Dr. BOUCHEKRIT M.

Electrophorèse

1. Histoire
L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont
inspirés des études de H. Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il
est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de
signe opposé à leur charge.

En 1937, Arne W. K. Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre

(figure 1). Cette technique lui a permis de séparer les protéines du sérum sanguin en appliquant
un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser
des mesures optiques au travers du tube. Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de
charge très négative comme l'albumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive
comme les globulines. Cette technique ne permet toutefois pas de séparer totalement les
protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des
méthodes optiques comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.

Figure 1. Electrophorèse libre.

En 1939, P. König et D. Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de
serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.

En 1952, P. Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le
nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des
mélanges très complexes d'antigènes.

En 1955, O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.

En 1957, J. Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique

d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.

En 1959, S. Raymond et Winstraub a introduit les gels d’acrylamide.

1
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

En 1961, H. Svensson a introduit la méthode d’électrofocalisation.

En 1969, K. Weber et M. Osborn introduisent l'agent dénaturant Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
pour séparer les différentes sous-unités protéiques.

En 1971, U.K. Laemmli a raffiné la SDS-PAGE.

En 1971, K. P. Meera a introduit les gels d’acétate de cellulose.

En 1975, P. H. O'Farrell et J. Klose a introduit l’électrophorèse bidimensionnelle.

En1979, l’introduction de l’électrophorèse sur gel d’agarose.

En1983, l’introduction de l’électrophorèse à champ pulsé

En 1983, l’introduction de l’électrophorèse capillaire.

2. Définition
Le terme " électrophorèse " décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un
champ électrique. Le préfixe " électro" fait référence à l’électricité du grec èlektron qui signifie
l’ambre jaune et la racine "phorèse" vient du grec phoresis qui signifie " porter d’un côté à
l’autre.

L’électrophorèse est une méthode d'analyse (identification et dosage) qualitative et quantitative,

de séparation et préparative basée sur la migration différentielle de particules, chargées
électriquement sous l’influence d’un champ électrique.

3. Principe de la migration électrophorétique

La migration dépend de plusieurs facteurs :

 Mobilité électrophorétique µ

La mobilité électrique c’est la vitesse de déplacement des particules dans la suspension, et elle
dépend de la charge et de la géométrie de la particule.
Les particules dispersées ont une charge extérieure électrique, sur laquelle un champ électrique
externe exerce une force électrostatique. De ce fait, une particule de charge électrique Q,
placée dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l'entraîne vers l'électrode de
signe opposé :
𝐅 = 𝐐. 𝐄

2
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Des forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu ɳ (le coefficient de viscosité dépend
de la température) s'opposent à la migration de la particule, et ce d'autant plus que la particule
est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande (figure 2) :
𝐟 = 𝟔𝛑. ɳ. 𝐫. 𝐯

Champ électrique
_ + _
+
_ _
+ +
_ _ + _
+ + Force de friction
Force électrostatique
_ + + _
+ +
_+ + + _
_ +
_ Force de retardement
+ _
+ _

Figure 1. Illustration de l’électrophorèse.

Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace alors à vitesse
constante; on peut alors écrire:

𝐐. 𝐄 = 𝟔𝛑. ɳ. 𝐫. 𝐯 𝐬𝐨𝐢𝐭 𝐯 = 𝐐. 𝐄/𝟔𝛑. ɳ. 𝐫

On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ électrique,

par la relation :

𝐯
𝛍= 𝐬𝐨𝐢𝐭 𝛍 = 𝐐/𝟔𝛑. ɳ. 𝐫
𝐄

La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une
séparation en se basant sur cette propriété.

 La charge Q

La charge dépend du pH isoélectrique de la particule et du pH du tampon.

La différence pH - pHi détermine le signe de la charge Q d'une particule :

si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode

si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la cathode
si pH = pHi charge nette nulle pas de migration

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La différence pH - pHi détermine l'intensité de la charge Q d'une particule : plus cette

différence est grande en valeur absolue, plus la charge est importante.

 La taille

La taille des molécules a une certaine influence, particulièrement dans le cas où les molécules
passent à travers une matrice poreuse. Plus la taille des molécules est petite, relativement à
celles des pores, plus les molécules se déplaceront facilement, ce qui implique évidemment
qu'elles migreront rapidement. La taille peut donc avoir une importance majeure dans une
électrophorèse. Elle peut même devenir la base sur laquelle on sépare les molécules,
particulièrement dans le cas des macromolécules si le montage expérimental est conçu à cet
effet. La taille des macromolécules peut aussi avoir un effet indirect puisque qu'elle est liée au
nombre de charges, à sa surface de contact avec le tampon ou la matrice, etc.

 L'affinité des molécules pour la matrice

L'affinité des molécules pour la matrice affecte la migration. Plus l'affinité est grande moins la
molécule migre vite et loin, parce qu'elle est retardée. Ce phénomène étant généralement
nuisible à la qualité de la séparation et la vitesse de la migration, on essaie de minimiser ce
problème en choisissant des matrices les plus inertes possibles par rapport aux molécules qu'on
veut séparer. Cependant on peut tirer parti d'une telle affinité qui constituera un des éléments
de séparation des molécules.

𝐯
 Champ électrique E 𝐄=
µ

 Courants liquidiens

 Courant d’électrolyse
Par suite de l’électrolyse qui se produit dans les cuves, la composition du tampon se
modifie dans les compartiments des électrodes. Cela entraîne à la longue des
modifications du pH des compartiments, perturbant les résultats.

 Courant d’évaporation
Le passage du courant s’accompagne d’un échauffement du support (effet Joule), qui
entraîne l’évaporation de l’eau de la phase liquide. Cet effet est maximum au milieu de
la bande. Il s'établit ainsi un courant liquidien depuis chaque extrémité vers le centre de

4
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la bande. Pour limiter ce phénomène, la cuve est fermée par un couvercle; on utilise
aussi des cuves réfrigérées (figure3).

Figure 3. Courant d’évaporation.

 Courant d'électro-endosmose

Dans les conditions expérimentales, le support se charge négativement; une couche

mobile de charges positives se forme dans le solvant, au contact du support et entraîne
globalement la phase liquide vers la cathode.

Ce courant accélère ou ralentit la migration des molécules, suivant qu'elles migrent vers
la cathode ou vers l'anode. Il peut dans certains cas être plus puissant que les forces
électriques, ce qui fait que des protéines chargées négativement peuvent globalement
migrer vers la cathode : c'est particulièrement vrai avec les gels d'agarose et nous le
verrons aussi dans le cas de l’électrophorèse capillaire (figure 4).

Figure 4. Courant d’endo-osmose.

 La durée de migration

La duré de migration influe sur la distance de migration :

𝐝 = 𝐯. 𝐭

Ou’ d : distance, v : vitesse , t : temps de passage du courant

Cette formule n'est pas applicable dans le cas de l'électrophorèse sur support, car les molécules
effectuent un trajet non linéaire dans les microcanaux du support poreux.

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 Facteurs liés à la nature du support : adsorption et texture.

4. Matériels
De nos jours, on n'utilise que des matrices solides pour supporter l'échantillon à analyser, c'est
ce qu'on appelle une électrophorèse de zone. En effet les fractions séparées migrent comme des
"zones" individuelles.

4.1. Montage horizontal

Ce genre de montage (figure 5) est surtout utilisé pour les matrices comme l'acétate de cellulose
ou le papier où les échantillons se déplacent à sa surface. La matrice est sous forme de bande
(de papier ou d'acétate de cellulose) longue et généralement étroite.

Les deux bouts de la matrice plongent dans un tampon d'électrode (solution d'électrolytes) ce
qui permet de créer une mince couche d'eau à sa surface. Dans cette mince couche, les ions se
déplacent à la surface, créant le courant qui entraînera les diverses molécules de l'échantillon
qui migreront suivant leur charge. Cet échantillon est déposé sur la matrice.

On utilise aussi des montages horizontaux pour des matrices d'agarose lors de l'électrophorèse
d'acides nucléiques ou d'immuno-électrophorèse.

Figure 5. Montage horizontale.

4.2. Montage vertical

Ce genre de montage (figure 6) est surtout utilisé pour les matrices comme les gels de
polyacrylamide ou, plus rarement, d'agarose. Les échantillons se déplacent généralement à
l'intérieur de la matrice.

La matrice est sous forme de matériel gélifié, entre deux plaques de verre ou, plus rarement de
nos jours, dans un tube cylindrique. Elle est souvent préparée peu avant usage en formant un

6
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

"sandwich" plaque de verre/gel/plaque de verre ou une "carotte" à l'intérieur du tube de verre.

Durant la gélification, on aura pris soin de faire des puits où on déposera des échantillons.
Chaque extrémité du gel sera mise en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui,
soumis dans à un potentiel électrique, permettra la propagation d'un courant dans le gel. Ce
courant entraînera les molécules constituant l'échantillon. Cette migration permettra la
séparation des diverses espèces moléculaires qui migreront à des vitesses différentes.

Il s'agit généralement de gel d'acrylamide puisque cette substance peut s'attacher sur le verre et
ne glissera pas hors du "sandwich". Par contre l'agarose ayant une faible affinité pour le verre
se prête mal à ce genre de montage.

On peut en général contrôler les facteurs d'ordre électriques par le réglage de la source du champ
électrique (e.g. tension ou courant), la composition des tampons (résistance du système de
tampon). Certains facteurs sont cependant plus difficiles ou impossibles à contrôler (e.g. affinité
pour la matrice).

Figure 6. Montage verticale.

4.3. Principales matrices d’électrophorèse

La matrice d'une électrophorèse est le support physique sur lequel ou dans lequel l'échantillon
sera déposé et ses molécules migreront. Cette matrice peut soit, être fabriquée d'avance et
utilisée telle quelle, soit faite immédiatement avant usage. Il y a plusieurs types de matrices qui
diffèrent au niveau de leur constitution (matériel avec lequel elles sont faites), du type de
montage dans lequel elles sont utilisées et leurs caractéristiques physico-chimiques.

4.3.1. Papier

Habituellement employé dans un montage horizontal, plus rarement vertical, il servait surtout
à séparer des acides aminés ou d'autres petites molécules chargées. Le dépôt et la migration des
échantillons se font en surface. La présence de charges sur la cellulose qui constitue le papier

7
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interfère un peu avec la migration. Il est de moins en moins utilisé sauf, quelques fois, pour la
séparation des acides aminés sous très haut voltage.

4.3.2. Acétate de cellulose

Il s'agit d'un dérivé acétate d'une forme purifiée de cellulose. Elle se présente sous la forme
d'une mince et fragile feuille. Le dépôt et la migration se font en surface sur un montage
horizontal. On s'en sert beaucoup pour séparer grossièrement des protéines. La faible résolution
ne permet que la séparation de grands groupes de protéines. Son faible coût et sa grande facilité
d'emploi la rendent utile pour la séparation des protéines sériques, particulièrement en
biochimie clinique pour le diagnostic de maladies. Mais même dans ce secteur, on le remplace
par des méthodes où la matrice est de l'agarose.

4.3.3. Amidon

Rarement employée de nos jours, cette matrice forme un gel poreux. Les gels d'amidon
servaient à séparer les protéines destinées à des colorations enzymatiques.

4.3.4. Agarose

L’agarose, un colloïde naturel extrait d’une algue, est un polysaccharide linéaire (masse
moléculaire moyenne : ~12 000 Da) composé de l’unité de répétition fondamentale agarobiose,
elle-même composée d’unités alternantes de galactose et de 3,6-anhydrogalactose. L’agarose
est très fragile et se détruit facilement sous l’effet de manipulations. Les gels d’agarose ont de
grands "pores" et sont utilisés essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse
moléculaire supérieure à 200 kDa. C'est la matrice très souvent utilisée pour l'électrophorèse
des acides nucléiques. Les immuno-électrophorèses sont aussi faites sur gel d'agarose. De plus
en plus, on utilise cette matrice pour la séparation des protéines sériques

Les gels d’agarose se transforment rapidement, mais avec une résolution limitée, étant donné
que les liens qui s’y forment ont tendance à être flous/diffus et à s’étaler en se disloquant. Ceci
est dû au format du pore et ne peut être contrôlé. Sa faible adhésion au verre oblige
généralement à étaler ce gel sur une plaque de verre maintenue horizontale. Les gels d’agarose
sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension dans un tampon aqueux,
puis en faisant bouillir le mélange jusqu’à ce que l’agarose se transforme en une solution claire.
Celle-ci est ensuite versée sur un moule et mise à refroidir à température ambiante jusqu’à
formation d’un gel rigide. En durcissant, l’agarose forme une matrice dont la densité est
déterminée par sa concentration.

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Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

 Concentration d’agarose
Un fragment d’ADN d’une taille donnée migre à travers des gels à différents taux en fonction
de la concentration d’agarose. En fonction de la concentration spécifique de l’agarose ou du
tampon, des segments d’ADN contenant entre 20 et 50 000 bp peuvent être séparés. Dans les
gels horizontaux, l’agarose est généralement utilisé à des concentrations comprises entre 0.7%
et 3% (tableau 1). Gels à 1% d’agarose sont utilisés pour la pluparts des applications.

Tableau 1. Concentration de gel d’agarose recommandée

pour différencier des molécules d’ADN.
% d’agarose Éventail de tailles d’ADN (bp)
0.2 5000 – 40 000
0.4 5000 – 30 000
0.6 3000– 10 000
0.8 1000– 7 000
1 500 – 5000
1.5 300 – 3000
2 200 –1500

3 100–1000

4.3.5. Polyacrylamide

On peut polymériser l'acrylamide entre deux plaques de verre ou à l'intérieur de tubes

cylindriques de verre, où il formera un gel poreux. On dépose l'échantillon sur le sommet du
gel de polyacrylamide, maintenu vertical. Les molécules pourront alors migrer à l'intérieur de
ce gel. Cette matrice électriquement inerte n'entrave pas la migration, permettant donc des
séparations de haute résolution. Les gels de polyacrylamide servent couramment à séparation
des protéines. Ils sont aussi souvent employés pour les acides nucléiques de petite taille,
particulièrement dans le séquençage.

Les gels de polyacrylamide sont obtenus par polymérisation du monomère acrylamide en

présence d'un autre monomère bifonctionnel et donc réticulant, le N,N'-méthylène
bisacrylamide (ou un équivalent).

La polymérisation est en général initiée par du persulfate d'ammonium en présence de

l'accélérateur N,N,N',N'-tétraméthylènediamine (TEMED). Le TEMED (sous sa forme basique,
ce qui implique un pH suffisamment élevé) catalyse la formation de radicaux libres à partir du

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persulfate. Les radicaux libres initient la polymérisation. On peut aussi utiliser la décomposition
par la lumière de la riboflavine-phosphate qui donne alors naissance à des radicaux libres.
L'oxygène étant un inhibiteur de polymérisation, les solutions de monomères devraient donc
être dégazées avant d'être mises à polymériser.

Généralement, on "coule" le mélange acrylamide/bisacrylamide/solution tampon

choisie/réactifs d'initiation de polymérisation dans un volume défini par deux plaques de verre
et des intercalaires de faible épaisseur. La polymérisation est terminée en quelques minutes.

La porosité des gels obtenus dépend de la concentration totale en monomères et de la proportion

d'agent monomère réticulant (le bisacrylamide).

En général, on appelle T (exprimé en %) la concentration totale en monomères avec a masse

d'acrylamide en g, b masse de bisacrylamide en g et v volume total de solution en ml :

𝐓% = (𝐚 + 𝐛) ∗ 𝟏𝟎𝟎/𝐯

On appelle généralement C la proportion d'agent réticulant :

𝐂% = 𝐛 ∗ 𝟏𝟎𝟎/𝐚

La porosité diminue quand T% augmente. Jusqu'à la valeur limite C%=5%, la porosité diminue
quand C% augmente. Au delà de C%= 5%, le bisacrylamide polymérise lui même beaucoup,
entraînant la formation de gels à porosité hétérogène.

Les gels avec T%=2.5% (une limite inférieure de solidité) sont convenables pour séparer avec
effet de tamisage moléculaire des protéines de masses moléculaires aux alentours de 1 million
de Daltons. Les gels avec %T=30% sont convenables pour des peptides vers 2000 de masse
moléculaire. Des tables fournissent les capacités de séparation des gels en fonction de %T et
%C. Les gels avec gradient de concentration en acrylamide ont des résolutions très élevées.

4.4. Tampons

La séparation efficace par l'électrophorèse de gel d'agarose ou de polyacrylamide dépend de la

maintenance efficace du pH dans la matrice.Par conséquent, les tampons sont une partie
intégrale de toute technique d'électrophorèse.D'ailleurs, la mobilité électrophorétique est
affectée par la composition et la concentration ionique (teneur en sel) de tampon de
l'électrophorèse.Sans sel, la conductibilité électrique est minimale et l’echantillon se déplace à
peine.Dans un tampon de concentration ionique élevée, la conductibilité électrique est très

10
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

efficace.Les différentes catégories des systèmes disponibles de tampons pour l'électrophorèse

sont :dénaturants et non-dénaturants, continus et discontinus.

4.4.1. Système tampon dénaturant et non-dénaturant

L'analyse électrophorétique des acides nucléiques simples brins est compliquée par la structure
secondaire assumée par ces molécules.La séparation sur la base du poids moléculaire exige
l'inclusion des agents dénaturants, qui déroulent les brins d'acides nucléiques et éliminent
l’influence de la forme sur leur mobilité.structures stabilisées par des liaisons d’hydrogène
entre les bases.Dénaturer exige la perturbation de ces liaisons d'hydrogène. Les systèmes
tampons dénaturants les plus utilisés incluent l'urée et le formamide comme dénaturants d'ADN.
L'ADN dénaturé migre à travers ces gels à un taux qui est presque totalement dépendant de son
composition et séquence. Les systèmes tampons dénaturants pour les protéinesincluent
l'utilisation du sulfate dodécylique de sodium (SDS). SDS est un détergent anionique qui
dénature des structures secondaires et tertiaires (mais pas de liaisons disulfures), et applique
une charge négative pour chaque protéine en proportion de sa masse. Chauffer les échantillons
à au moins 60 °C dénature les molécules en aidant le SDS à se lier. En conséquence, quand ces
échantillons sont electrophorésés, les protéines se séparent selon la masse seulement, avec un
très peu d'effet des différences compositionnelles. Les molécules d'ADN sont négativement
chargées ; donc l'addition du SDS dans le gel est seulement dans le but d'augmenter la puissance
de résolution des bandes.En absence des dénaturants, les double brins d’ADN, maintient sa
double structure hélicoïdale, qui lui donne une forme comme un roue pendant qu'elle migre à
travers le gel. 4.4.2. Systèmes tampons continus et discontinus

Dans les systèmes tampons continus, l'identité et la concentration des composants du tampon
sont les mêmes dans le gel et le réservoir.Bien que les systèmes tampons continus sont faciles
à préparer et donnent une résolution adéquate pour certaines applications, les bandes tendent
à être plus larges et par conséquence une résolution plus pauvre en ces gels. Ces systèmes sont
employés pour la plupart des formes de l'électrophorèse de gel d'agarose d'ADN, qui
contiennent de l’EDTA (pH 8.0) et du tris-acétate (TAE), du tris-borate (TBE) à une
concentration avoisinant les 50 mM (pH 7.5-7.8).

Les systèmes discontinus utilisent différents tampons pour le réservoir et le gel, et souvent
deux différents tampons dans le gel. Les systèmes discontinus se concentrent les échantillons
dans une zone très étroite avant la séparation, conduisant à l'amélioration de la résolution et la
netteté de la bande. Le gel est divisé en gel de concentration (pH 6.8) en haut du pourcentage

11
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

faible de l'acrylamide et le gel de séparation (pH 8.8) en bas avec un pourcentage d’acrylamide
plus élevé.

Le gel de concentration empêche tout ADN à haut poids moléculaire élevé présent dans
l'échantillon d'obstruer les pores à la surface du gel en cours d'exécution avant que les ADN de
faibles poids moléculaire sont entrés.

Les gels de concentration et de séparation, contiennent seulement du chlorure comme anion

mobile, alors que le tampon de réservoir contient la glycine en tant que son anion, à un pH de
8.8. L'avantage principal du système discontinu est ce que ce système de gel peut tolérer des
échantillons de plus grand volumes.

4.4.3. Tampons de chargement

Le tampon de chargement contient du glycérol ou du saccharose qui rendent plus dense

l’échantillon et lui permet donc de rester au fond du puits de chargement. Il contient aussi des
colorants qui permettent de suivre la migration des échantillons à traves le gel comme le bleu
de bromophénol, ou le xylène de cyanol. Etant donné que ces molécules sont petites, elles
migrent rapidement à travers le gel pendant l'électrophorèse, indiquant ainsi le progrès de
l'électrophorèse. Les composants et les concentrations du gel de chargement habituellement
utilisés sont: 0.25% de bleu de bromophénol, 0.25% de xylène de cyanol, 30% de glycérol, ou
0.25% de bleu de bromophénol, EDTA 50 mM, 0.4% de saccharose.

4.5. Courant appliqué

La tension du courant est en fonction de la longueur des fragments et la concentration du gel.

Plus elle est élevée, plus les échantillons migrent vite. Cependant, la haute tension cause une
augmentation énorme de la température du tampon et du courant dans un temps très court. Le
taux élevé de la chaleur et du courant accumulés mène à la fusion du gel, à la diminution de la
résolution de bandes d'ADN et à l'éruption de fusible.Par conséquent, il est recommandé de ne
pas dépasser 5-8 V / cm et 75 mA pour les gels de taille standard ou 100 mA pour les minigels.
De l'autre côté, lorsque la tension est trop faible, la mobilité de l’ADN (≤ 1 kb) est réduite et
l'élargissement de bande se produit en raison de la dispersion et de la diffusion.

12
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

4.6. Visualisation

La façon la plus simple de visualiser des protéines est de les colorer. Avant de procéder à cette
coloration, il faut fixer les protéines, en mettant le gel dans un acide dilué comme l'acide
acétique ou l'acide trichloroacétique 1 à 10%.

Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie. Il ya aussi rouge Ponceau,
Amido-schwartz (noir) et vert de lissamine.

La décoloration se fait en transférant le gel dans une solution méthanolique acide. On obtient
un gel transparent avec les bandes de protéines colorées.

L’agent d’intercalation le plus couramment utilisé pour rendes visible les bandes d’ADN à la
lumière ultraviolet est le bromure d’ethidium. Le colorant peut être inclus à la fois dans le
tampon et le gel, le gel seul, ou le gel peuvent être colorés après la séparation de l'ADN. Ce
produit est cancérogène et mutagène par inhalation et par contact avec la peau. Des produits
alternatifs comme SYPR Green I, SYPR Safe et GelRed moins dangereux et moins toxique
pour l’environnement sont disponibles mais plus chers.

Coloration à l'argent est un procédé hautement sensible pour la visualisation des bandes d'acides
nucléiques et de protéines après la séparation par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide.
Les acides nucléiques et les protéines se lient les ions argent, qui peuvent être réduits à des
granules insolubles d’argent. La disposition suffisante d'argent est visible comme une bande
brune foncée sur le gel.

5. Applications
L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines, peptides, acides
aminés, acides nucléiques et nucléotides. Elle permet dans certaines conditions (emploi de
micelles de détergents ioniques) de séparer des molécules non ioniques, comme des hormones
stéroïdes par exemple.

5.1. Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose

 Mettre à tremper les bandes d'acétate

de cellulose dans le tampon d'électro-
phorèse.

13
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

 Essorer l'excès de tampon en plaçant

les bandes entre deux feuilles de papier
absorbant (essuie-tout).

 Placer la bande sur le portoir en

veillant à disposer la face absorbante
vers le haut. La bande doit être tendue
et ses extrémités doivent dépasser
suffisamment pour tremper dans le
tampon une fois le support placé dans
la cuve.

 Remplir les deux compartiments de la

cuve avec un même volume de tampon
d'électrophorèse. Mettre en place le(s)
support(s) dans la cuve.

 Prélever un échantillon et le déposer

sur la bande au tiers de l'extrémité, côté
cathode (borne noire) en prenant garde
que la bande soit bien horizontale et
que l'échantillon ne coule pas.

 Fermer la cuve et mettre sous tension

(environ 1 h de migration à 150 V).

 Après migration, placer les bandes

dans la solution de rouge ponceau
pendant 10 minutes.

14
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

 Décolorer le fond dans des bains

successifs d’acide acétique à 5 %.
Agiter le cas échéant pour accélérer la
décoloration.

 La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau, Amido-schwartz, vert de
lissamine, bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des lipoprotéines avec un
colorant des lipides, révélation d'une activité enzymatique,...).
 La lecture peut se faire à l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitométrie
(enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) ; dans ce cas,
l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions; ou encore le dosage
peut être effectué après élution des fractions.

5.2. Électrophorèse sur gel d’agarose

 Préparation du gel d’agarose : peser la

quantité nécessaire d’agarose, y ajouter
le tampon et porté ensuite à ébullition
(microonde) jusqu’à ce que l’agarose
soit complètement dissous.

 Ajouter l’agent d’intercalation.

15
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

 Remplir le support avec le gel

d’agarose en évitant la formation des
bulles d’air. Laisser le gel polymériser
à température ambiante pendant
environ 20 min.

 Préparation des échantillons : il est

nécessaire de se munir un tampan de
chargement, des standards de PM et
l’ADN. Mélanger l’ADN avec le
tampan de chargement.

 Lorque le gel s’est solidifié, retiré

délicatement le peigne du gel.

 Placer le gel dans la cuve et ajouter le

tampon jusqu’à ce qu’il recouvre
complètement le gel.

 Charger les échantillons et le standard.

 Fermer la cuve et la connecté au trans-

formateur. A la fin de migration,
atteindre le transformateur et
désassembler le tous

16
Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

 Exposer le gel aux rayonnements

ultraviolets afin de visualiser les
différentes bandes d’ADN.

 Les résultats positifs sont caractérisés

par la présence de bandes, ce qui
témoigne l’obtention des fragements.

5.3. Electrophorèse sur gel polyacrylamide SDS-PAGE (voir vidéo)

C’est une technique largement utilisée dans la biochimie, la médecine légale, de la génétique et
de la biologie moléculaire pour séparer les protéines en fonction de leur mobilité électro-
phorétique (en fonction de la longueur de chaîne polypeptidique ou le poids moléculaire). SDS-
PAGE d'échantillons ayant une charge identique due à la liaison de la SDS conduisant à la
migration par fractionnement par taille.

5.4. Électrofocalisation
L'électrofocalisation ou focalisation isoélectrique utilise avantageusement la charge que
possède chaque protéine à un pH donné. Elle consiste en une migration, induite par un courant
électrique, des protéines dans un gradient de pH jusqu'à ce qu'elles atteignent un pH équivalent
à leur pHi -moment auquel elles cessent de migrer, puisque leur charge nette est nulle. On
utilise un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose), pour que la taille n'influence pas la
migration. Le gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules amphotères de synthèse
introduites dans le gel au moment de sa fabrication : on utilise un mélange de telles molécules,
possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large, ex. 3-9, ou ± étroite, ex. 4-5 ou 5-
6.5). Ces molécules migrent rapidement dans le gel jusqu'à atteindre une zone où leur charge
devient nulle. Elles ont alors une distribution statistique telle qu'elles génèrent un gradient de
pH sensiblement linéaire le long du gel. Il existe de telles molécules de petit poids moléculaire
et solubles (ampholines) et il existe également des gels à base d'acrylamide modifiée contenant
des groupements acides et basiques fixés (gels d'immobilines).

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Cette technique, qui sépare les polypeptides en fonction de leur charge plutôt que de leur masse,
est très sensible: elle peut distinguer des protéines dont la différence de pHi est aussi faible que
0,01 unité de pH.

L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir une courbe de
titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). On prépare un gel dans lequel on
établit le gradient de pH, puis on dépose dans une rigole centrale la solution de protéine, après
quoi on tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer un courant électrique.

9.5. Electrophorèse bidimensionnelle

L’électrophorèse bidimensionnelle est l'une des méthodes les plus puissants et les plus communes pour
la séparation de centaines à milliers de protéines extraites à partir des tissus, des cellules, etc.
Le principe de la séparation des protéines dans l’électrophorèse bidimensionnelle est effectué
en deux étapes principales : 1ère dimension et 2ème dimension. Dans la 1ère dimension, les
protéines sont résolues en fonction de leur point isoélectrique et séparé en bande étroite dans
un gradient de pH dont on utilise la focalisation isoélectrique. Dans la 2ème dimension, les
protéines sont séparées selon leur poids moléculaire par SDS- PAGE. Les deux séparations sont
effectuées en gel de polyacrylamide. Tant qu’il est peu probable que des molécules différentes
peuvent avoir les mêmes propriétés physico-chimiques (pHi et PM), les protéines sont plus
efficacement séparées par électrophorèse bidimensionnelle plutôt que SDS-PAGE.

Une caractéristique remarquable d’électrophorèse bidimensionnelle est que la résolution

obtenue au cours de la 1ère séparation n'est pas perdu quand le gel est joint au gel SDS-PAGE
dans la 2ème électrophorèse.

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5.6. Immunoélectrophorèse

Immunoélectrophorèse est un nom général pour un certain nombre de méthodes biochimiques

de séparation et caractérisation de protéines basant sur l'électrophorèse et la réaction avec
des anticorps. Toutes les variantes de l’immunoélectrophorèse exigent des immunoglobulines,
également connus comme des anticorps réagissant avec les protéines à séparer ou à caractériser.

Cette technique est utilisée pour la détection de petites quantités de protéines et l’étude de la
pureté d’une protéine en permettant la confirmation de la présence d’un seul antigène.

Le gel d’agarose 1% d'environ 1 mm d'épaisseur tamponnée à un pH élevé (environ 8.6) est,

traditionnellement préféré pour l’électrophorèse, ainsi que pour la réaction avec des anticorps.
L’agarose a été choisi comme une matrice, car il a de larges pores permettant le passage libre
et la séparation des protéines, mais aussi fournit un ancrage pour les protéines
immunoprécipitées et des anticorps spécifiques. Le pH élevé a été choisi parce que les anticorps
sont pratiquement immobiles à pH élevé. Un équipement d'électrophorèse avec une plaque de
refroidissement horizontale était normalement recommandé pour l'électrophorèse.
Les immunoprécipités peuvent être vu dans le gel d'agarose humide, mais ils sont colorés avec
des colorants des protéines comme bleu de Coomassie Brilliant dans le gel séché. A la
différence de SDS-gel électrophorèse, l'électrophorèse en agarose permet des conditions
natives, en préservant la structure native et les activités des protéines à investiguer, donc
l’immunoélectrophorèse permet, en plus de la séparation électrophorétique, la caractérisation
de l'activité enzymatique et la liaison du ligand etc.

Il existe en fait tout un ensemble de techniques qui utilisent des anticorps associés à des
séparations électrophorétiques. On peut distinguer les techniques suivantes :

5.6.1. Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

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Dr. BOUCHEKRIT M. Electrophorèse

Cette technique est utilisée pour la séparation et l’identification d’un mélange d’antigène (Ag).
Le support utilisé est le gel d’agarose qui comporte deux types de puits : un puits ponctuel pour
le dépôt de l’Ag (sérum à analyser) et un puits en forme de rigole pour le dépôt de l’anticorps
(Ac). Dans un premier temps, l’électrophorèse est menée sur gel après le dépôt du sérum. Dans
un deuxième temps l’Ac est déposé dans la rigole. Cet Ac pourra être spécifique d’une protéine
recherchée ou être un mélange d’Ac. Ag et Ac se diffusent dans le gel. Lorsque l’Ag rencontre
son Ac spécifique, le complexe Ac-Ag précipite. Le maximum de précipitation se produit
lorsque le rapport Ag-Ac correspond à la zone d’équivalence. Lorsque la précipitation Ag-Ac
est complètement finie, la plaque est lavée par une solution saline. La révélation se fait par le
colorant approprié (bleu de Coomassie). L’identification s’effectue par comparaison à un sérum
de contrôle normale traité dans les mêmes conditions. Avec un antisérum total, on peut par
exemple distinguer 30-40 protéines dans le sérum humain.

5.6.2. Electro-immunodiffusion double (= électrosynérèse)

Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle

consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques sont
choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est possible
car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines).

9.6.3. Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)

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Il s’agit d’une méthode quantitative qui permet la détermination d’un antigène particulier
présent dans un mélange. Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se
place à pH où les Ig migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les anticorps qui
forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est
proportionnelle à la concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire un
étalonnage.

5.6.4. Electro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell)

On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un gel
contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la seconde dimension.

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5.7. Electrophorèse en champs pulsés

Cette technique est utilisée pour l'électrophorèse des molécules d'ADN de haut poids
moléculaire (15 -100 kb). Dans cette gamme de taille (au-delà de 20 kb), les molécules ne sont
plus séparées par les méthodes classiques, car la migration devient indépendante de la taille.
L’emploi de deux champs orthogonaux utilisés en alternance fait que les molécules d'ADN, qui
mettent un certain temps à s'orienter dans le sens du champ électrique, ne migrent que lorsque
celle-ci est réalisée. Le temps nécessaire à l’orientation est d’autant plus grand que la molécule
d’ADN est longue.

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5.8. Electrophorèse capillaire

C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les
avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité
de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de diamètre d'environ 50 µm et
de longueur 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages élevés (15 -30 kV). Ceci aboutit
à des vitesses de migration très rapides des composés dans les capillaires et ceux-ci sont détectés
par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie directement sur le capillaire, donc dans un
volume très faible. Ceci fournit donc une sensibilité particulièrement élevée (on injecte
seulement quelques nanolitres de l’échantillon).

Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés,
d'oligonucléotides,… le nombre de plateaux est de l'ordre de 500000 par mètre, ce qui fournit
une résolution remarquable (on peut séparer des peptides différant d'un acide aminé, des
mélanges complexes d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est
utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse,…). La technique
peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en présence de micelles de détergents
appropriés.

5.8.1. Electrophorèse capillaire en solution libre (FSCE)

Dans l’électrophorèse capillaire, le courant d'endosmose est la force dominante (il entraîne tous
les solutés quelle que soit leur charge) et il dépend des charges présentes sur la paroi du
capillaire (qui est fonction du pH); ce courant diminue à pH acide.

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5.8.2. Electrophorèse capillaire micellaire (MCE)

Les micelles de détergent (SDS) forment une phase pseudo-stationnaire et le soluté se partage
entre celle-ci et la phase mobile. Les substances les plus apolaires sont davantage "retenues" et
la séparation obtenue s'apparente à celle de la HPLC en phase inverse.

5.8.3. Electrofocalisation en électrophorèse capillaire (CE-IEF)

Vous pouvez consultez le Youtube pour téléchargez des vidéos sur les différents types
d’électrophorèses et même la chromatographie pour mieux comprendre

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