Centre universitaire Abdelhafid Boussouf, Mila
Master 1 Biochimie Appliquée
Module de Biochimie Instrumentale
TP n° 01 + 02 : Chromatographie sur couche mince (CCM)
Partie 01 : Le bon choix de l’éluant et la concentration de l’échantillon
1- Choix de l'éluant
L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants.
Un éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire; celui qui empêche leur
migration ne l'est pas suffisamment.
Methode 01 :
Préparer des solutions de l'échantillon dans
différents solvants, en concentration d'environ 2 à
5% en volume. A l'aide d'une micropipette, on
dépose une goutte de chaque solution sur une
plaque, chacune séparée d'environ 1 cm. Le meilleur
éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa migration,
a entraîné le soluté à une distance d'environ la
moitié de celle qu'il a parcourue.
Méthode 02 :
Déposer une solution des substances à analyser
en plusieurs points, séparés d'environ 2 cm.
Après séchage, on applique au centre de chaque
point une micropipette remplie de solvant; Après
diffusion, l'éluant qui convient sépare les solutés.
Choix de l'éluant dans le cas d'analyses :
• d'hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
• de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions variables
avec du benzène ou de l'éther diéthylique forment un éluant de polarité moyenne.
• de composés polaires : éthanoate d'éthyle, propanone ou méthanol.
2- Quantité de l’échantillon à déposer
Si un dépôt ne contient pas assez de matière on risque d’être en dessous du seuil de détection de la
technique de révélation. Si un dépôt est trop chargé, on risque de saturer la phase mobile lorsqu’elle
atteindra la ligne des dépôts en début de migration: on observera un effet de traînée.
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Partie 02 : Chromatographie sur couche mince (Etude des substances incolores)
MISE EN EVIDENCE DE CERTAINES ESPECES CHIMIQUES DANS DES EXTRAITS DE
PLANTES
1 – But : Séparation des composants d’un
extrait de plante (Extrait chloroformique). On
cherchera à déterminer si l’extrait est composé
d’un mélange ou s’il est pur.
2 – Principe :
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé
l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant
monte à travers la phase stationnaire,
essentiellement par capillarité. Chaque
composant de l'échantillon (soluté) migre à une
vitesse qui dépend de sa nature et de celle du
solvant. On peut ainsi caractériser les composés
selon leur Rf (Rapport frontal : rapport de la distance de migration du composé par rapport à celle du
solvant).
3 – Matériels et produits :
02 cuves à chromatographie, 4 béchers, Agitateur, barreaux magnétiques, 04 Erlens, Eprouvettes graduées
50, 100, 250 ml, Pipettes 10ml, Poires, spatule, plaque CCM (04 plaques), papier Wattman03 et 04 (08
pièces), papier filtre ordinaire, un sèche-cheveux, une lampe à UV, des lunettes de protection, un mortier et
pilon.
Eau distillée, Ethanol, Méthanol, Butanol, Ac Acétique, KMnO4, Diiode, vanilline, quercetine, acide gallique,
extraits de plantes, médicaments.
4 – Mode opératoire
- Sur la plaque chromatographique, tracer au crayon de papier un trait horizontal à 1,5 cm environ du bord
inférieur. Ce trait ne doit pas tremper dans le solvant d’élution contenu dans la cuve.
- Remplir la cuve chromatographique du mélange de solvants (hauteur = 0,5 cm).
Eluant : (n-butanol + ac acétique + H2O) 60 /15/15
- La recouvrir, afin que l’atmosphère dans la cuve reste saturée en vapeurs d’éluant.
- avec un capillaire, déposer sur la ligne de base de la plaque une petite goutte du mélange à analyser (< 3
mm); il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques
déposées sans élargir les taches. Il faut dans ce cas attendre que le solvant s'évapore entre chaque dépôt.
- Laisser sécher les taches avant d’éluer (ou à l’aide d’un sèche-cheveux).
- Placer la plaque verticalement dans la cuve et la couvrir (ne pas déplacer le dispositif ).
- Lorsque le solvant a atteint les ¾ environ de la hauteur de la plaque (1 cm du bord supérieur), sortir la
plaque de la cuve et marquer immédiatement le front du solvant (car le solvant s’évapore très vite).
- Lorsque le solvant s’est évaporé, mesurer :
* la hauteur du front,
* les Rf des substances différentes (centre des taches).
- Révéler directement si les substances sont colorées ;
Ou à l’aide de révélateurs dans le cas de substances incolores. Il existe pour cela deux méthodes :
révélation avec une lampe UV : certaines plaques de CCM contiennent un indicateur fluorescent
permettant une résolution dans l'UV, UV proche (366nm) ou lointain (254nm).
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révélation chimique : on pulvérise sur la plaque un réactif spécifique (vapeurs de diiode ou
solution de permanganate de potassium) qui réagit avec les taches pour donner un produit
coloré.
Partie 03 : Chromatographie sur couche mince (Etude des substances incolores)
IDENTIFICATION DES PRINCIPES ACTIFS DANS QUATRE MÉDICAMENTS
1. But : On dispose de quatre médicaments : le Paralgan, le Co-paralgan, le Panadol-Extra et le Xydol
classés tous quatre dans la catégorie des antalgiques et antipyrétiques. On se propose de mettre en évidence
certaines espèces chimiques présentes dans ces médicaments.
2. Mode opératoire
- Saturer une cuve chromatographique avec l’éluant suivant :
Méthanol / acide acétique / H2O (60/30/10).
- Dans un bécher, écraser le quart d’un comprimé de Paralgan et le dissoudre partiellement dans environ (5 -
10) mL d’éthanol. Procéder de même avec un quart de comprimé de Co-paralgan, Panadol-Extra et Xydol.
- Sur une plaque chromatographique, faire un dépôt de chaque solution.
- Développer le chromatogramme.
- Révéler en exposant la plaque sous une lampe UV.
3. Exploitation des résultats:
Répondre aux questions suivantes :
1 – Combien de taches apparaissent au dessus des dépôts ? Combien d’espèces chimiques sont mises en
évidence dans chaque médicament ?
2_ Schématiser le chromatogramme obtenu et noter les observations ?
3 – Comparer la hauteur des taches obtenues. Existe-t-il une substance commune aux quatre médicaments ?
Justifier.
4– En conclusion : La chromatographie est-elle une technique de séparation ou d'identification d'une espèce
chimique ? Justifier.
