Travaux pratique

LES METHODES CHROMATOGRAPHIQUE (CCM-CC)

Encadré par :
Mr Lamcharfi El Hadi
Réalisé par :
Kerazi Kaoutar
Gr : 1

L’année universitaire 2022-2023

 TP De la chromatographie (CCM- CC)

Généralités sur la chromatographie

chromatographie Elle est utilisée dans divers domaines, tels que la chimie fine, la

parfumerie, l’œnologie, l’industrie pétrolière, la biologie, l’industrie des matières plastiques,

etc.

C’est une technique d'analyse analytique qualitative et quantitative dans laquelle l'échantillon
contenant

une ou plusieurs substances est entraîné par un courant de phase mobile, qui peut être liquide,

gaz ou fluide supercritique, le long d'une phase stationnaire, qui peut être du papier, de la

gélatine, de la silice, un polymère, de la silice greffée etc. Chaque substance se déplace à une

vitesse donnée, dépendant de ses caractéristiques (polaire, non polaire, ionique, etc., et de

celles des deux phases.

La chromatographie permet de séparer et d’identifier les éspèces chimiques d’un mélange.

Elle est basée sur leur différence d’affinité pour deux phases : la phase stationnaire, ou phase
fixe , et la phase mobile appelée éluant et constituée d’un mélange de solvants.

La chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie sur colonne sont des
chromatographies d’adsorption ;elles sont basées sur la différence d’adsorption sur la phase
stationnaire ; des éspéces à séparer entrainées par l’éluant . la phase stationnaire est solide
(silice….) .

Histoire

Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme

Chromatographie . À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer
des pigments de

plantes. On spécula donc l'étymologie du mot chromatographie à partir du grec khrôma- pour

couleur et donc pigment.

Principe
 La chromatographie repose sur l’entrainement d’un échantillon dissous par une phase
mobile à travers une phase stationnaire . dans ce tp on fait une séparation des colorants
alimentaires d’un sirop de menthe par deux méthodes :

 Chromathographie sur couche mince (CCM)

 Chromatographie sur colonne

I. Principe de la chromatographie sur couche mince (CCM)

La CCM est une technique d’identification ; elle permet de séparer les constituants
d’un mélange , et peut aussi suivre la cinétique d’une réaction chimique.
1) Préparation de la CCM
 on trace au crayon un léger trait à 1cm du bord inférieur de la plaque : c’est la ligne de
dépôt , qui est choisi de silice d’une support d’ aluminium , est une plaque rigide et
souple.

Les intéractions du gel de silice aves les molécules d’eau

NB : Le gel de silice est polaire.

 A l’aide d’un capillaire propre , on dépose dans chaque plaque deux taches vert et
rouge d’un sirop de menthe et grenadine , le couleur vert contient trois coleurs (jaune-
bleau 1- bleau2) et la coleur rouge contient un seul couleur (colorants alimentaires :
E124et le E131-E330-E211-E202).
 Sirop de menthe et grenadine les plaques CCM

 Après on met chaque plaque dans une cuve de verre chaque cuve contient une solvant
qui est consédéré comme phase mobile , le récipient fermé par un couvercle étanche
pour permettre à son atmosphére de se saturer en vapeur de l’éluant , On a placer
délicatement la plaque , la plus verticale possible dans la cuve d’élution , lorsqu’il
arrive environ 1cm du bord supérieur , on retire la plaque et on marque au crayon le
niveau atteint par éluant (front de l’éluant), après on observe dans la cuve la migration
des produits , la vitesse de migration des éspéces dépend de leurs affinités avec
l’éluant puisque on observe que les plaques qui se dépose dans l’eau et l’eau salée se
migre très vite que les plaques qui se dépose dans le mélange (eau éthanol) se migre
lentement.

1. L’eau 3. Nacl 10 g/L 5. Nacl 40g/L

2. Nacl 5 g /L 4. Nacl 20 g/L 6. Nacl 50g/L

7 . Nacl 100 g/L 8. Nacl 40g/L ( Eau/ETOH)

 La cuve d’élution de (Nacl 10g/L)

Les remarques :

- Ne pas toucher la surface de plaque avec les doigts

-Il faut verser l’éluant sur une hauteur moins de 1cm.

- L’opération de l’élution est términée lorsque l’éluant est traversé le maximum de la

couche mince pour avoir toutes les transitions possibles des colorants.

- Si on dépose beaucoup de produit ont perdu l’équilibre .

- Ne pas bouger la cuve , une fois que la plaque sera dedans .

Résultats

D’aprés les plaques étudiés on observe que la couleur jaune il a une grande affinité avec la
phase mobile de Nacl , tandis que la premiére couleur du bleu est séparé à partir de l’eau et
pour sortir la deuxiéme bleu on ajoute l’éthanol. à partir de la CCM on trouve que le bon
solvant utiliseé est le Nacl de concentration 5 et 10 g /L .

2. Révélation de la CCM :

Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est facilement
observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un
procédé de révélation. Les taches seront ensuite entourées au crayon.
  Quelques méthodes de révélation :

- la plaque contient un indicateur fluorescent : on soumet la plaque à un rayonnement UV

et les composés sont révélés sous forme de taches sombres.

- les UV (254 nm) : en exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés
(systèmes conjugués ou aromatiques) apparaissent sous forme de taches brillantes.

- l’iode : on plonge la plaque dans un bocal contenant un fond d’iode broyé. Les composés
apparaissent sous forme de taches brunâtres.

- le révélateur photomolybdique : c’est un révélateur universel obtenu en dissolvant 3 g

d’acide phosphomolybdique dans 100 ml d’éthanol. A manipuler avec précaution.

- le révélateur au p-anisaldéhyde : révélateur universel obtenu en dissolvant 4.5 g de para-

anisaldéhyde, 5 ml d’acide acétique à 99 % et 5 ml d’acide sulfurique concentré dans 85.5 ml
d’éthanol à 95 %.

- le révélateur de Dragendorff : spécifique des amines.

Solution A : solution de nitrate de bismuth (1.7 g), d’acide acétique (20 ml) dans 80 ml d’eau.

Solution B : dissoudre 72 g d’iodure de potassium dans 180 ml d’eau.

On mélange 1.5 ml de A avec 2 ml d’acide acétique, 5 ml d’eau et 1.5 ml de B

- l’atomisation : on pulvérise un réactif uniformément sur la plaque.

Le nitrate d’argent pour les halogénoalcanes, la 2.4-DNPH pour les carbonyles et la

ninhydrine pour les acides aminés.

ATTENTION : lors de la révélation aux UV, le port de lunette de protection adaptée est
obligatoire…

3. Mésure du rapport frontal Rf :

Le rapport frontal Rf ou rétention frontale est caractéristique d’un produit dans un éluant
donné et pour une phase stationnaire donnée.

On calcule le rapport frontal en appliquant la formule

Rf=h /H
Avec :

h : la hauteur atteinte par l’éspéce chimique .

H : la hauteur atteinte par l’éluant .

II. La chromatographie sur colonne :

1.Principe :

La technique de chromatographie sur colonne repose sur le même principe que la

chromatographie sur couche mince : les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins
entraînées par un éluant sur une phase fixe :

1. La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice remplissant une colonne.
2. L'échantillon est déposé en haut de la colonne. La séparation des espèces chimiques
est obtenue par l'écoulement continu d'une phase mobile ( l'éluant ) à travers la colonne. La
séparation est basée sur une différence de vitesses d'entraînement des espèces chimiques
vers le bas de la colonne.

2 . Objectifs :

L'objectif de ce TP est donc de séparer les constituants colorés d'un sirop de menthe. puis de
montrer l'intérêt de la chromatographie sur colonne vis –à- vis de la chromatographie sur
couche mince.
3.Préparation de la colonne :

L’opération de remplissage de la colonne conditionne l’éfficacité de la séparation :

 Pour la 1ére colonne :

1. Fixer verticalement la colonne à l’aide d’une pince .

2.On place un bécher sous la colonne pour récupérer le solvant.

3.On déposer un petit morceau de coton ou les verres frites dans la colonne, le coton joue
le role d’une filtre et de bouchon , le coton contient de l’air on dégaze le coton à l’aide
d’une baguette de verre.

Rq : - il ne faut pas qu’il y ait de bulles d’air car aurait alors des chemins préférentiels
nuissant à une bonne séparation des composés . pendant la phase d’élution avec le solvant

- lorsque les matériels est chaud ne pas utilisé directement .

4. On met une quantité de ( Nacl 10 g /L ) avec 8 g de la phase stationnaire la silice .

 5. on le mélange pour retires tous les bulles d’air ( dégazée) puis on remplait la colonne
(remplissage humide).

6. On tassée les deux phases après on trace la ligne de la phase stationnaire puis on tapote
jusqu’à ce que la phase mobile et en méme niveau avec la phase stationnaire.

7. Après on ajoute une quantité de 10 % du colorant vert par rapport la phase stationnaire
.

8. On ouvre le robinet pour que le produit entre dans la phase stationnaire et que la
surface de la colonne devient matte.

9. Introduire doucement un peu de solvant pour rincé la paroi de la colonne puis on ferme
le robinet .

10.On met un petit morceau de coton ou de sable à la surface de la colonne pour protéger
la phase stationnaire .

11. Lorsque le sirop de menthe a pénétré la surface de la phase stationnaire , éluer avec
l’eau salée en remplissent la colonne doucement à la pipette pour séparer le jaune aux deux
bleu.

12. Lorsque le premier colorant jaune arrive en bas de la colonne le récupérer dans un
premier bécher .

13. Eluer ensuite avec un autre éluant l’eau pour séparer le bleu 1 , lorsque le second
colorant bleu 1 parvient en bas de la colonne , le récupérer dans un second bécher .

14. Finalement on ajoute l’éthanol pour faire sortir le bleu 2 du colonne , le récupérer dans
un 3éme bécher .

Rq : on peut pas férmé le robinet pour éviter la diffusion moléculaire (vitesse ou débit =0).

Pour réussir à une chromatographie sur colonne il faut travailler avec une colonne bien
remplie et bien tasser .

Observations :

 La séparation des colorants se commence :

 On observe que le jaune commence à se déplacer d’après lajoute de l’eau salée
 Dans la fraction 1 on récupère l’eau salée puis dans la fraction 2 on récupère le
colorant jaune .

 On ajoute l’eau on observe le déplacement de bleu1

 Dans la fraction 3 on récupère l’eau puis dans la fraction 4on récupère le bleu1 .
 Pour la fraction 5 on récupére le solvant .
 Finalement on ajoute Et-OH pour récupèré le bleu2 dans la fraction 6.
 Pour 2éme la colonne :
on fait dans la colonne 2 méme étape que la colonne 1 , mais On utilise seulement les
deux solvants ( l’eau et l’éthanol ),On obtient une séparation de colorant jaune au deux
bleu avec le solvant 1(l’eau ) à cause de grand affinité de jaune avec l’eau , puis on
ajoute de l’ Et-OH pour migré le bleu 2.

Observations :

 Dans la fraction 1 on récupère l’eau puis dans la fraction 2 on récupère le colorant

jaune .

 On ajoute l’eau comme solvant et on observe le déplacement de vert mélange de

(jaune +bleu1)
 dans la fraction 4 on récupère le bleu1 , puis on récupére le solvant dans la fraction
5.
 Finalement on ajoute Et-OH pour récupèré le bleu2 dans la fraction 6.