VIII / ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE
Le but de la plupart des séparations chromatographiques est de fournir une
analyse de l'échantillon. Celle-ci est dite qualitative si elle permet de déterminer
le nombre et la nature des composants de l'échantillon et quantitative si elle
permet de déterminer la quantité d'un ou plusieurs des composants présents.
1) Etalonnage externe Avec cette méthode, on analyse séparément une solution
standard et une solution contenant le composé i à ci connue On effectue un
calibrage afin de connaître le facteur de réponse du composé i en analysant une
solution à ci et mi sont connues.
On a mi = ci vinj = Fi Ai --------> Fi = vinj ci/Ai On peut alors déterminer la
concentration cech des solutions à analyser cech = Fi Aech/vinj - On remarque
que pour cette technique, les conditions chromatographiques doivent rester
extrêmement constantes lors des analyses puisque les deux solutions sont
analysées séparément - la concentration du composé i dans la solution standard
doit être du même ordre de grandeur que celle à déterminer afin de limiter les
erreurs possibles dues à une légère non -linéarité du détecteur. - Cette méthode
nécessite une bonne reproductibilité du volume d'injection et par conséquent elle
est plutôt employée avec un injecteur automatique d'échantillon - Lors d'une
analyse de plusieurs solutions d'un composé i à des concentrations différentes, la
solution standard doit être analysée en alternance avec les échantillons de façon
à contrôler la stabilité des conditions chromatographiques.
2) Etalonnage interne Cette méthode est basée sur la comparaison des aires des
pics correspondant aux produits à quantifier à l'aide d'un composé de référence
( l'étalon interne). Ce dernier est introduit à une concentration connue dans
l'échantillon et dans les solutions de calibrage. On effectue tout d'abord un
calibrage afin de connaître le facteur de réponse du constituant Fi. On prépare
les solutions de calibrage de la façon suivante : - Une masse mi à ci connue du
composer i à doser - Une masse me à ce connue de l'étalon interne En HPLC :
On injecte un volume de la solution de calibrage et on obtient un
chromatogramme contenant 2 pics de surface Ai et Ae. On a les relations
suivantes : mi = ci vinj = Fi Ai mi/me = ci/ce = Fi/e Ai/Ae me = ce vinj = Fe
Ae
on détermine ainsi Fi/e On peut alors procéder à l'analyse d'échantillons
préparé de la façon suivante : mech du composé i à cech inconnue me de l'étalon
à ce connu On a donc cech/ce=Fi/e Aech/Ae cech = Fi/e Aech/Ae ce Le calcul
aurait été le même si on avait raisonné sur les hauteurs des pics. On remarque
que la précision sur vinj n'est pas nécessaire puisqu'il n'apparaît pas dans le
calcul de cech Le choix de l'étalon interne dépend de plusieurs conditions : -
L'étalon interne doit être pur et ne doit pas être présent dans l'échantillon -
L'étalon ne doit pas réagir avec un constituant de la solution dans laquelle il est
introduit. Il ne doit pas changer les propriétés physiques de la solution. - Le pic
de l'étalon doit être bien résolu et son temps de rétention doit être proche du
constituant à analyser.
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VI. ANALYSE QUANTITATIVE
Principe : La surface d’un pic est proportionnelle à la quantité injectée de l’analyte
correspondant. On doit au préalable s’assurer que cette condition indispensable est bien
remplie.
Comme vu plus haut, le détecteur ne donne un réponse linéaire que pour une certaine gamme
de concentration, on doit donc impérativement se placer dans cette zone de réponse linéaire et
mettre au pont les dilutions nécessaires de l’échantillon et des étalons pour qu’il en soit ainsi.
Analyse quantitative : On a alors : A = km . m
A = aire du pic
m : masse du composé injectée.
km : coefficient de réponse massique du détecteur dans les conditions utilisées.
Dans la pratique, on injecte les composés en solution et on préfère utiliser les concentrations
plutôt que les masses. Il y a proportionnalité entre la masse injectée et la concentration du
soluté, à condition de toujours injecter le même volume de solution.
On écrira donc : A = kC . C
A = aire du pic
C : concentration du composé injectée.
KC est le coefficient de réponse du détecteur.
XII. 1. METHODE DE L’ETALON EXTERNE :
On doit disposer du produit à doser à l’état pur pour pouvoir déterminer son coefficient de
réponse kC. Pour cela on prépare une gamme de solutions étalons que l’on injecte tour à tour.
Si la gamme des concentrations a été bien choisie, on obtient une droite d’étalonnage passant
par l’origine. Si ce n’est pas le cas on modifie la gamme des concentrations utilisée pour se
placer au cœur de la zone de réponse linéaire du détecteur. On peut alors par régression
linéaire déterminer l’équation de la droite d’étalonnage. A = a C + b
Si les conditions chromatographiques ont été bien choisies on obtient bien une droite passant
par l’origine : b = 0 et kC = a
Il peut arriver si les pics ne sont pas parfaitement résolus que la droite d’étalonnage ne passe
pas parfaitement par l’origine. On pourra alors déterminer le terme b et en tenir compte par la
suite. Il peut arriver aussi que par erreur un des points ne soit pas aligné, on pourra
éventuellement supprimer ce point et ne pas en tenir compte.
Il suffit ensuite d’injecter la solution inconnue, à partir de l’aire du pic AX on pourra calculer
la concentration correspondante : CX = AX / kC.
Si la droite d’étalonnage ne passe pas par l’origine :
AX = a CX + b et CX = (AX – b)/ a
Cette méthode est la plus précise et la plus fiable mais on préfère parfois simplifier le
processus en n’injectant qu’une seule solution étalon.
La droite d’étalonnage est obtenue en supposant qu’elle passe par l’origine et on pose donc :
kC = Aétalon / Cétalon
Soit CX = AX / kC = Cétalon AX / Aétalon
Si les conditions chromatographiques sont correctes et bien reproductibles, on obtient de très
bons résultats avec cette méthode simplifiée qui est très largement utilisée pour les analyses
de routine. On fait toujours par principe, plusieurs analyses du même échantillon pour
s’affranchir d’erreurs expérimentales et on calcule une valeur moyenne de la concentration
sur plusieurs injections.
La solution étalon est de même injectée à intervalles réguliers pour évaluer et corriger une
éventuelle dérive de l’appareillage…
XII. 1. METHODE DE L’ETALON INTERNE :
Cette méthode est très utilisée en chromatographie gazeuse ou liquide, elle consiste à ajouter à
la solution à doser une substance (absente naturellement) à une concentration connue, toujours
la même dans tous les échantillons à doser. Elle présente l’avantage de s’affranchir des erreurs
au niveau du volume injecté qui peut varier légèrement d’une injection à l’autre.
On prépare une gamme de solutions étalon contenant le produit à doser à une concentration
connue (mais variable).
Ce et l’étalon interne à la concentration connue et toujours la même CInt.
On injecte la gamme des solutions étalon et on porte le rapport des aires des pics obtenus
Ae / Aint en fonction de Ce.
On obtient une droite d’étalonnage dont on peut déterminer l’équation par régression linéaire :
Ae/Aint = a Ce + b
Comme précédemment cette droite passe généralement par l’origine et il est possible d’opérer
avec une seule solution étalon. L’intérêt de la méthode est que si le volume d’injection varie
Ae et Aint sont modifiés dans les mêmes proportions et leur rapport n’est donc pas modifié, on
s’affranchit donc des erreurs d’injection.
VI. DETERMINATION DE LA COMPOSITION D’UN MELANGE
On distingue trois méthodes principales :
♣ Normalisation interne : on compare les aires des pics d’élution au cours
d’une même injection.
♣ L’étalonnage externe ou "méthode des injections comparées ": on compare sur deux
chromatogrammes l’aire du pic d’élution de la substance de référence à celle
du produit à doser.
Cette méthode est basée sur la comparaison de deux chromatogrammes
(étalonnage et dosage) effectués dans des conditions identiques.
Céch = K.Aéch Créf =
K.Aréf
Aéch
Céch = Créf
Aréf
La précision des résultats dépend :
◙ des pesées de la substance de référence et de l’échantillon ;
◙ des dilutions ;
◙ de la reproductibilité du volume d’injection ;
◙ du maintient des conditions chromatographiques strictement
constantes pendant l’étalonnage et le dosage
♣ L’étalonnage interne : on compare les aires des pics de la substance
de référence et du produit à doser à la surface du pic d’élution d’un produit témoin appelé
"étalon interne" ajouté lors du dosage et de l’étalonnage.
On rajoute au mélange une quantité connue d’un corps pur
(EI) : celui-ci doit :
♦ ne pas être présent dans le mélange de départ ;
♦ éluer en dehors de tout pic du mélange.
Ax mEI
Dans ce cas :
%X= x x 100
AEI mM
mEI : masse d’étalon interne ajouté à la masse mM d
à analyser
