La protéomique :ses techniques d’études analytiques et quantitatives

et ses applications
Aubry M.A. , Aussagues Y. , Berge A. , Brunel L. , Cabeau J. , Chevalier S. , Chicanne G. , Dubreuil
B. , Friry C. , Morello E. , Samson A. , Trinchero N. , Zelazny E.
DESS Expression Génique et Protéines Recombinantes, Université Paul Sabatier, Toulouse, France.

Abstract
Proteomics, the systematic analysis of expressed protein, is a tool for the identification of
proteins involved in cellular process. Genomic can’t explain all the regulation nor all the
interactions observed in living cells. These technologies are based on high-throughput
techniques for the separation and the identification of proteins, allowing an integral study of
many proteins at the same time. Changes in protein expression in variable condition
(overexpression, silencing, drugs influence) can be detected. Proteomics try to determine all
the bio-chemicals and physical properties of proteins such as molecular weigh (MW), pHi,
proteins sequences, 3-D structures. The most efficient technologies used in these researches
are Mass Spectrometry (MS) linked with two dimensional polyacrylamide gel electropheresis
or sometimes liquid chromatography (LC) some attempts on quantitative measurements are
also reported ... In this review, practical and technical aspects, scientific innovations and
health applications are discussed.

Sommaire
1 Introduction
2 Techniques d’études analytiques
2.1 Electrophorèse bi-dimensionnelle
2.2 Méthodologies de spectrométrie de masse et de chromatographie
3 Techniques d’études quantitatives
3.1 Présentation
3.2 Quantification sur gel
3.3 Quantification par méthode immunologique
3.4 Quantification par spectrométrie de masse
4 Applications scientifiques de la protéomique
4.1 Variations de profil d’expression
4.2 Analyse des modifications post-traductionnelles.
4.3 Etude des interactions Protéine / Protéine
4.4 Analyse protéomique de microorganismes et de champignons
4.5 Analyse protéomique de cellules eucaryotes
4.6 Utilisation des cartes protéiques
4.7 Les bases de données Protéomiques
5 Applications médicales
5.1 Etude de l’efficacité et de la toxicité des agents thérapeutiques
5.2 Application aux différents types de pathologies humaines
6 Conclusion
7 Figures
8 Références bibliographiques

1 Introduction

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 Maintenant que les séquences génomiques de plusieurs organismes ont été décrites (
E. coli [1], S. cerevisae [2], Caenorhabditis elegans [3], Arabidopsis thaliana [4]…) il est
primordial de comprendre et d’intégrer les mécanismes cellulaires globaux. L’analyse
génomique ne donne qu’une vue partielle et statistique du fonctionnement cellulaire.
L’établissement d’un organisme pluricellulaire, les capacités évolutives des microorganismes
c’est à dire l’acquisition d’un phénotype, ne peut être élucidé que par des études génétiques
(la génomique). L’aire de la protéomique (définie comme l’étude de l’expression des
protéines totales d’un organisme ou d’un type cellulaire ) permet aujourd’hui de mieux
comprendre l’implication des protéines dans la machinerie cellulaire.
La protéomique passe par l’étude structurale et fonctionnelle de ces macromolécules,
par l’analyse quantitative mettant en évidence les mécanismes de régulation régissant leur
synthèse et par le regroupement de toutes les données à l’aide d’outils informatiques de plus
en plus performants. L’ensemble de ces connaissances entraîne des innovations majeurs, en
recherche fondamentale, en biotechnologie industrielle et en biotechnologie appliquée au
domaine de la santé.
Aujourd’hui, il apparaît que la biologie entre dans une nouvelle phase permise par le
développement de techniques et d’appareils de plus en plus perfectionnés et de plus en plus
résolutifs.
Les études analytiques, identifiant et caractérisant la structure et la fonction de protéines, font
intervenir des techniques très variées mais dont leur combinaison apparaît de plus en plus
indispensable. Les électrophorèses en gels deux dimensions [5] assurent la détermination de
paramètres protéiques comme la masse moléculaire et le point isoélectrique. La spectrométrie
de masse coupléé à des techniques de séparation-purification chromatographiques permet de
déterminer avec précision la masse moléculaire ainsi que la séquence primaire de la protéine
étudiée. Cette technique donne des résultats si précis qu’elle apparaît comme la technique de
choix en protéomique analytique.
Les études quantitatives permettent de mettre en évidence l’évolution de la quantité de
molécules protéiques dans un organisme ou dans un type cellulaire donné. L’étude du
transcriptome, mesurant le taux d’ARNm, a montré qu’il n’existe pas réellement de
corrélation entre le taux d’ARNmessagers (ARNm) et le taux de protéine [6]. De nombreux
mécanismes post-transcriptionnels interviennent pour réguler la synthèse protéique. Il est
possible d’estimer la quantité de protéine sur un gel à deux dimensions à l’aide de colorants
comme le bleu de coomasie ou à l’aide de coloration par l’argent. Or les marquages
radioactifs ou fluorescents donnent des quantifications plus sensibles. D’autres méthodes
comme les quantifications immunologiques telle que l’IDAT (Immuno Detection Amplified
by T7 RNA polymerase) et des méthodes couplées à la spectrométrie de masse telle que
l’ICAT (Isotope Coded Affiny Tag ) utilisant des isotopes lourds, donnent des quantifications
relatives utilisées en protéomique.

Dans cette publication, il a été présenté un tour d’horizon de ces techniques d’analyses
protéomiques ainsi que des exemples sur leurs applications tant au niveau de la recherche
fondamentale qu’au niveau médical.

2 Techniques d’études analytiques

2.1 Electrophorèse bi-dimensionnelle

Afin d’étudier l’ensemble des protéines exprimées par un organisme ou un type
cellulaire donné, il convient de mettre en oeuvre des méthodes analytiques et reproductibles.
L’électrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) introduite par O’Farrel en 1975 [5] est l’une de

-2-
ces méthodes . Elle permet, à l’issue de deux migrations électrophorétiques successives, de
visualiser un grand nombre de protéines de façon simultanée [7] .
Dans la première dimension, les protéines migrent dans un gradient de pH selon leur
point isoélectrique. Cette étape, appelée isoélectrofocalisation (IEF), est suivie d’une seconde
migration, généralement menée dans une direction perpendiculaire à la première, où les
protéines sont séparées selon leurs poids moléculaires [7] .
D’un point de vue pratique, les protéines doivent être préalablement solubilisées sans
modifier leur charge intrinsèque. C’est pourquoi, la solution de solubilisation contient , entre
autre, des détergents, du β-mercaptoéthanol et un agent dénaturant tel que l’urée. Cette
solution doit permettre de dissocier les chaînes polypeptidiques sans modifier leur charge
intrinsèque. L’IEF a lieu dans un gel de polyacrylamide où un gradient de pH a été établi.
Celui-ci est ensuite déposé le long d’un gel SDS–PAGE. Un champ électrique est appliqué :
les protéines migrent selon leur poids moléculaire [7]
A la fin du processus, les protéines peuvent être visualisées par coloration au bleu de
coomassie ou au nitrate d’argent. Chaque protéine apparaît sous la forme d’un spot. Une
‘carte protéique’, pouvant contenir jusqu’à 2000 spots, est ainsi obtenue. Les spots peuvent
subir divers traitements (digestion enzymatique puis étude par spectrométrie de masse) afin de
séquencer ,ou d’évaluer la masse moléculaire de la protéine correspondant à un spot donné.
Ceci démontre le rôle central de l’électrophorèse bi-dimensionnelle dans l’analyse du
protéome [8].

A l’origine, le gradient de pH nécessaire à la réalisation de l’IEF était établi après la

polymérisation du gel d’acrylamide, par migration dans un champ électrique de ‘carrier –
ampholyte’ (CA) ayant un fort pouvoir tampon local. Le gradient de pH ainsi établi dépendait
donc intimement de la tension appliquée sur le gel. Ceci posait notamment des problèmes de
reproductibilité , néfaste pour une étude du protéome [5 ].

Pour résoudre ces problèmes, un nouveau type de gradient de pH a été développé .

Immobilized pH gradients (IPG)

L’électrophorèse bidimensionnelle basée sur l’utilisation de gradients de pH

immobilisés (IPG) a été introduite en 1987 [9]. Les IPG permettent l’isoélectrofocalisation
(IEF) des protéines lors de la première dimension de la 2-DE .
Ils ont permis de surpasser les limites imposées par les anciens gradients d’ampholytes utilisés
pour l’IEF [9]. Contrairement à ces derniers, dans les IPG, le gradient de pH fait parti
intégrante du gel de polyacrylamide. Il est obtenu en incorporant dans le gel par
copolymérisation, des groupements acides et basiques ayant un effet tampon et appelés
immobilines.
Les IPG se présentent sous forme de bandelettes, faciles à utiliser et dont les
dimensions les plus courantes sont 180mm X 3.5mm pour seulement 0.05mm d’épaisseur.
Avant d’effectuer la migration, ces bandelettes sont réhydratées dans un tampon contenant
8M d’urée, 0.5-2 % d’un détergent, 0.2 % de dithiothreitol (DTT) et 0.2 % d’ampholytes
(CA) [8]. Les gels IPG réhydratés sont placés dans la chambre d’électrofocalisation qui est
réfrigérée pour éviter toute surchauffe lors de la migration des protéines. L’extrémité acide de
la bande IPG doit être placée du côté anodique.
Les échantillons protéiques (de 40 à 80 μl) sont déposés sur le gel grâce à des cupules
de dépôt (cup loading). La concentration des échantillons ne doit pas excéder 5 à 10 mg / ml
pour limiter les risques de précipitation des protéines[8]. Toujours dans ce but, le voltage doit
être appliqué de façon progressive [9].

-3-
Le temps de migration dépend du gradient de pH utilisé et de la longueur de la bande IPG.

Les gel de type IPG permettent d’obtenir de très bonnes résolutions, notamment parce
qu’ils présentent des gammes de pH très variées. Selon les applications, un IPG avec un
intervalle de pH faible (une unité pH), moyen (3 à 5 unités pH) ou important (7 unités pH)
peut être employé. Les IPG sont très utiles pour séparer des protéines basiques qui ne sont pas
visualisées par un gradient d’ampholytes. Ainsi, Norbeck et Blomberg [10] ont montré que 25
% des protéines (basiques) de la levure n’étaient pas résolus par un gradient d’ampholytes
mais mis en évidence par un IPG de pH 3-10.
Les IPG permettent d’obtenir des pH proches de 12, ils sont donc très intéressants
pour analyser des protéines très basiques comme les histones et les protéines ribosomales
[11].
Grâce à certains IPG, présentant un gradient de pH étroit, des peptides dont les pI diffèrent de
0.003 unités pH sont séparés. Cette très haute résolution est utile pour distinguer des protéines
mutantes [11].
La résolution en 2-DE est augmentée en utilisant des gels IPG présentant de faibles
intervalles de pH se chevauchant. Wildgruber et al. [12] ont pu révéler 2286 spots protéiques
chez la levure grâce à cinq IPG de pH 4-5, 4.5-5.5, 5-6, 5.5-6.7, 6-9. La même étude avec un
IPG de pH 3-10 ne permet de révéler que 755 spots.
Une étape de l’analyse est présentée en figure 1 : Comparaison des profils 2-DE obtenus avec
un extrait protéique de levure, deux IPG présentant des intervalles de pH différents.

Les IPG, contrairement au gradients d’ampholytes, offrent une très haute reproductibilité au
niveau de la position des spots en 2-DE. [9 ;10]. Par contre, la reproductibilité quantitative
pour les différents spots est moins élevée [10].

Solubilisation des protéines membranaires en 2-DE

Une des difficultés en 2-DE est l’analyse des protéines membranaires. Ces dernières
sont sous représentées dans les profils de gels 2-DE, à cause de problèmes de solubilisation.
En effet, les domaines hydrophobes de ces protéines ont tendance à s’agréger en milieux
aqueux [ 13].
Les tampons habituellement utilisés pour solubiliser les protéines avant l’IEF sont inefficaces
pour ce type de protéines.
Récemment, de nouveaux agents ont donc dû être employés afin d’améliorer cette
solubilisation. Parmi les chaotropes, qui induisent le dépliement des protéines, la thiourée a
permis d’augmenter, la solubilité des protéines et, par la même occasion la résolution en 2-DE
[14; 15]. La thiourée, pour être soluble dans l’eau, doit être associée à de fortes concentrations
en urée, les conditions optimales d’utilisation étant 2 M de thiourée et 5-7 M d’urée.
Dernièrement, de nouveaux surfactants de la famille des sulfobétaïnes ont permis de
favoriser la solubilisation des protéines [15]. Il s’agit du CHAPS (3-[(3-
cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanosulfonate) et du SB 3-10 (N-decyl-N,N-
diméthyl -3-ammonio-1-propane sulfonate) ce dernier ayant un pouvoir solubilisant plus élevé
du fait de sa queue alkyl apolaire. Néanmoins, l’efficacité du CHAPS diminue pour de forte
concentrations en thiourée et le SB 3-10 est insoluble au dessus de 5 M d’urée. Pour résoudre
ces problèmes, de nouvelles amidosulfobétaïnes ont été synthétisées : l’ASB 14
(amidosulfobétaïne 14) et le C8φ [15].

-4-
Possédant des groupes de tête plus polaires que SB 3-10, elles sont solubles dans de fortes
concentrations d’urée et comparées au CHAPS, elles permettent de visualiser plus de
protéines en 2-DE [15].
Le tributyl phosphine (TBP) est l’agent réducteur donnant les meilleurs résultats de
solubilisation des protéines lors de l ‘IEF [15].
Dans tous les cas, ces agents doivent être utilisés combinés pour une solubilisation
maximale.

Nouvelles stratégies suivies dans la résolution des protéines hydrophobes

Les protéines membranaires hydrophobes sont susceptibles d’interagir avec les dérivés
acrylamido constitutifs de la matrice du gel , compromettant ainsi leur migration lors de l’IEF.
Diverses solutions ont été envisagées .
L’une d’elle consiste à augmenter les quantités de protéines chargées sur le gel. Celui-ci est
réhydraté avec un tampon contenant l’échantillon protéique. Ce procédé permet d’augmenter
les volumes de chargement en résolvant les problèmes d’agrégation protéique observés lors
du ‘cup-loading’. Par cette méthode, plus de 450 μl d’extrait protéique peuvent être déposés
sur un gel IPG de 18cm , contre seulement 100μl par la méthode du ‘cup-loading’. De plus,
l’IEF peut être menée dès la fin de la réhydratation ce qui constitue un gain de temps par
rapport au technique classique de chargement des gels [15].

Afin d’optimiser la résolution des cartes protéiques, une autre voie a été suivie . Elle
consiste en une extraction séquentielle des protéines à partir de l’extrait protéique selon leur
propriété de solubilisation [15;16]. Chaque extrait est analysée sur des gels.

L’extraction par des solvants organiques comme le phénol/chloroforme a également

été testée [17] . Des études menées sur E. coli ont démontré que les protéines résolues par
cette technique étaient essentiellement des protéines périplasmiques ou des lipoprotéines . Ces
résultats ont suggéré que les solvants organiques étaient insuffisants pour dissoudre les bi-
couches lipidiques. Les protéines transmembranaires ne sont toujours pas résolues .

Ainsi, il pourrait être souhaitable d’isoler , dans un premier temps les membranes biologiques
puis de mener sur ces membranes divers traitements au triton X114 [18] ou à base de
carbonate de sodium en vue d’extraire ces protéines membranaires.

Pré-fractionnement des échantillons protéiques

Toujours en vue d’améliorer la résolution en 2-DE, Herbet et al. [19] introduisent la

technique du pré-fractionnement des échantillons protéiques via un électrolyseur
multicompartiment. Elle consiste à établir un gradient de pH permettant l’IEF, en créant une
série de chambres séparées par des membranes de polyacrylamide contenant des immobilines
de pH unique. Ces membranes agissent comme des barrières « pI sélectives ». Après avoir
appliqué la tension dans l’électrolyseur, chaque protéine va migrer puis s’immobiliser dans
une chambre délimitée par deux membranes dont les pH encadrent le pI de la protéine.
Chaque fraction isolée est utilisée pour effectuer une IPG 2-DE. Un pré-fractionnement
réaliser sur un extrait protéique de E. coli et faisant intervenir cinq membranes de pH 3, 4, 5,
6, 10.5 a été réalisé. En comparant les résultats obtenus en IPG 2-DE (pH 4-5) avec un
échantillon non pré- fractionné et la fraction de la chambre de pH 4-5, les auteurs constatent
que le pré- fractionnement augmente considérablement la résolution. De plus, grâce à cette

-5-
technique, une plus grande quantité de protéines peut être déposée sur le gel, la sensibilité de
détection peut donc être accrue.

Au regard des différents points évoqués ci-dessus, il apparaît clair qu’il est impossible
de visualiser sur un gel unique l’ensemble du protéome d’un organisme ou d’un type
cellulaire donné : les spots des protéines les plus abondantes masquent ceux des protéines les
moins abondantes .Il est par ailleurs, impossible de solubiliser en une seule étape toutes les
protéines
C’est pourquoi, de plus en plus de protocoles font intervenir un pré-fractionnement des
échantillons protéiques via un électrolyseur multicompartiment.

Des auteurs tels que Cordwell ont ainsi introduit la notion de sous protéome[16;20] .
Les cellules et tissus sont initialement pré-fractionnés selon le compartiment cellulaire ou la
solubilité relative des protéines .Les échantillons sont préalablement « screenés » sur gel IPG
à large gamme de PH pour déterminer la complexité du protéome puis , si nécessaire, analysés
sur des gels plus résolutifs pour visualiser les protéines exprimées à plus bas niveau (figure
2 ).
Le protéome est donc visualisé , de manière exhaustive, sur des cartes dites
composites .

2.2 Méthodologies de spectrométrie de masse et de chromatographie

Combinée à la bioinformatique, la spectrométrie de masse (MS) est l’outil
indispensable pour la détermination à très faible quantité de la séquences des protéines. Par
ailleurs, on vient de voir que pour l ‘analyse protéomique, on utilise le plus souvent
l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel, en dépit des problèmes rencontrés pour l’études des
protéines hydrophobes et de la dénaturation des protéines détruisant les interactions Protéine-
Protéine. ? ? ? ?Au vu de ces limitations, divers groupes de recherche tentent de trouver
d’autres techniques que les techniques électrophorétiques. Les techniques
chromatographiques permettent des couplages plus facile entre méthode de séparation et
spectrométrie de masse, que dans le cas des gels 2D [figure 3] .

Aperçu général [figure 4a et 4b]

Un spectromètre de masse se divise en trois parties : une source permettant l’ionisation

des peptides et des protéines, un analyseur permettant de différencier les ions formés et un
détecteur.
La source peut être une source MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) qui
permet la formation d’ions par excitation d’une matrice contenant l’analyte cristallisé ou une
source ESI (Electrospray Ionization) qui permet la formation d’ions par nébulisation de
l’analyte. Le MALDI va permettre de former des ions mono ou multichargés, par contre,
l’ESI forme essentiellement des ions multichargés analysés pour la caractérisation et
l’identification des protéines [21].
Les analyseurs utilisés pour l’étude du protéome sont de deux types. Le TOF (Time Of Flight)
mesure le temps de vol des ions pour arriver au détecteur. Principalement utilisé avec le
MALDI, cet analyseur permet d’avoir de très hautes résolutions. Le second type d’analyseur
est le quadripôle qui a la particularité de n’avoir qu’une résolution unitaire [22].

L’ensemle de cette partie est à réécrire, je m’en charge….

-6-
Le MALDI.
Cette technique contrairement à l’ESI est tolérante à la présence de petite molécules, de sels et
de détergeant. Elle nécessite au préalable la séparation des protéines par gel 2D. Les analytes
seront cristallisés dans une matrice et ionisés à l’aide d’un laser UV ou IR. Cette technique
permet d’engendrer des états de charge faible ce qui permet d’obtenir des spectres de
complexité réduite. L’analyseur TOF utilisé avec le MALDI peut être amélioré par
l’utilisation d’un réflectron permettant d’augmenter la résolution et par l’utilisation d’un PSD
(Post Source Decay) qui permet d’homogénéiser la vitesse des ions afin d’obtenir une
meilleure précision des résultats. Le détecteur est suivie d’un traitement informatique
permettant l’identification des protéines en fonction des peptides analysés. Cette technique
permet d’obtenir une sensibilité allant de la fmol à l’amol, une résolution de masse supérieure
à 10000Da et une exactitude inférieure à 30 ppm.

L’ESI.
C’est une technique de choix pour les expériences de haute sensibilité SM et SM/SM.
Contrairement au MALDI, cette technique permet le couplage avec la chromatographie
liquide tel que la chromatographie d’exclusion et la chromatographie phase inverse. De plus,
la source d’ionisation peut être améliorée par un nanospray qui va augmenter la sensibilité de
la technique en diminuant la quantité d’analyte entrant dans la source. L’analyseur SM
principalement utilisé est un quadripôle, mais pour augmenter la sensibilité on utilise des
analyseurs en tandem : triple quadripôle avec présence d’un CID (Collision Induced
Dissociation) ou combinaison Q-TOF. Comme en MALDI, le détecteur est suivie d’un
traitement informatique permettant l’analyse des données pour la détermination des
séquences. [23]

Comparaison des deux techniques d’ionisation [24]

Les deux techniques d’ionisation utilisés pour l’étude du protéome donnent des
informations différentes sur les protéines. En effet le MALDI est préférentiellement utilisés
pour obtenir des informations sur la séquence des protéines alors que l’ESI permet de
déterminer la masse des analytes. Toutefois, la spectrométrie en tandem permet d’utiliser
l’ESI pour la détermination de séquences.
Jörg T. Regula a démontré par l’étude du protéome de Mycoplasma pneumonia que
les deux méthodes d’analyses ont des caractéristiques différentes concernant la vitesse
d’opération et l’exactitude des masses. En effet une analyse en MALDI est 10 fois plus rapide
que l’ESI. Par contre l’ESI est un technique plus sensible permettant d’obtenir des mesures de
masses beaucoup plus précises.

Exemple de MS/MS
Le mode MS/MS ou spectrométrie en tandem correspond à l’utilisation de plusieurs
analyseurs en série. Quelque soit le type d’analyseur utilisés le principe est le même : filtrer
les ions provenant de la source, fragmenter les ions sélectionnés, analyser les ions fils et les
guider vers le détecteur.
Pour l’étude du protéome, trois types de spectromètre en tandem sont utilisés :
·Le triple quadripôle. [25] Comme son nom l’indique il est constitué de trois
quadripôles en série : Q1, Q2 et Q3. Q1 permet de filtrer les ions en fonction de leur ratio m/z
grâce à une modification de son champs électrique qui induit la modification de la trajectoire
des ions. Q2 correspond à une cellule de collision (CID) permettant de fragmenter les ions.
Q3 permet de sélectionner certains ions fils qui sont dirigés vers l’analyseur. Cette technique

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permet de générer des spectres très simple dont les informations sur la séquence sont
facilement extractibles. Une simple lecture des spectres donnera la séquence de petits peptides
en calculant la différence de masse des pics.
·La trappe à ions. [26] Le mode MS/MS est constitué d’une trappe à ions qui
opère par piégeage des ions dans un champ électrique tridimensionnel. Elle permet la
sélection d’un ion déterminé, sa fragmentation par collision avec un gaz et la libération
séquentielle des ions fils vers le détecteur.
·Le Q-TOF. [27] Cette technique permet la combinaison d’un analyseur
quadripôle et d’un analyseur TOF en un seul instrument. Le quadripôle est utilisé pour filtrer
les ions en fonction de leur ratio m/z et le TOF permet la mesure des masses avec une grande
sensibilité et une haute résolution. Cette technique a la capacité de produire des spectres d’une
haute qualité avec des quantités d’échantillon de l’ordre de l’attomole (10-18 mole). En outre,
le Q-TOF est un analyseur de plus en plus utilisés car il permet d’utiliser l’ESI et ses
nombreux avantages. C’est donc un puissant outil d’analyse pour la caractérisation et le
séquençage des protéines.

Dan Bach Kristensen et co. [27] montrent, par une série d’expériences, l’utilité d’un
spectromètre de masse Q-TOF pour la caractérisation de protéines, notamment en utilisant le
mode MS/MS.
Les chercheurs démontrent la très grande sensibilité du Q-TOF en mode MS/MS en
réalisant le séquençage complet du peptide modèle [Glu1]-fibrinopeptide B à 10fmol/µL avec
seulement 69 amol (alors qu’il faut 138 amol pour une acquisition en mode MS).De plus, si
on passe la concentration du [Glu1]-fibrinopeptide B à 100 fmol/µL, le séquençage ne
nécessite que 35 amol.
Il a été démontré à partir d’une série de dilutions que la sensibilité du Q-TOF en mode
MS/MS dépasse la sensibilité de la révélation à l’argent. Les auteurs réussissent à séquencer
la BSA avec 25 fmol de la protéine, alors que la bande en coloration à l’argent est invisible.
L’analyse en mode MS/MS permet le séquençage de nouvelles protéines à partir d’un
gel 2-D. Le groupe de recherche nous montre un exemple d’étude sur des protéines de peau de
grenouille. Après sélection d’une bande inconnue d’un gel 2-D et digestion trypsique, l’étude
MS/MS d’un peptide permet d’obtenir une séquence de 21 a.a. inconnue des banques de
données, ce qui démontre la découverte d’une nouvelle protéine. Les auteurs soulignent de
plus l’utilité de réaliser la digestion trypsique en présence de H218O, afin de réaliser un
marquage et d’identifier les ions fils N-ter et C-ter dans le spectre de MS/MS (du fait de
l’apparition de pics intenses de +2 Da pour le C-ter résultant de la coupure trypsique).

L’intérêt de l’utilisation de la MS/MS pour l’analyse du protéome est tout d’abord une
très bonne sensibilité (séquençage avec une centaine d’attomoles), une identification sans
ambiguïté des protéines par le séquençage d’un peptide (notamment pour des protéines de
rapport M/Z identiques), la découverte et le séquençage partiel rapide de nouvelles protéines.
Avec l’avènement de l’automatisation, la MS/MS va s’établir comme une méthode de choix
pour une analyse rapide et fiable du protéome.

Couplage MS et chromatographie 2-D

Les techniques de chromatographie sont utilisées en amont de la SM. Elles permettent
en général de concentrer les analytes, de séparer certaines protéines et d’éliminer les
contaminants tel que les sels.
Pour le MALDI, la chromatographie est utilisé off-line c’est à dire qu’il n’y a pas de
couplage entre la chromatographie et la source d’ionisation du fait de la cristallisation des
analytes pour l’ionisation. Dans ce cas, cela permet un enrichissement en certaines protéines

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la plus part du temps avant la séparation sur gel 2D. En général, on utilise cette technique
pour les protéines étant en faible abondance (non visible sur gel 2D) et pour l’étude de
l’expression différentielle des protéines.
La chromatographie sera sélectionnée en fonction des protéines à étudier. La chromatographie
d’interactions hydrophobes permet de séparer des protéines en fonction de leurs différences
d’hydrophobicité (variation du nombre de sites hydrophobes). Cette technique est
principalement utilisée pour les enzymes et les protéines ribosomales [28]. La
chromatographie sur héparine qui se comporte comme un échangeuse de cation permet de
séparer les protéines se fixant aux acides nucléiques, les facteurs de croissance et de synthèse
protéique. Cette technique peut être utilisés pour l’étude du désordre du système nerveux
central (maladie d’ Alzheimer, schizophrénie…) [29]. La chromatographie sur hydroxyapatite
permet grâce à des interactions électrostatiques de séparer différentes classes de protéines :
enzymes (sites catalytiques variés), protéines de choc thermique et nouvelles protéines à
fonction inconnue. Cette technique a permis l’étude du protéome d’Escherichia coli en
enrichissant les protéines de faible abondance [30]. Enfin , la chromatographie d’affinité par
immobilisation d’ions métalliques (Fer, Aluminium, Gallium) permet la séparation et la
caractérisation des phospholipides (2% des protéines totales) pour l’étude des signaux de
régulation et de prolifération [31].
Pour l’ESI, la chromatographie est utilisé on-line ce qui permet d’affiner la séparation
du gel 2D. C’est une approche robuste et facile pour l’identification des protéines en routine.
La LC-ESI-MS utilise des colonnes C8 ou C18 permettant la séparation des protéines en
fonction de leur polarité [32] ou des colonnes d’exclusion de taille [33].
Certains auteurs couplent plusieurs colonnes chromatographiques en amont du spectromètre
de masse (LC-LC-ESI-MS). Cette technique de haute résolution permet des séparer toutes les
protéines en fonction de leur caractéristiques biochimiques (masse, polarité, taille). La LC-
LC-ESI-MS présente différents avantages : c’est un système automatisable ce qui permet de
diminuer l’intervention de l’opérateur et la perte d’analyte, il permet la séparation deux
dimensions et enfin c’est un système rigoureux permettant un gain de temps. La première
chromatographie deux dimensions a été réalisée en couplant une chromatographie échangeuse
de cations suivie d’une RPLC [34]. Cette méthode permet dans un premier temps de séparer
les protéines en fonction de leur pI puis en fonction de leur polarité. Une seconde approche
correspond au couplage de 6 colonnes d’exclusion de taille (en série) suivie de deux colonnes
C18 en parallèle [35]. La première séparation se fait en fonction de taille des protéines puis
en fonction de leur polarité.
Ces techniques sont très complexes à réaliser du fait de l’importance de la vitesse du flux
entre les deux chromatographies et de l’utilisation de valves pour coupler les colonnes. Mais
le plus grand problème de ces techniques réside dans la sensibilité de l’ESI aux solvants [36].
En effet, le solvant ne doit pas contenir d’additif tel que les acides phosphoriques et
trifluoroacétique, des détergents et des agents chaotropiques qui inhibent l’ionisation des
protéines. De plus on ne doit pas retrouver des sels et des composés organiques non volatiles
qui peuvent boucher les capillaires, rendant l’analyse impossible. Pour optimiser la détection
en ESI lors de couplage avec des techniques chromatographiques il faut mettre au point : la
composition du solvant (acides formique ou acétique), la concentration en additif, la vitesse
du flux, la conductivité et le pH de la solution. De ce fait, le choix des conditions de la
chromatographie se fait en fonction de l’ESI.

Couplage EC et utilisation de la FT-ICR

L’évolution de la spectrométrie de masse vers la miniaturisation a permis l’élaboration
de nouvelles techniques telle que le nano-electrospray [37]. Cette dernière technique rend
possible de nouveaux couplages notamment avec l’électrophorèse capillaire [38]. L’avantage

-9-
de l’électrophorèse capillaire couplée au spectromètre de masse est une séparation rapide des
peptides, qui plus est, en ligne, avant de réaliser l’analyse en MS.
Divers groupes de recherche cherchent à montrer l’utilité d’utiliser un spectromètre de
masse à résonance cyclotronique à transformée de Fourier [39]. Pour l’analyse du protéome,
cette technique est intéressante du fait de sa très bonne résolution (>106), de la très haute
sensibilité (attomole), mais surtout du fait qu’elle permet l’étude de protéines intactes de haut
poids moléculaire (100 kDa).

Miniaturisation, bioinformatique et automatisation

Après la révolution des puces à ADN, les divers groupes travaillant sur le protéome
ont essayés de développer la même approche avec des micropuces (lab on a chip) pour la
recherche protéomique. Les avantages de tels systèmes sont : moins d’analyte requis, les
puces jetables ont un faible coût, rapidité des analyses, possibilité de contrôles et de dosages
automatiques à différentes étapes de l’analyse, automatisation facilitée. Beaucoup de ces
systèmes sont couplés en ligne avec des spectromètres de masse afin d’identifier les protéines
étudiées [40].

On peut trouver plusieurs types de puces couplés en ligne :

- des puces à microdialyse [41]
Une membrane de dialyse est comprise entre deux puces et permet d’éliminer les sels gênant
l’analyse en MS et d’introduire un tampon compatible avec l’analyse MS au fur et à mesure
que l’échantillon avance vers le spectromètre de masse.
- des puces à IEF [42]
Des ampholytes transporteurs forment un gradient de pH mobile sous l’action d’un champ
électrique permettant la séparation des analytes switterioniques en fonction de leur pI avant
l’analyse en MS.
- des puces à électrophorèse [43]
Les capillaires en silices de micropuces permettent de réaliser une séparation
électrophorétique avant une analyse par MS.

La Bioinformatique est un outil indispensable pour l’identification des protéines lors

d’une analyse protéomique. On consulte les banques de données, telles que Swiss-Prot ou
trEMBL, avec des logiciels dédiés à l’identification des protéines (Sequest, Mascot, Peptide
Search, Prowl, Protein Prospector, MS-FIT, Sequence retrieval system).Les logiciels vont tout
d’abord commencer par comparer la masse de la protéine étudiée aux masses des protéines
des banques de données. Ceci permet de réduire dans un premier temps le nombre de
candidats potentiels à l’identification. Si la protéine n’est pas identifiée, on réalise la
comparaison avec les masses des peptides issues de la digestion trypsique. Si un doute
persiste sur l’identification, un séquençage par MS/MS permettra d’enlever toute ambiguïté.
L’identification des protéines n’est pas le seul intérêt de la bioinformatique, c’est aussi
un moyen indispensable pour permettre l’automatisation des systèmes d’analyse.

L’automatisation est l’avenir de l’étude protéomique car elle permet un haut débit des
résultats et une analyse complète, sans intervention humaine, qui est à l’origine de beaucoup
d’erreurs lors des manipulations. Un exemple de ce qu’est l’automatisation complète d’une
analyse protéomique nous est donné par Dunlop. [44]. Les auteurs identifient des bactéries
grâce à l’analyse de leur protéome. Des extraits bactériens de E.Coli et de B.Globogii sont
analysés par LC-ESI-MS contrôlé par l’Agilent Chem Station. L’identification est réalisée par
le logiciel Sequence Retrieval System sur les banques de données Swiss-Prot et trEMBL.
L’analyse est entièrement automatisée, de l’injection de l’échantillon à l’analyse des spectres,

- 10 -
et permet, par l’identification de plus de quarante protéines, de reconnaître sans ambiguïté les
bactéries.

De nombreuses perspectives d’avenir apparaissent, avec la miniaturisation et

l’automatisation de l’analyse protéomique, grâce aux divers couplages possibles avec la
chromatographie et la spectrométrie de masse.
Néanmoins, malgré les progrès qu’autorisent ces nouvelles techniques, un travail très
important reste à faire sur l’aspect quantitatif de l’analyse du protéome.

3 Techniques d’études quantitatives

3.1 Présentation

Un domaine important de la protéomique est le dosage quantitatif du niveau

d’expression des protéines dans une cellule ou un tissu. Depuis les récentes avancées de la
génomique avec le séquençage systématique, l’utilisation de puces à ADN est devenu un outil
très puissant pour étudier la population en ARNm dans une cellule. Ceci permet de déterminer
le niveau de transcription de chaque gène dans un type de cellule donné, dans un état donné :
c’est ce qu’on appelle le « transcriptome ». Bien que ces analyses apportent d’importantes
informations, il serait également très intéressant de pouvoir mesurer individuellement le
niveau d’expression en terme de protéines par des analyses protéomiques. En effet, bien que
le taux d’ARNm reflète dans un sens le taux de protéines, de nombreux événements post-
transcriptionnels font qu’il n’y a pas de corrélation directe entre le taux d’ARNm et le taux de
protéines [6] notamment pour les gènes ayant un faible taux d’expression. Ainsi les études de
protéomiques quantitatives constituent une nouvelle approche pour l’étude des mécanismes
cellulaires [45].
En « protéomique classique », on étudie l’ensemble des protéines d’une cellule ou
d’un tissu sur un gel à deux dimensions où les protéines sont séparées en fonction de leur
charge puis de leur masse. Plusieurs centaines de protéines séparées sur le gel peuvent alors
être visualisées par coloration au bleu de coomassie ou à l’argent, ou par marquage radioactif
ou fluorescent. Les différences d’expression de protéines, entre deux états différents d’une
cellule, peuvent être mesurées en quantifiant le ratio de l’intensité des spots entre deux gel-2D
indépendants. Ceci requiert en général une assistance informatique. D’autres techniques ont
été mises au point pour faire de la quantification protéique sans passer par le gel-2D qui pose
des problèmes de reproductibilité. De plus, toutes les protéines ne sont pas représentées sur
ces gels et les protéines à faibles abondances ne sont pas détectées. Ainsi des techniques
utilisant l’immunodétection ou la spectrométrie de masse vont devenir incontournable pour
les expériences d’études du taux d’expression des protéines.

3.2 Quantification sur gel

Le principal problème technique dans la caractérisation de l'expression protéique
réside dans la quantification. Il n'existe pas de méthode simple de quantification absolue
valable pour l'ensemble des protéines (les colorants ou marqueurs ne se fixant pas de manière
uniforme sur toutes les protéines). Il ne peut y avoir par conséquent que des quantifications
relatives, en comparant des protéines de même famille par exemple. En outre la plupart des
techniques de mise en image présentent des phénomènes de saturation au-delà d'un certain
seuil ; seuls les Imagers évitent cet écueil. L’approche standard de l’analyse protéomique par
la technique de l’électrophorèse à deux dimensions couplée à la spectrométrie de masse (2DE-

- 11 -
MS), permet de comparer, de façon relative, l’abondance d’une protéine dans deux cellules ou
tissus différents en comparant l’intensité d’un spot, dans un gel, à celle du même spot dans un
autre gel. Cependant, certaines classes de protéines sont exclues et non représentées sur un
profil de gel 2D. Ceci inclus les protéines très acides ou très basiques, les très grosses ou les
très petites protéines ainsi que les protéines membranaires. Ainsi le nombre de spots sur un
gel 2D n’est pas représentatif du nombre total de gènes exprimés. De plus, la technique 2DE
détecte uniquement les protéines présentent dans les cellules de façon abondantes et,
l’importante classe des protéines régulatrices (faiblement exprimées) sont difficilement
détectable. Enfin, le pré fractionnement et la concentration des échantillons, nécessaire à la
détection des protéines de faible abondance rend la quantification impossible.
Il existe différentes techniques permettant de détecter et quantifier les protéines à
partir d’un gel [46]. L’utilisation du bleu de coomassie est une des méthodes les plus utilisées
en détection bien que cette coloration s’avère peu sensible et ne fournit une réponse linéaire
que sur une faible gamme de concentration protéique (de 100ng à 1 µg). La coloration à
l’argent, également très utilisée, présente elle une plus grande sensibilité mais n’est pas
applicable à la quantification des protéines sur gel du fait de sa faible linéarité de réponse. Il
est cependant possible de parvenir à une quantification efficace des protéines d’un gel 2D en
utilisant un marquage radioactif ou fluorescent. En effet, ces deux types de marquage
protéique sont actuellement les plus sensibles en permettant des détections de l’ordre de
10-13 mole (soit 1.5 à 20ng pour une protéine de15 à 200 Kda), tout en offrant une réponse
linéaire jusqu’à des concentrations de l’ordre du µg.
Ces techniques de quantification sur gel requièrent alors l’utilisation d’un appareillage
performant d’imagerie tel que les caméras CDD, les scanners laser, les densitomètres ou les
fluorimagers. Il existe de plus des logiciels d’assistance informatique, pour le traitement des
images, mis sur le marché par BioRad (Melanie II, Quest), par Genomic Solutions (Bio Image
2D) et par Amersham Pharmacia Biotech (Phoretix 2D Full) [47].
Il faut cependant considérer le fait que ces techniques de quantification sur gel posent
des problèmes du fait de leur faible reproductibilité et de la non représentation de certaines
classes de protéines.
3.3 Quantification par méthode immunologique
De nouvelles techniques basées sur la spécificité de reconnaissance entre un anticorps
et sa protéine cible ont été développées pour la protéomique quantitative. Il est en effet
possible lorsque l’on possède les anticorps spécifiques, de quantifier le taux d’expression de
ces protéines par la méthode ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)[48].
Cependant, la trop faible sensibilité de cette technique n’autorise pas l’étude du niveau
d’expression des protéines faiblement représentée. Ainsi, Zhang et al [49], ont récemment
publié une technique, basée sur le principe de l’ELISA sandwich, permettant d’augmenter sa
sensibilité d’un facteur 109. Pour cela après immobilisation de la protéine d’intérêt par
l’anticorps primaire correspondant, la révélation est effectuée par le biais d’un anticorps
secondaire permettant une amplification du signal et non un système enzymatique comme la
peroxydase ou la phosphatase alcaline.
Dans la technique appelée IDAT (Immuno Detection Amplified by T7 RNA
polymerase) un fragment d’ADN double brin contenant le promoteur de la RNA polymérase
du phage T7 suivi d’une courte séquence de taille définie est fixé de manière covalente à
l’anticorps secondaire. Ainsi, après fixation spécifique de ces anticorps secondaires, la RNA
polymérase T7 est ajoutée avec des NTP marqués au 32P dans le mélange réactionnel. Il y aura
alors amplification linéaire des brins d’ADN fixés. La quantité des brins d’ARN marqués

- 12 -
synthétisés sera directement proportionnelle à la quantité d’anticorps secondaires et donc à la
quantité de protéines présentes.

3.4 Quantification par spectrométrie de masse

De nouvelles techniques ont été mises en place en utilisant un marqueur isotopique
stable. La méthode consiste à l’addition dans l’échantillon d’un standard interne,
correspondant à la même entité chimique que l’analyte(s), mais marqué par un isotope lourd
(15N, 13C, 2H, 18O). Comme l’efficacité de l’étape d’ionisation est très variable pour les
peptides, le meilleur standard interne pour un peptide donné est le même peptide marqué avec
un isotope stable. Ces 2 entités ayant les mêmes caractéristiques physico-chimiques, ils
subiront de la même façon les étapes d’isolation, purification, séparation et ionisation. On
obtiendra sur le spectre de masse une paire d’ions-peptides séparée par le supplément de
masse apporté par l’isotope lourd. Ainsi, le ratio entre l’intensité des deux entités nous
donnera l’abondance relative d’une protéine en fonction des conditions, du type cellulaire ou
d’autres applications.
Une première technique, décrite par Oda et al [50] consiste à cultiver un type cellulaire
dans deux conditions différentes afin d’étudier les variations dans leur taux d’expression
protéique. Pour cela, une des deux cultures est réalisée en présence exclusive d’une source
d’azote lourd (15N). Un nombre équivalent de cellules de chacune des deux cultures est
rassemblé avant de subir une extraction et une séparation protéique par SDS-PAGE.
Après digestion trypsique dans le gel des spots sélectionnés, les peptides sont analysés en
MALDI-MS-MS.Cette analyse en spectrométrie de masse permettra l’identification de la
protéine ainsi qu’une quantification relative par mesure du ratio d’intensité des pics entres les
peptides non marqués et leurs homologues lourds. On peut ainsi déterminer les différents
niveaux d’expression des gènes en terme de protéines en fonction des conditions de culture
appliquées.
Les problèmes de cette technique résident dans le fait qu’une telle analyse n’est pas applicable
aux tissus et que les milieux enrichis en 15N peuvent perturber le taux d’expression protéique.

Pour palier à ces inconvénients, une amélioration de cette technique, l’ICAT (Isotope Coded
Affiny Tag ) [51,52], a été mise au point. Dans cette technique, bien que le principe général
soit similaire , l’incorporation des isotopes est réalisée après isolation des protéines par
alkylation sélective des cystéines avec un réactif soit lourd, soit léger [figure 5].
Ce réactif portant une biotine, il permet après digestion trypsique des protéines marquées, de
réduire sur colonne avidine la complexité du mélange peptidique.
Cette technique est donc compatible avec l’étude des protéines des fluides biologiques, des
tissus ou de tous types de cellules, bien qu’inapplicable aux protéines dépourvues de
cystéines. De plus la sensibilité de l’analyse dépend de la quantité de molécules marquées par
le réactif. Or la réactivité du réactif a une grande importance pour permettre le marquage des
protéines à faible concentrations, cette réactivité n’a pas été évaluée à notre connaissance.
Une troisième technique, récemment publiée par Xudong Yao [53] est basée sur
l’incorporation d’18O le marquage des peptides du type cellulaire étudié est directement
effectué lors de la digestion trypsique par incorporation d’18O, lors de la réaction d’hydrolyse,
en présence d’H218O.
Ainsi, l’incorporation de deux 18O lors du clivage permettra de visualiser le pic correspondant
à 4 unités de masse du même peptide clivé en milieu H216O.
Cette méthode présente l’avantage de permettre le clivage et le marquage des protéines en une
seule étape et facilite la déduction des séquences peptidiques sur le spectre de masse obtenu
par rapport à la technique de l’ICAT, où ce réactif, avait une masse de 500 Da .

- 13 -
4 Applications scientifiques de la protéomique
Les progrès en miniaturisation, en automatisation et en gain de résolution de toutes ces
techniques permettent de caractériser de plus en plus de structures, de plus en plus de
paramètres physiques et biochimiques. La spectrométrie de masse et l’analyse en gel 2D
représentent les méthodes majeures d’utilisation en recherche fondamentale. De nombreux
profils d’expression d’organismes , soumis à différents stimuli, sont établies. Les variations de
structures lors des modifications post-traductionnelles accompagnées d’interactions
protéiques multiples sont étudiés avec plus de facilité. La collecte de toutes ces données dans
les bases de données facilite d’autant plus l’essor de la protéomique.

4.1 Variations de profil d’expression

L’objectif de nombreuses études fondamentales est l’identification de protéines sur ou
sous exprimées selon différentes conditions expérimentales. Une comparaison des profils
d’expression protéique obtenus par gel 2D permet, par exemple, des études de variation
d’expression de protéine en réponse à des stimuli ou lors d’un phénomène de différentiation
ou encore au cours du développement d’organisme. Globalement, les protéines sont extraites
de tissus ou cellules issus de deux conditions différentes puis séparées par gel 2D. Les
protéines peuvent être visualisées par un traitement du gel à l’argent ou au bleu de coomassie.
Des logiciels analysent les profils obtenus et quantifient les différents spots. Le ou les spots
d’intérêt peuvent ensuite être récupérés et analysés par spectrométrie de masse. La figure 6
montre les variations d’expressions pouvant être observées lors d’une comparaison de profils
d’expression protéique[54].

De nombreuses applications sont retrouvées dans la littérature. Par exemple, des

études ont démontré le pouvoir d’une approche protéomique pour effectuer une corrélation
directe de la réponse d’un organisme à des stimuli environnementaux. En effet, Quadroni et
al. ont montré qu’une privation de sulfate induit chez Pseudomonas aeruginosa une
surexpression d’un certain nombre de protéines régulatrices [55]. Une étude similaire a permis
d’identifier chez Bradyrhizobium japonicum, différentes protéines induites par choc
thermique (28°C à 43°C) [56].
Une récente étude s’est intéressée aux variations d’expression protéique suite à une
interaction symbiotique entre la bactérie Sinorhizobium meliloti et le trèfle Melilotus alba.
Une comparaison du profil d’expression d’un état symbiotique et non-symbiotique a mis en
evidence l’induction et la répression de différentes protéines. Cette étude a permis de
caractériser des protéines responsable de la symbiose et de déterminer les différentes
modifications induites par la symbiose, au seins des deux partenaires [57].
Des études toxicologiques utilisent fréquemment les analyses protéomiques pour
comprendre le mécanisme d’action d’une drogue ou pour identifier ses cibles. Vido et al. ont
cherché à identifier des activités responsables de la détoxification du cadmium, métal lourd
très toxique à faible concentration, chez Saccharomyces cerevisiae. Ils ont comparé le profil
d’expression des protéines totales de levures soumises à un stress au cadmium et non traitées :
54 protéines sont induites et 43 sont réprimées. Parmi ces protéines induites, ils ont pu
identifier deux voies : glutathion et thioredoxine, qui semblent être essentiels pour une
protection contre l’empoisonnement au cadmium [58]. De façon similaire, Aicher et al. ont
observé une corrélation entre le niveau d’expression de la calbindine-D 28K, protéine liant la
calcium, et la nephrotoxicité induite par la cyclosporine A (CsA). La calbindine-D 28K a été
identifiée en comparant des profils d’expression de reins sensibles ou non à la toxicité de la
CsA, et peut donc être considéré comme marqueur de cette nephrotoxicité [59].

- 14 -
 L’analyse protéomique peut également permettre de caractériser des protéines
spécifiques d’une souche ou d’une espèce particulière. En effet la comparaison du protéome
de souches saines de Mycobacterium bovis BCG et de souches virulentes de Mycobacterium
tuberculosis a permis d’identifier entre autre, des facteurs de pathogénicité, ainsi que des
protéines exprimées spécifiquement chez M. tuberculosis, protéines susceptibles d’être
impliquées dans la maladie [60]. De façon analogue, les protéines de trois souches
d’Helicobacter pylori ont été séparées par gel 2D. L’équipe de Jungblut a ainsi identifié
quelques spots communs à ces trois souches, pouvant être considérés comme marqueurs
potentiels [61]. Un autre exemple est l’étude par Komatsu et al. de deux espèces de riz, le riz
vert et le riz étiolé. L’ensembles des protéines extraites ont été séparées par gel 2D et plus de
300 spots sont révélés et analysés. Les profils d’expressions obtenus, couplés à une analyse
partielle de la séquence de certaines protéines, ont révélé la présence de protéines
phosphosynthétiques chez le riz vert, protéines absentes chez l’étiolé où des enzymes
antioxydantes sont retrouvées. Cette approche permet donc d’identifier des protéines
spécifiques à une espèce, à une condition physiologique particulière, permettant ainsi la
compréhension du rôle de ces protéines [62].

Les techniques classiques de séparation des protéines par électrophorèse bi-

dimensionnelle et l’analyse des spots obtenus par spectrométrie de masse ouvrent donc un
grand champs d’application à l’analyse du protéome. Nous avons vu que les cellules,
soumises à différentes conditions environnementales, expriment un ensemble de protéines
qui peut varier d’une condition à l’autre. Ainsi ces différentes techniques complétées par le
traitement bioinformatique des données peut permettre la caractérisation de protéines déjà
connues ; la mise en évidence de nouvelles protéines et à terme, la reconstitution de voies de
signalisation et/ou de transduction.

4.2 Analyse des modifications post-traductionnelles.

Les modifications post-traductionnelles constituent un autre champs d’application très
important au niveau du métabolisme des protéines et de leur régulation qui peut être explorée
par l’analyse protéomique.
L’importance et le grand nombre des modifications post-traductionnelles sont des
évènements bien admis. Transitoires ou permanentes, elles jouent un rôle important non
seulement dans la fonction mais aussi dans la régulation de la fonction des protéines. Ces
différentes modifications s’effectuent sur des acides aminés particuliers pendant la maturation
de la protéine dans l’appareil de Golgi. Elles se caractérisent soit par l’addition de composés
ou groupements chimiques comme l’acétylations N-terminale pour la plus commune soit par
une protéolyse partielle de la protéine. Parmi les modifications post-traductionnelles, il existe
aussi des méthylations, des phosphorylations, des glycosylations, des addition de composés
lipidiques, par exemple acylation, prénylation, greffe d’une ancre Glycérophosphoinositol
(GPI) et beaucoup d’autres.
Les différents types de modifications et les plus importantes ont été recensées par
Natalia N. Nalivaeva et Anthony J. Turner [63] ainsi que leur influence sur l’enzyme
acétylcholinesterase. Cette enzyme, en dehors de son activité de dégradation du
neurotransmetteur acétylcholine, est impliquée dans la prolifération et la différentiation
cellulaire, la conductivité membranaire ainsi que dans la réponse au stress, l’apprentissage et
la mémoire. La N-glycosylation sur des asparagines de cette enzyme influence sa durée de
vie. Sa phosphorylation sur des motifs spécifiques par la Protéine Kinase A limite sa perte
d’activité lorsqu’elle est soumise à des agents inhibiteurs ; cette phosphorylation, in vivo,
pourrait avoir un rôle protecteur au niveau des transmissions cholinergiques.

- 15 -
 Ces modifications post-traductionnelles provoquent des changements des propriétés
physico-chimiques de la protéine. Une variation du point isoélectrique et de la masse est
observée. Ces variations vont avoir des conséquences lors de l’analyse par les techniques
d’électrophorèse 2D où la formation de traînée pendant la migration de la protéine peut être
observée. De même, lors de l’analyse en spectrométrie de masse, le spectre obtenu pour cette
protéine sera aussi modifié. Ces différences de propriétés identifiées et répertoriées peuvent
alors être utilisées pour caractériser ces modifications post-traductionnelles. Ainsi, A.
Sickmann et al. [64] donnent plusieurs exemples : l’analyse en MALDI-TOF de la
cyclophiline A de souris révèle un pic à 2048,99 Da qui peut seulement être expliqué par une
modification de type acétylation N-terminale confirmée par l’analyse en MALDI-PSD. Un
autre exemple est donné pour la phosphorylation où ils constatent que les fragments de
peptides modifiés révèlent un signal à –80 Da et –98 Da expliqué par la perte respective de
HPO3 et H2PO4 en MALDI-PSD par le fragment phosphorylé [Figure 7 ]. Connaissant
l’importance de l’évènement de phosphorylation dans les signaux de transduction (modulation
de l’activité de certaines enzymes et de certains récepteurs), les mêmes auteurs A. Sickmann
et al [65] rappellent que selon les différents types d’acides aminés O-phosphorylés, N-
phosphorylés, S-phosphorylés, des précautions doivent être prises lors de la préparation des
échantillons pour l’analyse. En effet la stabilité de la phosphorylation varient selon les acides
aminés sur lesquels elle s’effectue, ainsi les phospho-thréonines, -sérines, et -tyrosines sont
stables en milieu acide comme en milieu alcalin contrairement aux phospho-aspartates, -
glutamates dont le phosphate est très instable dans ces deux types de milieu. Le taux de
protéines phosphorylées étant très faible, la préparation des échantillons doit passer par une
étape d’enrichissement en la forme phosphorylée par analyse en chromatographie
échangeuses d’ions après incorporation ou non de phosphate radioactif. Une technique de
chromatographie d’affinité, IMAC (Immobilized Gallium(III) Affinity Chromatography) [66]
peut aussi être utilisée, les phosphopeptides sont retenus de façon sélective et en quantité
suffisante pour être analysés en spectrométrie de masse MALDI/TOF ou ESI.
Les travaux de P.B. Mills et al.[67] ont montré qu’il était possible de déterminer les sites et
les types de glycosylation retrouvées sur la protéine α1-antitrypsine. La séparation par
électrophorèse 2D révèle la présence de 8 isoformes de la protéine [Figure 8 : Analyse en
électrophorèse 2-D PAGE du plasma] dans un intervalle de pH de 4,5 à 5,5. Des digestions
dans le gel par diverses protéases (PNGase F, trypsine, chymotrypsine) et glycosidases
complétées par l’analyse en MALDI-TOF-MS leur permettent de localiser les sites de
glycosylation sur les asparagines 46, 83, 247. Ainsi la macrohétérogénéité des isoformes de
la protéine, c’est à dire l’état de la protéine en terme d’occupation des sites de glycosylation, a
été définie. Par la suite, la déglycosylation des peptides et l’analyse des sucres, en MALDI-
TOF, permet d’identifier les différentes glycosylations présentes sur ces acides aminés pour
définir ici, la microhétérogénéité des isoformes de l’α1-antitrypsine. Ainsi, ils trouvent, par
exemple, que l’isoforme M4 possède 2 groupements glycanes bi antennaires et un groupement
tri antennaire. La possibilité de caractérisation des sucres sur les glycoprotéines peut se
révéler très utile. L’utilisation combinée de l’électrophorèse 2D-PAGE et de la spectrométrie
MALDI-TOF peut constituer une stratégie de diagnostic pour des patients atteints de maladies
dues à une altération du processus de glycosylation.

- 16 -
 4.3 Etude des interactions Protéine / Protéine
La recherche d’homologies entre protéines permet d’attribuer un rôle assez général au
produit d’un gène. Cependant, il est plus complexe de déterminer la fonction physiologique
exacte d’une protéine. Même si les mécanismes d’actions de protéines homologues sont les
mêmes, les voies métaboliques auxquels ils appartiennent peuvent être très différentes.
L’étude des interactions protéine/protéine semblent être une approche intéressante
pour lier une protéine inconnue à un processus cellulaire connu. Des informations sur la
fonction peuvent aussi être obtenus en identifiant des partenaires d’action connus. L’une des
techniques les plus utilisées est celle du double hybride chez la levure [68], cependant son
utilisation est limitée pour l’étude d’éléments physiologiques spécifiques des organismes
pluricellulaires [69].
Des auteurs ont combiné une technique qui utilise des protéines mutées « piégeuses de
substrats » et des approches protéomiques pour découvrir des substrats de tyrosine
phosphatase (PTPs) [69]. Ces enzymes déphosphorylent les protéines phosphorylées sur une
tyrosine. La technique mise en œuvre utilise des enzymes mutées comme sonde, elles peuvent
se lier à leur substrat mais ne peuvent plus le déphosphoryler, le substrat est donc piégé [70].
Cette procédure a été adaptée à une approche protéomique pour sonder des substrats candidats
d’extraits cellulaires qui ont été séparés par gel 2D et transférés sur membrane. Les
interactions enzyme-substrat sont révélées par far Western et les protéines substrats positives
sont ensuite identifiées en spectrométrie de masse utilisant un appareil Z-spray Q-TOF en
mode MS/MS. L’utilisation de gels 2D a permis d’augmenter la résolution et la spécificité et
donc de mieux séparer les substrats potentiels.
L’utilisation de la tyrosine phosphatase mutée FAP-1 comme sonde a révélé 2
substrats potentiels de tyrosine phosphatase. Les séquences peptidiques obtenues par
spectrométrie de masse se sont révélées homologues à une α-tubuline humaine pour le 1er
spot et une ATPase du réticulum endoplasmique humain pour le 2ième spot.
La combinaison du far western immunoblot et de l’approche protéomique (gel 2D et
MS/MS) a permis d’attribuer des substrats connus et donc de mieux comprendre le rôle
physiologique de la tyrosine phosphatase FAP-1. Cette technique, contrairement à celle du
double hybride ne nécessite pas d’étape de transfection de cellules et permet une bonne
résolution grâce au gel 2D. Cependant la principale limite est que les protéines sondées sont
dénaturées, les résultas obtenus en conditions natives seraient peut être différents. Les outils
de l’analyse protéomique peuvent donc être utilisés pour analyser les interactions
protéine/protéine, cependant des analyses complémentaires, notamment en conditions natives
peuvent être nécessaire.

4.4 Analyse protéomique de microorganismes et de champignons

L’approche du protéome par les gels 2D permet de cartographier la localisation des
protéines en fonction de leur masse moléculaire et de leur pI. Cette approche est de plus en
plus réalisée sur des microorganismes modèles ou pathogènes ou sur des champignons.
Plusieurs types de protéines sont retrouvés dans ces analyses : 1°- les protéines phénotypiques
qui caractérisent l’état d’une protéine spécifique dans une condition donnée à un temps t ; 2°-
les « stimulons » qui appartiennent à un ensemble de protéines dont le taux de synthèse
change selon un stimulus ; 3°- les signatures protéomiques qui sont caractéristiques d’une
réponse à une condition donnée. La signature correspond le plus souvent à des voies de
signalisation ou à des fonctions biologiques.
Le « mapping » ou cartographie consiste à cataloguer toutes les séries de protéines par gel ou
chromatographie liquide. C’est une approche bien réelle pour la protéomique microbienne:

- 17 -
502 protéines de H. influenzae ont été annotées par Langen et al [72] grâce à l’approche de la
protéomique. De même, 401 protéines de S. cerevisiae ont été caractérisées par Perrot et al
[73] soit 6.8% des protéines totales de S. cerevisiae. Ceci a permis de caractériser des
fonctions protéiques dans le métabolisme du carbone (20%), les protéines du métabolisme
(30%) et les protéines intervenant dans la synthèse des protéines et des acides nucléiques
(25%) néanmoins 38 protéines ont encore une fonction inconnue.

Les techniques protéomiques (puissance de résolution, étroite gamme de pH et le

prefractionnement cellulaire) permettent de révéler environ 75% des protéines du génome
[74]. Un pourcentage plus faible est observé pour les espèces difficilement cultivables : H.
pylori et les mycobactéries qui poussent sur des milieux complexes. Mais malgré les
techniques d’analyse encore imprécises, certains basent leurs études sur les protéines les plus
abondantes. Futcher et al [75], en étudiant S. cerevisiae, révèlent 1400 spots sur un gel 2-D
mais n’identifient que 148 protéines sur les 6000 protéines prédites : leur étude est alors basée
sur 2.5% du génome de S. cerevisiae. Pour remédier à cela, il faut développer de nouvelles
techniques plus sensibles.

Les protéines les plus étudiées chez les microorganismes pathogènes sont les protéines
membranaires [76] et de la paroi qui sont à l’interface organisme - milieu extérieur et les
protéines excrétées qui représentent des facteurs de pathogénicité [60] et de toxicité.
Cependant, leur analyse est difficile car dans le milieu de culture les protéines excrétées sont
en présence de contaminants : peptone, tryptone et de fragment cytosolique due au turn over
des cellules. Les protéines membranaires sont elles aussi difficiles à analyser en raison de leur
hydrophobicité intrinsèque. Les cartes de référence des protéines membranaires ont été
achevés pour E.coli [77], Pseudomonas aeruginosa [78] (récemment complétés pour la
souche pathogène PA01 de 400 protéines associées aux membranes ), H. pylori [79] et pour
Borrelia burgdorferi [80]. Cette liste montre seulement un échantillon de l’avancée de la
protéomique sur les protéines membranaires, elle reste néanmoins exhaustive car de
nombreuses études sont toujours en cours.

L’une des difficultés rencontrées sur la protéomique des microorganismes est le

manque de matériel de référence dans certaines banques de données comme pour l’étude des
protéines de la paroi de Trichoderma reesei [81]. Il est l’un des champignons filamenteux
parmi les plus puissant producteur de protéines extracellulaires et ne possède pas encore de
banque de données complète. Le projet génome et du protéome de T. reesei a débuté en l’an
2000. L’utilisation des banque de données de S. cerevisiae n’est pas un support adéquate pour
la détermination des protéines de la paroi de Trichoderma reesei.

4.5 Analyse protéomique de cellules eucaryotes

Les technologies analytiques ont aussi permis d’établir des cartes 2D de référence en
utilisant différents tissus ou différentes lignées cellulaires. La complexité des cellules
eucaryotes ne permet pas de caractériser la totalité du protéome. Mais grâce à la réalisation
d’un protéome subcellulaire composé de compartiments cellulaires et de structures
macromoléculaires, l’analyse des protéines est facilitée. La plupart des études sur les
organelles (définies ici comme un compartiment cellulaire limité par une membrane) sont
restreintes aux plus abondantes telles que les mitochondries, le réticulum endoplasmique (RE)
/ appareil de Golgi, les lysosomes et le noyau.
Les mitochondries sont les organelles les plus importantes. Elles représentent dans
certaines cellules jusqu’à 25% du volume total. Une étude sur les protéines de placenta

- 18 -
humain [82] a permis de mettre en évidence une carte protéique de références et de localiser
53 protéines connues par séquençage N-terminal, immunoblotting et empreintes peptidiques.
Pour le RE et l’appareil de Golgi qui sont le siège des modifications post-traductionnelles, une
approche protéomique fut réalisée sur des complexes de Golgi d’hépatocyte de rat [83] et a
permis de localiser 173 protéines.
Le noyau qui contient l’information génétique représente environ 5% du volume total
cellulaire. Des cartes de référence sur des protéines nucléaires ont été construites à partir de
lignées cellulaires de lymphomes de Burkitt (BL60) [84].
De plus une étude sur des lysosomes de placenta humain [85] a permis de créer une
carte de référence et d’identifier 3 nouvelles protéines, de localiser 14 protéines luminales et 5
protéines membranaires.
Ces techniques de compartimentation des cartes protéiques peut permettre de
découvrir de nouvelles voies de signalisation dépendant de la localisation cellulaire. Les
structures macromoléculaires sont aussi utilisées pour l’analyse des protéines du fait de leur
intérêt dans la compréhension des fonctions biologiques. Des études ont été effectuées sur la
matrice nucléaire [86], sur les spliceosomes [87] et sur les pores nucléaires [88]. L’étude de
ces derniers a mis en évidence 29 protéines appartenant aux pores nucléaires et 11 facteurs de
transport. Elle a servi de base pour former un modèle 3D des pores nucléaires.

4.6 Utilisation des cartes protéiques

L’analyse soustractive de deux patterns d’expression suivant des conditions
expérimentales définies peut permettre d’étudier les « stimulons » qui sont des protéines
induites ou réprimées suivant des facteurs environnementaux et les marqueurs ou signatures
protéomiques qui correspondent soit à une souche spécifique soit à un facteur spécifique tel
que des facteurs de résistance, de pathogénicité.
Ces études peuvent aussi permettre d’observer de nouvelles voies de signalisation et
de prédire de nouvelles fonctions protéiques par les banques de données et par l’utilisation du
concept « d’analyse des fonctions voisines les plus proches ». Ce concept est valable lorsque
l’on étudie des structures macromoléculaires. Chaque protéine a un rôle propre dans la
structure mais la mise en corrélation de toutes les fonctions protéiques donne sa raison d’être
à la structure macromoléculaire. C’est pourquoi l’analyse des fonctions voisines les plus
proches peut permettre de prédire une fonction encore inconnue.

4.7 Les bases de données Protéomiques

Les bases de données protéomiques contiennent et organisent les nombreuses
informations des analyses protéomiques. D’une manière générale, elles contiennent de
nombreux gels 2D annotés réalisés dans des conditions cellulaires définies pouvant ainsi
servir de cartes de références. Ces bases de données contiennent également les informations
concernant les protéines identifiées au niveau de ces gels 2D, décrivant ainsi l’état du
protéome d’une cellule, d’un organite ou d’un organisme dans des conditions déterminées.
L’ensemble des bases de données protéomiques est répertorié et disponible sur le site
EXPASY (http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html ). Pour chaque base de donnée, une
description du ou des organismes ou du type cellulaire étudié est donnée accompagné d’un
lien hypertexte qui permet d’accéder directement à la base de donnée en question. Les
principales bases de données sont celles des organismes modèles comme Saccharomyces
cerevisiae (YPD), Arabidopsis thaliana, Escherichia coli, Mus musculus, mais aussi des
bases concernant différents types cellulaires et fluides humains ( Human and mouse 2D
PAGE database, Heart-2D PAGE ; Protein Disease database) ou encore concernant les

- 19 -
microorganismes pathogènes (2-DE database au Max Planck Institute for Infection Biology)
ou les parasites (Parasite proteome maps).
Le site de la SWISS 2D PAGE (http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html)est parmi
les plus complets, les plus faciles à utiliser et les plus interrogés ce qui en fait la principale
plate forme d’informations en ce qui concerne les analyses protéomiques de gels 2D [36]. Elle
contient 31 cartes 2D de référence des différents organismes : cellules d’humain et de souris,
d’E.coli, d’A. thaliana. Cela représente 2824 spots identifiés correspondant à 614 protéines
[89]. Les résultats sont présentés sous la forme d’une page Web donnant la description de la
protéine, les protocoles de réalisation des cartes de références, les informations
physiologiques et pathologiques, les données expérimentales (pI, poids moléculaire,
composition en acides aminés …) ainsi que les références bibliographiques liées à MEDLINE
[89].
Il existe des bases de données spécialisées comme la YPD : Yeast Proteome database
[90,91], base de donnée de la levure S. cerevisiae
(http://www.proteome.com/databases/index.html). Cette base de donnée est aussi un modèle
d’organisation et de présentation d’informations compréhensibles en ce qui concerne les
protéines [92]. Les résultats, présentés sous forme de «YPD protein report», contiennent une
partie description de la protéine ( nom, séquence, liens vers d’autres bases), une partie
propriétés (fonction, activité enzymatique, interaction physique, génétique, localisation,
régulation …) et une partie de références bibliographiques liées à MEDLINE. Cependant, la
localisation des protéines sur gel 2D se fait via le site YPM : Yeast Protein Map
(http://www.ibgc.u-bordeaux2.fr/YPM). Il est possible d’accéder aux protocoles de
construction des cartes 2D de référence via les références bibliographiques. En effet ces cartes
sont utilisées comme référence pour les scientifiques qui cherchent à mettre en évidence des
différences dans le protéome d’une cellule dans différentes conditions. Il est donc
indispensable de réaliser les essais dans les mêmes conditions que les témoins, i-e les cartes
de référence, pour une comparaison efficace.
Le développement de bases de données concernant les organismes pathogènes doit être
effectué. L’interconnexion de ces bases avec celles des organismes modèles permettra
notamment d’exprimer le pouvoir des approches génomique/protéomique dans l’étude des
problèmes biologiques et médicaux [91].

5 Applications médicales
Les avancées dans le domaine de la protéomique génèrent actuellement un grand
nombre de cibles thérapeutiques potentielles et permettent la découverte de marqueurs de
maladies.
Un des principaux défis du secteur pharmaceutique est d’augmenter l’efficacité de la
détection de la toxicité des médicaments par comparaison des profils protéiques entre des
individus soumis à un traitement et des individus non traités.

5.1 Etude de l’efficacité et de la toxicité des agents thérapeutiques

De nombreuses études utilisant la protéomique ont déjà été utilisées pour étudier les
effets d’un médicament sur des échantillons biologiques.
Ainsi, la protéomique a joué un rôle prépondérant dans la découverte des mécanismes
de la néphrotoxicité induite par un traitement à la cyclosporine A (CsA). L’étude des
modifications de profils protéiques sur gels 2DE entre des rats traités à la CsA ou non traités a
permis de mettre en évidence la régulation négative, en cas de traitement à la CsA, d’une
protéine de liaison au calcium, ce qui induit une accumulation de calcium dans les tubules du

- 20 -
rein et donc une toxicité tubulaire [93]. Cette étude a ensuite été généralisée à d’autres
espèces, mettant en évidence l’existence d’un mécanisme similaire de néphrotoxicité chez
l’homme [94].
Une autre application de la protéomique aux effets d’agents thérapeutiques est
l’établissement de profils protéiques typiques d’une catégorie d’agents. L’indométhacine a
ainsi servi à établir un profil d’expression protéique typique des agents anti-inflammatoires
non stéroidiens (NSAID) [95]. En établissant le même type de profil pour d’autres NSAID
potentiels, il devient alors possible de prédire leur efficacité par comparaison avec le profil
type correspondant au traitement à l’indométhacine.
Il est aussi possible d’observer le devenir d’un système de prise de thérapeutique par
voie intraveineuse constitué de particules de latex servant de transporteur pour l’agent
thérapeutique. En comparant les gels 2D des protéines adsorbées sur ces particules dans
différents milieux in vitro, sérum frais ou inactivé, plasma, on a pu déterminé que ces
particules provoquaient l’activation de la voie alternative du complément, permettant ainsi
leur élimination in vivo [96].
La protéomique permet de plus une meilleure compréhension des mécanismes
cellulaires et la détection de modifications post-traductionnelles induites par un traitement ou
une pathologie [97]. Mais l’intérêt de la protéomique consiste aussi en la détermination de
protéines pouvant être utilisées comme marqueurs des maladies, détectables de façon précoce
et pouvant ensuite être utilisées comme cibles thérapeutiques.

5.2 Application aux différents types de pathologies humaines

Pathologies du système nerveux central (SNC)

L’étude du liquide céphalorachidien (CSF) et du sérum permet de voir les

changements du profil d’expression protéique tout au long d’une maladie et de découvrir
quelles sont les protéines impliquées dans le développement de la pathologie.
Ainsi, dans le cas de la maladie d’Alzheimer (AD), ou de la schizophrénie, des études
ont démontré que l’expression de diverses protéines synaptiques était altérée. Les protéines
SNAP 25 et GFAP (glial fibrillary acidic protein) par exemple, se révélent être des protéines
associées à la maladie d’Alzheimer et leur présence a été décelée à l’aide d’études
protéomiques dans le cerebellum et dans les lobes frontaux, pariétaux, temporaux et
occipitaux du cortex de patients atteints d’AD[98].
D’autres études du protéome ont montré, chez des patients atteints d’AD, une
diminution globale de l’expression d’une protéine inhibitrice de la liaison au diazepam (DBI)
qui permet de réguler négativement la transmission GABAergique, alors que cette protéine est
régulée positivement dans le liquide cérébrospinal des mêmes patients [99].
Ces études sont désormais facilitées par l’établissement de cartes 2DE des protéines du
cerveau humain (180 protéines ont été caractérisées) [100].
De plus, puisqu’il est désormais connu que durant l’apoptose, la mitochondrie délivre
diverses protéines pro-apoptotiques comme le cytochrome c et des facteurs d’induction de
l’apoptose, son dysfonctionnement pourrait avoir un rôle critique dans le développement de
maladies neurodégénératives comme AD, Parkinson, ou la chorée de Huntington. Une carte
du protéome de la mitochondrie est donc en cours d’élaboration [101].

Pathologies cardiaques

Les maladies cardiaques sont souvent multifactorielles, ainsi la capacité d’obtenir une
vue globale des changements d’expression dans les cellules du myocarde pour les cas

- 21 -
d’hypertension, d’ischémie, d’arrêt cardiaque ou de la cardiomyopathie dilatée (DCM) permet
une meilleure compréhension des mécanismes causant ces maladies. La réalisation de banque
de données de gel 2D des protéines cardiaques de l’homme et d’espèces modèles comme le
chien et le rat permet aujourd’hui des recherches in vivo sur ces espèces modèles et de les
transposer à l’homme par la connaissance des protéines homologues. En analysant les gels 2D
de chiens chez lesquels une DCM a été provoquée, trente et une protéines voient leurs taux
d’expression modifié parmi lesquelles de nombreuses sont impliquées soit dans la production
d’énergie par les mitochondries, soit dans le système de contraction ou dans l’apport
d’oxygène dans les cellules du myocarde [102].
La comparaison des gels 2D de cellules du myocarde saines et hypertrophiées (état des
cellules dans le cas d’hypertension, d’infarctus ou de DCM) in vitro, a permis d’identifier
onze protéines changeant de taux d’expression dont cinq isoformes de la chaîne légère de
l’actine démontrant l’implication du système de contraction dans ces maladies [103].

Maladies infectieuses

Actuellement de nouveaux agents infectieux tels que le HIV, Ebola, Borrelia

burgdorferi apparaissent et s’ajoutent à d’anciens pathogènes que l’on croyait contrôler
comme Mycobacterium tuberculosis.
L’établissement du profil protéique de ces agents infectieux est donc essentiel au
développement de vaccins, de traitements et de méthodes de diagnostique.
Ainsi, la comparaison entre le profil protéique des souches de
Streptococcus pneumoniae résistantes à l’érythromycine et le profil de la souche sensible, a
démontré qu’un des deux phénotypes de résistance présente une surexpression de GAPDH
(glycéraldéhyde-3-Phosphate déshydrogénase) ainsi que des modifications post-
traductionnelles sur cette même protéine [104]. Le rôle possible de la GAPDH sur la
résistance à l’érythromycine doit donc être considéré.
De même, l’étude des profils protéiques de Mycobacterium tuberculosis, à l’aide de
gels 2DE et d’analyses de spectrométrie de masse, a permis la découverte de nouveaux
marqueurs de la maladie, dont un marqueur permettant de déceler avec beaucoup plus de
sensibilité et de spécificité, les individus positifs pour le VIH et atteints de tuberculose [105].

Cancers (vésicule biliaire, sein, rein…)

L’apport de la protéomique dans la recherche sur les différents cancers existants est
crucial. Tout d’abord, l’identification et la détermination des fonctions des protéines permet
une meilleure compréhension des évènements cellulaires, ce qui procure de nouvelles pistes
de recherche dans les mécanismes de cancérisation. De plus, la comparaison des profils
protéiques sur gel 2D de personnes atteintes de cancer et de personnes saines, suivi d’une
étude en spectrométrie de masse pour identifier les protéines, fournit un outil pour la
découverte de marqueurs pour chaque type de cancers comme dans le cas de la fig 1 pour le
cancer du colon. Ces nouveaux marqueurs peuvent être essentiels pour établir des
diagnostiques plus précoces et plus précis, mais peuvent également devenir de nouvelles
cibles thérapeutiques et permettre ainsi d’entrevoir de nouvelles drogues anticancérigènes.
L’établissement d’une banque de données de gel 2D des protéines urinaires [106] et
des deux types de cancer de la vésicule biliaire [107] a permis la découverte de marqueurs de
ces cancers dont un est externalisé dans les urines, ce qui fournirait un outil de diagnostique
simple [108].
De la même façon des études de profils protéiques ont été réalisées sur le cancer du
sein qui montrent la diminution d’expression de différents membres de la famille des

- 22 -
cytokératines et de certaines isoformes de la tropomyosine associées à la progression du
cancer[109]. De plus, ils ont observé l’augmentation d’expression des antigènes nucléaires de
prolifération cellulaire et de protéines du stress. Une autre étude récente portant sur les
différences de modifications post-traductionnelles dans le cancer du sein, en particulier sur les
différences de glycosylation des protéines [110], a démontré l’augmentation du taux de
glycosylation de certaines protéines comme HPA-gly1 dans les cellules cancéreuses.
En comparant les profils protéiques sur gel 2D de sujets sains et malades, de
nombreux marqueurs sont trouvés pour d’autres cancers comme celui de la prostate où, en
plus de l’augmentation d’expression de la tropomyosine retrouvée dans les cas de cancer du
sein, il a été trouvé une protéine de 40kDa, la phosphatase acide prostatique, dont le taux
d’expression diminue dans les cellules malignes [111].
Ainsi, l’identification de marqueurs par des analyses similaires pour de nombreux
cancers montre parfois des similarités entre certains cancers comme dans le cas de la
tropomyosine ce qui permettra éventuellement d’identifier des cibles potentielles pour de
nouveaux traitements. Les études actuelles sont pour l’instant focalisées dans la recherche de
marqueurs afin d’améliorer les diagnostiques et de classer les tumeurs pour mieux adapter les
traitements.

La protéomique permet donc un gain de temps considérable, en favorisant la

découverte de marqueur de maladies mais aussi en facilitant les tests de nouveaux agents
thérapeutiques, en particulier dans les phases d’essais cliniques. Ceci est facilité par
l’apparition des biocapteurs qui du fait de leur forte sensibilité va permettre dans les années à
venir l’ouverture vers des techniques de diagnostiques automatisées.

6 Conclusion
L’aire de la biologie actuelle traverse une phase de transition, la génomique laissant
place de plus en plus à la protéomique. La compréhension du fonctionnement cellulaire
nécessite une vue d’ensemble des caractéristiques structurales et fonctionnelles des protéines.
La protéomique met en jeux de nombreuses expériences, d’identifications, de caractérisations,
de quantifications, de mapping protéiques. Les avancées scientifiques proviennent d’une
symbiose des techniques physico-chimique telle que la spéctrométrie de masse, de techniques
biochimiques comme la chromatographie (souvent couplées aux MS) ou encore des
techniques électrophorétiques comme l’IEF.
Parmi ces techniques analytiques, la spectrométrie de masse représente la technique de pointe,
elle assure de meilleures résolutions et une meilleure sensibilité.
La protéomique quantitative, elle, utilise préférentiellement les techniques de coloration ou de
marquage ( immunologiques IDAT ou radioactifs ICAT) sur gel.
Les techniques chromatographiques telle la chromatographie liquide sont aménées à jouer un
rôle très important, la qualité de la séparation/purification protéique est une étape limitante, en
particuliers dans les mélanges complexes, mais ses dévellopements sont encore très
balbutiant.
Les applications qui découlent de la protéomique en recherche fondamentale et en
développement industriels augmentent considérablement les innovations conceptuelles et
matérielles en biotechnologie. Il est actuellement en étude des procédés et des outils de
dépistage et de diagnostiques en recherche clinique, facilitant les réduction de coût tout en
augmentant la précision et la sensibilité des détections de pathologies.

- 23 -
 La protéomique est actuellement une discipline en pleine expension, cependant de
rares équipes ont commencé à pousser encore plus la recherche pour dépasser l’intérêt non
plus pour les protéines mais sur l’effet de ces protéines sur les produits métabolisme cellulaire
[112,113]. Par analogie, ce programme d’étude a été appelé Métabolome. Il étudie les
phénomènes de reconnaissance moléculaire et l’implication des messagers secondaires
modulant les différentes voies et flux métaboliques [114,115].
Les industriels travaillent sur des outils d’analyse de plus en plus automatisables pour
que les études de protéomique, qui aujourd’hui motive de nombreuses équipes de recherches,
puisse utiliser des techniques d’analyses qui s’améliorent constamment en se miniaturisant et
offrir du haut débit d’analyse. La biologie doit miser aussi sur la bio-informatique pour créer
des bases de données (Swiss-Prot ou trEMBL)et logiciels d’analyses de séquences soit
protéiques soit génomiques(Sequest, Mascot, Peptide Search, Prowl, Protein Prospector, MS-
FIT, Sequence retrieval system, Genbank). Cet outil, à l’interface des différentes disciplines
de biotechnologie, apparaît comme un élément moteur de la recherche scientifique. Les
données provenant de ces études doivent pouvoir être stockées, échangées pour les transferts
de connaissances et des technologies.

- 24 -
7 Figures et légendes

(a)

(b)

Figure 1 : Comparaison des profils 2-DE obtenus avec un extrait protéique de levure,
deux IPG présentant des intervalles de pH différents.
Widgruber, et Al., Electrophoresis 2000, 21, 2610-2616.

Figure 2 : Screening sur gel IPG à large gamme de PH d’échantillon protéique.

- 25 -
Cordwell et al. Electrophoresis 2000,21,1094-1103

Figure 3 : Illustration schématique d’une analyse standard du protéome par gel

d’électrophorèse 2D et Spectrométrie de Masse.

- 26 -
 ESI
Méthode de choix pour les expériences de haute sensibilité
MS et MS/MS

•Chromato d’exclusion Sensible au flux du solvant et à sa composition

•Chromato d’échange d’ion
⇒élimination sels et
concentration de l’échantillon Nanospray
Grande sensibilité
•Chromato phase inverse (petite vitesse flux)
•Chromato capillaire Trappe à ion Spectre d’ion supérieur

Traitement informatique
COUPLAGE S A D Détermination des
séquences
Technique du Triple quadripole
« peak parking »
•Analyte en solution
Augmentation de •Spray de gouttelette en Combinaison
la sensibilité phase gazeuse triple quadripole/TOF

Série d’ions multichargé Exactide: 5ppm

pour chaque peptide Sensibilité: fmol

Figure 4a : Représentation générale de l’utilisation de l’ESI.

MALDI Technique tolérante à la présence de petites molécules,

de sels et de détergent

Technique de préconcentration Etape critique pour l’analyse de petit

et d’enrichissement volume et donc de petite quantité

Préconcentration analyte et
élimination mol interférantes Info sur séquences obtenue grâce :
• PSD: Post Source Decay
Chromato d’intéraction hydrophobe • CID: Collision Induce Dissociation
et hydroxyapatite

Traitement informatique
GEL 2D S A D Détermination protéines
en fonction des peptides

TOF
•Sensibilité: fmolÆamol
•Matrice = mb polymérique Réflectron •Résolution masse > 10000Da
•Laser UV ou IR •Exactitude < 30ppm
•Etat de charge faible ⇒ spectre
Augmentation résolution
de complexité réduite

Figure 4b : Représentation générale de l’utilisation du MALDI.

- 27 -
Figure5 : Stratégie ICAT de quantification de l’expression protéique
Gygi, Rist Nat. Biotechnol., Vol.17, october 1999, 994-999.
Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11:396-401.

- 28 -
Figure 6 : . Partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de
souches de Staphylococcus aureus résistante et sensible à un antibiotique, la
méthicilline.
A. Görg , IPG-Dalt of very alkaline proteins, Methods of Molecular Biology.
1999;112 :197-209. Review.

Figure 7 : (A) Spectre MALDI-MS d’une fraction HPLC radioactive contenant le

fragment tryptique autophosphorylé in vitro PI4K92h. (B) Spectre MALDI-PSD
d’un fragment issu du phosphopeptide.
A. Sickmann et Al, Identification of post-translationally modified proteins in
proteome studies, Electrophoresis 2001, 22, 1669-1676.

- 29 -
Figure 8 : Analyse en électrophorèse 2-D PAGE du plasma dans l’intervalle de pH
4,5-5,5.
P.B. Mills et Al, Analysis by matrix assisted laser desorption/ionisation-time of
flight mass spectrometry of the post-translational modifications of α1-antitrypsin
isoforms separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,
Proteomics 2001, 1, 778-786.

Figure 9:Exemple représentatif de l’approche protéomique pour l’étude du cancer du

colon
G. Chambers, L. Lawrie, P. Cash, G. I. Murray, Proteomics: a new approach to the
study of disease, Journal of Pathology 2000, 192, 280-288

- 30 -
Légendes

Figure 1: Comparaison des profils 2-DE obtenus avec un extrait protéique de levure, deux
IPG présentant des intervalles de pH différents ayant été utilisés :
(a)IPG 3-10 et (b) IPG 6-9 (18 cm) .
Un total de 596 spots est détecté avec l’IPG 6-9, alors que dans la région de pH 6-9 de l’IPG
3-10, seulement 294 spots sont visualisés.
Widgruber et al., Toward higher resolution : Two dimensional electrophoresis of
Saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow immobilized pH gradients,
Electrophoresis 2000, 21, 2610-2616.

Figure 2: Les cellules et tissus sont initialement pré-fractionner selon le compartiment

cellulaire ou la solubilité relative des protéines .Les échantillons sont préalablement screenés
sur gel IPG à large gamme de PH pour déterminer la complexité du protéome puis , si
nécessaire, analyser sur des gels plus résolutifs pour visualiser les protéines exprimées à plus
bas niveau .
Cordwell et al. Electrophoresis 2000,21,1094-1103

Figure 3 : Illustration schématique d’une analyse standard du protéome par gel

d’électrophorèse 2D et Spectrométrie de Masse.
Les protéines sont séparées par gel 2D. Les spots d’intérêt sont excisés, digérés dans le gel
avec la trypsine, et les peptides en résultant sont séparés par HPLC. Un peptide élué est ionisé
par ESI, puis pénètre dans le spectromètre de masse et est fragmenté pour récupérer les
informations sur la séquence (tandem MS). Le spectre du peptide ionisé sélectionné est
comparé avec le spectre de masse théorique généré par ordinateur à partir de banques de
séquences pour identifier la protéine. Une identification sans ambiguïté de la protéine est
effectuée lorsque plusieurs peptides de la même protéine sont retrouvés.
m/z : rapport masse sur charge

Figure 5 : stratégie ICAT de quantification de l’expression protéique

(a): structure du réactif ICAT composé d’un tag biotine, d’un linker pouvant incorporer
des isotopes stables, et d’un groupe réactif spécifique des groupements thiols(cystéines).
(b): schématisation de la stratégie ICAT ; La méthode présente l’analyse d’une seule
protéine mais est applicable au lysat cellulaire total. Les protéines des deux cellules à deux
stades différents sont dénaturées, réduites, et marquées sur les résidus cystéine avec l’ICAT
lourd ou léger respectivement.
Les préparation sont rassemblées et digérées . Les peptides portants l’ICAT sont isolés grâce
au groupement biotine par chromatographie d’affinité et analysés par HPLC couplé à un
spectromètre de masse (MS-MS).
Le ratio de l’intensité pour une paire de peptides marqués avec l’ICAT représente l’abondance
relative de ces protéines parentes dans les deux conditions de culture .
De plus, le spectre de masse MS-MS permet d’identifier la séquence du peptide étudié et donc
la protéine.
Cette technique permet donc de quantifier et d’identifier toutes les protéines d’une
préparation, et est en théorie applicable aussi bien à une partie qu’au protéome complet.
Gygi, Rist Nat. Biotechnol., Vol.17, october 1999, 994-999.
Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11:396-401.

Figure 6 : Partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de souches
de Staphylococcus aureus résistante et sensible à un antibiotique, la méthicilline. A, B,

- 31 -
protéines exprimées spécifiquement dans une des 2 souches ; C, protéines sur ou sous
exprimées selon la souche ; *, protéines ayant un profil de migration différent entre les deux
souches.
A. Görg , IPG-Dalt of very alkaline proteins, Methods of Molecular Biology.
1999;112 :197-209. Review.

Figure 7 : (A) Spectre MALDI-MS d’une fraction HPLC radioactive contenant le fragment
tryptique autophosphorylé in vitro PI4K92h. L’ion de m/z 1848,8 Da est sélectionné pour une
analyse en MALDI-PSD (voir B). Les pics supplémentaires obtenus en mode réflecteur
correspondent aux fragments caractéristiques contenant une phosphothréonine issu de la perte
de H2PO4 et HPO3. (B) Spectre MALDI-PSD d’un fragment issu du phosphopeptide. La
série d’ions b (fragmentation N-terminale) et d’ions y (fragmentation C-terminale) sont
visibles et permettent d’identifier la phosphorylation de la thréonine 423. La génération des
fragments caractéristiques issus de la perte de H2PO4 et HPO3 au cours de l’analyse est
détecté par un décalage de –80 Da et –98 Da des ions b et y.
A. Sickmann et Al, Identification of post-translationally modified proteins in proteome
studies, Electrophoresis 2001, 22, 1669-1676.

Figure 8 : Analyse en électrophorèse 2-D PAGE du plasma dans l’intervalle de pH 4,5-5,5. La

série d’isoformes de la protéine α1-antitrypsine sont indiquées par les lettres M1 à M8.
P.B. Mills et Al, Analysis by matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight
mass spectrometry of the post-translational modifications of α1-antitrypsin isoforms separated
by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, Proteomics 2001, 1, 778-786.

8 Références bibliographiques
1/ Blattner FR,Plunkett G, Bloch CA, Perna et Al., Science 1997, 277, 1453-1471.
2/ Goffeau A, Barrel BG, Bussey H, Davis RW et Al., Science 1996,274, 563-567.
3/ The Caenorhabditis elegans sequencing consortium , Science 1998,282,2012-2018.
4/ Meinke DW, Cherry JM, Dean C, Rounsley SD, Koornneef M, Arabidopsis thaliana, a novel model plant for
genome analysis, Science,1998,282,662-682.
5/ O’Farrel P.H, High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J.Biol.Chem 250 :4007-4021 1975.
6/ S.P. Gygi, Y. Rochon, B.R. Franza, R. Aebersold., Correlation between Protein and mRNA Abundance in Yeast,
Mol Cell Biol, Mar. 1999,19 (3), 1720-1730.
7/ Paul A.Haynes, John R. Yates, Proteome profiling – pitfalls and progress, Yeast 2000;17;81-87.
8/ Görg, A., A laboratory manual, Technical University of Munich, http://www.wzw.tu -
muenchen.de/blm/deg/manual/manualwork2html02test.html
9/ Hanash, S. M., Biomedical applications of two-dimensional electrophoresis using immobilized pH gradients,
Current status, Electrophoresis 2000, 21, 1202-1209.
10/ Norbeck, J. et Blomberg, A., Two dimensional electrophoresis separation of yeast proteins using non linear
wide range (pH 3-10) immobilized pH gradient in the first dimension; reproducibility and evidence for isoelectric focusing of
alkaline (pI > 7) proteins, Yeast 1997, 13, 1519-1534.
11/ Görg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Csordas, A., Diaz, J. J., Madjar, J. J., Very alkaline immobilized pH
gradients for two-dimensional electrophoresis of ribosomal and nuclear proteins, Electrophoresis 1997, 18, 328-337.
12/ Widgruber, R., Harder, A., Obermaier, C., Boguth, G., Weiss, W., Fey, F. J., Larsen, P. M., Görg, A., Toward
higher resolution : Two dimensional electrophoresis of Saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow
immobilized pH gradients, Electrophoresis 2000, 21, 2610-2616.
13/ Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T., Membrane proteins and proteomics, Un amour impossible?,
Electrophoresis 2000, 21, 1054-1070.
14/ Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J., Improvement of the solubilisation of proteins in two-
dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis 1997, 18, 307-316.
15/ Herbert, B., Advances in protein solubilisation for two dimensional electrophoresis, Electrophoresis 1999, 20,
660-663.
16/ Sjouke Hoving,Hans Voshol,Jan Van Oostrum, Towards high performance two-dimensional gel electrophoresis
using ultrazoom gels.
17/ Mark P.Molloy,Ben R. Herbert,Keith L.Williams,Andrew A.Gooley, Extraction of E.Coli proteins with organic
solvents prior to two dimensional electrophoresis, Electrophoresis:1999,20,701-704.

- 32 -
 18/ Véronique Santoni,Thierry Rabilloud,Patrick Doumas,David Rouquié, Towards the recovery of hydrophobic
proteins on two-dimensional electrophoresis gels, Electrophoresis:1999,20,705-711.
19/ Herbert, B., Righetti, P. G.: A turning point in proteome analysis, Sample prefractionation via
multicompartment electrolysers with isoelectric membranes, Electrophoresis 2000, 21, 3639-3648.
20/ Stuart J.Corwell,Amanda S.Nouwens,Nicole M.Verrils,David J.Basseal,Bradley J.Walsh, Subproteomics based
upon protein cellular location and relative solubilities in conjunction with composite two dimensional electrophoresis gels,
Electrophoresis 2000,21,1094-1103.
21/ Gygi SP, Aebersold R, Mass spectrometry and proteomics, Curr Opin Chem Biol 2000, 4:489-494
22/ John R. Yates, Mass spectrometry from genomics to proteomics, TIG January 2000, volume 16, N°1
23/ Hans-Werner Lahn, Hanno Langen; Mass spectrometry: a tool for the identification of proteins separated by
gels; Electreophoresis 2000, 21, 2105-2114.
24/ Jörg T. Regula,Towards a two-dimensional proteome map of Mycoplasma pneumonia, Electrophoresis 2000,
21, 3765-3780.
25/ Christian G. Huber, A. Premstaller, Evaluation of volatile eluents and electrolytes for HPLC-ESI-MS; J.
Chromatography A, 849 (1999) 161-173.
26/ Huiping Chen et al., Biopolymer sequencing using a triple quadrupole masss pectrometer in the ESI Nozzle-
skimmer/precussor ion MS/MS mode, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001, 12, 846-852.
27/ Dan Back Kristensen, Mass spectrometric approaches for the characterisation of proteins on a hybrid Q-
TOF/MS, Electrophoresis 2000, 21, 430-439.
28/ Fountoulatis M.;Enrichement of low-copy-nomber gene products by hydrophobic interaction chromatography;
J. Chromatogr. A; 833 (1999) 157-168.
29/ Karlsson K.; Enrichement of human brain proteins by heparin chromatography; Electrophoresis 1999, 20, 2970-
2976.
30/ Fountoulakis M.;Enrichement of low abundance proteins of Escherichia coli by hydroxypatite chromatography;
Electrophoresis 1999, 20, 2181-2195.
31/ Posewitz M.C., Tempst P., Immobilized Gallium (III) affinity chromatography of phosphopeptides; Anal.
Chem. 1999, 71, 2883-2892.
32/ Stone K.L., DeAngelis R., LoPresti M., Jones J., Papov V.V., Williams K.R., Use of LC-ESI-MS/MS for
routine amplification; Electrophoresis, vol 19, May 1998, 1046-1052.
33/ Whitelegge J.P., Le Coutre J., Lee J.C., Engel C.K., Privé G.G., Faull K.F., Kaback H.R., Towards the bilayer
proteome, ESI-MS, intact transmembrane proteins; Proc. Nat. Acad. Sci USA; Sept 1999, vol 96, 10695-10698.
34/ Opiteck G.J., Lewis K.C., Jorgenson J.W., Anderegg R.J., Comprehensive on-line LC-LC-MS of proteins;
Anal. Chem. 1997, 69, 1518-1524.
35/ Opiteck G.J., Jorgenson J.W., Two dimensional SEC/RPLC coupled to MS for the analysis of peptides; Anal.
Chem. 1997, 69, 2283-2291.
36/ John R. Yates, mass spectrometry and the age of the proteome, J of mass spectrometry, vol 33, 1-19 (1998).
37/ Wilm M, Mann M, Analytical properties of the nanoelectrospray ion source, Anal Chem 1996, 68:1-8.
38/ Tong W, Link A, Eng JK, Yates JR III, Identification of proteins in complexes by solid-phase
microextraction/multistep elution/capillary electrophoresis/tandem mass spectrometry, Anal Chem 1999, 71: 2270-2278.
39/ Marshall AG, Guan SH, Advantages of high magnetic field for Fourier transform ion cyclotron resonance mass
spectrometry, Rapid Commun Mass Spectrom 1996, 10:1819-1823.
40/ Figeys D, Pinto D, Proteomics on a chip: promising developments, Electrophoresis 2001, 22, 208-216.
41/ Xu N, Lin Y, Hofstadler SA, Matson D, Call CJ, Smith RD, A Microfabricated Dialysis Device for Sample
Cleanup in ESI MS, Anal Chem 1998, 70, 3553-3556.
42/ Wen J, Lin Y, Xiang F, Matson DW, Udseth HR, Smith RD, Microfabricated isoelectric focusing device for
direct electrospray ionisation-mass spectrometry, Electrophoresis 2000, 21, 191-197.
43/ Li J, Kelly JF, Chernushevich I, Harrison DJ, Thibault P, Separation and Identification of Peptides from Gel-
Isolated Membrane Proteins Using a Microfabricated Device for Combined Capillary Electrophoresis/Nanoelectrospray Mass
Spectrometry, Anal Chem 2000, 72, 599-609.
44/ Dunlop KY, Li L, Automated mass analysis of low-molecular-mass bacterial protéome by liquid
chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 925 (2001) 123-132.45/ Matthias Mann
Quantitative proteomics?, , Nat. Biotechnol.17, 954-955
46/ Wayne F. Patton, A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-
dimentional gel electrophoresis and proteomics, Electophoresis 2000, 21, 1123-1144.
47/ Piers Mahon, Paul Dupree,Quantitative and reproducible two-dimensional gel analysis using Phoretix 2D Full,
Electrophoresis 2001, 22, 2075-2085.
48/ L.G. Mendoza, P. McQuary, A. Mongan, R. Gangadharan, S. Brignac and M. Eggers, High-Throughput
Microarray-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),BioTechniques 27, 778-788 (october 1999).
49/ Hong-Tao Zhang, Janet E. Kacharmina, Kevin Miyashiro, Mark I. Greene, and James Eberwine, Protein
quantification from complexe mixture using a proteomics methodology with single-cell resolution, PNAS May 8, 2001, 98
(10), 5497-5502.
50/ Y. Oda, K. Huang, F.R. Cross, D. Cowburn and B.T. Chait. Proc. Accurate quantification of protein expression
and site specific phosphorylation,Natl. Acad. Sci. USA Vol 96, pp. 6591-6596, June 1999 Chemistry.
51/ Steven P. Gygi, Beate Rist, Scott A. Gerber, Frantisek Turecek, Michael H. Gelb, and Ruedi Aebersold,
Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags, Nat. Biotechnol., Vol.17, october 1999,
994-999.

- 33 -
 52/ Steven P. Gygi, Beate Rist and Ruedi Aebersold, Measuring gene expression by quantitative proteome analysis,
Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11:396-401.
53/ Xudong Yao, Amy Freas, Javier Ramirez, Plamen A. Demirev, and Catherine Fenselau,Proteolytique 18O
labeling for comparative proteomics :Model studies with two serotypes of adenovirus, Anal. Chem. 2001, 73, 2836-2842.
54/ A. Görg , IPG-Dalt of very alkaline proteins, Methods of Molecular Biology. 1999;112 :197-209. Review.
55/ M. Quadroni; P. James; P. Dainese Hatt; M.A. Kertesz, Proteome mapping, mass spectrometric sequencing and
reverse transcription-PCR for characterization of the sulfate starvation-induced response in Pseudomonas aeruginosa PAO1,
European Journal of Biochemistry. Dec., 1999; 266 (3): 986-996.
56/ M. Munchbech; P. Dainese; W. Staudenmann; F. Narberhaus; P. James, Proteome analysis of heat shock
protein expression in Bradyrhyzobium japonicum, European Journal of Biochemistry. Aug., 1999; 264 (1): 39-48.
57/ S. Natera; N. Guerreiro; M.A Djordjevic, Proteome analysis of differentially displayed proteins as a tool for the
investigation of symbiosis, Molecular Plant Microbe Interaction. Sept., 2000; 13 (9):995-1009.
58/ K. Vido; D. Spector; G. Lagniel; S. Lopez; M.B. Toledano; J. Labarre, A proteome analysis of the cadmium
response in Saccharomyces cerevisiae, Journal of Biological Chemistry. March. 16, 2001; 276 (11): 8469-8474.
59/ L. Aicher; D. Wahl; A. Arce; O. Grenet; S. Steiner, New insights into cyclosporine A nephrotoxicité by
protéome analysis, Electrophoresis. Aug., 1998; 19 (11): 1998-2003.
60/ Jungblut, P. R., Schaible, U. E., Mollenkopf, H.-J., Zimny- Arndt, U., Raupach, B., Mattow, J., Halada, P.,
Lamer, S., Hagens, K., Kaufmann, S. H. E., Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and
Mycobacterium bovis BCG strains: towards functional genomics of microbial pathogens. Mol. Microbiol. 1999, 33 (6),1103–
1117.
61/ P.R. Jungblut; D. Bumann; G. Haas; U. Zimmy Arndt; P. Holland; S. Lamer; F. Siejak; A. Aebischer; T.F.
Meyer, Comparative proteome analysis of Helicobacter pylori.Molecular Microbiology. May, 2000; 36 (3): 710-725.
62/ S. Komatsu; A. Muhammad; R. Rakwal, Separation and caracterization of proteins from green and etioled shoot
of rice (Oryza sativa L.): Towards a rice proteome, Electrophoresis. March, 1999; 20 (3): 630-636.
63/ N.N. Nalivaeva, A.J. Turner, Post-translational modifications of proteins : Acetylcholineesterase as a model
system, Proteomics 2001, 1, 735-747.
64/ A. Sickmann, K. Marcus, H. Schäfer, E. Butt-Dörje, S. Lher, A. Herkner, S. Suer, I. Bahr, H.E. Meyer,
Identification of post-translationally modified proteins in proteome studies, Electrophoresis 2001, 22, 1669-1676.
65/ A. Sickmann, H.E. Meyer, Phosphoamino acid analysis, Proteomics 2001, 1, 200-206.
66/ M.C. Posewitz, P. Tempst, Immobilized Gallium(III) Affinity Chromatography of Phosphopeptides, Anal.
Chem. 1999, 71, 2883-2892.
67/ P.B. Mills, K. Mills, A.W. Johnson, P.T. Clayton, B.G. Winchester, Analysis by matrix assisted laser
desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry of the post-translational modifications of α1-antitrypsin isoforms
separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, Proteomics 2001, 1, 778-786.
68/ Biffo S., Marchisio P.C. The identification f signaling molecules by the yeast two-hybrid system. Methods Mol
Biol. 1999;96:211-20.
69/ Pasquali C.,Vilbois F., Curchod M.L., van Huijsduijnen R.H., Arigoni F. Mapping and identification of protein-
protein interactions by two-dimensional far-Western immunoblotting. Electrophoresis. 2000, 21, 3357-3368.
70/ Flint A.J., Tiganis T., Bradford D., Tonks N.K. Development of ‘‘substrate-trapping’’ mutants to identify
physiological substrates of protein tyrosine phosphatases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997,94,1680-1685.
71/ Langen H, Takacs B, Evers S, Berndt P, Lahm HW, Wipf B, Gray C, Fountoulakis M. : Two-dimensional map
of the proteome of Haemophilus influenzae, Electrophoresis. 2000 Jan;21(2):411-29.
72/ Langen H, Takacs B, Evers S, Berndt P, Lahm HW, Wipf B, Gray C, Fountoulakis M. : Two-dimensional map
of the proteome of Haemophilus influenzae, Electrophoresis. 2000 Jan;21(2):411-29.
73/ Perrot M, Sagliocco F, Mini T, Monribot C, Schneider U, Schevchenko A, Mann M, Jenö P, Boucherie H. :
Two-dimensionalgel protein database of Saccharomyces cerevisiae, Electrophoresis. 1999; 20 : 2280-2298.
74/ Cordwell, S. J., Nouwens, A. S., Verrills, N. M., Basseal, D. J., Walsh, B. J., Subproteomics based upon protein
cellular location and relative solubilities in conjunction with composite two-dimensional electrophoresis gels, Electrophoresis
2000, 21, 1094–1103.
75/ Futcher B, Latter G, Monardo P, McLaughlin C, Garrels J: A sampling of the yeast proteome. Mol Cell Biol
1999, 19:7357-7368.
76/ Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. : Membrane proteins and proteomics: Un amour impossible?,
Electrophoresis 2000,21, 1054–1070.
77/ Molloy,M. P., Herbert, B. R., Slade, M. B., Rabilloud, T., Nouwens, A. S., Williams, K. L., Gooley, A. A. :
Proteomic analysis of the Escherichia coli outer membrane Eur. J. Biochem., 2000, 267, 2871–2881.
78/ Nouwens, A. S., Cordwell, S. J., Larsen, M. R., Molloy, M. P., Gillings, M., Willcox, M. D. P., Walsh, B. J., :
Complementing genomics with proteomics: The membrane subproteome of Pseudomonas aeruginosa PAO1
Electrophoresis, 2000, 21, 3797–3809.
79/ Nilsson, I., Utt, M., Nilsson, H. O., Ljungh, A., Wadstrom, T. : Two-dimensional electrophoretic and
immunoblot analysis of cell surface proteins of spiral-shaped and coccoid forms of Helicobacter pylor, Electrophoresis 2000,
21, 2670–2677.
80/ Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G., Effects of Environmental pH on Membrane Proteins in Borrelia
burgdorferi Infect. Immun., 1999, 67, 3181–3187.
81/ Dongbin Lim, Peter Hains, Brad Walsh, Peter Bergquist, Helena Nevalainen
Proteins associated with the cell envelope of Trichoderma reesei: A proteomic approach Proteomics 2001, 1, 899–910.

- 34 -
 82/ Rabilloud T, Kieffer S, Procaccio V, Louwagie M, Courchesne PL, Patterson SD, Martinez P, Garin J, Lunardi
J, Two-dimensional electrophoresis of human placental mitochondria and protein identification by mass spectrometry: toward
a human mitochondrial proteome, Electrophoresis. 1998 May;19(6):1006-14.
83/ Taylor RS, Fialka I, Jones SM, Huber LA, Howell KE, Two-dimensional mapping of the endogenous proteins
of the rat hepatocyte Golgi complex cleared of proteins in transit, Electrophoresis. 1997 Dec;18(14):2601-12.
84/ Eva-Christina Müller, Margitta Schümann, Anke Rickers, Kurt Bommert, Brigitte Wittmann-Liebold, Albrecht
Otto Study of Burkitt lymphoma cell line proteins by high resolution two-dimensional gel electrophoresis and
nanoelectrospray mass spectrometry Electrophoresis 1999, 20, 320-330.
85/ Chataway TK, Whittle AM, Lewis MD, Bindloss CA, Davey RC, Moritz RL, Simpson RJ, Hopwood JJ,
Meikle PJ, Two-dimensional mapping and microsequencing of lysosomal proteins from human placenta, Placenta. 1998
Nov;19(8):643-54.
86/ Gerner C, Holzmann K, Grimm R, Sauermann G., Similarity between nuclear matrix proteins of various cells
revealed by an improved isolation method., J Cell Biochem. 1998 Dec 1;71(3):363-74.
87/ Neubauer G, King A, Rappsilber J, Calvio C, Watson M, Ajuh P, Sleeman J, Lamond A, Mann M., Mass
spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex., Nat Genet.
1998 Sep;20(1):46-50.
88/ Rout MP, Aitchison JD, Suprapto A, Hjertaas K, Zhao Y, Chait BT., The yeast nuclear pore complex:
composition, architecture, and transport mechanism, J Cell Biol. 2000 Feb 21;148(4):635-51
89/ Hoogland C., Sanchez J.C., Tonella L., Binz P.A., Bairoch A., Hochstrasser D.F. and Appel R.D. The 1999
SWISS-2DPAGE database update. Nucleic Acids Research. 2000, 28 (1), 286-288.
90/ Hodges P.E., McKee A.H.Z., Davis B.P., Payne W.E., Garrels J.I. The Yeast Proteome Database (YPD) : a
model for the organization and presentation of genome-wide functional data. Nucleic Acids Research. 1999, 27, (1), 69-73.
91/ Hodges P.E., Payne W.E., Garrels J.I. The Yeast Protein Database (YPD) : a curated protéome database for
Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 1998, 26 (1), 68-72.
92/ Costanzo M.C., Hogan J.D., Cusick M.E., Davis B.P., Fancher A.M., Hodges P.E., Kondu P., Lengieza C.,
Lew-Smith J.E., Lingner C., Roberg-Perez K.J., Tillberg M., Brooks J.E., Garrels J.I. The Yeast Proteome Database (YPD)
and Caenorhabditis elegans Proteome database (WormPD) : comprehensive resources for the organization and comparison
of model organism protein information. Nucleic Acids Research; 2000, 28 (1) 73-76.
93/ S. Steiner, L. Aicher, J. Raymackers, L. Meheus, R. Esquer-Blasco, N. Leigh Anderson, A. Cordier,
Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein Calbindin-D 28kDa in rat kidney, Biochemical
Pharmacology 1996, 51, 253-258
94/ L. Aicher, D. Wahl, A. Arce, O. Grenet, S. Steiner, New insights into cyclosporine A nephrotoxicity by
proteome analysis, Electrophoresis 1998, 19, 1998-2003.
95/ I. Eberini, I. Miller, V. Zancan, C. Bolego, L. Puglisi, M. Gemeiner, E. Gianazza, Proteins of rat serum IV.
Time-course of acute-phase protein expression and its modulation by indomethacine, Electrophoresis 1999, 20, 846-853.
96/ M. Lück, W. Schröder, B.-R. Paulke, T. Blunk, R.H. Müller, Complement activation by model drug carriers for
intraveinous application : determination by two-dimensional electrophoresis, Biomaterials 1999, 20, 2063-2068.
97/ R. D. Unwin, M. A. Knowles, P. J. Selby, R. E. Banks, Urological malignancies and proteomic-genomic
interface, Electrophoresis 1999, 20, 3629-3637.
98/ S. Greber, G. Lubec, N. Cairns, M. Fountoulakis, Decreased level of synaptosomal associated protein 25 in the
brain of patients with Down Syndrome and Alzheimer’s disease, Electrophoresis 1999, 20, 928-934.
99/ P. F. Edgar, S. J. Schonberger, B. Dean, R.L. Faull, R. Kydd, G.J. Cooper, A comparative proteome analysis of
hyppocampal tissue from schizophrenic and Alzheimer’s disease individuals, Molecular Psychiatry 1999, 4 (2), 173-178.
100/ H. Langen, P. Berndt, D. Röder, N. Cairns, G. Lubec, M. Fountoulakis, Two-dimensional map of human brain
proteins, Electrophoresis 1999, 20, 907-916.
101/ B. J. Hanson, B. Schulenberg, W. F. Patton, R. A. Capaldi, A novel subfractionation approach for
mitochondrial proteins : A three-dimensional mitochondrial proteome map, Electrophoresis 2001, 22, 950-959.
102/ M. Y. Heinke, C. H. Wheeler, J. X. Yan, V. Amin, D. Chang, R. Einstein, M. J Dunn, C. G. dos Remedios,
Changes in myocardial protein expression in pacing-induced canine heart failure, Electrophoresis 1999, 20, 2086-2093.
103/ D. Arnott, K. L. O’Connell, K. L. King, J. T. Stults, An integrated approach to proteome analysis :
Identification of proteins associated with cardiac hypertrophy, Analytical Biochemistry 1998, 258, 1-18.
104/ P. Cash, E. Argo, L. Ford, L. Lawrie, H. McKenzie, A proteomic analysis of erythromycin resistance in
Streptococcus pneumoniae, Electrophoresis 1999, 20, 2259-2268.
105/ R. C. Hendrickson, J. F. Douglass, L. D. Reynolds, P. D. McNeill, D. Carter, S. G. Reed, R. L. Houghton,
Mass spectrometric identification of Mtb81, a novel serological marker for tuberculosis, Journal of Clinical Microbiology
2000, 2354-2361.
106/ T. Marshall, K. M. Williams, High resolution two-dimensional electrophoresis of human urinary proteins,
Analytica Chimica Acta 1998, 372, 147-160.
107/ J. E. Celis, M. Ostergaard, H. H. Rasmussen, P. Gromov, I. Gromova, H. Varmak, H. Palsdottir, N.
Magnusson, I. Andersen, B. Basse, J. B. Lauridsen, G. Ratz, H. Wolf, T. F. Orntoft, P. Celis, A. Celis, A comprehensive
protein resource for the study of bladder cancer, Electrophoresis 1999, 20, 300-309.
108/ J. E. Celis, H. Wolf, M. Ostergaard, Bladder squamous cell carcinoma biomarkers derived from proteomics,
Electrophoresis 2000, 21, 2115-2121.
109/ B. Franzen, S. Linder, A. A. Alaiya, Analysis of polypeptide expression in benign and malignant human breast
lesions : down regulation of cytokeratins, British Journal of Cancer 1996, 18, 2832-2841.
110/ M. V. Dwek, H. A. Ross, A. J. C. Leathem, Proteome and glycosylation mapping identifies post-translational
modifications associated with aggressive breast cancer, Proteomics 2001, 1, 756-762.

- 35 -
 111/ A. A. Alaiya, M. Oppermann, J. Langridge, U. Roblick, L. Egevad, S. Brändstetd, M. Hellström, S. Linder, T.
Bergman, H. Jörnvall, G. Auer, Identification of proteins in human prostate tumor material by two-dimensional gel
electrophoresis and mass spectrometry, Cellular and Molecular Life Sciences 2001, 58, 307-311.
112/ Beaudry et Al, :Metaboliteprofiling study of propanolol in rat using LC/MS/MS analysis, Biomed.
Chromatogr., 13,363-369.
113/ Duffield PH, Netting AG, Methods for the quantitation of abscisic acid and its precursors from plant tissue,
Anal. Biochem. 2001, 289, 251-259
114/ Katona et Al, Simultaneous determination of sugars, sugar alcohols, acids and amino acids in apricots by gas
chromatography-MS. J Chromatogr, 847,91-102.
115/ Kim, Park, Paik et al.,Gas chromatographic rofiling of urinary organic acids from uterine myoma patients and
cervical cancer patients,J Chromatogr, B, 712,11-22.

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