènes d’antagonisme :

La fermentation est historiquement utilisée comme un mode de conservation des aliments.
Durant la fermentation du lait, différents agents antimicrobiens ayant la capacité d’inhiber le
développement de bactéries pathogènes et/ou d’une flore de dégradation de l’aliment sont
produits par les bactéries lactiques. Cependant, lorsqu’ils atteignent une certaine
concentration, ces composés peuvent interrompre la croissance des souches productrices, il
s’agit d’autoinhibition, et/ou des autres souches constituant le levain.
Ces interactions négatives faisant intervenir la production de substances inhibitrices sont
connues sous le nom d’amensalisme. C’est notamment le cas des acides organiques issus des
mécanismes homofermentaire et hétérofermentaire des bactéries lactiques.
L’inhibition peut aussi résulter de la production de peroxyde d’hydrogène car
contrairement à d’autres genres bactériens, les bactéries lactiques sont dépourvues de catalase
capable de dégrader ce composé toxique. L’action inhibitrice du peroxyde d’hydrogène peut
être renforcée par le système lactoperoxydase-thiocyanate présent naturellement dans le lait
(Gilliland, 1985).
Le thiocyanate est oxydé, en présence d’H2O2, en un composé bactériostatique pour les
bactéries Gram positif. Les bactériocines, produites par quelques souches de bactéries
lactiques, sont également des agents inhibiteurs très puissants dont le spectre d’activité
s’étend de souches phylogénétiquement proches de la souche productrice à des espèces
génétiquement plus éloignées. Pour assurer leur développement dans le lait, les lactocoques
possèdent un système protéolytique capable de dégrader les caséines en acides aminés.
Comme nous l’avons vu précédemment, ils existent deux types de protéinases PI et PIII. En
culture mixte dans le lait, la population bactérienne possédant la protéinase de type PIII
domine sur le type PI.
Ce déséquilibre résulterait d’une inhibition de la synthèse de l’enzyme PI ou d’un
phénomène de compétition pour les peptides relâchés par les deux types d’enzyme au niveau
du système de transport des oligopeptides (Opp) (Flambard et al., 1997).

35
 Synthèse bibliographique

Tableau 18: Composés antimicrobiens (LMM) produits par les bactéries lactiques (Yang,
2000).

Souches Milieu Composé antimicrobien PM (Da) Spectre

Lb. casei subsp. casei MRS petits antibiotiques, <1000 E. coli et

peptides et acides Streptococcus mutans
organiques
Lb. acidophilus 2181 Lait Acidoline ~200 Entérocoques

Lb. delbrueckii subsp. Lait Bulgaricane <700 Spectre large

bulgaricus DD14

Lb. delbrueckii subsp. Lait Composé non lactique < 700 Pseudomonas fragi et
bulgaricus 7994 avec un groupe possibilité Staphylococcus
aromatique aureus
Lb. plantarum VTT E- MRS composés LMM <1000 Pantoea agglomerans
78076
Lb. rhamnosus GG MRS composé like microcine Fusarium avenaceum

Lb. reuteri 1063 Glycérol 3-Hydroxypropanal, 74 Spectre large

forme hydratée 92
et dimère (reutérine) 148
Lc. lactis subsp. lactis lait composés cationiques 100 - 300 Pseudomonas et E.
biovar. diacetylactis coli
DRC-1
Lc. lactis subsp. lactis Extrait levure Composés ninhydrines 385 Spectre large
biovar. diacetylactis S1- + glucose
67/C

Les phénomènes de compétition constituent la deuxième catégorie des interactions

négatives fréquemment rencontrées lors de la fermentation du lait par une culture mixte.
Certains nuppiments présents dans le lait en faibles quantités et indispensables à la croissance
bactérienne, peuvent être consommés préférentiellement par un groupe microbien aux dépens
d’un autre.
C’est le cas notamment des matières azotées nonprotéiques (NPN de l’anglais Non-
Protein-Nitrogen) regroupant l’urée, des acides aminés, de courts peptides et les bases azotées
adénine, guanine, uracile et xanthine.
La concentration en NPN dans le lait ne supporte la croissance que d’une faible densité
cellulaire de bactéries lactiques. Juillard et al. (1990 et 1991) ont ainsi observé que la
croissance d’une souche de lactocoque dans le lait ayant déjà préalablement servi à la
préculture de la souche était inférieure à celle réalisée dans du lait frais. Ce phénomène
s’explique par l’épuisement de la fraction azotée de faible poids moléculaire durant la
préculture (Juillard et al., 1990).
13.2 Les phénomènes de stimulation :
Les phénomènes de stimulation sont divisés en plusieurs catégories. On distingue le
commensalisme, lorsqu’une population est stimulée par la production d’une substance

36
 Synthèse bibliographique

essentielle ou la destruction d’un facteur inhibiteur par une autre population et le mutualisme
ou la protocoopération, lorsque l’interaction est positive pour chacune des populations.
Dans le cas du mutualisme, l’interaction est nécessaire à la survie des populations
contrairement à la protocoopération où l’interaction présente un caractère facultatif (Choisy et
al., 1997).
L’interaction entre les lactobacilles et les streptocoques thermophiles est particulièrement
mise à profit pour la fabrication des yaourts. Dans un premier temps, les lactobacilles se
développent puis, leurs activités protéolytiques et aminopeptidasique permettent de stimuler la
croissance des streptocoques. Ceci se vérifie également pour des souches de lactocoques
protéinase positive (Prt+) et négative (Prt-) associées en culture mixte. Certains variants de
lactocoques présentent une déficience dans leur système protéolytique résultant, notamment,
de la perte des plasmides codant en partie pour la protéinase de paroi (Prt-) et le système de
transport Opp (Yu et al., 1996).
En cultures mixtes dans le lait, la croissance des deux variants est similaire tant que la
concentration en NPN est suffisante. Dans un second temps, lorsque la source de NPN est
épuisée, la croissance du variant Prt– est stimulée, comparativement à une culture pure, par
l’activité protéolytique du variant Prt+ qui favorise la libération de fractions azotées de faible
poids moléculaire utilisables directement par les cellules.
Cependant, l’hydrolyse des caséines par les souches Prt+ est trop faible pour assurer une
croissance maximale des deux souches. Par conséquent, le développement du variant Prt+ se
trouve inhibé par compétition pour les oligopeptides avec le variant Prt– (Juillard et al., 1994
et 1996).
L’association des deux types de variant est également profitable pour éviter les défauts
d’amertume: les peptides amers générés par les protéinases des souches Prt+ pouvant être
dégradés par l’activité aminopeptidasique des variants Prt–. De nombreuses études ont
également porté sur l’association de Lactobacillus NSLAB et de lactocoques afin de
développer des arômes durant l’affinage des fromages (El Soda et al., 2000).
14. Les causes de la contamination du lait :
Le lait peut être contaminé par divers micro-organismes de l’environnement
(entérobactéries, Pseudomonas, Flavobacterium, microcoques, Corynebactéries, Bacillus) par
l’intermédiaire du matériel de traite et de stockage du lait, par le sol, l’herbe ou la litière, des
contaminations d’origine fécale peuvent entraîner la présence de Clostridium, coliformes et
éventuellement d’entérobactéries pathogènes (Salmonella, Yersinia, Helicobacter,
Campylobacter). Le lait d’animaux malades peut contenir des germes pathogènes pour

37
 Synthèse bibliographique

l’homme (Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus qui est un agent de mammite

infectieuse, Brucella qui est un agent de la fièvre de Malte, Bacillus anthracis qui est un agent
de la maladie du charbon, Listeria) (Leyral et Vierling, 2007).

Tableau 19: La microflore du lait cru de vache (Leyral et Vierling, 2007)

flore constante flore accidentelle
bactéries des canaux bactéries contaminant bactéries d'origine bactéries présentes
galactophores le lait pendant et après Fécale sur l'animal malade
La traite

Lactobacillus Pseudomonas Clostridium Streptococcus agalactiae

Streptocoques
lactiques Flavobacterium Coliformes fécaux Staphylococcus aureus
Enterobactéries Salmonella Brucella
microcoques Yersinia Listeria
Corynebacteries Campylobacter
Bacillus
Streptococcus faecalis
Clostridium

15. Presentation des souches pathogenes

15.1 Staphylococcus aureus :
La maîtrise de la contamination des produits laitiers par Staphylococcus aureus est un
enjeu économique et sanitaire pour l’ensemble des filières au lait cru, notamment caprine. La
contamination du lait cru par Staphylococcus aureus peut être due à :
- un contact du lait avec des porteurs sains (gorge et voies nasales).
- un contact avec une personne symptomatique (furoncles et plaies suppurantes).
- mammite (inflammation de la mamelle d’origine bactérienne) (Lamontagne et al.,
2002).
Staphylococcus aureus est l’agent principal causant les mammites bovines décrites par
Hunter (1984) et caprines décrites par Kalogridou et Vassiliadou (1991) et pose donc un
problème. Sanitaire pour l’homme. Valle (1990) a rapporté que 48.8% des souches de
Staphylococcus aureus isolées du lait de chèvre était toxinogène (Seifu, 2007). Des
intoxications staphylococciques ont été attribuées au lait de chèvre, au lait en poudre et aux
fromages.
Smith (1983) a montré que bien que Staphylococcus aureus soit détruit par le biais de la
pasteurisation, les entérotoxines produites par les pathogènes pouvaient supporter la
pasteurisation et causer ainsi l’intoxication. Park et Humphrey (1986) ont dénombré 3.3 x 103
UFC /ml de Staphylococcus sp.

38
 Synthèse bibliographique

Dans le lait de chèvre. Chubb (1985) a détecté des souches coagulases positives dans 40%
des échantillons du lait pris de façon aseptique de chèvres de Nouvelle Galles du Sud
(Australie) qui ne montraient aucun signe de mammite.
Vassiliadou (1991) a rapporté que 59.1% d’échantillons de lait de chèvre cru en Grèce était
positives aux souches. Harvey et Gilmour (1988) ont rapporté que les Staphylococcus étaient
l’espèce prédominante isolée du lait de chèvre en Irlande du Nord (Seifu, 2007).
Seuls les staphylocoques coagulase positifs sont considérés comme pathogènes. Trois
espèces peuvent coaguler le plasma du lapin oxalaté : Staphylococcus aureus, Staphylococcus
intermedius, Staphylococcus byicius, l’espèce aureus est elle-même scindée en plusieurs
biotypes selon l’origine animale de la souche (Leyral et Vierling, 2007).

Figure 8 : Aspect morphologique de la souche de Staphylococcus aureus observée au

microscope électronique (Leyral et Vierling, 2007)

 Pouvoirs pathogènes :
Staphylococcus aureus est à l’origine de toxi-infections alimentaires car c’est une bactérie
toxigène, elle produit entre autres des toxines thermorésistantes dans les aliments comme le
lait cru de chèvre.
15.2 Escherichia coli :
Les souches d’Escherichia coli sont rarement pathogènes, à l’exception de certaines
souches qui causent des diarrhées dans les pays en voie de développement, où elles touchent
surtout les enfants, ces bactéries infectent également les voyageurs venant de pays
industrialisés (Nauciel et Vildé, 2005). Escherichia coli est un commensal normal de l’intestin
de l’homme et de l’animal (Goubau et Pellegrims, 2000).

Figure 9: Escherichia coli observés au microscope électronique (Gx10000) (Goubau et

Pellegrims, 2000)

39
 Synthèse bibliographique

 Mode de transmission :
La bactérie se répand dans l’environnement par la voie des excréments. La présence
d’E.coli dans les eaux et les aliments est le témoin d’une contamination fécale. La
transmission se fait par voie féco-orale (Goubau et Pellegrims, 2000).
 Pouvoirs pathogènes :
E.coli est la bactérie la plus fréquemment impliquée dans les infections urinaires, elle peut
provoquer des diarrhées par des mécanismes très divers ainsi que diverses infections
communautaires ou nosocomiales, initialement sensible à beaucoup d’antibiotiques, elle a
acquis une résistance fréquente, surtout en milieu hospitalier (Nauciel et Vildé, 2005).
Les facteurs de virulence sont des flagelles et des pili qui permettent l’adhésion à la
muqueuse intestinale ainsi qu’une capsule qui prévient la phagocytose et les entérotoxines
(Goubau et Pellegrims, 2000).
Les colibacilles responsables d’entérites sont subdivisés en quatre catégories, au moins, en
fonction du syndrome provoqué et du mécanisme pathogénique.
15.3 Salmonella :
La salmonellose (gastro-entérite à Salmonella) est causée par plus de 2000 sérovars de
Salmonella, provoquant des symptômes fréquents, dont les douleurs abdominales, diarrhées,
qui durent de quelques jours à quelques semaines. La salmonellose la plus fréquente est due à
Salmonella Typhimurium. (Prescott et al., 2003) Elle est rencontrée dans tous les pays elle est
isolée chez l’homme, les animaux et dans l’environnement, elle occupe la première place dans
l’étiologie des toxi-infections alimentaires (Avril et al., 1992) .

Figure 10: Observation au microscope électronique de Salmonella typhi et Salmonella

infantis (Gx10000) (Prescott et al., 2003)

 Mode de transmission:
Salmonella typhi et Salmonella paratyphi infectent essentiellement l’homme et la
transmission se fait au contact de malades atteints de la fièvre typhoïde ou des porteurs
chroniques asymptomatiques. La contamination se fait par l’ingestion d’eau ou d’aliments
souillés par les excréments des malades. La mortalité est élevée à cause du développement par
les bactéries de résistances aux antibiotiques.

40
 Synthèse bibliographique

Les Salmonelles non typhiques comme Salmonella enteritidis ou Salmonella Typhimurium

sont largement disséminés dans la nature et sont associés à un réservoir animal. La
contamination se fait essentiellement par des aliments mal conservés ou infectés à partir de
réservoirs d’animaux (Rampal, 2000).

Tableau 20: Aliments suspectés et agents responsables (Rampal, 2000)

aliments S. enteritidis Autres Salmonelles
Lait et produits laitiers 6.3% 4.4%
Œufs et ovoproduits 56.6% 30.4%
Viandes et volailles 3.4% 18.5%
Poissons et fruits de mer 2.9% 7.6%
Autres aliments 16% 8.7%

15.4 Bacillus :
Le genre Bacillus renferme des germes telluriques aérobies stricts ou aéro-anaérobies,
sporogènes, se présentant sous forme de bâtonnets à Gram positif généralement mobiles. En
dehors de Bacillus anthracis, les Bacillus sont habituellement considérés comme des germes
de l’environnement et leur rôle en pathologie humaine est souvent négligé. En réalité, il est
actuellement bien établi que certaines espèces du genre Bacillus peuvent êtres responsables
chez l’homme de toxi-infections alimentaires ou, plus rarement, d’infections opportunistes.
Bacillus cereus est le principal germe incriminé, mais d’autres espèces comme Bacillus
licheniformis ou Bacillus subtilis peuvent également être mises en cause (Gaillard, 1989).

Tableau 21: Caractères bactériologiques de Bacillus cereus (Gaillard, 1989).

Caractères bactériologiques
Mobilité +
Hémolyse +
Aspect des colonies : Rugueux
atmosphère normale Rugueux
+ 5% de CO2
Pénicilline G (6µg/ml) Résistant

 Pouvoir pathogène :
Les toxi-infections alimentaires à Bacillus sont presque exclusivement dues à B. cereus.
Elles représentent prés de 5% de l’ensemble des toxi-infections alimentaires dans certains
statistiques anglo-saxonnes (Gaillard, 1989).
Deux aspects cliniques différents peuvent êtres observés :

 la première forme, la période d’incubation est de 8 à 16 heures et le symptôme

exclusif ou principal est une diarrhée persistant 12 à 14 heures. De nombreux
aliments peuvent êtres à l’origine d’un tel syndrome : viandes, légumes, sauces….
Ect.

41
 Synthèse bibliographique

 la seconde forme, la période d’incubation n’est que de 1 à 5 heures et les

vomissements, cédant en 6 à 24 heures, sont au premier plan. Les intoxications
alimentaires provoquées par B. cereus ne s’accompagnent pas de fièvre.
L’évolution est toujours bénigne et ne nécessite le plus souvent aucun traitement
particulier.
Des spores de B. cereus peuvent contaminer de nombreux produits : viandes, légumes. En
cas de cuisson insuffisante, les spores restent viables et donnent naissance aux formes
végétatives de la bactérie. Celles-ci peuvent ainsi se multiplier à une température située entre
15 à 50°C et élaborer leur toxines. Les symptômes diarrhéiques sont liés à la sécrétion d’une
entérotoxine, constituée de plusieurs composés protéiques agissant probablement en synergie
(Gaillard, 1989).
16. Propriétés inhibitrices des bacteries lactiques :
16.1 Choix de microorganismes :
La première étape essentielle réside dans le choix du microorganisme. Celui-ci doit être
exempt de toute pathogenicité (Suvarna et Boby, 2005).
Toutefois ce genre de risque est pratiquement inexistant du fait que les
microorganismes probiotiques ont trouvé de nombreuses applications dans l’industrie
alimentaire (ces souches sont incorporées dans les yaourts, les dérivés lactés, les boissons,
les fromages, les desserts réfrigérés et même dans le lait non fermenté) et ne présentent
aucun danger pour l’homme, les animaux ou l’environnement (Bouziane et al., 2004).

16.1.1 Résistance aux conditions rencontrées au cours du transit digestif :

Les bactéries probiotiques, pour être efficaces doivent parvenir vivantes au site de leur
action, à savoir l’intestin, et donc résister aux différents mécanismes de défense de l’hôte. Les
bactéries étant administrées par voie orale, il est nécessaire qu’elles franchissent les obstacles
majeurs du transit digestif (Chafai, 2006) : Elles doivent résister aux enzymes présents dans la
cavité buccale dont la principale est le lysozyme, au pH acide de l’estomac dû à la présence
de forte concentration d’acide chlorhydrique, aux sucs pancréatiques et aux concentrations de
bile et de mucus présentes dans l’intestin grêle (Malinen, 2002).
Les résultats des essais indiquent que diverses souches de lactobacilles, notamment :
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis I 23 et Lactobacillus fermentum I 24 peuvent
montrer une tolérance aux sucs gastriques et biliaires (Pereira et al., 2003).

16.1.2 Colonisation du tractus digestif et adhésion aux cellules intestinales :

Il est intéressant que les souches probiotiques puissent adhérer aux cellules de la paroi
intestinale, ceux-ci facilitant une bonne colonisation du tube digestif par les probiotiques

42
 Synthèse bibliographique

(Crittenden et al., 2005). D’après les travaux de Sanna et al., (2002), les lactobacilles (Lb.
crispatus ST1, A33 et 134mi , Lb. reuteri CT7 et Lb. gasseri CT5) présentent une meilleure
affinité aux cellules du jabot Gusils et al., (2002), ont confirmé l’existence de différents
déterminants de surface qui pourraient être impliqués dans les interactions entre des
lactobacilles (Lb. animalis, Lb. fermentum et Lb. fermentum subsp. cellobiosus) et les cellules
épithéliales intestinales (Chafai, 2006).
16.2 Activités antimicrobiennes :
Les probiotiques doivent essentiellement jouer deux rôles au niveau du tractus digestif :
améliorer la digestibilité de la ration alimentaire et maintenir de bonnes conditions sanitaires.
L’activité antimicrobienne des lactobacilles (Lb. acidophilus, Lb. plantarum et Lb. brevis) a
été prouvé in vitro contre deux pathogènes entériques : Escherichia coli et Salmonella
typhimurium (El-Nagger, 2004). L’effet inhibiteur de Lactobacillus fermentum sur
Escherichia coli, sur Salmonella typhimurium et sur Staphylococcus aureus avait été
démontré (Reque et al., 2000).
Il est donc important que ces bactéries soient capables d’inhiber le développement des
germes indésirables :
- Soit par la production de substances antagonistes de types bactériocines ou autre
tels que les acides organiques et le peroxyde d’hydrogène (Lima et al., 2005).
- Soit en empêchant l’adhésion des germes pathogènes aux cellules de la paroi
intestinale; selon Hariharan et al., (2004) l’emploi des probiotiques réduit la
colonisation du tractus digestif par Campylobacter jejuni (Chafai, 2006).
16.3 Viabilité et stabilité des microorganismes :
C’est l’une des critères de sélection la plus importante. Pour que les probiotiques puissent
exprimer ces diverses potentialités, il faut qu’elles atteignent leur site d’activité digestive dans
les conditions les plus propices à leur efficacité, ce qui suppose qu’elles soient vivantes : cela
induit des contraintes technologiques sévères au cours de concentration et de la dessiccation
pout une présentation en poudre, et interdit le passage dans une presse à granuler (qui porte la
température au dessus de 80°C à moins de faire appel à des enrobages thermorésistants
(Klaenhammer, 2000).

17. Définition des interactions :

Les produits laitiers, en général, comme le lait fermenté ou les fromages sont les supports
d’écosystèmes dont la composition évolue avec le temps. Les facteurs de sélection qui
gouvernent cette évolution sont générés par l’activité métabolique des micro-organismes eux-

43
 Synthèse bibliographique

mêmes. Ceux-ci, à un instant donné, créent à la fois les conditions de leur déclin et celles
favorisant l’installation d’autres groupes microbiens :
 par la production de substances inhibitrices ou au contraire celles de facteurs de
croissance.
 par la modification de facteurs physico-chimiques, dont le pH. (Leyral et Vierling,
2007).

 Interactions positives: synergie

Le meilleur exemple en est l’effet coopératif entre deux espèces ; Streptococcus
thermophilus et Lactobacillus delbrueckii qui jouent un rôle dans l’élaboration du yaourt. Au
début de la fermentation, c’est le Streptocoque qui se développe le plus rapidement et produit
différents acides (acide pyruvique, acide formique, acide lactique), l’adénine et une très faible
quantité de CO2. L’abaissement progressif du pH et la présence de ces substances vont petit à
petit activer la croissance du Lactobacille qui est plus acidophile. Celui-ci a une activité
protéolytique plus importante que celle du Streptocoque et la libération d’acides aminés
(valine, histidine, glycine, acide glutamique, leucine, méthionine) et des peptides vont les
stimulers. Malheureusement pour le Streptocoque, ces interactions positives ne durent pas très
longtemps, dans la mesure où il est beaucoup plus sensible au pH que le Lactobacille, sa
croissance va être progressivement inhibée par l’acidité du milieu (Branger et al., 2007).

 Interactions négatives : inhibition

L’un des avantages présentés par les bactéries lactiques est l’augmentation de la durée de
conservation d’un produit alimentaire par la production de nombreux métabolites aux
propriétés antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le
dioxyde de carbone, la reutérine, le diacétyl et les bactériocines (Dortu et Thonart, 2009).

17.1 Les acides organiques :

La production de l’acide lactique et de l’acide acétique et la diminution consécutive du pH
sont de loin les plus importants facteurs d’inhibition (Adams et Moss, 2008).
Dans une étude menée par Jinet et al., (1996), il est suggéré que l’inhibition de
Lactobacillus a l’égard des souches pathogènes de Salmonella et de Escherichia coli est du à
la production d’acides organiques par Lactobacillus.
Gudkow (1987) et Taylor, (2005) ont montrés qu’Escherichia coli est inhibé par l’acide
lactique à pH de 5.1.
L’inhibition de E. coli par Lactobacillus est du à un fort effet bactéricide de l’acide
lactique à pH bas.

44
 Synthèse bibliographique

On admet que la première cause d’inhibition par l’acide lactique des bactéries lactiques est
la réduction du pH qui inhibe la croissance de nombreuses bactéries, dont les organismes
pathogènes Gram négatifs.
Fayol et Messaoudi (2005) ont observés une complète inhibition de la croissance de
Salmonella Typhimurium cultivée en association avec différentes souches de Lactobacillus
(Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei) qu’ils ont attribué à
une diminution du pH. De plus on a observé une inhibition par le biais du pH de l’adhésion de
Salmonella à l’intestin. Lehto et Salminen (1997) ont conclus que les effets anti-adhésion des
lactobacilles sur Salmonella Typhimurium étaient dus principalement à la réduction du pH
(Pelaez et Martin-Orue, 2009).
Bien que le pH soit le principal facteur d’inhibition, il a également été démontré que les
basses valeurs du pH gouvernent l’activité des acides organiques car les formes indissociées
sont plus bactéricides (Acheson, 1999).
Les travaux de Holtzapfel et al. (1998) ont montré que l’acide indissocié est aisément
diffusé à travers la paroi cellulaire bactérienne, réduisant ainsi le niveau du pH intracellulaire
et ralentissant les activités métaboliques des bactéries (Taylor, 2005).
On a observé que les acides faibles ont une activité anti-microbienne plus importante à pH
bas qu’à pH neutre (Salminen et al., 1998).
En effet, la force d’un acide dépend de son degré de dissociation. Quand le pH est égal au
pKa d’un acide, la moitié de l’acide est dissocié, si le pH augmente, la dissociation augmente
de même (Adams et Moss, 2008).
A cause de sa constante de dissociation plus élevée, l’acide acétique montre une inhibition
plus forte que l’acide lactique à une concentration molaire et à une valeur de pH donnés
(Taylor, 2005). La forte activité anti-microbiennes des acides acétique et propionique
s’explique en partie par le pKa élevé, comparativement à l’acide lactique, respectivement
4,87, 4,75 et 3,08. A pH 4, par exemple, seulement 11% de l’acide lactique est indissocié
contre 85% d’acide acétique et 92% d’acide propionique. En présence d’un mélange d’acides,
l’acide lactique contribue principalement à la réduction du pH, alors que les acides
propionique et acétique devenus indissociés jouent leur rôle antimicrobiens (Salminen et al.,
1998).
Les travaux de Bohatier (1999) sur les taux de croissance des bactéries en fonction de
l’acide acétique ont montré qu’il était fortement inhibiteur, il existe une concentration critique
d’acide acétique pour laquelle la croissance des bactéries s’arrête et le taux de décès de la
culture augmente très vite. Celle-ci dépend de la composition du milieu, le pH correspondant
à cette concentration est compris entre 2,25 et 2,28.

45
 Synthèse bibliographique

Makras et al., (2006) ont observés que l’activité anti-bactérienne de la souche de

Lactobacillus contre Salmonella était due à l’effet de l’acide lactique et d’autres composants
inhibiteurs, dont la proportion s’est élevée avec la diminution du pH (Pelaez et Martin-Orue,
2009).
Cependant, en plus de réduire le pH, l’acide lactique a le pouvoir de perméabiliser les
membranes, de ce fait, il renforce l’activité des autres substances anti-microbiennes.
(Salminen et al., 1998).
Alakoni et al., (2000) ont étudié l’effet de l’acide lactique sur la perméabilité de la
membrane externe de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhimurium
in vitro et ont observés qu’il perméabilise la membrane externe des Gram négatifs et ainsi,
agit comme amplificateur des effets d’autres substances anti-microbiennes (Pelaez et Martin-
Orue, 2009).
17.2 Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) :
En présence d’oxygène, les bactéries lactiques sont capables de produire du peroxyde
d’hydrogène par l’action des oxydases, de flavoprotéines et du superoxyde dismutase. Comme
les bactéries lactiques ne produisent pas de catalase à cause de l’absence d’une source hème,
cela permet l’accumulation du peroxyde d’hydrogène, mais pas dans des quantités
significatives, parce qu’il est quand même décomposé par des peroxydases et pseudocatalases.
Son effet bactéricide a été attribué à son pouvoir oxydant (Salminen et al., 1998).
En effet, Juven et Pierson (1996) ont démontrés son effet cytotoxique sur la cellule
bactérienne qui génère des espèces hautement toxiques, telles que le radical hydroxyle qui est
à la base de l’oxydation des biomolécules (Taylor, 2005).
De plus certaines réactions produisant H2O2 font disparaître l’oxygène, créant un
environnement anaérobie non favorable à certains micro-organismes (Salminen et al., 1998).
Le peroxyde d’hydrogène confère aux bactéries lactiques un avantage de compétition
puisqu’il a été démontré qu’elles sont moins sensibles que d’autres bactéries à ses effets, mais
l’effet inhibiteur du peroxyde d’hydrogène reste généralement faible (Adams et Moss, 2008).
Le peroxyde d’hydrogène est une substance de préservation utilisée depuis longtemps pour le
lait cru, dans des conditions où il peut être difficile de refroidir le lait rapidement. La
concentration de H2O2 requise est de 300 à 800 ppm (Guizani, 2007).

17.3 Le dioxyde de carbone (CO2) :

Le dioxyde de carbone est formé principalement durant la fermentation des hexoses par le
processus d’hétérofermentation. Sa formation crée un environnement anaérobie et lui-même a
une activité anti-microbienne, le mécanisme de cette activité est mal connu, mais il a été

46
 Synthèse bibliographique

suggéré que les décarboxylations enzymatiques étaient inhibées et que l’accumulation du

dioxyde de carbone dans la bicouche lipidique causait un disfonctionnement de la
perméabilité membranaire (Salminen et al., 1998).

17.4 Le diacetyl (C4H6O2) :

Le diacétyl (2,3-butanédione) a été identifié par Van Niel et al, composant aromatique du
beurre, il est produit par les espèces et les souches du genre Lactobacillus, Leuconostoc,
Pédiococcus, Streptococcus, de même que d’autres micro-organismes (Jay, 1982).
Le diacétyl a des propriétés anti-microbiennes qui sont dirigées contre les levures, les
bactéries Gram négatives et les Gram positives non lactiques, ces dernières y sont néanmoins
moins sensibles (El Ziney et al., 1998).
Les concentrations nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100 ppm et
supérieures à celles présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2 à 7
ppm) (Caplice et Fitzgerald, 1999).

17.5 La reutérine :
La reutérine est secrétée spécifiquement par Lactobacillus reuteri, elle a un spectre très
large d’activité anti-microbiennes (antibactérien, antifongique, antiviral) (Axelsson et al.,
1989). Il a été démontré qu’elle inhibait les sous-unités de liaison des substrats de la
ribonucléotide-réductase et de ce fait, qu’elle interférait avec la synthèse de l’ADN (Salminen
et al., 1998).
La reutérine est produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation
anaérobique du glycérol (El Ziney et al., 1998).
La reutérine s’accumule dans le microorganisme producteur à haute concentration, elle est
excrétée dans le milieu. Sa toxicité contre la cellule productrice limite sa production, certaines
espèces comme Lactobacillus reuteri y sont plus résistantes (Vollenweider, 2004).

18. Bactériocines :
Les bactériocines sont des composés de synthèse ribosomale produites par les bactéries
dans le but d’inhiber la croissance des autres bactéries. Ces composés sont trouvés chez la
plupart des espèces bactériennes étudiées jusqu’à aujourd’hui. Mais peu d’entre eux sont
largement étudiés. En général, elles ont un spectre d’action restreint, inhibant seulement les
bactéries voisines de la souche productrice. Les bactéries à gram+ n’inhibent pas les bactéries
à gram– et vice versa (Ouwehand et Vesterlund, 2004).

47
 Synthèse bibliographique

Habituellement, elles sont de faible poids moléculaire (mais des bactériocines à haut poids
moléculaire sont également produites). C’est leur nature protéique et leur spectre d’inhibition
étroit qui les distingue des antibiotiques (De Vuyst et Leroy, 2007).
Au cours des deux dernières décennies, la sécurité alimentaire est devenue un problème
majeur, et de grands efforts ont été fournis pour identifier des bactériocines qui inhibent la
croissance des germes pathogènes et nuisibles. Pour l’utilisation dans l’aliment la bactériocine
doit être :
 Stable à la chaleur,
 Stable à l’acidité,
 Résistante aux protéases qui se trouvent dans l’aliment,
 Active pendant une période prolongée,
 En activité au pH de l’alimentation (4,5 à 7,0),
 Avoir un effet bactéricide que bactériostatique,
 Un large éventail d’hôtes, en inhibant plusieurs agents pathogènes et nuisibles (Fox
et al., 2000).
18.1 Classification des bactériocines
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre classes,
comme proposé par Klaenhammer (1993). Ces quatre classes sont :
 Classe I. Les lantibiotiques : peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la
chaleur et qui contiennent des acides aminés inhabituels soufrés formés post-
traductionnellement, c'est-àdire la lanthionine, la β-méthyl lanthionine, la
déhydrobutyrine et la déhydroalanine. Ils peuvent être divisés en deux types : la
classe IA qui comprend des peptides cationiques hydrophobes allongés contenant
jusqu'à 34 acides aminés et la classe IB qui comprend les peptides globulaires
chargés négativement ou sans charge nette et contenant jusqu'à 19 acides aminés.
Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués de deux peptides agissant
ensemble pour avoir une activité comme la lacticin 3147. La nisine, produite par
Lactococcus lactis subsp. lactis, est la bactériocine la plus largement étudiée de la
classe I (Dortu et Thonart, 2009 et Rajaram et al., 2010).

 Classe II. Peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant

pas d'acides aminés modifiés. Leur point isolélectrique varie entre 8 et 10. Cette
classe est divisée en trois sous-classes. Les bactériocines de la sous-classe IIa
contiennent entre 27 et 48 acides aminés et ont toutes une partie N-terminale
hydrophobe contenant la séquence consensus YGNG ainsi qu'un pont disulfure et

48
 Synthèse bibliographique

une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile qui détermine

la spécificité d'action. Elles ont toutes une activité contre Listeria monocytogenes.
Certaines bactériocines de cette sous-classe contiennent également un deuxième
pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui semble être important dans la
stabilisation de la structure tertiaire. Il semble par ailleurs qu'il leur conférerait une
meilleure activité antimicrobienne, une meilleure résistance à l'exposition à des
hautes températures et un spectre d'action plus large. La sous-classe IIb comprend
les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour avoir une activité. Deux types
de bactériocines de classe IIb peuvent être distingués : le type E (Enhancing) où la
fonction d'un des deux peptides est d'augmenter l'activité de l'autre et le type S
(Synergy) où les deux peptides sont complémentaires. La sous classe IIc contient
les bactériocines ne pouvant pas être classées dans les autres sous-classes (Dortu et
Thonart, 2009).

 Classe III. Protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la chaleur. La

structure et le mode d'action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres
bactériocines produites par les bactéries lactiques.

 Classe IV. Peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une
activité. Aucune bactériocine de cette classe n'a été décrite (Dortu et Thonart,
2009).
Le tableau 22 montre les différentes classes de bactériocines avec leurs descriptions
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).

Tableau 22 : les classes des Bacteriocines produites par les bacteries lactiques (Ouwehand et
Vesterlund, 2004).

Classe Sous-classe Description

Classe I (lantibiotiques) A (1) Allongé, cationique, membrane active, la charge
nette est légèrement + ou -.
A (2) Allongé, cationique, membrane active, la charge
nette est hautement -.
B Globulaire, inhibe l’activité enzymatique.
Classe II Petite (<10 kDa), stabilité à la chaleur modérée.
(100°C) à élevée (121°C), les peptides membrane
actives ne contiennent pas la lanthionine.
IIa Peptides Listeria active avec –Y–G–N–G–V–X–C–
près de l’amino-terminus.
IIb bactériocines deux-peptides.
IIc bactériocines autres peptides.
Classe III Grand (>30 kDa) protéines thermolabiles.
Classe IV Bactériocines complexes : protéines avec lipides
et/ou carbohydrates.

49
 Synthèse bibliographique

18.2 Bactériocines de Lactobacillus plantarum :

La plupart des bactériocines produites par les lactobacilles, ont une gamme d’activité
étroite. Lb. helveticus produit helveticine J et lacticine LP27. Helveticine J est une
bactériocine.
inhabituelle, car elle est codée par l’ADN chromosomique et active à pH neutre (Joerger et
Klaenhammer,1986).
Lb. acidophilus produit de nombreuses bactériocines, y compris lacticines B et F et
acidocine J1229 (Muriana et Klaenhammer, 1991) et Lb. casei produit la caseicine 80 et Lb.
delbrueckii subsp. lactis produit lacticines A et B (Hoover et Chen, 2005).
Lactoline a été la première documentation d’une protéine à effet antagoniste produite par
Lb. plantarum (Kodama, 1952). Après, d’autres travaux comme ceux d’Andersson (1986), ont
montré que certaines bactériocines Lb. plantarum 83 inhibent S. aureus et les spheroplastes
des bactéries à gram– (Hoover et Chen, 2005).
Récemment, un groupe de chercheurs japonais a découvert une nouvelle bactériocine,
plantaricin ASM1 produite par Lactobacillus plantarum A-1 (Hata et al., 2010). Le tableau
VII présente quelques exemples de bactériocines produites par l’espèce Lactobacillus
plantarum, et leur spectre d’action.

Tableau 23: Exemples des bacteriocines produites par Lactobacillus plantarum

Bactériocines Souche productrice Activité antimicrobienne
Classe IIa Lb.plantarum WHE92 Etendu, L. monocytogenes
Pediocine PA-1/AcH/SJ-1
Classe IIb Lb. plantarum C11 Leuconostoc spp., Lb. helveticus, Lb.
Plantaricine EF Plantaricine JK Lb. plantarum C11 plantarum, Lb. delbrueckii, Lb. reuteri,
Plantaricine S Lb. plantarum Enterococcus spp., Pediococcus spp.,
Lactococcus spp., Streptococcus spp.,
Micrococcus spp., Propionibacterium spp.
et Clostridium tyrobutyricum
Classe IIc Lb. plantarum C-11 Lb. plantarum, Lactobacillus spp.,
Plantaricin A Leuconostoc spp., Pediococcus spp. ; Lc.
lactis. et E. faecalis

18.3 Mode d’action des bactériocines

Le siège d’activité des bactériocines est la membrane cellulaire, raison pour laquelle les
bactériocines n’ont pas d’activité contre les bactéries Gram–. Cependant, les mécanismes
d’action des bactériocines sur la membrane sont variés.
18.3.1 Les lantibiotiques :
Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions
électrostatiques ou par liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II (un decaprenyl-
pyro-phosphoryl- MurNAc-pentapeptides-GlcNAc), un précurseur de peptidoglycanes.

50
 Synthèse bibliographique

Suite à cette liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et non spécifiques
dans la membrane cytoplasmique, ce qui va causer l’efflux rapide des petits composés
cytoplasmiques tels que les ions, les acides aminés, l’ATP, etc. Cette augmentation de la
perméabilité membranaire va conduire à la dissipation des deux composantes de la force
proton motrice, à la cessation rapide des activités cellulaires et à la mort de la cellule.
L’interaction avec le lipide II permet d’augmenter la stabilité des pores formés et de réduire la
concentration du lantibiotique nécessaire à la formation des pores, mais peut également
conduire à l’inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire (Dortu et Thonart, 2009). Les
lantibiotiques de type A dissipent la force proton-motrice par formation de pores et interfèrent
avec la synthèse des peptidoglycanes alors que la plupart des lantibiotiques de type B agissent
par inhibition de la synthèse des peptidoglycanes. Néanmoins, certains forment également des
pores dans la membrane des cellules cibles. La nisine, un lantibiotique de type IA, interagit
avec le lipide II au niveau du MurNAc tandis que la mersacidine, un lantibiotique de type IB,
interagit avec le GlcNAc du lipide II (Dortu et Thonart, 2009).

18.3.2 Les bactériocines de classe II :

Le mécanisme d’action supposé des bactériocines de classe IIa est l’interaction de la
bactériocine avec la membrane ou un récepteur spécifique, la « mannose perméase », pour
ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la perméabilisation de la
membrane, la dissipation des deux composantes de la force proton motrice et la mort de la
cellule. Le mécanisme de formation des pores n’est pas connu, même si l’hypothèse la plus
courante est l’association de différentes molécules de la bactériocine (Dortu et Thonart,
2009). La figure 11, montre le mécanisme d'action bactéricide de la pédiocine PA-1/AcH
(Naidu et al., 2006).
Les bactériocines de classe IIb ont en général un spectre d’action inhibant une large
gamme de bactéries Gram+. Elles forment des pores et rendent la membrane perméable à
différentes petites molécules, des cations monovalents ou des anions, ce qui dissipe une ou les
deux composantes de la force proton motrice (Dortu et Thonart, 2009).

18.3.3 Les bactériocines de classe III

Le mode d’action de ces bactériocines diffère complètement des bactériocines des autres
classes. Par exemple, l’entérolysine A, la zoocine A et la milléricine B agissent par
l’hydrolyse des liens peptidiques des peptidoglycanes des cellules sensibles. La zoocine A a
un spectre d’action étroit alors que l’entérolysine A et la milléricine B ont un spectre d’action
large. L’helvéticine J a un mode d’action bactéricide (Dortu et Thonart, 2009).

51
 Synthèse bibliographique

Figure 11: Modèle d'interaction pour la bactériocine de la classe IIa avec la membrane des
cellules ciblent. (a) structure de la bactériocine. (b) positionnement de la bactériocine par
des récepteurs (présumée) de reconnaissance, interactions électrostatiques et hydrophobes.
(c) attachement de la bactériocine avec le site cible. (d) l'agrégation et la formation des
pores hydrophobes (Naidu et al., 2006).

52
 Synthèse bibliographique

Tableau 24: Les principales bactériocines produites par certaines espèces de bactéries
lactiques letterature (Dortu et Thonart, 2009).
Dénomination Espèce productrice Espèces sensibles
Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus, bactéries Gram positif (dont
Nisine
Clostridium, Bacillus, Listeria)
Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus, Lactobacillus
Lacticine 481
Leuconostoc, Clostridium
Diplococcine Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactocoques
Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus, Streptocoques hémolytiques,
Lactostrepcine (S) Lactobacillus helveticus, Leuconostoc,
Clostridium, Listeria
Lactocidine Lactococcus fermentum Lactobacillus
Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
Lactocine 27
acidophilus
Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
Helveticine
bulgaricus, Lactobacillus lactis
Lactobacillus acidophilus N2 Lactobacillus leichmanii, Lactobacillus
Lactacine B bulgaricus, Lactobacillus lactis,
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus acidophilus SS Id+ Lactobacillus fermentum+
Lactacine F
Enterococcus faecalis
Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum, Pediococcus
Plantaricine A pentosaceus, Leuconostoc
paramesenteroides
Pediococcus pentosaceus Clostridium botulinum, Clostridium
sporogenes, Staphylococcus aureus,
Pediocine A
Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis,
Leuconostoc, Pediococcus

19. Biopréservation des produits laitiers :

Les espèces de Listeria monocytogenes sont responsables de plusieurs intoxications
associées avec les produits laitiers, tel que le lait pasteurisé (Flamand et al., 1985) et le
fromage (James et al., 1985). La nisine a montré son efficacitée contre L. monocytogenes dans
les produits laitiers. Ferreira et Lund (1996) ont trouvés qu’après inoculation d’une souche
résistante à la nisine dans du fromage blanc de longue durée de conservation à pH 4.6 à 4.7, le
nombre de L. monocytogenes décroit approximativement 1-Log ufc/ml pendant le stockage à
20°C pour 7 jours. L’addition de nisine (2000 IU/g) au fromage blanc augmenterait le taux
d'inactivation d’approximativement 3-Log ufc/ml dans 3 jours.
Davies et al., (1997) ont déterminés l'efficacité de la nisine pour contrôler L.
monocytogenes dans les fromages du type ricotta de plus de 70 jours à 6-8°C. L’addition de la
nisine (100 UI/ml) inhibe efficacement la croissance de L. monocytogenes pour une période
de 8 semaines ou plus (dépendant sur type de fromage). Le fromage témoin contient des
niveaux dangereux du microorganisme après 1 à 2 semaines de stockage.
Zottola et al., (1994) utilisent le fromage du cheddar contenant la nisine produite par un
lactocoque comme composant du fromage au lait pasteurisé. La durée de vie du fromage au

53
 Synthèse bibliographique

lait pasteurisé (301 et 387 UI/g de nisine) était considérablement plus grande que celle de
l’échantillon témoin de fromage. Dans le fromage en paquet réfrigéré, la nisine (100 et 300
IU/g) a réduit largement le nombre de L. monocytogenes, S. aureus, et des spores de C.
sporogenes ayant subi un choque thermique. Un autre problème dans la production fromagère
est la fermentation butyrique des Clostridium.
La nisine est ajouté fréquemment aux fromages du lait pasteurisé pour prévenir la
germination des spores de Clostridium, tel que Clostridium tyrobutyricum (Schillinger et al.,
1996).
Une application de la lacticine 3147, une bactériocine à large spectre et à deux 2
composants produits par Lc. lactis subsp. lactis DPC 3147, est le maintien de la qualité du
cheddar en réduisant le nombre de bactéries lactiques de la population exogènes aux ferments
pendant la maturation (Ross et al., 1999). Le fromage produit avec Lc. lactis 3147 DPC4275
transconjuguée productrice de lacticine 3147, contient 2 Log ufc/ml de bactéries lactiques
exogènes aux ferments que dans l’échantillon témoin après 6 mois de maturation.
De plus, le fromage fabriqué avec 3 souches productrices de lacticine 3147 n'avait aucune
bactérie lactique exogène à la culture initiale détectable sur la même période. Dans le fromage
blanc la population de L. monocytogenes a été réduite de 3-Log ufc/ml sur une période d’une
semaine de maturation que lorsqu’il a été fabriqué avec Lc. lactis DPC4275; cependant, le
nombre de Listeria dans l’échantillon témoin fabriqué par culture non productrice de lacticine
3147 restes inchanger (104 ufc/g).
La culture transconjugante produisant la lacticine 3147 a aussi été utilisée comme une
culture protectrice pour inhiber Listeria sur la surface d'un fromage à maturation par les
moisissures. La présence de la souche productrice de la lacticine 3147 sur la surface du
fromage a réduit le nombre de L. monocytogenes de 3-Log ufc/ml (Ross et al., 1999).

20. Model type de bacteriocine : La nisine

La nisine est un agent antimicrobien produit par quelques souches de Lc. lactis sp. Elle
appartient au groupe des bactériocines définies par Tagg et al., (1976) comme des composés
protéiques ayant une activité inhibitrice contre des souches phylogénétiquement proches de la
souche productrice. De nombreuses bactériocines répondent à cette définition mais certaines
d’entre elles présentent un spectre d’activité plus large s’étendant à des souches plus
éloignées. La nisine fut découverte en 1928 par Rogers lorsqu’il s’aperçut qu’un métabolite
produit par Streptococcus lactis (Lc. lactis dans la nouvelle nomenclature) possédait une
activité inhibitrice contre d’autres bactéries lactiques. La nisine appartient à la classe I des
bactériocines (Klaenhammer, 1993).

54
 Synthèse bibliographique

Cette classe regroupe les composés protéiques d’une taille inférieure à 5 kDa et contenant
les acides aminés modifiés thioéther lanthionine et méthyllanthionine et des acides aminés
déshydratés tels que le didéshydrobutyrine (Dhb) et didéshydroalanine (Dha). Le terme
lantibiotique (par contraction des mots lanthionine et antibiotique) leur est généralement
réservé (Sahl et al., 1998).

 Propriétés physico-chimiques :

La nisine est un peptide de 3488 Da constitué de 34 acides aminés dont la structure est
représentée à la Figure 12. Les molécules de nisine peuvent s’assembler en dimères ou
oligomères de 7000 à 14000 Da via des réactions intermoléculaires entre les résidus Dha et
Dhb. La conformation en anneaux des lanthionines assurerait la rigidité du peptide,
diminuerait sa sensibilité à la protéolyse et augmenterait sa résistance à la chaleur (Mc Auliffe
et al., 2001).

Figure 12: Structure de la nisine A et de la nisine Z (Mc Auliffe et al., 2001).

Mulders et ses collaborateurs en 1991, ont isolés un variant naturel de la nisine A, la nisine
Z, qui diffère par un acide aminé en position 27. La spécificité de l’activité antimicrobienne
des deux variants est identique. Cependant, des tests d’activité menés par la technique de
diffusion en gélose et des concentrations en bactériocines supérieures à 0.1 µg/ml ont montré
que la nisine A donnait des zones d’inhibition d’un diamètre inférieur à celles de la nisine Z à
concentrations identiques. Cette différence s’explique pas une meilleure diffusion de la nisine
Z dans l’agar (de Vos et al., 1995).
La solubilité de la nisine est fonction du pH et de la force ionique de la solution. En-
dessous de pH 5, la nisine A présente une solubilité supérieure à celle de la nisine Z. Dans des
conditions de pH neutre ou basique, la solubilité des deux variants est comparable. Le pH
influence de façon importante la stabilité de la nisine à la température (Rollema et al., 1995).
La nisine dans une solution à pH 5.0 et 6.8 perd respectivement 40 et plus de 90 % de son
activité après un autoclavage à 115.6°C, alors qu’à pH 2 aucune diminution de l’activité n’est
observée (Hurst, 1981).

55
 Synthèse bibliographique

 Biosynthèse:

Trois classes de transposons d’une taille de 70 kb contenant les gènes responsables de la

synthèse de nisine ont été identifiés chez Lc. lactis sp (Rauch et al., 1994). Les classes I et II
regroupent les transposons conjugatifs portant respectivement les gènes nisA et nisZ codant
pour le prépeptide de la nisine A et Z.
Les membres de la classe III contiennent le gène nisZ et sont non conjugatifs. Les
transposons portent également les gènes des protéines impliquées dans les modifications post-
traductionnelles du prépeptide (nisB, nisC et nisP), la sécrétion du peptide mature (nisT), de
l’immunité de la souche productrice à la bactériocine (nisI, nisF, nisE et nisG) et des facteurs
de régulation de la transcription (nisK et nisR). La production de nisine évolue en fonction de
la phase de croissance. Elle débute au milieu de la phase exponentielle pour atteindre un
maximum de la fin de cette phase de croissance au début de la phase stationnaire
(Kleerebezem et al., 2001).
La régulation se fait au niveau de la transcription par un système de type «quorum sensing»
(Kleerebezem, 2004). La production de bactériocine est également influencée par les facteurs
environnementaux, notamment le pH et l’aération du milieu de culture. L’aération stimule la
production de nisine Z par Lc. diacetylactis UL719 tandis qu’elle possède un effet antagoniste
pour la nisine. Hurst (1981), Amiali et al. (1998) ont observé une diminution de 50 % de la
concentration en nisine Z, produite par Lc. diacetylactis UL719, lorsque la souche est cultivée
à un pH de 5.0 comparativement aux pH 5.5, 6.0 et 6.5.
Pour d’autres souches productrices de nisine, différents auteurs ont mis en évidence une
augmentation du titre en bactériocine pour des cultures effectuées sans contrôle de pH ou dans
des milieux non tamponnés (Guerra et al., 2003).

 Spectre d’activité et modes d’action :

Parmi toutes les bactériocines, la nisine possède un spectre d’activité très large incluant des
souches de Lactococcus, Lactobacillus, Listeria, Enterococcus, Micrococcus, Pediococcus et
Staphylococcus ainsi que des cellules végétatives et des spores de Clostridium et Bacillus
(Meghrous et al., 1999).
Dans des conditions normales, les bactériocines produites par des bactéries Gram positif
n’ont pas d’effet bactéricide sur des espèces Gram négatif. Cependant, la nisine présente une
activité inhibitrice contre des souches de Helicobacter pylori et Neisseria (Mota-Meira et al.,
2000) et de Salmonella en présence d’EDTA. La première cible de la nisine se situe au niveau
de la membrane cytoplasmique des souches sensibles.

56
 Synthèse bibliographique

Des deux modèles proposés dans la littérature pour expliquer la formation des pores trans-
membranaires par la nisine, celui de Driessen et al. (1995) et Van den Hooven et al. (1996)
est généralement retenu (Sahl et al., 1998). Ce modèle est représenté à la Figure 13.

Figure 13 : Modèle de formation d’un pore transmembranaire par la nisine (Sahl et al., 1998).

Les forces d’attraction électrostatiques entre les charges négatives des têtes
phospholipidiques de la membrane et les charges positives des résidus de lysine de l’extrémité
C-terminale de la nisine serait à l’origine des interactions entre les molécules de nisine et la
membrane (Breukink et al., 1998). Le caractère amphiphile de la nisine lui permettrait ensuite
de s’insérer dans le feuillet externe de la bicouche lipidique (Van den Hooven et al., 1996).
L’accumulation de plusieurs molécules de nisine au même point conduirait à la formation
d’un pore. Tout en restant attachées à la surface, les molécules de nisine se déplaceraient à
travers la membrane, en réponse au potentiel électrique, entraînant avec elles les lipides de la
couche externe du côté cytoplasmique (Moll et al., 1996).
La formation transitoire de ces pores s’accompagne d’une rupture de la force proton
motrice par dissipation du potentiel électrique transmembranaire (ΔΨ) et du gradiant de pH
conduisant à l’arrêt de toutes biosynthèses (Montville et al., 1994).
Les pores entraînent également le passage dans le milieu extracellulaire d’ATP, d’acides
aminés, de potassium et de phosphate inorganique (Abee et al., 1994).
Le deuxième mode d’action de la nisine est l’inhibition de la biosynthèse de la paroi
cellulaire (Reisinger et al., 1980). Cette inhibition résulterait de la formation d’un complexe
entre le précurseur lipidique membranaire du peptidoglycane, le lipide II, et les molécules de
nisine. Le lipide II est également la seule cible spécifique de la nisine pour la formation de
pores (Mc Auliffe et al., 2001).
Cette association engendrerait des pores stables et uniformes composés de 8 molécules de
nisine et 4 de lipides II selon un nouveau modèle proposé par Hasper et al. (2004).
L’implication du Dha situé en 5ème position sur la molécule de nisine a clairement été
démontrée dans la capacité de la bactériocine à inhiber le développement des spores (Chan et
al., 1996). La double liaison du résidu Dha interagirait avec des facteurs associés à la

57
 Synthèse bibliographique

sporulation (Liu et al., 1993). La nisine active également des facteurs reliés à l’autolyse de
cellules sensibles.
 Application de la nisine :
La nisine est une bactériocine (peptide antimicrobien) produite par certaines bactéries du
genre Lactococcus lactis. C’est un peptide de 34 acides aminés, il est actif contre certaines
bactéries pathogènes des aliments, notamment les Listeria les Bacillus et les Clostridium et
elle est utilisée commercialement en tant qu’agent de conservation dans les conserves et
certains fromages (Harris et al., 1991).
Les conditions d’application de la nisine sont liées à son spectre d’action, ainsi que le pH
doit être inférieur à 7. Les raisons qui peuvent permettre l’utilisation de la nisine comme
additif alimentaire sont les suivants :
 Elle est produite par un organisme normalement utilisé dans les fermentations
alimentaires.
 La nisine résiduelle dans les aliments est dirigée, elle est en effet sensible à la
chymotrypsine.
Des tests effectués en Grande Bretagne et en URSS conclus à l’absence de toxicité.

21. Possibilité d’utilisation dans les produits laitiers :

L’application de cette propriété de Lactococcus lactis de produire de la nisine a été d’abord
envisagée pour l’inhibition de Clostridium trybutyricum dans les fromages et divers travaux
anciens ont confirmé cette possibilité mais la sensibilité des souches nisinogemes aux plages
de la sensibilité des ferments à la nisine rend la problématique de l’utilisation du procédé.
Cependant, Liinska (1997), en utilisant des souches productrices de nisine en combinant avec
des ferments résistants à la nisine a obtenu 90% de fromage de très bonne qualité, alors que
parmi les témoins 59% des fromages étaient butyriques.
La nisine est également utilisée dans les fromages fondus, Somers et Taylor (1987) ont
montrés que la nisine était efficace dans la prévention de la formation de toxine de C.
botulium dans les fromages fondus possédant un taux d’humidité supérieur à 50%. La nisine
est également utilisée pour améliorer la conservation des produits laitiers contenant du
chocolat, dans les yaourts pour éviter la forte acidification et dans le « cottage cheese » pour
inhiber le développement de souches de Bacillus et de Listeria monocytogènes (Bayoumi,
1991).

58
 Matériels et Méthodes

1. Provenances des échantillons :

Les échantillons du lait cru de chèvre proviennent des fermes d’élevage se situant dans la
ville d'Es-Senia, de la région d'Oran. Les prélèvements de lait dérivaient de chèvres des
populations Makatia et de la population Arabia. Les prélèvements sont réalisés sur une periode
de quatre ans, de 2007 à 2011, dans des conditions aseptiques puis amenés le jour même au
laboratoire pour analyse microbiologique.
Après lavage à l’eau savonneuse, rinçage à l’eau javellisée puis séché avec une lingette
stérile du pis (sans trayons) de la chèvre, le lait a été recueilli dans des flacons stériles (100
ml/flacon) dés les premiers jets puis échantillonné durant la même période pour cause de
disponibilité fourragère durant quatre ans au mois de Mars (2007 pour les variétés Makatia,
2011 pour les variétés Makatia et la variété Arabia). L'enrichissement est réalisé en incubant
les échantillons à 30°C pendant 24h (Badis et al., 2004)

Figure 14 : Prélévement des échantillons du lait à partir des chèvres de la race Arabia de la
ville Es-Senia de la region d'Oran.

2. Provenance des bactéries pathogènes :

Neuf souches pathogènes ont été utilisées dans cette étude : trois souches de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923, ATCC 29213 et ATCC 43300), Listeria ivanovii
ATCC 19119, Escherichia coli ATCC 25921, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus et Salmonella enterica, proviennent du laboratoire
central médical du CHU Oran, sauf les souches de Listeria qui proviennent du Department of
Analytical chemistry, Nutrition and Food Sciences, University of Santiago de Compostela
(Espagne).

3. Isolement des bactéries lactiques:

Les milieux utilisés au cours de ce travail étaient soit des milieux liquides, soit des milieux
solides additionnés d'agar-agar à 2% pour les milieux solide et 0,7% pour les géloses molles.
Le milieu MRS à pH=6,8 a été utilisé pour la croissance de la microflore lactique totale, les
lactobacilles sont énumérés sur milieu MRS acidifié à pH=5,4 (De Man et al, 1960).

59
 Matériels et Méthodes

La stérilisation des milieux est réalisée par autoclave à 121°C pendant 20 min. Le milieu
lait est stérilisé à 110°C pendant 10 min.

3.1 Préparation des suspensions de dilution

Après coagulation du lait des suspensions de dilutions décimales dans l'eau physiologique
(NaCl 0,9%) ont été préparées. Pour les besoins du comptage en milieu solide trois dilutions
seront choisies 10-7, 10-8 et 10-9 afin d'obtenir un nombre de colonies variant entre 25 et 250
colonies, l’ensemencement se fait en profondeur. Après solidification des milieux, les boites
de Petrie sont incubées à 30°C pendant 48h.

3.2 Purification des isolats de bactéries lactiques

Après croissance et comptage des colonies en boite et par dilution, On prend de chaque
boite 10 colonies isolées sur lesquelles sera effectuée une coloration de Gram et une
recherche de la catalase. Les bactéries à Gram+, catalase- et non sporulées sont retenues et
repiquées sur bouillon MRS. L’opération est renouvelée jusqu'à l'obtention d'une culture pure
dont la puretée est estimée par observation microscopique après coloration de Gram (Balows
et al, .1992, Curk et al., 1996 et Heleni et al., 2006).

3.3 Conservation des isolats

3.3.1 La conservation à court terme :
La conservation des isolats purifiés est réalisée par ensemencement sur gélose inclinée.
Après incubation à 30°C pendant 18 heures, les tubes sont conservés à + 4°C, Le
renouvellement des cultures se fait tous les trois semaines (Saidi et al., 2002).

3.3.2 La conservation à long terme :

A partir des jeunes cultures (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont récupérées par
centrifugation à 4000 t/min pendant 10 min. Une fois le surnageant éliminé, on ajoute le
milieu de culture de conservation sur le culot. Le milieu de conservation contient du lait
écrémé, 0,2% d’extrait de levure et 30% de glycérol. Les cultures sont conservées en
suspension dense et en tubes Eppendorfs à -20°C. Indiquent que des suspensions très
concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures sont repiquées
dans le lait écrémé à 0,5% d’extrait de levure, avant utilisation (Saidi et al., 2002).

60
 Matériels et Méthodes

Culture de 18 h sur bouillon MRS

↓
Centrifugation à 4000 tr/mn pendant 10 min
Conservation du culot
↓
Culot est additionné de 2ml de lait écrémé stérile
à l’extrait de levure plus 30 % de glycérol
↓
Répartition dans des tubes Eppendorfs
↓
Conservation a – 20 °C.

Figure 15: Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi et al., 2002)

4. Tests d’orientation pour l’identification des bactéries lactiques :

Sur chacune des boîtes servant aux dénombrements, nous classons les colonies en
catégories selon leur aspect macroscopique. Le pourcentage de chaque type de colonie est
noté pour chaque dénombrement. Dans chaque catégorie, nous choisissons aléatoirement une
colonie supposée représentative parmi celles, observées pour réaliser les premiers tests
d’orientation.
Chaque colonie suspectée est une bactérie lactique et purifiée deux fois par isolement sur le
milieu MRS gélosé (incubation en aérobiose 48 h à 30°C). Des cultures pures issues de ces
isolements sont réalisées pour stocker les souches à -20°C, dans un milieu MRS contenant du
glycérol pour des analyses ultérieures. Pour une identification préliminaire des bactéries
lactiques, nous nous sommes basés sur des études :
- Microscopiques (les formes caractéristiques des cellules microbiennes, leur
arrangement, la présence ou non de spore et leur coloration de Gram).
- De la mobilité, du test de catalase et du type fermentaire.

4.1 Identification des souches de bactéries lactiques :

Suite à la purification des isolats, vingt huit souches ont été retenues, dont nous avons
étudié les genres conformément au protocole de Carr et al., (2002).
4.1.1 Étude macroscopique :
Une observation macroscopique permet de décrire l’aspect des colonies, obtenues
sur milieu solide (taille, pigmentation, contour, aspect, viscosité).
4.1.2 Étude microscopique:
L’observation microscopique au grossissement (G x100) permet de classer les
bactéries selon leur Gram, leur morphologie cellulaire, leur mode d’association (Joffin et
Leyral, 1996).

61
 Matériels et Méthodes

4.1.3 Coloration de Gram :

Nécessaire à l’observation microscopique car elle nous oriente suite aux formes observées
vers les démarches à suivre pour les autres tests. Cette étape sert à colorer les bactéries Gram-
en rose et les Gram+ en violet.
4.2 Critères physiologiques
4.2.1 Test du NaCl et du pH :
Effectué en parallèle avec la catalase, et dans le même but (différencier les enterocoques
des lactocoques et des leuconostocs). Il nécessite l’emploi de deux milieux MRS liquides ;
l’un contenant 6,5% de NaCl (6,5g de NaCl par 100ml de milieu) et en incube à 28°C pendant
24h a 48h, et l’autre MRS à un pH de 9,6 (Carr et al., 2002 et Mathara et al., 2004). Dans
lesquels on a ensemencé les souches ayant une forme cocci. Ces deux paramètres sont très
caractéristiques des entérocoques qui sont les seuls à pouvoir croitre dans ces deux milieux.
Nous avons utilisé aussi un milieu MRS à 4% de NaCl pour l’ensemble des souches, ainsi
qu’un autre MRS à 8% de NaCl pour les bacilles, la procédure est la même que pour les tests
cité ci-dessus.

4.2.2 Test des températures de croissance et de thermorésistance :

On à ensemencé les isolats dans du MRS6, 8 liquide et qu’on à incuber à 15°C et à 45°C
Carr et al, (2002), de plus une troisième série de tube à subit un chauffage à 63°C au bain
Marie pendant 30 min puis on à incubé à 30°C pendant 24h a 48h (Badis et al., 2004). Ces
tests vont nous aider à distinguer les souches mésophiles des thermophiles, ainsi que les
thermorésistantes.

4.3 Critères biochimiques

4.3.1 Test de la catalase :
Pour différencier les lactocoques ou leuconostocs (catalase-) des entérocoques (catalase+) ;
les lactocoques comme la majorité des bactéries lactiques sont des microaérophiles et n’ont
pas besoin de synthétiser la peroxydase contrairement aux entérocoques qui sont aérobies. Le
test consiste à verser une goutte de peroxyde d’hydrogène dilué au dixième, sur une lame de
verre et d’y ajouter, à l'aide d'une pipette pasteur, une colonie développée sur gélose MRS s’il
y a effervescence l’activité de l’enzyme catalase est positive (Cat+) qui décompose le
peroxyde d’hydrogène selon la réaction suivante :
catalase
2H2O2 2H2O2+1/2O2
Le contraire est négatif (Larpent et al., 1990).

62
 Matériels et Méthodes

4.3.2 Etude du métabolisme azoté (recherche de l’arginine déhydrolase (ADH)) :

Le milieu utilisé pour ce test est le M16 BCP (milieu M16 solide avec un indicateur de pH
qui est le pourpre de bromocrésol). Les bactéries qui possèdent l’ADH (Arginine
Déshydrogénase) vont acidifier le milieu en fermentant le lactose (le BCP va virer au jaune),
puis en déshydratant l’arginine, elles vont réalcalinisés le milieu et de ce fait la couleur du
BCP redeviendra violet. Les bactéries qui ne possèdent pas cette enzyme vont seulement
acidifiés le milieu (Thomas, 1973).

4.4 Etude du profil fermentaires :

L’étude de la fermentation des dix sept sucres suivants a été effectuée : arabinose, glucose,
galactose, lactose, maltose, mannitol, raffinose, saccharose, xylose, esculine, sucrose,
fructose, cellobiose, melibiose, sorbitole, ribose, mannose.
La suspension bactérienne est obtenue à partir d'une preculture sur milieu MRS qui est
icubé à 30°C pendant 18h, 2ml de la culture jeune est centrifuge à 5000 t/min pendant 5min.
Le culot contenant les cellules bactériennes est ensuite lavé deux fois avec de l’eau
physiologique pour éliminer les traces du milieu de culture. Ensuite, 2 ml de MRS BCP
(milieu MRS sans sucre avec un indicateur de pH : le pourpre de bromocrésol) sont ajoutés au
culot ce qui represente l'inoculum. 17 carbohydrates sont répartis séparement dans des tubes à
hémolyse a raison de 100 µl de sucre dans 1 ml de MRS BCP, auxquels on ajoute 100 µl de
l'inoculum (Mannu et al., 2002 et Guessas et Kihal, 2004).
Les conditions d’anaérobiose sont assurées par ajout d’une couche d’huile de paraffine a la
surface et l’incubation se fait dans des conditions optimale 30°C, pendant 48h (Guessas et
Kihal, 2004). Le trouble du milieu accompagne le virage au jaune de l’indicateur de pH du a
l’acidification du milieu, traduit la fermentation du sucre test. Ainsi, le profil fermentaire
d’une souche donnée est comparé aux profils-types donnés par la littérature, ce qui permet
l’identification de la bactérie selon (Carr et al., 2002 et Klein et al., 2004).
L’identification complète de nos souches bactériennes a été achevée selon les schémas de
systématique illustrée dans le schéma illustre dans les figures 16 ,17 et 18 suivantes.

63
 Matériels et Méthodes

Figure 16: indique le schéma général de différentiation des genres appartenant aux
bactéries lactiques (Carr et al., 2002)

Figure 17: Schéma général dichotomique d’identification rapide des streptobacilles (Carr et
al., 2002)

64
 Matériels et Méthodes

Figure 18: indique le schéma d’identification dichotomique rapide pour lactobacilles

heterofermentatif (Carr et al., 2002).

4.5 Identification de l'espèce par galerie API 50 CHL:

Pour la détermination de l’espèce, l’étude du profile de la fermentation des hydrates de
carbone sur une galerie API 50 CH a été réalisée. La galerie API 50 CH (biomerieux) est
constituée de 50 microtubes permettant l’étude de la fermentation de substrat, appartenant à la
famille des hydrates de carbone et dérivés (hétérosides, polyalcools, acides uroniques).
L’inoculum est préparé dans le milieu MRS-BCP (sans extrait de viande), puis répartit à
l’aide d’une micropipette stérile dans les 50 tubes de la galerie. Durant la période
d’incubation, la fermentation se traduit par un changement de couleur dans le tube, dû à une
production d’acide en anaérobiose révélée par l’indicateur de pH (pourpre de bromocrésol).
Le premier tube, sans principe actif, sert de témoin. La lecture des résultats se fait après 24
et 48 heures d’incubation. Les résultats sont traités selon les recommandations de Carr et al
(2002), Axelsson (2004) et Hammes et Hertel (2006), et comparés avec ceux de la souche
Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (obtenus à partir de la base des données
«
Biomérieux»), et le coefficient de simple appariement «SSM» de chaque binôme de souches a
été calculé (Sneath, 1973 et Prescott et al., 2003).

65
 Matériels et Méthodes

4.6 Caractérisation technologique :

4.6.1 Etude de la thermorésistance :
On a ensemencé les isolats dans du MRS liquide puis ils subissent un chauffage à 60,5°C
au bain marie pendant 30 min puis on à incuber à 30°C pendant 24h à 48h (Badis et al.,
2004).
4.6.2 Production des composés aromatiques :
La production d’acétoïne (acétylméthylcarbinol) est testée sur milieu Clark et Lubs. Les
souches sont cultivées sur ce milieu; Après 24h d’incubation, on test par la réaction de Voges-
Proskaeur dite réaction de V.P (Avril et al., 1992).
Dans un tube à hémolyse, 2 ml de cette culture sont transvasés, 0,5 ml d’une solution de
soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP1) et 0,5 ml de réactif α-naphtol à 6% dans
l’alcool absolu (VP2). On agite soigneusement les tubes et on laisse au repos 5 à 10 min à
température ambiante. La production d’acétoïne se traduit par l’apparition d’un anneau ou la
diffusion de la couleur rose à la surface du milieu. Un VP positif signifie que la souche
possède une voie métabolique particulière pour la fermentation des hexoses, la voie
butylèneglycolique (Zourari et al., 1992 et Guessas, 2006).

4.6.3 Production de dextrane :

La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence sur milieu solide
MSE (Mayeux et al., 1962). Les souches productrices de dextrane sont caractérisées par la
formation de colonies larges, visqueuses et gluantes.

4.6.4 Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose):

L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980). Ce milieu
contient une solution de ferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La
présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le ferricyanide de
potassium. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction entre ces ions il en résulte
la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu foncé (après 18 h-72 h d’incubation).
Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.

4.6.5 Etude de l’activité protéolytique :

L'aptitude à la protéolyse des caséines du lait des différentes espèces de Lactobacillus est
recherchée sur milieu MRS liquide, dont le peptone est remplacé par la caséine du lait.
L'appréciation de l'activité protéolytique se fait par l'apparition d'un coagulum du à
l'hydrolyse de la caséine (Badis et al., 2004).

66
 Matériels et Méthodes

5. Mise en évidence des inhibitions inter bactériennes :

La recherche d’éventuelle production de substances inhibitrices par les bactéries isolées est
réalisée selon deux méthodes :

5.1 La méthode directe :

Selon Fleming et al. (1975), consiste à cultiver les deux souches dans le même milieu en
double couche.
Sur du MRS solide tamponné et à partir des cultures jeunes des souches de bactéries
lactiques (un spot de la souche à caractériser en phase exponentielle de croissance), qu’on a
incubé à 30°C pendant 24h. On à versé 0,1ml de cultures jeunes de bactéries pathogènes
(Staphylococcus aureus, Bacillus sp. et Escherichia coli) dans 7,5ml de MH semi-solide
(contenant 0,7% d’agar-agar) qu’on à versé par dessus la première gélose conformément à la
méthode de la double couche. Après solidification du milieu, les boites de Pétri sont mise à
28°C pendant 24h.
La lecture des résultats consiste à déterminé la présence d’un halo clair autour des souches
ensemencées en touche et de mesurer leurs dimensions.
5.2 La méthode indirecte :
Décrite par Barefoot et al., (1983), cette méthode permet de mettre en contact le
surnageant de la souche lactique productrice de substance antimicrobienne avec la souche test.
Les souches précédemment sélectionnées pour leur production de substances antimicrobienne
sont concernées par ce test.
Les souches sont cultivées dans le milieu MRS liquide et incubées pendant 18 heures.
Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le surnageant est conservé.
Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et ensemencé par la souche test, des puits
sont réalisés avec un emporte pièce et sellée par 10 µl de gélose MRS. Les puits recevront
100µl du surnageant de la souche test et les boites sont incubée pendant 24 à 48 heures. Les
colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un
diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme positive.
6. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur :
Les inhibitions de la croissance de la souche indicatrice peuvent être dues à l’acidification
du milieu, à la production de peroxyde d’hydrogène, à la présence de phages ou à la synthèse
de bactériocines.

67
 Matériels et Méthodes

6.1 Inhibition due à la production d’acides organiques:

L’étude de l’effet de l’abaissement du pH du milieu sur l’inhibition des souches
indicatrices est réalisée en milieu MRS tamponné à pH 7 à l’aide de tampon phosphate
(0,1M). Ce tampon est préparé selon les indications de Benhamouche. N (2005). Après
incubation la lecture des résultats se fait par comparaison au milieu témoin non tamponné.
6.2 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène:
La croissance de certaines cultures lactiques entraîne la production de peroxyde
d’hydrogène (H2O2) qui est considéré comme un inhibiteur de la croissance bactérienne
(Cogan et al, 1981 et Julliard et al, 1987). Cet agent peut être dégradé par une enzyme « la
catalase » présente chez certaines espèces bactériennes.
Pour détecter la production de H2O2, on réalise des cultures en présence de catalase à
raison de 2 mg/ml de milieu. L’enzyme et la souche indicatrice sont mélangés dans la gélose
molle en surfusion. Après incubation la lecture des résultats se fait par comparaison au témoin
ne contenant pas de catalase.

Figure 19: Méthodes utilisées pour la recherche des substances antimicrobienne. (a)
méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits (Guessas, 2007)

6.3 Recherche de substances inhibitrices de nature protéique:

La recherche d’éventuelle production de substances inhibitrices par les souches
sélectionnées lors du criblage est réalisée en milieu solide. Pour s’assurer de la nature
protéique des substances inhibitrices, on utilise des enzymes protéolytiques : la trypsine et
l’–chymotrypsine. Chaque enzyme est dissoute dans du tampon phosphate de sodium (0.1M;
pH 7). 2 mg d’enzyme et 1 ml de tampon phosphate stérile.
Le but de ce test est de prouver la nature de la substance antimicrobienne élaborée par les
isolats. A partir des cultures jeunes, un volume de 2 ml a été prelevé et centrifugé à 8000
t/min pendant 10 min. Au préalable, des boites Pétri contenant 10 ml de milieu MH solide
sont ensemencées par 500 µl de Staphylococcus aureus. Avec l'emporte pièce 5 puits sont fait

68
 Matériels et Méthodes

dans le milieu solide juste après sa solidification. Un volume de 500 µl de surnageant brut est
ajouté 250 µl de chaque enzyme (trypsine et α-chymotrypsine) (2 mg d’enzyme + 1 ml de
tampon phosphate stérile). Le tous est incubé à 37°C pendant 1h. Dans les puits 50 µl ont été
disperser :
 Surnageant dans le premier
 MRS liquide dans le deuxième
 Surnageant + trypsine
 Surnageant + α-chymotrypsine
 Surnageant + catalase

6.4 Recherche de phages lysogènes

Nous avons effectués ce test pour éliminer la supposition d’une inhibition causée par les
phages bactériens.
Avec une pipette Pasteur, on découpe un fragment de gélose dans la zone d’inhibition. Ce
fragment est suspendu dans 1 ml de tampon phosphate stérile contenant 50 µl de chloroforme.
Après agitation, on laisse décanter 5 min, puis on prélève 300µl de milieu que l’on ajoute à
7,5 ml de gélose molle contenant la souche indicatrice à 0,1ml. Le mélange est coulé
stérilement dans une boite de Pétri et incubé 48 h à 28°C. La présence de plage de lyse
indique la présence de phages.

7. Dosage de l’acidité dornic:

L’évaluation de l’acidité produite par les souches pures de Lb. plantarum est réalisée par
pH métrie et par titrimétrie à différentes températures 20°C, 30°C, 37°C et 44°C. Cette
dernière a pour but de déterminer par titrage la concentration molaire en ions H3O+ dans un
échantillon de lait. La concentration est exprimée en «Degrés dornic (°D)».
Le matériel nécessaire est le suivant : un statif avec noix et pince, une fiole conique de 100
ml, une solution de NaOH N/9, une burette de 25 ml, une pipette jaugée de 10 ml et une
solution de phénolphtaléine à 1% dans l'éthanol. Remplir la burette de la solution de NaOH
N/9 et la fixer au statif. Régler le niveau du liquide à zéro. À l'aide d’une pipette de 1 ml,
prélever 1ml de lait et transférer dans une fiole conique de 10ml. Ajouter 5 gouttes de solution
de phénophtaléine et titrer jusqu'à l’apparition d'une couleur rose persistante. Noter le volume
de solution titrant utilisé en dixièmes de millilitres. Nombre de dixièmes de millilitre de
NaOH = 1°D.

69
 Matériels et Méthodes

Figure 20 : Montre les Instruments pour la mesure de l’acidité dornic titrable.

Les résultats sont exprimés selon la relation :

Acidité = VNaOH x 10
VNaOH : volume de la soude coulé pour neutraliser l'acidité.
L’acidité est exprimée en degré Dornic où 1°D = 0,1g/l d’acide lactique.
Pour conserver un lait on doit mesurer son acidité, que l'on exprime le plus souvent par le °D
un degré doriques représente 0,1 g d'acide lactique par litre; un lait frais a une acidité de 18°D
(Bourgeois et al., 1996).

8. L’étude du l’effet du pH sur l’évolution de la croissance et d’acidité

de Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68):

On prépare le milieu MRS à différent pH (4- 4,5- 5- 5,5 -6- 6,5- 7- 7,5 -8 et 8,5) puis on
mesure chaque trois heures le pH et la Densité optique (Do).

9. Mesure de la croissance :
On utilise la méthode de numération sur milieux solides. On inocule chaque souche dans 10ml
de lait écrémé stérile et après incubation (18h ou plus) et coagulation, on réalise une série de
dilutions dans 9ml d'eau physiologique (10-6, 10-7, 10-8 et 10-9). On ensemence les dilutions
adéquates en profondeur puis on ajoute le milieu solide (MRS) en surfusion (45°C) et on
incube à 20°C, 30°C, 37°C et 44°C pendant 24 - 48h (deux sont ensemencées par dilution).
On dénombre seulement les boites contenant 30 à 300 colonies (Kihal., 1996). Les cinétiques
de croissance et d’acidification sont réalisées simultanément aux intervalles de temps
suivants : 0h, 3h, 6h, 9h, 14h, 18h, 24h et 48h.

70
 Matériels et Méthodes

n= t/G
X=X0 21/G
LnX=LnX0+Ln2/G t
LnX=LnX0+µ t
µ=Ln2/G

X : le nombre de cellule au temps t1

X0 : le nombre de cellule au temps initial t0
µ: Taux de croissance spécifique.
G : temps de génération (temps nécessaire au doublement de la population cellulaire).
n : le nombre de génération.
Ou bien:
La vitesse de croissance ou taux de division (µ) est le nombre de générations par unité de
temps:
µ=n/t=log Nt – logN0/0.301 t

n= log Nt – logN0/0.301

Alors: µ= log Nt – logN0/0.301 t

Le temps de génération G est l'intervalle de temps entre 2 divisions de la population ou le

temps de doublement moyen de la population: G = 1

71
 Matériels et Méthodes

Transférer une colonie de la souche Lb plantarum incubation

sur MRS bouillon de pH=5,4 à 30°C/24h

Transférer 0.1ml
10ml de lait De la culture jeune Culture pure et
Écrème Dans 10ml lait Jeune
Ecrème stérile
Incubation à (20°C- 30°C- 37°C- 44°C)
Et à différents temps

Mesure de la croissance
microbienne par La mesure de la cinétique d'acidité :
dénombrement sur gélose. pH et l'acidité titrable.

Préparation des dilutions décimales

9ml d’eau
Physiologie

Ensemencement en masse de chaque dilution et

incubation 30°C pendant 24h

Figure 21: Les différentes étapes de la cinétique de croissance et d’acidification.

72
 Matériels et Méthodes

10. L’étude du l’évolution de la croissance et d’acidité des deux souches

au dépend du sucre et l’acide aminé du milieu:
On inocule chaque souche dans un milieu MRS modifié, la modification se fait soit au niveau
du sucre; en remplacent le glucose par mannose, ou le maltose, dont le 250 ml de MRS 5g de
chaque sucre, soit au niveau du l’acide amine ou on enlève l’extrait du levure et remplacé par
un autre acide aminé tel que l’Asparaginine 0.04g ou la glycine 0.02g pour 250 ml du MRS
et les incubés a des T°C différents et la lecture du pH et de la DO.

11. La détermination de la sensibilité aux antibiotiques:

Pour chaque souche testée (Les six souches de Lactobacillus ont subis ce test), une colonie
de morphologie typique a été sélectionnée et repiquée sur milieu MRS liquide, et incubé
pendant 18h. La densité cellulaire des cultures a été aux environs de 108 UFC /ml. Les
souches sont étalées sur milieu MRS à l’aide d’écouvillon, et Trente trois antibiotiques ont été
testés, le tableau (25) montre la charge de chaque disque d’antibiotique utilisé. Gélose avec
disques d’antibiotiques ont été ensuite incubées pendant 48 h. Les diamètres des zones
d'inhibition ont été mesurés à l'aide d’une règle. Les résultats ont été exprimés comme
sensibles (S), intermédiaires (I) et résistantes (R) selon les normes recommandées (Comité de
l’antibiogramme de la société française de microbiologie, 2007). Deux souches de référence
de résistance aux antibiotiques connue, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 25922, ont été inclus dans les essais (Zhoua et al., 2005 et Taheri et al., 2009).

73
 Matériels et Méthodes

Tableau 25 : Les antibiotiques utilisés pour definir la sensibilité de nos souches lactiques.
Antibiotiques Charge du Disque Symbole
PENICILLINES
Penicilline 6 µg / 10 IU P
Oxacilline 1 µg OX1
Ampicilline 10 µg AM
Amoxycilline + Acide Clavulanique 20 µg + 10 µg AMC
Piperacilline 75 µg PIP 75
Ticarcilline 75 µg TIC
CARBAPENEMES
Imipeneme 10 µg IPM
CEPHALOSPORINES
Cephalothine 30 µg CF
Cefazoline 30 µg CZ
Cefoxitine 30 µg FOX
Cefotaxime 30 µg CTX
Ceftazidime 30 µg CAZ
Cefsulodine 30 µg CFS
AMINOSIDES
Amikacine 30 µg AN
Netilmicine 30 µg NET
Tobramycine 10 µg TM
TETRACYCLINES
Tetracycline 30 µg TE
MACROLIDES
Erythromycine 15 µg E
Spiramycine 100 µg SP
LINCOSAMIDES
Lincomycine 15 µg L
Clindamycine 2 µg CM
STREPTOGRAMINES
Pristinamycine 15 µg PT
GLYCOPEPTIDES
Vancomycine 30 µg VA
POLYPEPTIDES
Bacitracine 0,02 à 0,04 IU BAC
Colistine 50 µg CS 50
SULFAMIDES-TRIMETHOPRIME
Trimethoprime-Sulfamethoxazole (co-trimoxazole) 1.25 µg + 23.75 µg SXT
NITROFURANES
Nitrofurantoine 300µg FT
QUINOLONES
Acide Nalidixique 30 µg NA
FLUOROQUINOLONES
Ciprofloxacine 5 µg CIP
Ofloxacine 5 µg OFX
Pefloxacine 5 µg PEF
DIVERS
Acide Fusidique 10 µg FA
Rifampine 30 µg RA 30
1 les disques d’antibiotiques proviennent de Bio-rad (Marnes-la-Coquette, France), sauf VA
de OXOID (Basingstoke, Hampshire, England).

74
 Matériels et Méthodes

12. Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) sur la croissance de S.

aureus :
La souche dans du MRS pH 6,8 pour obtenir la culture jeune. Dans des eppendorfs nous
avons déposé un volume de 2ml de la solution bactérienne qu’on centrifuge à raison de 8000
tours/min pendant 10 minutes. On prend le surnageant puis en fait un chauffage de ce dernier
à 100°C pendant 10 min dans un bain marie. On prend 2ml de l’extrait brut de Lactobacillus
plantarum (58) chauffé à 100°C en lui ajoute 2ml de bouillon nutritive, et 10 autres tubes
contenant tous la même quantité du bouillon nutritive, puis en commence à faire des dilutions
de (1/2) jusqu'à la dilution (1/1016) qui est la 10eme dilution. Puis on prend-la culture jeune
de Staphylococcus aureus et l’ajoute à raison de 0.1 ml par tube et par dilution.
En fin on calcule la densité optique de chaque dilution faite à 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h, 26h
et 28h.

75
 Résultats et Discussions

1. Dénombrement et isolement des bactéries lactiques du lait cru de

chèvre :
Les résultats du dénombrement de la microflore lactique sur milieu MRS acidifié a donné
une concentration cellulaire microbienne de 29 ± 4 108 ufc/ml de lait. Ce taux de bactéries ne
reflète que les germes acidotolérants. A partir des boites contenant un nombre réduit de
colonies séparées, 252 isolats ont été purifiés et pré-identifiées avec l’observation
morphologique macroscopique et microscopique, le type de gram et la réaction de la catalase
pour retenir que les isolats en forme de bâtonnet gram positif et catalase négative (Badis et al.,
2004), Toutes les souches (252) ont répondues à ces critères.

2. Recherche des souches lactiques productrices de substances

antimicrobiennes:
Les résultats des interactions obtenues ont permis de retenir 64 isolats représentatifs
donnant 4096 couples d’interaction. Les zones d’inhibition ont été produites sur milieu MRS
non tamponné. Les causes de l’obtention des zones d’inhibition doivent être précisées. La
production de l'acide lactique est responsable de certaines zones d'inhibition. L'utilisation du
milieu MRS tamponné (le tampon phosphate, 0,05 mM) a réduit le nombre de souches
productrices de zone d’inhibition à 08. Nos résultats sur l’étude des interactions ont permis la
révélation de différents cas d'inhibitions :

 des cas d'auto-inhibition.

 des cas inter-inhibition entre souches de mêmes espèces.

Sur 252 isolats du lait cru de chèvre, seulement 08 souches peuvent être considérées
comme productrices de substances inhibant des espèces proches. Pour la confirmation de
l’aspect bactériocinogènes des souches retenues, la détermination de la nature de l’agent
inhibiteur a été réalisée en éliminant les facteurs suivants :
- l’inhibition par la production d'acides organiques par la neutralisation.
- l’inhibition par la production du peroxyde d'hydrogène par l’enzyme de la catalase.
- l’inhibition due à l’attaque par les bactériophages en utilisant le formol.
Le choix des 08 souches fortement inhibitrices est basé sur les deux critères:
1- L’importance du diamètre de la zone d'inhibition et le pourcentage des souches inhibées.
2- Le spectre d’activité par la détermination des souches indicatrices (Type de bactéries).
La vérification de la pureté des souches et de leurs appartenances au groupe des bactéries
lactiques est régulièrement réalisée par observation microscopique.

76
 Résultats et Discussions

3. Résultats de l’identification des isolats :

 Caractérisation macroscopique:
La caractérisation macroscopique, permet de décrire l'aspect des colonies obtenues sur milieu
solide MRS a pH 5,4 après 72h d’incubation à 30°C (Ana Belen florez et al., 2006) et de
déterminer les critères relatifs aux colonies des bactéries lactiques (taille, pigmentation,
contour, aspect, viscosité), Pour les isolats testés, on a observé sur milieu solide des petites
colonies d'environ 1mm de diamètre, de forme lenticulaire de couleur blanchâtres ou
laiteuses, avec une surface lisse et un pourtour circulaire régulier (Fig. 22), La croissance en
milieu MRS liquide est caractérisée par l’apparition du trouble au fond du tube avec une zone
transparente de 5 mm d’épaisseur à la surface du milieu liquide (Fig. 23).

Figure 22: Aspect lenticulaires de couleur blanche des colonies des bactéries lactiques sur
milieu MRS solide après incubation à 30°C pendant 24 h.

Figure 23: Aspect microaérophiles des cultures pures des bactéries lactiques sur milieu MRS
liquide après incubation à 30°C pendant 24h.

77
 Résultats et Discussions

 Caractérisation microscopique:
Les 08 souches dominantes représentatives ont fait l’objet d’une étude microscopique, Les
résultats obtenus suite a la coloration des Gram et au test de la catalase, montre que les 08
souches sont des bâtonnets Gram positif et catalase négative non sporulé, Toutes les souches
présentent une forme cellulaire en bâtonnet, Le mode d’association varie d’une souche à
l’autre, il est expliqué dans le tableau (26), Ces observations permettent de classer
initialement les isolats selon le gram, leurs morphologies cellulaires et leur mode d'association
(Joffin et Leyral, 1996).

Tableau 26: Critères morphologiques, le gram et le test de la catalase des huit isolats
présumés des bactéries lactiques isolées de lait cru de chèvre.

Code de souche Gram Catalase Forme Mode d’association

Lb, 13 + - Bâtonnets fins et longs En chaine
Lb, 21 + - Bâtonnet En diplobacilles
Lb, 22 + - Bâtonnets courts En chaine
Lb, 52 + - Bâtonnets courts En chaine
Lb, 54 + - Bâtonnets courts En diplobacilles
Lb, 55 + - Bâtonnet En diplobacilles
Lb, 58 + - Bâtonnets courts En chaine et en diplobacilles
Lb, 68 + - Bâtonnets courts En chaine et en diplobacilles

La coloration de Gram montre que tous les isolats sont de Gram positif et de forme bâtonnet,
isolés ou regroupées en paire ou en chainette (Fig. 24).

100 µm
10 µm

Figure 24: Aspect morphologique cellulaire des cultures pures des isolats (Lb.58 et Lb.68)
appartenant au genre Lactobacillus.

78
 Résultats et Discussions

3.1 Le type fermentaire:

Ce test nous a permis de différencier entre les souches homofermentaires et les souches
hétérofermentaires en utilisant un milieu glucosé stérile qui contient une cloche de Durham,
Aucune production du gaz (CO2) à partir du glucose n’a été observé chez les huit isolats, ainsi
elles sont considérées comme homofermentaires.

T
T- T- 21 22 31 52 T+ 54 55 58 68 T-

Figure 25: Le test du type fermentaire des différentes souches de Lactobacillus sp, sur milieu
MRS glucose contenant une cloche de Durham, Le témoin négatif milieu MRS stérile (tube 1)
et le témoin positif (dégagement du gaz) culture de Leuconostoc mesenteroides (tube 7).

Tableau 27: Résultats du test du type fermentaire sur milieu glucosé et sur milieu gluconate
pour déterminer les souches hétérofermentaires facultatives.

Souches Homofermentaires Hétérofermentaires

(Glucosé) (gluconate)
Lb. 21 + -
Lb. 22 + -
Lb. 31 + -
Lb. 52 + -
Lb. 54 + -
Lb. 55 + -
Lb. 58 + +
Lb. 68 + +

Alors que dans la production de gaz à partir du gluconate présente deux aspects : les souches
Lb.58 et Lb.68 étaient hétérofermentaires, et les souches (Lb.21, Lb.22, Lb.31, Lb.52, Lb.54
et Lb.55) sont homofermentaire, Le tableau (27) indique clairement que les isolats (Lb.21,
Lb.22, Lb.31, Lb.52, Lb.54 et Lb.55) sont homofermentaire obligatoire, tandis que les
souches Lb. 58 et Lb. 68 sont hétérofermentaires facultatives.
3.2 Le test de l'ADH :
L’activité de l’arginine déshydrogénase effectuée sur les huit souches, sur milieu M16 PCP
a révélé que seule la souche Lb. 58 qui est ADH positive.

79
 Résultats et Discussions

Tableau 28: représente les résultats du test de l’arginine déshydrogénase (ADH) des isolats
retenus.

Souches ADH
Lb. 21 -
Lb. 22 -
Lb. 31 -
Lb. 52 -
Lb, 54 -
Lb. 55 -
Lb. 58 +
Lb. 68 -
3.3 Croissance à 15 et 45°C et la thermorésistance :
Cette étude de la croissance à 15 et à 45°C et Le test de la thermorésistance à 63,5°C
pendant 30 min (Badis et al., 2004) permet de faire la différence entre la flore thermophile et
mésophile.

Tableau 29: Croissance à différentes températures et la thermorésistance des isolats retenus.

Souches Culture à Culture à Culture à Thermorésistance
15°C 30°C 45°C (63,5°C)
Lb. 21 - + - Mésophile -
Lb. 22 - + + Thermophile -
Lb. 31 + + - Mésophile -
Lb. 52 + + + Thermophile +
Lb. 54 + + + Thermophile +
Lb. 55 + + + Thermophile -
Lb. 58 + + + Thermophile +
Lb. 68 + + + Thermophile -

L’emploi des tests (croissance à différentes températures, la recherche du type fermentaire,

l’hydrolyse de l’arginine, l’utilisation du citrate en présence du glucose) nous ont permis
d’établir une pré-identification pour le genre Lactobacillus, Nous avons subdivisés nos
souches en plusieurs groupes (groupe 1 : homofermentaires et hétérofermentaires, groupe 2 :
mésophiles et thermophiles).
Les huit souches poussent bien à 15 et 45°C après 24h, sauf la souche Lb.22 et Lb.21 qui
ne pousse pas à 15°C et Lb.31 et Lb.21 qui sont de type mésophile, elles fermentent tous le
ribose dans la galerie API 50CHL, A partir des résultats ci-dessus, et en suivant les
recommandations de Carr et al (2002), Axelsson (2004) et Hammes et Hertel (2006), on peut
conclure que les huit souches appartiennent au genre Lactobacillus.

3.4 Profil fermentaire :

La détermination des genres et des espèces bactériennes, réside essentiellement dans leur
capacité à fermenter les sucres en acide lactique et autres acides organiques. L’analyse des

80
 Résultats et Discussions

profils fermentaires (Tab. 30) révèle une grande diversité métabolique des carbohydrates chez
les isolats retenus.
Tableau 30: Profil fermentaire des sucres par les huit isolats de Lactobacillus sp.

Saccharose
Arabinose

Cellobiose
Galactose

Melibiose
Raffinose

Mannitol
Mannose
Fructose

Esculine
Sorbitol
Maltose

Glucose
Sucrose
Lactose
Ribose
Xylose
Lb.21 + + + - + + - + - - - + + - + + +
Lb.22 + + + - - + - + + + - + + - + + +
Lb.31 + + + + + + - + + + - + + + + + +
Lb.52 + + - - - + - + + - + + - + + + +
Lb.54 + + + - + + - + + - + + + + + + +
Lb.55 + + - - - + - + + - + + - + + + +
Lb.58 + + - - + + - + + - + + + + + + +
Lb.68 + + + + - + + + + + + + - + + + +

La figure 26 donne un aperçu des résultats enregistrés pour Lb.58 et Lb.68 respectivement.

Ara Rib Xyl Gal Fru Man Sor Cel Mal Lac Mél Raf

Ara Rib Xyl Gal Fru Man Sor Cel Mal Lac Mél Raf

Figure 26: Profil fermentaire des sucres de la souche Lb.58 (A) et Lb.68 (B), le virage de
l’indicateur de pH au jaune indique une réaction positive.

Les lactobacilles ne possèdent pas la catalase mais ils peuvent produire une pseudo
catalase quand le milieu contient une concentration élevée de glucose (Carr et al., 2002), Sur
la base des différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de l’arginine et du type

81
 Résultats et Discussions

fermentaire selon le substrat employé (glucose ou gluconate), le genre Lactobacillus est

subdivisé en trois groupes (Tab. 30).
Les bactéries homofermentaires et mésophiles font partie du groupe Streptobacterium, les
homofermentaires et thermophiles celui de Thermobacterium alors que Betabacterium
renferme les hétérofermentaires et mésophiles (Collins et al., 1987; Charterïs et al., 2001 et
Hammes et Hertel, 2003).
La différenciation entre les différentes espèces du genre Lactobacillus repose
essentiellement sur leur faculté de fermenter différemment les carbohydrates (Tab. 30).
Les profils fermentaires enregistrés (Tab. 30) sont comparés avec celui des souches de
référence dans la clé d'identification de Berge (Kandler et Weiss, 1986; Stiles et al., 1997 et
Carr et al., 2002) et nous a amené à définir les différentes espèces, Ainsi, le genre
Lactobacillus a été réparti en 8 éspèces.
Les souches qui fermentent le mannitol, le ribose et le raffinose, sont identifiées comme
Lb. plantarum (Schillinger et Lücke, 1987).
 La souche Lb.58 est hétérofermentaire, Thermophile et possèdent un profil
fermentaire qui correspond à celui de Lb. plantarum,
 Les souches Lb.68, Lb.54 et Lb.52 se développent à 15°C et 45°C, elles sont
identifiées à Lb. plantarum, Lb. rhamnosus n'hydrolyse ni l'arginine, ni l'urée mais
hydrolyse l’esculine (Collins et al., 1989).
Lb. plantarum est capable de pousser à des températures comprises entre 2°C et 8°C et de
ce fait peut être considérée comme étant une espèce psychrotrophe, cependant sa croissance à
ces températures est lente (Sharpe, 1962 et Schillinger et Lücke, 1987).
Les souches Lb.58, Lb.68, Lb.54 et Lb.52 sont aptes à se développer à 15°C et 45°C,
propriétés trouvées chez Lb. plantarum, Lb. paracasei subsp. parcasei, Lb. casei et Lb.
rhamnosus.
Les souches Lb.55, Lb.13, poussent à 15°C et non à 45°C caractéristiques rencontrées chez
Lb. paracasei subsp. paracasei, Lb. casei.
Les isolats qui fermentent les hexoses en lactate, en acétate et/ou en éthanol et CO2, Lb.
acidophilus fermente l’amygdalines et le cellobiose, et hydrolyse l’esculine (Rogosa et al.,
1953 et Johnson et al., 1980).
La classification des lactobacilles pourrait être mieux menée si nous avions entamés la
recherche de production de gaz à partir de gluconate, en plus du test de production de gaz à
partir du glucose, Cela nous aurait sans doute permis de classer plus facilement les
lactobacilles isolées selon leur type de fermentation (lactobacilles homofermentaires,

82
 Résultats et Discussions

lactobacilles hétérofermentaires facultatifs et lactobacilles hétérofermentaires obligatoires)

Demarigny et al., (1996).
Actuellement, le genre Lactobacillus renferme 92 espèces et 15 sous espèces, sans compter
les cinq espèces qui ont été transférées au genre Weissella (Collins et al., 1993 et Charterïs et
al., 2001).

Tableau 31: Résultats de l’identification des espèces après comparaison avec des tableaux
référentiels de Björkroth et Holzapfel, (2006) et de Hammes et Hertel, (2006).

Code de la souche Genre et espèce Pourcentage de fiabilité

Lb.21 Lactobacillus sakei subsp. sakei 85%
Lb.22 Lactobacillus plantarum 90%
Lb.31 Lactobacillus casei 75%
Lb.52 Lactobacillus rhamnosus 75%
Lb.54 Lactobacillus rhamnosus 70%
Lb.55 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 70%
Lb.58 Lactobacillus plantarum 93%
Lb.68 Lactobacillus plantarum 90%

4. La mise en évidence d'interaction entre bactéries lactiques en milieu

tamponné :
Les espèces de lactobacilles sont généralement connus par leur production des acides
organiques dans le milieu de culture et elles peuvent produire aussi le peroxyde d'hydrogène
et d’autres composés antimicrobiens (Barefoot et Klaenhammer, 1984, Walsh et al., 2008,
Saidi et al., 2011 et Mami et al., 2012).
4.1 Production de substance antimicrobienne :
Les résultats des interactions en milieu solide entre les différentes souches de Lactobacillus
indiquent éventuellement que l’agent inhibiteur est une bactériocine, La confirmation de la
nature de cette substance passe obligatoirement par plusieurs étapes, Ces tests permettront la
détermination de la nature de l’agent inhibiteur, du mode et du spectre d’action.
La méthode par diffusion sur milieu solide (Fleming et al., 1975) est utilisée pour la
détection des inhibitions; elle se traduit par la formation d’un halo autour de la souche
ensemencée en touche, La lecture des résultats consiste à mesurer le rayon de l’halo
d’inhibition de la souche indicatrice ensemencée en double couche au-dessus des souches
inhibitrices, Les résultats obtenus ont révélé la présence de zone d’inhibition chez 08 isolats
qui appartiennent aux espèces suivantes, Lb. plantarum (2), Lb. rhamnosus (2), Lb.
acidophilus (1), Lb. sakei subsp. sakei (1), Lb. casei (1) et Lb. paracasei subsp. paracasei (1).
L’intérêt de ces espèces de Lactobacillus consiste à leur intégration en transformation
laitière et à la production de bio-ingrédients à activité antimicrobienne (Ennahar et al., 1999;
Luchansky, 1999 et Deegan et al., 2006), Ces souches pourront donc être pris en

83
 Résultats et Discussions

considération pour l’élaboration de ferments possédant la capacité d’améliorer la qualité

sanitaire des produits alimentaire fermentés (Bredholt et al., 2001; Brillet et al., 2005;
Abriouel et al., 2001 et Deegan et al., 2006).

4.2 Inhibitions entre les bactéries lactiques :

La majorité des lactobacilles retenus possèdent un spectre d’activité élevé, En revanche, les
espèces de Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus ont un
spectre d’action réduit et elles ont inhibées un nombre de souches inférieures à 3 souches
(Tab. 32).
- Les souches les plus inhibées comprennent Lb. plantarum.
- L’espèce la plus inhibitrice est Lb. plantarum.
Ce grand effet inhibiteur des lactobacilles peut avoir deux origines :
La première est la production d’acide organiques; en effet, les lactobacilles sont connus
pour une grande résistance aux pH acides (jusqu’à un pH voisin de 3,5) contrairement aux
autres genres de bactéries lactiques qui sont plus sensibles (Adams et Hall, 1988; Wong, et
Chen, 1988; Benthin et Villadsen, 1995; Podolak et al., 1996 et Wilson et al., 2005).
La deuxième est que les lactobacilles produisent une autre substance inhibitrice (type
bacteriocine) active sur de nombreuses espèces (Larsen et al., 1993; Anderssen et al., 1998;
Oyetayo et al., 2003 et Avila et al., 2005).

5. Recherche de la nature de l’agent inhibiteur :

La présence d’une inhibition n’est pas due uniquement à la production de bactériocines,
Cette inhibition peut avoir plusieurs origines parmi lesquelles, nous pouvons mentionner la
production d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène, de phages et/ou de bactériocines
(Moreno et al., 1999; Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Maldonado et al., 2003;
Todorov et Dicks, 2005 et Boumehira et al., 2011).
Les bactériocines des bactéries Gram- et Gram+, représentent un groupe hétérogène de
substances antibactériennes dont le poids moléculaire, les propriétés biochimiques, le spectre
d'activité et le mode d'action peuvent être très différents (Riley et Wertz, 2002; Aslim et al.,
2005 et Deegan et al., 2006).
Trois critères sont indispensables pour qu'une substance antibactérienne soit définie en tant
que bactériocine (Klaenhammer, 1988).
1. La présence d'une partie biologiquement active de nature protéique;
2. Un spectre d'activité limité aux espèces taxonomiquement proches, ou occupant
la même niche écologique ;
3. Un mode d'action bactéricide.

84
 Résultats et Discussions

Les résultats obtenus à la suite des différents tests sur milieu solide et liquide, nous
orientent sur l'activité des substances antimicrobiennes que nous avons décelées. Pour la
recherche de la nature de l’agent inhibiteur sur milieu solide, nous avons sélectionné huit
souches qui se répartissent comme suit:
Lactobacillus plantarum (2), Lactobacillus rhamnosus (2), Lactobacillus acidophilus (1),
Lactobacillus sakei subsp. sakei (1), Lactobacillus casei (1), Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (1).
Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al., (1977) qui établit que le sélection des
souches soit établit à partir des mesures des activités inhibitrices sur milieux solides.

5.1 Effet de la production d’acides :

Pour minimiser la production d’acide, nous avons utilisé un milieu tamponné à pH 7 avec
le tampon phosphate 100 mM.
L’évaluation des résultats obtenus avec le milieu normal (non tamponné) et le milieu
tamponné à pH = 7 nous ont permis de déterminer si la production d’acides est un facteur actif
des inhibitions enregistrées, L'inhibiteur due à la production de l’acide lactique a été mise en
évidence par (Budde et al., 2003).
L’intensité de l’inhibition pour toutes les souches est diminuée en milieu tamponné,
Plusieurs chercheurs ont soulignés l’influence que peut exercer le pH sur le degré de l’activité
inhibitrice de la bactériocine (Aasen et al., 2000; Abriouel et al,, 2001 et Mataragas et al.,
2003).
L'apparition de zones claire dans le milieu ne confirme pas que ces inhibitions sont dues à
des bactériocines elles peuvent être dues à l'acidification du milieu (Desmazeaud, 1983). Le
milieu tamponné (tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH =7) maintient le pH constant
(Sambrook et al., 1986) afin d'éliminer l'effet de l'acidité produite dans le milieu, Le nombre
de souches inhibitrices observées, en milieu tamponné, était moins important que celui
observé en milieu non tamponné, Le diamètre des zones d’inhibition des souches a diminué
comparé à ceux obtenues en milieu non tamponné (Fig. 27).
On remarque aussi que toutes les souches lactiques inhibent la souche Lb.58 (Lactobacillus
plantarum) avec des diamètres qui varient entre 3mm et 8mm, mais la Lb.58 n’est pas inhibée
par elle-même, alors on peut dire qu’il n’y a pas d’auto-inhibition, ceci est due à la protection
de la souche contre ces propres métabolites (Guessas et al., 2005).
En remarque tous les souches lactiques inhibent les souches Lb.68 et Lb.55 (Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei), avec des diamètres qui varient entre 3
mm et 7 mm.

85
 Résultats et Discussions

Tableau 32: Les interactions entre les différentes souches retenues, les souches ensemencées
en touches sont des bactéries (en colonnes), les souches test (bactéries lactiques) sont
ensemencées en surfaces, le diamètre de la zone d'inhibition est mesuré en (mm) dans le
milieu de culture (milieu tamponné) :

Code des souches 58 55 68

Lb. 21 6 4 2
Lb. 22 3 3 5
Lb. 31 7 4 3
Lb. 52 4 7 2
Lb. 54 5 4 5
Lb. 55 8 3 5
Lb. 68 6 3 0
Lb. 58 0 7 5
Souche 58

Lb. 22 Lb. 68 Lb. 21

Lb. 52 Lb. 55

Lb. 58 Lb. 31 Lb. 54

Souche 68

Lb. 22 Lb. 68 Lb. 21

Lb. 52 Lb. 55

Lb. 54 Lb. 31 Lb.58

Figure 27: Les interactions entre les isolats des bactéries lactiques du genre Lactobacillus
(SoucheLb.58 et Lb.68) sur milieu solide tamponné (la zone claire autour des colonies indique une
inhibition de la souche test.

5.2 Production de peroxyde d'hydrogène :

Le peroxyde d'hydrogène est, depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de
l'activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des lactobacilles (Juillard
et al, 1987).
Les bactéries lactiques sont généralement catalase (–) négative mais certains souches
peuvent accumuler du peroxyde d'hydrogène lorsqu’elles sont cultivées en aérobiose ou en
micro aérobiose.

86
 Résultats et Discussions

Tableau 33 : La production de peroxyde d'hydrogène par les différentes souches retenues

Souches Catalase
Lb. 21 -
Lb. 22 -
Lb. 31 -
Lb. 52 -
Lb. 54 -
Lb. 55 -
Lb. 68 +
Lb. 58 +

Le niveau d'accumulation varie selon la souche bactérienne, il peut être auto-inhibiteur

révélant une activité plus intense des réactions génératrices de peroxyde d'hydrogène que des
réactions peroxydasique provoquant son élimination (Juillard et al., 1987).
La synthèse entre l’inhibition due à la production d’acide et de peroxyde d’hydrogène
montre que l’inhibition est due à des facteurs différents:
1. l’acidité uniquement : pas de souches.
2. le peroxyde d’hydrogène: (Lb.58, Lb.68) Lactobacillus plantarum, (Lb.52, Lb.54)
Lactobacillus rhamnosus, (Lb.55) Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.
3. les deux (l’acidité + le peroxyde d’hydrogène): pas de souche.
4. à un autre agent inhibiteur qui peut être une bactériocine: Lactobacillus plantarum
(Lb.58), Lactobacillus sakei subsp. sakei (Lb.31), Lactobacillus acidophilus (Lb.2),
Lactobacillus casei (Lb.13).

5.3 La production de phage lysogène:

Les phages peuvent être l'origine des inhibitions dans la croissance bactérienne (Davies et
Gasson, 1980), Le test des phages s’est révélé négatif pour l’ensemble des souches, aucune
plage de lyse n’est apparue après incubation, L’obtention d’un tapis bactérien signifie que
l'effet inhibiteur ne peut pas se propager d'une bactérie à l'autre et donc qu'il n'est pas dû à la
présence de bactériophages (Lewis et al., 1991).
Les substances actives sont donc épuisées au cours de l'action antibactérienne, ce qui
n'exclut pas la production d’acides (Deegan et al., 2006), de peroxyde d'hydrogène (Piard et
Desmazeaud, 1991), de diacétyle (Condon, 1987) et ou de substances de type bactériocines
(Alexandre et al., 2002) par les souches isolées.

87
 Résultats et Discussions

5.4 L’effet des enzymes protéolytiques sur la substance inhibitrice:

Comme les bactériocines sont de nature protéique, les réponses obtenues après l’action des
enzymes protéolytiques (trypsine et α-chymotrypsine) nous permettra d’identifier les
substances antibactériennes comme étant des bactériocines.
Si le halo d’inhibition disparaît en présence de l’action d’une enzyme protéolytique,
l’agent inhibiteur est de nature protéique (Callewaert et de Vuyst, 2000 et Aslim et al, 2005).
Mais s’il persiste après l’action des deux enzymes utilisées, il y a une forte probabilité pour
que l’agent ne soit pas de nature protéique c'est-à-dire une bactériocine,
Puisque les bactériocines sont par définition des substances protéiniques, la sensibilité aux
enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation.
La perte de l'activité antimicrobienne après traitement avec des enzymes indique la
sensibilité des composés actifs sécrétés par les souches mises en culture. Puisque les
bactériocines sont par définition des substances protéiques. Elles doivent être sensibles à au
moins à une enzyme. En conséquence, la sensibilité aux enzymes protéolytiques est le critère
principal dans leur caractérisation (Çon et Gökalp, 2000; El Shafei et al., 2000 et Cintas et al.,
2001).
Cependant, plusieurs facteurs peuvent avoir un effet sur l'activité antimicrobienne
comprenant l'interaction entre la bactériocine et les constituants des cellules ou du milieu de
croissance, de la pureté et de la concentration de l'enzyme et de la technique employée pour
déterminer la sensibilité enzymatique (Nes et al., 1996).
L'effet des diverses enzymes protéolytiques utilisées est montré dans la figure 28 et le
tableau 34.

Tableau 34: Révèle l'action des enzymes protéolytiques et le traitement thermique sur
l'activité antimicrobienne des extraits bruts sur la croissance de Staphylococcus aureus.

Souches α-chymotrypsine Trypsine Traitement thermique 100°C

Lb. 21 - - -
Lb. 22 - + -
Lb. 31 - - -
Lb. 52 - + -
Lb. 54 - - -
Lb. 55 - - -
Lb. 68 - - +
Lb. 58 - - -

88
 Résultats et Discussions

68 58
1 1
2 2

4 4
3
3

Figure 28: L'action des enzymes protéolytiques et le traitement thermique sur l'apparition des
zones d'inhibition en presence de Staphylococcus aureus (1: α-chymotrypsine; 2: Substance
de la Souches; 3: Traitement thermique 100°C; 4: Trypsine)
La perte de l'activité antimicrobienne après traitement avec les enzymes protéolytiques
indique la sensibilité des composés actifs sécrétés par les souches à l’action des enzymes
protéolytiques, Pour les souches performantes testées pour leur nature d'agent inhibiteur, On a
pu remarquer que parmi les huit souches inhibitrices motionné dans le tableau 34, les souches
(Lb.58, Lb.68, Lb.55, Lb.54, Lb.52 et Lb.31) permettent de suggérer que l'activité antagoniste
de ces souches soit due à une substance de nature protéique ou peptidique, des résultats
similaires ont été rapportés par Scheved et al., (1993) au cour de leurs recherches sur la nature
des agents inhibiteurs de types bactériocines, Tandis que pour les souches (Lb.52 et Lb.22)
nous avons notés une zone d’inhibition autour de l’enzyme de la trypsine elle reflète une
sensibilité de cet agent inhibiteur aux enzymes protéolytiques.
Cette sensibilité partielle, déjà observée, peut s'expliquer par:
 Soit l'agent inhibiteur est protéique et alors le clivage enzymatique conduit à un
fragment qui garde une activité inhibitrice partielle.
 Soit l'agent inhibiteur est une protéine conjuguée et l'activité inhibitrice est portée par
la partie non protéique : dans ce cas les enzymes effectuent la configuration structurel
de la partie protéique ce qui réduit l'activité antagoniste.
1. Peroxyde d’hydrogène et substance protéique cas de la souche (Lb.22)
Lactobacillus sakei subsp. sakei.
2. Acidité, peroxyde d’hydrogène et substance protéique pas de cas observée.
3. Substance protéique uniquement cas de la souche (Lb.52 et Lb.22)
Lactobacillus rhamnosus et Lactobacillus sakei subsp. sakei respectivement.
L’agent inhibiteur est résistant uniquement à une seule enzyme:
 l’-chymotrypsine pas de souche.
 la trypsine cas de deux souches: Lb.52 et Lb.22.
 l’agent inhibiteur est sensible aux deux enzymes cas de: Lb.58, Lb.68,
Lb.55, Lb.54, Lb.21 et Lb.31.

89
 Résultats et Discussions

La substance protéique produite par Lb.52 et Lb.22 est sensible à l’α-chymotrypsine et

mais résistante à la trypsine.
Plusieurs facteurs peuvent avoir un effet sur l'activité antimicrobienne parmi lesquelles
l'interaction entre la bactériocine et les constituants des cellules ou du milieu de croissance
(Ness et al., 1996), de la pureté et de la concentration de l'enzyme et de la technique employée
pour déterminer la sensibilité enzymatique (Piard et al., 1990).
Cependant, plusieurs facteurs peuvent avoir un effet sur l'activité antimicrobienne
comprenant l'interaction entre la bactériocine et les constituants des cellules ou du milieu de
croissance, de la pureté et de la concentration de l'enzyme et de la technique employée pour
déterminer la sensibilité enzymatique (Nes et al., 1996).
La spécificité de l'action des bactériocines parmi les bactéries à Gram+ est fonction des
caractéristiques des souches: composition des protéines et des phospholipides membranaires
et de la couche de peptidoglycane. L'incapacité des bactériocines à traverser cette barrière est
due à leur poids moléculaire et/ou à leur propriétés hydrophobes (Schved et al., 1994).
Dans le cas où la membrane externe est rendue perméable, soit par un traitement physique
(Kalchayanand et al., 1992), soit par un traitement chimique (Stevens et al., 1991 et Schved et
al., 1994), les bactéries Gram- deviennent sensibles aux bactériocines.
D'autres bactériocines de lactobacilles possèdent un champ d'activité pouvant regrouper
n'importe quel genre de bactérie Gram+: ce sont par exemple les plantaricines C19, A et B
(Lb. plantarum C19, C-11 et NCDO1103) (Nettles et Barefoot, 1993).
Les substances antimicrobiennes produites par les souches bactériennes isolées du lait cru
de chèvre répondent aux critères retenus par Klaenhammer (1988) on peut dire que les
souches Lactobacillus possèdent une activité antibactérienne, qui est due à l’acide lactique, et
à un agent de nature protéique, peut être bactériocine, C’est le cas des substances inhibitrices
produites par Lb. plantarum (Lb.58, Lb.68).
Lors de la caractérisation des bactériocines, des variations importantes dans les spectres
d'activité sont constatées, Il est également noté que la sensibilité d'une souche dépend du
genre, de l'espèce et même de la sous-espèce, Ces variations de sensibilité sont dues aux
caractéristiques des souches (présence ou absence de sites récepteurs) et donc aux niveaux de
lésions occasionnées par le facteur inhibiteur (Kalchayanand et al., 1992).

90
 Résultats et Discussions

6. Identification par galerie API 50 CHL :

Les résultats de la fermentation des hydrates de carbone sur la galerie API 50CH, ont
permis l’identification des espèces, la figure (29) et le tableau (35), indiquent les résultats du
profile de fermentation des hydrates de carbones, Après la comparaison des résultats, avec les
donnés de Carr et al., (2002), Axelsson (2004) et Hammes et Hertel (2006). Les souches sont
classées dans les espèces suivantes :
 Les souches Lb.58 et Lb.68, appartiennent à l’espèce Lactobacillus plantarum, ces
résultats sont identiques au profil fermentaire de Lactobacillus plantarum ATCC
14917, obtenu à partir de la base des données de Biomerieux, à qui le pourcentage de
similitude était de 100% pour la souche Lb.58 et de 97,95% pour les souches Lb.68.

91
 Résultats et Discussions

Tableau 35: Comparaison du profil d’utilisation des carbohydrates par Lb.58, Lb.68, Lbc 22,
Lbc 5 et Lbc 6.
hydrates de Souches
carbone Lb.58 Lb.68 LbC 22 LbC 5 LbC 6 Lactobacillus
Lait de Lait de Lait de Lait de Lait de plantarum
chèvre chèvre chamelle chamelle chamelle ATCC 14917
Témoin - - - - - -
Glycérol - - - - - -
Erythritol - - - - - -
D- Arabinose - - - - - -
L- Arabinose + + + + + +
D- Ribose + + + + + +
D- Xylose - - - + - -
L- Xylose - - - - - -
D- Adonitol - - - - - -
MDX - - - - - -
D- Galactose + + + + + +
D- Glucose + + + + + +
D- Fructose + + + + + +
D- Mannose + + + + + +
L- Sorbose - - - - - -
L- Rhamnose - - - - - -
Dulcitol - - - - - -
Inositol - - - - - -
D- Mannitol + + + + + +
D- Sorbitol + + + + + +
MDM + - + - - +
MDG - - - - - -
NAG + + + + + +
Amydaline + + + + + +
Arbutine + + + + + +
ESC + + + + + +
Salicine + + + + + +
D- Celiobiose + + + + + +
D- Maltose + + + + + +
D- Lactose 1 + + + + + V
D- Melibiose + + + + + +
D-Saccharose + + + + + +
D- Trehalose + + + + + +
Inuline - - - - - -
D- Mélézitose + + + + + +
D- Raffinose + + + + + +
Amidon - - - - - -
Glycogène - - - + - -
Xylitol - - - - - -
Gentiobiose + + + + + +
D-Turanose + + + + + +
D- Lyxose - - - - - -
D- Tagatose - - - + - -
D- Fucose - - - - - -
L-Fucose - - - - - -
D- Arabitol - - - - - -
L-Arabitol - - - - - -
GNT + + + + + +
2KG - - - - - -
5KG - - - - - -
Identifiée Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus
comme plantarum plantarum plantarum plantarum plantarum plantarum

MDX : Méthyl-βD-Xylopyranoside, MDM : Méthyl-αD-Mannopyranoside, MDG : Méthyl-αD-

Glucopyranoside, NAG: N-AcétylGlucosamine, ESC : Esculine citrate de fer, 2KG : Potassium 2-
cétogluconate, 5KG : Potassium 5 cétogluconate, GNT : Potassium Gluconate. 1origine bovine

92
 Résultats et Discussions

Afin de donné un approche quantitative entre les différentes souches, le coefficient de

simple appariement (SSM) a été calculé, en utilisant les différents caractéristiques de chaque
souche, en prenant en compte les résultats de l’identification du genre et des tests
technologiques, Dans le tout la comparaison a pris en compte 62 caractères, Les résultats sont
exprimés sous forme de matrice (Fig. 29).

Lb 22 1,00
Lb.58 1,00 1,00
Lb.68 0,98 0,98 1,0
LbC 5 0,93 0,93 0,95 1,0
LbC 6 0,98 0,98 1,0 0,95 1,0
Lb 22 Lb.58 Lb.68 LbC 5 LbC 6

Figure 29: Matrice de similitude entre les cinq souches lactiques étudiées.

Le degré de similitude des souches s’étend de 0,93 à la similitude complète 1,0. A partir de
ces résultats ont peu clairement distingué 3 groupes: le groupe 1: LbC 22 et Lb.58, le groupe
2: Lb.68 et LbC 6 et le groupe 3: LbC 5.

Lb 22

0,98
0,96
0,94
LbC 6 0,92 Lb 58 Série1
0,9 Série2
0,88 Série3
Série4
Série5

LbC 5 Lb 68

Figure 30: Représentation graphique du coefficient SSM entre les cinq souches lactiques.

93
 Résultats et Discussions
Souche Lb. 58

Après 24h Après 48h

Souche Lb.68

Figure 31: Test de fermentation des hydrates de carbone sur galerie API 50 CHL des souches
Lb.58 et Lb.68

Les caractères microbiologique et le profile fermentaire de la souche Lb. plantarum

(Lb.58) et de la souche de référence Lb. plantarum ATCC 14917 sont identiques à 100 %, Ce
coefficient de similitude est calculer entre souche Lb.58 et la souche de référence et la souche
(Lb.68) est de 97 %, Ce qui oriente l’identification de la souche (Lb.58) a l’espèce de
Lactobacillus plantarum.

7. Les souches tests :

La confirmation des souches pathogènes a été vérifiée par l’étude morphologique et
l’observation microscopique. La confirmation de staphylococcus aureus (ATCC 25923,
ATCC 29213, ATCC 43300) a été réalisée par la croissance sur milieu Chapman qui nous
indique l’utilisation du mannitol et la résistance au sel (NaCl) car ce sont des halophile et le
pouvoir pathogène confirmer par les deux tests coagulase et DNase effectuée au CHU d’Oran.
L'autre espèce d'Escherichia coli ATCC 25922 a été vérifiée par les tests courants des
enterobactéries et la de production d’indole.

94
 Résultats et Discussions

Les bactéries Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella enterica ont été identifiées aussi et vérifiées par les tests
biochimiques des enterobactéries et les milieux spécifiques l’identification au niveau du
laboratoire central CHU d’Oran.
La souche de Listeria ivanovii ATCC 19119 provient du département de chimie
anaclitique, de nutrition et science alimentaire, de l’université de Santiago decomposto
(Espagne).

8. Apptitudes technologiques des souches :

La production d’acetoïne se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du
milieu, nos résultats révèlent que tous les isolats sont producteurs d’acetoïne (VP+).
Les cinq souches ont résisté à un chauffage de 30 min à 63,5°C au bain Marie, Elles
produisent de l’acetoïne sur milieu Clark et Lubs, ne produisent pas de dextrane sur milieu
MSE, utilisent du citrate en présence de glucose « milieu KMK », et possèdent la capacité
d’hydrolyser la caséine du lait, Le tableau 36 résume ces différents résultats technologiques :

(a) Production d’acetoïne sur milieu (b) Test de production de dextrane

Clark et Lubs glucose milieu MSE

(c) Utilisation du citrate en présence (d) Hydrolyse de la caséine du lait

de glucose sur (milieu KMK) dans milieu MRS liquide

Figure 32: Résultats des tests technologiques des cinq souches de Latobacillus.

95
 Résultats et Discussions

Tableau 36: Résultats des tests technologiques des cinq souches de Latobacillus;
thermorésistance, production d’acetoïne et de dextrane, utilisation du citrate et l'hydrolyse de
la caséine du lait.

Caractère Souches
Lb 58 Lb 68 LbC 22 LbC 5 LbC 6
Thermorésistance (30min à 63,5°C) + + + + +
production d’acetoïne + + + + +
Production du dextrane - - - - -
Utilisation du citrate + + + + +
Hydrolyse de la caséine du lait + + + + +

9. L’action des lactobacilles sur la croissance de Staphylococcus aureus,

Bacillus cereus et E. coli sur milieu solide non tamponnée et
tamponnée :
Les résultats obtenus dans l'interaction entre souches lactiques les plus performantes dans
le milieu tamponné montrent une inhibition de 8 souches, ces derniers utilisées dans
l'interaction avec les souches test à Gram+ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus et à Gram-
Escherichia coli comme souche pathogène.
Staphylococcus aureus ATCC 25923

A B
Lb.22 Lb.68 Lb.21

Lb.52 Lb.55

Lb.54 Lb.31 Lb.58

Figure 33: L'activité antimicrobienne vis-à-vis de Staphylococcus aureus ATCC 25923 par
l'apparition des zones claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A et en
milieu tamponné B.

Escherichia coli ATCC 25922

A B
Lb.22 Lb.68 Lb.21

Lb.52 Lb.55

Lb.54 Lb.31 Lb.58

96
 Résultats et Discussions

Figure 34: Illustre l'activité antimicrobienne vis-à-vis Escherichia coli ATCC 25922 par
l'apparition des zones claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A et en
milieu tamponné B.

Bacillus Cereus
A B
Lb.21 Lb.68 Lb.13

Lb.55 Lb.52

Lb.58 Lb.31 Lb.54

Figure 35: Illustre l'activité antimicrobienne vis-à-vis de Bacillus cereus Par l'apparition des
zones claires d'inhibition autour des colonies en milieu non tamponné A et en milieu
tamponné B.

Tableau 37: Résultats des interactions entre les souches de bactéries lactiques et les souches
pathogènes, En mesurant le diamètre de la zone d’inhibition en mm (A : Milieu non
tamponné ; B : Milieu tamponné).

Souches S. aureus ATCC 25923 Bacillus cereus E. coli ATCC 25921

A B A B A B
Lb.21 16 14 25 12 12 12
Lb.22 26 15 23 08 11 08
Lb.31 25 13 26 10 12 12
Lb.52 15 15 25 9 11 10
Lb.54 25 17 24 08 16 12
Lb.55 20 20 25 10 11 11
Lb.58 28 22 26 15 14 12
Lb.68 19 14 26 11 13 10

On remarque que la souche Lb.58 a donné une inhibition considérable vis à vis de
Staphylococcus aureus, cette inhibition est due à une substance inhibitrice, sachant que
L’expérience a été conduite en milieu tamponné afin d’écarter l’effet d’acidité dû à la
production d’acide lactique , les tests supplémentaires à savoir peroxyde , phage et l’effet des
enzymes protéolytique confirme la nature de cette substance, ainsi l’inhibition est due à une
bactériocine selon la définition donné par Tagg et al. (1976).
- Les souches Lb.58 et Lb.68 ont aussi exprimés des inhibitions vis à vis Bacillus cereus et
E. coli a différents diamètres de zone d’inhibition.
- Les souches Lb.58 et Lb.68 ont aussi exprimés des inhibitions vis à vis du
Staphylococcus aureus en milieu lait en culture mixte.

97
 Résultats et Discussions

Pour cette étude nous avons choisi une souche productrice en se basant sur les résultats
statistiques et les résultats observés dans l'étude de l'interaction entre souche inhibitrice et
souche test Staphylococcus aureus, on a remarqué que la souche Lb.58 a présenté un diamètre
de 22 mm avec Staphylococcus aureus et 15 mm avec Bacillus cereus et 12 mm avec E. coli.
- La souche 68 a présenté un diamètre de 14 mm avec Staphylococcus aureus et 11 mm
avec Bacillus cereus et 10 mm avec E. coli.
10. Interactions bactériennes :
10.1 L’antagonisme bactérien des souches Lactobacillus plantarum (Lb.58, Lb.68) :
Les résultats des tests d’interactions des souches Lactobacillus et les souches pathogènes
sont présentés dans le Tableaux (38).
Les résultats sont exprimés en mm, par mesure de la distance entre la limité de la colonie
bactérienne et le début de la zone de non inhibition de la souche indicatrice.
Les souches présentant une zone claire d’extension latérale supérieure à 2 mm sont
considérées comme productrices de substances antibactériennes (Fleming et al., 1975), Le test
statistique de Student a été utilisé pour comparer entre les différents résultats.

Tableau 38: Résultats des tests d’interaction sur milieu MRS pH 6,2 (A) et MRS tamponné
(B) (en mm).

Souches indicatrices Lb. plantarum 58 Lb. plantarum 68

Gram + A B A B
S. aureus ATCC 25 923 28,00 ± 1,00 20,00 ± 1,00 19,00 ± 1,00 14,00 ± 1,00
S. aureus ATCC 29 213 20,00 ± 1,00 15,00 ± 1,00 10,00 ± 1,00 2,6 ± 0,45
S. aureus ATCC 43 300 18,00 ± 1,00 10,00 ± 1,00 12,00 ± 1,00 0,40 ± 0,89
Listeria ivanovii ATCC 19 119 10,00 ± 1,00 07,66 ± 2,02 10,00 ± 1,00 1,66 ± 2,02
Bacillus cereus 26,00 ± 1,00 13,00 ± 1,00 26,00 ± 1,00 11,00 ± 1,00
Gram -
E. coli ATCC 25 922 14,00 ± 1,00 13,00 ± 1,91 13,00 ± 1,00 10,00 ± 1,00
Klebsiella pneumoniae 7,50 ± 1,80 2,00 6,00 ± 2,00 0,5
Acinetobacter calcoaceticus 2,00 ± 0,50 0,5 5,00 ± 0,50 2±1
Pseudomonas aeruginosa 3,16 ± 1,75 0,5 4,50 ± 0,50 0,5
Salmonella enterica 5,00 ± 0,50 3,00 3,00 ± 0,50 1,50 ± 0,70
Lactobacillus
Lb. plantarum 58 0,00 0,00 2 0,5
Lb. plantarum 68 3,00 1,00 0,00 0,00

10.1.1 Inhibition des souches Staphylococcus aureus :

Dans notre étude, on a utilisé trois souches de S. aureus : ATCC 25 923, ATCC 29213, et
ATCC 43300.
a) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 25923 par les souches
Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68):
Sur le milieu MRS normal (pH 6,2) toutes les souches lactiques ont inhibées la souche S.
aureus ATCC 25923, Sur milieu MRS tamponnée (pH 7), les deux souches Lactobacillus

98
 Résultats et Discussions

plantarum (Lb.58, Lb. 68) possèdent une activité inhibitrice sur la souche S. aureus ATCC
25923, Après l’application du test de Student, il apparait qui existe une différence
significative entre l’activité inhibitrice des souches Lb.58, Lb.68.

b) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 29213 par les souches

Lactobacillus plantarum (58 et 68):
Sur le milieu MRS normal (pH 6,2) toutes les souches lactiques ont inhibées la souche S.
aureus ATCC 29213, avec une activité d’inhibition égale à 10 ± 1 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les cinq souches Lactobacillus plantarum (Lb.58,
Lb.68) possèdent une activité inhibitrice sur la souche S. aureus ATCC 25923, Après
l’application du test de Student, il apparait que la souche Lb.58 possède la meilleure activité
inhibitrice avec un score de 15,00 ± 0,83 mm, Une activité qui ne diffère pas beaucoup sur
celle observé sur un milieu MRS normal, La souche de Lb. plantarum (Lb.68) a une grand
différence par rapport au milieu normale et la souche Lb. plantarum (Lb.58).

c) Inhibition de la souche Staphylococcus aureus ATCC 43300 par les souches

Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68):
Sur le milieu MRS normal (pH 6,2) toutes les deux souches lactiques ont inhibées la
souche S. aureus ATCC 43300, avec une activité d’inhibition égale à 18 ± 1 mm pour la
souche Lb. 58, et de 12 ± 1 mm pour Lb. 68.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), la souche Lb.58 possède une activité inhibitrice contre
la souche S. aureus ATCC 43300, Après l’application du test de Student, il apparait que la
souche Lb.58 possède la meilleure activité inhibitrice avec un score de 10,00 ±1 mm, Une
activité qui ne diffère pas trop sur celle observée sur un milieu MRS normal, La souche
Lb.68, possède une très faible activité inhibitrice sur S. aureus ATCC 43300, avec un score de
0,40 ± 0,89 mm.

10.1.2 Inhibition de la souche Listeria ivanovii ATCC 19119 :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2) toutes les deux souches lactiques ont inhibées la
souche Listeria ivanovii ATCC 19119, avec une activité d’inhibition égale à 10 ± 1mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les deux souches Lb.58, Lb.68 possèdent une activité
inhibitrice contre la souche Listeria ivanovii ATCC 19119, Après l’application du test de
Student, il apparait que la souche de Lb. plantarum (58) possède la meilleure activité
inhibitrice avec un score de 7,66 ± 2,02 mm.

99
 Résultats et Discussions

10.1.3 Inhibition de la souche Escherichia coli ATCC 25922:

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2) toutes les deux souches lactiques ont inhibées la
souche E. coli ATCC 25922, avec une activité d’inhibition égale à 14,00 ± 1 mm et 13,00 ± 1
mm pour Lb. plantarum (Lb.58, Lb.68) respectivement.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les souches (Lb.58, Lb.68) possèdent une activité
inhibitrice contre la souche E. coli ATCC 25922, Après l’application du test de Student, il
apparait que la souche de Lb. plantarum (Lb.58) possède la meilleure activité inhibitrice avec
un score de 10,00 ± 1,91.

10.1.4 Inhibition de la souche Klebsiella pneumoniae :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), les souches Lb. plantarum (Lb.58, Lb.68) ont inhibées
la souche Klebsiella pneumoniae, Après l’application du test statistique de Student, il n’existe
pas apparemment une différence significative entre leur activité antibactérienne, elle est
estimée à 7,5 ± 1,80 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), la souche Lb. plantarum (Lb.58) a inhibées la souche
Klebsiella pneumoniae, avec le minimum accepté (2 mm), Alors que les souches Lb.
plantarum (Lb.68) a une activité de 0,5 ± 0,00 mm dans ces conditions.

10.1.5 Inhibition de la souche Acinetobacter calcoaceticus :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont
inhibées la souche Acinetobacter calcoaceticus, Après l’application du test statistique de
Student, on distingue la souche Lb. plantarum (Lb.58) qui a une activité antibactérienne
estimée à 2,00 ± 0,50 mm, et la souche Lb. plantarum (Lb.68) qui ont une activité aux
alentours de 5,00 ± 0,50 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont inhibées
la souche Acinetobacter calcoaceticus, La souche Lb. plantarum (Lb.68) possède une activité
inhibitrice de 2 ± 1 mm et la souche Lb. plantarum (Lb.58) a inhibé avec 0,5 mm.

10.1.6 Inhibition de la souche Pseudomonas aeruginosa :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), les souches Lb. plantarum (Lb.58, Lb.68) ont inhibée
la souche Pseudomonas aeruginosa, Après l’application du test statistique de Student, les
souches ont presque la même activité aux alentours de 4,50 ± 0,50 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont inhibées
la souche Pseudomonas aeruginosa, avec le minimum accepté de 0,5 mm.

100
 Résultats et Discussions

10.1.7 Inhibition de la souche Salmonella enterica :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont
inhibées la souche Salmonella enterica, Après l’application du test statistique de Student, les
souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont presque la même activité aux alentours de 5,00 ±
0,5 mm, La souche Lb. plantarum (Lb.68) à une activité inhibitrice de 5,00 ± 0,5 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), aucune souche lactique n’a inhibé la souche Salmonella
enterica.

10.1.8 Inhibition de la souche Bacillus cereus :

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont
inhibées la souche Bacillus cereus après l’application du test statistique de Student, les
souches ont la même activité aux alentours de 26,00 ± 1,00 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), les souches Lb. plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont inhibées
la souche Pseudomonas aeruginosa, avec 3,00 ± 0,0 mm pur Lb. plantarum (Lb.58) et 1,5 ±
0,00 pour Lb. plantarum (Lb.68).

10.1.9 Inhibition de la souche Lactobacillus plantarum Lb.58:

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), la souche Lb.68 a inhibé la souche Lactobacillus
plantarum (Lb.58), Après l’application du test statistique de Student, La souche Lb.
plantarum (Lb.58) à une activité inhibitrice de 2,00 ± 0,00 mm.
Sur milieu MRS tamponné (pH 7), la souche Lb. plantarum (Lb.68) a inhibée la souche
Lactobacillus plantarum (Lb.58), avec une activité inhibitrice acceptée (0,5 mm).

10.1.10 Inhibition de la souche Lactobacillus plantarum Lb.68:

Sur le milieu MRS normal (pH 6,2), la souche Lb. plantarum (Lb.68) a inhibée la souche
Lactobacillus plantarum (Lb.58), Après l’application du test statistique de Student, La souche
(Lb.58) à une activité inhibitrice de 3,00 ± 0,00 mm. Sur milieu MRS tamponné (pH 7), la
souche Lb. plantarum (Lb.68) a inhibée la souche Lactobacillus plantarum (Lb.58), avec une
activité inhibitrice acceptée (1 mm).

11. Cinétique d'évolution de l’acidité (pH et D°) et Etude du pouvoir

coagulant du lait écrémé de Lactobacillus plantarum a différentes
températures d’incubation :
C’est principalement pour leur activité acidifiante que les industries agro-alimentaires
utilisent les bactéries lactiques, car elle est considérée comme un critère primordial de
sélection des souches à intérêt, L’activité acidifiante de Lactobacillus plantarum (Lb.58)
sélectionnée et isolée à partir du lait de chèvre de l’ouest d’Algérie, après 0, 3, 6, 9, 12, 15,

101
 Résultats et Discussions

18, 24 et 48h d’incubation à 20°C, 30°C, 37°C et 44°C a été évaluée, Le suivi de l’activité
acidifiante de la souche a été réalisé sur le milieu lait écrémé stérilisé, selon la méthode
décrite par Psono et al., (2006).
Tableau 39: Les variations de l'acidité et pH en fonction du temps et températures en milieu
lait écrémé.
Température 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h
°D 1,00 4,00 9,00 14,00 19,00 21,00 28,00 35,00 44,00
20°C
pH 6,80 6,75 6,70 6,50 6,42 6,33 6,25 5,90 5,53
°D 1,00 4,00 8,00 14,00 23,00 35,00 49,00 68,00 130,00
30°C
pH 6,80 6,77 6,68 6,50 6,28 5,98 5,70 5,00 4,92
°D 1,00 4,00 8,00 13,00 19,00 28,00 36,00 46,00 61,00
37°C
pH 6,80 6,66 6,58 6,50 6,28 6,11 5,98 5,70 5,24
°D 1,00 5,00 10,00 16,00 23,00 30,00 38,00 52,00 80,00
44°C
pH 6,80 6,74 6,62 6,50 6,40 6,42 6,34 6,09 5,29

Les valeurs du pH enregistrées :

 À 20°C varie entre 6,70 et 6,90 après 6h d’incubation; 6,42 après 12h d’incubation;
et enfin entre 5,90 et 5,53 après 24h et 48h d’incubation.
 À 30°C varie entre 6,68 et 6,90 après 6h d’incubation; 6,28 après 12h d’incubation;
et enfin entre 5,00 et 4,92 après 24h et 48h d’incubation.
 À 37°C varie entre 6,58 et 6,90 après 6h d’incubation; 6,28 après 12h d’incubation;
et enfin entre 5,70 et 5,24 après 24h et 48h d’incubation.
 À 44°C varie entre 6,62 et 6,90 après 6h d’incubation; 6,40 après 12h d’incubation;
et enfin entre 6,09 et 5,29 après 24h et 48h d’incubation.
Le résultat de la variation du pH de Lb. plantarum (Lb.58) se résume comme suit: après 6h
d’incubation, les valeurs du pH minimal et maximal à 20°C et 30°C atteintes sont 6,70 et 6,68
respectivement, soit une moyenne de 6,69 ± 0,11 avec une production d’acide lactique de 8°D
et 9°D; après 12h d’incubation, l’acidification du lait écrémé atteint un pH minimal de 6,42 et
maximal de l’ordre de 6,28, soit une moyenne de 6,35 ± 0,15 et une production d’acide
lactique de 19°D et 23°D ; après 24h d’incubation, la moyenne d’acidification est de l’ordre
de 5,45 ± 0,3, avec une valeur de pH minimal de 5,90 et maximale de l’ordre de 5,00 et une
production d’acide lactique de 35°D et 68°D, En fin après 48 h d’incubation, la moyenne
d’acidification est de l’ordre de 5,22 ± 0,28, avec une valeur de pH minimal de 5,53 et
maximale de l’ordre de 4,92 et une production d’acide lactique de 44°D et 130°D.
les valeurs du pH minimal et maximal à 37°C et 44°C atteintes sont 6,58 et 6,62
respectivement, soit une moyenne de 6,60 ± 0,02 et une production d’acide lactique de 8 °D et
10 °D ; après 12 h d’incubation, l’acidification du lait écrémé atteint un pH minimal de 6,40
et maximal de l’ordre de 6,28, soit une moyenne de 6,34 ± 0,06 et une production d’acide

102
 Résultats et Discussions

lactique de 19°D et 23°D ; après 24 h d’incubation, la moyenne d’acidification est de l’ordre

de 5,89 ± 0,19, avec une valeur de pH minimal de 6,09 et maximale de l’ordre de 5,70 et une
production d’acide lactique de 46°D et 52°D.
Enfin après 48h d’incubation, la moyenne d’acidification est de l’ordre de 5,26 ± 0,03,
avec une valeur de pH minimal de 5,29 et maximale de l’ordre de 5,24 et une production
d’acide lactique de 61°D et 80°D.
Selon la capacité de Lb. plantarum (Lb.58) à réduire le pH du lait écrémé après 6h
d’incubation à différentes températures en peut classer cette dernière comme une souche
moyennement acidifiante, dont les pH observé après 6h d’incubation à différentes
températures d’incubations se situent entre 6,58 et 6,70 avec une production d’acide lactique
de 8°D à 10°D, Enfin après 24h et 48h d’incubation se dernier attient sont minimal qui est de
5,53 et maximal 4,92 une production d’acide lactique de 44°D à 130°D.

140,00 7,00

120,00

100,00
Acidité dornic °D

6,00
80,00

pH
60,00
5,00
40,00

20,00

0,00 4,00
0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h
Temps (h)
°D 20°C °D 30°C °D 37°C °D 44°C
pH 20°C pH 30°C pH 37°C pH 44°C

Figure 36: Variations de l'acidité et du pH en fonction du temps et différentes températures

de Lb. plantarum (Lb.58).

Le résultat de l’activité acidifiante montre une variation dans les valeurs du pH entre les
différentes températures d’incubations de la souche Lb. plantarum. Nos résultats sont
comparables à ceux obtenus par certains travaux ayant étudié l’activité acidifiante de souches
de bactéries lactiques appartenant au genre Lactobacillus (Xanthopoulos et al., 1997; Ayad et
al., 2004 et Dagdemir et Ozdemir, 2008). Ces auteurs ont montré qu'il y a une variation dans
les valeurs du pH entre les souches à l’intérieure de la même espèce et ont classé les souches
étudiées comme étant «rapide» ou «lente» par rapport à leur pouvoir acidifiant. Cette diversité
dans l’activité acidifiante offre donc un large choix pour satisfaire les différentes exigences
technologiques. En ce qui concerne le test de coagulation du lait écrémé à 20°C, 30°C, 37°C

103
 Résultats et Discussions

et 44°C après 24h d’incubation. Les résultats obtenus ont montré que la souche Lb. plantarum
coagule rapidement le lait à 30°C et 37°C. Cette capacité à coaguler le lait a été également
testée après 48h d’incubation.
Le mécanisme de coagulation du lait par des bactéries lactiques peut être provoqué soit par
la transformation progressive du lactose du lait en acide lactique qui provoque l'abaissement
du pH et la coagulation du lait; soit par un système enzymatique ou enzymes protéolytiques
qui ont la propriété de coaguler le lait.
La souche de Lb. plantarum (Lb.58) produit la valeur plus élevée d’acide lactique à 30°C
après 24h d’incubation elle est de 68°D (6.8 g/l) et de 130°D (13 g/l) après 48h d’incubation,
Lactobacillus plantarum et Lactobacillus brevis étudies par katina et al 2002 ont produit une
quantité de 4 à 5g d’acide lactique par litre, ce résultat est proche de notre souche en
particulier (Kask et al., 1999), En trouve que cette dernier produit une quantité d’acide
lactique supérieure à 4 g/l et atteindre une valeur maximale de 10 g/l, En milieu synthétique
sature en glucose, Callewaert et de vuyst (2002) ont revêlées que Lactobacillus reuteri produit
en 24h 40g d’acide lactique par litre.
Compte tenu de résultats obtenus, la souche sélectionnée durant cette étude peut être
proposé pour une éventuelle utilisation comme ferments pour fabriquer des produits de
transformation du lait en Algérie, Cette acidification provoque la coagulation du lait, favorise
l’égouttage du gel, participe aux qualités organoleptiques des produits transformés et inhibe la
croissance des microorganismes nuisibles ou indésirables, Donc on peut considérer que ce
paramètre est un élément essentiel pour l’utilisation de ces souches dans l’industrie agro-
alimentaire, De plus, une association de cette souche avec des souches lactiques habituelles ou
commerciales est indispensable pour obtenir un produit de qualité organoleptique et
nutritionnelle recherchée.
En conclusion, l’utilisation des souches sélectionnées et isolées à partir du lait de chèvre
d’Algérie pour la fabrication des fromages artisanaux, boissons ou laits fermentés offre pour
notre pays un aliment approprié et compétitif aux besoins de nos citoyens, Aussi, la
connaissance de nouvelles souches de bactéries lactiques utilisées dans l’industrie
agroalimentaire offre une nouvelle voie dans le domaine de la recherche scientifique en
microbiologie appliquée dont le but de produire a l’avenir de nouveaux produits alimentaires
concurrentiels sur le plan national et international type Kefir (Lb. plantarum et Lb.
fermentum), le Dahi dans lequel on ajoute, en plus les deux types de ferments utilisés pour le
yaourt, des souches de l’espèce Lb. plantarum.

104
 Résultats et Discussions

12. Cinétique de croissance dans le milieu MRS à différentes

températures d’incubation:
La cinétique de croissance de la souche a été réalisée sur milieu MRS pH 5,4, La
croissance bactérienne est suivie par dénombrement sur milieu solide MRS (Fig. 38).

Figure 38: Dénombrement des colonies de Lactobacillus plantarum sur milieu MRS solide
après incubation à 30°C pendant 24h.

La vitesse de croissance est estimée par le calcul de la pente de la droite de régression de la

courbe de croissance de chaque souche entre T=0h et T=12h, Le taux de croissance est calculé
à partir de l’équation suivante :
LogNt  LogNo
Taux de croissance =
Ln 2 * T
Ce test a été appliqué que sur la souche Lb. plantarum, la cinétique de croissance a été
réalisée sur milieu MRS, Les tubes étaient incubés à différentes températures (20°C, 30°C
37°C, et 44°C), A chaque point d’observation choisis (0, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 48h), la croissance
bactérienne était suivie par mesure de la densité optique à 600 nm et l’acidification du milieu
par pH mètre.
Les résultats de ce test sont présentés dans le tableau (40, 41) et la figures (38, 39), La
concentration bactérienne est estimée en Log ufc/ml à partir de la densité optique.
Tableau 40: Le dénombrement en log (ufc/ml) chez Lactobacillus plantarum en fonction du
temps et de la température.
Temps 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h
Log ufc/ml à 20°C 5,1 5,44 6,43 7,46 7,68 7,73 7,9 7,45 6,98
pH à 20°C 6,5 5,93 5,88 5,72 5,24 5,17 5,09 4,82 4,7
Log ufc/ml à 30°C 5,1 7,06 7,4 7,6 8 8,2 8,4 7,5 7
pH à 30°C 6,5 6,24 6 5,78 5,49 5,14 4,98 3,85 3,78
Log ufc/ml à 37°C 5,2 6,86 7,1 7,4 7,52 7,55 7,55 7,18 6,81
pH à 37°C 6,5 6,39 6,12 5,93 5,74 5,51 5,34 5,27 5,12
Log ufc/ml à 44°C 5,4 7 7,32 7,95 8,03 8,17 8,29 7,9 7,35
pH à 44°C 6,5 6,42 6,28 6,03 5,97 5,84 5,62 5,42 5,26

105
 Résultats et Discussions

Tableau 41: Le taux de de croissance (µ) et le temps de génération (G) chez Lactobacillus
plantarum a différentes températures d’incubation,
Lactobacillus plantarum (Lb.58)
Températures
µ G (h) G (mn)
20°C 0,17 5,88 353
30°C 0,30 3,33 200
37°C 0,20 5,00 300
44°C 0,16 6,25 375

Dans l’incubation à 20°C: La concentration initiale de la souche était de 5,1 Log10 ufc/ml
l'analyse de régression fournit une valeur de 0,02 unité de Log10 ufc/ml par h (soit un taux de
croissance de 0,17 h-1, ou un temps de génération de 352 min environ), Après 24 h, la
concentration bactérienne est estimée de 7,45 Log10 ufc/ml, La vitesse de l’acidification du
milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de régression a la courbe de variation
du pH, elle est de – 0,005 unité de pH par heure.

Dans l’incubation à 30°C: La concentration initiale de la souche était de 5,1 Log10 ufc/ml
l'analyse de régression fournit une valeur de 0,10 unité de Log10 ufc/ml par h (soit un taux de
croissance de 0,3 h-1, ou un temps de génération de 140 min environ), Après 24 h, la
concentration bactérienne est estimée de 7,5 Log10 ufc/ml, La vitesse de l’acidification du
milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de régression a la courbe de variation
du pH, elle est de – 0,18 unité de pH par heure.

Dans l’incubation à 37°C: La concentration initiale de la souche était de 5,2 Log10 ufc/ml,
l'analyse de régression fournit une valeur de 0,06 unité de Log10 ufc/ml par h (soit un taux de
croissance de 0,2 h-1, ou un temps de génération de 300 min environ), Après 24 h, la
concentration bactérienne est estimée de 7,18 Log10 ufc/ml, La vitesse de l’acidification du
milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de régression a la courbe de variation
du pH, elle est de – 0,011 unité de pH par heure.

Dans l’incubation à 45°C: La concentration initiale de la souche était de 5,4 Log10 ufc/ml
l'analyse de régression fournit une valeur de 0,04 unité de Log10 ufc/ml par h (soit un taux de
croissance de 0,16 h-1, ou un temps de génération de 375 min environ), Après 24 h, la
concentration bactérienne est estimée de 7,9 Log10 ufc/ml, La vitesse de l’acidification du
milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de régression a la courbe de variation
du pH, elle est de – 0,033 unité de pH par heure.

106
 Résultats et Discussions

Figure 38: Effet de la température d’incubation sur la croissance de Lactobacillus plantarum

(Lb.58) en milieu MRS.

Figure 39: Changement de la vitesse de croissance () de Lactobacillus plantarum

(Lb.58) et le temps de génération (▲) en fonction de la température d’incubation.

A partir des résultats de calculs de µ et G montre ont peu déduire que la température optimale
de croissance chez Lb. plantarum (Lb.58) est 30°C, car le temps de dédoublement des cellules
pour Lb. plantarum à cette température est plus réduit (140 min) et la vitesse de croissance est
plus importante (µ= 0.3). Concernant l'acidité qui est relié étroitement à la croissance
bactérienne, plus le taux de croissance est élevé plus le taux d'acidité est plus important, plus
le pH diminue (livre des bactéries lactiques), Ce qui explique l’augmentation de l’acidité qui
atteint 130°D pour Lb. plantarum (Lb.58) à une température de 30°C par conséquent une
diminution de pH qui atteint 4,92 avec une vitesse d’acidification de – 0,011 unité de pH /h.

107
 Résultats et Discussions

Tableau 42: Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58)
incubée à 20°C.

pH Temps 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h

4 pH 4 3,89 3,87 3,75 3,61 3,45 3,24 3,03 3
4 Do 0,063 0,12 0,164 0,225 0,305 0,525 0,672 0,714 0,725
4 ,5 pH 4,5 4,16 4,09 3,93 3,74 3,58 3,17 3,05 2,95
4 ,5 Do 0,064 0,163 0,36 0,478 0,647 0,967 1,307 1,455 1,5
5 pH 5 4,71 4,6 4,37 4,03 3,89 3,26 3,11 3
5 Do 0,067 0,267 0,44 0,618 0,829 1,097 1,307 1,455 1,467
5,5 pH 5,5 5,34 5,12 4,95 4,23 4,03 3,79 3,42 3,18
5,5 Do 0,062 0,287 0,471 0,745 1,076 1,435 1,785 1,956 1,96
6 pH 6 5,69 5,02 4,85 4,65 4,47 4,05 3,92 3,89
6 Do 0,074 0,255 0,385 0,42 0,9 1,231 1,456 1,645 1,698
6,5 pH 6,5 5,93 5,88 5,72 5,24 5,17 5,09 4,82 4,7
6,5 Do 0,067 0,23 0,35 0,43 0,765 1,178 1,389 1,509 1,532
7 pH 7 6,72 6,45 5,91 5,74 5,6 5,27 5 4,92
7 Do 0,067 0,193 0,331 0,385 0,675 0,805 1,123 1,432 1,456
7,5 pH 7,5 7,31 7,02 6,94 6,85 6,72 6,64 6,5 6,02
7,5 Do 0,062 0,178 0,252 0,3 0,418 0,728 0,954 1,242 1,243
8 pH 8 7,74 7,52 7,28 7,12 7 6,86 6,74 6,4
8 Do 0,067 0,176 0,204 0,257 0,45 0,642 0,84 1,115 1,12

Figure 40: Résultats de la mesure de cinétique de croissance Do (A) et l'évolution du pH (B)

de Lb. plantarum (Lb.58) incubée à 20°C.

108
 Résultats et Discussions

Tableau 43: Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb, plantarum (Lb.58)
incubée à 30°C.

pH 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h

4 pH 4 3,80 3,73 3,50 3,36 3,12 2,94 2,87 2,79
Do 0,063 0,106 0 ,2 0,34 0,427 0,619 0,824 0,995 1,066
4,5 pH 4,5 4,16 4,02 3,93 3,82 3,61 3,40 3,04 3
Do 0,060 0,42 0,53 0,66 0,845 1,245 1,43 1,683 1,787
5 pH 5 4 ,56 4,03 3,92 3,81 3,72 3,63 3,39 3,28
Do 0,062 0,45 0,885 1,182 1,5 1,721 1,9 2,007 2,017
5,5 pH 5,5 5,34 4,77 4,09 3,89 3,63 3,40 3,24 3,15
Do 0,068 0,668 1,2 1,648 1,946 2,079 2,182 2,265 2,3
6 pH 6 5,24 5,05 4,87 4,15 3,97 3,69 3,58 3,42
Do 0,063 0,51 0,728 1 1,35 1,709 1,987 2,182 2,243
6,5 pH 6,5 6,24 6 5,78 5,49 5,14 4,98 3,85 3,78
Do 0,066 0,42 0,647 0,84 1,027 1,228 1,409 1,584 1,7
7 pH 7 6,48 6,25 5,86 5,77 5,38 4,97 4,49 4,27
Do 0,068 0,254 0,442 0,707 0,937 1,354 1,563 1,684 1,68
7,5 pH 7,5 7,09 6,89 6,70 6,58 6,49 6,28 6,15 6
Do 0,062 0,171 0,345 0,4 0,6 1 1,231 1,354 1,4
8 pH 8 7,85 7,36 7,42 6,95 6,78 6,60 6,41 6,25
Do 0,065 0,187 0,325 0,45 0,608 0,973 1,235 1,508 1,6

Figure 41: Résultats de la mesure de cinétique de croissance (Do) (A) et l'évolution du pH

(B) de Lb. plantarum (Lb.58) incubée à 30°C

109
 Résultats et Discussions

Tableau 44: Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58)
incubée à 37°C.

pH 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h

4 pH 4 3,84 3,77 3,650 3,5 3,27 3,14 2,94 2,89
Do 0,062 0,129 0,187 0,210 0,350 0,5 0,658 0,723 0,754
4 ,5 pH 4,5 4,26 4,05 3,93 3,87 3,80 3,76 3 ,24 3,04
Do 0,061 0,238 0,420 0,6 0,685 0,756 0,89 0,942 0,954
5 pH 5 4,69 4,32 4 ,05 3,98 3,91 3,85 3,79 3,62
Do 0,068 0,334 0,720 1 1,181 1,365 1,642 1,789 1,81
5,5 pH 5,5 5,23 5,16 5 4,15 3,02 3,95 3,87 3,77
Do 0,064 0,350 0,850 1,242 1,468 1,694 1,912 1,965 1,957
6 pH 6 5,46 5,24 4,81 4,72 4,63 4,21 4,28 4,05
Do 0 ,067 0,280 0,52 0,820 1,12 1,420 1,737 1,856 1,864
6,5 pH 6,5 6,39 6,12 5,93 5,74 5,51 5,34 5,27 5,12
Do 0,065 0,234 0,397 0,6 0,954 1,212 1,516 1,645 1,679
7 pH 7 6,85 6,82 6,39 6,27 6,21 6,12 6 5,94
Do 0,064 0,207 0,403 0,597 0,721 0,897 0,982 1,134 1,145
7,5 pH 7,5 7,18 7,05 6,84 6,71 6,64 6,42 6,23 6,12
Do 0,063 0,179 0,239 0,350 0,446 0,587 0,754 0,912 0,923
8 pH 8 7,74 7,68 7,5 7,42 7,3 7,14 7,05 6,95
Do 0,065 0,174 0,194 0,217 0,250 0,34 0,480 0,602 0,623

A B

Figure 42: Résultats de la mesure de cinétique de croissance (Do) (A) et l'évolution du pH

(B) de Lb. plantarum (Lb.58) incubée à 37°C.

110
 Résultats et Discussions

Tableau 45: Les résultats de la mesure de densité optique et pH de Lb. plantarum (Lb.58)
incubée à 44°C.

pH 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h

4 pH 4 3,95 3,81 3,69 3,38 3,29 3,26 3,08 2,79
Do 0,062 0,180 0,2 0,234 0,334 0,421 0,56 0,67 0,6
4,5 pH 4,5 4,30 4,13 3,96 3,91 3,45 3,40 3,03 2,90
Do 0,066 0,170 0,239 0,318 0,439 0,598 0,83 0,976 0,98
5 pH 5 4,58 4,39 4,02 3,80 3,53 3,51 3,26 3,24
Do 0,065 0,210 0,35 0,492 0,646 0,79 0,912 0,927 0,9
5,5 pH 5,5 5,12 4,9 4,72 4,5 4,36 4,12 4 3,96
Do 0,064 0,350 0,541 0,69 0,825 0,912 1,034 1,123 1,119
6 pH 6 5,36 5,05 4,97 4,85 4,63 4,20 4,12 4
Do 0,064 0,24 0,41 0,525 0,734 0,956 1,123 1,246 1,24
6,5 pH 6,5 6,42 6,28 6,03 5,97 5,84 5,62 5,42 5,26
Do 0,066 0,235 0,290 0,450 0,614 0,835 0,956 0,990 1
7 pH 7 6,59 6,15 6,85 6,76 6,26 6,17 5,82 5,76
Do 0,068 0,192 0,210 0,287 0,409 0,534 0,834 0,976 0,97
7,5 pH 7,5 7,35 7,26 7,12 7 6,85 6,74 6,63 6,5
Do 0,064 0,180 0,190 0,240 0,312 0,425 0,711 0,840 0,823
8 pH 8 7,82 7,74 7,65 7,45 7,26 7 6,98 6,84
Do 0,062 0,165 0,185 0,209 0,298 0,374 0,456 0,608 0,595

Figure 43: Résultats de la mesure de cinétique de croissance (Do) (A) et l'évolution du pH

(B) de Lb. plantarum (Lb.58) incubée à 44°C.

111
 Résultats et Discussions

Les résultats obtenues de la mesure des variations de la Do avec une longueur d’onde égale
a 576 nm et le pH des cultures pures de Lb. plantarum (Lb.58) aux dépends de différentes
températures et pH aux intervalles de 3 heures et à partir des graphes réalisés :
On note que les courbes de la mesure de la Do en fonction du temps généralement
représentent trois phases de croissance: la phase de latence étalé sur les trois premières heures
(0h-3h) dont les souches ayant développées une adaptation avec le milieu MRS; la phase
exponentielle qui se déroule entre 3h et 18h où s’éfféctue la multiplication des cellules
bactériennes et la production des métabolites parmi l’acide lactique ; finalement la phase
stationnaire de 18h à 48h.
Concernant le pH, on constate sa diminution en fonction du temps ce qui est due à la
production de l’acide lactique à partir du glucose présent dans le milieu MRS qui modifie le
pH de milieu (Heillig et al., 2005).
L’abaissement du pH n’influence pas la croissance et la production d’acide lactique de la
souche, elle est capable de croitre dans des pH bas compris entre 2,8 et 3, ce qui ressemble à
des études ayant confirmées la présence de Lb. plantarum dans le pH 2,5 à 3 (Ahrné S et al.,
1998).
Pour notre souche de Lb. plantarum (Lb.58) à T=30°C; la cinétique d’acidité était optimale
pour les pH 5,5 et 6 par rapport aux autres pH, dont pH 5,5 elle démarre à t = 0 h par Do =
0,068 et pH 5,5; pour atteindre à t = 9h une valeur Do =1,648 et pH = 4,9 mais pour les pH=
4 et 8 la Do était à t = 0 (0,065) et (0,063), à t = 9h la Do égale (0,34) et (0,45)
respectivement.
Alors Lb. plantarum (Lb.58) a un pH optimal de croissance de 5,5 mais elle peut survivre
jusqu’à pH 9,5 (Sownd et al., 2005).
On constate que la cinétique d’acidification varie selon les différentes températures dans
un même pH et pendant la même durée d’incubation; à t = 12h et à pH 5,5 les valeurs de la
DO et pH pour Lb. plantarum (Lb.58) pour les températures 20°C, 30°C, 37°C et 44°C sont
(1,076 / 4,23) ;(1,946 / 3,89); (1,468 / 4,15) et (0,825 / 4,5) respectivement.
Alors la température optimale de croissance pour Lb .plantarum (Lb.58) est entre 30°C et
37°C (Sownd et al., 2005).

112
 Résultats et Discussions

Tableau 46: Evolution de la cinétique de croissance et d'acidité de Lb. plantarum (Lb.58)

dans un milieu MRS modifié, En fonction du temps et des températures.

température La souche 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h

Do 0,06 0,507 1,2 1,46 1,9 1,94 2,15 2,00 1,95
Maltose
pH 6,8 6,48 6,4 5,11 4,9 4,09 4,08 3,81 3,76
20°C
Do 0,06 0,53 0,96 1,34 1,55 1,77 1,88 1,85 1,06
Mannose
pH 6,8 5,91 5,8 4,87 4,72 4,11 4,02 3,75 3,68
Do 0,06 0,84 0,99 1,98 2,1 2,13 2,17 2,18 1,31
Maltose
pH 6,8 6,17 6 4,52 4,42 4,05 3,94 3,75 3,65
30°C
Do 0,06 0,81 1,03 1,65 1,86 1,95 1,92 2,05 1,89
Mannose
pH 6,8 6,09 5,25 4,74 4,41 4,05 3,98 3,56 3,83
Do 0,06 0,38 0,86 1,58 2,04 2,26 2,27 2,28 2,3
Maltose
pH 6,8 6,78 5,69 4,46 4,29 4,11 3,91 3,71 3,54
37°C
Do 0,06 0,27 0,83 1,22 1,75 2 2,03 1,96 2,03
Mannose
pH 6,8 6,57 5,69 4,63 4,33 4,25 3,81 3,71 3,57
Do 0,06 0,74 1,39 1,85 1,89 2,1 1,49 1,52 0,86
Maltose
pH 6,8 6,74 5,08 4,41 3,85 3,84 3,79 3,75 3,7
44°C
Do 0,06 0,88 1,5 1,58 1,85 1,88 1,94 1,17 0,8
Mannose
pH 6,8 5,48 4,76 4,36 3,97 3,87 3,84 3,8 3,71

Figure 44: Evolution de la cinétique de croissance (A) et d'acidité (B) de Lb. plantarum
(Lb.58) dans un milieu MRS modifié (+ Maltose et mannose), En fonction du temps et des
températures.

113
 Résultats et Discussions

D'après les courbes, on observe que la vitesse de croissance de Lb. plantarum (Lb.58) dans
le milieu qui contient le maltose est presque la même pour celui contenant du mannose, et
cette vitesse augmente a la température 30°C et 37°C, puisque c’est la température optimale
pour la croissance de cette souche.
Lorsque on compare ces résultats avec ceux obtenus du milieu MRS non modifié, on
trouve que la croissance dans ce milieu est plus important que le milieu MRS modifiés car le
glucose est un substrat facilement métabolisable par les bactéries lactiques notamment les
lactobacilles (Thompson et Torchia, 1984; Neves et al., 1999 et Mijakovic et al., 2002).
Concernant l'évolution de pH, plus la croissance est importante plus l'accumulation d'acide
lactique augmente, qui se traduit par un abaissement progressif du pH qui atteint 3.57 et 3.54
pour Lb. plantarum (Lb.58).

Tableau 47: Les variations de la densité optiques et le pH de Lb. plantarum (Lb.58) dans un
milieu modifié en acides Aminés.
Température les souches 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 24h 48h
Do 0,06 0,91 0,92 1,04 1,2 1,23 1,82 1,78 1,54
Asparagine pH 6,8 5,91 5,61 4,58 4,3 4,25 4,02 3,78 3,71
20°C
Do 0,06 0,4 0,92 1,45 1,5 1,66 1,89 1,9 0,84
Glycine pH 6,8 6,29 5,6 4,46 4,3 4,1 4,07 3,83 3,65
Do 0,06 0,76 1,07 1,53 1,8 1,87 1,93 2,12 1,02
Asparagine pH 6,8 6,37 5,47 4,36 4,2 4,21 4,13 3,67 3,59
30°C
Do 0,06 0,74 1,03 1,42 1,5 1,89 1,96 2 1,15
Glycine pH 6,8 6,37 6,22 5,54 5,1 4,14 4,1 3,8 3,55
Do 0,06 0,41 0,93 1,4 1,7 2 2,23 2,09 1,44
Asparagine pH 6,8 6,51 5,2 4,35 4,3 4,07 3,92 3,72 3,68
37°C
Do 0,06 0,37 0,87 1,58 1,8 2 1,9 1,8 1,65
Glycine pH 6,8 6,67 5,12 4,21 4,2 3,8 3,79 3,72 3,58
Do 0,06 0,87 1 1,5 2 2,26 1,6 1,5 1,4
Asparagine pH 6,8 5,56 4,75 4,36 4,2 3,96 3,9 3,67 3,65
44°C
Do 0,06 0,83 1,46 1,72 1,9 1,89 1,55 1,48 1,1
Glycine pH 6,8 5,68 4,72 4,67 4,2 3,98 3,75 3,67 3,84

114
 Résultats et Discussions

Figure 45: Evolution du pH du milieu de croissance de Lactobacillus plantarum (Lb.58) en

présence de la glycine et l’as arginine comme source d’acide aminé dans le milieu MRS,
incubé à quatre différentes températures 20°C, 30°C, 37°C et à 44°C.

Figure 46: Croissance de Lactobacillus plantarum (Lb.58) en présence de la glycine et l’as

arginine comme source d’acide aminé dans le milieu MRS, incubé à quatre différentes
températures 20°C, 30°C, 37°C et à 44°C.

Par comparaison aux résultats de milieu MRS non modifiés, La vitesse de croissance de
Lb. plantarum (Lb.58) dans le milieu MRS modifié est faible que ça soit dans le milieu qui
contient l'asparagine ou la glycine, ce qui explique que cette souche de Lb. plantarum (Lb.58)
nécessite plus que ces deux acides aminés pour ça croissance, selon Lenoir et al. (1992) les
lactobacilles nécessitent pour leur croissance l'aspartate, histidine, lysine, leucine, méthionine
et de valine et ces derniers sont présent dans la composition de l'extrait de levure (Ghaly et
al., 2003).
Ces derniers ont un effet significatif sur la production d'acide lactique et ne peuvent donc
être que difficilement enlevées de la constitution du milieu de culture (Selmer-Olsen et
Sorhaug, 1998 et Aeschlimann et Von Stockar, 1990) en plus c’est une source de vitamine B
pour les lactobacilles.

115
 Résultats et Discussions

13. Résultats de la cinétique de croissance de Staphylococcus aureus

(ATCC 25923) en culture pure et mixte à 37°C :
L’étude de la cinétique de croissance de la souche Lactobacillus plantarum (Lb.58) et
Staphylococcus aureus ATCC 25923 exprimé en ufc/ml seules ou en culture mixte a été
réalisée dans le lait écrémé. Le dénombrement s’effectue à un interval de temps regulier. La
densité initiale de la souche de Lb. plantarum (Lb.58) était de 3.19 log ufc/ml. Ce critère
d’inoculum est identique à celui pratiqué par Erdogan et al. (2006) qui était de 3.24 log. Après
24 h d'incubation en culture pure, le nombre de bactérie de Lb. plantarum (Lb.58) atteint une
valeur de 8,19 log ufc/ml et 5,07 log ufc/ml a été enregistré pour Staphylococcus aureus. En
culture mixte dans le lait, après 24h d'incubation, on aperçoit une diminution de la densité de
Staphylococcus aureus (1,6 log ufc/ml), cette reduction témoigne de l’effet inhibiteur de la
souche Lb. plantarum sur la croissance de Staphylococcus aureus. Après 72h d'incubation, le
nombre de cellules viables de la souche Lb. plantarum (Lb.58) atteint 8.05 log ufc/ml. Après
72h d’incubation en Co-culture avec la souche Lb. plantarum aucune croissance de
Staphylococcus aureus n’a pu être détectée.
Dans le cas de culture Lb. plantarum, l'analyse de régression donne une vitesse de 0,419
unité de Log10 ufc/h (soit un taux de croissance de 1,38 h-1, ou un temps de génération de 43
min environ). Après 72h, la concentration bactérienne obtenue est de 8.05 Log10 ufc/ml. La
vitesse de l’acidification du milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de
régression a la courbe de variation du pH, elle est de – 0,006 unité de pH par heure, Alors que
la production de l’acide lactique, est de 59 °D (65,5 mM).
En culture pure de S. aureus ATCC 25923, l'analyse de régression fournit une valeur de
0,041 unité de Log10 ufc/h (soit un taux de croissance de 1,93 h-1, ou un temps de génération
de 31 min environ). Après 72h, la concentration bactérienne est estimée de 3.11 Log10ufc/ml.
La vitesse de l’acidification du milieu est estimée par le calcul de la pente de la droite de
régression a la courbe de variation du pH, elle est de – 0,007 unité de pH/h, alors que la
production de l’acide lactique, est estimée à 41.8°D (46,44 mM).
En culture mixte, Lb. plantarum croit avec une valeur de 0,236 unité de Log10 ufc/h (soit
un taux de croissance de 1.45 h-1 et un temps de génération de 41 min environ). Après 72h, la
concentration bactérienne est estimée de 7.90 Log10 ufc/ml. Pour S. aureus ATCC 25923,
l'analyse de régression donne 0,133 unité de Log10 ufc/h (soit un taux de croissance de 0,37/h,
et un temps de génération de 162 min environ). Après 72h, aucune croissance n’a était
observée. La vitesse de l’acidification du milieu est estimée de – 0,005 unité de pH par heure,
alors que l’acidité dornic atteint 71°D (78,8 mM).

116
 Résultats et Discussions

À partir de ces résultats on peut dire, que la souche Lb. plantarum (Lb.58) a inhibé
totalement la souche S. aureus ATCC 25923 après 72h d’incubation.
En Azerbaijan, Gulahmadov et al. (2006) ont étudié, l’effet inhibiteur des espèces de
lactobacilles isolées à partir d’un fromage traditionnel et du lait cru sur la croissance de
certaines bactéries pathogènes parmi les quelles Staphylococcus. D’autres travaux conduits
par Rodrigues et al. (2005) sur l’inhibition de Staphylococcus aureus en fromagerie, ils ont
constaté que le nombre de Staphylococcus aureus a été de 0.40 log ufc/ml après 24h comparé
au témoin qui été de 5,16 log ufc/ml. La souche de Lactobacillus plantarum (Lb.58) a montré
un potentiel conséquent dans l’inhibition de Staphylococcus aureus; cette inhibition est due à
la production de multiple substances anti-bacteriennes appartennent probablement à des
bactériocines (Hernandez et al., 2005). Après 72h d’incubation, Arqués et al. (2005) ont
remarqué la dimunition du nombre de Staphylococcus aureus (0,46 log ufc/ml) comparé au
témoin (6.46 log ufc/ml).
Tableau 48: Cinétique de croissance, d’acidification et de production d’acide lactique dans le
lait écrémé à 37°C, en culture seule et en culture mixte des souches Lactobacillus plantarum
et Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Souches 0h 3h 6h 9h 14h 18h 20h 24h 48h 72h
S. aureus Log ufc/ml 3,22 3,25 4,75 6,5 7 7 6,07 5,07 3,14 3,11
pH 6,45 6,42 6,3 6,13 5,82 5,5 4,64 5,13 4,9 4,72
°D 0 2,7 6,30 8,5 16,4 23,4 4,64 36,3 41 41,8
Lb. plantarum Log ufc/ml 3,19 4,31 6,09 7,34 8,04 8,06 8,22 8,19 8,07 8,05
pH 6,44 6,35 6,08 5,56 5,01 4,53 4,4 4,32 4,24 4,09
°D 0 2 6,5 16,1 28,5 43,7 48,5 50 55 59
M 58 Log ufc/ml 3,19 4,61 6,30 7,40 8,14 8,16 8,32 8,40 8,07 7,90
Lb.plantarum
Log ufc/ml 3,24 3,26 3,6 3,28 3,02 2,4 1,94 1,64 0,5 0
S. aureus
pH 6,42 6,3 6,02 5,7 5,21 4,8 4,64 4,6 4,47 4,35
°D 0 3 12,9 25,8 42,3 58,2 4,64 67,4 69,7 71

Figure 47: Evolution du dénombrement en fonction du temps pour culture pure et mixte de
la souche inhibitrice Lb. plantarum (Lb.58) et Staphylococcus aureus.

117
 Résultats et Discussions

Tableau 49: Révèle le (µ) et le temps de génération (G) pour les souches en culture pure et en
culture mixtes avec la souche de Staphylococcus aureus

souche µ G (temps de génération)

Staphylococcus aureus 1.93 31 min
Lb. plantarum 58 1.38 43 min
M (Lb. plantarum) 1.45 41 min
M (S.aureus) 0.37 162 min

Staphylococcus aureus Lb. plantarum Lb.58

Figure 48: Evolution du Staphylococcus aureus (souche test) et Lb. plantarum (Lb.58)
(souches inhibitrices) en culture pure

24h 48h 72h

6h 3h 0h
.
Figure 49: Evolution du Staphylococcus aureus (souche test) avec Lb. plantarum (Lb.58)
(souches inhibitrices) en culture mixte.

14. Effet de l’extrait brut de Lactobacillus plantarum sur la croissance de

Staphylococcus aureus :
Les resultats du test de l’effet des dillutions de la substance de Lb. plantarum (Lb.58) sur la
croissance de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ont montré queles dillutions ½ et ¼
produisent un effet inhibiteur permanent sur la croissance de Staphylococcus aureus ATCC
25923.
En revanche les dillutions plus forte, de la substance ralentissent la croissance de
Staphylococcus aureus ATCC 25923.

118
 Résultats et Discussions

T- T+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figure 50: Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) chauffé à 100°C pendant 10 min
sur la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a différentes dilutions.

Tableau 50: Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) sur la croissance de
Staphylococcus aureus.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T+
Temps (h) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/254 1/508 1/1016 Staph
0 0,033 0,030 0,032 0,031 0,040 0,039 0,050 0,016 0,016 0,008 0,044
2 0,050 0,054 0,076 0,150 0,073 0,057 0,063 0,022 0,038 0,080 0,362
4 0,070 0,065 0,045 0,211 0,178 0,153 0,184 0,149 0,147 0,212 0,655
6 0,061 0,064 0,044 0,405 0,334 0,354 0,477 0,316 0,484 0,591 0,698
8 0,050 0,062 0,038 0,566 0,440 0,647 0,692 0,590 0,634 0,666 0,740
24 0,050 0,058 0,037 0,412 0,386 0,475 0,636 0,681 0,622 0,723 0,760
26 0,050 0,057 0,037 0,412 0,378 0,435 0,600 0,677 0,618 0,702 0,760
28 0,040 0,050 0,037 0,399 0,358 0,431 0,630 0,661 0,599 0,643 0,700

Figure 51: Effet de l’extrait brut de Lb. plantarum (Lb.58) sur la croissance de
Staphylococcus aureus a différentes dilutions

119
 Résultats et Discussions

Tableau 51: le taux de mortalité en pourcentage de Staphylococcus aureus traité avec

l’extrait brut de la souche Lb. plantarum (Lb.58).
Temps (h) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T+
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/254 1/508 1/1016 staph
0 25 37.8 27.9 29.5 9.1 11.4 13.2 63.6 63.6 81.8 100%
2 86.2 85.1 79 58.6 79.8 84.3 82.6 93.9 89.5 77.9 100%
4 89.3 90.1 93.1 67.8 72.8 76.6 71.9 77.3 77.6 67.6 100%
6 91.3 90.8 93.7 42 52.1 49.3 31.7 54.7 30.7 15.3 100%
8 93.2 91.6 94.9 23.5 40.5 12.6 6.5 20.3 14.3 10 100%
24 93.4 92.4 95.1 47.8 49.2 37.5 16.6 10.4 18.2 4.9 100%
26 93.4 92.5 95.1 45.8 50.3 42.8 21.1 10.9 18.7 7.6 100%
28 94.3 92.9 94.7 43 48.9 38.4 10 5.6 14.4 8.1 100%

Les résultats obtenus montrent que les dilutions 1/2 et 1/4 et 1/8 ont montré une activité
inhibitrice. Aucune évolution de la densité optique n'a été observée. Ces résultats révèlent
l'efficacité de l'extrait chauffé sur l'inhibition de Staphylococcus aureus. A partir de la dilution
1/16 on remarque que le taux de survie et de croissance de Staphylococcus aureus dépasse
largement les 50 %.
Cette activité inhibitrice de Staphylococcus aureus par Lactobacillus plantarum (Lb.58)
observée en milieu synthétique riche doit être exploitée pour servir comme moyen de
biopréservation des aliments pour lutter contre les intoxications alimentaires observées dans
les saisons estivales.

15. Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques des

lactobacilles étudiés :
Les résultats de ce test sont présentés dans la figure 52 et les tableaux 52. Le tableau (52)
montre les diamètres obtenus avec chaque antibiotique et chaque souche. Après l’application
des recommandations du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie
(2007), ce dernier donne la signification de chaque résultat, à savoir : R, bactérie résistante, S,
bactérie sensible et I, intermédiaire. D’après les résultats du test, les souches lactiques
étudiées étaient sensible aux antibiotiques suivants : ampicilline, lincomycine (sauf LbG 22 et
Lb.58), ticarcilline, imipeneme, érythromycine, pristinamycine, rifampine, nitrofurantoine,
trimethoprime-sulfamethoxazole (sauf LbC A2), Clindamycine (sauf LbG 22 et Lb.58). Par
contre elles étaient résistante aux : oxacilline, cefoxitine, ceftazidime, cefsulodine, amikacine,
tobramycine, spiramycine, vancomycine, bacitracine, colistine, acide nalidixique,
ciprofloxacine, ofloxacine, pefloxacine, acide fusidique.
Pour les autres antibiotiques les résultats étaient variables entre les souches. Cependant on
peut remarquer la présence de trois groupe selon les résultats de ce test : (LbG 22, Lb.58),
(Lb.68, LbC 5 et LbC 6) et (LbC A2).

120
 Résultats et Discussions

PIP75
OX1

AM VA TIC FOX

BAC CAZ

P CS50 IPM AN

CFS
AMC

CZ E

TM
CF L
CTX
CM NET

NA TE SP

CIP PT

SXT

FT

OFX PEF

RA30

FA

Figure 52: Quelques résultats du test de l’étude de la sensibilité des souches Lactobacillus
aux antibiotiques.

121
 Résultats et Discussions

Tableau 52: Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques des lactobacilles
étudiés.

Antibiotiques Charge du
Disque Symbole
Souches testées
LbG 22 Lb.58 Lb.68 LbC 5 LbC A2
PENICILLINES
Penicilline 6 µg / 10 IU P I I I I S
Oxacilline 1 µg OX1 R R R R R
Ampicilline 10 µg AM S S S S S
Amoxycilline + Acide Clavulanique 20 µg + 10 µg AMC I I I I I

Piperacilline 75 µg PIP 75 S S S S S

Ticarcilline 75 µg TIC S S S S S
CARBAPENEMES
Imipeneme 10 µg IPM S S S S S
CEPHALOSPORINES
Cephalothine 30 µg CF I I R R S
Cefazoline 30 µg CZ S S I I I
Cefoxitine 30 µg FOX R R I R R
Cefotaxime 30 µg CTX I S I R S
Ceftazidime 30 µg CAZ R R R R R
Cefsulodine 30 µg CFS R R R R R
AMINOSIDES
Amikacine 30 µg AN R R R R R
Netilmicine 30 µg NET R I R I S
Tobramycine 10 µg TM R R R R R
TETRACYCLINES
Tetracycline 30 µg TE R I S S I
MACROLIDES
Erythromycine 15 µg E S S S S S
Spiramycine 100 µg SP R R R R R
LINCOSAMIDES
Lincomycine 15 µg L R R S S S
Clindamycine 2 µg CM R R S S S
STREPTOGRAMINES
Pristinamycine 15 µg PT S S S S S
GLYCOPEPTIDES
Vancomycine 30 µg VA R R R R R
POLYPEPTIDES
Bacitracine 0,02 à 0,04 UI BAC R R R R R
Colistine 50 µg CS 50 R R R R R

SULFAMIDES-
TRIMETHOPRIME
Trimethoprime-Sulfamethoxazole 1.25 µg + SXT S S S S R
23.75 µg
NITROFURANES
Nitrofurantoine 300µg FT S S S S S
QUINOLONES
Acide Nalidixique 30 µg NA R R R R R
FLUOROQUINOLONES
Ciprofloxacine 5 µg CIP R R R R R
Ofloxacine 5 µg OFX R R R R R
Pefloxacine 5 µg PEF R R R R R
DIVERS
Acide Fusidique 10 µg FA R R R R I
Rifampine 30 µg RA 30 S S S S S

122
 Discussion Générale

DISCUSSION GÉNÉRALE
L’identification microbiologique et la caractérisation technologique de la microflore
lactique du lait cru de chèvre ont été abordées.
Les résultats des tests microbiologiques classiques ont permis une pré-identification de
plusieurs espèces du genre Lactobacillus dont: 08 souches réparties essentiellement sur (Lb.
plantarum (Lb.58), Lb. plantarum (Lb.68), Lb. casei (Lb.13), Lb. rhamnosus (Lb.54 et Lb.52),
Lb. paracasei subsp. paracasei (Lb.55), Lb. sakei subsp. sakei (Lb.21) et Lb. plantarum (Lb.22).
Les souches Lb.22, Lb.58, Lb.68 sont hétérofermentaires facultatives par l’utilisation de l’acid
glutamique, elles appartiennent au groupe II des Lactobacillus.
L’identification des souches a été réalisée en suivant les recommandations de Carr et al.,
(2002); Axelsson (2004) et Hammes et Hertel (2006).
Les espèces de Lactobacillus dominants Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb.
paracasei subsp. paracasei, Lb. sakei subsp, sakei, ont été déjà signalé dans le lait de chèvre
d'Algérie par les travaux suivants (Saidi et al., 2002; Badis et al., 2004a, Badis et al., 2004 b
et Badis et al., 2005).
Le profil de fermentation des hydrates de carbone sur galerie API 50 CHL, confirme
l’appartenance des souches (Lb.22, Lb.58 et Lb.68) à l’espèce Lb. plantarum. Cette
identification est c o m p a r é e à la souche Lb. plantarum ATCC 14917 et le pourcentage
de similitude était de 100% avec les souches Lb.22 et Lb.58, de 97,95% pour Lb.68. Le
calcul du coefficient de simple appariement (SSM) a permis de distinguer trois groupes: le
groupe 1 (Lb.22 et Lb.58), le groupe 2 (Lb.68) et le groupe 3 (LbC 5). L’espèce Lb.
plantarum est très diversifier phénotypiquement (Axelsson, 2004). Nos souches de Lb.
plantarum Lb.58 et Lb.68 poussent à 45°C. Les anciennes études indiquent que l’espèce Lb.
plantarum ne pousse pas à 45°C (Axelsson, 2004 et Hammes et Hertel, 2006). Mais Carr et
al. (2002) ne considère pas cette caractéristique comme clé d’identification dans son
diagramme dichotomique, il exige seulement: la croissance à 15°C, ADH (-), Ribose (+),
Raffinose (+) et mannitol (+). En 2004, An et collaborateurs ont étudié les bactéries
lactiques isolées du chigee et du lait de jument collectés de la Mongolie interne, dans le
chigee, ils ont identifié 5 souches qui poussent à 45°C (An et al., 2004). L’identification par
le profile fermentaire des hydrates de carbone, montrent que les cinq souches appartiennent à
l’espèce Lb. plantarum, l’identification moléculaire par le séquençage de l’ADNr 16S,
montre que trois de ces cinq souches, sont réellement des Lb. plantarum. Donc, il existe
réellement des souches de Lb. plantarum qui se développement à 45°C. Lactobacillus
plantarum sont très diversifiés, possèdent un grand génome par rapport aux autres espèces de

123
 Discussion Générale

Lactobacillus et par conséquent elles sont stables (Axelsson, 2004 et An et al., 2004).
Souvent la comparaison des données microbiologiques traditionnelles (phénotypiques) et les
génotypiques (moléculaire) révèlent une grande similitude dans la caractérisation des espèces
de Lb. plantarum.
L’isolation de souches appartenant à l’espèce Lactobacillus plantarum à partir du lait cru
de chèvre et de chamelle d’Algérie a été déjà décrite dans plusieurs études (Guessas et
Kihal., 2004; Badis et al., 2004; Badis et al., 2005; Laouabdia Sellami et al., 2007; Mami et
al., 2008 et Bendimerad et al., 2012). Drici et al. (2009) ont isolé à partir du lait de chamelle
d’Algérie une souche de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis atypique par
apport à la croissance a une température de 50°C. Les analyses du génome de cette espèce par
des méthodes récentes ont confirmés l’authenticité de cette éspèce (Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar. diacetylactis) pouvant lie se caractère a une adaptation spécifique aux conditions
des régions arides Algériennes. La souche Lactobacillus plantarum (Lb.58) possède un
caractère antibactérien capable d’inhiber à la fois les bactéries Gram+ et les Gram-. Cette
activité a été détecté in vitro ont milieu solide sur lequel l’effet de l’acide lactique a été
neutralisé par le tampon phosphate ce qui a facilité la révélation de l’effet d’un autre composé
possédant cette activité. Le milieu de culture a aussi révélé l’effet synergique entre l’acide
lactique produit par Lb.58 et la substance inhibitrice, car l’élimination de l’effet de l’acidité
réduit la zone d’inhibition. L’absence la zone d’inhibition dans le milieu tamponné lorsque
l’inhibition est d’origine lactique cas de la souche Lb.52.
Les deux souches choisies Lb.58 et Lb.68 ont été confronté à 10 espèces bactériennes
pathogènes et d’altération. La mesure des diamètres d’inhibitions pour déterminé le spectre
d’activité des deux souches de lactobacilles dévoile un effet inhibiteur très élevé sur milieu
non tamponnée. En revanche sur milieu tamponnée cette zone d’inhibitions diminue
fortement dans le cas des bactéries pathogènes Gram négatives.
La cinétique de croissance de la souche Lb.58 a été réalisée sur milieu naturelle lait à 30°C,
elle pousse fortement à pH=5,5 et a une température de 30°C et 37°C dans des conditions
d’anaérobiose. Ces facteurs ont permis d’établir les conditions de croissance optimales, qui
ont permis de suivre la croissance de Lactobacillus plantarum dans le lait.
Pour notre souche de Lb. plantarum à T=30°C; la cinétique d’acidité était optimale pour
les pH 5,5 et 6 par rapport aux autres pH, dont pH 5,5 elle démarre à t = 0 h par Do = 0,068
et pH 5,5; pour atteindre à t = 9h une valeur Do =1,648 et pH = 4,9 mais pour les pH= 4 et 8
la Do était à t = 0 (0,065) et (0,063), à t = 9h la Do égale (0,34) et (0,45) respectivement.
Alors Lb. plantarum a un pH optimal de croissance de 5,5 mais elle peut survivre jusqu’à pH
9,5 (Sownd et al., 2005).

124
 Discussion Générale

On constate que la cinétique d’acidification varie selon les différentes températures dans
un même pH et pendant la même durée d’incubation ; à t = 12h et à pH 5,5 les valeurs de la
Do et pH pour Lb. plantarum (Lb.58) pour les températures 20°C, 30°C, 37°C et 44°C sont
(1,076 / 4,23); (1,946 / 3,89); (1,468 / 4,15) et (0,825 / 4,5) respectivement.
L'acidité qui est relié étroitement à la croissance bactérienne, plus le taux de croissance est
élevé plus le taux d'acidité est plus important, plus le pH diminue (livre des bactéries
lactiques), Ce qui explique l’augmentation de l’acidité qui atteint 130°D pour Lb. plantarum
(Lb.58) à une température de 30°C. Par conséquent une diminution de pH qui atteint 4,92
avec une vitesse d’acidification de – 0,011 unité de pH /h.
Les résultats de calculs de µ et G nous conduit à une température optimale de croissance
chez Lb. plantarum (Lb.58) de 30°C (Corry et al., 2003), le temps de dédoublement des
cellules pour Lb. plantarum (Lb.58) à cette température est de 140 min et la vitesse de
croissance est plus importante (0.3 UFC/h). Alors la température optimale de croissance pour
Lb .plantarum est entre 30°C et 37°C (Sownd et al., 2005).
D’après les résultats, la souche de Lb. plantarum a une cinétique de croissance et
d’acidification, dans le milieu MRS et dans le lait écrémé à 30°C, presque identique. La
meilleure température de croissance pour la souche Lb. plantarum (Lb.58) était à 37°C,
malgré que certains auteurs recommandent généralement l’incubation à 30°C, pour la culture
des souches lactiques issues du lait et des produits laitiers.
Cependant, les souches d’origines intestinales et du yaourt, poussent mieux à 37°C. Ce qui
suggère que la souche Lb. plantarum (Lb.58) peut être d’origine intestinale (Corry et al.,
2003).
L’évolution de la cinétique de croissance et d'acidité de Lb. plantarum (Lb.58) dans un
milieu MRS modifié, En fonction du temps et des températures a été effectuée.
D'après les courbes, on observe que la vitesse de croissance de Lb. plantarum (Lb.58) dans
le milieu qui contient le maltose est presque la même pour celui contenant du mannose ou
bien celui qui contient l'asparagine ou la glycine, et cette vitesse augmente dans la
température 30°C et 37°C, puisque c’est la température optimale pour la croissance de cette
souche.
Lorsque on compare ces résultats avec les résultats de milieu MRS non modifié, on trouve
que la croissance dans ce milieu est plus important que le milieu MRS modifiés car le glucose
est un substrat facilement métabolisable par les bactéries lactiques notamment les
lactobacilles (Thompson et Torchia, 1984; Neves et al., 1999 et Mijakovic et al., 2002), et les
souches de Lb. plantarum nécessite plus que ces deux acides aminés pour ça croissance, selon

125
 Discussion Générale

Lenoir et al., 1992.

Les lactobacilles nécessitent pour leur croissance l'aspartate, histidine, lysine, leucine,
méthionine et de valine et ces derniers sont présent dans la composition de l'extrait de levure
(Ghaly et al.,2003).
Concernant l'évolution de pH, plus la croissance est importante plus l'accumulation d'acide
lactique augmente, qui se traduit par un abaissement progressif du pH qui atteint 3.57 et 3.54
pour Lb. plantarum (Lb.58). Ce dernier a un effet significatif sur la production d'acide
lactique et ne peuvent donc être que difficilement enlevées de la constitution du milieu de
culture (Selmer-Olsen et Sorhaug, 1998 et Aeschlimann et Von Stockar, 1990) en plus c’est
une source de vitamine B pour les lactobacilles.
L’interaction des souches Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68) avec dix souches
pathogènes et avec les autres souches de Lactobacillus a été effectuée.
Les infections à S. aureus sont très fréquentes et apparaissent sous des aspects cliniques
très variés. Parmi ces infections on a les toxi-infections alimentaires, qui sont dues à
l'ingestion d'entérotoxines (A et E), préformées dans l'aliment, résistant aux sucs
digestifs et pour certaines à la chaleur, entraînant des troubles d'apparition précoce (moins
de 3 heures) avec vomissements, diarrhée, déshydratation et absence de fièvre. L'évolution
est bénigne, sauf en cas de pertes hydro-électrolytiques importantes (sujets âgés, nourrissons).
S. aureus peut aussi causée des entérocolites aiguës, qui surviennent au décours d'une
antibiothérapie et sont dues à la prolifération de S. aureus antibiorésistant et producteur
d'entérotoxines (Avril et al., 1992).
Dans ce travail, on a étudié la capacité de la souche Lb. plantarum (Lb.58) à inhiber trois
souches de référence de S. aureus (ATCC 25923, ATCC 29213, ATCC 43300). Sur milieu
MRS normale (pH 6,2) et sur milieu tamponné (pH 7), les staphylocoques ont été inhibés par
la souche Lactobacillus (Lb.58) étudiée.
La souche Lb. plantarum (Lb. 58), possède la plus grande activité d’inhibition contre les
staphylocoques. L’inhibition des souches S. aureus par des souches Lb. plantarum a été déjà
décrite. Par exemple, Mami et al., (2008), ont mentionné que des souches Lb. plantarum
isolées du lait cru de chèvre inhibent des souches de S. aureus (ATCC 25923).
Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii sont naturellement (L. ivanovii pour les
animaux) et expérimentalement pathogènes. L. ivanovii est hémolytique et pathogène chez
l'animal (ovins) et a été rarement rencontrée chez l'homme (Avril et al., 1992). Dans ce travail,
on a étudié la capacité de Lb. plantarum (Lb.58) à inhibé Listeria ivanovii ATCC 19119. Sur
milieu MRS normale (pH 6,2) et sur milieu tamponné, L. ivanovii a été inhibée par la souche
Lactobacillus étudiées. L’inhibition des souches du genre Listeria, par certaines souches de Lb.

126
 Discussion Générale

plantarum a été déjà décrite (Ouwehand et Vesterlund, 2004).

Escherichia coli est connu depuis longtemps comme une bactérie commensale du tube
digestif et pathogène pour l'appareil urinaire. Au cours des dernières décennies, le rôle de
certaines catégories d’E. coli dans les syndromes diarrhéiques a été précisé et les mécanismes
de ce pouvoir pathogène ont été analysés. L'existence de diarrhées à E. coli est connue depuis
1940. Ces diarrhées sont dues à des souches de sérotypes particuliers qui provoquent soit des
cas sporadiques, soit des petites épidémies. Ce sont les souches entérohémorragiques (EHEC)
et entéro-invasifs (EOEC) qui causent les intoxications alimentaires (Avril et al., 1992). Dans
ce travail, on a étudié la capacité de Lb. plantarum (Lb.58) à inhibé E. coli ATCC 25922. Sur
milieu MRS normale (pH 6,2) et sur milieu tamponné, E. coli a été inhibée Lb. plantarum
(Lb.58). L’inhibition des souches E. coli par certaines souches de Lb. plantarum a été déjà
décrite par plusieurs travaux (Todorov et al., 2004 et Karthikeyan et Santosh, 2009).
Les autres souches à Gram– étudiée, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter calcoaceticus, Salmonella enterica, ont été inhibé à pH 6,2, par Lb. plantarum
(Lb.58). Par contre, en milieu tamponné, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter calcoaceticus étaient inhibées surtout par les souches Lb. plantarum (Lb.
68). Cependant, Salmonella enterica n’était pas inhibée par aucune souche lactique sur milieu
tamponné. Karthikeyan et Santosh (2009), ont décrit des souches de Lactobacillus plantarum
qui inhibent les souches de Salmonella Typhimurium, Salmonella Paratyphi, Klebsiella sp. et
Pseudomonas aeruginosa.
L’interaction des souches lactiques entre elle, montre que la bactérie qui a la meilleure
capacité d’inhibition c’est Lb. plantarum (Lb.58) qui est en même temps, la plus sensibles à
l’inhibition. Lb. plantarum (Lb. 58) a la meilleure activité antibactérienne, elle a inhibé toutes
les souches testes.
En culture mixte, la croissance de S. aureus ATCC 25923 avec Lactobacillus plantarum
(Lb.58) a été évaluée sur milieu lait. Après 9 h d’incubation la croissance de S. aureus
commence à diminuer. Cette décroissance continue est atteinte 1.64 Log ufc/ml après 24h
d’incubation. Après 48h d’incubation le nombre de Staphylococcus aureus été inférieur à 10
cellules. Aprés 72h d’incubation aucune culture de Staphylococcus aureus n’a été obtenue.
L’activité antibactérienne des souches lactiques peut être due à la production de plusieurs
agents antibactériens. L’acide lactique et l’acidification du milieu inhibent plusieurs types de
bactéries. Aussi, ces souches produisent aussi le diacétyle, qui possède aussi un pouvoir
d’inhibition. L’H2O2, libéré par les souches lactiques inhibent les bactéries qui ne possèdent
pas des défenses contre le stress oxydatif (la catalase, par exemple) (Ouwehand et Vesterlund,
2004).

127
 Discussion Générale

Gulahmadov et al., (2006) ont étudiés l’effet inhibiteur des lactobacilles isolés à partir d’un
fromage traditionnel d’Azerbaïdjan préparé à partir du lait cru de chèvre sur la croissance de
certaines bactéries pathogènes parmi les quelles Staphylococcus. D’autres travaux conduits par
Rodrigues et al., (2005) sur l’inhibition de S. aureus en fromagerie ainsi le nombre de S.
aureus a été de 0.40 log ufc/ml après 24 h comparé au témoin qui été de 5,16 log ufc/ml. La
souche de Lb. plantarum (Lb.58) a montré un potentiel remarquable dans l’inhibition de S.
aureus; cette inhibition est due à la production de multiple substances anti-bacteriennes
appartennent probablement à des bactériocines (Hernandez et al., 2005). Arqués et al., (2005)
ont observé qu’après 72h d’incubation le nombre de S. aureus était de 0,46 log ufc/ml comparé
au témoin ou le nombre était de 6.46 log ufc/ml.
Cependant, dans un milieu tamponné à pH 7, et dans l’interaction avec des bactéries qui
possèdent la catalase, S. aureus par exemple, l’activité antibactérienne des souches étudiées
persiste. Après le traitement avec des enzymes protéolytiques, α-chymotypsine et la pepsine,
l’inhibition disparait. Ce qui suggère que les souches Lb. plantarum (Lb.58) étudiées
produisent des agents de nature protéique, qui causent l’inhibition des autres bactéries.
Ces composés protéiques peuvent êtres des bactériocines. La production des bactériocines par
les souches Lb. plantarum est largement acceptée (Olasupo, 1996; Ouwehand et Vesterlund,
2004 ; Todorov et al., 2004 et Karthikeyan et Santosh, 2009).

Nous notons la double action de Lactobacillus plantarum (Lb.58) par la production d’acide
et ou une production de substances antimicrobiennes (bacteriocin-like). L'acidité est la
première étape dans la production de fromage pour atteindre le pH approprié pour former un
lait caillé. L'acidité et la production de bactériocine jouent ensemble un rôle important en
production fromagère comme décrit par Ryan et al., (1996). L'inhibition de S. aureus par la
souche Lactobacillus plantarum (Lb.58) est due à la production de substances antibactérienne,
cependant l’acidité produite joue un rôle combiné dans cette inhibition. Des résultats
semblables ont été rapportés par Noonpakdee et al., (2003) qui ont isolés un nombre
considérable de bactéries lactiques à partir des produits de charcuterie et ont constatés que
seulement une souche de Lactobacillus était capable d'atteindre un pH final de 4,3.
La détermination de la sensibilité aux antibiotiques des lactobacilles Lb. plantarum Lb.58 et
Lb.68 été réalisés.
Plusieurs chercheurs ont déjà utilisé cette techniques dans l’étude des lactobacilles (Zhoua
et al., 2005; Ortu et al., 2007 et Taheri et al., 2009).
Nos résultats obtenus dans ce travail, sont comparables à celles trouvés par d’autres

128
 Discussion Générale

chercheurs. Mikelsaar et al., (2004), ont signalé que des souches de Lb. plantarum étudiées,
ont présenté une résistance de 100% à la cefoxitine et la vancomycine et 71% à la
ciprofloxacine. Pour la tetracycline, 43% des souches étaient sensibles, 29% intermédiaires
et 29% résistantes.
Vescovo et al., (1982), ont trouvé que des souches de Lb. acidophilus et Lb. reuteri, sont
résistante à la plupart des Antibiotiques testés (21 antibiotiques), de même Strompfová et
Lauková (2004), ont signalé des lactobacilles résistantes à la vancomycine.
De nombreux chercheurs ont spéculé que la bactérie commensale telle que les bactéries
lactiques peuvent servir de réservoir des gènes de résistance aux antibiotiques similaires à
ceux trouvés dans les pathogènes humains. La principale menace associée à ces bactéries, c'est
qu’ils peuvent transférer des gènes de résistance aux bactéries pathogènes. Des gènes conférant
la résistance à la tétracycline, l'érythromycine et la vancomycine ont été détectés et caractérisés
chez Lactococcus lactis, entérocoques et plus récemment dans les espèces Lactobacillus
isolées de la viande et des produits laitiers fermentés (Mathur et Singh, 2004).
West et Warner (1985), ont prouvé que certaines souches de Lb. plantarum, peuvent devenir
résistantes à la streptomycine et la rifampine, après le transfert d’un plasmide à partir des
Streptococcus.
La réduction des cas des intoxications alimentaire due aux germes nuisibles peut se réaliser
par l'exploitation des potentialités des bactéries lactiques capables de produire des substances
diverses dotées d'une activité antimicrobienne.
Cette approche a été déjà soulignée par Topisirovic et al., (2006) en exploitant les
potentialités inhibitrices naturelles de Lactobacillus helveticus dans la biopréservation des
aliments et la réduction des germes de contamination. Les espèces de Lactobacillus isolées du
lait cru de chèvre d'Algérie peuvent servir à cet objectif.
Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes pour lutter contre les intoxications
alimentaires en utilisant des potentialités biologiques et les interactions entre les
microorganismes afin de réduire ainsi l'effet secondaire indésirable des produits chimiques
appelés conservateurs. Les lactobacilles isolés du lait cru de chèvre qui synthétisent des
substances antimicrobiennes, seront utilisées comme un moyen efficace dans la
biopréservation des aliments dans le futur proche.
Effet de l’extrait brut de Lactobacillus plantarum (Lb.58) sur la croissance de S. aureus
ATCC 25923 a été testé. Les résultats obtenus montrent que les dilutions 1/2 et 1/4 et 1/8 ont
montré une activité inhibitrice. Aucune évolution de la densité optique n'a été observée.
Ces résultats révèlent l'efficacité de l'extrait chauffé sur l'inhibition de S. aureus. A partir de
la dilution 1/16 nous remarquons que le taux de survie et d’une croissance de S. aureus dépasse

129
 Discussion Générale

largement les 50%. Cette activité inhibitrice de S. aureus par Lb. plantarum (Lb.58) observée
en milieu synthétique riche doit être exploitée pour servir comme moyen de biopréservation
des aliments pour lutter contre les intoxications alimentaires observées dans les saisons
estivales.
La réduction des cas des intoxications alimentaire due aux germes nuisibles peut se réaliser
par l'exploitation des potentialités des bactéries lactiques capables de produire des substances
diverses dotées d'une activité antimicrobienne. Cette approche a été déjà soulignée par
Topisirovic et al., (2006) en exploitant les potentialités inhibitrices naturelles de Lactobacillus
helveticus dans la biopréservation des aliments et la réduction des germes de contamination.
Les espèces de Lactobacillus isolées du lait cru de chèvre d'Algérie peuvent servir à cet
objectif.
Ces résultats préliminaires ouvrent des perspectives intéressantes pour lutter contre les
intoxications alimentaires en utilisant des potentialités biologiques et les interactions entre les
microorganismes afin de réduire ainsi l'effet secondaire indésirable des produits chimiques
appelés conservateurs. Les Lactobacillus isolées du lait cru de chèvre qui synthétisent des
substances antimicrobiennes, seront utilisées comme un moyen efficace dans la
biopréservation des aliments dans le futur proche.

130
 Conclusion Générale

CONCLUSION GÉNÉRALE
Le screening des bactéries lactiques appartenant au genre Lactobacillus a été effectué à
partir du lait cru de chèvre de la région d’Oran. 252 isolats ont été caractérisés. Les isolats
sont tous des bâtonnets gram positif, catalase négative, non sporulé, sont microéaophiles et
poussent en anaérobiose et dans un milieu légèrement acide.

Sur 252 isolats, 64 ont produit des zones d’inhibitions par confrontation directe sur milieu
solide, L’utilisation du tampon phosphate dans le milieu à réduit le nombre de souche
productrices de zone d’inhibition à 8. Ces 8 isolats retenus ont subit des tests supplémentaires
physiologiques et biochimiques pour identification de l’espèce. Les espèces révélées sont: Lb.
plantarum (Lb.58, Lb.68), Lb. casei (Lb.13), Lb. rhamnosus (Lb.54, Lb.52), Lb. paracasei
subsp, paracasei (Lb.55), Lb. sakei subsp, sakei (Lb.21), Lb. plantarum (Lb.22).

Les Lactobocillus identifiées ont été testées pour déterminer leurs activités
antimicrobiennes vis-à-vis les souches test à Gram+ (Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Bacillus sp.) et à Gram- (Escherichia coli ATCC 25921). Parmis les 8 espèces de
Lactobacillus, 2 souches ont montré une activité interessante vis-à-vis de 10 souches
indicatrices et pathogènes et qui sont les suivantes: trois souches de Staphylococcus aureus
(ATCC 25923, ATCC 29213 et ATCC 43300), Listeria ivanovii ATCC 19119, Escherichia
coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
calcoaceticus, Salmonella enterica et Bacillus sp. Les deux souches performantes de
Lactobacillus plantarum (Lb.58 et Lb.68) ont produit des profils d’inhibition différents.

La souche de Lactobacillus plantarum (Lb.58) a montré une activité antimicrobienne

importante (diamètre supérieure à 7 mm) vis avis des bactéries test sur milieu solide par
rapport aux autres espèces de lactobacilles.

Les caractères technologiques de Lactobacillus plantarum (Lb.58) sont satisfaisants pour

une utilisation en agro-alimentaire et industrielle. Elle est thermorésistante, produit des
arômes et possède une activité protéolytique. Cependant, elle ne produit pas du dextrane sur
milieu MSE. La souche de Lb.58 a une cinétique de croissance et d’acidification identique
dans le milieu MRS et dans le lait écrémé à 30°C.

Lb. plantarum (Lb.58) possède la meilleure activité antibactérienne, elle a inhibé toutes les
souches étudiées. En culture mixte, la croissance de S. aureus ATCC 25923 avec Lb.
plantarum (Lb.58) a été évaluée sur milieu lait. Après 9 h d’incubation la croissance de S.

131
 Conclusion Générale

aureus commence à diminuer. Cette décroissance continue est atteinte 1.64 Log ufc/ml après
24 h d’incubation. Après 48 h d’incubation le nombre de S. aureus été inférieur à 10 ufc/ml.
A 72 h d’incubation aucune culture de S. aureus n’a été observée.

La sensibilité aux antibiotiques, montrent que la souche Lb. plantarum (Lb.58) est sensible
aux antibiotiques suivants: ampicilline, ticarcilline, imipeneme, érythromycine,
pristinamycine, rifampine, nitrofurantoine, triméthoprime et sulfméthoxazole. Par contre elle
est résistantes aux: oxacilline, cefoxitine, ceftazidime, cefsulodine, amikacine, tobramycine,
spiramycine, vancomycine, bacitracine, colistine, acide nalidixique, ciprofloxacine,
ofloxacine, pefloxacine et acide fusidique.

Ce travail nous a permis de détecter Lb. plantarum (Lb.58) isolée à partir du lait cru de
chèvre de d’Algérie capable d’inhiber Staphylococcus aureus de référence en milieu lait.
L’intérêt de ce travail de recherche est de développer une stratégie permettant de contrôler et
de limiter la croissance des germes indésirables, par l’exploitation des potentialités
antibactériennes des Lactobacillus qui sont capables d’assurer une qualité hygiénique et bio-
préservative désirable inhibant ainsi les germes nuisibles et toxinogènes dans les produits
alimentaires.

Le développement d’un levain spécifique contenant Lb. plantarum (Lb.58), doté d’un
pouvoir bio-préservatif permet d’augmenter la durée de conservation des produits laitiers et
d’assurer une qualité sanitaire.

L’exemple dans cette étude, des interactions entre souche Lactobacillus plantarum locales
et Staphylococcus aureus conduit à une possibilité de développer un levain lactique local
possédant des caractéristiques préventives et technologiques recherchés. Ce travail ouvre des
perspectives sur la recherche et le screening des espèces de Lactobacillus indigènes à
caractère probiotique afin de réduire la prolifération des germes nuisibles, d’assurer une
qualité sanitaire efficace rechercher et d’améliorer la valeur nutritive du produit fermenté par
les espèces de Lactobacillus indigènes.

132
 Bibliographie

BIBLIOGRAPHIE

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157
 Annexe

ANNEXE

Milieu MRS (De Man, Rogosa and Sharpe, 1960)

Extrait de levure 5g
Extrait de viande 10 g
Peptone 10 g
Acétate de sodium 5g
Citrate de sodium 2g
Glucose 20 g
KH2PO4 2g
MgSO4 0,25 g
MnSO4 0,05 g
Cystéine-HCl 0,5 g
Eau distillée 1000 ml
pH =6,8
Autoclavage 120°C, 20 min

Milieu MRS-BCP Sans Extrait De Viande

Extrait de levure 5g
Extrait de viande 10 g
Peptone 10 g
Acétate de sodium 5g
Citrate de sodium 2g
Glucose 20 g
KH2PO4 2g
MgSO4 0,25 g
MnSO4 0,05 g
Pourpre de bromocrésol 0,025 mg
Eau distillée 1000 ml
pH =6,8
Autoclavage 120°C, 20 min

Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)

Extrait de levure 3g
Biopolytone 2,5 g
Glucose 5g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH=6.6
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé (121°C, 15mn).Au moment
de l’emploi, 1 ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v) et 1 ml
d’une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p) sont ajoutés.
Ces solutions sont stérilisées par filtration (millipores 0.22 µm) et sont conservées à
l’obscurité à +4°C.

161
Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Extrait de levure 2,5 g
Extrait de viande 5g
Lactose 2g
Biopolytone 5g
Peptone papaînique de soja 5g
Acide ascorbique 0,5 g
Acétate de sodium 1,8 g
L-Arginine 4g
Pourpre de bromocrésol 0,05 g
Agar 10 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 6,5
Autoclavage 120°C, 20 min

Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)

Tryptone 10 g
Extrait de levure 5g
Saccharose 100 g
Citrate de sodium 1g
Glucose 5g
Gélatine 2,5 g
Azothydrate de sodium 0,075 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 6,5
Autoclavage 120°C, 20 min

Milieu Chapman
Peptone 10g
Extrait de viande 1g
Chlorure de sodium 75g
Mannitol 10g
Rouge de phenol 0.025g
Agar 15g
pH 7.4
Autoclave 120° C, 20min

Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)

Infusion de viande de bœuf 3000 cm3
Peptone de caséine 17,5 g
Amidon de mais 1,5 g
Agar-agar 17 g
pH=7.4
Autoclavage 120°C, 20 min

162
Bouillon nutritif
EXTRAIT DE VIANDE 1 g
EXTRAIT DE LEVURE 2 g
PEPTONE 5 g
CHLORURE DE SODIUM 5 g
pH =7.4
Autoclavage 120°C, 20 min

Gélose nutritive
EXTRAIT DE VIANDE 1 g
EXTRAIT DE LEVURE 2 g
PEPTONE 5 g
CHLORURE DE SODIUM 5 g
AGAR 15 g
pH =7.4
Autoclavage 120°C, 20 min

Eau physiologique
Chlorure de sodium 8,5 g
PEPTONE 0,5 g
EAU DISTILLEE 1000 ml
pH =7
AUTOCLAVAGE : 120° C PENDANT 20 MINUTE

Lait écrémé
LAIT ECREME 10 g
EXTRAIT DE LEVURE 0.5 g
Eau distillée 100 ml
pH =7
Autoclavage 120°C, 20 min

MILIEU M17 (TERZAGHI ET SANDINE, 1975)

Peptone de caséine 10 g
PEPTONE PEPSIQUE DE VIANDE 2,5 g
PEPTONE PAPAÏNE DE SOJA 5 g
Extrait de levure 2,5 g
EXTRAIT DE VIANDE 5 g
B-GLYCEROPHOSPHATE 19 g
MGSO4 0,25 G
LACTOSE 5 g
ACIDE ASCORBIQUE 0,5 g
AGAR-AGAR 20 g
EAU DISTILLEE 1000 ML
pH=7.2
Autoclavage 120°C, 20 min

163
Eau peptonée
PEPTONE EXEMPLE D’INDOLE 10 g
CHLORURE DE SODIUM 5 g
pH=7.2
Autoclavage 120°C, 20 min

Tampon phosphate de sodium

Solution (a): 27,8 g NaH2PO4 dans 100ml d'eau distillée
Solution (b): 53,65g Na2HPO4, 7 H2O dans 100ml d'eau distillée
Tampon 0,1 M: 39ml (a) + 61 ml (b) + eau distillée
Stérilisation à 110° pendant 20mn
Tous les milieux sont stérilisés par autoclavage à 121°C pendant 20mn sauf ceux
contenant le lait (110° C pendant 10 min).

164