MANUEL TECHNIQUE

DE

MICROBIOLOGIE
ET
, SEROLOGIE
PAR

LE PROFESSEUR A. CALMETTE
S.-Directeur de I'Inslitul Pasteur,

L. NEGRE ET A. BOQUET
Chefs de Lahoraloire it !'Instilu t Pasteur.

DEUXIi::ME EDITION RIWUE

ET MISE A JOUR

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de traductiolt et d' adaptation
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COPyright 1026 by Masson_et C t,

,J>jll'js
 PREFACE DE LA DEUXIEME EDITION

L' accueiL fait ci ce manuel en ayant epuise la premiere

edition im quelques semaines, nous avons dli. en composer
une nouvelle pour repondre au desir qui nous a eie
exprime. On trouvera dans celle-ci de ires nombreuses et
utiles additions qui, pour Ia plupart, nous ant ele sug-
ph'ies /)or nos £olleplJl!s de l'JnsJiil1i Pasteur ei par les
nombreux tmvailleurs fJ"am;ais ou etrangers qui fre-
quentent nos laboratoires.
Nalls souhaitons que, sous cefie forme essentiellement
pratique, notre petit livre continue ci eIre aussi favora-
blement appl'ecie et qu'en fa cilitant les 'recherches des
travailleurs de laboratoire il contriblle ci la diffusion des
methodes pastoriennes ainsi qu'aux progres des sciences
biologiques.
PROFESSEUR A. CALMETTE,
A. BOQUET, L. NEGRE.
(Institut Pasteur, janvier 1926.)
 PREFACE DE LA PREMIERE EDI110N

Nous avons appris, par noire eXp'erience personnelle,

com bien les microbiologistes et les serologistes, surtout
quand ils sont livres a eux-meme~ et qu'ils ont la respon-
sabilite de diriger un laboratoire, eprouveni de difficul-
fes Ii trouver, au momerri OU ils en ont besoin, la'descrip-
tion de teUe methode de recherches, de tel pro cede techni~
que ou de tel disposilif d'experiences qu'ils se rappellent
imparfaitement. Les mieux dOlles et fes plus instrufts
savent bien qu'il est prudent de ne pas toujollrs s'en rap-
porter a leur memofre, sf fidele qu'elle puisse eire. II
peui donc leur eire commode d'avoir, sur leur table de
travail, un livre tel que celui que 110US leur offrons, qu'ils
pllissent feuilleter ou consulter a leur gre.
Ce (( Manuel» n'est ni un traite, ni lin Cours de
micl·obiologie. II n'a Ia pretention de rien enseigner. Il ne
s'adresse pas aux microbiologistes debutants, mais sell-
lement a ceux qui ont deja que/que habitude des' manipu-
lations de, [aboratoire.
NOllS ['avolls d'abord compose pour nOlls-memes, et si
nous nolZS decidons ,a le publier, c· est parce que plusieul's
de nos collegues et de nos eleves, auxquels nolZS avions
prele nos notes, ont fini pal' nOlls convaincre qu'il pOllr-
rail rendre service a beaucoup d'autres.

PROFESSEUR A. CALMETTE,
A. BOQUET, L. NEGJtE.
(Institut Pasteur, octobre 1924.)
 MANUEL TECH:N"IQUE
Dil

MICROBIOLOGIE ET SEROLOGIE

PREMIERE PARTIE

TECHNIQUES GENERALES
DU LABOBi\TOIRE

CHAPITRE PREMIER

MICROSCOPE ET UL!RA-MICROSCOPE

Microscope.
Le microscope se compose d'un slali! et d'une partie
~~~. .
Pour ,un laboraloire de bacteriologie, Ie microscope doit
comprendre, sur 1e statif, une platine·mobile, avec ou sans
chariot, un condensateur Abbe avec diaphragme iris et un
miroir.
On fixe la preparation sur la platin~ du microscope a
I'aide des valets, Ceux-ci sont cOI1stitues pdt' deux petites
lames flexibles,implvntees'il angle droit BUrJlne lige rigide
qui s'enfonce dans un trou creuse dans la platine. Un
ressort 'a boudin, enroule autour de la tige et appuye sur
la platine, maintient chaque lanie flexible.
La platine mobile 'permet de centret exactement les prc-
10 TECHNIQUES GENERALES

paratio~s, mais elle n'a pas un deplaeement assez etendu

pour qu'on puisse examiner toute leur surface. Avec une
eertaine habitude, en saisissant la lame entre Ie pouce et
J'index de la main gauche, on peut, en otant les valets, la
deplacer a son gre .sur la platine.
Quand on veut faire des examens systematiques, on se
sert d'une platine a chariot. La preparation, fixee sur le·cha-

Fig. 1. - i\lnrche lies rflyons lumineux dans un microscope.

riot; peut ~tre promenee en tous sens, grace a un mouve-

ment antero-posterieur et a un mouvement lateral, comman-
des par deux vis.
Le condensateur Abbe, constitue par deux ou trois len-
tilles, re90it les rayons lumineux envoyes par Ie miroir
et augmente leur puissance en les condensant su~ In prepa-
ration.
Le diaphragme iris permet d'elargir ou de retrecir, :'\
 MICROSCOPE ET ULTRA-MICROSCOPE 11

volonte, Ie diarpetre du cone eclairan't. II sert surtout dans

les examens a retat frais.
Le miroir a deux faces, .rune plane et l'autre concave.
La partie optique se compose des ob;ectifs et des ocu-
Zaires.
Les objectifs a sec sont employes pour les grossissements
moderes. Les constructeurs fran<;ais les designent par les
chiffres 0, 1, 2, 3, etc., jusqu'a 9, par ordre de grossisse-
ment croissant.
Pour les grossissements plus forts, on se sert des ob;ec-
tifs a immersion homogene qui ne peuvent 'Hre utilises
qu'en interposant, entre la preparation et l'objectif, un
liquide, rhuile de cedre, dont l'indice de refraction est
sensiblement egal a celui du verre de l'objectif. On
evite ainsi la perte des rayons lumineux qui se pioduit par
la refraction dans l'air.
Les objectifs a sec ou a immersion achIellement employes
sont dits achromatiques parce qu'ils sont construits pour
eviter la dispersion .d£;s, coulep.cs fondamentales du spectre.
La correction est encore plus com'piete avec les objectifs
dits apochromatiques, mais leur prix est tres eleve.
Les objectifs se fixent sur un revolver. Les revolvers a
trois objectifs sont tres suffisants dans la pratique cou-
rante.
On peut avoir deux objectifs a sec (un nO 4 et un nO 60u
7) et un objectif a immersion (1/12 ou 1/15).
Les oculaires de Huyghens sont numerotes en chiffres
romains de I a III. On les em ploie avec les objectifs achro-
matiques a sec. .
Les oculaires compensateurs sont fabriques specialement
pour corriger l'inegalite de grossissement pour les diffe-
rentes couleurs et ne conviennent theoriquement qu'aux,
objectifs a immersion (Langeron) .. Ces oculaires portent des
chiffres 2, 4, 6, 8, 12, qui indiquent leur grossissement,
propre. Ils sont capables de grossir autant de fois l"image
donnee p'ar l'objectif.
Les oculaires 4, 6 et 9 sont les plus employes.
Pour chaque objectif, la valeur du grossissement, avec
toute la serie des oculaires, calculee pour un ecartement des
deux' systemes de 160 millimetres, est indiquee par chaque
fabricant.
12 TECIlIYI9UES GENERAFES

Daqs }tjs PflYS a forte Juminosite, l'reil qui n'est .pas

occupe pendant l'observation au microscope monoculaire.
peut etre fatigue par la lumiere ambiante. Pour obvier a.cet
inconvebient, Ed. et Et. Sergent ont fait construire Pill'
Stiassnie un « cache-reil » qui se fixe sur l'extremite su-
perhmre du tube du microscope, -a la hautElUr de l'pcu-
Iaire, et qui protege l'un QU l'autre reil, it volonfe.
Mensllration des microbes. - Les dimensions des
ll}icr.obt:s so.nt !Jxp,rirp.ees en milliemes de millimetre ,par la
IeHre grecque v- (mu). -
~our: les mesurer. on se sert d'un o«ula1r.e mic~ometrique
et a'un mlcrometre objectif.
L'oculaire micrometrique porte. entre ~,es d~ux le'1tiUes,
un . verre, sur Iequel est gravee une echelle graduee Iln
dixiemes de millimetre.
Le.micrQmetre objectif est une lame de verre portant une
serie rectilig!1e de traits espaces q'un centieme de J1lilli-
mMre. -
. La mensuration se (ait de la fayon suivante :
On commence par placer Ie microm~tre objectif sur la
platine et'l'oculair.e micrometrig;ue ala place dl'l l'oculaire.
On fait tourner l'oculaire de fayon it rehdre ·p.aralleles les
deux echelles graduees et on superpose le~ deux zeros en
qeplaQant Ie micrometre objectif. Puis, en sui'\:ant des yeux
les deu'- echelles a partir du zero, on note les ~eu4 pre-
miers traits qui se confondent.
S~, par exemple, Ie trait 10 du micrometre oculaire tombe
sur Ie trait 4 de l'objectif micrometrique. 10 divis-ions ocu-
Iaires repr~sentent. sur la preparation, 4 fois 1/100, de milli-
m~tre ;,lli'1e division oculaire representera
o mm
10
04 : 0 mm. 004 =
4 v-

On enleve alors l'objectif micrometrique et on Ie remplace

p'ar la preparation porta'nt les microbes a mesurer.
Si la longueur d un microbe correspond a N divisions de
l'oculaire. sa longueur sera N X 4 fL.
Si N = 2, la longueur du microbe sera de 8' V-.
Reperage des )Joints interessants d'une prepara-
tion microscopique. - Si 1'0n ne dispose pas d'un mar....
 MICROSCOPE ET ULTRA-MICROSCOPE 13

queur a pointe de diamant, on peut reperer commode-

ment un point du champ d'un objectif a immersi_?n homo~
gene par Ie procede suivant 'de Edm. et Et. Sergent: Pla-
cer Ie point p. reperer au· centre du champ de l' objectif I!
immer.!)ion (oculaire faible). Remplacer I:objectif a immer-
sion par uil. objectif n° 4 Stiassnie. Mettre au point Abais-
ser Ie condensateur Abbe. Decouper dans du papier
gomme, qui entoure les timbres-poste, une minctdanguette
autour d'un des trous. Humecter la gomme et porter' oaUe
languette, gomme en dessus. a l'aide du doigt, sur la face
inferieure de la lame porte-objet, pendant que l'on observe
au microscope. Les trous !)u papier gomme ont a peu pres
Ies dimensions du champ de l'objectif nO 4 de Stiassnie,
avec un O'Cuiaire faible On peut ainsi guider avec Ie daigt
l'applicatioq, de Ia languette gommee sur la face infe--
rieure de la lame, de fa90n qU6 i'objet rep ere S6 trouve
bien au centre du cercle. ce que l'on vcrifie ensuite avec
l'ohjeCtif a immersion. Le papier hien cone ne se detache
pas.
•
Entretien du microscope - Le microscope demande
it etre entretenu avec beaucoup de soin.
II doit etre mis a l'abri des poussieres et de l'humidite en
Ie repla9ant, apres chaque examen, dans sa boite. On peut
aussi Ie recouvrir d'un linge ct Ie mettre sous une grande
cloche de verre.
Les objectifs a sec sont essuyes avec un papier de soie au
une peau' qe chamois.
Apres chaque examen, l'huile de cedre doit etre enlevee
de l'objectif a immersion avec un papier de soie ou un
linge fin Si l'huile s'est dessechee sur l'objectif, on nettoie
ce demier avec du papier fie soie ou un linge fin ifnbibe
legerement de xylol, puis on l'essuie avec du papier ou un
linge, sec. .
Le xylol ne doit pas etre mis en ex~es, car it pour.mit
di::;soudre Ie cimen! qui fixe Ies lentilles:' Po'ur la meme rl!i-
son,. ne pas laisser tremper l'objectif a immersion darts
l'huile de cedre deposee sur la preparlHion.
Les oculaires sont essuyes de temp~ en temps avec un
papier de soie ou un linge fin, sec. Si les grains de poussiere
persistent malgre un nettoyage exterieur, devisser les len·
14 TECHNIQUES GENERALES

tilles, nettoyer leurs faces interieures et les. rer.lettre en

place.
Le condensateur, Ie miroir, la platine, sont entretenus en
les essuyant, de temps en temps, avec un, tinge fin, sec ou
avec la p-eau de chamois.
Si de l'huile de cedre s'est repandue suda platine, frotter
celle-ci avec un papier imbibe de xylol, puis l'essuyer avec
du papier ou un linge s'ec.
II est bon de luhrefier de temps en temps les organes de
glissement avec un peu' d'huile de vaseline,

Ultra-microscope.
Le principe de l'ultra-microscope est base.~ur Ie pheno-
..mene de Tyndall: les poussier,es en suspensi,on dans l'ail'
d'une chaIhbre, qui sont en general invisibles, deviennent
visibles lorsque. les fenetres etant closes. un rayon de so-
leil filtre par une fente et vient se ref1~hir sur les grairls
de p!lussier~ qui s'illuminent.
Alors 'que, dans un microscope ordinai~,~ 11)s rayons
.lumineux penetr~nt directement dans l'appareU ftl'>ri!s avoir
traverse l'objet qui, ag,it: 'sur eux par absorption., ~traction
et diffraction, dans les appareils a fond noir ailellrt rayon
lumineux ne peJleire' dil'ecteme.nL daIis ie microscope, ils y
penetrent indireciement apres avoir ete refiechis, rer~ctes
ou diffractes par l'objet D (Langeron).
Comme let> grains de poussiere s'illuminent dans la ,Pt>ece
obscure,. les microbes, eclaires lateralement, apparalssent
lumineux sur un fond noir.
Tous les grands fabricants d'appareils optiques con§-
truisent des ultra-microscopes. Nous ne parlerons que
de celqi de Stiassnie, tres simple et tres repandu en
France.
L'examen it l'ultra-microscope necessite, en dehors de'
l'appareil lui-meme. un petit diaphragm'e coni que qui s'a-
dapte it l'objectifa immersion, et une source lumineuse spe-'
cia Ie (bee Auer, lampe it acetylene ou lampe electrique a,
verre depoli).
Ondoit, autant que possible, pratiquer les examens dans·
une piece obscure.
Pour opereI' un examen ultra-microscopique, on depose,
 MICROSCOPE ET ULTRA-MICROSCOPE 15

sur une lame' tres propre, une goutte d'eau con tenant les
microbes, et on la recouvre d'une lamelle. .
La prop rete des lam~s et des lamellcs, leur epaisseur
ainsi que celle- de la couche de liquide, sont autant de fae-
teurs qui ont leur importance.
Pour se servir de l'appareil, on doit retirer Ie conden-

Fig. 2. - Ultra-microscope de Stia.snie.

sateur Abbe du microscope et placer l'ultra-microscope

sur la platine du microscope en Ie fixant avec les valets.
On place Ie microscope a 25 centimetres environ du
foyer lumineux quand on interpose une lentille condensa-
trice entre la source de lumiere et Ie miroi'r, et a 15 ou
20 centimetres quand il n'y a pas de lentille. On de place
alors Ie miroir jusqu'a ce qu'on-ait obtenu Ie maximum d'in-
ten site lumineuse. "
Dans la cavite-superieure de la lentille de I'ultra-micros-
cope, on verse un peu d'huile de cedre. On pose sur I'ap-
pareil ~a lame qui a ete preparee et on la fixe l\vec les valets.
IG TECHNiQUES GENERALES

L 'huile de cedre de la cavite doit venir en "C~nlact avec Ia

partie inferieure de Ia lame. Avoir bien soin qu'aucune
bulle d'air ne reste entre Ia lame et l'huile de cedre de Ia
cavite.
Avant de proceder it l'examen, on centre Ia lentille de
l'ultra-microscope avec un objectif faible. On fait coincider
10 'cercle qui est au centre de l'appar~iI avec Ie centre du
champ
On peut alors deposer une goutte d'huile.de cedre sur la
lamelle et examiner avec l'objectif it immersion. ,-
 CH4PITRE Il

STERILISATION. - FILTRATION.

Les instrumen ts, la verrerie, les milieux de cl)lture qui sop t

employes dans Ie:> recherches bacteriologiques doivent etre
parfaitemellt steriles. Tous les germ.es sont detrlJlts par une
temperature de 1150 -120 0 (chaleur humide) ; de 1800 (cha-
leur seche).
Les methodes de sterilisation par les agents physiques
peuvent etre rangees dans l'un des groupes suivants :
1" Chaleur seche ;
20 Chaleur bumide
30 Filtration.

1. - Sterilisation par la chaleur secbe.

A. Sterilisation dans La f/.amme, - Employee pour

les petits instruments en llerre ou en metal. On .se ~onte;nte
de les passer plusieur& fois dans la flamme d'un b.ec BUI}-
sen, d'une lampe a alco.ol ou d'nn bru!eur apetroLe. On l~s
laisse enspite refroidir, en eyitant qu'ils soient ~ouilles p.ar
Ie contact des objets voisins.

B. Sterilisation par Ie fOllr a fIamber. - Le four a

£lamber n'est utilise que pour steriliser la verrerie. Les
extremites des objets qui portent de rouate ou du papier
doivent etre tournees vers Ie haut. II faut eviter leur .contact
avec Ie fond au les parois de l'appareil qui sont toujours
b.eaucoup plus chauds. Eviter e.ussi que les bees brUlent.en
dedans. On en sera averti par ,une pe~ite explosi@fi ,qui t;e
produit au moment de l'allumage, par la hlancheur de la
flam me, par un bruit special et par l'oneur qui se repand.
Cbauffer jusqu'a 1800 • Eteindre une demi-heure tlpr~s
que cette temperature a eM attell1te.
MTCROBIOLOGIE 2
18 TECHNIQUES GENERALES

Laisser refroidir, puis ouvrir Ie four et attendre quelque

temps avant d'enlever les objets, pour eviter que la verre-
rie 'Se brise.
Le flambage a ete reussi si Ie coton et Ie papier ont pris
une teinte jaune clair. S'ils sont restes incolores, la tempe-
rature n'a pas ete suffisante. S'ils sont noircis, eUe a ete
trop elevee.
Le four Pasteur automatique de L. Marmier ne necessite
aucune surveillance. n fonctionne electriquement ~l la
temperature. choisie et pendant Ie temps voulu. L'air
chauffe sur des resistances est agite par un ventilateur, ce
qui permet une sterilisation uniformc de tous les objets
contenus dans l'appareil.

II. - Sterilisation par la chaleur humide.

A. Au-dessous de 100°. - Sterilisation par chauffage

discontinu ou tyndallisation. Employee pour les liquides
tels que Ie serum, l'ascite, etc., qui sont modifies par un
chauffage au-dessus de 60°. On les chauffe dans un bain-
marie regIe a 56-G8°, pend an tune heure, trois jours de
suite.

B. A 100 0 • _!_ La vapeur d' eau a 100° ne permet pas un~ ste-
rilisation complete en llne seule operation. II faut repeter Ie
chauffage trois jours de suite, chaque fois pendant 45 mi-
nutes a 1 heure, et meme une hem'e et demie pour les mi-
lieux epais '(bouillies de viande, de farine, empois d'ami-
don, etc.).
C. A 110 0 , 1150 , 120 0 par vapeur d'eau sous pret'-
sion dans l'autoclave de Chamberland. - Verser de
l'eau'dans la chaudiere. En pla~ant Ie couvercle, verifier si
Ie joint de caoutchouc 'est en place et ne pas trop serrerles
boulons, Allumer en observant les precautions indiquees
pour Ie four a flambeI'. Ne fermer Ie robinet de vapeur que
Iorsque la vapeur s'echappe en jet continuo A ce moment
seulement, l'appareil est entierement purge d'air. Lorsque
la sterilisation esl terminee (20 it 30 minutes de chauffage it
1150 ou a 120"), ne pas ouvrlr Ie robinet de vapeur et ne pas
desserrer les houlons avant que J'aiguillc duJmanometre
 STERILISATION. - FILTRATION 19

soit revenue a 0'. Si on ouvre plus totl'autoclave, la brusque

decompression des liquides provoque, par leur ebullition,
la souillure et Ja. projection des cotons.
La temperature atteinte "dans la- sterilisation peut etre
controlee par l'emploi d'indicateurs. Ceux-ci, contenus
dans des petites ampbules scellees, sont places dans les
liquides a steriliseI'. Le soufre en poudre avec traces de
fuchsine fond a 1150 et se colore en rouge. L'antipyrine avec
trace de bIen de methylene fond vel'S 1200 et se colore en
bIen.

III. - Sterilisation par filtration sur bougies poreuses.

Les'bougies filtrantes, qui sont employees pour Ia sterili·

sation des eaux destinees a l'alimentation, servent, dans les
labnratoires de bacteriologie, a separer, des corps micro-
'biens, les toxines produites par la culture des microbes en
milieu liquide (toxine diphterique, toxine tetanique) ou it
steriliseI' les milieux de culture qui pourraient etre altcres
pa_r la chaleur.
Les bougies Chamberland sont de deux types: 10 les
grosses bougies marquees F ou B. Ces dernieres sont moins
permeables que les preceden tes. La marque F sert a filtrer les
cultures microbiennes pour en separer les toxines ; 2 0 les
bougies de tahoratoire S~IlS embase, numerotees LIt Ll his,
L2J L 3 , L 4 , L s, etc... Ls correspond, comme porosite, a
la grande bougie F ; L lo egale celle de B. Les bougies
marquees Ll et L2 sont les plus permeables. On peut s'en
servir pour la filtration des solutions diastasiferes telles
que les liquides de maceration de cultures d'Asper-
gilllls niger. Toutefois, il faut savoir qne beaucoup de
diastases sont partiellement retenues par la porcelaine
poreuse. surtout lorsqu'elles sont en solution acide.
II faut donc toujours neutraliser les liqtiides avant la filtra-
tion.
Les bougies, de Ll a L 3 , sont traversee~ par les microbes
dits virus filtrants.
La filtration peut s'operer par pression ou par aspira-
tion. Dans Ie premier cas, on se sert de la bougie Chamber-
land B ; dans Ie se~ofid de la bougie F.
20 TECHNIQUES GENERALES

D'autres filtres que les bougies Chamberland peuvent

etre utilises, telles que les bougies en terre d'infusoires (bou-
gies Berkefeld) et les hougies d'amiante qui sont tres per·
meables, mais offrent moins de securite paree qu'cUes pre.
sentent plus souvent des fissures.
Avant leur emploi, les bougies seront eprouvees avec
soin. Les immerger dans uue epl'ouvette l'emplie d'eau et y
insuffiel' de rail' au moyen d'une poire en caoutchouc. Si
,des buIles d'air,partant d'un meme point, s'echappent dans
l' eau, ]a bougie est fissur~e et doit etr() rejetee.
Dans la filtration, 1'emploi des tests microbiens permet-
tra de deceler la meme
c cause d'erreur. On em-
ploie genel'alement com-
me test Ie microbe du
Cholera des paules qui
est h'es petit et rap ide-
ment cultivable,
A La filtration ne doit
r=:Z:::::::3:r:::::::J pas .etre de trop longue
duree et la pr~ssiQn at-
teinte doit toujoul's etre
notee.

Appareil if filtra-
tion de R. Legroux.
- Cet appareil est cons-
titue par une tubulure
en bronze creusee de
deux canalisations dis-
D tinctes : L une AB (fig. 3)
Fig. 3. par Iaquelle on aspire
rail' des recipients au
moyen de l'appareil a vide, l'autre CD, d'ou se detache une
oranche E. L'orifice lateral E, en communication avec la
bougie, conduit Ie liquide filtre dans Ie recipient 'de re-
colte L'ol'ifice C re90it un tube de caoutchouc termine par
une effilure de verre. Un anneau de caoutcb.ouc en F permet
de fixer {'appareil sur tous les recipients en usage dans les
laboratoires,
A l'extremite superieu1'e d'un tube a thermGmetre I, long
 STERILISATION. - FILTRATION 21

de 12 a 13 centimetres et enfonce jusqu'au fond J'une

petite bougie Chamberland L de 70 mm. de hauteur (ce
qui permet de {ilirer Ie liguide en ioialite), on ada pte un
bouchon de caoutchouc K perce, 'que ferm'e fa bougie.
L'extremite du tube de
verre est reliee par un
tube de caoutchouc it l'ori-
fice E de Ia tubulure de
bronze. Ce tube de caout-
chouc a vide doit etre assez
long pour que Ie recipient
con tenant Ie Iiquide a fil-
trer et Ie recipient de
recolte reposent sur un
meme plan, Le tube i de- D
passera Ie bouchon de quel-
ques centimetres. On fer-
mera l' orifice A par un
petit bourdonnet de coton
et on ligaturera au fil de
lin les raccords du tube de
caoutchouc (fig. 4).
L'appareil est facilement B
sterilisable a l'autoclave.
Pourassurerson etancheite
on paraffinera les joints. Fig. 4.

Appareil a vide, a chute d'eau (R. Legroux el M. Gory).

Sile liquide est peu abondant ou s'il filtre aisement, on pent
faire I'aspiration au moyen de Ia depression qu'entralne la
chute de l'eau d'un flacon de 5 a. 10 litres, a deux orifices.
L'orifice superieur est ferme par unbouchon de caoutchouc
traverse par un tube coude sur Iequel on ada pte un tube de
caoutchouc demi-vide, relie it l'autre extremite a l'appareil
a filtration. On ferme l'orifice inferieur avec un bouchon de
caoutchouc traverse par un tube de verre auquel on fixe tin
tube de caoutchouc demi-vide. On adapte & celui-ci une pi-
pette effiMe ouverte dont l'extremite plongera dans l'eau
d'un cristalliso ir.
On porte Ie flacon rempli d'eau a une certaine hauteur:
1 m. 50, 2 m. 50, on laisse couler l'eau par la pipette et
22 TECHNIQUES GENERALES

l'aspiration se produit. On I'arrete en pla!;ant une pince

sur Ie tuyan d'econlement. Lorsque Ie flacon est vide, on Ie
remplil en adaptant ie tuyau d'ecoulement a un robinet
d'ean en ayant soin de Iaisser ouvert Ie tube superieur.

Appareil de securite de R. Le[Jroux. - Lorsqu'on

filtre des Iiquides peu l1uides, on emploiela twmpe a eau, et
pour eviter les retonrs d'ean on interpose habitllellement
entre Ia trompe et J'appareii a filtration un flacon a deux
tubulures. L'appareil automatique de secllrite, de Legrou:r,
permet de mieux elJiler cel inconvenient. 11 est constitne par
deux tubes de "erre A et B (verre it
pipettes) traversant un bouehon de caout-
chouc E fixe a frottement dur sur un
gros tube de verre C (diametre 25 mm.,
hauteur 90 it 100 mm.) fig. 5).
Le tube A deborde de quelques milli-
metres Ie bonchon a I interieur du tube C.
Son extremitc superieure est reliee it la
trompe par un tube de caoutchouc demi-
E vide.
Le tuhe B descend un pen plus pro[on-
dement, 15 it 20 mm., dans ly tube C.
A son exlremite inferieure on adapte un
tuyan de gomme pure g, long de 60 a 70
mm., ferme it son extremite inferieure
n par un tube de verre plein D. Sa partie
superieure re!;oit un tube de caoutchouc
fixe it l'appareil it filtration.
Avant de l'adapter, on pratique, comme
il suit, dans Ie tube de gomme, un petit
orifice lineaire E: introduire un histouri
dans Ia Iumierc du tube; poser ceIui-ci a
plat sur une surface de bois lisse, du cote
ou se trouve Ie tranehant du bistouri et,
en appuyant legerement, faire une inc~sion
nette, de 2 a 3 mm. de longueur.
L'appareil en service doit toujollrs Nre
rempli d'eau jusqu'en n, pour empcchcr
la dessiecation dn tuhe de gomme.
Fig. 5. Lorsque 1a depression se fait dans
 STERILISATION, - FILTRATION 23

l'appareil it filtration, et tant qu'elle est constante, Ie tube de

gomme reste cylindrique, l'orifice E demeure beant, l'air
s'echappe et la trompe l',aspire, Si l'aspiration par la trompe
eesse,l'eau reflue par Ie tube A. Immediatement, la pression
atmosph~rique aplatit Ie tube de gomme, les deux levres
de la fente E s 'aeeolent et toute communication entre l'eau
du tube C et l'appareil it filtration est supprimee. On evite
ainsi les retours d'eau. (M. Gory.)

Nettoyage, regeneration et sterilisation des bougies

Chamberland.

La calcination des bougies do it etre evitce, car elle pro-

voque la formation de sediments adherents, qui colorent
les bougies, les fendillent'Ct diminuent leur porosite.
II faut, aprcs usage, les tremper dans un recipient en
verre rempli d'eau chaude, additionnee de 1 it 2 p. 100 de
ehlorure de chaux en poudre.
Ce bain a pour effet de gonfIer et de ramollir Ie depOt
superficiel. On passe ensuite les bougies sous un filet
d'eau en les brossant avec une brosse en I:rin, puis on
les plonge dans un buin d'eau froide contenant 1.000 a
1.500 grammes Je chlornre de chaux pour 10 litres d'eau.
On les laisse ainsi immergces pendant 30 minutes. Le
chlore detruit les matieres organiques it l'interieur des
pores, Ensuite on rince de nouveau sous Ie robinet et on
plonge les bougies dans un autre bain d'eau froide contenant
1 000 a 1.500 grammes d'acide chlorhydrique dans 10 litres
d'eau. On les y,laisse pendant 30 minutes. Les sediments
exterieurs et Ie calcaire sonl ainsi solubilises. Il ne reste plus
qu'a rincer une derniere fois fortement sons Ie robinet at it
laisser tremper les bougies dans de l'eau distillee qu'on
change plusieurs fois jusqu'a ce qu'elle ne fournisse plus
aucune reaction acide au tournesol.
Si les bougies sont colorees, on peut les plonger dans
un bain concentre de bisulfite de soude avant Ie dernier
lavage. Lorsqu'elles sont bien propres, on les laisse secher
it l'air et on les conserve dans de larges flacons bouches it
l'emeri ou au liege.
On sterilise les bougies en les playant une a une dans un
24 TECHNIQUES GENERALJSS

grO$ tube a essai au fond duquel on a verse quelqu~s goutte&

d'EJau at qu'on bouche ~ l'ouate. Ort les porte albrS a I'auto-
elhEl et On chauffe it 116d pendant 20 minutM. ,Les'hcJUgiM
st~rileS peuVElht ensuiterester dans letubequi les l'enfel'me;
jusqu'au moment oil. ron doit Ies emplOyer.
 CHAPITRE III

180LEMENT ET. PURIFICATION DES MICRO)3ES _

CONSERVATION DES SOUCHES MIGROBIENNES

A. lsolement a l'aide de milieux solides. - Sepa-

ration par dilution et ensemencement ~n Plaques
de{Jelatiil~ou de gelose. - Lorsqu'on se propose d'iso-
ler les germes d'une culture en milieu Iiquide, d'abondance
mOj'enhe, ou d'un pus aSSez riche en microbes, on preleve
une nnse d'environ un millimetre de diametre de Ces
produits at on la dilue dans lO.ccntimetres cubes d'eau phy.
t;iologique. Apres agitation j porter une gouUe de cette dilll-
;tmt;1,. .» J'.!lj.dt' .d '.!.1.t;1e p.ipNJe .P.»...".f.N.'T, ibms .!..')) J.t_,Pe .de geJatioe
fondue. Bien melanger en inclinant, puis en redresgltnt brus-
quement Ie tube et en Ie roulant rapidernent entre les deux
mains. Faire un prelevement dans ce premier tube de
gelatine avec une nouvelle pipette et porter troit; gouttes
dl1ns un second tube. Apres bra~snge, prendre llvec une
Qutre pipette quelques gouttes dans ce dernier tube at en
deposer six dans un troisieme tube da gelntine.
Chncun des tubes de gelntine est alors coule dans une
hoHe de Petri sterile. Pour cola, enlever Ie coton du tube
a assaij et flamber rapidement I'orifice, soulever· Ie cou~
verele de la bolte et y verser la gelatine en aynn\ soin de
la repartir sur toute la surface. Poser ensuite les bo!tes
horizontaletnent sur nne table froide, puis, quand Ia gela-
tine a fait prise, les porter a l'etuve a 220.
All lieu de gelatine, on peut~e servir de gelose. 11 est
alors necessaire de maintenir les tubes, qui contiElnnent In
gelose fondue, a une temperature de 40°, pour evit{\r q-q'elle
ne fasse prise avant la coulee dnns les boites .qe Petri.
Cdles-ci seront placees al'etuve a37° apres avoir tt-e retour-
 TECHNIQUES GENERALES
nees. afin que l'eau de condensation ne souille les cultures.
Lorsqu' on veut proceder a la separation de microbes qui
ont pousse sur milieu <;olide, il faut emulsionner la culture
dans del'eausterilisee, puis on procede com me precedem-
ment.

B Separation par epuisement sur milieux solides

(gelose, serum). - Pro cede de Roux et Yersin. - La
semence est etalee a la surface de 3 ou 4 tubes de g~lose
inclines ou de serum" a l'aide d'un fil de platine ou d'une
spatule, sans les recharger. Eviter de touch~r l'eau de
condensation, La semence s'epuise peu a peu et, dans les
derniers tubes ensemences, Ie nombre des colonies est peu
eleve. CeUe methode est tres pratique dans Ie cas OU la se-
mence n'est pas tres riche en germes ou lorsqu'on se sert
d'un milieu electif, comme Ie serum pour Ie bacille diphte-
rique.
Au lieu de tubes de gelose ou de serum inclines, la sepa-
ration par epuisement peut etre faite en tubes a faces plates
de Legroux ou en boites de Roux remplis des memes
milieux prealablement ,coagules. L'ensemencement doit
alors etre fait avec une pipette coudee qu'on essuiera sur
Ie milieu sur toute sa longueur, ou avec un petit :couleau qui
sera prepare de la fa<;on suiyante :
On plie par Ie milieu, it angle aigu, un fil d'alumin\ulll,
,de fer ou de cuivre, deJO a 15 centimetres de long et de
2 millimetres de diametre environ ; on fait en suite un
conde a 10 ou 15 millimetres de chacune des extremit¢s et
on introduit ,un tube de verre de 2 centimetres de long sur
5 millimetres de diametre (tubes dont on fait les pipettes
Pasteur) a extremites mousses, entre les branches pliees.
Le tube ron)e doucement sur la surface de la gelatine sans
l' egratigner.
Pro cede de Veillon. -Epuiser successivement la semence
dans l'eau de condensation de plusienrs tubes de gelose ou
de serum. Incliner erisuite ces tubes pour que l'eau de con-
densation vienDe les ensemencer.
{ ......
-f"'" C. lsolement par ensemencementsur milieux elec-
tifs, - Exemple : Ensemencementsurserum coagule pourle
 ,/ .
ISOLEMENT ET PURIFICATION DES 'MICROBES 27

bacille diphterique, sur milieu de Dieudonne pour Ie vibrion

cholerique.

D. lsolement par divers mogens. - Chauffage a

900 , 100 0 • Seuls les microbes sporules resistent.
Inoculation a un animal sensible (Exemple : souris pour
Ie pneumocoque, cobaye pour Ie bacille tubercuIeux).

E. lsolement des anaerobies (voir chapitre XXXIX). -

Le procede Ie plus employe, f: cause de sa simplicite, est
ceIui de Veillon.
II faut se servir de tubes a essai de grande taiUe : 22 cen-
timMres de long sur 15 millimetres de diametre. Ils sont
remplis, sur une hauteur de 10 centimetres environ, avec
une gelose transparente, a 1 ou 2 p. 100, a laquelle on ajoute
1,5 p. 100 de glucose. On fait fondre une dizaine de tubes
en les pIa<;ant dans de l'eau qu'on porte a l'ebullition pendant
10 minutes ~de favon a bien chasser l'air). Ils sont ensuite
refroidis au bain-marie a 40 0 •
A l'aide d'une pipette sterilisee, verser une goutte de
semence dans un premier tube; a.pn!s avoir agite, prelever
avec une nouvelle pipette une goutte de gelose ensemencee
qu'on porte dans un second tube, et ainsi de suite jusqu 'a la_
fin de Ia serie.
On peut aussi, avec un fil de platine ou avec une pipette
effilee. non ouverte; toucher la 'semence et les laver succes~
sivement dans les tubes sans les recharger.
Lorsque l'ensemencement est termine, les tubes sont
plonges dans l'eau froide, puis portes a l'etuve a 37°.
Les tubes de cul~ure sont' examines tous les jours pen-
dant un temps prolonge, certains anaerobies ne poussant
qu'au bout de 8 a 10 jours.
Les colonies d'anaerobies s'arretent a 1 centimetre de la
surface, car'la partie superieure de la gelose a dissous de
l'airopendant.le refroidissement.
Si Ie pus ensemence contient des anaerobies facriltatifs
ou des aerobics stricts, on peut trouver. des colonies dans la
zoneaeree.
On preleve les colonies au moyen d'une pipette effilee ct
sterilisee qui joue Ie role d'emporte-piece. Pour les rep i-
quer, il suffit de soumer la colonie, qui a ete ainsiemportee,
28 TECHNIQUES GBNF;RALES

dans un tube de gelose glucosee. Le prelevement est plus

facile quand on adapte a la partie superieure de la pipette
un tube de caoutchouc souple de 0 m. 40 de longueur, dont
l'extremite libre, munie d'un embout, est re9ue dans la
bouche.
Lorsque Ie produit a ensemencer contient des formes
sporulees, on peut, comme les aerobies, les separer au
moyen de la chaleur.
L'inoculation aux animaux sensibles (cobayes) s'emploie
specialement pour l'isolement du bacille tetanique.

F. Purification des colonies isoU:es. - II est rare

qu'a la premiere separation une colonie isolee soit pure.
Les 'microbes d'impurete sont gen,eralement masques par
Ie developpement rapide du microbe principal. Dans les
repiquages ulterieurs, quand les tubes sont conserves un
certain temps. ces microbes peuvent prendre Ie dessus. II
est donc prudent de faire, a deux ou trois reprises, de
nouvelles separations par epuisement sur tubes de gelose
inclinee, ou par dilution et ensemencement sur plaques de
gelose.
Pour les anaerobies, faire une nouvelle sep~ration en
tubes de gelose glucosee, comme il a ete indique.
I
G. Conservation des souches microbiennes!
Conservation des cultures vivantes.
Les cultures de microbes conservent generalement assez
longtemps leurvitalite et leur virulence lorsqu'on les main-
tient a l'obscurite. a basse temperature et en tubes scelles,
a l'abri de l'air. Toutefois les conditions de conservation
sont tres variables suivant les especes, Certaines cultures en
milieux liquides doivent etre maintenues en tubes effiles et
scelles a une temperature inferieure a 0°, ou mieux it 7°, et
continue, obtenue par exemple au moyen de la machine
Audiffl'en-SingriiJ1, ,tres commode pour les laboratoires
qui disposent de force electrique, D'autres s'accommodent
mieux de reensemencements plus ou moins frequents par
simple piqure dans des tubes droits de gelose peptone on de
gelose glucosee ; d'antres encore ne se conserventbien que
dans Ie sang au dans les liquides albumineux. additionnes
au non de carbonate de chaux sterile.
 CONSERVATION DES SOUCHES MICROBIlN:!NES 29

La formule suivante a ete recommandee.:

Serum formole.
Ajouter a 500 centimetres cubes de serum de ch Nal un
centimetre cube de formol du commerce, melanger.
quelques instants de contact, ajouter un centimetre be
d'ammoniaque (l! 22 0 Baume) pour neutraliser la form -
dehyde. Etendre de deux parties d'eau distillee et sterilise
quinze minutes a 1100 (Legroux).
PROCEDE n'UNGERMANN. - Ungermann conserve les mi-
crobes fragiles dans du serum de lapin pur ou dilue,
cliauffe nne demi-heure a 60°, recouvert d'une couche
d'huile de paraffine.
PR()CEDlfDE TRUCHE. - Truche a combine Ie procede de
Legroux et celui d'Ungermann.
Sa technique est la suivante: On repartit dans des tubes
l! essai ordinaires, steriles, 8 centimMres cubes environ de
serum formole ; on recouvre avec 2 a 3 centimetres cubes
d'huile de vaseline sterilisee a 1200 pp.ndant une demi-
heure. Touies les manipulations doivent etre faites sterile-
ment. On a ainsi une provision de tubes qui sont prets it
recevoir les divers germes qu'on veut garder.
Pour conserver un microbe, on l'ensemence sur un tube
de gelose inclinee (g6loseau sang ou.gelose-serum, si besoin
est). Apres 24 heures d'etuve, on preleve it la pipette ste-
rlle 2 centimetres cubes environ de serum formole qu'on
etalea la surface de la gelose ensemenc~e. On agite avec l'ex-
tremile de Ja pipette pour detacher Ie plus 'possible la couche
niicrobienne, et lorsque ~a surface du milieu solide parait
bien nette, on re~ueille toutle liquide charge de corps micro~
biens. On Ie porte ensuite dans Ie tube Oil on Jl puise Ie
serum neu£.
On garde les tubes, soit it la glaciere, soit a la cave, soit A
l'etUye., suivant les germes. II se forme au bout de quelques
fours un petit depot microbien au fond du tube.
PROCEDE DE THA¥sEN. - Pour couseryer les souches de
microbes asporogetles, Thaysen recommande d'addilion-
ner les cultures de atrbonate de calcium precipite, .ou de
biphosphate de calcium.. I
Le milieu de culture, distribue dans des tubes a essai,
sterilise el ense_menc.ej est .abandoDue a l'etuve pendant 24-
48 heures. Lorsque Ie developpement est assez vigouretl'X,
30 TECHNIQUES GENERALES

on introduit dans les tubes 0 gr. 2 environ de craie ou

de phosphate de calcium sterilises: on melange bien et on
scellea la flamme.
Conservation des champignons.
Pour les moisissures du groupe des Ascomycetes (Peni-
cillium, Aspergillus) il fant prendre soin de dessecher Ie
milieu de culture, apres la sporulation, sous une cloche a
acide sUlfurique, et de conserver les spores dans des tubes
hien sees, simplement bouches a rouate et non sceIles, pour
que I'air y penetre librement. Les spores restent ainsi
vivantes et peuvent germer apres plus d'un an.
Les Alucorincs se conservent mieus, au contraire, dans
des tubes de bouillon sucre alp. 100, sous une couche
d'huile de vaseline sterile. L'anaerobiose favorise la forma-
tion des chlamydospores qui sont tres resistantes et qui.
reensemencees apres plusieurs annees, sont capables de se
developper (Pinoy).
Milieu de culture pOllr consel'lJer les semellces de leIJures.
Maltopeptone dn commerce. 10 gr.
Saccharose. . . . . . . 20 gr.
Ean . . • • . . . . . 1. 000, cc.

A dMaut de maltopeptone I, on peut employer une

decoction de touraillons (radicelles d'orge germce. rcsidn
des malteries).
On fait houiIIir, pendant 15 minutes, 50 grammes de tou-
raillons dans un litre d'eau, on ujoQte sa('charose (ou glu-
cose) et on filtre.
COllscl'lJution et fixation des cultllre.~ mortes.
Pour fixer et conserver les cultures de demonstration, il
est recommande de se servir de tube!$ larges, de 16 milIi-
metres par exemple, et de milieux aussl sees et transparents
'que possible. On introduit, entre Ie bQuchon d'ouate et Ie
velTe, une languette de papiel' Imvard impregnee de formol
commercial pur et on coule de Ia paraffine fondue sur Ie
bouchon d'ouate, puis on obture Ie tubr avec un cupuchon
de caoutchouc paraffine ou avec un capuchon de cellulose.
On peut encore placer quelques fragments de trioxyme-

1. La maltopeptone est un extrait aqueux de tOllraillons, concentre SOllS pression

reduite. EUe est livree dans Ie commerce sous la forn1e <l'une poudre ou d'un e:stl'uit
sirupeux•
 CONSERVATION DES SOUCHES MICROBIENNES 31

thylfme entre deux bouchons d'ouate et couler de la

paraffine sur Ie bouchon exterieur.
Les cultures doivent etre gardees dans une armoire, a
l'abri de la Inmiere. .
Pour fixer les cultures de moisissures aux divers stades
de leur 'developpement, on peut commodement employer Ie
liquide cOllservaleur de Pilloy :
Alcool :\ 800 . 300 cc.
Acide acetique • • . . . 20 gr.
Sublime. . . . . . . . 10 gr.

el monler des preparations (qn'on hordet'n:'t In paraffine)

dans Ie liquide suivant (Pinoy)
Hydrate de chloral. . . . . . 40 gr.
Glycerine . . . . . • . . . 20 gr.
Eau. . . . . . . . . . . 20 gr.
Sol. alco.olique d'acetate de plomb a 2 p. 100 : 10 cc, (Sltrer).

CeUe solution rend de grands services, surtout dans les

pays chauds, parce qll'elle ne s'evapore pas. L'acetate de
plomb diminue la trop grande transparence de I'hydrate de
chloral el a la propriete de conserver beaucoup de pig-
ments.

H. Expedition postale des cultures et matU:res

virulentes. - Les dispositions a prendre pour ces enyois
ont ete fixees en France par nne instruction du Ministere
de l'Intt~rieul' du 2 fevriel' 1912. En voici les prescriptions
essentielles :
10 Lei; cultures, matieres ou liquides virulents doivent
etre enfermes dans des tubes au flacon;; de verre epais, for-
tement bouches et cachetes a la eire.
2° Ces tubes ou flacons seront introduits dans une hoite
en . metal solide, apres avoir ete entoul'es d'ane cOllche
d'ouate sufIisamment cpaisse.
3~ La bolle metallique sera eUe-meme placee dans une
seconde boite en bois parfaitement close.
4 0 Chaque envoi devra porter d'une maniere tres appa-
rente, du cote de l'adresse, la men'tion ; Malieres desti/lees u
Ill! examen haclel'iologiqllc.
 CHAPITRE IV

ALCALINISATION ET MESURE DE LA REACTION

DES MILIEUX DE CULTURE

A. - PROCEDE AU PAPIER DE TOURNESOL

Les bouillons prepares avec des peptones commercjales,

et surtout avec 1a peptone Martin, ont generale.rnent untl
reaction acide qui convient mal a Ia culture des bacMries.
Pour les amener ala neutralite au tournesol, on ajoute pen
a pen de petites quan'tites de, s01utio,n ,nqrmale ,de soude
(:).40 pDur 1.000), en melangeant intimement, par agitation
de la masse, avec nne baguette de verre. Apn!s chaque
addition de soude, on preleve une goutte de bouillon qu'on
porte sur duo papier de tournesol bleu et sur du papier de
tournesol rouge. La teinte lilas correspond a la neutralite.
Comme un grand nbmbre de bacteries se multiplient plus
activemcnt en milieu alcalin qu'en milieu acide, on ajoute,
a partir du point neutre,5 centimetres cuhes de solqtion
normale de soude par litre de bouillon.

B. - PROCEDE A LA PHENOLPHTALEINE

Ce procede n'est applicable qu'a des liquides froids. Ver-

ser 10 centimetres cubes de bou'i110n a alcaliniser dans )me
fiole de Fourneau. Ajouter un volume suffisant d'ea:q dis-
tillee pour que I.e liqujde apparaisse faiblement colore en
jaune: puis quelques gouttes de solution a 2 pour 100 de
phtaleine du phenol dans l'alcool et agiter. Neutraliser en
laissant tomber goutte it goutte de la solution deciPQrmale
de soude contenue dans une burette graduee, en melangeant
ires intimement, jusqu'a c,e qu'une faible teinte ropg!! orange
apparaisse. A ce moment, on note Ie volume de solutiop
sodique employe et on en ajoute deux nouvelles gouttes ql}.i
accentuent Ie virage. Pour neutraliser un litre de bouillon,
il suffira d'y ajouter une quantite de soude cent fois plus
grande que 1a quantite employee dans Ie precedent titrage.
 ALCALINISAl'ION DES MILIEUX DE CULTURE 33

C.-METHODES ELEOTROMETRIQUE ET OOLORIMETRIQUE

POUR LA DETERMINATION DES CONOENTRATIONS
IONiQUES DES MILIEUX

Les methodes au tournesol et a la phenolphtaleine ont

l'inconvenient de ne pas indiquer l'acidite ou l'alcalinite
vraie. Elles sont actuellement remplacees, dans les Iabora.-
toires, par les methodes electrometrique et colorimetrique
qui permettent de mesurer exactement la concentration en
ionos H + et OH - libres des solutions.
Dans une solution aqueuse d'acide (chlorhydrique par
exemple), il existe a la fois des ions H + et Cl- libres, et
une fraction non dissociee de la molecule HCI d'acide. Le
rapport entre Ie produit des ions libres et la fraction non
dissociee exprimeen molecules-grammes. est constant pour
une temperature donnee H + ~l Cl- = K. Cette COllstanie de
dissociation est caracteristique de chaque acide. De meme
pour les'ions OH- des bases.
On choisit comme unite de concentration en ions H, la
solution normale d'un acide qui renferme, par litre,
1 gramme d'hydrogene susceptible de se combiner avec une
quantite equivalp,nte d'ions OR- o.
L'eau pure est neutre et renferme, a la temperature ordi-
naire, environ 1 X 10- 7 atomes-grammes d'ions H + et
1 X 10-7 molecules-grammes d'ions OH-. Le nombre de
molecules d'eau _non diss6ciees elant constant, Ie produi.t
ionique devi-ent Ko = H+ X OH-, soit 1 XJO-14.
Toute solution, quelle que soit son acidite ou son alcali-
nite, renferme nne certaine teneur en ions H + dont Ia
concentration sert de mesure dans les deux cas.
Pour eviter l'emploi de nQmbres trop infimes, Sorensen les
a remplaces par Ie logarithme du nombre inverse ,designe
par Ie symbole pH. La concentration des ions H + par litre
dans l'eau pure elant de 1 X 10-7 OU 10.0~O.UUU' l'inverse
de 10.000.000 a pour logarithme 7, pH = 7.
Une solution N d'acide completement ionisee a nne conl.
centration ep ions H+ de) X 1, pH"= O.
U ne solution ~ d'acide a une concentration en ions H de
1 X 10-1 pH = 1.
MICRODIOLOGIE 3
 TECHNiQUES G~1vER.AtES

Vne solution l~O d'acide a une concentration en ions H

oe 1 X 10-2 pH =: 2.
Vne solution l.~OO d'acide a une coricenlrll.Hon eti i'tlns H
de 1 X 10-3~pH = 3.
Vile s'oIution N tl'alCali 'compI~ieln'ent iclnisee uurait urie
conceiitrillid1\ en ions k+ tie i X 10-14 pH = 14.
Diie solution ~ d;aleaii aura une coD.'centratioh en i'ohs
a+ de i X 10-13 pH = 13. ; .
Pour transformer en pH nne concentration H + de
{l X W-P, 0,0, additionnera Ie logar!thme nit - p. ~x.2 X i(j~7;
l'og, 2 = 0,3, on aura 0,3 + (-7) = - 6,7 pH = 6,7.

DETERMINATiON DE LA CONCENTRATION EN iONS H+

Deux m61hooes peuvent eire utilisees pour determiner

'c'Ctte
2dnceb.'tration: }(I. ine~hdd'e ~l~ctt'on\~tri(}'ti'e '~ fa
methode colorimetrique imagitte-e par Sorensen.

M'ethode ettlctrom,etTtqu'e.

Ln il1eth~d~ electtometriqU'e est ta }:lIu'l\ 'e"lftte, mais

11 est ificontesta:ble q'Il~elte est d'a~plicatiofi ~l't'ls -deircate
que fa rn-etb<fde c()lotim~frique. Elle 'exige 'tin a')Jpren\\ssage
t1i~riq\te e't ptatique pluS'lo'ng, Me'es~ire un '3p'psreii'tage
telativentent coMellX et n\!st pas toujOI1'rs ais-emenbp\,lt-
tic'trb1e. TOlltef6i!> 'etle don'rte nux meS'O.Tes tL't'l'e ~ec'Uri'l'e et
'une 'conMince auxqueUel:! lfe S'::tur!lit prer~mi'rl:l1a mellrmte
colorimetriq'Ue poiSque l'ex~ritU'de de c'eUe-ci 1d~J1e'tl9 'de
l'aP'Preciafion 'd~s tei'tlfes pll'r l'ope'1'atl!ttt.
Dans Men des 'ca!>, il est indli'spelYSaMe 'd1aV'Oir I"e~onts
a ~'a rrtetlldde'etectronre'triq'lie, par exemp'le 'paur preparE1r
des sQtt'Ltigns'-types de pH co'nnu, conk&Ier ~es resultals
obtenus it l'"aide des i'lldicate?-rs et, surtout, aJu'sieT'a uil pH
c}onne les m,ilieux mem'e troubles ou tres cC?Iores ('industries
Je fermentation, preparation industrielle des peptone!; ott
des diastases, etc ... ). On aura egalement interet it lui
'i!ciiirier la 'preference pour I'aJustage de 1a reaction des
grandes quantites de milieux destines it 'la ·pr~ara>tion des
 ALCALINISArlON DES MILIEUX DE CULTURE 311

toxines microbienrtes, generalernent tres sensibles aux

variations du pH.
La determination de la con~ehtration en ions H par la
methode ~Iectrometrique consiste a mesurer la force elec-
trornotrice d'une pile constituee, Ie plus Sou vent, par
l'en1iemble d'uhe electrode it hydrogene (lame de pla-
tine, recouverte d'une couche de noir de platine sature
d'hydrogene, plongee dans la solution dont on veut me~
surer Ie pH), d'un electrolyte de liaison (solution de
KCI) et d'une electrode-etalon au calomel. L'electrode it
hydrogene est Ie pole negatif de la pile, l'electrode au
calomel Ie pole positif ; la difference de potentiel qui existe
entre eux est mesuree par la methode de compensation de
Poggendorf dans laqueUe la force electromotrice inconnue
de la pile est opposee it une farce electromotrice exacte-
ment connue. Un dispositif forme de rht\ostats it curseur,
d'un millivoltmetre, d'un galvanometre et d'un interrupteur
(clef de Morse)permet de faire varier et de mesurer la force
electromotrice d'opposition fournie par un accumulateur,
jusqu'it ce qu'eUe compense exactement la force electro,mo-
trice du systeme lame de platine platinee et hydrogenee
+ solution it analyser +
electrolyte de liaison elec- +
trode Itu calomel. Ce dispositif constitue ce qu'on nomme
un pofentiom~tte; ort peut Ie monter tres simplement,
qu.and (1n a sous la main l~s elements necessaires et nne
certaine pratiqtre des lDesl1res electriques, ou· bren se
procurer un des modeles qui ont ete construits specia-
let'nent.
L'un d'eux, tres simpHfie, a ete etabli, a l'intention des
laborntoires de bacteriologie et des industries biochi-
l'niqnes, par M. A. Arnomt, sur les donnees de M. Albert
Bel'thelot. 11 nollS parait utile de' Ie decrire sommaire-
ment, d'l1pres cet auteur 1, parce qu'il repond plus parti-
culierem~nt aux besoins des microbiologistes, notaml'nent
en Ce qui concetne I'ajustage des mi'lieux.
« Ce potehtiometre est contenu dans une boile, en bois
vetbi, l'n'Unie de \ris calantes. Le couvercle amovible abrite

1, Bulletin. d. la SocUtl! de Chl",l. biologique, nO 7, jUillet 1924, p. 683. Sur I~s

nvantages -duo contr6le electrontetrique de In reaction du milieu, voir du mems
nUteur : Reput .cfentlfique, ~1' mars 1922.
36 TECHNlfJOES GENJ5RALES

une tablette d'ebonite sur laquelle sont disposees cinq

+
bornes (fig. 6). Deux d'entre elles. marquees 2v - , doivent
etre reliees aux deux poles d'un accumulateur de 2 volts;
deux autres +E - sont mises respectivement en commu-
nication avec l'electrode au calomel (+) et l'electrode a H
(-). U ne borne interruptrice. montee sur une piece. de
laiton rectangulaire, permet de ne pas laisser l'accumula-
teur en circuit quand les mesures sont effectuees. Au

rr-'- Resistance
2V (8ccumu/atBiJr)

.-....O-:::c::::::==-~_ _ _ _-t
Borne 6 f'6Ul'ir
electrode hydrogene

Fig. 6.

centre de la platine d'ebonite est piace Ie cadran d'un

millivoltmeire aperiodique de precision, avec miroir sous
l'aiguille pour eviter les erreurs de parallaxe.- Sur un des
cOtes se trouvent deux curseurs dont l'un est dispose de
maniere a servir de vernier a l'autre. A l'une des e:lftremi-
t~s de l'appareil, est encastre un galvanoscope tr~s sensible
dont l'aiguille oscille entre deux fleches qui indiquent,
suivant Ie sens des deviatjons, comment on doit deplacer
les curseurs pour faire Ie zero. Un bouton interrupteur,
qui est en serie avec Ie galvanoscope" est place a gauche
de celui-ci. Un niveau a bulle d'air et un dispositif de
reglage permettent, avec les vis calantes placees sous l'ap-
pareil, de rendre celui-ci bien horizontal et de placer
convenablement l'aiguille du g·alvanoscope. Deux bornes,
reliees par une petite barrette de cuiv.re amovihle, donnent
la possibilite de substituer au galvanoscope un instrument
de zero plus sensible. d'une resistance ohmique plus
grande et presentant moins d'inertie.
« La graduation du Jllillivoltmetre est hahituellement de
1 volt diyise en 100; les divisions de 10 millivolts per-
ruettent la lecture facile a cinq millivolts et l'appreciation)
 .tLCALINISATION DES MILIEUX DE CULTURE 37

aisee, a la loupe, de 2 millivolts. Ce meme millivoltmetre,

pourvu d'une table d'etalonnage, presente l'avantage d'etre
a une seule sensihilite; pendant toute la duree des mesures,
il indique constamment lao valeur de la forc:e electro-
motrice. L'appareil est d'un tres faible encombrement;
quand il ne sert pas, tous ses organes sont parfaitement a
l'abri dans une boite hermetiquement close. .
ee Le millivoltmetre est place en derivation sur les resis-
tances it curseur qui permettent de faire varier la force
electromotrice entre Ies bornes E reliees aux electrodes.
Le bouton interrupteur et Ie galvanoscope - ou eventuel-
lement un galvanometre a miroir - sont places en serie
sur une des bornes E; par Ie jeu des curseurs, on arrive
r~pidemeni it faire equilibre a la difference de potentiel
qui existe entre les electrodes, et a obtenir que l"aiguille o'u
Ie miroir du galvanometre reste immobile quand on appuie
un court instant sur Ie bouton interrupteur A ce moment,
iI suffit de lire la force electromotrice indiqu~e par Ie milli-
voltmeire; c'est celIe qu'on desirait mesurer.
« .Employe avec les electrodes a hydrogene de W-.-M.
CLARK, de BUNKER, de HILPEBRAND, de SORENSEN, de
WALPOLE, etc ... , ou avec I'electrode a quinhydrone, il
permet de determiner Ia concentration en ions H tres
facilement et avec un degre de precision parfaitement suf-
fisant pour les applications en vue desquelles il a ete cons-
truit. A l'aide de l'electrode a hydrogene de HILDEBRAND,
qui permet l'emploi d'un agitatenr mecanique vertical et
l'usage de burettes, on peut tres aisement ajuster a un pH
donne la reaction des milieux, etablir des courbes de satu-
ration, apprecier I'effet tampon de certains composes,
preparer des liqueurs titrees acides ou alcalines, deter-
miner avec precision Ie point final des titrages acidime-
triques ou alcalimetriques en solutions troubles ou colorees,
et titrer les acidites ou les alcalinites apparentes et reelles
des produits naturels complexes.
(i Le potentiometre simplifie permet egalement d'assurer

la formation ou ·Ia redissolution de precipites dans des

conditions de concentration en ions H determinees, d'ap-
precier la reaction des sols et de determiner l'action satu-
rante de certains engrais ou amendements. Enfin, avec des
electrodes appropriees, on peut l'employer pour effectuer
38 TECHNIQUES GENERALES

les me!iures de potentiels d'oxydation au de reduction qui

ant tant d'applications analytiques.
« Ainsi que I'ont recommande divers auteurs,_ notamment
M. W.-M. CLARK, at comme A. Berthelot I'a lllontre :;tvec
un exemple a l'appui, il faut n'employer que des appareils
bien adaptes au but que I'on poursuit, et c'est peut.etre
pour avail' voulu etre trop precis dans des applications.
qui ne Ie comportaient pas, que certains experhnentateqrs
se sont prives des grands services que la methode electro~
metrique peut rendre dans I'industrie et dans les labora.-
toires bacteriologiques ou agronomiques.
« Ainsi que A. Berthelot l'a fait remarquer, ce potentia.'
metre n'a pas ete etabli ell vue des mesl.\res tres pn~cises
que necessitent les recherches des physico.chi.mistes et
certains CflS partieuliers des recherches hiol()gique!i. mais
il suffit amplement pour les usages courants, surtout glland
on l'am~/iore en rempiac:anl Ie galvanoscope par un galva ..
nometre srnsible. a cadre asse,;; rcsistqnt avec lecture pal'
lunette ou spot lllminel1x. Les determinations sont plus
rllpides et plus !Hires, en raison de Ia. precision avec
laqueUe on fixe l~ ze~Q, c'~st-a-dire Ie pQint OU les deu~
forces electromotrices se compensent exactement. On peut
aussi, quand on doit travailler seulement avec dd cQn..
centrations en ions H assez grandes, faire reduire la portee
de l'echelle du millivoltmetre de maniere a diminuer la
valeur des divisions. I)
Pour les travaux de haute precision on pourra se servir
d'instruments plus sensibles permettant de faire des mc~
sures it un vingtieme de millivolt pres et meme moins,
tel que Ie grand potentiometre de Chauvin et Arnoux em·
ploye avec un galvanometre sensible a miroir, a cadre de
plus de 500 ohms.
Dans Ia pratique des mcsures eIectrometriques, Ie choix
des accessoires est au moins aussi important que ceIui dl.\
potentiometre. Nous allons enumerer ceux qui conviepnent
Ie mieux pour les usage& courants :
Electrodes a hydrogene : Pour Ie titrage des solntionli Oll •
I'ajustage des milieux, l'electrode Ia plus pra'tique est cella
de Hildebrand (fig. 6) ; mai&, pour Ies mesures precises <le
pH, quaJId on veut eviter I'entrainement, par Ie barbotaga
d'hydrogene, du C02 en dissolution dans Ie liquide qu'9Q
 ALCALINISA.T1ON DES MILIEUX DB CULTURE a~

~nl;llyse, i1 f~"t opeJ;"c r avec lInc electrodll fflrmell C9wm~

Ie modele BirifoJ;"mtl de Mich~6Iis, Oll willij~ l'~lfilc\rodll l\
S~QQ",sses de W.-M; Clark. :Paul' l'et\l~e specitlle Qt}. ~~n,g
on peut recomroanoer l'electrode de Slilqn\~ at V\n~pt.
ElectrQd~$ a fJuil).nydrOne. - Qua.nq la liquBl~t dout ~"
veut mesur~r Ie pH renferme des substances Ijul\ceptibl~!i
Intre n~dllit6s Pill' l'hydrogene en prtsence dfl floil;" de!

Fig.7. Fig.8.
Electrode de Hildebrand: Electrode nu Cnlomel.

platine, I'electrode a hydrogene est inutilisable ; on la

remplacera alors, et meme dans bien des applications de
l' electrode a hydrogene, par l' electrode a quinhydrone de
Einart Billmann. Elle ne peut servir pour les solutions
dont Je pH est superieur a 9, et il faut tenir compte de ce
qu'elle est positive dans certains cas par rapport it l'tlectrode,
au calomel.
Electrode:; au calomel. - On le& preparer~ avec dl\
merCl,lre Pill', redistille, et du calomel it la Vapeur Codllx
1008 ; comme solution Qe KCI, q'Qi seryira egalelllent
d'(flectro1ytt:l de liai:ion. prendrll la liolutioll normale -
preparee avec dll chlorure de potassium !lieq pllr ~t ~o~~
40 TECIINIQUES GENERAiES

gneusement verifiee. - ~e vase 4 electrode avec borne

inferieure soudee (fig. 7) est tres commode, mais on peut se
conteriter d'un type mOlns codteux (mod. A. B. par exemple).
En outre, il est necessaire - sauf avec l'electrode a
quiJ?hydrone - de disposer d'une source d'hydrogene pur:
un tube d'hydrogene electrolytiquc constilue lao plus pra-
tique, a condition de la munir d'un 'robinet a pointeau, a
"is micrometrique permettant de regler bulle a bulle Ie
d'cbit gazeux. On se procurera aussi (de preference en
double exemplaire) un accumulateur de 2 volts, bien isole,
qu'on maintiendra toujours charge et qu'on entretiendra
soigneusement; une source de courant continu d~ 4 volts
est egalement indispensable pour hydrogener les elec-
trodes de pIa tine platinees.
II est bon d'avoir toUjOlll'S pretes deux electrodes de

Fig, 9. Fig. 10.

;\iont.ge de rele.trade it hydrogen. Difilpositif complet pour l'ajustnge d'un milieu
de Hildebrond. par la methode electromctrique.

Hildebrand et deux electrodes au calomel, afin de ne pas

etre oblige, en cas de panne d'electrodes, d'interrompre
un'e experience en cours. Enfin on devra preparer ou se
procurer tine solution-tampon rigoureusement exacte,
celie de Michaelis, par exemple, de maniere il verifier Ie
 AtCALINISATION DES MILIEUX DE CULTURE 41

bon fonctionnement du potentiometre et des electrodes

avant de commencer chaque serie de mesures.
Nous ne donnerons pas la technique detaillee de la
determination du pH ou de I'ajustage des milieux par la
methode electrometrique, car on la trouvera, avec toutes les
indications pratiques utiles, dans la notice que M. J. Bar-
taudy 1 a redigee sur les applications du potentiometre a ,
cadran de A. Berthelot. On consultera egalement avec
profit I"excellent ouvrage de W. Mansfield Clark 2: The
..determination of hydrogen iOIlS, ainsi que Ie chapitre special
du Manuel de techniques phgsico-chimiques de Michaelis s.
Pour transformer en pH ou en concentration en ions H
les forces electromotrices mesurees au potentiometre les
biologistes prefereront sans doute eviter les calculs et se
servir d'abaques ou de tables. Celles qui ont ete puhliees
par Schmidt et Hoagland, a I'Universitg of" California Press,
de Berkeley, U. S. A., et qui ont ete calcnlees pour des
lectures it 2 millivolts pres, leur donneront to ute satis-
faction.
Methode colorimtHrique.
Elle ~st basee sur :les teintes differentes que presentent
les solutions d 'indicateurs colores, suivant la teneur en ions
H + des milieux. Avec une gamme suffisante de ces
indicateurs, virant a des concentrations differentes en
ions H+, on peut determiner l'aciditc vraie d'un liquide
quelconque en ]e comparant a une concentration egale
avec des tubes etalons de p~ connu.
Ces dernieres annees, l'Ecole americaine a repris la
question avec une grande precision. Elle propose l'emploi
d'une echelle d'indicateurs tres sensihles, dont la plupart
appartiennent it la serie des sulfones phtaleines.
Ces indicateurs sont en pratique hicolores, jaunes e,n
solution acide, rouges ou bleus en solution alcaline. L'un
d'eux, Ja thymolsulfonephtaleine, peut etre employe comme
indicateur tricolore: outre Ie virage bleu vers pH 9, elle
offre un virage rouge vets pH + 2.

1. Etahlissements Pouienc, editeurs, Paris.

2. "illiams and Wilkin., edit., Baltimore U. S. A. 2' edition. r,'emploi de.
ndicateurs est cgalement expo~e en detail dons celouvrage.
3. l\Jnsson et ele , wiL, Pads, trnduction rmn~nise.
42 TECIlNIQtIES GENERAL~S

s~rga
!;g
9 90"~O
'"=
~

-
9 = Hd

I~
]
,....9
 ALCALINI8A,rJ0N DES MILIBU;c De CULTURE 43

TABLEAU II
Zone utile feH
Serie de Clark Limite (ulilisab e
Indicateurs de virage avec es milieux
virage colore. en joune)
pH
Thymol phlnleine suUonee
(hleu de thymol). • . • I'ouge it joune 1,2 - 2,11
Te Ir a hromophenolphlJl.-
Mine sulfoUl,e (bleu de pro-
mophcinol).. . . . . . jaune nu bleu 3,0 - 4,6 4,0 it 4,6
o rt b ocn r box, benzene
nzodimethylnniline. . • • rouge au jaune 4,4 - 6 4,4 it 6
DibromoortbQcresQI pbta.
leine sul£onee (pourpre de
bromocresol). . • • . . jnune au violet 5,2 - 6,8 5,4 it 6,6
D i bromotbr.mol pbta-
~ lejn6 suifoJ)el3 (!:ileu de bro-
mothymol).. . . . . . jaune au bleu 6 - 7,6 6, it 7,6
Phenolphto.leine sulfonee
(rouge de phenol). . • . jnune au rtlUge 6,8 - 8,0 6,8 it 8,0
Orlhocresolpbtaleine sul-
fomie (rouge q'l misol). , jnune aU rQugll 7,2 ~ Q 7,' a9
Thymol phtaleine sulfom\e
(bleu de thymol). . . jaune au bleu 8 - 9,6 8,6 i\ 9,6
Orllulcresolpblaleine .• tncolore a rouge &,2 - 9,8 9 a 9,6

Cette serie de 9 indicateurs permet 1a determination de

pH 1.~ i'I pE 9,8 avec llQe grande »ppro:J~j11latiQll, On
Qbtient. ):}QtJ.r chaqq.e lndi<;ateur, entre les de\lx poil;ltli
,6~tr~mes dll virllge indique:; dans Ie t<lbI~au ci-dessus, 'Vue
gamme df) coloratiQPI' asSez; differflnci¢ell; de pl\ls, les
intervaIIes de virage pour les differents ip<!icateurli CheVqll"
chent les uns sur les autres, ce -qui permet de n~ laisser
aucun point douteux sans controle.
La methode la plus simple de determination de pH dans
'une solution coqsistera a comparer la couleur obtenue avec
une meme concentratieln d'indioateur sur Ie liqui'de a exa-
miner et sur des tubes temoins de concentration pH
connue.

Preparations des $Qll,1tiQ(lS meres d'indicateurs.

a) Sulfones phtaleines. - 0 gr. 1 de matiere colorante

en poudre est mis en solution dans un peu d'eau (15 cc.
environ) additionu~e de n cc. (variable su,ivant l'indicateur)
de solution de soude Nj20; on opere dans un petit vas~
d'Erlenmeyer et on chauffe. Apres dissolution, on eten~
44 TECHNIQUES GENERALES

d'eau it 500 cc. dans une fiolejaugee I; On a, de la sorte, des

solutions d'indicateur it 0,02 %.
n = 5 CC. 7 pour Ie rouge de phenol;
= 5,3 rouge de cresol;
= 4.3 bleu de thymol;
= 3 bleu de bromophenol;
= 3,2 bleu de bromothymol;
- 3,7 pourpre de bromocresol.

bj Rouge ·dc· Methylc. - On Ie dissout a raison de

o gr. 1 dans 300 ce, d'alcool et on amene it 500 cc. avec de
l'equ = 0,02 %.
, c)Orthocresolphtaieinc. - Solution it 2 % dans l'al-
cool.

Preparation des etalons de concentration iortique.

10 Bchelle de pH 1 a pH 10 de 0,2 en 0.2: -

Pour etablir ceUe echelle, il faut tout d'abord preparer les
solutions suivantes :
a: Une solution de NaOH Nj5. Le mieux est de l'etalon-
ner sur une solution d'acioe sulfurique 'N(5 preparee par la
methode decrite dans tous les ouvrages de chimie analy-
tique, ou sur une solution de phtalate acide de p~tasse pre-
paree comme ci·dessous.
La solution de soude devra etre garantie contre l'action
de C02.
b. La solution Nj5 de phtalate acide de potassium. Dis-
soudre 40 gr. 828 de phtalate acide pu.r et amener iI.'11itre
avec de l'eau distillee dans une fiole jaugee,
c'. Solution Nj 5 de phosphate acide de potassium
PO'H2K, Dissoudre 27 gr. 231 de PO~H2K pur, recris-
taUise, seche it 1000 , et amener a un litre.
d. Solution double d'acide borique N/5 et de chlorure d~

1. Nousdirons une rois pour tOlltes que reau a employer dans tautes ces operations
doit etre de reau distillee Bussi pur~ que possible et bouillie avant remploi pour.,
chasser CO'. La verrerie it utiliser doit etre en vcrre neutre, e'est-:\-dire ne cednnt
pas d'alcall a reau.
 ALCALINISATION DES MILIEUX DE CULTURE 45

potassium N/5. Dissoudre 12 gr. 405 d'acide borique secM

a rail', a poids constant, et 14 gr. 912 KCI pur; amener a un
litre.
e. Solution de chlorure de potassium N/5 14 gr .. 912 KCI
pur par litre.
f. Solution d'acide chlorhydrique N/5 Pl'eparee avec
HCI pur et titl'ee sur la solution de soude a.
A l'aide de ces solutions, on pOUl'l'a preparer l'echelle de
solutions sqivante de pH determine:

Tabledonnantla composition de melanges de pH connu

a des intervalles de 0,2 a temperature = 20· (Clark
et Lubs),
TABLEAU III
pH:
1.050 cc.KC1N/5 + 97,Occ.HC1N/5comp1.200cc.av. H'O:
1,2 » + 64,5 »
1,4 » ,+ 4 1 , 5 » »
1,6 » + 26,3 »
1,8 + 16,6 »
2,0 + 10,6» »
2,2 + 6,7 »
2,2 50 cc.Phtalate acide de K N/5 + 46 cc7 HCl N/5 completerit200ec.;
2,4» + 39,6 »
2,6» + 32,95 » »
2.8 » + 26,42
3,0» + 20,32
3,2 + 14,7
3 4» » + 9,9 »
3.6» )) + 5,97 »
3,8» » + 2,63 »
4,0 50 cc. Phtalate acide de K N/5 + Occ-t Soude N15 com pleter a200 ce. ;
4,2 » + 3,7 '" »
4,4.» » + 7,5 )). »
4,6 + 12,15 » »
4,8 » + 17,7 »
5,0 » + 23,85 »
5,2» » + 29,95 »
5~» » + U~5
5,6» » + 39,85 » »
5,8» » + 43.0 »
6,0» » + 45,45 ))

6,2 + 47,0 »
5,8 50cc.Phosphateac.deKN/5 + 3""72 'Soude N/5 eOl1lplet~r it 200cc. ;
6,0» »' + 5,70 » »
6,2» + 8,6 » })

6,4» + 12,6 » »
46 tEct:lNIQUES GltZI(ERALES
6,6 50 te. Phosphllte ac. de KNj5 -+' 17,8 Soude N/5 eompWer ii 200 ee.
68» ~ + 23,65 n »
,~» » + 29,M »
7,2» » + 35,0 » »
7,4 J) + 39,5
7,6» + 42.8 » »
7,8» » + 45,2 »
8,0» + 46,8 »
718 50 ce.Ac.Borique N/5 Kel N/5 + 2"61 Soude N/5 eomplCtllril 200ce.;
8,0» » + 3,97 » )'
8,2» » + 5,9 ),

. 8,4» » + 8,5 )l

8,6» » + 12,0 »
8,8» » + 16,~ » »
9.0» n J + 21,3 » )l

9,2») » + 26,7 » »
'9,4» » + 32,0 J)

9,6» » + 36,85 » »
11.8 + 4{),8
10,0» » + 43,90 »

Pour etablir l'echelle colorimetrique, mesurer exacte,

ment. dans des tubes en verre neutre, bien calibres, 10 cc.
de chaqtre solution et ajouter 1 cc. de solution d'indicateur
a 0,01 % (solutions meres diluees un~ fois). Faire une
serie pour chaque indicateut dans les Ii mites de son virage
indiquees au tableau 2. On opere en tubes prealablement
etires et on sceUe a la lampe apres remplissage.
Pour determiner Ie pH d'une solution quelconque, on
essayera la reaction de cette solution sur les huit in<Uca-
teurs. On mesure exactement 10 cc. de la solution aans
8 tubes differents ; a chaque tube on ajoute 1 cc. de solution
a 0,01 % d'un des indicateurs.
Pour des pH 1,2 a 9.8, Ie'S tubes seront hors serie avec
certains indicateurs, mais il en restera au moins un qui
presentera une teinte pouvant se classer dans une des
series de tubes etalons. On peut utiliser, pour finir 1a deter-
mination, Ie petit cu\Uparateur dont il sera'questiun a pro-
pos de l'~ustement des milieux a un pH donne. L'emploi
de cet appareil est indispensable dans Ie cas d'une solution
coloree par eUe-meme.

20 Ec"elles pH 6,6 a pH 8. - En general. en hio-

logie (determinatro,n de la concentration en ions H+ de
liquides organiques, ajustement d'un milieu de culture a pH
determine, etc.), on pourraoperer avec une echeUe d'etal'ons
 ALCALINISATION nES MILiEUX DE CUL1'VRE 47
}ji~n ruoins etendue. La phenolsulfonephtalein~ sera Ie· senl
indicateur employe.
1l'e Fotmule. - Un mtflange simple de phosppates sett it
l>l'~pArer les etalons.
bh preplir'era :
a. Solution N/5 phosphate monopotassique
9 gr. 078 de sel recristaJlise, secM it 1000 it poids cons-
taM, !>O"nt dissbus dans 500 ec a'eau; on ajoute 45 ce. 5 de
solutlOIi d1iddicaleur (ph~b.olsulfortephtaleine) a 0,02 % et
on complete it 1.000 dans'une fiolejaugee, aVec ae l'eau 'dis-
tiil~e.
b. Solution Nt 5 phosphate disodique :
Le sel commercial pur est it 12 H20; on l'ellen-rit en cou"
che mince it temperature-ordinaire (1·8~20o) it poids constant;
l'operation demande 8 it 15 jours. On obtie_nt Ie sel
P04Na 2H+2H aO.
11 gr. 876 de ce sel sont dissous dans 500 cc. d'eau ; on
ajortte 45 cc. 5 de solution de phenolsulfonephtalcine it
0,02 % et on torrtplete it 1.000 cc. avec de l'eau.
A l'aide des deux solutions preccdentes, on prepare, dans
urte fiole jaugee de 100 ce., la serie suivante_ d'ctalons
(SORENSEN) :

C01111losition des melanges lie phos~hafus dondb.nt des

solutions de pH 6,6 a pH Rde 0, I en 0, t.

TABLEAU IV
B8 "c. FO~HNa2 N/15 amenes a 100 cc. avec la solntl<1n N/15 de- PO'HK' = 'pH 6,6
43,5» » » » = ,pH 6,7
49,5» » » » = pk-6,1!
55,5»» » =' pH 6,9
61;0» ,., pH 7,0
,66,5 » » = pH 7,1
'12,0» » » » = pH 7,2
76,1;.» » » » = pH 7,3
'110,5» » • ». = pH '7,4
84,<l» » » » = = PH 7,5
86,5» » » = pa ;,6
~ »=~~
91,3» » ,[ » = p1:J.17,8
93;0» » » » = pil7,9
!!4,5» " » ". =
'pH 8,0

~~e. -- Uue autre J01'mule permet 'd'obtenir -des

48 TECHNIQUES GENERALES

solutions etalons de meme ordre; on emploie alors seule·

ment Ie phosphate mono-potassique et la soude titree.
A. Solution de POjH~K N/5 : peser 13 gr. 613 de sel
recristallise, seche a 100° a poids constant, les dissoudre
dans 300 cc. d'eau chaude. Refroidir, ajouter 91 cc. de solu-
tion de phenoisulfonephtaleine a 0,02 %. Amener a 500 cc.
dans une fiole jaugee avec de l'eau.
B. Solution de soude N/lO exactement titree sur un aeide
de titre connu (conserver a l'abri de C02). On n'ajoute pas
d'indieateur it la solution B.
Avec ees deux solutions, on fait les melanges suivants
dans une fiole jaugee de 100 ce. :

Melanges de PO'H2K et de sou de donn ant des solutions

pH 6,6 a pH 8 de 0,2 en 0,2.

TABLEAU V
SOLUTION N/5 P04H2l{ SOUVE N/IO A~IENER AVEC DE L'EAU A pH
25 ce. 17 ce. 80 100 cc. 6,6
25 ce. 23,65 100 ce. 6,8
25 ee. 29,63 100 ee. 7,0
25 ee. 35,00 100 ee. 7,2
25 ee. 39,50 100 ce. 7,4
25 ee. 42,80 101) ee. 7,6
25 ee. 45,20 100 cc. 7.8
25 ee. 46,80 100 ce. 8,0

Que ron emploie l'une ou l'autre formule de phosphates,

les solutions etant faites, on remplit des divers melanges
une serie de tubes Mires, en verre neutre ; on les seeIIe a la
lampe et on indique sur chaque tube Ie pH correspondant.
Les gammes d'etalons se 'conservent longtemps si on les
garde a I'abri de la lumiere.
Pour la determination du pH dans une solution
quelconque dans les limites de 6,6 a 8, mesurer exaete-
ment 10 ce. de la solution et ajouter 1 ce. de solution a
0,01 %. de phenolsulfonephtaleine. Chereher sa place dans
I'eehelle etalon. OpereI' avec Ie eomparateur Merit ci-
dessous dans Ie cas d'un liquide dont la coloration propre.
peut masquer ou modifier 1a teinte de l'indieateur.
Ajustement de la reac;tion d'un milieu ~e c.ult~re.
 ALCALINISATION DES MILIEUlf DE CULTURE 49

Pour l'ajustement de la reaction d'un milieu de culture

a un pH donne, on se trouve dans Ie cas d'un Iiquide 'd'Ont
la teinte plus ou moins jaune brun (bouillons, infusions, etc,)
peut modifier la teinte de l'indicateur.
On opererasur les milieux fraids et on utilisera Ie c'ompa-
rateur. Ce petit appareil est un simple bloc de bois percc,
a la face superieur~, de six trous en 3 rangs de deux, au
calibre des tubes a essai employes; les tubes a essai entrent
dc la moitie dc leur longueur dans Ie bloc de bois, comme
dans un porte-tube ordinaire. Deux des. faces laterales sont
pleincs, les deux autres sont percees de trois fenetres qui
elonnent Ia lumiqre au travers d~s trois rangs de deux tubes.
On dispose pour chaque essai les tubes dans l'ordre sui-
vant:
Fenetre
I II III
Elalon Eau pure Etalon

pH <pH Ii oblenir pH> pH it obtenir'

IV V VI
Milieu Milieu Milieu
sans illdicateur a ajuster sans indicateur
+ Indicateur
Ob .•ervaleur

Dans ces conditions, Ie changement de teinte propre u'la

coloration du milieu se trouve compense du fait de 1a
presence du milieu dans les trois champs de vision.
On ajoute au tube V, qui renferme 5 cc. de milieu exacte-
°
ment ,mesure, cc. 5 d'indicateur (pheno!sulfonephtaleinii)
a 0,01 %. ~vcc une microburette (pipette de 1 a 2 cc. divi-f'
sce en dixiemes et munie d'un petit tube de caoutchouc
avec une pince it pression), on laisse tomber, dans ce tube,
une solution de soude N/20 jusqu'a ce qu'on ohtienrie une
teinte intermediaire entre celles des deux etalons I etH vus
au travers des tubes de milieu IV et VI.
La solution de sou de N/20 a employer s'ohtient en melan-
g~ant 500 cc. de soude N/10 avec ,,91 cc .. de phencil~ulfo­
nephtaleine it 0.01 % et completant a 1'.00(} avec de l'eau·
Connaissant Ie volume n de la solution de sou de N /20 neces-
saire pour amener n. cc. du milieu a la reaction·vou}1ie;.lc
MICROBIOLOGIE: 4
.50 TECHNIQUES GENERALES

nombre de·centimetteseubes x de solution N desoudea'ajou-

ter it ·1 litre de milieu pour l'amener au pH oherche sera
X = 10n

Par un petit dosage analogue, on pourra determiner la

.quantite d'acide produite par fermentation sur un milieu de
pH connu au depart de la culture. 11 sera bon de centrifu-
ger dans ce cas pour avoir un liquide clair.
Les sucres s'alterent au cours de la sterilisation des
milieux par chauffage, surtout lorsque leur reaction est
nIcaline, et ils modifient Ie pH. II convient de les steriliser
.it part, en solution aqueuse, et de ne les ajouter aux milieux
qu'apres Ie chauffage definitif a l'autoclave.

D. - METHODES OOLORIMETRIQUES SANS SOLUTIONS

SPECIALES

Ces methodes permettent de determiner Ie pH sans em-

ployer de solutions Malons.
Melhodede Michaelis. - Un indicateur monocolore comme
Ie nitrophenol developpe sa couleur avec Ie maximum d'in-
tensite au terIne du virage du cote alcalin ; a egale distance
entrece pointet Ie terme du -:irage du cOte acide,l'inten-
site totale est moitie moindre, et, par suite, on obtient la
mem~ t~inte qu~ si on e,?ployait moitie m.oins Id'i,ndicateur
a lit lImIte alcahne de vlrage. On constrmt une echelle en
:ajoutant a une lneme solution alcaline des quantites crois-
santes d'indicateur.
Methode de Barnett et Chapman. - A egale distance des
limites acide et alcaline de virage, Ia teinte obtenue avec les
indicateurs bicoiores de Clark et Lubs est un melange a
parties egales de la couleur acide et de Ia couleur aIcaline.
,De meme, lorsqu'on met la moilie de l'indicateur dans une
'solution acide et l'autre moitie dans une solution alcaline,
la nuance observee est mixte.
Technique d'apres Medalia - On met dans sept tubes
10 cc. de soude'N/20 et dans sept autres 10 cc. d'acide chlo-
·rhydrique aO,! %. Puis on ajoute it la premiere ~erieO, 1 0,2 ...
·0,7 de somtion d'indicateur; et dans la seconde 07,0,6 .. ,
0,1 de In meme solution. On forme ainsi sept paires de tubes
'dont chacune contjent 0,8 d'indicnteur. A 10 cc. du liquide
 ALCALINISATION DES MILIEUX DE CULTURE 51

a examiner on ajoute egalement 0 cc. 8 d'indicateur. On '

compense Ia couleur propre du milieu a I'aide du compara-
teur a2 rangees de 3 trous. Dans la premiere ran gee 00 dis-
pose les tubes dans l'ordre suivant : tube. contenant Ie
milieu sans indicateur ; tube aeide et tube alealin ; dans la
seconde, tube contenant Ie milieu. additionne d'indicateur
et deux tubes d'eau distillee.
On' emploie les indieateurs de Clark et Lubsoen solution
a O,2p. 100, sauf'le rouge de phenol quidoit etre a 0,04%.
Pour Ie hleu de thymol, 10 zone aeide: onajoute 0,5 p. 100
d'RCI dans les tubes les plus acides et 0,001 p. 100 dans
les moins aci~es, qui representent la serie a'lcaline ; 20 zOne
alcaline : HCI a 0.001 p 100 dims Ies tubes acide's. Pour
Ie bleu de bromophenol, NaOHN/200 dans les tubes alca-
lins.
Le pH des couples s'etablit par comparaison de la teinte
obtenue avec celle des solutions etalons, Le point de demi-
'virage, c'est-a-dire Ie couple qui a la meme quantile d'indi-
cateurdans les deux series, a les pH suivants :
BIen de thymol • . . 2.0
Bien de bromophenol . 3,87
Rouge de methyle . . 5,01
Violet de bromocresol. 6,28
Bleu de bromothymol . 7.08
Rouge dB phenol. • 7,77
Rouge de cresol. . . 8,13
Bleu de thymol. • . 8,86

Ces chiffres doonent Ie pH de Is' 4 e paire'; pour la 3 e et Ia

6e on rettanche ou on ajoute- 0,2.; pour la 2 e et Ill. 6e , {),45 ;
pour la 1 re et la 7e , 0,80. Les resuitats sont exacts a 0,05
~u 0,1 pres.
 CH!1P1TR!1 V

METH_ODES ,DE PREPARATION DE~ MlLIEUJa

DE CULTURE USUELS

NOTA. - Les milieux de culture destines aux inoculations

doivent, en general, etre prepares sans peptone.

A. - Preparation du bouillon de viande.

(Bouillon simple, non peptone) I,

500 grammes de viande de beeuf ou de veau, debarrassee

de graisse et de tendons, sont haches finement au hache-
viande. I
On met ce hachis dans un bocal dans Iequel on verse
1 litre d'eau du robinet, froide. On remue un instant avec
une cuiller de bois. On Iaisse en repos Ie,bocal couvert
d'un Iinge pendant quatre heures, temps suffisant pour la
dissolution de toutes les substances nutritives. On remue
encore it Ia cuiller et on verse Ie contehu du bocal Jans une
marmite emaillee qu'on porte sur Ie feu. On chauffe douce-
ment et on laisse bouillir lO'minutes en remuant 'constam-
ment avec la cuiller de bois. Les matieres albuminoides
sont ainsi coagulees.
On filtre ensuite Ie melange sur un Hnge de· toile et on
verse Ie liquide dans une autre marmite. On exprime la
viande cuite restee sur Ie linge. en tordant fortement ceIui-
ci, pour en faire sortir tout Ie jus On laisse refroidir et on
filtre sur papier mouille pour retenir les particules de
graisse entrainees mecaniquement.
On aicalinise ensuite avec une solution de soude pure it

1 Pour 1a preparation des bouillons destines II l'obtention des toxin.. diphte-

rique ou tetanique, voir respectivement les chapitres XXVI et XXXIX. La viande de che-
val ne doit pas eire employee pour la preparation des milieux de culture en general.
Beaucoup de microbes poussent tres bien dans Ie bouillon de cheval, mais certains de
leurs caracteres (chromogenie surtout) s'y trouvent modifies.
 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE 5q
1 p. 10 qU'OD verse goutte a gout~e, en agilanl forlemenl Ie
liquide dans lequel on a plonge un gros fragment ,de. papier
de tournesol bleu qui rougit aussitot et un autre fragment
de papier de tournesol rouge. Quand les deux papiers
prennent une teinte legerement violacee, la neutralite est
ohtenue. (Pour Ia culture de Ia plupart des microbes patho-,
genes, il convient de pousser l'alcalinisation .un peu plus
loin: on ajoute alors, par litre, 5 a 7 cc. 5 de lessive nor-
male de soude.) II se produit un trouble du it la precipita-
tion des phosphates alcalino-terreux.
On porte ensuite Ie marmite it l'autoclave, on chauffe sous
pression a 1200 pendant 20 minutes, puis on filtre sur papier
Chardin. Le bouillon fiItre est recueilli dans des ballous,
ou reparti en tubes qu'on bouche a l'ouate (non hydrophile)
et qu'on sterilise de nouveau a 115 0 seulement, pendant
20 minutes.
Le mem~ bouillon peptone et sale se prepare en :).joutant
au liquide, avant l'alcalinisaiion par la soude, 20 grammes
de peptone et 5. grammes de sel de cuisine par litre.
Dans les Iaboratoires de serotherapie, OU 1'0n peut dis-
poser des caillots de sang proven ant de la saignee des ani-
maux producteurs des serums therapeutiqucs, il est tres
recommandable et economique d'employer ces caillots, au
lieu de viande, ~ Ia preparation des bouillons de culture
destines aux analyses d'eaux d'alimentation, pat exemple.
Voici comment il convient de les utiliser :
On pese 1 kilogramme de caillots (fragmentes grossiere-
ment avec Ia main ou avec une cuiller de bois) et on y
ajoute 1 litre et demi d'eau. On laisse en contact pendant
24 heures a 18 temperature du laboratoire en remuant de
temps en temps la masse. On filtre celle-ci sur un Iinge de
toile et on porte Ie filtrat a l'autoclave a 1150 pendant une
demi-heure. On filtre ensuite, de nouveau, sur un linge
d'abord, puis sur uq entonnoir garni d'ouate hydrophile. Ce
liquide rem place la maceration de viande.
On pent, a Ia rigueur, rem placer la maceration de viande,
lorsque celle-ci fait defaut, par une maceration de levure de
brasserie on de distillerie, preparee de la fa\;on suivante:
On purifie d'abord la levure en la mett:mt en suspension
dans une grande quantite d'eau (20 litres par exemple pour
2 kg. 500 de Ievure pressee) dans laquelle on verse, par
54 TECHNIQUES GENII;.HALES

petites portions, 150 it 200 grammes d'acide chlorhydrique.

La levure se depose en flocons. On decante et on rejette Ie
liquide surnageant ; on recueille la levure sur un linge, on
l'essore et on en fait macerer 2 kg 500 dans 4 litres d'eau
de conduite. On porte sur Ie feu et on fait bouillir pendant
quelques instants en agitant constamment avec une cuiller
de bois. On ajoute encore 5 litres d'eau de conduite. On
lai8se la levure se deposer pendant 3 heures et on filtre. Au
liquide clair recueilli, on ajoute 10 grammes de peptone
et 5 grammes de chlorure de sodium par litre. On neutra-
lise, on sterilise it 1150 et on filtre.
Ce milieu peut servir it cultiver la plupart des microbes
de l'eau ou de I'air et beaucoup de microbes pathogenes.
On peut aussi employer Ie bouillon de legumes d' Albert
Berthelot:
Dans 41itres d'eau, on met 300 grammes de pommes de
terre de Hollande, it chair jaune, pelees et coupees en
morceaux menus, 150 grammes de caroites et 150 grammes
de navets. On fait bouillir 4 heures jusqu'a reduction a 3
litres. On passe sur toile fine et on ramene a 3 litres par
addition d'eau distillee. On alcalinise faible!uent (au tour-
nesol) avec de la soude. On sterilise a l'autoclave, on laisse
reposer 24 heures en glaciere et on filtre sur papier: On
repartit et on sterilise 20 minutes a 115°.
Ce bouillon sans peptone convient parfaitement pour la
culture des microbes-vaccins. On peut Ie gelatiniser ou Ie
geloser;
Les champignons y poussent bien, a la condition de ne
pas l'alcaliniser a la soude, d'y ajouter 2 a 5 p. 100 de malto·
peptone et, s'il ya lieu, 2 a 10 p. 100 d'un hydrate de Car-
bone.
On peut Ie peptoner en l'additionnant de son volume de
peptone de Martin ou de 15 a 20 grammes par litre d'une
peptone seche, convenablementchoisie.

B. - Preparation du bouillon a l'extrait

de viande Liebig.
Peser 5 grammes d'extrait de viande Liebig qu'on fait
dissoudre dans un litre d'ean tiMe a 500u 55°. Ajouter :
peptone 10 grammes et selmarin 5 grammes, Neutraliser
 PR£PARATlON DES MILIEUX DE OUL"1'ORE 55

en suite, comme pour Ie bouillon ordinaire, jusqu'a ce que.

Ie papier de toursenol rouge vire nettement au bleu. Porter
a l'autqclave a 1200 ,20 minutes. Filtrer sur papier (:'hardin.
Repartir en ballons ou en tubes ·et steriliser a 115~. 20 mi-
nutes.

C. - Preparation de reau peptonee simple ...

Solution de 20 a 30 grammes d'une peptone seche (lans

un litre d'eau distillee. On fait bouilJir et on neutralise
a la soude pendant l'ebulJition. On filtre sur papier, on I
repartit en tubes a essai ou en matras et on sterilise ~,1l5o
pendant 20 minutes.
Nola. - Pour l'emploi des peptones commerciales dans
Ia preparation des milieux de culture, il importe,de savoir·
que ces substances presentent entre eUes de gran des diffe~
rences de composition. Celles qui sont obtenues par di·/
gestion pepsique, par exemple, renferment tantot une forte
proporti,on d' albumoses; tan tot ,une faible proportion de
celles-ci. avec beaucoup de peplollBs vraies ; tantO! des
polypeptides tres complexes. Dans les peptories panCrea-.
tiques, la degradation des proteiques est plus ayancee.
Aussi y trouve-t-an surtout de') melanges de polypeptides
de plus en plus simples, avec Ul)C proportion souvent.
elevee d'acidcs amines libres Enfin, a ces variations
resultant du mode de preparation, viennent s'ajouter
celles qui sont liees it Ia nature de Ia matiere premiere,
mise en reuvre: viande, poisson, foie, caseina, fibl1ine,
gelatine, sang, etc.
II n'est donc pas surprenant qu'avec un meme germe et
pour un meme pH, plusieurs peptones commerciales
donnent des resultats differents. les unes favorisant sur-
tout Ie developpement du microbe,les autres modifiant
les proprietes pathogenes ou toxigenes.
Dans les travaUx courants on aura donc interet a em-"
ployer la peptone Martin, si economique et si facile a pr.e:-
parer au laboratoire (voir plus loin). Lorsqu'on devra se
servir de peptones commerciales on .o.onnera la preference,
pour Ia preparation d~s milieux usuels, a une bonne peptone
pepsique de viarule. de breuf, saufpour l'etude speciale des
56 T_ECHNIQUES GENERALES

germes non proteolytiques des putr~factions ou de la

flore intestinale auxquels convient mieux, generalement,
llne peptone pancreatique de viande de hamf. C'est cette
derniere peptone que 1'0n choisim egalement dans les re-
cherches sur les proprietes biochimiques des microb~s.
Pour I'etude particuliere de certaines fonctions des bacte-
ries et pour Ia preparation de bonnes toxines ou de grandes
quantites de corps microhiens, ou encore pour Ia produc-
tion economique de virus destines a la destruction des
animaux nuisihIes, on aura avantage a essayer des peptones
d'origi'ne et de composition diverses Lorsqu'on aura fait
choix de la meilleure. on demandera au fabricant un bulle-
tin d'analyse et on exigera ens\lite un produit repondant
toujours aux caracteristiques de l'echantillon essaye.
D'une maniere generale, on ne devrait jamais designer
dans les publications scientifiques nne peptone par son
seul nom commercial. Mieux vaudrait indiquer son origine
et son mode de labrication, par exemple :
Peptone pepsique de viande de bamf, marqcze X.
Peptone pancreatique de caseine, marque Y.
CeUe precaution est d'autant plus indispensable que
certains fahricants de peptones qui, a l'orig-ine, n'en prepa-
raient qti'un senl type, meltent parfois en vente, sons la
meme marque, de nombrenses varietes obtenues llar des
procedes tres divers, a partir de tontes sortes de matieres
albuminoides. I
II serait encore plus rationnel d'indiquer, avec la nature de
la peptone employee, quelques caracteres physiques et chi-
miques faciles a determimer. Cette remarque s' applique egale-
ment aux peptones preparees au laboratoire (A. Berthelot).

D. - I1reparation du bouillon tviartin (pl'ocede

recommande).
1 Solution de peptone. - On prend cinq estomacs de
0

porc qu'on laye a grande cau et qu'on passe au hachoir,

~i'pres avoir enleve la graisse adherente.
On fait une maceration de ce produit hache, dans les pro-
portions suivantes :
Estomac de porc hache. 200 gr
Acide chlorhydrique pur 10 cc.
Eau tiede it 500 • . • 1 litre.
 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE 57

On laisse dans un bain-marie, a 500 environ, pendant

24 heures I, Ensuite on porte a l'autoclave (non boulonne) et
on chauffe a ] 00 0 pendant une demi-heure. On verse sur un
tamis recouvert de caton hydrophile.
On neutralise Ie liquide filtre et chaud en ajoutant de la
soude alp. 10 au du ~arbonate de soude alp 10, jusqu'a
ce que Ie papier rouge de tournesol bleuisse nettement.
On filtre sur papier et on nlpartit en ballons de 1 litre,
par 500 grammes On sterilise a'115° pendant une demi-
heure pour conserver.
2D Maceration de viande. - On fait macerer pendant 20 a
24 heures, a ret~ve II 37 0 , 500 grammes de viande hachce,
dans 1 litre d'eau.
On passe a travers un linge, on exprime Ie jus et on
ajoute 5 grammes de sel marin.
30 Melange {tnal. - On melange 500 grammes de solution
de peptone a 500 ·grammes de maceration de viande. On
chaufl'e a 70 0 et on alcalinise legerement avec de la soude.
Pouda culture du bacille de la diphterie, on neutralise d'a-
bard exactement avec la soude et, Iorsque Ie papier de tour-
nesol rouge commence a bleuir, on ajoute au liquide, par
litre, 7 centimetres cubes de lessive normale de soude (fl
40 p. 1.000).
Porter a l'au to clave a 1200 pendant 15 minutes~ Filtrer
sur papier Chardin, repartir en ballons au en tubes et steri-
liser a 1150 , pendant 20 minutes.

E. - Preparation de Ia gelatine nutritive.

On prepare du bouillon de viande ordinaire, au du

bouillon peptone a l'extrait de viande Liebig et, en meme
temps qu'on additionne celui-ci de peptone et de sel marin,
on ajoute 150 grammes (par litre) de gelatine en feuilles 2
que ron fait fondre.dans Ie liquide chaud en agitant avec
la cuiller, sans depasser la temperature de 800 •

1. Ou un temps moins long si I'on desireobtenir une peptone plus riche en albu-
mO'les.
2. On emploie Ie plus sQuvent, dansles laboratoires franc;ais, ]n gelatine marque Coi-
gnot (doree) qui est excellente. Cest une gelatine d'os.. Elle fond it 25". Dans 1••
pays chauds on peut avantageusement se servir de gelatine de poisson au colle de
po~son (prcparee avec les vessies natatoires d'esturgeons) et qui n'est fusible qu'a 30 0 •
58 2'ECHNIQUES GENERALES

an neutralise cnsuite (la gelatine est toujours t·res acidc)

ct on alcalinise legerement avec 5 centimetres cubes de
lcssive de soude .normale, de telle sorle' que Ie papier de
tournesol rouge bleuisse un peu.
On porte a l'autoclave et on chauffe 10 minutes a 110·
seulement, dans la marmite emaillee.
AU'sortir de l'autoclave, on laisse refroidir jusque vers
609, puis on colle la gelatine avec une solution de blanc
d'reuffaite en battaQt un blanc d'reuf dans un verre conique
avec 50 ou 100 centimetres cubes d'eau qu'on verse par
fractions, en agitant fortement, dans Ie bouillon gelatine.
On reporte de nouveau ul'autoclave. On chauffe 10 minutes
a 1150 et on filtre dans un entonnoir a chaud. Repartir en
ballons ou en tubes qu'on sterilise de nouveau 10 minutes
a 1150 et qu'on solidifie suivant les besoins, inclines ou
droits.
Certaines gelatines ne se solidifient plus lorsqu'on les a
chauffees sous pression a 1150. Mais cela est rare. II faut
al6rs steriliseI' seulemenT a 1000 par chauffage discontinu,
nne heure chaque fois, trois jours de suite, dans rautoclave·
non boulonne.

F. - Preparation de la gelose nutritIve.

On prepare du bouillon de viande normal, ou du bouillon

Martin, ou du bouillon a l'extrait Liebig et, apres lieulralisa-
lion et alcalimsation Legere on ajoute par litre, 15 grammes
de gelose 1 qu'on a prealablement coupee 'en fragments,
lavee et fait gonfIer pendant quelques heures dans un peu
d'eau. Cetto gelose, exprimee, se disso~lt dans Ie bouillon
chaud qu'on maintient auxenvironsde 1000 , en agitantavec
la cuiller.
Lorsque la dissolution est achevee, on veri fie la reaction'
qui doit etre toujours un peu alcaline. Sinon, on ajoute:
quelques gouttos de solution au 1/10 de carbonate de soude,.
jusqu'a ce que Ie papier de tournesol bleuisse, et on ajoute

1. La gelose au agar-agar cst ournie par diverses algues particulierement aban'"

dantes dans les mersde Chine. Ce sont : Gelidtum cartilagmeum au ('0 ntUm. Graci..
laria Itchenolde8, b.ucIlema 8pino8um, etc Elle n'est fusible qu'au-dessus de 40° Elle a
un pouvoir f'ixateur considerable, par exemple "is-a·vis de l'alexine des serums frais ...
 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE 51)

encore 5.cc. de lessive normale de soude. On laisse refroi-

dir aux environs de 60 0 et on colle h gelose au blanc
d'reuf, en melangeant a toute la masse de bouillon gelose
(par petites portions et en agitant fortement, un blanc
d'reuf qu'on a bauu a part dans un verre conique avec
50 ou 100 cc" d'eau.
On porte alors la marmite contenant Ie bouillon gelose a
l'auloclave ; on chauffe a 120 pendant 15 II}inutes, puis, au
0

sortir de l'autoclave, on verse sur un filtre en papier Char-

din mouilIe, dans un entonnoir a bain-marie. (A defaut d'en-
tonnoir:) baln-marie, on peut filtrer ilire'ttement dans l'au-
toclave qu'on maintient a 'fa tempGrature de 80 0 environ,
non boulonne:) .
On reC:oit la gelose filtree, soit dans des ballons, soit dans
de~ tubes qu'on sterilise de nouveau a 1150 pendant
20 minutes et qu'on laisse solidifier droits ou inclines, sui-
yant· les besoins.
Gelose glycerinee. - Preparee comme il vient d'etre
dit.
En meme temps que Ie blanc d'reuf pour Ie collage, ou
nussitOt apres, on ajoute 40 a 60 grammes de glycerine pure
par litre.
Gelose sacl'ee. Preparee comme il vient d'etJ::e dit. On
substitue a la glycerine 20 grammes par litre (2 p. 100) de
sucre (glucose, ou saccharose, ou lacto~e, ou maltose).
Nota. - Pour su~rer les milieux de culture peptones 'et
alcalins, il y a inten~t a steriliser a part, dans des ampoules
de verre 'neutre, des solutions concentrees, de titre connu,
des divers sucres dans l'eau distillee. On ajoute aseptique-
ment, avec une pipette graduee, sterile, un volume de-
termine de ces solutions dans un volume constant de
bouillon sterile ou de gelose liquefiee par la chaleur. On
evite ainsi la formation des produits nuisibles qui resultent
de l'action des alcalis et des peptones sur les glucides a
haute temperature. Ces produits sont egalement la cause du
brunissement des milieux sucres sterilises a l'autoclave.
Gelose au serum (de Joos). On verse dans un ballon de
2 litres de capacite :
300 cc. de serum de cheval.
150 cc. de bouillon ordinaire.
50 cc. de solution not'mule de soude Ii 40 p. 1.000.
60 TECIINIQUES GENERALES

Porter ce ballon pendant 2 it 3 heures dans un hain-

marie entre 600 et 70 0 , puis 30 minutes it l'autoclave it 1000
(autoclave non boulonne). Ajouter en suite 500 cc. de
bouillon chaud sterile" dans lequel on a fait dissoudre
20 grammes de gelose.
Repartir et steriliser 15 minutes it 120°.

G. - Preparation du lait comme milieu de culture.

Le Jait du commerce doit etre d'abord ecreme par

centrifugation, puis Jegerement alcalinise par quelques
goultes de solution de carbonate de soude a 1 p. 10
jusqu'a ce qu'il bleuisse legerement Ie papier de tour-
neso1.
Repartir en tubes. Steriliser par 3 chauffages successifs
de 30 minutes chacun, it 1000, a 24 heures d'intervalle. La
sterilisation it 115 0 altere Ie lait en peptonisant la caseine et
caramelisant Ie lactose.
Lait tournesole. - Meme preparation. On ajoute au lait
legerement alcalinise, de la teinture de tournesol en quantite
suffisante pour donner une 'teinte nettement violette. On
peut, plus commodement, avoir de la teinture de tournesol
tonte sterilisee a parf et l'ajouter, avec une pipette ;terile,
au fur et it mesure des besoins.
Petil lail. - On determine, par une epreuve prealable~
pour Ie lait dont on dispose, la quantite de HCI (au dixieme)
en centimetres cubes qu'il faut pour provoquer la coagula-
tion de 100 cc. de lait porte a 1000 • Cette determination
faite, on porte a l'ebullition Ie lait tolal et on ajoute Ie
volume d'HCl reconnu necessair:e, puis un leger supple-
ment, goutte it goutte, jllsqu'a ce que la coagulation soit
complete. On laisse refroidir pendant quelques heures;
on filtre sur un entonnoir garni d'ouate hydrophile, puis
sur papier Chardin mouille. Entre ces deux filtrations, on
alcalinise au carbonate de soude au dixieme. jusqu'a bleuis-
sement net du papier de tournesol rouge. On ajoute, s'il y
a lieu, la quantite de teinture de tourne.sol necessaire pour
teinter Ie liquide en violet pale: on repartit en tubes et
on sterilise, comme pour Ie lait, 8100 0 , troisjours de suite,
30 minutes chaque fois.
 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE '61

H. - Preparation des pommes de terre pour cultures.

Les tranch~s de pommes de terre, ~nlevees et coupees it

l'emporte-piece. doivent etre 'immediatement immergees
• dans un cristallisoir contenant une solution de bicarbonate
de soude a 10 p. 1000 1. A'}Jres une ou deux ·heures. on les
cssuie dans un linge, puis on les rcpartit en lubes elrangles
de Roux et on sterilise a l':tutoclave maintenu pendant
20 minutes a 120°. Au sartiI' de l'autoclave, on ctale les
tubes a plat, de telle sorte que la face plane de chaque
fragment de pomme de terre so it dirigee en bas. On evite
ainsi !'incurvation des fragments et l'adherence de leur face
convexe it la paroi du verre. Apres quelques heures dans
cette position, on reI eve les tub~s et on les maintient
droits.
Pommes de terre glgcerin.~es. - Preparees comme ci-
dessus, mais, au lieu d.e,les tremper dans Ie bain de bicar-
bonate de soudll" on les immerge pendant 48,heures dans
de l'eau glycerinee if 5 a 6 p. 100. On remplit ensuite, avec
la meme eau glycerinee, ou du bouillon glycerine, les
tllbes de ROllx jusqu'fI l'etranglement. et on les garnit de
leur fragment ~e pomme de terre. Steriliser comme il est
dit precedemment.

I. - Serum coagule.

Repartir Ie serum dans des tubes stefiles jusqu'a une

hauteur de 5 a 6 centimetres. Incliner les tubes dans l'etuve
a coagulation en evitant de mouilier les cotons, Chauffer
jusqli'a coagulation complete de tous les tubes, sans depas-
ser 70-7~o. Eteindre, et' quand l'etuve est refroidie, retirer
,les, tubes', flamber et enfoncer les cotons ; capuchonner.
On coagule de meme Ie serum glycerine a 6 p. 100.

1. Cette immersion dans la solution de bicarbonate de sOude est surtout indispen-

suble lorsqu'on emploie des pommes de terre un peu anciennes, qui sont generalement
ires acides Les pommes de terre nouvelles Ie sont beaucoup moins. On peut les utili-
her sans "utre precaution.
62 TECHNIQUES GENERALES

J. - Gelose au sang de lap,in.

a) Gelose seche 7 grammes. Laver dans un courant d'eau
pendant environ 12 heures. Egoutter.
Peser dans une.capsule tan\e. Ajouter:
NaCI. 3 gr.
Eau. . . • .. Q. S. pour·450 gr. !Ie poids total,
plus In tare de la capsule.

Verser'le tout dans un ballon. Steriliser a l'autoclave' et

repartir par 3 cc. dans des tubes a e'ssai (droits).
Dans chaque tube prealablement liquefie a 45 0 au bain-
marie, on repartit ensuite environ 1 cc. de sang preleve
dans Ie creur d'un lapin avec une seringue sterile (voir
pour cette technique, chap. XIV, C). Avant la ponc-
tion, la peau du lapin doit etre soigneusement aseptisee a
l'iode Apres la ponction aspiratrice, changer l'aiguille et
la remplacer, pour la repartition du sang, par une autre
'niguille sortant de l'eau bouillante ; ou bien repartir direc-
tement avec Ie bec de la seringue debarrassee de son
aiguille, en evitant de Ie toucher avec les doigts.
b) Milieu de Navy-Neal, Ch. Nicolle.
(POUR LEISHMANIA ET TRYPANOSOMES).
Gelose. 14 gr.
NaC!. . . . . . . . . . . . . . 6 gr.
Eau. ........... 900 cc.

Faire macerer, dans un cr.istallisoir tres propre, la gelose

dans l'eau' distillee. Apres 5 a 6 heures, on renouvelle reau
distillee et on rejette celle-ci apres 24 heures de maceration
totale. On porte alors la gelose gonflee dans un vase
d'Erlenmeyer tare, et on ajoute la quantite d'eau distillt\e
necessaire pour arriver au poids de 914 grammes, puis
6 grammes de chlorure de sodium. On fait fondre a l'auto-
clave en sterilisant. a 120 0 pendant 30 minutes, puis on
filtre sur ouate hydrophile et on repartit par 8 centimetres
cubes, dans des tubes a essai de 15 centimetres de longueur
sup 16 millimetres de diametre, qU'on sterilise et maintient
droits pour la solidification.
Conserver des provisions de ces tubes bien bouches avec
un capuchon de caoutcho!lc.
 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE '63

Faire [ondre au bain-marie cette gelose a 55 0 , em~i'ron et

introduire dans chaque tube 4 centimetres cubes de sang
preleve aseptiquement a la seringue dans Ie cmur du lapin.
Melanger sang et gelose fondue en agitant legerement sans
former de huIles, et laisser faire prise, les tubes etant incli-
nes.
On garde ces tubes inclines a l'etuve a 37 0 pendant 2 ou
3 jours, puis· on les redresse, on les houche au caoutchouc
et on les consei've it l'obscuritejusqu'it usage.

K. - Plasma coagule de Gessard.

On recueillc aseptiquement"au sortir de la veinc du che-
val. du bmuf, du mouton ou du pore, 300 cc. de sang dans
]00 cc. d'eau distiIlec sterile contenant 20 grammes de chlo-
rure dt sodium. Apres depot das hematies, Ie liquide sur-
nageant est apte a se coagulcr par son melange al'eau, dans
1a proportion d'un dixieme en volume. Le coagulum ne se
retracte que faihIement ttt apres un long temps, meme a 'la
-temperature de l'etuve.
On peut reincorporer des hematies au taux originel et
realiser ainsi un equivalent du caillot sanguin, sous Ie
degre de dilution susdit. Pour ceia, les hematies sont
·mises dans 1'eau physiologique. La dose coaguIante est
cnsuite meIangee.
On peut introduire. dans ce milieu coagulable, du glu-
cose, de la gly<,:erine, des sels, etc ... en solution sterile. En
cas de retard darts la coagulation, ajoutera 1:1 dose primitiye
quelques gouttes de solution au dixieme de chlorure de
calcium. .
Ce milieu est utile pour les recheFches qui reclament
l'integrite des principes animaux et des proprietes humo-
rales.

'L. - Bouillon-reuf de Besredka-Jupille.

Reunir les jallnes de vingt mufs (350 centimetres cubes)

dans un grand verre a pied et,gjouter un litre' d'eau distillee.
L'eau do it etre pure et avoir une reaction neutre : dans Ie
cas ou elle serait acide, tln commence par la neutraliser.
Le temps Ie plus delicat de la preparation ~st lao clttrifi-
64 TECHNIQUES GENERALES

cation de l'emulsion au moyen de la solution de soude a

1 p. 100 : !'exces de soude rend Ie milieu impropre ala ('.ul:'
ture, Ie dMaut de soude nuit a la transparence du milieu.
On evite ces ecueilS' en versant d'abord une quantite de
sonde egale ala moitrede la quantite de jaunes reunis. Ainsi.•
a 350 centimetres cubes de jaune on ajoute, par petites por-
tions, 175 c()ntimetres cubes de solution de soude alp HlO.
On s'arrete un moment po'Ur s'assurer du degre de la
solubilisation en aspirant chaque fGis Ie jfiune dans une
pipette: On suit de la sorte la clarification; celJe-ci est arri-
vee au point optimumlorsque Ie liquide apparait transpa-
rent en couche mince, dans la pipette par exemple, et qu'il
reste legerement opaque en couche epaisse, ou a travers
les parois du verre a pied. U ne dizaine de centimetres
cubes, ajoutes a 175 centimetres cunes precedemment ver-
ses, suffisent generale~ment.
On complete avec de l'eau distillee, jusqu'a obtenir, dans
Ie cas particulier, sept litres de liquide qui renferme ainsi
un vingtieme de .iaune d'muf:Le DJilieu est reparti en boites
de Roux (50 a 150 centimetres cubes) e! sterilise a 110 0 pen-
dant vingt minutes.
II est bon de savoir que la quantite de soude 'necessaire
pour dissoudre Ie jaune d'muf n'est pas toujours_la meme.
Le milieu a l'muf convient a beaucoup d'especes micro-
biennes a vitalite breve, particulierement au pneumocoque,
au meningocoque, au streplocoque, au gonocoqlle, au micr'obc
de la coqlleluche et au melitensis. ;
1;e bacille tuberculeux s y developpe tres rapidement,
en voile tres mince et en poussiere fine dans la profondeur.

M. - Milieux additionnes d'hemoglooine.

10 grammes d'hemoglobine du commerce sont dissous
dans 90 centimetres cubes d'eau distillee additionnee de
10 centimetres cubes de solution de soude a 10 p. 100.
On sterilise it I'autoelave. On ajoute 1 centimetre cube
de ce melange a 9 centimetres cubes environ de milieu
nutritif (gelose fondue, etc ... ),
On peut preparer soi-meme l'hemoglobine en recueillant
aseptiquement du sang de cheval 'oli de bmuf dans un
.bocal contenant 2 volumes d' ean salee 'physiologique'pour
 PREpARATION DES MILIEUX 1)E CULtURE 65.

} volume de sang. On Iaisse repos.er a la glftciere pendant

24 heures et on decante pour separer le..s g lobules rouges..
Ceux~ci sont additionnes d'une petite quantite d'elher. Par
ag)tat.ion l'hemolyse se produit tres rapideroent. On evapQr.e
r ether dans Ie vide et on filtre, a trave:rs un~ bougie. Cham-
berland (marque F), Ia solution d'hemoglobine qui peut etre
employee telle quelle en melange, en proportions va-
riables, avec les milieux de culture.

N. - Milieux additionnes d'exsudats ou d'extrait d'or-

ganes (AscHe, liquide d'hydrocele ou ce kyste oya-
rien, exsudats leucoc:ytaires).

Les liquides exsudatiques doivent avoir ete recueiUis

aseptiCluement. On les melange en proportions variables
avec les milieux de culture sterilises. Les exsudats leuco-
cytaires, pleuraux. peritoneaux, etc., dont la steritite n'e!)1;
pas certaine, peuvent etre melanges aVec parties egales de
glycerine a 30· Be ; on les conserve ainsi pendant plu-
sieurs semaines avant de les utilis,eF. pour s'en servir,
on les melange dans la proportion de 0,5 aLp. 100 aux
milieux tie cultRre liquides ou pFealablemcut liquefies et
ollles waintieut a l'etuve a 37~ pendant 48 heuPes avant
de les ensemencer
Milieux a extrail aleQoliCJue de tDie.
~ foie de cheval est rapidelu,ent lave a l'eau du Jlabine!.
dli~upe Ill} pet~ts mere~aux et hro:ye linemen!; au martier.
de porphyre j,llsqu'a obtention d'une pUFee. Olll aj<Ult.tl·
en5t)ite au fQie lion poids d'akool a 90 0 et Fon continoo de"
broyer pendant un quart d'heure La puree, alcoolt~e\est>
placee dans des bocaux a large goulot, o.U elle est agitee
deux fois par jour. Au bout de trois jours, on filtre s.ur,
papier. '
Cet extrait alcoolique de· foie se conserve tras longtemps
a la temperature ordin·~i~e a l'abri de fa lumiere. On
l'ajoute au bouillon ordinaire en voie de preparation;
imm~diatem~nt avant sa stevilisatioo. Le milieu ainsi
(J?btenu ne renfe:rn;lc pa-s d,'alcoo.l. qui s.'e"\1Ap.Qr6 pendant Ie
~u\f~g~. Si ron "\tellt 9bt~oill des mili.eull te.u.l1 a fait lim-
pid,es, sans pr.ecipitt. il sqffit d'ajQuter l:extfiaihv.anJ! la ill-
)IlCROBIOLOGIE 5
66 TECHNIQUES GENERAtES
lration du bouillon. Les meilleurs resultats ont ete opUmus
avec Ie bouillon renfermant 10 a 12 p. 100 d'extrait..
L'extrait alcoolique de foie de cheval renferme
0,885 gramtnes de glucose par litre; son acidite totale est
de 0 gr. 390 p. 1000; l'extrait sec est de 0,475 grammes
p.100.

O. '7 Milieux vitamines.

Recevoir du, sang dans un flacon siCrile. con tenant d~s

perles,de verre; agiter pour defibriner; mesurer la quantite
de sang defibrine et etendre de trois-a quatre foi~ Ie volume
avec de l'eau physiologigue ; chauffer a 800 pendant
15 minutes. Filtrer sur papler pour retenir les substan<{es
precipitees et steriliser par filtration a la bougie.
Ajouter ce liquide aux milieux de culture dans la pro-
portion de 5 a 10 % (XX gou'ttes dans un tube de bouillon
et X gouttes dans un tube de gelose en culot).

P.·_ Milieux de cultures anaerobies.

a) Le procede Ie plus pratique pour cultiver les microbes

anaerobies en milieux liquides consiste a repartii ces
milieux (bouillon par exemple) en tubes ou en ballons et a
recouvrir leur surface d'une couche epaisse de 10 a 15 mlIli-
metres environ d'huile de vaseline. On sterilise et 'on laisse
refroidir dans l'autoclave ferme. On ensemence a la pipette,
aprcs refroidissement, a travers la couche d'huile.
O'est Ie procede de choix pour Ie b. du tetanos (voir cha-
pitre XXXIX).
b) Pour les cultures sous cloche, on peut, soit faire Ie
vide. soit absorber l'oxygene par Ie melange suivant :
Acide pyrogallique. 10 gr.
Polnsse caustique. . • • . . 10 gr.
Eau distillee. •••.•. 100 ce.

Ce melange doit Cire prepare et verse dans les vases

immediatement avant la fermeture de ceux-ci.
II est commode d·avoir,·toutes preparees, deux solutions:
l'une de potasse caustique a 20 p. 100, l'autre d'acide pyro-
 PREPARATlON DES MILIEUX DE CULTURE 67

a
gallique 20 p. 100. On les melange en parties egales dans
Ie tecipient dont il s'agit d'absorber l'oxygene.
On peut aussi, tres simplement, faire des cultures anae-
robies en se servant de deux tubes concentriques : l'un,
interieur, bouche ~ rouate, contient Ie milieu de culture
ensemence (liquide ou solide) ; dans Ie tube exterieur on a
verse 1 gramme d'acide pyrogallique en poudre. On y
ajoute, avec une pipette, 1 centimetre cube de solution a
10 p. ]00 de soude caustique et on bouche aussitot avec un
bon bouchon de caoutchouc qu'on recouvre de cire Golaz
ou de paraffine fondue.
c) Substances reduclrices sllsceptiDles d' eire incorporees aNX
milieux liquides ou solides (indicateurs de {'absence d'oxy-
gene)
Glucose. • • • 0,5 0. 1,5 p. 100 (Liborius.
San Felice, Vei1lon).
Sulfo-indigotate de sonde it 0,1 p. 100 Salomonsen).
Formiate de soude.. . . 0,3 it 0.5 p. 100 (Kitasato-
Weil)
Bleu. de methylene, sol. alcool. it 1 p. 100 qq. gil.
jusqu 0. faible coloration bleue.

Le s[tlfu]'e de calcium en poudre, sterilise it sec, introduit

en tres faible quantite (ce qU,i adhere it l'anse de platine)
dans des tubes de bouillon sterile, permet de cultiver, sans
autres precautiqns, un grand nombre de microbes anaero-
bies (M. Nicolle).
d) Tubes de Veillon (procede de choix pour les anaero-
bies intestinaux) :
On prepare de la gelose additionnee de 5 it 15 p. 1.000 de
glucose et de 1 p. 1.000 de nitrate de potasse I, que ron
repartit dans de gros tubes it essai (tubes de 2 centimetres
de diametre X 20· sur 10 a 12 centimetres de hauteur. On
sterilise al'autoclave, sans depasser 120', pendant20 minutes
(pour eviter la caramelisation 'du glucose) et on solidifie
rapidement en position verticale dans un courant d'eau
froide.

1. Le nitr:.te de potnsse empeche la p"oduction dc bulles de ga. hydrogene 'lui frag-

mcnteraient In gelose et gencraient }'isolentent ultedeur des colonies (Veillon el lIJa:e)~
On peut ajouter au .nitrate, co mIlle mntii~re azotce animale, 1 centimetre cube de
.erum sterile de cheval ou de lapin, par tube. Cetto addition de serum doit a)ors etre
raite apres la sterilisation de Ia gelose glum•••• lorsque cclI...ci cst refroidi. nux envi-
rons de'50·. .
68 TECHNIQUJ:$S GENERALES

On ensemence pal' piqure profonde. La c01\che de gelose

est assez epaisse Rour empecher Pacces de )''air au milieu
et au fond du tube.
Le prelevement des colonies s'effectue en piquant ceJles-
oi aveo une pipette it eflilure tres fine.

e) Bocal pour la culture 4-es microbes anaerobies,

Cet appaveil permet la culture des J;lJ.icrohes anaerohi~s
a 1a surface des milieux solides.
Les milieux ensemenC6S SO.11t places it l'interieur d\m bu.
cal clos special, dont l'oxygene est elimine pal' oOlnbinaiy
son avec l'hydrogen~ eQ. Ilre~~!1ce d'u.n ~a~al:x~eur ~e~on Ie
principe l?ro:{lolle par Laidlow.
Les appareils initiaux de Mac Intosh et de Fildes ~lllt ete
heureusement modifies par Brown qui a propose Ie dispo~
sitif suivant 'lui comprerid :
10 Le hC,lcal ttuae,robiqQ.e,
20 L'appareil de chauffage electr.ique destine it elever la
temperat\l.re d.u catalys.eur,
3 0 Le gellerateur d'hydrogeue.
l O 'Bocal anajrob.ique. - II est consti~u~ pa,r qn recjpient
cyli~<\riq\).e en verre, <\e 30 centim¢tres. de haut ~r 1~ CJ;lJ.. 5
de dhlmetJ;e. Le cou.vercl,<, eQ.
verre, s'ad~pte s-qr 1e :Q9cal I?~r
l'intermediaire d'un ~oint <i.e pl~s,
tiline; il est fixe solidement ~u
moyen d'W.l e\riel' roetalliq~' lV-lJni
d'une vis de serrfi.$ ~\).\ s.'ap.pJ:i"t
que &\\r 1e S~~UI~t du. cQu\',ercle
(tig· H)·
~e C9,wv6rcle e~t perce d'un 01'i ...

JFig. 11.
~c~ oirc\11~ira d'eo\'iroB, 3. CUI. de
d.~\\ll}.~tr~, ~tt,lf~ PAP un b.O,\l,Ch_o,u
d~ CflQo.\phOl}C (fig. 12). L.e boo. ...
chnn est tfav~rs.e p,a~ un tube d.~
verre dont l'extremite infed~
est garnie d'un tnbe de caoutchouc
qui descend j\lsqu'i1u, f01)(1 du l>.ocal i rextr¢,u;lite s.uper~~qre
du tube porte un l'obinet de verre roqe. La cata..lYl?e e~t
a.~so.J;ee Bar qe l'al\li.~nte platinee QU palladinee (A) qui es\
appliquee et maintenue sur un tube de verre (D) d'eJivh;oo
 PREPARATION DES MiLIEUX DE CULTUR1£ 69

4 <:ifi. de' Jong·, au moyen d'an fil d~ re~istnnce fin~ len 01-
chrom~ enroul-e autOU): .au tube. Les extremites du tube
stmt munies de bouchtlos de 'OOou\chQut Ct et G 2' Le tube
et les bouchons torment une bobine autour de laquelle on

I
Fig. 12,

enroule une toile metallique a mailles fines qui est fixee

par des boucles de fil de' cuivre serrees sur les bouchons.
Dans Iii cavite comprise entre les parois de la hobintl ~t I'll
toile m'Ctallique, Ia ctltalyse peut se poursuivre sans d-an~
ger -d'explusiun grace 11, l'interposition, enke Ie tnmlyseuT
et Ie melange -expi'Otiif d'J:!ydrogene et d"O'ltygene de Ia toile
meta1lique qui joue Ie mi!mll r~le de protection que dans
la lampe de Davy. A leur sbrtie de In bobine, les fiI~ -de
.resistance sont mis ~n 'Connection avec deux fib electri.que'S
isoles, (diametre 1 mm.) qui trn~e:rsent Ie honchon du cOu~
vercle. Pour ns"Surer l"etancMite des joint~ (tube et fils
.eIectriques), les fates .supeneure et in~rieure au hou~
chon soot tecDUverte'!> d'une ctmche epa.isse..,de ci.te (Wbz,
puis noyees ·dans Un capuchon de p'nstiline dont ies fils
electriq'utls emergent pout pennetU'e les conne~tions,
avea l'appateil de -chauffage.
70 TECHNIQUES GENERALES

20 Appareil de chauffag'e electrique. - Pour Ie., chauffage.

on peut utiliser Ie courant urbain (110 volts), en interca-
lant sur Ie circuit une lampe a filament de charbon de
16 bougies.
30 Genera/eur d'hydrogene. - On peut utiliser, it cet effet,
un appareil de Kipp ou mieux une bouche a hydrogene. Le
gaz est recueiIli dans des bocaux de 5 a 10 litres, par·depla-
cement d'eau, disposes selon Ie schema de la fig. 13 pro-
pose par F. Gates. Le remplissage du bocal de reserve

Fig. 13.

(C) est assure au moyen du robinet it 3 voies B. L'hydrogene

rcfoule l'ea_u du bocal C dans Ie bocal B Le barbottage du
gaz dans Ie flacon A permet dc controler la marche de
l'operation. L'admission de l'hydrogtme dans Ie bocal
anaerobique se fait egalement au moyen du robinet B.
40 Fonctionnemenl. - Le bocal contenant les milieux
de culture et muni de son couvercle hermetique est mis en
relation avec Ie tubc F de l'appareil a hydrogene.
En meme temps que les milieux de culture, .on place
dans Ie bocal un tube servant de test de reduction et con-
tenant 10 cc. de bouillon sterile, dextrose it 2 % et additionne
de O. 1 cc. d'une solution aqueuse a 1 %de bleu de methy-
lene. La decoloration du bleu de methylene indiquera quc
les conditions d'anaerohiose sont correctement realisecs.
 ,
PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE 71

Le bocal hermetiquement clos est mis en relation avec

Ie tube F de l'appareiJ a hydrogene.
La manamvre s'execute dans l'ordre suivant :
1 0 Mettre en connection des fils de chauffage. L' allumage
de la lampe indique Ie passage du courant.
20 Ouvrir Ie robinet d'admission de l'hydrogene adapte
au couvercle du bocal. Le gaz traverse Ie flacon E bulle it
bulle. Apres quelques minutes, en raison de la contrepres-
sion du bocal, Ie degagement de gaz s'arrete et reprend
apres 5 it 10 minutes. lorsque commence la catalyse qui
reduit Ie volume du melange gazeux a l'interieur du bocal.
Pendant l'operation, Ia combinaison de l'hydrogene et
de'l'oxygene donne naissance a de la vapeur d'eau qui se
conqense et ruisselle Ie long des parois du bocal.
L'operation est terminee lorque l'eau s'est formee et
que Ie degagement gazeux cesse dans Ie flacon E. On ferme
Ie robinet du couvercle du bocal et Ie robinet d'adduction
d'hydrogene. On interrompt Ie courant electrique. Le bo-
cal est mis it l'etude.
Si la reduction est complete, Ie bleu de methylene du
tube indicateur doit se decolorer apres 24 heures de sejour
it l'etuve.
r) Milieux l'enfermant de l'acide pyruvique SOllS forme de
pyruvates aicalills .
.Les anaerobies stricts se developpent bien, en milieux
liquides contenus dans des tubes simplement bouches a
]'ouate, qunnd on ajoute· a ces milieux du pyruvate dc
sodium a la dose de 2 a 20 pour 1000, variable aVlfc l'espece
microbienne et la nature du liquide nutritif.
L'acide pyruvique et les pyruvates alcalins sont des corps
spontanement alterables; pour cette raison leur emploi
necessite les precautions suivantes :
10 Ne pas employer l'acide pyruvique du commerce a
moins qu'il vienne d'etre rectifie dans Ie vide et qu'il titre
au minimum 95 % d'acide pyruvique reel. Ce titre doit,
bien entendu, etre determine par distiilation dans Ie vide
et non par titrage volumetrique, certains acides' commer-
ciaux de preparation ancienne accusen>t en effetplus de 75 %
d'acide par dosage volumetrique alors qu'en realite iis con-
tiennent 30 % d'acide pyruvique distillable.
20 Comme pyruvate, employer de preference le sel de SQ-
 TECHNIQUES GENERALES

dium .qui cristaUise hien et qui e.st ass'ez stable quand il

a ete prepare avec certaines precautions, lorsqu'il est par~
faitement sec et qu'il est bien exempt de bases ou de carbo-
nates alcalins libres. II se presente «Iors sou.s I'aspect d'une
poudre parfaitement blanche, sans trace de teintejaune, forr
mee de paiUettes fines et briIlantes.
3°Au moment de l'emploi, en preparerune solution concen~
tree, a 25 %. dans reau distillee ; la sMriliser par filtratron
sur bougie LG bien neuire at l'utiliser pour introduire asep-
tiquement la dose de pyruvate necessaire dans des milieux
fraicherilent prepares ou venant d' etre sterilises apres a\'toir
ete s'Oigneusement ajust~s au pH optimum. Ces milieux rloi~
vent etrecontenusdans des tubes ou recipients asse£ etroits;
il est commode d'employer des tubes de Pyrex ou de "\Terre
vert de 30 cm. de haut et de 18 miUimetres de diametre OU
l'on intt()duit du bouillon jusqu'amoiti'8 de 1a hauteur.
L~ solution-mere de pyruvate doit toujours etre prepacec
extemporanement et tres concentree. Les solutiol1s de
pyruvate se conservent d'autant moins qu'elles sont plus
diluMs. Elies s'alterentet s'alcalinisentspontnnementn froid
et beallcoup plus vile it chaud ; c'est pour cette raioon qu'il
ne faut pas les preparer a l'avance et encore moins les con~
server en ampoules sterilisees par lachaleur. On...pcllt dans
certains cas Ies tyndalliser; on peut aussi, pour les especes
ires strictement anaerobies, introduire Ia solution-ll}{;re
dans les milieux avant de les regenerer quelques instants a
l'ebullition, mais il faut ne pas perdrE? de vue que cas chauf~
fages ainsi que I action des constituants des milieux sur Ie
pyruvate transforment on alterent celui-ci. II faut done en
tenir compte et elever notablement Ies doses ajol1tees {tux
milieux.
4° Quand on prepare une solution-mere de pyruvate, soit
par dissolution du sel pur, soit en neutralisant l'acide pur,
il raul ioujo'lrs, avant sterilzsation. ajuster Ie la Bolution
Ii pH = 6,5 a 6,7 car c'est en milieu alcalin que la stabi~
lite est la plus faible. En raison de la concentration de la so-
lution-mere. ceUe tres legere acidite n'est pas genante si Ie
pH du milieu a bien ete amene a I optimum de l'espece que
l'on desirecultiver. II faut remarquerqu'en tubes,ouverts les
germes anaerobies sont plus sensibles qu'a l'abri de l'oxy"
gene aux variations de la r~actiop du mjlieu.
 PRgPARATION.DBS'M1LlEUX DB CULTURE ,3

L'lIcUon favorisante '<tn pyruvate de 60dium 00 lh~nifest~

aussi bien, et meme pour des d'()~es moindr-es, quand on cul~
u'\le Iesanaerobies en vasesclos ou ~n milieux solides SYlvant
les techniques. uSlteUes EDlin il est bon de ntl\er que raoCid~
py.ruvique sous forme ue pyruvates nlcalins et, vrai~mbla.
blement, de plusieurs <leses prodo.its de t:ol'loensatmn, n'ae.
ti~e pas seulementle ut\veloppemen\ des anaerobies, mRis
egalement celui des aerobics. II favorise ailssi In cttlture de!!
ISpirochete!;. celIe des vegetaux inferieurs et certaines pro~
priet6s biologiques' on bioehitniques des bllcteries t.

Q. - Milieux voyageurs pour hemocul~ures.

L'hemocuitnre oucultnre du sang dans des milieux ap).:>ro-

pries n'est possible que si Ie transport du sang du lit du
malade au laboratolce peut etre fait sans risque de Ro-ail-
lure
Pour faice des hemocuitures« distance, Delater e\ Merle
ont prepare Jes milieux ge1atines ,suivanis qui pellveht etre
transportes eh uhemin de fer datl& n'importe queUI) position,
S¥lS se con.taruiner. et q'lti fournissent autant d-e resultats
positifs que les milieux a houilloh si.mple.
10 Pour les gennes du groupe coli·typhique :
nnll de hOltif' . 2{) 'Ce.
GlUI:OS(l. 0,20 ~r.
Peptone .. 0.20 «r.
Gelatine • . 2,50 gr.

2" Pour les autres germes :

Eon . . '200 Cc.
Glucose 0,59 gr.
Peptone • 6 Itl'.
set • . 1 gr.
Gelatine 25 gr.

Pour cultiver Ie meningocoque, Ie pneumocoque' et Ie

gonocoque, il stlffit de rem placer l' eau par une maceration
de viande bouillie et filtree, d'ajoutet 1/5 de blanc d'reuf al-

1. Pour la preparatlon de I'acide pyruvi'fue pur, employer la techniqu~ de lit L.-J.

SIMON These de Doctorat es sciences, ParIS, 189':', page 27); au sujetde!; applications
de l'acide pyruvique et des pyruvates en microbiologie, consulter ALBERT Bli=RTHELOT,
pulletin de La Societe d~ chiptie bioLogiqde, avri11924, tbmt! VI. h' 4.
74 TECHNIQUES GENERALES

calin dt( SacquepeEj-Delater ou 1/4 d'ascite et de modifier en

consequence la teneur en gelatine.
Ces additi(Jns sont faites apres alcalinisation et sans fil-
tration dans des flacons de differente capacit~, bouches par
un tampon de coton et recouverts par une fermeture ca-
neUe f celle-ci n'est rabattue qu'apJ;eS la sterilisation.
On rechauffe les milieux au bain-marie entre 3()O et 40 0
jusqu'a liquefaction complete. On les ensemence ensuite
et on les laisse refroidir en portant au besoin les ballons
dans de I 'eau fraiche. Au laboratoire, ces derniers seront
places dans l'etuve OU la liquefaction permettra la culture
comme daris du bouillon.

R. ~Cultures en milieu a ecoulement constant.

Pour eviter l'epuisement du milieu ou sa saturation par

les produits vitaux, Berednikov se sert de grands bal-
Ions de 1 a 2 litres de capacite, faisant office de reser-
voir de substances alimentaires et places a une certaine
hauteur Ce ballon a un orifice d'ecoulement forme par une
pipette effilee I laissant passer VI a X gouttes de liquiJIe
a Ia minute. L'extremite de Ia pipette efIilee est enfermee
dans un tube bouche au coton. L'extn!mite inferieure de ce
tube effilee et recourbee forme siphon pour maiptenir un
niveau constant. Pour eviter que !'ouverture du siphon
ne soit bouchee par les corps microbiens, on place au fond
du tube une petite quantite de coton. Un recipient conte-
nant un antiseptique rec;oit Ie Iiquide qui s'ecoule 'du
siphon goutte a goutte.
On sterilise separemcnt Ie ballon avec Ie tube de caout-
chouc et Ie tube avec Ie siphon ferme it Ia soufflerie. Apres
sterilisation, on ensemence Ie tube. La pipette en verre est
placee extemporanement et flambee; on Ia reunit au tube en
caoutchouc dOune part et au tube d'autre part.
On peut conserver, dans ces conditions, des cultures
pures. La contamination par l'air ne se produit pas, car l'ori-
fice capillaire du siphon se trouve constamment obstrue
par un ,courant de fiquide allant du dedans \iU dehors.

t. VQiI' c, R. Soc. de Riologi•• 1923, page 886.

 CHAPITRE VI

MILIEUX DE CULTURE PARTICULIERS' A QUELQUES

ESPECES MICROBIENNES

A. - Milieux synthHiques sans rnatieres

albOrninoitles.
a) Liquide Raulin pour La culture des Aspergillus:
N° 1 Enu . . • • • . . • . 1 500 cc.
2 Sucre cnndi. . . • • . 70 gr.
3 Acide tnrlrique. . • .. . 4 gr.
4- Azolate d'ammoninque. • 4 gr.
5 Phosphale d'ammoniaque. o gr. 60
6 Cnrbonate de polnsse. . o gr. 40
7 Carbonate de magnesie. o gr. 25
8 Sulfate d·ammoniaque .• o gr. 07
!J Sulfate de zinc. . O. gr. 07
- 10 Sulfate de fer. . o gr. 07
-.11 Silicate de polnsse. d gr. 07

Steriliser par filtration sur bougie Chamberland, a froid,

pour ne pas intervertir Ie saccharose.
On peut avoir, stcrilisee d'avance a l'autoclave dans un
baIlon, l}ne solutjon de toutes les substances minerales
(nO 3 a nO 11) dans 500 centimetres cubes d'eau distillee, et
faire dissoudre, au moment de l'usagel 70 grammes de
sucre candi dans un litre d'eau qu'on vient de faire bouillip.
On melange a cette solution de sucre,la solution minerale
sterile et on verse dans une cuvette a photographie en verre
ou en porcelaine. Pour Ia culture de I'Aspe/'gilius niger, qui
s'effectue a la temperature de 35° environ, on recouvre Ia
cuvette d'une plaque de verre afin de reduire I'evaporation.
L'Aspergilills /llmigallls se cultive a Ia temperature de
33 0 a ~5° dans Ie meme liquide, qu'on repartit, sterile et en
couche peu epaisse, dans des hallom, a fond plat.
b) Milieu mineral'de PusEeUl':
Tnrtrate d'ammoninque. 1 gr.
SUcre cnndi. . , . . 10 gr.
Cendres de levures. . 1 gr.
Eou . . . . • . . . lOG cc..
76 TECHNIQUES GJ5NERALES

c) Milieu de Cohn:
Phosphate monobasiquede potassium. 1 ou 2 gr.
Sulfate de magnesie crist. pur. • . 1 gr.
Phospbate tribasique de calcium. o gr. 1
Tartrate d'ammoniaque. 2 gr.
Eau distillee,. . . • '. 200 ce.

d) Milieu d' Us-chinsky :

Eau . • • . • • • 1.000 cc.
Glycerine.. • . • • . 30 a 40 gr.
Chlorure de sodium pur. ,5 a 7 gr.
C~I~rQre -de calcium pur. o gr. 1
Sulfate de magnesium. . • . • 0.2 a 0,4
Phosphate bibasiqne tie pota~!;iult1. 2,0 a 2.5
Lactate d·ammoniaque. . • • • 6.0 a 7,0
AS'(lllrll.'gine: • , . • . . . . B.t>

e) Milieux ~ynthetiqlles de Ph. Lttsseur pour liI 'Culture des

microbes flu'Orescents et parliculierement du Bacillus chlorora-
phis et du Bacillus Le Monnieri
Milieu I.
Eau • . . . 100 ce.
A"paragine. . o gt. 700
Glyceriue . . • . '. 2 gr. 500
Phosphate dipotassique. o gr. 100
SuUate de magnesie. . o gr. 500
Chlorure de calcium. () 'gr._.t)40
Sulfate ferreux. o gi-. 1)10
Milieu II.
Hau • • . . • • . lOD cc.
Asparagine. . . . . '0 gr. 9bo
Suecillate d'ammonium G gr, 100
Glycerine . , . . . 2 gr. 000
Glucose . . • • . . 1 gr. 000
f>hosphotll dipotos!;ique. o gr. 2'50
Sulfate tie magnesium . o gr. 5l:lO
Chlorure de calcium. . o gr. 400
Sultate ferreux. . . • o gr. 010
f) Milieu de A. Ber.the1ot pOllr l'isolemenl des bacUries
aci~aminolyliques .
Eou 'de source. . , . . • • . . . 1.000 ce.
Phosphate dipotassique pur et sec . •. 1 gr. 50
Sulfate de magnesium cristallise. . .. 0 gr. 75
Acide amine. . . . . • • . . ., 1 a 2 gr.
Chauffer 5' a 1200, flltrer au papier et st<lriliser 20' a 1150.

Ce ~iIieu ne donne de bons 'resultats lIue si Ie phosphate

est bien dipot:l'Ssique, se metIer des produits commerciaux.
 MILIEUX DEJ CU:piU'l/.E: 77
II est ~on de rappder que les bacteries acidaHiinolgtiq.l1es
vraies snnt celles qni se developpent abondamment qans.le
milieu ci-dessus et qui, par cops.equent, utilisent a la foi:s.
'Ie carbone et l'azote uniquement fournis p~l' l'acide amin'e,
Ces hacterifls sont ~pables,. suivant les conditioJ;ls d.e
milieu, soit de desa\Dinel' et d~Clarboxyler, voire meme dislo-
quer completem.ent, les moleoules amin.oiq:ues, soit d'aHa. ..
'1 ue l' separeple.tlt Fun au l'autre d-es groupes Nm oU C00R
en donnant dans Ie premieu Cas un aoide, dalls Ie s~on.d.
une amine.
On ne doit donc pas les confondre ltvecles espcoos, heau-,
voup plus nombreuses, .qui. dans les conditions d:e milioo ai . .
dessus inctiquees, ne pcuvent donner un niWlbre illimite
de p~.ssages successifs, ni foumer d':;l.Inines par de.carhoxy ..
lation de I'acide amine et qui sootsimplement tres des.ami.,
nantes. Ces s;:ermes quisont it lllaoor: al~ suite des. mioro.bes
proteolytiques et peptolytiques ~ ont deS' aminolytiqJlCS, mais
non des acidaminolytiques vrais.
Les acides amimlS a essayer sont pratiquement AU nom-
bre de quatre : q, alanine. ~ryptop.hane, tyuosine. et 'histi-
dine; ils do;vent provenir ae'~'hydrqlyse des prottiiques
et etre, bien entendu, completement exempts de Ba, Ag. Cu,
Hg, Bi ou Pb ain&i que d.'~mpu.retes awtee,g (l'histidine
s'emploie ~ous forme de monochlorhydrate}.
Distri.1.lUer les ll,lilieux pa' 10 cm.. d.am .' es. tub.eaa essais en
Pyrex ou eJ.l,verre vert. Ensemeneer avec la plu6peJi~ quan-
tile poss.iblt; de matiere (feces. exsudat de plaies <Ie 'uerre,
terre, suhstances en putrefaction). Par e'X-emple. avec les
matieres fecales y tremper simplement la pointe dufil de pla-
tine et ellsemencel' de manh!r~ ~ De prodw,r-e Ql:l,J:lS l~ w.ij.~eu
qu'l,l,J;l h es ~geli QQage b~t;¢fiieq ne &' C;te\l<,t:;t;D.t q~' ~ q~)q~~
millime.1a'es Qe 1'ex~ ..emi\e ql\ fil qe pll!tiJl~. ~ u,pres ~ ...
,lQura37°=-en.gelle J;al24 heures-r- en pal' l\l{lt ~ ~ qql,~ll;~
obtenue.eo.seqlencer UJ) Q.Quvea\1 tube ~ miti.eu eJecijf'~v~
lI.1)eMse deplatined!lH.2mm. dedia~l'e in~r~t\{. Wl'~
deux ou trois. aub1es.repiquages suc;cessif~et I;}C~'l(lr. ~ ~~pa.­
ration sur p}a.ques de amtine onlinauc, ou. ep«q~e. ~*r lq
milieuobtenuen solidifiant par la gelose ou la gelatine Ie li-
quide nuttitif d'isolt-ment. Quand on opere'". avet:: tWill, dans
c~J;tl1i.n!? eM p<;lr\i<;w\en~m.ent favo.rI;}Qle.s~ oQ,qqti~nt p<Jrfoi,s,
des Ie 49 pas.sage, u.ne culture d'nne seule.espece bacteriesaCo
i8 TECHNIQUES GENERALES

C' est avec la tyrosine et 1'histidine qu!on obtient genera~

lement les rcsultats les plus interesfants; avec I'alanine
el. Ie tryptophane ne pas depasser 1 gramme pour 1.000 cc.
de milieu. Quel que soit l'acide amine employe', on ne peut
arriver'a_ selectionner les especes acidaminolytiques vraies
si ron ensemellce avec une trop gmnde quantite de matiere.
Enlin il y a des gerrnes, comme Ie B. pyocyanique, qui
n'etant pas des acidaminolytiques vrais, decarboxylants, mais
de puissants aminolytiques, envahiss~nt tous les milieux
amines qui ont ete chauffes, acause de la presence de com-
poses ammoniacaux p1'oduits par 1'action des alcalis sur les
amino-acides; dans ce cas, il faudrait steriliser, d'une part,
dans des tubes de verre vert, la solution aqueuse de
PO'Na 2 H et de SO, Mg, d'autre part, dans des tubes de Pyrex,
la solution saturee dans l'eau distiZlee de l'acide amine choisi,
puis iritroduire aseptiquement 'dans Ie milieu salin une
quantite calculee de cette solution d'acide amine inaltere 1.

B. - Milieu de culture pour les microbes

phosphorescen ts.

Poisson de mel' (harengs Crais ou maqne-

reaux). • . . . . _. . . . . . . 50tr gr.
Glucose. 10 gr.
Peptone. . . . 10 gr.
Asparagine. . . 5' gr.
Glycerme.. . . • 10 gr.
NaC!. .... 30 gr:
Enu q. s. pour . . 1 lit.

Faire bouillir d'abord it feu doux une heure, ou it rau~

toclave (non boulonne), {luis jeter sur un linge, s'assurer
que Ie liq\lide est alcalin au papier de tourhesol, filtrer
au papier Chardin, repar\ir en tubes ou en ballons et
steriliser it 120 0 pendant ~5 minutes. On peut gelatiner
ce bouillon en y ajoutant 1Q p. 100 de gelatine. La sterilisa~
tion sera alors faite de pref¢rence par chauffage discontinu,
1 heure par jour it 100 0 , 'pendant 3 jours consecutifs.

1. Avec In tyrosine opereI' avec la solution suluree houillantc (20 0/00), cur ,\ froid
1a s61ubilite de eet amino-acide dans]' ellu distillee est .culement dc 0 gr. 5 pa~ lill·e.
 MILIEU.x. DE CULTURE 79

C. - Milieux de culture du B. Cyariogenus.

(Lail bleu).
Lai!.. • • . . • . • . • , 100 gr.
Glucose. . . . . . . 2 gr.
Lactate de chaux ou d'nmmon'iaque, steri-
lise Ii part dans 10 cc. d'enu. . . • . 1 gr.

Cultiver it 22°. Ou bien:

Bouillon de veau sans peptone. 100 cc.
Glucos~. • • . • . • • . ·2 gr.

Le meme bouillon gelose constitue Ie reactif des diverses

races de bacilles. Ensemence avec Ie B. Cyanogenlls, il
devient bleuatre.

D. - Milieux speciaux divers.

a) Milieux pour la cullure des ferments Ilceliques :
Vin rouge ou blanc. . . . . . . . 1 partie
Villaigre de vin filtre au Chamberland. 1 partie
Eau. . . • . . • • . . . . . 2 parties

au bien (Beyerinclc) :
Eau du robinet. . . . .
.
100 cc.
Alcool Ii 95-. . • . • • 3 ce.
Phosphate d'ammoniaque .. o gr. 05
Chlorure de potassium.. . o gr. 01
au encore
Alcool a 10-120 • • • • • • • • • • 1 litre
Vinaigre . . . , • . • . • . . • 100 cc·
Y ajouter 100 ce. d'eau dans laquelle on aura dissous it I ebullition
2 grammes de bitartrale de potasse et 2 g~ammes de maltopeptone.

b) Milieux pOllr la culture des ferments lactiques "

Maltopeptone. • . • 5 gr.
Glucose. . . . • . . • . . 10 gr:
Carbonate de calcium. • . . . 10 gr.
Ean. • . . . • • . . . . . 200 cc.

Milieu gelaline pour l'isolement des rel·menls. lacliglles

Petit-lait. . . • . 100 cc.
Chlorure de sodium. o gr. 0;;
Peptone . • " 1 gr.
Gelatine . . 10 gr.

c) Milieu de G. Bertrand el P. J)llchal<ek POIlI' la culture du

$0 1'ECJJN1UVES GENJJRALES

ferment lqcti9ue bu.lgare en milieu. non sucre (pour les I"I.sages

therapeutiques) :
Faire bouillir 30 grammes de touraillons (radicelles
d'orge dessechees) pelldant 15 minutes dans un litre d'eau
additionnee de 1 p. lQO de peptone Chapoteaut et de 3 p. 100
de carbonate de calcium precipite.
Repartir en tubes ou ballons et st~'riliser a l'autoclave a
115°. Dans ce milieu, ]a bacterie conserve toutes ses pro-
prietes biochimiques.

dl Milieu:¥( llQur la culture all..CJ.e[!obit; du Iel'llv:nt bu(y·

rique ~
Saccharose. . . . . . . Ii gr.
Phosphate d'ammoniaque . . 0,1 it 0,2
Carbonate de calcium. • • 5
Ean. . ..... . ~ •. 20.0 cc.
ou bien:
Ean qi&tillee. wg. cs:.
GI.~e. ou saccharose. 5,'gl'.
Callbqnate de .calcium. • 3 gt.
Phosphate de soude .. o gr. 05
Sulfate de magnesie.. . o I:fl". (),5
Chlorure de potassium .• o gr. 05
Pour l'isQI~ment qu ferment lJutyri.que. ou s~ sert de ce
milieu additionne de.15 p. 100. de .gelatine eb coule en tubes
inclines Les tubes sont maintenus sous une cloche a vi~e a
la temperature de 20 a 22°.

e) Mi1.i,eTJ, q,e Beg.er:iJ),Ck p"oW' la culture de&feI;IJI,cJ)Js de l'tlJ:ee

(Micrococcus ul'ere principa.lemenl) :
Haq d.e J;opin~ . . . .
Uree. • • . • • • • •
Acetate de soude. . • • .
., 1 litre
50 gr .
W 81'.
Phosphate neutre de potasse.. ().~, 25

f) Milieu de Delden pour la culture des ferments reducleurs

des sulfates :
ElJu de robinet. ....." .' .' '100 ce.
Phosphate acide 'de' potasse: o gr. 0&
Lacta'" de soude , . , • . • (» gr 0&
Asparogine., .' • . • . • o gr 0'"
Sulfatjl de magnesie ou de chaux. o gr, Q1
, Sulfate de fer. . , • • • • .::. • traces.
 MILIEU~ DE CULTURE 81

g) Milieu d'Omeliansky pour la culture anaerobie des fer-

ments de fa cellulose:
Eau distillee. • 1.000 cc.
Phosphate de potasse. • I gr.
Sulfate de magnesie.. . o gr'. 05
Phosphate d'ammoniaque. 1 gr.
Chlorure de sodium . • . . • • . • traces
Cellulose sous la forme de papier Berzelius,
lave et sache.

'Repartir en tubes ou en ba1l6ns, Verser sur.la surface du

liquide une couche d'huile de vaseline et steriliser a rauto-
clave. .
h) Milieu de culture pour les teignes :
Peptone. 20 gr.
Gelose. 13 gr.
Eau. 1 litre

Fondre a 120 0
1 heure, retirer de l'autoclave et ajou·
ter:
Acide acetiqtyl cristallisable. • • . • . V gouttes
Glycerine. . . • • . . . • . . . 20 gr.

Remuer, porter a 1000 pendant 20 minutes a l'autoclave

non boulonn6 ; filtrer et repartir en tubes inclines.
i) Miliel1 de culll1re de Sabouraud pour les bacilles sebor-
rheiques: .
Ensemencer des comedons sur:
Eau de robinet. . . . . 1 litre
Peptone granulee Chassaing. 10 gr.
Glycerine neutre. . . • . 40 gr.
Acide acetique cristallisable. V gouttes
Gelose. . . • . . • . 10 gr.

Vne culture sur dix environ est pure d'emblee. Les autres
sont melangees de cocci polymorphes qui meurent en un
mois, tandis que Ie micro-baciUe sous-jacent survit.
II faut reensemencer assez abondamment.
j) Miliw de cullure pour les champignons inferieul's :
Eau. . . • • • • • . . . 1.000 cc.
Phosphate bipotassique pur et sec 1 gr.
Sulfate de magnesium cristnllise.. 0 gr. 50
Maltopeptone . • . . • • • " 5 cc.
Bitnrtrate de potasse. . . . • 0 gr. 50
Glucose masse blanc. . . . . . 25 gr.
Saccharose (sucre cristallise blanc).. 25 gr.
MICROBIOLOGIE 6
82 TECHNIQUES GENERALES

k) Milieu a l'extrait de malt pour les champignons infe~

l:ieurs ou les leuures :
Eau. • . . • . . . . . . • . 1. 000 ce.
Extr.ait de malt sirupeux "Progi~)) pour
bacteriologie N. L. . . . . . .. 100 gr.
Steriliser tel quel, ou apres addition de gelatine ou de gelose, par
3 chauflages d'une heure a 100 degres.

1) Milieux a la maltopeptone pour la culture en grand des

leuures pures :
10 Eau. : • • • . . 1.000 ce.
Maltopeptone. • . • 10 gr.
Bitartrate de potasse • 1 gr. 5
Sucre cristallise blanc. 100 gr.
Steriliser II 1150 •
20 Eau • . . • • • . 1.000 cc.
Maltopeptone. 10 gr.
Bitartrllte de potasse. . 1 gr.
Phosphate d'ammoniaque 1 gr.
Sucre cristallise blanc. . 100 gr.
Steriliser 111150 •
30 Ean . • • . . . • • 1.000 ce.
Nitrate d'ammoniaque. . o gr. 5
Phosphate d'ammoniaque {) gr. 8
Phosphate de potasse . o gr. 3
Sulfate de magnesie . o gr. 1
Bitartrate de potasse / • 1 gr.
Acide tarlrique • . . 1 gr.
Maltopeptone. 10 gr.
I Sucre cristallise blanc. 120 gr.
Steriliser II 1150 • (FernbaclL)

m) Milieu pour /'elude el l'z'solemenl des bacteries pheno.

[ogenes :
Eau • • • • . . . • . • 1.000 cc.
Sulfate de potassium. . . . o gr. 20
Sulfate de magnesium cristallise o gr. 20
Phosphate bipotassique . . . o gr. 50
Azotate de potassium. . • • o gr. 25
Chlorure de calcium . • . . . o gr. 02
Tyrosine en exces (exempte de Ua, Cu,
Ag, Pb. Bi, Hg). 2 gr.
Steriliser 20' II 115' . (.A. Hert'he10t.)
 CHAPITRE VII

PRINCIPALES MATIERES COLORANTES EMP[,OYEES

EN TECHNIQUE MICROBIOLOGIQUE. - METHODES
USUELLES DE COLORATION DES MICROBES ET DES
PRO TOZOAIRES.

La coloration des microbes s'effectue <raprel; les memes

principes que celle des fibres vegetales et des tissus ani-
maux, c'est-a.-dire conformement auxlois physjco-chimiques
q)1i regissent les phenor.nimes d'adhesion moleculaire (ou
adsorpfion) et les phenomenes d'osmose.
Tantot les substances tres complexes, qui constituent les
corps microbiens, fixent les matieres colorantes par ~imple
adhesio!l ou « adsorption », comme Ie fait Ie charbon animal,
par exemple : tantOt ~lles se comportent comme des membra-
nes dialysanles qui laissent diffuser les colorants vers les
colloides intracellulaires (albumine, ca~eine, gelatine ou
collagenes, mucine, etc.), sur lesquels ils exercent des
actions chimiq.rles 4 extremement variables: coagulation, in-
solubilisation ou laquage, precipitation. etc.
Et comme, parmi les matieres colorantes, les unes sont
acides, les autres basiques, on con\toit que les substances
basiques ,par exemple tendent a s'uniraux substances acid,es
(sero-albumines, nucleines, ·.a.cide nucfeique. acide meta-
phosphorique) qui sont, les principaux constituants des
albuminoides, tandis qu'au contraire les couleurs acides
satureront leur acidit,e ''aux depens des sels alcalino-terreux
ou ammoniacaux qui entrent pour une large part dans la
composition de "certains tissus (fibrine. stroma globu-
laire. etc.).
Les coulcurs basiques, en raison de leur affinite elective
pour les protoplasmas microbiens riches en nucIeine et en
aci4~ 'metaphosphorique, sont donc les plus utiles en micro-
biologie.
! Cependant les couleurs acides rendent aussi beaucoup de
services comme colorants,de contraste, ou de fond, permet-
tant de meUre en valeur les,colorations electives.
8'4 TECHNIQUES GENERALES

Les couleurs d'aniline employees en technique microbiolo-

gique portent les noms indiques sur les c~talogues de leurs
fabricants et il arrive souvent que Ie meme produit, chimi-
quement defini, suivant qu'il est vendu par telle ou telle
maison, porte une denomination differente 1.

I. - Couleurs d'aniline.

A. - COLORANTS BASIQUES
a) Fuchsine (chlorhydrate. acetate ou sulfate de rosani-
line, derive du triphenylmethane). Divers noms commer-
ciaux : ruhine, roseine, fuchsine-diamant, rouge magenta,
rouge solferino. .
Excellent colorant nucleaire. Tres soluble dans l'alcool.
L'eau n'en dissout que 0,3 plOD.
Solution de Ziehl. - Triturer dans un mortier:
Fuchsine • • • • 1· gr.
Acide pbenique cristallise • 5 gr.
Aleool ii 950. • .10 ce.

Reprendre dans Ie mortier par :

Eau distillee. • 90 ce.

Filtrer apres 48 heures de repos.

Apres coloration par Ie Ziehl, on peut differencier, c'esh\-
dire eli miner l'exces de colorant qui n'est pas fixe sur les ele-
m~nts electifs, soit par l'alcool a 95", soit par l'alcool aniline
(10 volumes d'aniline pour 90 volumes d'alcool absolu), soit
par Ie gaiacol (solution a 10 p. 100 dans l'alcool it 90 0 ) .
h) Safral1ine (chlorhydrate de tolusafranine ou rose d'ani-,
line). Peu soluble dans l'eau (0,6 p. 100), tres soluble dans
l'alcool. Excellent colorant nucleaire. II est avantageux de

1. Toutes les t'natieres colorantes necessaires ;\ !'industrie et au Iaboratoire sont ~\

present fabriquees par des firllles franc;aises: Societe anonyme des Math!res colorantes
de Saint-Denis; Compagnie fram;nise de Matieres colorantes de &iint-Clail'-du-Rhone ;
Compagnie nationale des matieres colorantes (Etablissements Kuhlmann). CeUe der-
niere societe fabrique les prodmts RAL specialement etudies pour les recherches de
laboratoire. Us ont ete mis au point n l'Institut Pasteur qui continue it les contr6"
ler. On peut s'adresser pour ces prodults~ soit directement aux Etablissements
J{uhlmann, section des produits organiqueR, 134, boulevard Haussmann, it Paris, soit
aux Etahlissements PouJenc freres, 122, houlevard Saint-Germain, chez Cogit, chez
Jouan au n'importe quel fournisseur de produils de laboratoire, en exigeant la
marque RAt. garantie de l'origine et du control.. .
 PRINGIPALES MATIBRES GOLORANTES 85

la conserver en solution alcoolique saturee et de diluer quel-

ques gouttes dans I'eau saturee d'aniline au moment de s'en
servir. On differencie avec l'a~cool it 95 0 ou avec l'alcool
acidule par 0,5 p. 100 d'acide chlorh),drique.
FormuZe de Babes (recommandee) : preparer d'avance,
dans un grand _flacon, de I'eau d'aniline saturee (une eau
d'aniline ancienne donne, en effet. de meiIleurs resultats
qu'une eau preparee extemporanement). Au moment de
l'emploi, on la filtre sur un filtre mouille et on la sature
de safranine.
c) BZeu de methylene (thiazine, chlorhydrate ou chlorozin-
cate de tetramethyl-thioninel. Marque RAL specialement
recommandee. C'est un colorant puissant, non toxique pour
les elements ceIIulaires vivants, a forte action elective sur
les noyaux, les granulations basophiles du sang, la substance
protoplasmique basophile des leuc09ytes, des hematies, des
plaquettes, la mucine et les granules de Nissl des ceIIules
nerveuses.
II est tres soluble dans l'eau et l'alcooI. Les solutions
meres alcooliques saturees se conservent bien Son pouvoir
tinctorial est plus considerable en solutjon legerement
alcaline.
BZell de LanZer:
Solution alcoolique saturee de bleu . 1 vol.
Solution aqueuse de potnsse a 1 p. 10.000. 2 vol.

Oubien, aulieu dela solution de potasse, eau saturee d'ani-

line et filtree (I 'aniline est soluble a3 p.100dans l'eau). Les
preparations colorees au bleu de Loffierdoivent etredifferen-
ciees par lavage rapide it I'eau acidulee·parO,5 p.100 d'acide
acetique, puis par une solution aqueuse de 10 grammes de
tanin (prepare it l'ether) dans lOOcc. d'eau (8 it 10 sec~>udesi.
Le bleu de methylene pur n'est pas polychromatique. Un
traitement chimique en milieu alcalin l.f transforme tres
facilement en derives d'oxydation (azur et violet de me-
thylene). Ces deux colorants, ou leur melange avec du bleu
de methylene inattaque, permettent d'obtenir des reactions
metachromatiques tres belles et des differenciations par-
faites entre les elements cellulaires.
Ce proceSSllS d'oxydation en milieu alcalin intervient
dans la preparation des bleus Borrel a l'argent, de Lr,ffler it
86 TECHNIQUES G~N~RALES

la potasse, des bleus borates. des azurs de Giemsa, des pre-

parations de Tribondeau a l'ammoniaque, etc.
Preparation du bieu Barrel:
Dans une fiole de 150 cc. environ, on met 3 ou 4 grammes
de cristaux d'azotate d'argent et 50 a 60 cc. d'eau distilIee.
Quand les cristaux sont dissous, on remplit la fiol~ avec une
solution de soude a 10 P" 100 et on agite: II se forme un pre-
cipite d'oxyde d'argent qu'on decante et lave a plusieurs
reprises a 1'enu distillee, jusqu'a ce que Ie liquide qui s'ecoule
ne bleuisse plus Ie papier de tournesol. On verse alors, sur
l'oxyde d'argent, une solution aqueuse alp. 100 de bIen
medicinal RAL. Le bIeu de methylene ainsi oxyde forme
un melange d'azurde methylene et de violet de methylene. On
laisse en contact pendant trois semaines au moins, en agi-
tant a plusieurs reprises, et on Eltre ; ou bien, si 1'on est
presse, on murit immediatement la solution en la chauffant
pendant 45 minutes, 'aU moins, it 1200 , it l'autoclave. Ce
liquide colorant est tres stable. 11 convient particulierement
a la coloration du sang et de ses parasites.
Azur Il (de Giemsa) :
Melange de chlorhydrate d'azur de methylene (azur Il et
de chlorhydrate de bIen methylene. Excellent colorant qu'on
peut substituer avantageusement au bleu de Lomer :
Solutions meres:
A. - AzurII • . . . • . . . . . 1 gr.
Eau pheniquee a 5 p. 1000 • • • 100 CC.
B. - Carbonate de sodinm a 1 p. 100.

On dilue, au moment de s'en servir, 1 cc. de solution A

dans 10 ou20 cc. d'eaudistillee(jusqu'it obtention d·un~solu·
tion transparente). A 10 cc. de ceUe solution on ajoute 5 it 10
gouttes de B. Colorer 10 a 15 secondes. Laver a reau et
seeher.
Pour les usages courants du laboratoire, on emploie gene-
ralement les solutions de bleu pheniqlle de Kuhne ou bomte
de Kolle, qui se conservent bien:
Blell pheniqlle de Kuhne:
On broie dans un mortier :
Bleu de methyMue medicinnl . 2 gr.
Acide phenique cristallise . . 2 gr.
AI cool a 95 0 • • • • • • • 10 cc.

On verse dans un fl~con bouche. a l'emeri et on laisse In

 ,.-
PRINGIPALES' MATIERES GOLORANTES 87

couleur se dissoudre lentement. Apres 24 heures. on ajoute :

Eau distillee . • • 100 ce.

On agite et on filtre.
Bleu borate de Kolle:
Solution de 2 grammes de bleu medicinal dans une solu-
tion aqueuse de borax it 5 p. 100. Les colorations sont meil-
leures, avec un liquide prepare depuis quelques jours.

d) Le bleu polychrome de Unna (marque RAL) est une pre-

paration speciale tres metachromatique, c'est-a-dire qui
permet de colorer en nuances caracteristiques les .difTerents
elements chromotropes des celluies ou des tissus (par
exemple la substance amyloide en violet. la mucine et les
tissus cartilagineux en rouge). Apres son empIoi, OIl aoit
laver rapidement et differencier par l'ether glycerique de
Unna etendu de 5 parties d'eau, puis laver a fond a rea\!
distillee et deshydrater it l'alcool absolu.
e) La thionine (violet de Laulh) possede des proprietes
metachromatiques analogues. Son emploi est tres.commode
avec Ia formule de Maurice Nicolle:
Thionine . • . . • • . o gr. 5
Alcool absolu. . • . . • 10 ce.
Acide pbenique crislallise • S gr.

Triturer et laisser dissoudre 24 heures dans un flacon,

puis ajouter :
Eau dislillee . 90 ce.

et filtrer.
Les coloratious sout meilleures avec les solutions vieilles
d'au moins 3 semaines. Pour differencier, on lave a l'alcool
a 800 ou 90°.
Le vieillissement etant assez inconstant, nous recomman-
dons Ie mode operatoire suivant, qui permet d'obtenir une
solution parfaite, immediatement utili sable :
Dissoudre la thionine a saturation dans l'eau distillee.
Precipiter parune solution de soudecaustique a 10 p. 100.
Recueillir Ie precipite sur un filtre et Ie laver it l'eau distillee
jusqu'a ce que Ie liquide sortant du mtre ne soit plus alcalin.
Reporter Ie precipite dans un flacon et l'y dissoudre a
88 TECHNIQUES GENERALES

saturation dans de l'eau pheniquee it 2 p. 100. Laisser

reposer 24 heures. Filtrer.
La solution est des lors prete it l'usage.
f) Le bleu de toluidille (chlorozincate de dimethyltolu-
thionine) est egalement tres utilise et offre sensiblement les
memes avantages que la thionine. On peut l'employer pour
les colorations vitales, comme Ie bleu de methylene, parce
qu'il n'est pas toxique. Pour les preparations de frottis
fixes ou de coupes, on se sert de solutions it 1 ou 2 p. 100
dans l'eau pheniquee,.ou bor-atee it 1 p. 100. On differencie
aveC une. solution aqueuse de tanin a 10 p. 100 ou avec
l'alcool absolu additionne de 1 p. 100 d'acide oxalique.
g) Violet de methyle ou violet de Paris, violet 5 ou 6 B, me-
lange de chlorhydrates de tetra, penta et hexamethylpararo.
saniline. Tres soluble dans l'eau, l'alcool, Ie chloroforme.
Employe en solution dans l'eau saturee d'aniline (10 ce.
de solution alcoolique saturl\e, dans 100 cc.) avec diffe-
renciation par l'alcool au par l'iode (solution de Lugol) et
I'alcool. Ou bien en solution acMique :
Solution saturee dans l'alcool it 96°. 10 cc.
Eau distillee. . . . . . • . . 20 cc.
Acide acetique crislallisable. . • • 2 cc. 5

Colore Ie protoplasma cellulaire en bleu, la s'p.bstance

amyloJde en rouge.

h) Violet de gentiane.
Melange de violet de methyle et de violet cristallise
(chlorhydrate d'hexamethyl-pararosaniline avec un peu de
dextrine).
Pour les frottis, exsudats, cultures et pour la reaction de
Gram, on emploie la solution suivante, qui se conserve bien:
Solution alcoolique saturee de violet de
gentiane. . • . ....... 10 ce.
Ea';! phimiquee II 1 p. 100.. . • • • . 100 cc.

Pour les coupes it differencier par Ie Gram, la formule

d'Ehrlich est meil1eure :
Violet de genliane. 1 gr.
Alcoo!. . . . . . 15 cc.
Eau saturee d'oniline. 85 cc.
 /

PRINCIPALES MATIERES COLORANTES 89

i) Violet benzyle (ou violet methyl5B,6B, 7B, violet 6B).

Memes techniques. Coloration plus bleue qu'avec Ie violet
de methyle.
j) Violet cristallise (chlorhydrate d'hexamethyl-pararo-
saniline). Tres soluble dans I eau et l'alcoo1.
On pent employer une solution it 1 p. 30 dans l'alcool it
950 pour colorer Ie bacil1e tuberculeux par exemple, et diffe-
rencicr par l'acide azotique it 0,1 p. 100, puis rapidement
par l'alcool
On I'utilise aussi pour la preparation du milieu de Dri-
galski-Conradi qui sert Ii isoler Je bacille typhique (voir
chap, XXXII).
k) Veri de methyle (vert it l'iode),
Soluble dans l'alcool et I'eau, insoluble dans l'alcool amy-
lique et Ie chloroforme.
Excellent colorant pour la chromatine nucleaire; colore
faiblement les microbes. On l'emploie en solution saturee
dans l'alcool absolu. a laquelle on ajoute 0.5 p. 100 d'acide
acetique cristallisable. II faut ensuite differencier et des-
hydrater les preparations par l'alcool absolu, additionne de
1 p. 100 d'acide acetique.
I) Le vert malachite (chlorozincate, oxalate ou sulfate de
tetramethyldiamidotriphel?yl-carbinol, vert de Chine, vert
diamant, malachite) est d'un usage courant, On l'emploie
it l' etat de chlorozincate pour la differenciation du bacille
typhique selon la methode de Lofiler.
m) La pyronine est souvent utilisee comme conleur ba-
sique pour la preparation de melanges neutres. Ses solu
tions aqueuses sont rouges et fluorescentes.
On l'associe parfois an vert methyle (Pappenheim) pour
colorer les elements basophiles.
n) Ve.mvine (colorant azoique, brun de phenylene ou de
cresylene, brun de Bismarck). Colorant brun qu'on dqit dis-
sondre dans l'eau it l'ebullition et qu'on filtre apres refroi-
dissement. S'emploie en solution aqueuslt alp. 100 ponr
teindre en,brun les noyaux, les cartilages, la mucine' et aussi
les microbes. On diflerencie par l'alcool absolu. Surtout
90 TECHNIQUES 6ENERALES

employe pour les doubles colorations et parfois pour 'le5

colorations vitales.
0) Rouge neuire (marque RAL). Tres soluble dans reau
qu'il teinte en rose legerement violace. Avec une faible trace
d'acide organique, il devient rouge fuchsine et, avec les
alcalis, jaune bruno La faihle teneur en alcali des eaux de
source suffit a Ie faire virer au jaune bruno
Ce reactif entre dans la composition de beau coup de
milieux de culture speciaux. II.colore, comme les couleurs
basiques, les noyaux et les substances basophiles. II teint
en rouge Ie protoplasma des leucocytes et des lymphocytes,
Jes granules basophiles des mononucleaires, les granules de
Nissl, la mucine.
On l'emploie egalement en solution a 0,5 p. 100 dans l'eau
salee physiologique pour les colorations vitales du sang. II
colore en rouge Ie.:; cellules et tissus vivants. II n'est pas
toxique, de sorte qu' on peut l'injecter dans l' organisme des
petits animaux.

B. - COLORANTS DIRECTS

Rouge Congo. Azoique (benzidine tetrazotee\sur 2 mole-

cules de naphtionate de sodium).
Employe pour les celluloses et les colorations vitales.
Solution a 0,5 p. 100 dans l'eau. Tres sensible aux acides
mineraux qui Ie font virer au bleu.
Benzo-bleu bl:illant 6 B ou bleu pur direct 6 B (dianisidine
tetrazotee sur 2 molecules aeide SS).
Non toxique. Employe pour les colorations vitales. Tres
soluble dans l'eau.

C. - COLORANTS DES GRAISSES

Electifs en raison de leur solubilite dans les corps gras :

a) Soudan III ouecarlate au grasA (amidoazobenzene dia-
zote sur betanaphto 1).
Colorant diazoique, insoluble dans l'eau, soluble dans
 PRINCIPALES MATIlmES COLORANTES 91

I'alcool et les corps gras. Est utilise pour colorer les parti-
cules graisseuses. (Soudan III BX et ecarlate R pour gtais-
ses ; marque RAL recommandee.)
Utilise aussi pour la coloration du liege en histologie
vegetale.
b) Blea d'indophenol (par action de la nitrosodimetyla-
niline sur alpha-naphtol). Produit insoluble dans reau,
soluble dans I'alcool et les graisses .

.. ..
\
D. - COLORANTS ACIDES
(Sels a base in colore. ncide colore, colorants de fond electifs.)

a) Eosine. Il en exist~ plusieurs varietes, qui toutes sont

des sels alcalins d~ la tetrabromo-fluoresceine. La meilleure
est,l'eosine marque RAL nO 225 pour histol~gie, soluble dans
J'eau et dans 1'alcool. C'est une couleur acide bibasique qui
teint fortement en rouge vermillon les elements oxyphi-
les des cellules des tissus. On l'emploie en solution aqueusa
a 0,5 p. 100 dans I'alcool a 70 0 • Son action est rapide. On
elimine I'exces de couleurpar lavages plus ou moins prolon.
ges a I'eau ou a l'alcool faible. L'eosine est d'un usage cou-
rant pour les doubles colorations et eritre dans la composi-
tion de plusieurs melanges d'une utilisation tres commode
pour la coloration du sang etdes parasites sanguicoles (eosi-
ne-bleu, eosine-vert, Giemsa. Romanowsky, etc.); dans
ce dernier cas, employer l' eosine dite extra cristallisee
RAL.
b) L'erylhrosille ou eosine bleuatre est Ie sel sodique
de la tetraiodofluoresceine. On I'emploie comme I'eosine.
Les tons obtenus sont plus violets.
c) Orange G (aniline diazoiee sur sel G). C'est un des
meilleurs colorants plasmatiques. OI1l'emploie -en solution
aqueuse a 0,5 p. 100 ou meme en solution plus faible. Son
action est tres rapide. ,
D'autres azolques sont aussi employes comme colorants
de fond: chomotrope 2 R. teint en rouge fuchsine; eear-
late de Biebrict ; pomeall S, SS, 6R, etc.
92 TECHNIQUES GENERALES

d) Fuchsine acide (scI de sodium de la fuchsine trisl1l-

fonee, rubine S ou amaranthe G; rubine S). - Tres soluble
dans l'eau (20 p.l00) ; beaucoup moins dans l'alcooL Bon
colorant plasmatique et de contraste en solution aqueuse a
0,1 p.100 dans l'alcool dilue. Son action est intense et rapide.
On differencie avec l'eau picriquee saturee ou avec l'alcool
acidule par l'acide acetique.'
On peut employer de meme les vert et violet acides.
e) Acide picrique (trinitrophenol, colorant nitre). S'em-
ploie en solution aquel1se ou alcoolique saturee.

,. .
E. - COLORANTTS COMPOSES

Ces colorants, en melanges plus ou moins neutralises, de

telle sorte que chaque couleur garde pourtant ses proprietes
electives, sont d'un emploi commode. surtout pour l'etude
du sang. Leur preparation est assez delicate. II est avanta-
geux de les acheter tout faits. Les solutions sont inaltera-
bles, pourvu qu'on les tienne en flacons bien fermes, a l'a-
bri de la lumiere.
a) Melange d'Ehrlich-Biondi-Heidenhain. I
On prepare separement des solutions aqueuses saturees
de fuchsine acide (Rubine S.), orange G. et veri melhyle. On
les melange dans les proportions suivantes. pour faire la
solution mere :
Fuchsine acide 4 cc.
Orange G . . 7 cc.
Vert methyle • 8 CC.

Pour l'usage, on verse 1 centimetre cube de cette solution

mere dans 50 centimetres cubes d'eau distillee. _
L'action est lente (24 heures). On porte ensuite les pre-
parations pendant 2 heures dans de l'alcool additionne de
2 p. 100 d'acide acetique, puis on deshydrate par l'alcool
absolu acetique (acide acetique 1 centimetre cube p. 100
centimetres cubes d'alcool absolu), enlin on passe au xylol.
La chromatine est ainsi coloree en bleu, Ie protoplasma en
rouge.
 PRINGIPALES MATIERES GOLORANTES 93

b) Triacide d'Ehrlich. Compose des memes colorants que

Ie precedent, mais en proportions differentes :
Solution saturee d'orange G. • . 30 ee.
Solution saturee de fuchsine aeide. 6 ee.
Eau distillee • 15 ee.
Aleoo!. • . • 15 ec.

On agite, puis on ajoute :

Solution snturee de vert methylene 12 ec.
Alcool • . 10 cc.
Glycerine • . 10 ce.

Meme differen?iation par l"alcool iode acetique.

c) Colorant de Leishman. Sur la lame sechee, non fixee,
verser un nombre de gouttes (8 a 10) suffisant pour recou-
"rir Ie frottis. Couvrir la lame, pour eviter l'evaporation
de l'alcool, avec Ie couvercled'uneboite de Petri, ou la placer
dans une boite de Laveran. Faire agir 30 secondes a 1 mi-
nute. Ajouter sur la lame un nombre de gouttes d'eau dis-
tillee neutralisee 1 double du nombre de gouttes de colorant.
Agiter pour melanger. Laisser colorer 5 a 10 minutes.
Rineer a l'eau de source ou a l'eau distillee.
Le colorant (marque RAL) est livre en solution toute
prete ou en poudre. Pour preparer Ie colorant avec la
poudre, mettre cette derniere en solution dans l'alcool
meLhyliqne a 990 5 (pur et neutre) a raison de 2 gr. 5 par
litre. Faire la solution a froid ou a l'etuve a 37 0 en agitant
de temps en temps. FiItrer apres 48 heures.

9-) Colorant de May Grunwald (marque RAL). (Eosinate de

bleu de methylene.) Verser sur Ie frottis non fixe 10 gouttes
de liquide de May Grunwald, couvrir comme dans la techni-
que de Leishman. Apres 2 ou 3 minutes, ajoutcr 40 gouttes
I

1. La mnuuu;se qualite de l'eal! distillee est la cause fa plus friquente d'insucre. dans
tau. lesproced" de coloration derir!is d_la methode de Romanowsky. Elle doit ctre par·
faitcmentneutrt, c'est-a-dire avoir nne concentration en ions hydrogene de pH7. Or,
reau distillee est generalement acide. Voici un procede simple de neutralisation indique
par POl1selle : un tube it essai d'environ 16 millimetres de diamelre. tres propre et
l'ince it reau distillee, porte un trait au diamant au au crayon gras a 10 centimetre$
cubes. On verse de reau distillee jusqu'au trait. on y fait tomber 4 gouUes de bromo-
cresol pom'pre en solution aqueuse it 0,04 p. 100 et on ag\te. Le liquide prend generalc..
ment une teinte vert jnune; on verse alors goutte a goutle. avec tme~plpette effiIee, en
agitnnt apr". cha'lue goutte, un. solution 1/100 normale de carbonate de soude jus-
qu'D. ce qu'on obhenne une teinte violette. Cette eau est employee pour diluer les colo-
rants nvec rindicateur qu'elle contient.
94 TECHNIQUES GENERALES
d'eau distillee neutralisee. Bien melanger, laisser agir '1 ou
2 minutes, puis laver a l'eau distillee.
Ce colorant D;'est pas p'ropre it donJ;ler seul une coloration
convenable des frottis. Il est destine a servir de premier
temps a Ia methode panoptique' de PaP1?enheim. 11 fixe
Ia preparation et met en evidence les 'elements acidophiles
et les granulations neutrophiles.
II est vendu en solution prete pourl'emploi, ou en poudre.
Dissoudre cette poudre dans l'alcool methylique pur, ala
dose de 2 gr. 5 par litre.

e) Colorant de Wright (marque RAL). Meme technique

que pour Ie colorant de Leishman.

f) Colorant de Giemsa. 10 Methode classique avec fixation

prealable. Fixer la lame prealablement avec de l'alcool
methylique ou avec Ie colorant de May. Grunwald (indique'
ci-dessus). Preparer dans une largeeprouvette, oudans une
boite de Laveran, une dilution de colorant de Giemsa danS'
l'eau distillee; neutralisee, a raison de:
Eau distillee. • • • . . • • 10 cc.
Colorant de Giemsa. . • • • . o cc. 5

Plonger la lame, sans l'avoir sechee, dans Ia solution de

Giemsa diluee, laisser colorer 10 minutes al). minimum,
I'aver a l'eau.
La fixation prealable de la lame peut eire faite en se ser-
vant du colorant de Leishman. On fixe 30 secondes a 1 mi-
nute par quelques gouttes de colorant de Leishman pur. Au
bout de ee temps, on egolltte l' exces de colorant et, sans laver.
Q.A plonge dans Ia solution diluee. Cette methode remplaee
Ia nouvelle methode rapide de Giemsa, et la solution de
Leishman est employee Comme Ie « Farbfixierenlosung )l.
Elle donne d'excellents resultats avec les pretozoaires.
2 0 Methode rapide. Verser sur Ie frottis, non fixe, 20
gouttes du colorant. COllvrir la lame pour eviter l'evapo-
ration de l'alcool. Laisser agir exactement 30 sect'lndes.
Ajouter ensuite 20 cc. d'cau distillee neutralisee. :Agiter
p,our hien melanger et laisser agir au mains une demi-
heure.
 PRINCIPALES MATIERES COLORANTES 95

Lavedl.l'eaudistillee et secher.
Le colorant de Giemsa se vend sous deux marques :
MarqueR, donne des colorations intenses, recommandee
pour les colorations rapides.
Marque L, recommalJdee pour les colorations lentes; il
pn\cipite rilOins rapidement que Ie colorant marque R.
Le colorant marque Lest aussi vendu en poudre, ce qui
est avantageux pour les transports; cette poudre est mise
en solution a raison de 0 gr. 76 dans un melange de:
Alcool metbylique. . • . • . . •• 75 gr.
Glyceyine. . . • • . . • • . .. 25 gr.

Le melange est mis a retuve it 370 et agite frequemment .

.Filtrer apres 48 heures.

g) Panchrome de Laveran (hieu de methylene, bieu de

toluidine, azur et violet de methylene, eosine). Ce colorant
peut etre employe en dilution de 1/2 centimetre cube dans
10 centimetres cubes d'eau distillee neutralisee, de la mem.e
fa!(on que Ie colorant de Giemsa, apres fixation du frottis par
un des procedes decrits.
II peut a'Ussi etre employe seul. realisant a la fois la 'fixa-
tion et la coloration de la lame.
Dans ce dernier cas, placer la lame a plat dans une boite
ae Laveran, versc~ sur Ie frottis 1/2 centimetre cube au
colorant, recouvrir, laisser agir comme fixateur pendant '3
minutes, ajouter 10 centimetres cubes d'eau disti'llee, me-
langer, laisser colorerlO a 20 minutes au mOIDs (1/4 d'heure
pour les protozoaires).

h) Panchrome de Pappenheim.
10 Fixer Ie frottis :it l' alcool methylique ou a'Vec Ie coloran t
de May Grunwald.
2 0 Egoutter la lame et la plonger, sans la secher, dans une
dilution <iu panchrome de Pappenheim prealablement pre-
puree a raison de :
Pancbrome ~e Pappenh eim. . . . • . 1/2 cc.
Eau distillee neutralisee. • . • • • • 10 ce.

Laisser colorer 15 a 20 minutes. Laver et seeher.

06 TECHNIQUES GENERALES

..
II. - Colorants non anilines, electifs
des noyaux cellulaires.

A. - HEMATEINE ET HEMATOXYLINE

a) Himateine alanee de 'Mayer (colorant nucleaire).

Eau . . . . . • • • • • • • . . 1.000 cc.
Alun de potasse. • • . • . . . • • 50 gr.

Chauffer jusqu'a dissolution de 1'alun, puis ajouter :

Hemateine. • • . • . • . 1 gr. dissoute dans:
Alcool absolu. . • • . • . 50 cc.

Melanger, laisser refroidir, filtrer. Laisser vieillir avant

1'usage, mais pas plus d'un mois, car Ie melange rougit a la
longue et colore bien moins. On peut garder separement
les deux solutions.
b) Hematoxyline Delafield.
A 400 grammes d'eau satureed'alun ammoniacal, on ajoute
4 grammesd'hematoxyline cristallisee, dissoute dans 25 cen-
timetres cubes d'alcool absolu. On laisSe reposer a la lu-
miere et a 1'air pendanttrois jours dans une capsule. On filtre
et on ajoute 100 grammes de glycerine et 100 grammes d'al-
cool methylique. On ahandonne au repos pendant plusieurs
jours dans un flacon bouche. Quand la solution est devenue
tres foncee, on filtre de nouveau et on repartit en plusi"eurs
flacons bouches.
c) Hematoxyline de Weigert (laque cuprique).
On mordance les coupes par immersion pendant 30 mi-
nutes dans une solution d'acetate de cuivre alp. 100. On
colore par:
Hematoxyline de Heidenhain. . • ., 0 gr. 50
Eau. • • . . . • . • . . . . . 100 cc.

Puis on differencie par la solution' suivante :

Borate de soude. • . • • 2 gr.
Ferrocyanure de potassium. 2 gr. 50
Ellu distillee. • • . • • • 200 cc.
 PRINCIPALES MATIERES COLORAN'J'ES 97

Si les coupes sont surcolorees, on les passe rapidement

dans l'alcool chlorhydrique:
Alcool a 70·. • . • . . • . • • . 1 Ii tre
Hel pur.. • . . . . . • . . • . XXXIII gU.

Puis on lave a l'eau distillee, deshydrate, etc.

d) Hematoxyline au fer (Jaque ferrique).
Mordancer les coupes sur lame pendant 30 minutes it 24'
heures dans Ia solution suivante :
Alun de fer ammouiacal (sulCate double
d'lImmoniaque et de sesquioxyde de ter). 1 a 3 gr.
Eau distillee. • • . . . . • • " 100 ce.

Laver rapidement, puis colorer pendant24 heures par une

solution a 0, 5 p.lOO d'hematoxyline de Heidenhain. Quand
la teinte est uniformement noire, on. rince a reau et on
differencie doucement et plus ou moins longtemps par Ja
solution d'alun de fer ammoniacal, jusqu'a ce que les
noyaux et centrosomes apparaissent au microscope en
hleu noir. On arrete la decoloration par lavage a l'eau
lorsqu'on Ja juge suffisante.

n. - CARM IN (colorant .nucleaire. reactif de la chromntine).

a) Carmin chlorhydrique. MeUre dans une capsule de por-

celaine 1 gramme de carmin. Ajouter peu ii. peu Ie melange:
Acide chlorhydrique. . . . • . . • I
Eau dislillee. . • . . . • . . . .) ii1l 2 cc.

en agitant avec une 'baguette de verre, jusqu'a formation

d'une bouillie homogene, violacee. Laisser au repos 1 a 2
heures, puis ajouter :
Alcool a 95 0 • • • • • • • • • • • 200 cc.

Verser dans un ballon it fond rond, bouche a1'0uate, tare,

puis eyaporer au bain-marie jusqu'a reduction de moltie.
Eviter l'inflammation des vapeurs sortant du ballon. R~paI"
tir ensuite en flacous
, bouches a l'emeri pour conserver.
~

b) Carmin de Orlh.
Sol. saturee a froid de carbonate de lithine. 100 ce.
Carmin • • • • • . . . . . . . • 2 gr. 50
lfICROBIOLOGIE 'J
98 TECHNIQUES GENERALES

Pour donner relection, traiter Ia coupe (apres coloration)

15 it 30 secondes par:
Acide chlorhydrique o ce. 5
Eau . • . . . . 50 ee.

Picrocarmin de Orth.
Carmin de Orth, Ii thine 1 vol.

On melange;
Eau picriquee satllrce . . . . . . . . 1 a 2 vol.
Apnis coloration, Jes coupes sont portees dans Ie fixateur
suivant:
Alcool absolll. . • . 70 ce.
Eau picriquee saturee . 30 cc.
He! pur. . . . , . o gr, 5

c) Picl'ocQl'min de Ranuier. Dissoudre du carmin a satu-

ration dans de l'ammoniaque et verser dans une solution
aqueuse d'acide picrique saturee.
Chauffer doucement au bain-marie dans une capsule pour
evaporer jusqu'a reduction aux 4/5du volume primitif(don~
evaporation 1/5 en poids). Apres refroidissement, fiJtrer sur
papier et evaporer a siccite. Le residu _est Ie picrocarmin
qu'on peut conserver en poudre et utiliseI' ensuite en solu-
tion aqueuse it 1 p. 100. Colore en rouge les noyaux, en
orange Ie protoplasma. '
d) Picrocarmin de Jensen,
10 Carminate de magnesium (P. Mayer): dissoudre 1 gram-
me de carmin et 0 gr. 1 d'oxyde de magnesium dans
50 centimetres cubes d'eau distillee, faire bouillir pendant
5 minutes. Apres refroidissement, filtration, addition de
o cc. 5 d'acide phenique.
2 0 Picrate de magnesium (P. Mayer) : verser 0 gr. 5 d'a-
cide picrique et 0 gr. 5 d'oxyde de magnesium dans 50 cen-
timetres cubes d'euu distillee Faire bouillir pendant
5 minutes, laisser refroidir et filtrer.
3 0 Solution alp. 100 d'acide picrique dans l'eau dis-
tillce, On mele alors 1 avec 2' et on ajoute Ienlement 10 cen-
timetres cubes de la solution d'acide picrique en agitant Ie
melange. II se forme nn liquide colorant tout it fait limpide,
d'nn rouge [once, qui se conserve pendant des mois,
 PRINCIPALES MATISRES COLORANTES 99

Les noyaux sont colo res en rouge, Ie protoplasma en

orange, les muscles et Ie sang en jaune et Ie tissu conjonc-
tif en rose,
C. - ENCRE DE CHINE"
au DE BURRI (marque RAL)
Encre de Chine speciale, tres commode pour rechercher
les treponemes et les spirilles sans coloration (voir plus
loin, meme chapitre G).
Au lieu de l'encre RAL on peut employer dans les memes
conditions l'encre americaine de Higgins.

.*,.
III. - Methodes usuelles de coloration des microbes.
A. - FIXATION
On fixe habituellement les cultures eta lees sur lame ou
les frottis d'organes en passant la preparation; lentement
comme si on coupait du pain, a trois reprises, dans ]a partje
chaude d'une flamme de bec Bunsen, frottis en dessus. II
est preferable de secher d'abord les preparations douce-
ment sur la platine chauffante ou a l'etuve et de fixer
cnsuite avec l'alcool-ether ou l'alcool methylique pur.

B. - METHODES DE COLORATION SIMPLE

DE MAURICE NICOLLE
Fixer.
Colorer 1 minute avec la solution alcaline de bleu de
methylene (bleu de Loffie,r).
Ne pas laver. Differencier par lavage rapide avec une
solution a 0 gr. 5 d'acide acetique cristallisable pour ~OO
d'eau distillee. Verser sur la preparation quelques gouttes
d'unesolution aqueuse a 10% de tanin a l'ether, laisser en
contact 8 a 10 secondes.
Laver a l'eau distillee, essorer, secher, eclaircir avec
une goutte de xylol et monter au baume de Canada. On
examine directement la preparation secnee dans une goutte
d'huile a immersion. Ou bien, colorer 1 minute avec:
Solution alcoolique saturee de thionine. . 10 ce.
Sdlution d'ncide phenique it 1 p. 100. • . 100 ce.
100 TECHNIQUES GENERALES

Laver a l'eau distill(\e 1/2 a 1 minute. Essorer, passedl

l'alcool absolu tres rapidement pour deshydrater, eclaircir,
etc.

C. - COLORATION DIFFERENTIELLE
DES MICROBES

a) Methode de Gram.
1 0 Pour les frottis, exsudats ou cultures.
Fixer, puis colorer 2 minutes par la solution de violet de
gen!iane pheniquee (ou par les violets 5 ou' 6 B, penta em
hexamethyles, ou par Ie bleu Victoria, a l'exclusion de
tout autre colorant).
Sans laver, verser sur la preparation la solution suivantlf
(solution de Lugol-M. Nicolle.) qu'on renouvelle 2 ou 3 fois
en 2 minutes :
Solution de Lugol (forte) :
lode • . • , . • 1 gr.
Iodure de potassium. 2 gr.
Eau distillee • . . 200 CC.

II se forme avec certains elemen.ts chromatiques une

combinaison (iodopararosaniline) insoluble dans l'alcool.
Decolorer a l'alcool a 95 0 , 10 secondes ~nviron, laver a
l'eau. Recolorer 30 secondes par la safranine. Laver a
l'eau; essorer; secher; xylol. Examiner dans une goutte
d'huile a immersion ou monter au baume de Canada au
xylol. .
20 Pour les coupes:
Colorer 5 a 30 minutes dans la solution de violet de gen-
tiane pheniquee.
Traiter 2 minutes (sans laver) par la solution de Lugol :J.
l'iode, qu'on renouvelle jusqu'a ce que la decoloration soit
complete. Laver a I'eau. Recolorer a la vesuvine (solution
aqueuse a 1 p. 100) ou par Ie picrocarmin de Ranvier
(solution aqueuse a 1 p. 100). Passer dans l'alcool faihle il
60 p. 100. Laver a l'eau. Secher. Xylol.. Baume.
b) Methode de Gram-Nicolle (recommandee).
10 Pour les frottis, exsudats, cultures: I
Fixer, puis colorer 1 a 5 minutes dans la solution sui-
 PRINGIPALES MATIERES COLORANTES 101

vante, en chauffant doucement au-dessus de Ia veilleuse

d'gn bec Bunsen:
Solution alcoolique de violet de gentiane. • 10 cc.
Eau pheniquee alp. 100. • . • • • . 100 cc.

Snns laver, verser sur la preparation quelques gouttes

1e solution de LugoI, qu'on renouvelle 2 ou 3 fois en 40u
5 secondes. Decolorer 8 a 10 secondes par l'alcool-acetone :
Alcool absolu . . . . ..... 3 vol.
Acetone • . . . • . • . . . . . • 1 vol.

Laver a l'eau. Recolorer 30 secondes par la solution

aqueuse de safranine ou par Ie Ziehl dilue. Laver it l'eau.
Essorer, secher, etc.
20 Pour les coupes:
Colorer d'abord pendant 30 it 60 secondes par Ia solution
suivante;
Carmin lithine de Drlh. . . . . • .• 5 vol.
Alcool it 950 • • • • • • • • • • •• 1 vol.

Sans laver, traiter 5 minutes par la solution de violet de

gentiane pheniquee (comme en q), puis solution iodee de
Lugol 4 it 6 secondes. Decolorer 8 a 10 secondes par alcool-
acetone (1 partie d'acetone pour 2 d'aicool absolu). Traiter
1 a 5 secondes par l'alcool absolu picrique (sature) jusqu'a
ce que la couleur devienne jaune verd~Hre. Laver a l'alcool
absolu. Secher, etc.
c) Methode de Gram-Claudius.
Colorer les coupes pendant 10 it 15 minutes par Ie car-
min de Orth alcoolise. comme ci-dessus, puis laver a l'eau
distillee. .
Colorer 1 it 2 minutes dans une solution aqueuse 'de
violet de methyle it 1 p. 100, ou de violet de gentlp.ne pbe-
nique.
Laver it l'eau, essorer.
Decolorer par Ie chioroforme, puis par l'essence de gi-
roBe, jusqu'it ce que Ia coupe prenne une teinte rose.
Eclaircir au xylol et monter au baume. Ou bien, pour les
frottis: secher au papier buvard, puis a l'etuve, examiner
dans une goutte d'huile a immersiorr. (Outre les microbes
qui prennent Ie Gram, on pent colorer ainsi Ie bacille du
charbon symptomat~que ct Ie vibrion septique).
102 TECHNIQUES GENERALES

d) Methode de Romanowsky (modifiee par A. Ple111l).

On laisse murir quelques semaines une solution aqueuse
a 2 p. 100 de bleu de methylene medicinal (exempt de
ZnCI9) a laquelle on a ajoule 5 'po 100 de borate de soude.
Melanger 2 parties de cette solution avec une partie de
solution aqueuse d'eosine alp. 100. Quinze a trente
secondes apres que Ie melange bien homogene a ete fait, et
qu'il s'est forme une pellicule irisee a la surface, on pre-
leve du liquide en introduisant l'extremite d'une pipette
sous la pellicule, et on Ie transporte dans une boite de
Petri ou un godet con tenant, face retournee en dessous, Ia
preparation a colorer. Au bout de 2 minutes, 1a coloration
est terminee.
On lave a l'eau. On passe quelques secondes dans l'alcool
a 90 0 et on revient rapidement a l'eau. Enfin on seche au
huvard et on monte dans l'huile de cedre.
Pour les coupes, ce procede est bon, mais seulemen! si
elles n'ont pas plus de 5 microns d'epaisseur. II faut les
laisser secher a l'air avant de monter dans Ie baume, au
lieu de passer a 1'alcool et au xylol.
e) Melhode'de Giemsa (pour les coupes et pour les frottis
d'organes).
Plonger Ia coupe pendant 10 minutes dans la solution
suivante : I
Iodure de potassium. 2 gr.
Solution de Lugol. . 3 ce·
Eau distilIee. • • . 100 ce.

Laver a l'eau rapidement. Traiter pendant 10 minutes

par Ul)e solution aqueuse d'hyposulfite de soude a
0,5 p. 100. Laver 5 minutes dans l'eau courante.
Colorer 2 a 12 minutes a la temperature de 37 0 a l'etuve
par:
Solution de Giemsa • . • • • '. . • . 10 gouttes
Eau distillee • • . . • • . . • • • 10 cc.

Placer la coupe inclinec, la face tournee en bas pour

eviter les depots. Laver rapidement a l'eau distillee, puis
passer successivement quelques minutes dans chacun des
bains suivants :
a) Acetone. 95 CC.
Xylol. . 5 ce.
 PRINCIPALES MATIE'RES COLORANTES 10:'1'

b) Acetone. . 70 cc.
Xylol . . . 30 cc.
c) Acetone. . 30 cc.
Xylol. . . 70 cc.
d) Xylol pur.

Monter a l'huile de cedre ou au haume.

f) Colorations des coupes de tissus par fhCmalcine-eosine.

On doit avoir it sa disposition une batterie de tubes
Borrel contenant :
10 Hemateine alunee de Mayer;
2 0 Solution aqueuse alp. 100 d'eosine, ou bien Ie
melange de Mann pour l'etude des protozoaires ou pour la
recherche des corps de Negri dans la rage:
Bleu de methylene alp. 100, sol. aq. 35 ce.
Eosine a 1 p.100, solution aqueuse. . 45 cc.
Eau distillee . • • • . . . . . 100 cc.

40 Alcool it 70 0 ;
5c Alcool it 90 0 ;
60 Alcool absolu;
70 Xylol pur.
Les coupes fixees, deparallinces, deshydratees, puis
repalisees it l'eau, sont d'abord plongees 5 a 20 minutes
dans l'hemateine.
Laver abondamment dans reau, Examiner it un faible
grossissement pour voir si la coloration est suffisante. Si
elle est trop intense, differencier par l'alcool chlorhy-
drique, plus ou moins longtemps. Si elle est bonne, difl'e-
rencier seulement quelques secondes par l'alcool chlo-
rhydrique et laver abondamment. On laisse les lames dans
l'eau courante ou mieux dans l'eau additionn'ee de 1 p. 100
de carbonate de lithium pendant 10 a 20 minutes.
Colorer ensuite 1 minute dans l'eosine (ou bien de
10 minutes a 24 heures dans Ie Mann). Laver abondamment
a reau.
Differencier par l'alcool a 70°, puis dans l'alcool a 90 0
jusqu'u disparition de la teinte rouge diffuse. Dcshydrater
rapidement par l'alcool absolu. Essuyer Ie dessolls de III
-lame pour enlever l'exces d'alcool et plonger dans Ie xylol
pur pendant 15 a 20 secondes, puis monter dans Ie baume
de Canada ou dans l'huile a immersion.
104 TECHNIQUE::) GENElIALli:S
.;

g) Coloration au safran de Pierre Masson (methode excel-

lente).
Pour preparer la solution de safran, on fait bouiUir dans
100 centimetres cubes d'eau distillee 1 gramme de stig-
mates aussi frais que possible. Apres une heure d'ebulli-
tion on filtre sur papier et on ajoute au liquide 1 <?enti-
metre cube de solution de tanin it 5 p. 100 et 1 centimetre
cube de solution commerciale de formol!.
Les coupes, fixees et hydratees par immersion dans l'eau
apres deparaffinage, sont colorees a 1'hemateine alunee de
Mayer comme cipdessus, differenciees it l'alcool chlorhy-
drique, bleuies dans Ia solution de carboll<tte de lithium it
1 p. 100, lavees et colort~es 1 heure dans la !,olution
d'eosine it 1 p, 100, lavees et immergees pendant 10 minutes
dans la solution de safran, puis finalement lavaes, deshy-
dratees et montees.
Les noyaux apparaissent en bleu fonce, Ie protoplasma
en rose saumon, les granulations eosinophiles en rouge
vir, les fibres nerveuses, elastiques et musculaires en rose
vif,les fibres conjonctives, l'osseine et la chondrine en
jaune d'or.
h) Methode au bleu polychrome de Unna (frottis et coupes).
Colorer dans Ie bleu polychrome -"pur (5 minutes a
12 heures it froid). Laver rapidement it 1'eau. Differencier a
l'ether glycerique de Unna etendu de 3 it 5 parties d'eau.
Laver abondamment plusieurs minutes. Deshydrater it
1'alcool ahsolu, rapidement. Passer au xylol et eclaircir a
l'huile de cedre avant montage'.

D. - COLORATION DES SPORES

Methode de Moller. Fixer 2 minutes par 1'alcool absolu,

pUis 2 minutes par Ie chloroforme. Sans laver, faire agir sUr
la preparation: acide chromique it 5 p 100. 3 a 5 lpinutes.
Colorer a chaud par la solution de fuchsine de Ziehl,
5 minutes (ou it froid 5 heures). Decolorer par l'acide sul-

1. On peut eviter cetle manipulatlo~ en employant la ?,ali~re ":,,tr~ite prcalablement

du safran Ipolychroite RAL) que Ion met en solutIOn a ra150n d. 0 gr. 2 dan&
100 centimetres cubes d'eau et 1 centImetre cube de formol La polychroite, tres
hygroscopique, est livree en tubes scelles d. 0 gr. 2,
 PRINGIPALES MATIERES COLORANTES lOG

furique a 5 p. 100, 5 secondes, ou par Ie chlorhydrllte

d"aniline (solution aqueuse a 2 p. 100) 1 minute, puis par
l'aICoo1 absolu.
Laver a l'eau. Reeolorer avee la solution aqueuse it
1 p. 100 ~e bleu de methylene I/.2 mio~te, ou p~r Ie hleu de
KullJH),dilue a 1 p. 3. Laver a reau. Egoutter, seeber:
f

E. - COLORATION DES eILS

a) Methode de Lo/ller-Ni"cQlle-Morax. - Pour la colo-
ration des cils, il importe de ne faire usage que de lamelles
au de lames bien propies qU:on lave a l'alcool, puis a l'ether,
et sur lesquelles on laisse tomber avec une anse de pIa tine
une goutte de culture jeune, diluee dans l'eau s.terile. Apres
dessiccatiQll a l'etuve. Sans passer sur Ia flamme, on verse
sur la pfep~ration une grosse goutte du mordant ci-apres,
en chauffant jusqu'il, emission de vapeurs; on lave aussitOt
al'eau distillee et on recomUlence de meme 3 ou 4 fois.
Mordant (encre de fuchsine):
Tanin (ii. l'ether) sol. IIq. q. 25 p. lOO. " 10 cc.
Sol. sat. iI. froid de sulfate ferreux. • . , 5 cc.
Sol. alcoo!. saturee de fuchsine. . . . ' 1 ce.
Colorer ensuite par la fuchsine de Ziehl a chaud iusqu'a
emission de vapeurs, pendant 10 a 15 secondes. Laver
aussitOt a l'eau distillee, secher, monter.
b) Methode de van Ermengem (tres elegante, recnmman-
dee).
10 Fixateur: Faire agir pendant Une demi-he:ure a froid
ou 5 a 10 minutes a chaud, sur pia tine chauffante:
Acide osmique iI. 2 % . . . . . . . 1 ce.
Tanin it 20 % . . . . . . . . . . . 2 cc,
Acide acetique . . . • • . • . . . IV gu.

Laver soigneusement a l'eau distillee.

211 Semibi{isaleur: solution aqueuse de nitrate ~'argent
de 0,5 a 2 p. 100. Faire agir pendant 2 a 3 minutes ju~q~'a ce
que les gouttes prennent une teinte grisiHre. Ne pa's laver.
Plonger 1 a 2 minut~s dans:
30 Reducteur: \
Acide gallique.. . • . 5 gr.
Tanin . . . . . . . 3 gr.
Acetate de soude fondu. 10 gr.
E;au distillee. • • • . 350 gr.
106 !ECHNIQUES GENERALES

Apres lavage, secher rapidement; examiner. Si la colora-

tion n'est pas suflisante, on recommence, apres lavage, 1a
sensibilisation et la reduction. Renouveler la solution argen-
tique des qu'elle commence a noircir.
c) Methode de Pit field, modifiee par Benignetli el Gino.
Solution coloranle : A 3 centimetres cubes de solution
alcoolique saturee de violet de gentiane, on ajoute 5 centi-
metres cubes d'une solution aqueuse saturee d'alun et 5 cen-
timetres cubes de la solution suivante :
Sulfate de zinc. • • • . • . . 1 gr.
Tanin . . . • . . . . . . . . 10 gr.
Eau . • . . . • . . . . . • . 100 cc.

On depose sur la lamelle une gouttelette de l'emulsion

microbienne, on fixe par la chaleur et on verse quelques
gouttes de la solution colorante. On chauffe directement ala
veilleuse d'un bec Bunsen jusqu'a emission de vapeurs ; on
lave soigneusement a l'eau et on seche a l'air, puis on monte
dans Ie baume.
Cette methode, tres simple, donne de bons resultats.
d) Methode d'Edgar Lancercaux.
1 0 Mordant:
Chlorure d'antimoine. ~ gr.
Tanin . . . • .) gr.
Formo\. . . . 10 Ce.
Eau dislillce. . 100 Ce.

2 0 Sensibilisaleur :
Nitrate d'argenl. 1 gr.
Eau distillee. 20 ce.
30 Reducteur :
MetoI (pnramethyIaminophenol). 1 gr.
Eau dislilhie. . • . .•. 20 cc.

(On peut Ie stabiliser en .ajoutant 5 grammes de sulfite de

soude.)
Utiliser des lames propres, lavees a l'alcooL Verser des
gouttes separees d'une ,dilution de culture de 24 heures
.dans de l'eau ordinaire (l'eau physiologique precipiterait
les sels d'argent et rendrait la preparation opaque); secher
a l'etuve.
10 Verser ]e mordant sur 1a preparation a colorer; chauf-
 PRINC/PALES MATIE:RES COLORANTES 107

fer au Bunsen vers 60 0 ;'Iaisser 'refroidir 10 mihutes. Laver

a l'eau courante, pui~ a l'eau distillee.
20 Faire agir Ie nitrate d'argent ammoniacal. On 'peut
obtenir un noircissement de la preparation immediatement.
On chauffe legerement sur la flamme du Bunsen jusqu'a ce
qu'on obtienne une teinte metallique, laver Iargemel\t a l'eau
ordinaire ou a I'eau distillee.
30 Faire agir I'e reducteur au metol pendant une minute.
Laver a l'eau ordinaire, secher et examiner a l'immer-
sion.
e) Methode de.Kiyoshi Yokota.
10 Culture. Fixation par addition de formol. - II est neces-
saire, pour le~ bacteries aerobies ciliees, d'employer des
cultures dans l'eau. de condensation de tubes de gelose in-
clinee a 2 p. 100, faiblement alcaline et fraichement prepa-
ree, maintenues a 33-35° de 18 a 24 heures.
L'eau de condensation prelevee est soigneusement centri-
fugee pendant 30 minutes environ; Ie eulot de centrifugation
contenanv les germes a etudier est ensuite emulsionne dans
une certaine quantite d'eau physiologique. En ajoutant du
formol a cette emulsion (0,5-1 p. 100), on obtient une
emulsion stabilisee en meme temps que 1'0n rend plus
facile l'action des maticres eolorantes.
20 Colorants. a) Mordant, - A une solution de tanin aeide
a 5 p. 100 on ajoute, goutt~ a gouttc, jusqu'a environ 10 p.
100 <lh volume primitif, une solution de tartre stibie saturee;
a ce mtlment la solution devient trouble et laiteuse Ainsi
preparee, ceUe solution pourra etre utilisee pendant un
mois environ.
b) Colorant. - On emploie Ie meI;lUge suivant :
Eau d'aniline. • • . . . . • • . • 30 ce.
Solution de fuchsine concentree. . . . • 1 cc.

3 0 Techniqlle de coloration. - On etaie sur une lame soi-

gneusement nettoyee une goutte de l'emulsion en couche
mince; on laisse secher a l'air; on fixe par la chaleur.
On mordance en chauffant fortement et pendant un court
instant, a la flamme du bec Bunsen, dans la solution de tanin
acide-tartre stibie jusqu'a ebullition et eclaircissement de la
solution. On lave largement a l'eau de conduite et la lame
recouverte de la solution de fuchsine anilinee est portee a
108 TECHNIQUES GENERALES

nouveau sm' la Hamme, jusqu'a ebullition. Lavage a l'eau.

Sechen entre 2 feuillcs de papier buvard. Examen micros-
copique.
Pendant Ia coloration, il est necessaire de chauffer it deux
reprises differentes et a une temperature tres elevee.

F. - COLORATION DES CAPSULES

a) lIfellzode de Johne : Colorer 1 ou 2 minutes avec une

solution aqueuse a 2 p. 100 de viowt de methyle ou de viole!
de gentiane tiede.
Laver a l'eau 2 secondes. Traiter par solution alp. 100
ou a 2 p. 100 d'acide acetique,10 secondes. Laver it l'eau.
Examiner dans l'eau (methode excellente po,ur l'etude des
capsules de la bactcridie charbonneuse) ..
b) MetllOde de Klett: Colorer a chaud,jusqu'a tiliullition,.par
solution hydro-alcoolique de bleu de methylene (1 gramme
de bleu, 10 grammes d'alcool, 100 grammes d'eau). Laver a
1'eau. Traiter parune solution de fuchsine de men~ concen-
tration que celIe de bleu de methylene, 5 secondes. Laver a
l'eau, examiner dans l'eau.
c) Methode de Friedlander: Laver d'abord Ia preparation
pendant 2 minutes (apres fixation) dans une solution it
1 p. 100 d'acide acetique. Egoutter. Secher.
Colorer quelques secondes par une solulion de violet de
gentiane dans l'eau saturee d'aniline. Laver a l'eau, secher.
Pour les coupes, colorer pendant 24 heures a 37 0 dans :
Solution concenlree alcoolique de violet de
gentiane. • 50 ce.
Acide acetique. • . . • . . . • 10 gr.
Eau distillee. • . . . . . • • 100 ce.

Differencier pal' solution d'acide acetique alp. 100.

Laver it l'ezm, egoutter, etc.

G. - EXAMEN DES CAPSULES ET DES ClLS SANS

COLORATION

a) Methode de Gins Ii l' encrede Burri (tres simple et reCOl1l-

mande-e):
On depose, au centre d'une lame, une gouttelette d'encre
 PRINCIP'ALES MATI1~RES COLORANTES 109

de Burri et on melange en suite a celle-d, avec un fil de

platine, une trace de la culture a etudier, delayee dans
une goutteleUe d'eau de volume egal a celui de la goutte-
lette d'encre. On etale Ie melange avec Ie bord d'une
lamelle couvre-ohjet, on laisse secher un instant et on exa-
mine dans une goutte d'huile a immersion. Les haciIles, les
capsules, les cils apparaissent nettement incolores sur Ie
fond noir. Bien avant Burri. et des 1884, Leo Errera (de
Bruxelles) avait propose l'emploi de l'encre de Chine pour
l'etude des infusoires.

b) Methode de Borin (pour la mise en evidence des cap-

sules microbiennes) : ' .
Les lames sont lavees au bichromate de potassium et a
I'acide sulful'ique) sbigneusetpent .rincees a reau distillee et
secheesa I'etuve. On depose alors sur l'une,d'elles nne goutt~
d'un serum quelconque (serum humain, serum de cheval ou
de toute autre espece animal e) . Au moyen d'une lamelle on
etale en couche mince Ie serum, a la fa~on d'une goutte de
sang, e1,on Ie desseche au-des sus d'une veilleuse de bec Bun-
sen. Lorsque la dessiccation est parfaite, on laisse refroidir.
On melange alors sur Ia lame une goutte d'encre de Chine a
Ia culture (une 'goutte de culture Iiquide ou une goutte d'une
(~muision en eau:physiologique de culture solide ). Avec l'anse
de platine (et non avec une lamelle) on Male la preparation'
sans s'inquieter de l'irregularite de I'epaisseur du frottis.
Celui-ci etant toujours humide, on inonde Ie tout avec du
xylol. On renverse Ia lame pour eliminer la plus grande
partie de ce liquide et on laisse tomber sur Ia preparation,
d'une hauteur d'un centimetre environ, une goutte d'huile
de cedre. Puis on porte sur la pIa tine du microscope et on
examine a l'immersion, sans interposer de lamelle. mais en
ayant soin de ne jamais meitre en;contact avec la lame la
lentille frontale de l'ohjectif. II cst necessaire de diaphrag-
mer. Pour des raisons d'optique, il ne faut examiner que
les germes fixes contre la lame; les germes en suspension
ne montrent pas de capsules apparentes, mais seulement
parfois une aureole. Les capsules ainsi fixees et aplaties sur
une face, par contact, apparaissent en 'gris clair sur Ie fond
noil' de la preparation.
 11.0 TECHNIQUES GeNERALES

H. - COLORATIONS DES VIRUS fILTRANTS

(Peripnenmonie. Chlamydo~oaires. Strongyloplasmas, etc.)

II est indispensable de diluer les virus ou les emulsions

/' de tissus (molluscum contagiosnm, lymphe vaccinale ou va-
riolique, etc.) avec de l' eau distillee ou de l' eau salee, phy-
siologique, sterile. Fixer par alcool absolu', ou par melange
en parties egales d'alcool methylique et d'ether, ou par l'al-
cool au sublime (Schaudinn) : 2 parties de solution aqueuse
saturee de sublime ou, mieux, d'apres la methode de Borrel,
par Ie melange suivant :
Acide osmique . . . 2 gr.
Acide chromiqne. • • 3 gr.
Chlorure de platine. • 2 gr.
Acide acetique glacial . 20 gr.
Ean distillee. . • • '350 cc.

Colorer (Bqrl'e1) avec une solution aqueuse de rouge Ma-

genta a la temperature de 5° pendant 10 a 15 minlttes ; trai-
ter pendant 5 minutes par une solution de picro-in~igo-car­
min (indigo-carlVin ou sulfo-indigotate de soude, I\sr. 75,
dissous dans 100 c.entimetres cubes d'eau distillee ; ~ltrer;
ajouter eau distillee, saturee d'acide picrique, 100 centi-
metres cubes). Laver rapidement a l'eau, passer a l'aIcool it
95°, eclaircir ap xyl~1 et monter au baume', ou examiner
dans une goutte d'hu\le it immersion.
On peut aussi employer la methode de Halbel'stadtel' et
V. Pl'owazek qui est une modification de celIe de Giemsa.
Le reactif colorant est a10rs compose comme suit:
Solution d' eosine (2 cc. 5 de solution d' posine
alp. 100 dans 500 cc. d'eau) . . 12 p.
Aznr I. sol. alp. 1.000 aqueuse • 3 p.
Azur I~, sol. a 0,8 p. 1. 000 aqneuse. 3 p.
ou bien encore (Lindner) ;
Ean distillee. . . • 10 cc.
Colorant de Giemsa glycerine . V gtt.
Acide acetique pur. . . • . 1 gil.
,
I. -COLORATIONS VITALES

Certaines couleurs basiques d'aniline sont absorbables

par les cellules vivantes lorsqu'elles sont solubles dans les
lipoi'des qui entrent dans la constitution du protoplasma.
 PRINCIPALES MATIERES COLORANTES III

Les plus interessanles a ce point de vue sont : Ie bleu de

methylene et Ie rouge neutre.
Bleu de methylene. II faut employer Ie bleu medicinal pur
frahc;ais RAL, en solution a 0,5 p. 1000u 1 p. 100 dansl'eau
salee physiologique.
Rouge neutre. Prend une couleur rouge ecarlate en
milieu_ acide, jaune ou rouge orange en milieu alcalin. On
l'emploie en solution tres diluee 0/2 it 1 centimetre cube de
solu~ion aqueuse, saturee, dans 100 centimetres cubes d'eau
salee physiologique)
Beaucoup de' petits animaux aquatiques, et meme des
poissons, vivent tresbien dans des solution!? de rougeneutre
alp. 10.000 ou it 1 P 100.000. Leurs tissus se colo rent en
rouge. Le protoplasm a et Ie nayau des cellules restent inco-
lores. Le pigment est fixe par les granulations protoplas-
mi<Iues.

a) Colorations des microbes vivants (pour etudier leur

structure) .
Methode de Neisser : Colorer quelques secondes avec un
melange de 2 parties de 1a solution a et 1 partie de Ia solu-
tion·b ci-apres :
Solution a:
Bleu medicinal en poudre. 1 gr.
Alcool Ii 96 0 • • • • • • 20 cc.
Eau distillee . . . . . . 1.000 cc .
Acide ncetique crist allis able • . 50 cc.

Solution h :
Alcool II 96 0 10 cc.
Eau dislillee 300 cc.

Laver a l'eau. Recolorer pendant 3 secondes avec une

solution de chrysoidine (colorant azoique, chlorhydrate de
diaminoazobenzene) : 2 grammes de chrysoidine dissoute
dans 300 centimetres cubes d'eau bouillante filtree et refroi-
die. Laver encore it l'eau. secher a l'etuve a 37 0 et exami-'
nero Ou bien, employer Ie bleu azur de Giemsa (1 gautte
de solution glycerinee de bleu de Giemsa pour 1 centimetre
cube d'eau distillee). LaisseragirlO it 30 minutes laprepa-
ration tournee face en dessous, a la surface du bain colorant,
pour eviter les depots, laver it l'eau, secher etexaminer.
112 TECHNIQUES GENERALES

J. - COLORATION POST-VITALE
Methode de J. Sa brazes au bleu de toluidine phenique,
pour la cytologie et Ia bacterioscopie des crachats, du
lait centrifuge, des depots d'urines, des residus gastriques,
des mucosites fecaJes, des exsudats fibrineux et purulents.
Le titre de la solUtion colorante peut varier d.{} 1 p. 50lJ'a
1 p. 100. La formule est la suivante :
BIeu de toluidine. . • • . . . o gr. 50
, Alcool j; 950. • • •
Acide pMnique . . .
.
•
• . • •
• . .
10 j;15 ce.
3 gr.
Eau distillee sterilisee q. s. pour. 100 Ce.

Le reactif est stahle: il se conserve indefinitnent asep-

tique. Le flacon a poste fixe se sedimente constamment. On
y puise par capillarite, avec une effilure de pipette plongee
dans Ie liquide sans toucher Ie !fond. Sur Ie frottis rec~t,
etale en couche mince, sans asperites, bien seche, on ren-
verse Ia lamelle chargee de la gouttelette de bleu ; elle doit
s'appliquer hermetiquement sur la lame. La solution colo-
rante impregne tres vite Ies elements desseches du frottis.
Le bleu de toluidine colore en bleu plus ou mo_ins pale
Ie cytoplasme, en violet rouge:Hre les noyaux, en viqiet
les nucleoles, en rouge Ie mucus, en rouge violatre l'atI)y-
lorde, en bleu pur la substance col1oide, en bleu terne cer-
taines substances Fpoides, la fibrine en bleu, les fibres
elastiques en vert pale, les grains d'amidon en bleu pule
verdatre. . .

J<. - COLORATION DES CHA_MPIGNONS

(Hyphomyceles, Teignes, etc., voir cpapitre xxxvnr.)

Degraisser d'abord soigneusement par l'alcool·ether.

Colorer pendant i) a 10 minutes dans une solution de bleu
alcalin de LoftIer ou de thionine pheniquee.
Laver a l'ean. Passer rapidement a l'alcool absoln, secher
et examiner dans une goutte d'bnile de cedre.

L. -- MONTAGE DES PREPARATIONS MICROSCOPIQUES

POUR L'EXAMEN APRES COLORATION,

Les preparations colorees s'abiment assez rapidement et

se decolorent. II importe de pouvoir les recolorer si c'est
 PRINCIPALES MATIERES CdLORANTES 113

necessaire. II ne faut done pas, surtout lorsqu'il s'agit de

preparations de sang 9onten~nt des' parasites. les monter
dans Ie baume de Canada. comme on Ie fait habituellement
pour les coupes histolcigiques. II est preferable de se
servir d'huile it immersion, ou, mieux encore, de paraffine
Iiquide, bien transpareQte (huile de paraffine).
NOTA. - Pour les transports au loin et la conservation
indefinie, on protegera tres simplement )es preparations
seches et fixees de sang ou de frottis, colorees ou non colo-
rees, en les recouvrant d'une mince couche de paraffine
fusible a 45 0 , dissoute dans dll xylol (parties egales de
paraffine et de xylol) qu'on laisse evaporer a l'air libre,
;1 l'abri des poussicres. Lorsqu'on veut Mudier et recolorer
ces preparations, rien n'est plus facile que de dissoudre
dans du xylol pur la mince couche de paraffine qui les
recoll\'rait.

~nCR0B10LOGIE 8
 CHAPfTRE VHf

TECHNIQUE DE FIXATION ET DE COLORATION DU SANG

ET DES PROTOZOAIRES SANGUICOLES

A. - Methodes de fixation des frottis de Sl;1·itg:

1° Par l'alcool absolu (Ia plus pratique. mais l'alMol ddit

etre rigoureusement absolu) ; Ie conserver en petits flttc6'ns
bouches a l'emeri et contenant. dans un sachet de toite, 'quel-
ques cristaux de sulfate de cuivre deshydrate (paJ.' c~Icina­
tion).
Temps: une demi-heure d'immersion (20 minutes au
moins).
2 0 Par l'alcool-ether (parties egales): 10 minutes. Bon
pour I'emploi du Giemsa, mais inferieur au precedenP.
30 Par l'alcool methylique seul, 5 minutes (procede recom-
mande).
40 Par l'alcool methylique-acetone (pqrties egales) : 2 a
5 minutes.
50 Par Ie chloroforme: quelques secondes sufli~ent.
60 Par l'acide chromique (Malassez), solution alp. 100 :
5 a 10 minutes, laver en suite it l'eau distillee. tres bon fixa-
teur. ..
70 Sublime iode (Dominici et Lenoble). On prepare Ie
bain sllivant :
Teinture d'iode fra!cbe. . . . . • . . 10 cc.
Solution aquense saturee de snblime. . . 90 cc.

II se forme un precipite. On filtre, et c'est dans Ie filtrat

jaune clair qu'on plonge les lames pendant 25 secondes.
Laver a l' eau courante. Le melange ne se garde pas au
dela de quelques heures.
8 0 Par les vapeurs osmiques : 10 secondes.

1. Verifier au moyen d'un papier de tournesol mouille que le melange :lleDol-ether

est bien neutre et ne laisse pas de residu acide par evaporation.
 "
FDMTION ET COLORATION DU SANG 115

9° Par Ie formol. Vapeu_rs ou immersion dans solution

alcoolique de formol it 1 p. 100. Duree d'nction : 1 minute.
100 Par Ie Flemming (Jolly). Le liquide de Flemming!;e
compose de:
Acide chromique a 1 p.·1oo 15 vol.
Acide osmique it 2 p. 100 • 4 vol.
Acide acHique cristallisable 1 vol.

10 minutes en plongee. Laver en suite it reau courante.

Tres bon fixateur pour la coloration de la chtomatine des
noyaux.
11 0 Par la chaleur (pour la coloration au triacide d 'Ehr-
l~ch).

B, - Coloration du sang.
Les methodes de coloration des frottis de sang les plus
employees it l'heure actuelle sont celles qui ont 6te decrites
au chapitre VII, E;c a h. Colorants de Leishman, de Wright,
de Giemga rapide, de Laveran, de Papp_enheim. Elles ont
a peu pres partout rem place les methodes anciennes dont
nous croyons ~canmoins devbir dcctite ci·dessous un cer-
tain .nombre. Les methodes nouvelles oifrent l'avantage
d'une rapidite tres grande et colorent avec nettetc tous les
details des parasites: hematozoaires, trypanosomes, etc.,
qui peuvent se trouver dans les sangs pathologiques.
a) Methode ali ttiacide d' 8hrlich.
Le triacide d'Ehrlich est compoSe de deux colorants
acides 'et d'lin neutre' (vert de methyle). On peut se Ie pro-
curer tout prepare chez Cogit, it Paris, ou Ie preparer soi-
meme, cotnme il a etc dit au chapitre vlJ, E.
Duree d'action : 30 minutes sur lames fixces par In cha-
leur.
Resultats : hematies couleur brique.
Noyaux bleu pale. peu 'Visibles.
Granulations neutrophiles tres nettes, sous forme de pain-
tilles violets.
Granulations cosinophiles oranges.
Hcmatoblastes gris violet: a peine visibles.
b) Methode de Dominici: Bleu de toluidine, eosine, orange.
Tr~iter d'abord pitt 'Une solution en parties cgales it
116 TECHNIQUES GENERALES

1 p. 100 d' eosine et d'orange pendant 2 a 5 minutes'. Laver.

Faire agir nne solution aqueuse alp. 200 de bIen de
toluidine pendant 2 a 5 minutes.
Sans laver, passer dans l'alcool a 60° rapidement. puis
dans l'alcool a 90 0 et dans l' alcool abs'olu. Secher et exami-
ner. CeUe coloration met en evidence: noyaux, proto-
plasma et granulations :
Hematies. roses ou oranges.
Noyaux, bleus.
Granulations eosinophiles, roses ou orangees.
Granulations neutrophiles, violet rose.
Hematoblastes, bleu pale.
c) Methode de Romanowskg.
Fixation it la chaleur a 105-110°. Coloration 1 ou 2 heures
uans
Sol. aqueuse saturee tie bleu de methylene. 2 parties
Solution aqueuse d'eosine Ii 1 p. 100. . . 5 parties
Ne se conserve pas... Laver a l'eau courante. secllCr.
d) Methode de Laveran au bleu Borrel.
On prepare separement :
Une solution aqueuse d'eosine i\ 1 p. 1.000.
Une solution aqueuse de tanin it 5 p .•100.

Pour colorer, on melange au moment de s'e~ servir, en fil-

trant les deux premieres sur un petit entopnOir :
'Solution aquense d' eosine it 1 p. 1.000. 4 cc.
Bleu Borrel. . . • . . . . 1 ce.
Enn distillee. . • . . • . . -6 cc,
On place la lame dans Ie bain en position verticale pour
climiner Ie precipite qui se forme. Colorer 20 minutes;
laver a grande Ilau. Faire agir 1a solution de tanin 1 minute.·
Laver a l'eau distillce, secher.
Laveran emploie aussi l'azur II au lie"\]. duo Men Borrel.
Solution aqueuse saturee d'azur II, 1 centimetre cube
(filtrer au moment de s'en servir), verser dans.;
Solution aqueus!l d' eosine it 1 p. 1.000
(filtree). . . . . . . . . • . , 2 cc.
Enu distillee. • . • . • • • • . • 8 cc.

Colorer 10 minutes, laver,. passer au tanin, laver, secher.

 FIXATION ET COLORATION DU SANG 117

e) Methode de Giemsa.
Fixer par l'alcool absolll 30 minutes.
Au &Ortir de l'alcool, les lames etant encore un peu humi-
des, les plonger dans Ie bain colorant, inclinees, de telle sorte
que les precipites ne sl:l deposent pas sur la preparation:
Solution de Giemsa (1). • .'. • . . 1 partie
Ean ordinaire (prealablement additionnee
de 2 gouttes d 'un melange a parties egales
d'alcool methyliqne et de glycerine pure
par cent. cube. . • • . • . • • • 9 parties

Colorer 20 a 30 minutes, laver a grande eau et secher.

Eclaircir, s'il y a lieu" par lavage rapide de quelques se-
condes a une minute dans une solution alp. 100 d'acide
borique et laver a l' eau.
La dilution du Giemsa dbit etre faite au moment del'usage,
car elle perd tres vite sa puissance colorante. Pour l'etude
des filaires, il faut employer une dilution faible, alp. 40.
f) Methode de R. Ross et Rllge. (Pour la recherche ~es
hematoioaires et des embryons de filaires.)
Au lieu d'etaler Ie sang en couche mince, on en depose
une grosse goutte au milieu d'une lame et on laisse secher
a l:etuve pendant environ deux heures, a l'abri des mouches.
Lorsqu'elle est seche, on la traite pendant 5 a 10 minutes
par un melange de :
Formol. . • . 2 cc.
At;ide ncelique • " lee.
Eau. . • • . 100 ce.

Ce melange fixe Ie sang et dissout en meme temps l'hemo-

globine.
On lave a l' eau.
On colore en suite par Ie Giemsa (1/2 heme a 1 heme) au
par la methode de Laveran a l'eosine-bleu Barrel, au encore
par l'hematoxyline (filaires).
Lorsque les hematozoa ires sont rares dans Ie sang, cette,
technique permet de les decouvrir avec plus de faciliM.
g) Coloration vitale dll sang. Methode de Pappenlzeil1t.
SUI' un porte-objet on depose, avec l'ex,tremite d'une

1. La solution de Giemsa, marque RAL concentree et glycerinee, se conserve pendant

tres longtemps.
118 TECHNiQUES GENERALES

. pipette, une gouttelette de. solution alcoolique alp. 100 de

l'un des colorants ci·apres :
Brillant Cresylbleu ou Azur II,
ou Soudan.

On laisse secher, puis, immediatement it cote, on depose

une gouttelette de sang frais qu'on recouvre d'u,pe lamelle.
Le sang s'etale sous celle-ci jusqu'f\ atteindre Ie depot sec
de matiere colorante, qu'il dissout .de proche en proche. On
peut aussi se ser.vir d'une solution de violet de mcthyle
dans l'eau salee physiologique a 8,5 p. 1.QOO- et dont on
melange une gouttelette a une goutte de sang frais, directe-
ment sur lame.

C. - Coloration des protozoaires et parasites

indus dans des cellules.

a) Pour les {roitis d'organes on peul employer les memes

techniques que pOllr les {rottis de sang (colorant de Giem~a, el~.).
b) Fixation au Bouin :
Solution aqueuse saturee d'aciqe pierique. 75 Ill'.
Formol. . . • . . . . • '. . . . 20 ce.
Acide acetique glacial. . . . . . . . 5 cc.
\
Pour les frottis, amibes, etc., 30 minutes d'immersion ;
laver a l'eau 5 minutes.

c) Coloration.
Mordan\(age des frpttis (amibes, protozoaires) peJ;ldant
15 minutes.dans une solution d'alun de fer ammoniacal a
3 p. 100.
Poser la lamelle sur une lame recouverte de la solution
et maintenir celle-ci sur platine <;hauffante a 40° au plus,
pendant 15 minutes .
. Passer a reau. Colorer pendant 15 minutes en chauffant
encore a 40 0 avec la solution d'hematoxyline a5 p. 100. Les
preparations deviennent noires. DecQlorer tres progressi-
vement a froid, sous Ie microscope. avec une solutiond'~lun
de fer alp. 100. Laver a l'eau. Monter. A aucun moment
ne laisser la preparation se dessecher.
 FIXATION ET C(JLORATIO" uu i).L'LNG 119

d) Coloration des coupes d'intestin ·pour la -recherche des

.atnibes ou in/usoires.
Colorer les coupes par la technique ci~dessus, a l'hema-
toxyline au f~r. Apre!! 'd,ecoloration et lavage a reau, colorer
1/4 d'heure dans sblution eosine-vert·lumiere. La prepara-
tion est rouge. DifIetencier a l'alcool absolu-acetique, a 10
p. 100 jusqu'a l'apparition des teintes vertes dq tisllU (jon-
jonctif et du mucus. Les muscles et les epitheliums demeu-
rent roses. Substituer directernent Ie xylol a l'alcqol absQlu
acetique et monter au baume.

D. - Coloration 4es coupes de tumelira QancetCI.I$es.

a) Methode de 8Qrr~1 (modifiee P41r Coca) &ur C9ul'lt;~ de
5 microns d'epaisseur, provenant de fragments fixes au
Zenker (voir cpap. l~) et enrobes en pilrf\ffiIW,
Immersion pendant 10 minutes dans U41~ soliltipu fllc9q~
lique d'iode 4 1 p. 100.
Lavage rapide avec alGool a 90 0 pour enlever l'e~ce!l'
d'iode.
Lavage a reau.
Immersion pendant une heure dans urte sqJution aq"euse,
saturee de Magenta.
Lavage a l'eau.
Immersion peJ?dant 5 minutes dans la solution suivantlf:
Indigo carmin (ou sulfo-indigotate de
soude). . . . 0 gr. 75
Eau distillee . • • . • . . . . . 100 ce.

Filtrer et ajouter :
Eau distillce saturee d' aeide pierique. 100 ce.

Differencier par lavage a l'alcool a 95 0 (avec Ie flacon

compte-gouttes), sans lavage prealable a l'eau.
b) Methode a ['eosine bleu.
Immersion pendant 10 minutes dans la solution alcoo-
liqued'iodea 1 p. 100.
Lavage rapide a l'alcool a 95° pour eliminer l'iode.
Lavage a l'eau. "
Immersion pendant 45 minutes, ala temperature de 55 0
,

dans une solution agueuse d'eosine a 5 p. 100.

120 TECHNIQ UES: GENERALES

Lavage a·r eau.

Immersion pendant 20 minutes dans la solution suivante,
diluee a raison de 5 p. 100 dans l'eau distillee :
Carbonate de potasse . . . . 1 gr.
BIen de methylene medicinal • 1 gr.
Ean . . . . . • . • • . • 100 ce.

Differencier par l'alcool a 95 0

•

E. - Fixation et coloration des frottis de tumeurs :

Epithelioses, Clavelee, Vaccine, etc. (d'apres Borre!).
Etaler Ie frottis en couche mince et, avant toute dessiecn-
tion, passer rapidement la lame dans une solution de tanin
a 5 p. 100 'qui produit instantanement l'adherenee de In
pellicule.
On verse en suite Ie fixnteur sur In lame (fixateur aceto-
osmochromique de preference) (voir chap. IX, A, e.)
II se produit un leger precipite de tannate d'osmium que
ron entraine par un execs de fixateur.
Fixer environ 1 heure.
Laver a l'eau.
Colorer par la methode Rouge mngenta·picro-indigo-
carmin, indiquee ci-dessus, en D.
 CHAPITRE IX

FIXATION ET INCLUSION DES FRAGMENTS DE'TISSUS

OU D'ORGANES DESTINES A-FOURNIR DES COUPES

Les fragments doivent etre ,coupes au rasoir,- jamais

aux ciseaux, Bien que l'on puisse faire des coupes larges,
pour la bacteriologie, nous conseillerons de prelever de
petits fragments: 2 a 3 mm. d'epaisseur sur 1 a 2 cm. de
largeur. Les temps que nous indiquons conviennent pour
des fragments de cette taille.
Pour fixer et inclure dans la parniline les fragments d'or-
ganes ou Jes petits anirhaux destines aux coupes microsco-
piques, il est tres commode, comme l'ont indique M. Calli-
lery et A, Chapelier, de se servir de tubes I de verrc dont
l'extremite inferieure, d'un diametre de 10 millimclres
environ, est fermee par une toile maintenue par une liga-
ture On y introduit Ies objets a couper. Ii suffit alors de
porter Ie tube et son contenu dans les liquides successifs,
jusque et y compris la paraffine fondue.
A chaque changement, Ie liquide filtre a travers la toile.
On peut naturellement effectuer des lavages aussi soignes
que l'on veut. La paraffine de la derniere operation, main-
tenue dans Ie tube et refroidie rapidement, fournit, grace it
la forme du tube, un bloc immediatement utilisable sur Ie
microtome, sans rognures. On Ie demonte en chauffant
Iegerement Ie bas du lube et en poussant.
Ce procede tres simple evite toute perle de materiel.

A, - Liquides fixateurs pourlesfraglllents d'organes.

a) Formol.
Formol du commerce, II 40 %, neutre 4 II 10 ce.
Eau de conduite, . , • . • , q s. p. 100 c::.
(ou mieux eau, salee physiologique).

Ce procede, tres simple, est pratiquel~ent suffisant pour

122 TECHNIQUES GENERALES

la recherche des microbes dans les tissus, lorsqu'on ne tient

pas a obtenir des details histologiques fins.
La fixation est obtenue apres 24 heures. Elle peut durer
heaucoup plus longtemps.

b) Alcool formol
Formol i\4Q %, neutre • H> c:~.
Aleool a 950 . . • . 90 ee.

Mcme technique que ci-dessus.

Ce procede est aussi simple que Ie precedent et donne de
meilleuJ;s resultats.

c) Liquide de Carnoy.
Bichlorure de mercure a saturatiou dans
l'eau distilIee chaude, puis refroidie et
qecan1ee . . • .' . • • . • . . . 100 cc.
;\cidll acetique cristallisable. . . . . • o cc.
Fixation de 3 a 6 heures. Laver 24 heures it l'eau cou-
rante avant inclusion.

d) Liquide de Zenker.
Bichlorure de mercure sec. 5 gr.
Bichromate de potasse. . 2 gr. 50
Eau.distillee . . • " . 100 gr,

Au mQment de l'emploi, ajouter 10 it 201% de formol d,u

commerce. Fixation 6 heures.
Laver 24 heures a l'eau courante avant d'inclure.

e) Liquides de Flemming (conserver it l'obscurite en fla-

cons noirs ; it n'employer que pour de tres petits fragment:;
de tissus de 2 a 3 millillletres d'epaisseur).
1) Solution forte a I pour 100 15 cc.
Acide osmique a 2 pour 100 4 ce.
Acide acetique eristallisable 1 ee.
2) Solution faihle.
Acide chromique It 1 pour 100 25 ec.
Aeide O<Imique U 1 pour 100 . 10 ce.
Acide acetique a 1 pour 100 • 10 cc.
Ean distillee . • . . . • 55 cc.

Fixation 24 heures. (Toutes les colorations ne sont pas

possibles apres celte fixation, notamment l'hemalun.)
 PREPARATION DES COUPES 123

f) Liquide de van Gehuchten (surtout pour les fragments

de tissu renal).
Alcool absolu. \ • . . . . 60 ce.
Chloroforme • . • • • • 30 cc.
Acide acetique cristallisable • 10,cc.

Fixation: 4 heures ; 'ne pas laver avant la deshydratation

par l'alcool.
g) Liquide de Borrel (pour la fixation a basse ;temperature
des org~nes glandulaires 'en tres.petits fragmepts).
Eau . . . . • • . • . • 350 cc.
Acide chromique. • • • • 3 gr.
Chlorure de pia tine . . . . ,2 gr.
Acide bsmillu~. . . , . . 2 gr.
Acide acetique cristallisable . 20 gr.

Fixation ala glaciere 12 a 24 heures. Lavage a l'eau cou-

rante 24 heures. .
h) Liquide de Dominici.
Solution aqueuse saturee de sublime a 60·
centigrades. . . • . . • • . . , 90 ce.
Formol du commerce . • • . . . . , 10 cc.

Au moment de l'emploi. ajouter goutte a goutte de la

teinture d'iode jusqu'a couleul' de vin de Porto. Fixation:
3 heures a l'etuve entre 400 et 500 •
i)Liquide. de Perenyi.
Pour la fixation des mousliques et des arthropodes en
general. '....
Solution aqueuse d'acide chromique a 0,5
p, 1QO • • • , • • . . • . • • • so cc.
Solution d'acide azotique pur it 10 p. 100 . 40 cc,
Alcool absolu .. . . . . • . . . . • 30 cc.

Immersion 6 it 24 heures, puis alcoQI a 70°, alcool it 90°,

alcool absolu, xylol. paraffine.
j) Liquide de Bouin (modifie par P. Masson).
Fqrmol du commerce , . 10 cc.
Eau • . . . • . . . , . . • • • 30 cc.
Al;ide lU:etique glacial.. . . • . • . • '2 cc.
Acide picrique a saturation.

Cetta solution peut se conserver indefiniment. II doit y

124 TECHNIQUES GENERALES

avoil' un exces d'acide picrique dans Ie fond uu ·flacon.

Fixation: 2 jours. Les pieces peuvent sejournel' dans ce
liquide jusqu'a 6 ou 8 jours sans s'alterel'. C'est un excel-
lent fixateul', tres recommandable pour toutes les recher-
ches hacteriologiques et particulierement pour celles qui
portent sur les protozoaires.
k) Liquide de Dubosc-Bra:il (recommande par Chatton
pour les amibes).
Alcool it 80 0 • • • • • • 150 ce.
Formol commercial . . . 60 cc.
Acide ace Ii que glacial . . 15 cc.
Acide pieri que eristallisable' 1 gr.

Fixation: c'est Ie procede Ie plus rapiue ; 1/2 heme

pour uneepaisseur de' 1 mm.; 2 heures pour2 mm. ; opti-
mum: 24 heures.
I) Fixalellr de Stamm (recommande pour les arthropo-
des).
Melange bouillant a pnrties egnles de formol au quart et de sublime
sature.

Nota. - Les fixateurs it base d'acide osmique, d'acide

chromique, de bichromates, de chlorure d',or et Ie mela'nge
de Flemming genent plus ou moins les colorations bac-
teriologiques i les fixateurs osmiques ne genentl que les
colorations histologiques. Les alcools,l'ether,)e sublime,'
l'acide picrique, Ie formC?1 et Ie liquide de Bouig n'ont
aucune influence nuisible.

B. - Inclusion des fragments d'organes destines

a la microtomie.
\
a) Deslzydralaiioll de la piece. - Au sortir du fixateur,
plonger directement dans l'alcool absolu, Ie lavage n'etant
requis que dans les cas indiques ci-dessus.
Le volume d'alcool doit etre 15 it 20 fois celui de la picce.
On emploiera 4 bains successifs, chac.un d'une duree mi.
nima de 3 heures. Pour des raisons d'economie, Ie premier
et Ie deuxieme baill pourront etre dOIlJles avec des alcools
absolus ayant deja servi respectivement deuxet une fois.
 /"
PREPARATION DES COUPES 125

h) Pelletration par Uil solvant de la paraffine. - Apres Ie

4e bain d'alcool absolu, 1a piece sera portee dans dix fois
son volume de' toluene (meilleUJ." marche que Ie xylol et don-
nant de meilleures inclusiorts): 3 bains successifs de 3 heures,
au moins, chacun. Pour· des raisons d'economie, Ie' 1er et Ie
28 bain pourront etre donnes avec des toluenes ayant deja
servi respectivement deux e.t une rois.
c) Inclllsion. - Apres Ie 3 e bilin de toluene, porter la piece
dans la paraffine fusible a 540 • fondue a l'etuve reglee a 56°.
(On ameliore beaucoup la paraffine en y ajoutant environ
:") % de eire a parquet.) Utiliser 3 bains, snccessifs de
paraffine d'une duree minima de 3 heures.
Les paraffines des ler et 2 e bains peuvent servir illde-
finimen·t. Le 3e bain necessite de la paraffine neuve. H
servira aincIure.la piece.
Pour cette operation, I'ustensile Ie plus commode consiste
en l~ne petite bolte metallique it paroi mince ou, a deEaut,
une boite de carton.
Collage des cOllpes. - Le mban de coupes etant obtenn,
on sep:ue une coupe avec un scalpel et on la porte,ta face
brillante elt dessolls, sur une lame propre, recouverte d'eau
gelatinee.
Eall gelatinee. - Dans une feuiIle de p;elatine blanche,
decouper un carre de 1/2 cm. de cote; Ie faire dissondre en
chauffant dans quelques. centimetres cubes d'eau distiIIee,.
dans un tube a essai; apres dissolution, remplir Ie tube
d'eau distillee froide, agiter et filtrer.
Le collage des coupes sur lames peut egalement se faire
par l'albllminc de Maycr :
Albumine d'oouf . 30 cc.
Eau distilIee '. . . . . 5 c~·.
Glycerine it 300 Bo • . • ]0 cc,

ou par Ie blanc tf'reuf de DeJ1ige,~ :

Blanc d'reu£. . nO 1
Eau dislillee , . . • . . . 150 ce.
~cide acetique. • . . . . . 3 gr.
Dissoudre l"acide acetique dans la solution Illbumineuse. Fillrer.
'-
La lame' est portee sur une pl~tine chauffante. L'etale-
ment doit etre obten~ ires rapidemellt, en l'aidant avec deux
126 TECHNIQUES GENERALES

aiguilles montees. mais fa paraffine ne doit pas fondre.

Egoutter reau gelatinee ; essorer au papier Joseph; laisser
secher a l'abri des poussieres entre 400 et 500 • Les coupes
sont collees en une 1/2 heure si elles sechent dans une
atmosphere de vapeurs de formol. Sinon il sera prudent
de les laisser de 12 a 24 heures.
Trailement des coupes avant la coloration. - Porter suc-
cessivement la coupe collee dans des cylindres de verre
(tubes de Borrel) contenant les liquides suivants :
10 Toluene I. une minute;
2 0 Toluene II. une minute; egoutter; essuyer Ie dos et
les bords, laver Ia lame a l'aicool absolu contenu dans un
flacon compte-gouttes;
3 0 Alcool a 95° formole a 10 %, deux minutes;
4 0 Alcool a 800 , deux minutes;
50 Eau distillee.
A partir de ce moment, jusqu'au montage, la coupe ne
doit plus se dessecher.
Si l'on a employe un fixateur au sublime, il seranecessaire,
a la sortie de l'eau distillee et avant la coloration, de laver
1a coupe pendant une 1/2 beure dans la solution de Lugol,
puis, jusqu'a decoloration, dans l'hyposulfite de soude a 5 %.
Nouveau lavage a l'eau distillee.
d) Deshydratation continue. _.- Pour ~deshydrater les
pieces destinees aux coupes histologiques, Limousin
emploie une technique simplifiee qui lui donne de tres
bons resultats.
Les fragments de tissus sont fixes pendant 24 heures dans
Ie liquide suivant:
Acetone. . . . 150 gr.
Formol. . . • 60 gr.
Acide pieri que •. 1 gr.
Acide aeetique. 15 gr.

Si l'on a affaire a des organes tres mous, comme Ie foie,

Ie rein, Ie poumon, il est avantageux d'en immerger un frag-
ment assez gros, pendant 3 heures, dans ce fixateur: Ie
fragment deviendra assez ferme pour etre ensuite taille a
l'epaisseur voulue, a I'aide d'un rasoir.
Les fragments ainsi obtenus sont alors replaces dans Ie
fixateur jusqu'au lendetnain.
 PREPARATION DES COUPES 127

Au sortir du fixateur, les morceaux de tissus sejournent

24 heures dans un appareil a deshydratation continue par
l'acetone anhydre. L'acetone elant miscible a l'eau et a la
paraffine, des traces de ce produit ne peuvent . gener rin-
elusion a la paraffine, comme cela a lieu avec 1'alcoo1. Au
sortir de l'acetone il suffira done d'c,~claircir les pieces du-

Fig. 14. - A gauche l"appareil construit par « Pyrex ». A droite, appareil

qu'il est facile de construire soi-meme.

rant quelques heures dans un seul flacon de toluene ou

d'nuile de cedre, puis de faire l'inelusion a la paraffine sui-
vant la technique habituelle.
128 TECHNIQUES GEN/~RALES

L'nppal'eil a deshydl'atalion continue est essentieHement

compose d'un flacon a large goulot, eontenant du earblll'e'
de calcium cone~sse, et rempli d'acCtone. A travers un bon
bouehon hermelique, penetre une eprouvette, dont Ie fond
est perce de trous. Vne autre petite Ol1vertnre est menagec
dans Ie haut, au-dessous dll bouchon dll flacon et au-dessus
du niveau de l'acetone, de fa~on a maintenir l'equilibre des
deux liquides, qui ponrrait etre modifie pm' un degagement

Fig, 1:>. - r;"PP,"'cil ou\'ert POIII' chungcr la pil'ce pal" "implc rCl1\'erscment
<II' l'eproLl\'elte.

degaz. L'eprouvette est fermee par un bouchon muni d'une

soupape, simple tube etrangle, et dont l'ctranglement re-
tient nne biUe de verre. On place les pieces dans l'eprou-
vette centrale et on les retire au bout de 24 hem'es a I'aide
d'nne pinee. Si Ie bouchage est convenable, l'appareiI pellt
servir plusieurs mois Sans etre recharge.
 PREPARATION DES COUPES 129

L'acetone usage sert a la confection du fixateur. mais il

est necessaire de filtrer apres Ie melange des difl'erents
produits.

C. - Digestion artificieUe des tis sus et decalcification.

a) Digestion artificielle des coupes de tissus cartiiagineux, de
lo nucUine, de id gelatine et dll tissll conjonctif reticule :
Trypsine.. . o gr. 20
Eau distillee. 100 ce.
Soude.. • . o gr. 30
ChlQ[·oforme. qu.e[q. gouttes.

A l'etuve a 370 pendant 12' au 24 heures au au bain-marie.

Cette digestion peut se faire directement sur lames. On
13 suit uu microscope et on l'arrete par lavage a reau aci-
dulee, puis a l'eau courante.
b) Decalcification des tissus osseux par ia solution de Hang.
Acide nilrique de densite 1,4.. . . . • 10 gr.
Phloroglucine. • . , •..• 1 gl'.

Faire dissoudre a chaud, ajouter ensuite

Eau dislillee. . . . • . . . 100 ce.
Acide Ilitrique de den site 1,4.. . . . . 10 gr.

Laver ensuite a l'eau courante pendant 48 heures.

MICROBJOJ.OGlE 9
 CHAPITRE X

MARCHS A SUIVRE POUR LA DETERMINATION DES

MICROBES D'APRBS LEUR MORPHOLOGIE ET LEURS
FONCTIONS BIOLOGIQUES ..

1. - Examen microscopique.

a) San$coloration en goutte pendanteCsur culturesjeunes):

mobiHte, forme et rapidit~ des mouvements.
b) Avec coloration (fuchsine, violet de gentiane, thionine,
Giemsa) : forme des elements, isoles ou groupes, dimension,
arrangement en chaines oU.en amas, absence ou existence
de spores.
c) Methode de Gram: resistance ou decoloration au Gram-
Lugo!.

II. - Culture dans les milieux us~els.

a) Bouillon simple et eau peptonee.

Trouble ou limpidite apres 24 heures, ou plus, a l'etuV€
a 370 et apres 48 heures, ou davantage, a la temperature du
laboratoire; aspect du trouble: uniforme, grumeleux, ondes
soyeuses. anneau muqueux adherent au verre, etc., for-
mation de voiles et aspect de ceux-ci (irises, epais ou
'minces, muqueux ou sees, plisses ou lisses, etc.), formation
d'un d~pOt (pulverulent, muqueux, caseeux, etc.), reaction
alcaline ou acide apres developpement de la culture,
odeur de Ia culture.
b) Gelatine enplaqlles, ida temperature de 20-22°. I
Date de I'apparition des colonies apres ensemencement.
Leur aspect, leur coloration, leur developpement. Date et
marche de Ia liquefaction si elle se produit. Aspect et
 DJ1TERMINATION DES MICROBES 131
forme- des colonies de surface et des colonies de profon-
deur. Odeur de la culture.
c) Gelatine en piqi1l'e.
Aspect de la trace d'jnoculation (invisible, granuleuse,
arborescente, etc.). Marche de la liquefaction (en form£'
d'entonnoir, de cupule, de bulle d'air, etc.).
d) ·Glllose incliRf!e; en surface.
e) S~rum gelatine incline.
f) Pommes de terre,
g) Gelose glucosee at nitl'atee de Veillon (culture anaerobic).
Avec ces divers milieux, on determinera si Ie microbe es~
anaerobie ou a~robie, oU anaerobie facultatif. On precis era
la temperature optimum de sa culture surles milieux; les
plus favorables, sa resistance it la chaleur et son aptitude
it former des pigments colores sur les divers milieux.

III. ~ Action sur les matieres azotees.

a) Eau peplonee simple: formation d'indol.

b) Albumine Guile: tube de Mette pour la recherche des
ferments proteolytiques.
c) Lait : coagul::,ttion pl!r ?cidifjcption ou par production
de presure, _peptonisation de Ia caseine.
Epreuve sur lait additionne de carbonate de Ghaux (pur
et precipile) pour eviter la coagulation PfJr les acides.
Epreuve sur bit colore au bleu de tournesol avec 2.
p. 1.000 de chlorure de calcium (temperature de 370) pour
determiner s'il s'agH d'une presure.
d) Uree ; transformation en cllfPonate d'ammoniaque pal'
secr6tio(l d'ur6asB,
e) Nitrate : eall peptance alp. 1QO additionn~e de 1
p. 100 cie nitrate de potasse pur, stMilisee, 48 hellres aprea
ensemencemept, rechercher la presence des pitrites par Ie.
reactif de Tromsdorf et noter sur les cultures:
132 TECHNIQUES GENERALES

si Ie nitrate est decompose avec deg~gement gazeux ou

sans formation de nitrites;
si Ie nitrate donne des nitrites sans degagement gazeux ;
si Ie nitrate n'est pas reduit.
qn repetera les reactions sur les tubes temoins non ense-
menees.

IV. - Action sur les hydrates de carbone.

En raison de Ia production de composes basiques par les·

microbes, on ne peut etre certain de l'action de ceux-ci
sur un hydrate de carbone donne qu'en introduisant dans
un milieu convenable une quantite connue de' ce corps,
pese au milligramme pres, aussi pur qu'il est possible de
l'obtenir, et en dosant cequ'il en reste dans la culture apres
un certain temps de sejour a Ia temperature optima.
A cause de l'action des constituap.ts des milieux sur les
glucides pendant la sterilisation, avoir soin de toujours
prepareI.' un ou deux temoins avec Ie meme volume de mi-
lieu, Ie meme poids de glucide et un recipient identique ;
on les sterilise en meme temps que les tubes ou ballons
d 'essai, mais on ne Ies ensemence pas. Temoins et cultures
sont places cote a cOte a l'etuve, d'ou on les sort ensemble
pour les analyser simultanement.
Comme milieu de culture on emploie gen¢ralement:
Eau. • . • . . 0 • • 0 0 • • • ° 100 CC.
Peptone seche verifitie exempte dOhydrates de
carbone. • . . . . . . . • . . • 1 gr.

ajuster Ie milieu a pH = 7,2 a 7,5, mettre en ballons, ajouter

une quantite de glucide (hydrate de carbone) exactement
pesce et calculee de telle fa~on que Ie milieu renferme de 2
i13% du corps etudie. SteriliseI' de preference par trois chauf-
fages de 1 heure a 100 degres, sinon 20 minutes a 115 degres.
Pour que l'attague des glucides ne soit pas gence par
l'acidification des cultures, on ajoute au milieu un exces de
carbonate de calcium. Ce compose, meme Ie plus pur, en
agissant a chaud sur les peptones augmente notablement
l'aIcaIinite des milieux et accroit l'alteration des glucides ;
il est facile d'eviter cet inconvenient en introduisant asepti-
quement. avant l' ensemencement, dans les tubes ou ballons
 DETERMINATION DES MICROBES 133

renfermant Ie milieu sucre, une certaine quantite d'un lait

assez cpais, prepare a l'avance, en sterilisant; dans de reau
distillee, du carbonate de' calcium precipite, leger, chimi-
quement pur (les carbonates'lourds sont mbins facilement
attaquables dans les solutions diluees d'acides faibles).
Au lieu de carbonate de calcium on peut introduire it
l'avance dans reau peptonee un melange de phosphates
alcalins qui constituent d'exceIIents tampons.
La quantitedephosphatesdoit eire d'environlOpourlOOO
et la proportion respective du P04Na 2 H et de PO' KHZ
doit etre calculee et essayee de maniere que Ie milieu,
apres sterilisation, soit a pH = 7,2,a 7,4.
Quand on ne disposera pas du temps ou des moyens ne-
cessaires pour analyser les cultures, on pourra determiner
approximativement l'action des hacteries sur les glucides
it l'aide de la technique suivante :
10 Preparer la solution suivante:

• Eau. . . . . • . . • . . . . . . 1.000 CC.

Peptone pancn\atique de viande Defresne
exempte d'hydrates ue carbone. • • . , 20 gr.

Ajuster cette solution de maniere que sa reaction aprfs

sterilisation a 1150 soit bien neutre, c'est-a-dire corresponde
a pH =,7. La repartir par 10 cc. dans des tubes a essai de
Pyrex ou it deraut en verre vert. Steriliser 20minutes a 115°.
20 Preparer d'autre part (en avoir toujours en stock) des
sQlutions concentrees, titrees, des glucides aessayer, conser-
vees steriles en ampoules de Pyrex ou de verre neutre.
30 Disposer sur des supports aut~nt de tubes d'eau de
peptone, plus deux, que ron veut examiner de sucres. Con-
server deux tubes comme temoins; introduire aseptiquement
dans chacun des autres la dose de glucide convenable
(1 a 3 %). Preparer 2 series de tubes pour chaque microbe
etudie: placer une nuit a l'etuve it 37 0 pour s'assurer
qu'aucun tube n'a cultive. Preparer une emulsion bien
homogene de corps micro biens provenant d'une culture
de 24 heures sur gelose et, avec la JIleme dose dc celle-
ci, ensemencer tous les tubes, sauf un des deux temoins.
Maintenir les tubes a 37 0 et, au bout d'un ou trois jours
par exemple) introduire, dans tous les tuhes, Ie meme
134 TECHNIQUES GENERALES

nombre de gouttes d'une bonne tointure de tournesol lIen-

sible f; noter les resultats par comparaison avec les temQins.
Du quatrieme au dixieme jour, faire la meme operation
avec Ia 2e serie de tubes. Pour chaqRe microbe on pourrait
avantageusement preparer deux autres series de tubes
qu'on examinerait en meme temps que les autres, mais
avec un indicateur polyvalent comme Ie B. D. H. Universal
Indicator, prepare par The British Drug Houses Ltd,
qui permet d'apprecier approximativement les variatidns
dupH.
Quant a Ia maniere d'exprimer les resultals. cUe dbit
varier avec la technique employee, Lorsqu'on aura pratique
des dosages, et dans ce cas seulement, on pourra dite qu'un
microbe attaque ou n'attaque pas tel ou tel glucide, mais
quand on aura simplement appre(:ie ave!; les indlcateurs la
variation dela reaction des milieux sucres, on devra S6 Ma-
tenter d'ecrire: Ie Bacille x determine OU ne determine
pas, apres de tant de jours, l'acidification de I'eau peptonee
neutre additionnee de tel ou tel sucre, Bien entendu, quand
il ya acidification on peul dire que Ie sucre est attaque ;
par contre Ia persistance de la Lutralite, ou a plus fortc
raison l'alcalinisation d'un milieu, ne permet nullement
d'affirmer qu'il n'y a pas eu formation d'acide aux depens
du glucide. La reaction finale d'une culture en milieu pep-
tone Sucre resulte en effet du balancement de deux pheno-
menes: production d'elements basiques (amnloniaque ou
corps azotes complexes) et production d'acides, ph~nomenes
dont )e premier peut masquer completement Ie secon.d
quand il s'agit, par exemple, d'un sucr.~ peu atta.quable par
un microbe grand producteur d'ammoniaque. C'est I?eme
pour cette raison qu'on doit faire des essais multiples,
avec des temps de developpement variables, quand on se
contente d'examiner les variations de la reaction. II est hon
de remarquer, toutefois, que to utes ces precautions ne
concernent que 1es recherco:hes ayant pour but de decrire
des especes nouvelles, ou de completer des descriptions
anciennes, et que, pour les diagnostics bacterlologiques, il

1. La technique qni conaist. a introduire Ie tournesol dad. Ie nlIUeu ftvltnt ense-

mencement n-est pAS it reeorllmander a Mlllse des phenoll'letIes de teductiO'll qui at! pro-
duisent '1U cOllrs du developpement microbien ot qui Bonvent decolorent Ie milieu.
 DETERMINATION DES MICROBES 135

faut s'en tenir aux methodes couramment appliquees

dans les laboratoires cliniques (geloses sucrees, tourneso-
lees, etc.). (A. Berthelot.)
Les hydrates de carbone'a etudier seront :
a) A.lcools potgalomiques (que les microbes oxydants trans-
forIpent en une aldose .cotrespondallte, par exemple ~ mal1-
nite en levulose, sorbite en sorbose; etc .•. :
Glycerine •
. Mnnnite.
Dulcite.
Erythrite.

b) Sucres ea Co :
Arabinose.
Xylose.

C) Sucre$ t!n Co :
Glucose.
Levulose {cristallise, solution sterilisee it froid).
Galactose .

. d) Sucres en C12:
Saccharosll (l'echetehllr s'illlll ~roduit une inV'ertrne).
Maltose.
tactose.

e} Aulres hydrates de carbone :

Dexlrine. lnuline. Reehercher s'\1 M prodllit dll 111. de~\ti~
nase et de l'inulase, par la liqueur dll Feh1fng.
Amidon. Preciser si I'cmpois d'amidon est seulement
liquefie ou s'il est saccharifie. On prepare a cet eft'et
,un milieu special avec 5 p. 100 d'amidon et 1 p. 100
de pepto,ne. On sterilise 45 minutes a 115 0 CIa masse
etant·trtl~ peu cb'nduclrice).

V. - Formation d 'hydrogelle slllfUte,

Beaucoup de microbes reduiseut les sulfates et produi~

sent une plus ou moins grande quantite d'hydrogcne sul~
fure dans les milieux pept.oncs, ce 'Corps se forme, souvent
en abondance, nux depens des constiluants sulfures des ma"
tieres albumiuoldes (cystine). CeUe production est mise en
~vidence en ajoutant au milieu de cullure soli de {eau pepto ..
1'36 TECHNIQUES GENERALES

ne.e gelosee, par exemple). avant sterilisation, une quantite

de carbonate de plomb telle, que les particules insolubles de
cctte substance soient assez rapprochees pour donner it la
masse une teinte blanchatre homogene. Les colonies reduc-
trices qui~s'y developpent prennent une teinte brune (sul-
{ure de plomb) tres caracteristique.
On peut aussi incorporer au milieu 1 gramme d'acetate
de plomb par litre, toujours avant sterilisation. Le
bouillon ne convient pas pour cet usage, car Ie plomb s'y
precipite. ,
Il faut eviter de boucher les tubes ou vases de culture
avec du caautchouc lorsqu'on se propose de rechercher
HIS, car les bouchons et capuchons contiennent presque
toujours du soufre.
S.\T. Darling a propose de remplacer l'acetate de plomb
par Ie sous-nitrate de bismuth, dont 1 it 2 grammes p. 100,
ajoutes aux~milieux de culture, decelent avec plus de sensibi-
lite l'hydrogene sulfure ou les composes sulfures cap abIes
d~ former des sulfures metalli1:fues. Tantot c'est Ie milieu
qui se colore apres diffusion de l'hydrogene sulfure, tan tot
c'est Ie metal qui penetre dans les corps microbiens, s'y
transforme en sulfure, et alors les microbes sont colores en· ,
noir, soit en masse, soit par depOt de granules places it la
peripherie ou aux extremites des corps microbiens. Le
bacille' typhique. Ies paratyphiques, Ie bacille dip~terique,
la bacteridie charbonneuse, ne donnent aucune reaction
dans les milieux bismuthes.

VI. - Action ~ur les animaux.

Etude ~u pouvoir pathogene, de Ia propr!ete toxigene, de

la virulence.
Tout microbe est pathogene quand il se montre capable
d'engendrer des troubles morbides.
Tout microbe est loxique quand il secrete ou contient un
poison specifique.
Tout microbe·est virulent quand il se multiplie dans 1'0::--
ganism~ attaque et qu'ill'envahit plus ou mains vite et plus
ou moins completement.
 DETERMINATION DES MICROBES 137

VlI. - Recherche des caracteres antigene S

. a I'aide d'un serum specifique.
Agglutination, precipitation (extraits bacteriens), fixation
du complement ou de l'alexine (methode de Bord~t·Gen­
gou).
 TECHNIQUES GENERALES

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DETBRMIN.ATION DES MICROBES 139
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140 TECHNIQUES VENERALES

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142 TEOHNIgUES GENERALES

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 DETERMINATION DES MICROBlis 1'48

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144 TECHNIQUES GENERALES

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 DETERMiNATION DES MICROBES

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MlCROBIOLOGIE 10
1,46- TECHNIQUES GENERALES

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DETERMINATION DES MICROBES 147

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148 TECHNIQUES GENERALES

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 DETERMINATION DES MICROBES 149
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 IX. - Tableau type pour· la determination
d'un microbe.
Designation :
Origine:
Mode d'i,olement :
Forme et disposition des elements :
Motilit~ : • Cils:
Capsule: Spores:
Formes a"involution :
Caracteres de coloration :
Gram: Acido~resi8tance :
Dimensions des elements
Action de r oxygene :
T. Optimum: T. martelle:
Caractere,v des cultures. Bouillon ordinnire :
Bouillon Martin:
Bouillon glucose :
Bouillon ascite :
Bouillon serum :
Bouillon lactique 2 %. : Bouillon laclique 5 %., glucose 5 %. ,:
Lait: of
Lait tournesole : Presllre :
Gelatine. - Colonies sur plaques :
Gelatine. - Piqure :
Gelose ordinaire. - Colonies sur plaques:
Gelose ordinaire. - Strie :
Gelose ol'dinaire. - Piqure :
Gelose glucosee. - Colonies et strie :
Gelose glucoseo (Veillon). Tubes proronds. - Colonies:
Gelose glucoseo nitratee. - Colonies:
Gelose ascite inclinee :
Gelose au sang inclinee :
Serum coagule :
Pomme de terre:
Pomme de terre glycednee :
Gelose do Sabouraud :
Carotte :
Navet:
Bouillon de haricots (Maze) :
Eau de malt:
Gelatine it la maltopeptone (glucose, acide) :
Sol. de maltopeptone 10 % 0 + Saccbarose 10 % :
Sang delibrine :
Urine:
Gelose de Conradi-Drigalski :
Eau peptonee (p. pancreatique Defresne) : reaction:
Enu peptonee glucosee 10 %0: reactioll.limite en SO'H' ou NoOH par litre:
Lactoserum (presure) :
Gelose glycednee :
Gelatine au bouillon de harengs, sale 30 0/00 :
Empois d'amidon : Malta.. Glucose.
lUilieu de Gessard (Succinate NH4) :
Gelee de silice (Beyerinck) :
Liquide de Uscbinsky :
Liquide d'Omeliansky avec cellulose:
Liquide Rnulin :
Gelose: PO'K'H + SO'Mg+
Ascite :maerobie fNoguchi \ :
C03Ca: Gelose + PO'K'H + SO'Mg + CO'Mn:

C'aracleres biochimiques : Pouvorr proteolytique :

Gelatine: Blanc d'reuf coaguJe Serum co"guM Caseine
Pouvoir acidaminolytique: Developpement sur milieux d'isolement (A, Berthelot),
4e passage, culture de 48 heul'es.
Tyrosine Tryptopbane Ac. Glutamique Proline
Histidine Leucine Ac. Aspartique Arginine
Alanine Glycocolle Phenylalanine l..vsine
Solution de peptone de soie (H. La Rocbe) it 1 %.
Solution d'ereptone (Hoecbst) " 1 0/0
pH optimum: pour Ie developpemellt . pour la toxicite au la virulence
pour la conservation
 DETERMINATION DES MICROBES 151
Develol'pement ~n solution saline (PO'K'H, SO'Mg CaCI·) dans laquelle N et C sont
fournis par 2 0/00 d'une des substances suivantes :
Uroe : Allantoine : Cafeine : Creatine:
Action sur Ies hydrates de carbone: Reaction au tournesol des cultures (4 jours) en
eau peplance additionnee d'un des corps suivants :
Glucose 1\{annite Arabinose Glucosamine
Levulose Dulcite Xylose Salicine.
Galactose Erythrite Mannos. Amygdaline
Saccharose Dextrine Raffinose Arbutine
Lactose Amidon Rhamnose Esculine
Maltose Inulin. Sorbit. Methylglucoside a
Glycerine Glycogene Inosite Methylglucoside ~.
Remarques sur les cultures ci-dessus :
Action sur I'acide laetique (C fourni par un laclate)
Action sur les nitrates: Nitrites: Ammoniaque:
Action sur Ie rouge neutre (eall peptonee) :
Pigments:
Corps microbiens en masse(methode de Maurice Nicolle) (culture de 24 h.). - Aspect:
Rendement : H'O %.
:Action de la bile ou des sels bilioires :
Action de la piperidine :
Action sur les graisses : Gelose ordinaire + beuITe (plaques) :
Gelatine ordinaire + beurre (plaques) :

Produits formes nux dcpens des proteiques OU de leurs constituants :

Milieux au tryptophane :
I ndol : Scatol : A c. Indolacellque :
Mil. a In tyrosine : Phenol:
p. Cresol OxyaCid" : P. ozyphenylt!thylamtne :
Mil .•iI l'histidine :
ImidazoIethglamine I
Milieux Ii I'arginine: Putrescine
Sol. de peptone panereatique (Defresne) : H'S I Mercaptan.: NB'
Amine. volatile. Aeides vola til. Uree :
Mil. au blanc d'reuf caaguIe, a la gelatine, au serum au a Ia cascHne :
Produits formes nux depens des hydrates de carbone ou de leurs derives :
(Ean de peptone glueosee) Aleool ethylique : Aldehydes:
Acetone: .A Ie. propylique : Ale. butylique nornfel
A Ie. isobutgllque : Ale. omylique: Ale. methylique:
Dioxyact!./one : Acetylmethylcarbinol: Butyl'ne·glycol :
Acide formique : Ac. acitique : ..le. proplonique :
Ac. butgriqae : Ac. vaIerianique: .de. caproique: : Ac. Buccinique
Ac. laetique droit: Ae. lacllque gauche: Ac. oxalique :
CO': H: CHi;
Aclde pyruvique Acid. ~ oxybuty,ique:

Pou.oir pathogene. - Cultures totales en bouillon (24 h.) :

Souris: Inj. sous-cut. Inj. int .. periton.
Cobaye : lnj. sous-cut. Inj. int.-periton. lnj. int.-veineuse
Lapin: Inj. sous-cut. Inj. int.-periton. Inj, int.-veineuse
Corps mlcrobiens (24 h ).
Poisons solubles (Cult. en bouillon Martin, 10 jours). - Toxine.
Subst. alcnloldiques (sol. alcool).
Endotoxine (corps microbien. 24 h ..l.
Hemolysine (bouillon + globules 24 h.).

Cdtures en milieux speciaux.

Ob.;;ervations :

Notes c~iniques :

Date:
D'upres A. Berthelot (Institut Pasteur).
 CHAPITRE XI
R:(IJOE'l'T]JJS UTILf)S DANS LES LABORATOIRf)S

A. - Fermeture et etiquetage des vases ou flacons.

10 Mastic pour luter les flacons con tenant des pieces anato.
/.
mlques.
Caoutchouc (fragments de vieux lubes). 200 gr.
Suif ou paraffine fusihle it 40-500 • • • 125 gr.
Talc de V.enise. .•...... 200 gr.

Faire fondr~ Ie suif a une douce ehaleuret y jet~r les frag.

ments de caoutchouc. Agiter de temps en temps, puis
ajouter Ie talc. Le melange refroidi se conserve indefini·
ment. II faut Ie chauffer pour s'en servir et Ie porter avec
une baguette chaude sur les joints qu'on desire Iuter.
Ce mastic est inattaquable par 1'alcoo1.
Ou bien:
Glu marine.
Faire macerer pendan~ 3 au 4 jours 1 pattie de caout-
chouc et 3 parties d'huile de goudron. Decanter Ie liquide
e1 y mire fondre it chaud 3 parties de gomme Iaque Couler
dans des moules. La masse se solidifie a froid Cctte glu est
tres recommandable pour luter les flacons bouches au
liege. Elle forme un enduit tres soli de et impermeable a
l'humidite.
On peut aussi luler les flacons qui renferment de petites
pieces anatomiques ou d'autres pieces de collection (in sec-
tes, vers, etc.), en recouvrant Ie bouchon avec l'un des luts
suivants:
a) On fait une bouillie avec du silicate de soude commer-
cial et du kaolin pulverise. On l'applique sur les' houchons
et on laisse seeher.
b) On gache du platre avec de l'eau contenant 5 p. 100 de
 RECETTES UTILES DANS LES LABORATOIRES '153

gomme arabique. La 'bouillie devient solide en une demi-

.
heure et tres adherente .
c) On melange :.
Silicate nentre de soude. 1 partie.
Magntlsie calcinee. 1 partie.
Oxyde de :tine.. • • • 1 partie.

Appliquer et laisser secher. Ce lut constitue un mastic

lVec lequel on peut coller les objets de porcelaines et qui
sup porte Ia cuisson, au four.
Lul de Kronig. (Pour border les preparations en milieux
liquides) :
Faire fondre 20 grammes de eire jaune dans une capsule
de porcelaine. Y ajouter peu a peu 80 grammes de colo-
phane en agitant avec une baguette de verre. Lorsque Ia
masse est bien homogene, couler dans de petites boites
metalliques. Ce lut fond au contact d'un fer chaud. II est
adherent au verre s~ et durcit tres rapidement.
2 0 Encre pour ecrire sur Ie verre:
A 100 centimetres cubes d'encre ordinaire ou d'encre de
Chine liquide, on melange 20 centimetres cubes de solution
commerciale de silicate de soude.
Avec cette e.ncre silicatee. on ecrit, comme on Ie ferait
sur du papier, au moyen d'une plume ordinaire qu'on
prendra soin de laver chaque fois dans l' eau, car, ap'res des-
siccation. les becs ne se separeraient plus.
30 Impermeabilisation des etiquettes,
On la realise tres simplement en les recouvrant au pinp
ceau d'une couche de paraffine fondue.
4 0 Gelatine ge/osee pour polycopie:
Ean. • . • . • . . . . • . . 400 cc.
Gelose.. . . . . . • . . . . . 8 gr.

Laisser tremper 24 heures. Passer a l'autoclave a 1200 ,

puis ajouter au melange fondu:
Gelatine . . 80 gr.
Glycerine. . • • . . • . 600 gr.
Glucose. . . . . . . . . 100 gr.
Talc. . . . • . . . . . 25 gr.

Couler dans une large cuvette a photographie en passant

sur tarlatane ou sur un tamis fin.
154 TECHNIQUES GENERALES
50 Encre a polygraphie sur gelatine:
Violet de Paris. • . . . . . . • 1 gr.
Aleoo!.. • • • • . • . • • • . 2 ee.
Eau. • . • . • . . . • • • • 7 ee.

Pour effacer, laver la gelatine avec un tampon d'ouate

hydrophile imprtgne. d'eau ac}dulee d'un dixieme d'acide
chlorhydrique. Faire suivre d'un lavage it l' eau et secher.

B. - Nettoyage des lames porte-objets usagees.

Su~ la table du laboratoire, les lames eUes lamelles sont
conservees dans de petits vases a recouvrement, remplis
d'alcool a 95". On les'sort de ce liquide au fur et a me sure
des besoins et on les essuie avec un linge fin.
Les lames et les lamelles usagees sont reunies dans un
bocal contenant une solution de carbonate de soude a
5 p. 100. Lorsqu'elles sont assez nQ,mbreuses, on les fait
bouillir .pendant une demi-heure dans une capsule remplie
egalement de solution de carbonate de soude. On les egoutte
ensuite et on les reporte dans une autre capsule OU I'on
verse une solution acide bichromatee, preparee comme
suit:
Bichromate de potnsse. 5Q.gr.
Enu, . . . . • . . • ' . ' 1 litre.
Acide sulfurique ordinnire. 100 gr.
On fait bouillir de nouveau pendant 30 minutes, puts on
sort les lames ou lamelles, on les lave a grande eau cou-
rante, oh les egoutte et on les essuie une it une. Elles sont
alors de nouveau pretes it servir.

C. - Obturation des tubes pU vases de culture.

CeUe obturation se fait Ie plus commodement avec des
capuchons de caoutchouc qu'on peut steriliser it I'autoclave
et conserver dans une solution de sublime 'au milJieme.
Mai~, comme ils coutent ass,ez. cher, on,peut treshien les
remplacer par l'obturation au moyen d'un melange de
10 par~es <I.e vaseliI_1e ,fusil?le a 400 et de) p~rtie de paraf-
fine fusible.a 55°, qu'on coule sur Ie bouchon d'ouate lege- ,
rement enfonce dans Ie tube ou Ie goulot du vase et qu'on
recouvre d'un capuchon de papier ou d'etain.
 RECETTES UTILES DANS LES LABORATOIRES 155

D. - Conservation et e-ntretien des seringues

et aiguilles it injection.
Les seringues a injection, sterilisables par la chaleur, it
piston de caoutchouc ou de fibre, doivent etre maintenues
constamment immergees dans un bocal a large ouverture,
bouche it I'emeri et contenant une solution saturee 'it froid
de borate de soude.
On prendra soin de talquer et de faire jouer de temps en
temps les pistons,
Les aiguilles a injection en acier seront conservees inde-
finiment a l'abri de la rouille si, aussitOt apres qu'on en a
fait usage, on les plonge dans Un flacon con tenant la meme
solution de borate de soude saturee a froid et filtree, Chaque
aiguille doit toujours etre pourvue d'un fil d'argent ou de
nicke),' afin d'empecher l'obturation de son canal par de
petits cristaux de sel.
II est toujours recommandable d'a'jouter un peu de borate
de soude a reau dans laquelle on fait bouillir seringues,
aiguilles, bistouris, instruments nickeles divers. C'est un
excellent moyen d'e,'iter les taches de rouille. .
On trouve maintenant dans Ie commerce des aiguilles et
instruments enacier renfermant 13 a 15 pour 100 de chrome
au en divers autres alliages completement inoxyda'bles.

E. - Sterilisation des aiguilles d'acier

au cbloroforme paraffine.
La sterilisation est obtenue par l'immersion dans du
chloroforme paraffine (paraffine 3 grammes, chloroforme
100 centimetres cubes) ; on taille en copeaux la paraffine et on
la fait dissoudre dans du chloroforme commercial ou
anesthesique.
Aprcs une heure de sejour dans ce liquide, I'aiguille peut
etre consideree comme sterile, mais on peut l'y laisserinde-
finiment sans dommage.
Avec une pince flamhec, on la retire du tube contenant le
chloroforme paraffine. On l'introduit, pointe en bas, dans un
pet,it tube sterile bouche avec de I'ouate, On renverse Ie
tube ferme et on l'abandonne sens dessus dessous durant
156 TECHNIQUES GENERALES
quelques minutes : l'aiguille tombe et vient s'accoler au
bouchon ; son embout deverse sur Ie caton tout Ie chIoro-
forme contenu dans sa cavite. On redresse Ie tube et on Ie
porte a J'etuve a 37°. Cette temperature accelere l'evapora-
tion du liquide volatil. Deux heurcs suffisent pour assecher
les aiguilles.
La sterilisation ne s'accompague d'aucune oxydation de
racier. En s'evaporant, Ie chloroforme abandonne un enduit
minuscule de paraffine sur la paroi interieure de l'aiguille,
qui s'oppose a la coagulation du sang.

F. - Conservation des tubes et bouchons

de caoutchouc.

Les objets de caoutchouc dont on fait rarement usage, se

durcissent et se fendillent a l'air et a la lumiere. II faut,
pour assurer leur conservation en bon etat, -les tenir it 1'obs-
curite, noyes dans du talc eh poudre fine. Ils gardent ainsi
leur elasticite et leur souplesse.
Pour les tubes a gaz ou a vide dont on se sert de temps
en temps seulement, il est plus simple de les tenir immer-
ges dans un large bocal rempli d'une solution de carbo-
nate de soude it 10 p. 1.000 qu'on change tous le~ aeux ou
trois mois.

G. - Destruction des mouches et des mo~stiques

dans les laboratoires, les logements, les ecuries, etc.

a) Lavage des planchers, carrelages et eviers au cresyl a

5 p. 100.
b) Lail formoIe. - Dans des cu~ettes photographiques,
on verse, en couche mince, du lait additionne de 10 centi.-
metres cubes de solution commerciale (a 40 p. 100) de for-
mol. par litre. Les mouches qui s'abrenvent a ce liquide
ne tardent pas a succomber. .
On peut preparer de la meme maniere de la biere formo-
lee. Les mouches en sont tres ·friandes.
c) Papiers tue-mouches.
On peut en fabriquer tres facilement soi-melIl;e avec du
 RECETTES UTILES DANS LES LABORATOIRI6 15?

papier buvard ou du papier d'emballage 'etale ell carres

sur des assiettes ou dans des cuvettes photdgraphiques et
imbibe de la liqueur preparee comme suit:
Faire bouillir 10 grammes de bois de quass.ia amara dans
250 centimetres cubes d'eau. Passer et ajouter 135 gnimmes
de melasse ou de miel et 10 grammes d'emetique (tartrate
de potasse et d'antimoine).
d) Cobolt (arsenic metallique reduit en poudre fine et qui,
par son contact avec l'air, subit rapidement un commence·
ment d'oxydation).
On etale cette poudre en couche mince dans des assiettes
ou des cuvettes photographiques sur un papier buvard que
I'on maintient mouille avec une tres petite quantite d'eau.
Elle est tres toxique pour les mouches.
(On trouve Ie cO'bolt chez Poulenc freres.}
e) Vapeurs de cresgl chauffe (methode de Bouet et Roubaud,
recommandee pour les ecuries, salles d'anitnaux, etc.).
Dans un recipient metallique un peu profond, une vieille
marmite par exemple, on fait houillir, sur une lampe a
petro Ie ou a alcool, une quantite de cresyl pur corr~spon­
dant it 5r grammes de cresyl par metre cube d'espace a trai-
ter.
f) Tabac (methode preconisee par Simond et par Thiroux),
Soufre, Pyrethre, Quinoleine.
On detruit facilement les moustiques d~une case indigene
en enveloppant celle-ci d'une vaste bache en toire et en fai-
sant bruler a l'interieur, sur un petit rechaud contenant du
charbon de bois bien allume, 20 grammes. de tabac en
feuilles (ou de tabac a fumer) par metre cube. Apres une
heure de contact, tous les moustiques sont tues.
On obtient Ie meme resultat avec 5 grammes de soufre
en canons ou en fleur par me~re cube, 'ou 10 grammes de
poudre de pyrethre, ou mieux avec un melange de
10 grammes de tabac et de 10 grammes de poudre de pyre-
thre ..
La poudre de pyretlire seule donne, par sa combustion,
des vapeurs qui stupefient les moustiques," mais ne les
tuent ql).e difficilement.
Les vapeurs de quirroleine a la dose de 0 gr. 50 par
15'8 TECHNIQUES GENltRALES

metre cube tuent egalement bien les mouches et les mous-

tiques dans leslocaux mal fermes, apres 2 heures de contact.
(J. Legendreet G. Bourret.)
g) Huile de schisie, recommandable pour In destruction
des larves de mouehes dans les fumiers et fosses d'ai-
sances.
On l'utilise en emulsion it 5 p. 100 dans l'eau, projetee
avec u'n balai de brindilles ou avee une pompe it pulveri-
sation.
Pour les fosses it purin ou d'aisanees, il faut employel'
10 litres de schiste par metre cube de fumier ou d'or~
dures.
Nota. - Pour Ia defense contre Ies pOUX, puces,
punaises, tiques, etc., voir Ie chap. XLVll.

H. - Teintur~ noire lavable pour les tables en bois

des laboratoires.
Cette teinture doit etre appliquee, autant que possible,
sur Ie bois neuf bien uni, ou apres degraissage soigneux it
l'essence de petrole.
On effectue un premier et abondant badigeonnage avec
une solution nqueuse it 10 p. 100 de chlorhydrate d'ani-
line tiede. On renouvelle Ie badigeonnage apres qqelques
·heures.
On laisse seeher. Le lendemain, on applique une couche
de solution de 100 grammes d'aeide .ehromique dans un litre
d'eau tiede. A deraut d'acide chromique, on peut employer
un melange de 120 graIl\mes de bichromate de potnsse 1
241 grammes d'acide sulfurique it 66° Be et 1 litre d'eau.
Il se produit du sulfate de potasse avec mise en liberte
d'acide chromique.
Le bois est ninsi teint dans sa profondeur en noir d'ani-
line qui n!siste it In plupart des agents decolorants.
Apres un ou deux jours, on lave it l'eau chaude, on laisse
bien secher et on impermeabilise Ie bois en Ie frottant avec
des dechets de coton impregnes de paraffine chaude, fon-
due. '
 CRAPITRE XII

DOCOMENTS CHIMIQUES. - REACTIFS UTILES DANS

LES LABORATOIRES.

A.-Solutions norm ales et decinormales d'alcalis

et de divers sels.
Les solutions dites norm ales contiennent, par unite de
volume du dissolvant, un p<?ids de substance active egal it
l'equivalent chimique de celle-ci, pa.r exemple : 40 grammes
par litre d'eau distilIee pour la'soude caustique; 56 gr. 100
pour la potasse caustique; 53 'granimes pour Ie carbonate
de sodium anhydre.
La solution decinormale de sozzde est preparee en dissol-
vant 4 grammes (exactement 3 gr. 97) de soude caustique
pure dans 1 litre d'eau distillee. 1 centimetre cube de cette
solution decinormale doit eire exactement neutralise par
1 centimetre cube de solution decinormale d'acide oxalique;
il contient 0 gr. 004 d'hydrate de soude.
La solution decinormale de potasse est prePflree en dis sol-
vant 5 gr. 61 de potasse cau.stjql,le .pure dans 1 litre d'eau
distillee. 1 centimetre cube de cette solution doit etre neu-
tralise par 1 centimetre cube de solution decinormale
d'acide oxalique, il contie'llt 0 gr. 0065 de potasse caus-
tique.
La solution normale de carbonate de sodium est preparee
en dissolvant 53 grammes de carbonate de sodium pur
dans 1 litre d' eau distillee.
La solution normale d'ammoniaque = 16 gr. 93 par
Ii tre.
'Solution decinormale de permal19anate de potasse = 3 gr. 5
par litre (conserver en flacon jaune).
Solution decinormale de nitrate d'argent = 16 gr. 868 par
litre. 1 centimetre cube de ceUe solution = 0 gl'. 003518 de
chI ore ou 0 gr. 0058 de chiorure de sodium.
160 TECHNIQUES GENlSRALES

B. - Solutions acides normales :

Acide chlorhydrique. 36 gr. 18 par litre.
» sulfurique. 48 gr. 67» )J

» azotique.. . 63 gr. )) »
» oxalique.. • . . • • 62 gr. 55» ))
(Conserver 11 l'abri de Ia lumiere.)

C. - Reactifs divers d 'usage courant.

Acide chlorhydrique pur Be 1,2.
» » diIue.. 200 gr. pour800d'eau distiIMe.
)l azotique pur, B 0 1,39.
» » dilue. • . • 200 gr. II 800 »
sulfurique pur Bo 1.83.
» dilue. 100 gr. » 900 » »
"
» acetique wIue : acide
cristallisable. . • 300 gr. » 700 »
Hydrate de soude. . • • 10 gr. 90 »
» de /t0tasse. .. 10 gr. » 90 » »
" de aryte • . . 10 gr. » 190 )) »
Ferricyauure de potassium. 10 gr. » 190 »
Ferro » » 10 gr. » 90 »
Chlorure de calcium. 10 gr. » 90 »
Chromate de potassium. . 10 gr. • 190 »
Sulfocyauure de potassium. 10 gr. » 90 »
Sulfate de cuivre. ••. 10 gr. » 90
» de magnesium .• 10 gr. » 90 II
Acetate de sodium. . 10 gr. » 90 » »
Carbonate de sodium. 20 gr. )) 80 » »
Phosphate de sodium. 10 gr. » 190 »
Chlorure de fer. . . 10 gr. :D 100 » ))

Nitrate d'argent • ' . 10 gr. » 190 » »

Bichlorure de mercure. 10 gr. » 190 » »
Acetate plombique. 10 gr. » 190 ), »

Eau de chaux. - Deliter 10 grammes de chaux vive avec

,environ 50 centimetres cubes d'eau distillee. Delayer dans
300 a 400 centimetres cubes d'eau en agitant. Laisser ,epo-
ser 12 heures et decanter Ie liquide surnageant qu'on rem-
place par 1 litre d' eau distiUee. Conserver en flacon bien
bouche.
Eau iodee. - Eau distillee saturee d'iode en paillettes.

D. - Indicat~urs colores des reactions. chimiques.

Phenolphtaliine. - Solution it 1 p. 100 dans l'alcool a
95<' incolore en milieu acide ; rouge vir en milieu alcalin):
Ne doit pas etre.employee en- presence d'ammoniaque.
 RECETTES UTILES DANS LES LABORAT'OIRES 161

Teinlure de iournesol. - On peut la preparer soi-meme

avec du tournesol en pains dont on prend 100 gtammes
qu'on pulverise ftnement. On fait houillir ceUe poudre avec
de l'alcool a ·S5· qu'on jette ensuite. La poudre, recueillie sur
une toile, est p1elangee it 600 ou 800 centimetres cubes
d'eau. On chauffe a l'ebuUition dans une capsule, puis on
filtre au papier. On ajoute. au liquid.e filtre son volume d'al-
cool a 850 et on divise en deux·parties.
A la moitie de cette teiritu're' on ajotJ.te, goutte it goutte, de
l'acide chlorhydrique jusqu'a ce que la coloration so it pres-
que rouge, et on reunit a_l'autre moitie pour'avoir la teinte
sensible. On y trempe Ie papier pour l'avoir bleu. Pour
l'avoir rouge. on Ie trempe dans une solution tres faible
d'acide chlorhydrique, et on fait secher.
Papier d'amidon.
Amidon. . . . . . . . . . • • • 1 gr.
Enu distillee. . . • • . • . . .• 100 cc.
Faire bouillir; decanter apres refroid~sseme'nt. Tremper
dans ceUe solntiC!n des feuilles de papier a fiItrer qu'on
fait secher et qu'on decoupe en bandelettes.
Papier Ii ['acetate de plorrib.
Tremper des feuilles de papier a filtrer dans une soJution
a 1 p. 10 d'aceLate neutre de plomb. Faire secher et decou~
per en bandelettes. Ce papier est noirci par les sulfures et
par l'hydrogene sulfure.
Solution de m'elhylorange (helianthine, orange III ou
dimethylorange).
Solution aqueuse alp. 1.000. J aune en milieu alcalin ;
rouge en milieu aciae. Ne doit pas etre employee en pre-
sence des acides organiques .
. Solution de nitroprussiate de sodium a 1 gramme p. 20
d'eau distillee.
Coloration violette par les sulfures. Pas de coloration par
l'hydrogene sulfure.

E. - Principaux dissolvants des matieres

grasses, cires et resiDes.
'points d't!bullilion
a Ia pression barome-
J , trique de 760 rom.
Ether sulfurique .. 35·
Sulfure 'de carbone. 46·
llucnOlllOI.OGIE
 162 TECHNIQues. a£N.E.1t:t!LES
lager~ <lft plilroJ.El· SQ· a. 7&~
acetQ.qe.. . . . 56·
f.:hlorororme. 6-}o.
Alcoal methyliqUI!._ . , . fi6 0Q " 64·
,{rqtr""hlo.rure q(ol <;arbol)o.• 76 1
Alcoql ethylique. . 78 0 4
Benzol (Benzene).. . . . 8693
Tolwj\lJ:.. . , • . • • 111·
Alc,ool amylique. . . . . 137'
Xylol (Xylene). . . • . . . . • 142<>.
Essence de terebeptbillllo (terebe,nth.cl\lll). l60'
~&seQ.ce de cedre. • • . . • • • 2370

R ~ Q.eactif d.e 1& celluloStt (chlaroiodure de £w.c) .

.It 25 11\\ 5.0. c(lI\tim~tr~s cubes do s.Qlu.tio,n sirlijlcus.e de

chlorure de zinc dlJ. cQmmerc~ (45 0 .6 e ), on ajpute'l fI
2 grammes d'iodure de potassium cristqIlj,s4 et q.uelques
paillette~ d,'iode. 'f
On chattffe dans une capsuk, a feu nu, en agitant, pour
cone.entrer la solution. De temps eu temps OJ) preleve une
8,Q1l1te qU:O{l depose sqr une fcnille de papier a filtrer.
Lorsque 1a conce.ntration est suffisante, il se produit rapi-
dement une taohe blene intense.
Si l.a coloration. tarde it se manifester, on prolonge un
PElU r~vt\pora.tion, mais it ne faut pas qne ctllle-ci soit pous-
s~e tl:QI} lQin" car Ie reactif perdrait son aCtion colorante
et, pour la lui restituer, il serait necessaire de Ie dil'uer
d'l,ln pen <l'~an. La reaction est plus intetlse ~ ch:1ll,.d qu'a
froid.

G.. ...,.,.. R_.eac.t\fs 4~s. mat;.ieres ~ra.sfie.s.

SOl\lti-Qil d'adde osmique alp. 100 (colore les gouttelcttes

huileuses en noir intense: reduction de Facide o&ulique par
l'QI,~in~.
Pour les matieres grasses d'origine vegetale, Ie reactif de
choix est l'orcanette acetique qu'on prepare comme suit:
On e~ui~.~ 10 gramllles de ra,cin.e d'orcanett~ pulvcrisee
au moyen d'alcool a 90 0 jusqu'a <:e qu'on ait obtenu 50 cen-
timetres cubes de teinture. 1\ celIe-ci, on ajoute 5 ceati-
metr~ c..lWe,:?' d'l\cid~ acetique cristallisable et 32 grammes
d'hydrate de «hloral dissous dans 32 centimetres cubes
d'eau. On lais~e deposljr 24 heures et on filtrfil.
 REACTIFS UTILES DANS LES LABORAtOlRES 163
Les glohules gras ou les gouttelettes d'essence se colo-
rent en rouge. Si ron traite la preparation par l'alcool a
90 0 qui dissout et eli mine les essences, la coloration ne
'Porte plus que sur les corps gras.

H. - Caracteres et reactions colorees des

albumoses et des peptones.
Les alhumoses et les pepiones sont solnhles dans l'ean et
non coagulahles par Ia chaleur. Les hetero-albumoses ne
se dissolvent qu'en presence d'une petite quantite de sels
neutres.
Les albumoses se precipitent de leurs solutions aqueuses,
acidiflees par l'acide acetique, par saturation avec Ie sul-
fate d'ammonium. Les peptones.ne precipitent pas dans cas
conditions.
Pour determiner Ie degre de purete d'une peptone com-
merciale, on en dissout 5 a 10 grammes dans 50 centimetres
cubes d'eau, on acidule avec deux gouttes d'acide acetique
eton ajoute, dans Ie Iiquide, du sulfate d'ammonium pulve-
rise, err agitant pour favoriser la dissolution. Quand iI reste
llll petit exccs de sel non'dissous, Ia saturation est com-
plete et la presque totaIite des albumoses est precipitee. On
filtre et, dans Ie Iiquide, on recherche Ia presence des pepto-
nes vraies par la reaction du hiuret (indiquec plus loin).
Le precipite reste sur Ie fiItre est lave avec une solution
:s~tun!e de sulfate d'ammonium, puis egouttc et essore entre
des feuilles de papier a flltrer. On Ie redissout ensuite
-dans qnelques centimetres cuhes d'eau. On y retrouve les
-earacteres des aIhumoses primaires ou secondaires. (Voir
,le tableau ci-apres d'apres Gab. Bertrand et P. Thomas.)
Le serum du sang de cheval ou de hreuf renferme de 7 .a
:s p. 100 de proteines, dont 4,5 p. 100 de globuline ct
-8 p. tOO d'alhumine environ. On pent separer Ia giohuline
'Cn additionnant Ie serum (en agitant constamment) d'un
,",olume egal de solution de sulfate d'ammonium satu-
ree, it Ia temperature de 50 a 60 0 , puis filtree et abandonnee
llU refroidissement. Le precipite de Slohuline peut etre
tecueilli sur un filtre, Jave avec Ia meme solution et essore.
ta globuline, redissoute dans la plus petite quantite pos-
sible d'eau tiede, peut etre isolee par dialyse.
164 TECHNIQUES G'&NERALES

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 REACTIFS UTILES DANS LES LABORATOIRES 165
Le liqtiide dont on a precipite la globuline, additionne
de sulfate d'ammonium pulverise, jusqu'a. saturation, donne
Ufil nouveau precipite blanc qu'on peut recueillir et laver
comme la globuline : c' est Ia 'serum-albumine.

J. - R,eactions colorees des substances proteiques.

a) Reaction xCf-nlhoproUique. - A 5 centimetres cubes de

solution (1 partie de blanc d'reuf par exemple et 9 parties
d'eau), on :;tjoute 0 cc. 5 a. 1 centimetre cube d'acide nitrique
a 36 Btl, II se forme, en general, un precipite qui se redis-
0

sout en partie par chauffage. ·On fait bouillir pendant 1 ou

2 minutes environ. Le liquide et Ie precipite se colorent en
jaune. L'addition d'ammoniaque it ce liquide prealable-
ment refroidi, ou de soude caustique, fait virer la teinte a
I'orange.
Cette reaction est due a la presence de noyaux aroma-
tiques dont les derives nitres sont colores en jaune.
b) Reaction de Millon. - A 5 centimetres cubes de la solu-
tion 'proteique, on ajoute 1 a 2 centimetres cubes de reactif
de Millon et on fait bouiIIir doucement. Un precipite appa-
rait, qui se colore en rouge, du rouge carmin au rouge
brique. Si on continue a chauffer, Ie precipite peut se deco-
Iorer et se redissoudre partiellement. On doit donc.chauffer
avec beaucoup de precaution au debut. Cette reaction est
attribuable it la tYI:osine. Le phenoIla donne avec intensite.
La gelatine ne la donne habituellement pas. La liqueur de
Millon non diluee colore a froid, en moins d'une minute, la
peau et les angles .(matieres cornees) en rouge fonce.
On prepare Ie reactif de Millon en faisant dissoudre
1 partie de mer cure dans 2 parties d'acide nitrique a 360 Btl
et chauffant Iegerement a Ia fin, 's'il est necessaire. Apres
dissolution complete, on etend Ie liquide vert de 2 volumes
d'eau. On agite et on decante.
c) Reaction du biuret. - A quelques centimetres cubes de
la solution proteique. on ajoute 1 centimetre cube de soude
a 10 p. 100 pour alcaliniser forteme;t, puis nne solution
de sulfate cup rique alp. 100, goutte a goutte, avec une
pipette. La premiere goutte donne une teinte rose violacee,
1&6 "TECHNIQUES GENERALES
qui vire au violet blen par addition ulterienre de sulfate
de cni.vre. Gatta coloration est due it la formation d'un
compose cupro~pot~ssique. Elle est donnce par toutes les
substances proteiques, Inais est surtout intense avec les
albumoses, et encore plus avec les peptones.

J. - Reactifs urologiques.
a) Liquide d'Esbach (dosage de l'albumine).
Acide picl'ique. .,. . 10 gr.
Acide citrique.. . • . ' . ' . 20 gr.
Eau distillee. . • • • . • . q. s. pour 1 litre.

hJ Liqueur de Fehling (dosage de sucre).

Sulfate de cuivre pur 'It cristallise. M gr. 65.
Sel de Seignette (tartrate dE! potasse
et de soud~),. . . • . . . 173 gr,
Lessive de soude. • . • . . . 300 gr.
Eau distillee. . • . . • • . q. s. pour 1 litre.

On fait dissoudre separement Ie sulfate de cuivre dans

200 centimetres cubes environ d'eau distillee, puis Ie sel
de Seigllette et Ia lessive de soude dans une autte portion
d'eau distillee. On mele, on porte it I'ebullition pendant
10 minutes, on laisse refroidir et on complete Ie volume it
1 litre. (Conserver it l'abl'i de l'air, de la lllmiel'e, et en plu-
sieurs fla~ons remplis et soigneusement. bouches).
Chaque centimetre cube de cette liqueur dOitletre reduit
par 0 gr. 005 de glucose.
c) Diazo·reaction d'Ehrlich (reaction xanthoprateique).
Dimethylaminobenzoaldehyde. • 1 gr.
Acide chlorhydrique.. : • . • 25 gr.
EaD distillee. . • . . . • • 25 cc.
On verse quelques gouttes de ce reactif dans 4 a 5 centi-
metres cubes d'urine. Dans les cas positifs il se produit
une coIoration rouge.

K. - Dosage de l'uree dans Ie sang d 'apres

la . methode de Fosse.
(Combittaison de l'u/'ee avec Ie Xdfllhydrol : dixanthgluree.)
On 'prend, avec une pipette graduee, 10 centi'metres
cubes de serum que l'on verse dans 100 centimetres cubes
 RECETTES TJtILES DANS HIS LABfJllATOIRES 167,

d'alCool ii ~5". On ajol1re qttehJl't~s gouttes d'ucifie acetiqul!

fJOur acroifier le melange. n se forme un eoagullim 'qui est
C'O'mplet aptes 4 heures de repo'S -a Ia temperature du I~ho­
ratoire. Ce coagulum esl l'ecUeilli sut un filtre" ess6re.
puis lave a 2 reprises avec 10 a 20 centimetres cubes
d'alcool.
Les fiItrats, reunis dans une ~'apsul~ de verI"e de 150 cen-
timetres cubes enviro'n de c9pacite, sont evapores dou-
cement sur un bain-marie jusqu'a reduction du volume
a. 5 cc. environ. On ajoute a1ors, dans Ia capsule, 50 centi-
l1'l1!tres cubes de solution alcoolique 'a I) ou 8 p. lOt> ile
xanthydrol , puis 50 centimetres cubes d'acide acetiqub
cristallisable.
On recouvre la capsule d'un disque de verre et Gn )aisse
en contact pendant 4 heures (au mobs) a 1a temperature
du laboratoire. II ne faut pas depasser Ie delaide 15 heures,
Apres quoi on recueiIle Ie precipite de xanthydrol S'CLr 'un
petit filtre exactetllent tare. Le meilleur filtre est Un
petit entonnoir cylindrique, a aouille capi)laire, qu~on a
prealablementgarni d'un tampon d'ouate hydrophile et se-
eM a 1050 avant de 1e porter a la balance de precisibn.
La filtration aehevee, on seche de nouveau l~ finre a 105'>
et (In pcse. La diff~rence de poids, divisee par', donne 16
poids d'uree contenu dans 10 centimcttes cubes de serum
mis en ceuvre.
Pour Ie serum humain normal, ce poids varie entre 15 e\
30 milligrammes. II s'e1eve a 100 dans certains elats patho-
logiques.

t. - Preparation de III teinture de gai'ac.

(Pour la recherche des oxydases.)

On fait dissoudre a chaud 5 grammes de resine de

gaiae dans 70 centimetres cubes d'alcooI a 950, pUIS 6n
filtl'e et bn ajbute (m~iron 30 centimetres cubes d' eau.
G~tte tcinture doit toujours etre employee fraiche, car
elle se peroxyde ires rapidement. ,II faut Ia teni~ rigou-
reusement a l'abri de l'air.
En choisissantun bloc de resine, on en ecartera les parties
superficielles,. deja oxydees. Si la resine est impure, on la
168 TECHNIQUES GENERALES

dissout d'abord dans Ie chloroforme; puis on filtre et on

chasse Ie chloroforme par evaporation dans Ie vide. La
poudre jaune restant est alors dissoute dans l'alcool. On
obtient ainsi une solution tres limpide.

M. - PrepaTation de la pectine.
(G. Bertrand et Mall~vre.)

2 k. 500 de carottes nouvelles, finement broyees, sont

delayees dans environ 2 litres d'alcool a 950 • On chauffe
au bain-marie vers 60° pendant environ 1 heure pour dis-
soudre les matieres colorantes, les graisses, etc. On
decante I'alcool. On passe a la presse dans un linge pour
obtenir un gateau de carottes bien sec .
. Ce gateau est dissocie en menus morceaux et mis it ma-
cerer dans environ 1 litre d'acide chlorhydrique it 2 p. 100,
pendant 24 heures, en ayant,soin de melanger de temps 'Cn
temps. On reporte .sous Ia 'presse et on retire un liquide
duquel on precipite la pectine par 2 volumes d 'alcool it 95 0 •
Les flocons gel~tineux de pectine decantes sont pas-
ses it travers une etoffe de laine, puis exprimes a l,a main.
11 reste sur Ie tissu une masse blanche amorphe, qu'on
~nleve avec une spatule en corne et qu'on dissout dans une
tres petite quantite d'eau tiede it 50°. Cette solut\on .t>rute
de pectine est mise it dialyser dans des sacs de collodion
pendant trois jours en changeant trois fois par jour l'eau
exterieure. La p~ctine est alors purifiee. On peut la

°
concentrer dans Ie vide it basse temperature. 2'k. 500 de
carottes donnent environ gr. 9 a 1 gr. 7 de pectine. Les
solutions de cette substance, traitees par la soude caustique
a 33 0/0, donnent un precipite insoluble dans l'eau,
gelatineux, qu'on peut recueillir par centrifugation et laver
a plusieurs reprises jusqu'a reaction neutre des eaux de
lavage.
Cette pectine gelatineuse a Ia propriete de fixer l'alexine
des serums frais. Elle ne renferme aucune trace de matiere
azotee (W. Kopaczewski et S. Mutermilch).
 •
REACTIFS UTILES DANS LES LABORATOlRES 169

N. - Bain-marie. Points d'ebullition

de diverses solutions salines saturees.
TEMPERATURE QUANTITE J}E SEL
n'iBULLl'rION. DISSOUS A 100' DANS 100
p. n'EAu.
Sulfate de cuivre crist.. . 102- 203 gr. 3
,Chlorure de potassium. . 103· 57
Alun d'ammoniaque crist. 104" 422
Borax crist. . . : . 105. 201,4
Chlorure de sodium. . 106· 39,6
Chlorul'e d'ammonium. 112· 73
Nitrate de potasse. . . 113· 247
Nitrate de soude.. • . 117" 180
Acetate de soude.. . • . • 122· 204
Chlorure de calcium anhydre. 141 0 156

O. - Melanges refrigerants de liquides et de sels

a 100 • +
Chlorhydrate d'ammoniaque pulv. 5 parties ~
Azotate de potassium plilv. 5 parties - 120
Eau •• • , • • . . . 16 parties
Azolale d'ammonium pulv. 1 partie ) _ 16.
Eau •. . • . . . • • 1 partie I
Sulfate,de sodium pulverise, 8 parties ) _ 18.
Acide chlorhydl'ique. 5 parties 5

P. - Melanges refrigerants de neige et de sels a 0°.

Neige (011 glace pilee). 1 partie ~ _ 180
Sel marin . . . 1 partie 1
Neige. ' .•. 2 part~es ~ _ 51.
Chlorure de calcium crist. plilv. 3 parlles I'

Q. - Alliages fusibles pour tests de sterilisation.

Bismuth.
Plomb •. g3 ~:~:l::
parties)
, fusibl? a + 100 Pression 1 kgr.
(alhage de Darcet).
0
•

Etain • •

parties ~ {:US)' be l 'a

Bismuth.
Plomb •.
88 parties + 113•.
3 P resslOn
.
Etain •• 4 parties 1 kgr. 5.
Bismuth.. 8 parties ~ ,
Plomb .. 8 parties )' fusible it + 1230. Pression 2 kgr.
Etain . • 3 parties .
170
On fond dans une coupelle, d'abord Ie plomb sous une
couche de charbon de bois en .poudre., puis on ajoute Ie
bismuth et fetnin. On melange et 'On coule ($n disques ou
en crayons dans un moule metallique.
On pentainsi preparerJ:espastilles qu'on emploie comme
tests de sterilisation. Ineluses dans un tube a essai ou dans
une bolte de Petri, on les place .dans l'autbchwe aU milieu
des objets qu'on veut porter surement, dans toute leur
masse, a une'temperatul."e determin!!e.
En melangeant a CMu.d 9 parties d'a1liage de Darcet et
1 partie de metcure, on obtient un amalgame fusible a 530 •

R. - Solu"bilite des prihcipaux corps chimiq'Ues

employes en microbiologie.

1° COMPOSES MINERAUX.
pOln~ DU CORPS SoT.t1Bl.F! EN GRAMMES:
dans reau il. 15' dans l'a\~oo!.
Alun d'ammoniaqae crist. 10 gr. insoluble
Carbonate d'ammonium. 25 »
Nitrate d'argent. 215 10
Acide arsenieux .. 1,2. 0,7~
Acide arsenique.. . 16,7 tres soluble
Acide borique cri~t. • 3 25 bb\\iUant.
Acide chromique. • • 166 ~sblublll
Carbonate de lithium .. 0.77 insoluble
Carbonate de magnesium: 0,01 »
Phosphate de magnesium. 0,3
Sulfate de magnesium 33 »"
Chlorure mercureux. insoluble
lodure mercureu:r;. 0,04 )}
Chlorure mercuriqu:. : 7 33
Cganure mercurique. . 12 5
lodure mercurique. • 0,6 U,S
Chlorure de potassium. 33 '0,5
Bromure de potassium. . 64,5 0,5
Carbonate de potassium
anhydre. .. . . . 90 insoluble
Bicarbonate de potassium. 25 »
Iodure de potassium. . • 140 1.5
Nitrate de potassium. . . 25 insolnble
Permariganate de pota$- decompose
sium .• 6,3 1,8
Arseniate d~ s~di~m:
Arsenite de sodium.
Borate de sodium.
. 28
tres soluble.
7
insoluble
,.
Carbonate de sodium crist. 88 »"
Bicarbonate de sodium. 10,5
Chlorure de sodium. 95 "
»
Nitrate de soqium. . 8~ ~
 REACTIFS UTILHS DANS LES LABQRATOIRES 171
Phosp_hate bibusique de
sodium.. . . . 15 insoluble
Phosphate tribasique. . . 20 »
Sulfate de sodil1m anhydre. 25-
Sulfite de sodium. • • . 25 ..."
Bisulfite de sodium. • • tres soluble »
Hyposulfite. • • • • • 60 »

2° COMPOSES ORGANIQUEs.

a) Serie grasse.
SOLUBIUT' DAN'S POINT
100 p. D'EAU. D~EnULL1TloN.

Serie methyl. Chloroforme. . . . . traces ~1,2

Tetrachlorure de carbone. insolUble 8.1
Iodoforme. . . » vap.
Trimethylamine. » 9.3
Uree . . . . . . 100 decompose
Serie ethyl. Acide acetique .• tres soluble 117,3
Acide oxalique .. 170 deCOMpose
Alcool ethylique. tres soluble 78.05
Chloral (hydrate de), » 98 (dec.)
Glycocolle. • . 23 decompose
Serie propyl. Acetone. tres soluble 56.4
Acroleine. . . 2,5 52
Monochlorhydriue. tres soluble 227
Dichlorhydrine. peu soluble 185
Glycerine. .. tres soluble 290,4
Serie butyl. Acide butyrique. ,. 160
Acide malique .. »• decompose
Acide succinique. 5,2 235 (dec.)
Acide tartrique. 170 decompose
Asparagine. . 1,8 ))

SucciQirqide.. , . soluble 287

Serie amyl. Furfurol •. 9 162
Serie hexy 1. Leucine... 3,7 decompose
Series superieures.Acide oleique. . insoluble
Acide. palmitique. J) 348
Acide stearique. » :]87
Paraffine.. . . » 300

b) Serie aromalique el divers.

SOLUBlLITE DANS POINT
100 p. D'ALCOOr.. n'EBuLLITION.
Benzine. tres soluble 80,5
Phenol. • l) 183
Aniline. · t. sol. (3 % dans
reau) 182
Hydroquinone. · tres soluble sublimee
Phloroglucine. · t. sol. (40 d'eau) 210
Toluene . . · peu soluble 182
Xylol. . . . · solhhle 218
Acide tannique. · t~sol. (40 d'eau) decompose
Acide gallique .. »
Napthaline. "
· peu soluble 218
Thymol. . • t. sol. (0,3 eall) 23Q
172 TECHNIQUES GENERALES
Mentho!. • (peu soluble
eau) 212
Camphre .. soluble 209
Indo!. • tres soluble 245 dec.

c) Sels d' acides organiques.

SOI~UDlLI'l.'I:: DANS
100 p. U·EAtJ.
Acetate d'ammonium. tres soluble
Acetate de plomb. . 66
Acetate de potassium. 190
Acetate de sodium. . 28
Benzoate de sodium. . Ires soluble
Citrate de sodium. 40
Lactate de zinc. 2
Oxalate d·ammonium. 33
Oxalate de potassium. 33
Tartrate de potassium. 150

d) Sucres.
En C5H 1005 Arabinose. soluble
En CGH 14 06 Mannite. 16
Dulcite .. 4
Sorbite •. soluble

En C6H1206 Reduisant lllliq. de Fehling

Glucose .. 81
Levulose. tres soluble
Galactose. »
En 02H 22 0l1
Saccbarose. 300 \
Lactose. 20 '
Maltose. tres soluble

S. - Table de diluti0'"3-s de l'alcool..

(en par/anl de l'alcool a 90 0 .)

TITRE AT.COOMETRIQUE. VOl.UME D'EAU A AJOUTRn A 100

VOr..VMF.S D'ALCOOI~ A 000

80 0 14 cc.
75 0 22 ce.
70 0 31 cc.
65 0 42 cc.
60 0 54 cc.
50 0 85 cc.
40 0 131 cc.
30 0 206 ee.
 DEUXIEME PARTIE

EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX

CHAPITRE XIII

ELEVAGE DES PETITS ANIMAUX DE LABORATOIRE

A. - Lapins et cobayes.
Le local destine a l'elevage des lapins et des cobayes
doit etre pourvu d'eau, convenablement eclaire et facile-
ment acrable. Les fenetres seront largement ouvertes en ete.
Mais, en hiver, il convientde chauffer pendant les journees
froides pour entretenir une temperature moyenne de 10 a
12°.
On repartira les animaux dans de petits boxes en ciment
anne, de 1 m. 20 a 1 m. 50 de long, sur 0 m. 60 a 0 m. 80 de
profondeur et 0 m. 60 de haut,.reposant sur un sol cimente,
legerement incline vers une rigole- exterieure. A la rigueur,
de simples caisses de bois, munies d'un fond perce de trous
et posees sur des supports de 1 m. a 1 m. 20'de haut, peuvent
convenir. Boxes et caisses doivent .etre fermes par des cadres
de bois grillages, assez lourds pour qu'ils ne puissent eire
souleves, surtout par les lapins. On les garnira toujours
d'une abondante litiere de paille.
La meilleure ,disposition consiste a placer les cages en
une seulefilele long des murs, et en double file sur la ligne
mediane. On,menage ainsi deux aIIees laterales, assez larges
pour permettre Ie nettoyage et l'enJevement des fumier~.
Lapins et cobayes re90ivent les memes aliments: en ete
fourrage vert (luzerne, trefle, sainfoin), des feuilles de choux·,
des epluchures de salade, des fanes de carottes ou de navet,
des grains (avotne de preference au son, dont les proprie-
174 E~PERIMENTATioN SUR LES ANIMAU){i

tes nutritives sont maintenant a peu pres nulles). En

hiver, les aliments seront remplaces par des hetteraves,
ou mieux par des carottes fourrageres, du foin sec, des
grains ou des restes de pain. II est inutile de faire hoire les
animaux quand on Ies alimente avec des fourrages verts.
On De leur donnera un peu d'eau que dans Ie cas de
regime sec.
Poureviter la souillure et.la'perte des aliments, Ie fourrage
sera place dans un petit ratelier en fil de fer galvanise, sus-
pendu par deux clous a l'une des parois de la cage. Une
mangeoire metallique, accrochec a la paroi opposee, rece-
vra les grains.
Un lapin consomme chaque jour 600 a 800 grammes d'ali-
ments verts et 200 a 25{)" grammes de hetteraves ou de
carottes ; un cohaye, 200 a 300 grammes de fourrage vert
ou 70 a 80 grammes de hetteraves remplayables par 40 a 50
grammes de carottes. Ces aliments sont distrihues en
deux repas, Ie premier Ie maun, ioomooiatement apres Ie
nettoyage des cages, Ie second Ie soil'. Les beUer.aves et les
carottes doivent etre, au prealabJ.e, soigneu~eluent grattees.
et cou.pees en qRartiers.
L' errtretien des animaux com porte l' enlevemen t quotidien
des Iitieres souillees, Ie raclage des boxes ou des cages et Ie
lal'age a grande eau -du sol.
Les lapines destinees a la reproduction doivept eire iso-
lees. Des l'age de 6 a 9 mois, elles sont aptes a t-ep.rodu1J>e.
Au m<lment du rut on les trlilnsporte dans la cage d'un
male O'u on les laisse une heure <m deux.
Une holl.lle lapine pe!!t donner 4 it I) p@rrees par an. La
dunie de la gestation est en rnoyenne de 35 jours. Vel's la
floll, quand les femelles commencent a s'arracher les poils
du ventre pour en faire un nid, il faut augmenter les aliments
et donner un peu d'eau dans un abreuvoir metaJJ.ique. Le
nombre des petits est ordinairement de 5 .ou 6, parfoi~, il
s'eleve jusqu'a dix.Du 20· au 25" _jpur, les jeunes Iapel'eauiX
sortent du nid et commencent a b.r.outer. Us peuvent et~e
sevres it 6 semaines et separes de leur mere. Celle-oi entre
de nouveau en chaleur deux mois -et ,derni apres la mise has
et peut, des lors. etre representee a.u male.
On Re conserve, pout' 1a reproduction, que les lapines
agees de moins de deux MS, Ie no.mbre des PQrfl~es an-
 ELEVAGE DES PETITS ANIMAY~ DlJ l.ABaRA.TOIRE 175
nuelles et des petits dlminuant par la suite. Un male su.fJ,it
pour 8- ou 10 femelles.
Des qu'on reconnalt qu'elles sont pleines, on s.epan,le&
cobayes femeHes des males et on les reunit par gJ.:O,u:pe.s de
5 ou, 6 dans une meme cag!}. EUes donnent 2. ou 3 petits,
rarement 4, et la periode de gestation clure 60 a. 6,5. jt)lolrs,.
Les cobayes naissent couverts de poils, marchent et s'es,"I
saient a manger des leur naissance.
Lorsqu'elles ont atteint Ie 4~ mois, les femelles peuvent
~tre fecondees. Elles produisent 3 it 4 p_ortees par an p.en·
dant 2 ans. :Passe ce temps, eIles ne conviennent plm: a la
repl'oduction.
On conservera un male pour une vingt:;tine de femelles .
Les animaux inocules doivent etre entretenus dans un.
local distinct du local d'elevage et aussi eloigue que pos-
sible de celui-ci. On les rt!partira, suivant les necessites. du
tre.vai1, par groupes de 5 a 6. dans des cages metalliques
grillagees, munies d'un plateau mobile Qn, de preference,
dans d~s cages en ciment arme, parfaitement etantyhes, fer·
mees lateralement par une porte metalliqne basculant sur
deux axes. Ces cages se.ront ouvartes a 1 metre environ du
sol pour faciliter Ie nettoyage. Un trou, creuse au centre de
leur paroi inferieure inclinee, facilitera l'ecoulement des
urines v~rs un tuyau qui deboueheradam; un cenduit ~tG\n«he,
comrnUD.
Immediatement apres l.'inoculation, lapios et cobayea.
s€vont marques a l'oreille au mQyen d'une petite medaiUe
metallique chiffree, ou avec des couleurs vaI1iees disSDutes..
dans l'ean pheniquee a 5 p. 1.000 et additionnees d'une
petite quantite d'albumine P,Qur assurer leur adhesion.
Toutes les cages porteront un numero et une plaque a glis-
siere sur Ia.queUe on fixera un carton iudiq.uant la dp.te des
inoculations, Ie nombre et Ia marque des anilllaux inQcu16s,
etc.

B. - R.ats et s~uris.

Ces animaux, dont Ia variete aIbin!)s fiSt Ia plult rechor""'

chee, sont tres faciles a elever dans des caisses de bQil! dQu-
blees de metal et ferlllees par un couvercle· grilla.ge, -ou dans
des bocaux de verre. Da·ns les caisses, separees par une cloi-
176 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX;

son mobile, on dispose de petites boites-abris percees d'un

trou, dans lesquelles les rongeurs peuvent se refugier et
elever leurs petits.
Le foin, la paille, la sciure de bois, du papier coupe en
morceaux, constituent d'excellentes litieres, mais la laine,
les etoffes, Ie coton, les chiffons ne conviennent pas (Mou-
quet).
Rats et souris mangent beaucoup. 30 a 40 grammes d'ali-
ments par jour sont necessaires pour entretenir un rat;
lOa 12 pour une souris: debris de pain. viande, grains
(sauf I'orge) pour les rats, epluchures de legumes ou de
fruits. Un regime compose uniquement d'avoine provoque
un deperissement rapide par carence; un peu de verdure
est indispensable comme rafraichissant.
On ne manquera pas de mettre constamment a la dispo·
sition des petits rongeurs de l'eau dans une soucoupe, OU,
mieux, dans un tube de verre ,perce a son extremite infe-
rieure d'une ouverture tres etroite, bouche avec un bou-
chon de caoutchouc et suspendu it une des parois de la cage
(Ponsel1e).
La gestation dure 21 jours chez l.es rats et les souris qui
peuvent reproduire vel'S l'age de 2 a 3 mois. On peut obte-
nil' chaque annee I) ou 6 portees de 5 a 8 petits. Ceux-ci
sont nus a leur naissance ; leurs yeux restent clos jusqu'au
13" jour. lls sortent du nid du 15" au 20e jour et p~uvent etre
sevres Ie 20· jour pour les rats, Ie 30· pour les souris. Les
femelles pleines doivent eire sepan!es des males dont un
seul suffit pour 8 it 10·reproductrices.

C. - Maladies des lapins.

Pasleurellose (maladie du nez). - Tres contagieuse. Elle
se traduit p.ar de l'inappetence, de la prostration, dujetage,
parfois de Ia toux et de la diarrhee. La mort survient rapi-
deme'llt.
Pneumococcie. - 1;{.are chez les lapins neufs, cette affec-
tion est frequente chez les animaux inocuIes. Le pseudo.
pneumocoque qui en est Ia cause est Un microbe de sortie
(M. Nicolle).
Necrobacillose. - Due au bacil1e de Ia necrose,ou bacille
de Schmor!. Se traduit par de la dermite, des abces sous-
ELEVAGE DES PETITS ANIMAUX. DE LABORATOIRE 177
cutanes et pulmonaires, du coryza et des collections des
sinijs.
Pseudo-tuberculose. - Relativement rare chez Ie lapin,
elle est causee par Ie cocco-haciIle de Malassez et Vignal.
Son evolution est lente. :A I'autopsie on trouve des lesions
I)oqulaires du foie, de la rate et des intestins.
Coccidiose. - Elle revet la forme intestinale ou Ia forme
hepatiqu~ et se traduit par un amaigrissement progressif.
l'aspect terne des poils, l'enflure du ventre, de la diarrhee
et des copvplsions. La mort survient en quelquesjours chez
les jeunes, ell quelques semaines ehez les adultes. A,l'autop-
sie on trou'\'e, dans Ie cas de coccidiose hepatique, des
masses blanchatres au jaunatres, echelonnees Ie long des
canaux biliaires. Ces masses contiennent une enorme quan-
tite d' oocystes ovalaires a double paroi, tres refringents.
Dans la coccidiose intestinale, des plaques hlanchatres
sont disseminees sur !'intestin grele.
La diffusion de ces maladies tres contagieuses sera evi-
tee en surveillant attentivement les lapins at en separant
immediatement ceux qui paraissent tristes ou ne mangent
pas. Les cages infecMes seront evacuees, puis ahondamment
lavees avec une solution cresylee forte. On rcpartira les ani-
maux contamines par petits lots, dans des cages spc<!.iales, et
on incinerera les cadavres au on les enfouira profondement
en 'Ies saupoudrant de chaux vive.
D'flutres affections parasitaires dues a des strangles, des
tamias au des cenures, peuvent egalement survenir. La cenu-
rose, provoquee ~ar la forme cystique du Trenia serialis
du chien, se manifeste par des kystes plus ou moins volu-
mineux au cou, a l'epaule ou sur la nuque et dans les
serel,lses.
(rale des oreilles. - La gale psoroptique des oreilles, due
a Psoroptes commllnis, debute par Ie conduit auditif
e~terne et envahit parfois l'oreille moyenne, determinant
des troubles de l'attitude, des accidents epileptiformes et Ia
mort. Cette affection se traduit Iocalement par des croutes
epaisses et adherentes, obstruimt Ie conduit auditif. Elle
doit etre attentivement surveillee par l'examen systema-
tique des oreilles Des son apparition,'les lapins en contact
avec les malades seront separcs et on soumettra les galeux
au traitement suivant : enlever les croutes avec de reau
lIfCROBlOLOGlE 12
 1:78 ExpERIMENTATION SUR·LES ANJMAUX!

.savonneuse tiede et un ecouvillon de coton, rincer a l'eau

tiede, puis secher, et introduire dans l'oreille une petite
quantite de baume de Perou, en massa,nt legerement la~base
.de l'organe. Des insufflations de fleur de soufre et des
lavages. ah polysulfure de sodium a 5 p. 1.000 reussissent
egalement bien.
Gale de La tete el des palles. - Due a Sarcoptes scabiei,
cuniculi, ou it Notoedres cali. Envahit l'extremite des
pattes et du nez qu'elle couvre de squames. Moins fre-
quente que la,precedente, elle presente cependant Ia meme
contagiosite. On peut la traiter au moyen de frictions avec
la pomniade d'Helmerich, mais iI est preferable de sacrifier
les mala des et de desinfecter les locaux.

D. - Maladies des cobayes.

Pneumonie et broncho-pneumonie. - Tres frequentes et

~res contagi~uses, ces affections sont provoquees par des
pasteurella. Les symptomes observes sont peu nets. Les
malades se mettent en boule, les poils herisses, s'immobi-
Hsent et maigrissent. Souvent du jetage apparait en meme
temps que de la dyspnee. La mort survient en quelques
jours. A l'autopsie on trouve des epanchements cavitaires
et des lesions inflammatoires pulmonaires et ple~rales.
MaLadie dll nez. - Elle a souvent pour cause la\« sortie l)
d'un pseudo-pneumocoque chez des animaux sensibilises
par des inoculations diverses : microbes vivants ou morts,
toxines (M. Nicolle). Ses symptomes consistent en unjetage
sereux, puis purulent, qui obstrue peu it peu les cavites
nasales, de l'amaigrissement et une dyspnee accentuee. La
mort' se produit apres un temps variable qui peut atteindre
plusieurs semaines. Dans la forme nasale pure, on observe
seulement de Ia degenerescence graisseuse du foie ; dans 1a
forme broncho-pulmonaire, Ie poumon enflamme est carnifie.
-La peritonite avec epanchement est frequente, Ia pleuro-
pericardite aS5ez rare.
Pseudo-tuberculose. - Provoquee par Ie cocco-baciIle de
Malassez et Vignal. CeUe affection peut eire aigue au chro-
·nique (Ramon). Le type septicemique evolue en 24-48 heu-
res'etne determine pas d'autre symptome caracteristique
ELEVAGEDES PETITS ANIMAUX DE LABdRATOIRE 179

qu'une dyspnee croissante. Dans Ia forme ganglionnaire. on

observe des adenopathies sous-glossiennes. cervicales ou
inguinales s'accompagnant de suppuration. Le type cIas-
sique se traduit par une cachexie progressive, qui amene Ia
mort en nne ou plusieufs semaines. 11 n'existe de lesions
typiques que dans ceUe derniere forme: nodules blancs,
plus ou moins volumineux, dissemines a Ia surface de Ia
rate ou envahissant Ie parenchyme hepatique hypertrophie ;
-abcedation des ganglions mesenteriques. Les poumons sont
parfoisenvahis par un' semis de petits tubercules de dimen-
sions variables.
Peste. - Due a un virus filtrant. Assez rarement obser-
vee.
Paralysie'. - Assez rare. Decrite en Autriche par Romer,
eUe existe egalement dans Ies elevages de Ia region pari-
sienne. Le train posterieur des cobayes devient mou puis
se paralyse tout a fait et l'animal traine Ies membres en
,extension quand il se deplace, Mort en 15 a 20 jours.

E. - Maladies des rats et souris.

Seplicemie des souris. - Due a un bacille d6crit par Koch.

Somnolence, dyspnee, mort rapide.
Typhose. - Due a des bacilles paratyphiques, dont B
Typhi murium.
Sarcosporidiose. - Determine un,e degell(!resc~nce parti-
culiere du tissu musculaire et se traduit par de fines trai-
nees bIancnatres Ie long des fibres.
Teiglles. - Frequen'tes.
 CHAP ITRE XIV

CONTENTION ET ANESTHESIE DES ANIMAUX! D'EXFE-

RIENCES. _, DIFFERENTS MODES D'INFECTION EXPE·
RIMENTALE. - PONCTION DU CmUR. - P.ONCTION
DU FOIE, DE LA RATE ET DES OS LONGS. -
EPILATION. - AUTOPSIES. - ENFOUISSEMENT ET
INCINERATION DES CADAVRES. - TEMPERATURES
NORMALES

A. - Contention.
Les moyens de contention varient avec les differentes
especes animales employees.
Les souris et les rats peuvent etre manipules avec des
pinces a mors de dimensions variables. On les saisit par la
peau de la nuque e1 par la base de la queue, de favon ales.
immobiliser completement.
Les cobayes et les lapins sont main tenus avec les mains
par un aide pour les operations courantes. I
S'il s'agit d'interventions delicates (ponction intracar-
diaque, denudation de la veine jugulaire, mise en place d'lln
sac de collodion dans Ie peritoine" ils doivent etre fixes sur
un plateau en zinc. dont les bords releves sont perces ae .
trous. Aux quatre pattes, on attache des nreuds coulants
dont les extremites sont fixees aux bords du plateau par
l'un des trous. Les dimensions de ces plateaux sont :
pour les lapins de 0 m. 66 X 0 m. 40 ; pour les cobayes de
Om. 46 X 0 m. 27.
Si une immobilisation plus complete est necessaire. on
peut avoir recours au mors de Malassez qui maintient la
tete dans la position qu'on veut lui donner, ou it .l'appa-
reil de Latapie. Ce dernier est combine pour s'adapter it
tous les petits animaux de laboratoire.
Pour les plus gros animaux, employer la gouttiere de Ver-
din.
 ANE8THESIE. - INFECTION. - PPNCTION 181

B. - Technique pour r~pilatiod des animaux

d' experiences.

Lorsqu'il est impossible, ou contre-indique, de se servit

du rasoir pour epiler' les animaux d'experiences en vue
d'inoculations transcutanees (par exemple : vaccine, tuber-
culose), il est recommandable d'employer une solution
epilatoire ne contenanf pas d'arsenic. La meilleure est une
solution aqueuse de monosulfure de sodium it 36 p. 100.
On badigeonne fortement Ia region it epiler avec un tam-
pon d'ouate monte sur une tige de bois ef impregne de
mO,nasulfure, on laisse agir quelques instants et on hIve
rapidement a grande eau pour arreter raction caustiqtte du
liquide epilatoire. On essuie avec soin la pe:tu, on la seche,
et on y etale aussitOt, avec un pinceau ou une spatule, Ia
substance virulente.

C. - Anesthesia.
Toutes les {ois qu'une inoculation ou une operation peut
entrafner de la douleur, on doit recouril' a l'allesthesie.
L'e!llpioi du chlorofo:rme est souvent dangereux chez les
animaux, particulierement chez Ie lapin et chez Ie chien. II
faut done eviter de s'en servir, sauf pour Ie cobaye et Ie
chat qui Ie supportent assez bien.
On l'utilisera &ous forme d'eau chlol'o(ormee paur l'in-
sensibilisation des petits animaux a sang froid (vers, mol-
lusques, grenouilles, etc.).
Les vapeurs degagees par une petite quantite de chloro-
forme ou d'ethersous nne cloche conviennent tres bien pour
insensibiliser les souris, les rats, les tortues, les lezards et
les reptiles.
On pent aussi insensibiliser les reptiles, particuliere-
ment les serpents venimeux, ell leur pulverisant de l'ether
sur Ie crane au niveau des hemispheres cerebraux.
On endort Ie cobaye (prealablement fixe sur J'appareil a
contention) en lui faisant inhaler des vapeurs de chloro-
forme ou d'ether degagees d'un petit tampon d'ouate place
au fond d'un cornet de papier dont gn coiffe la tete de l'ani-
mal. L'ex(remite du cornet doit etre ouverte, de teUe sorte
182 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUx<

que l'air exterieur vienne aiseme.nt se meIer aux vapeurs de

chloroforme.
Si 1'0n doit operer sur Ie chat, il est plus commode de Ie
placer d'abord so us une cloche a tubulu.re dans laquelle on
introduit un tampon d'ouate hydrophile impregne de chIo-
roforme. Mais pour cet animal, comme pour Ie lapin, iI est
plus recomman.dable de se servir de cliloralose qu'on admi-
nistre par ingestion melange a un peu de lait par exemple.
a Ia dose de 0 gr. 10 a 0 gr. 15, une demi-heur-e avant I'ope-
ration.
Chez Ie cobaye, Ie lapin et Ie singe de petite taille, on
peut faire ingerer Ie chloralose a. la sonde oosophagienne.
- toujours une demi-heure d'avance, - a. la dose 'de
ogr. 15 pour Ie premier, de 0 gr. 30 a 0 gr. 40 pour les
autres.
Le chloralose p~ut encore etre injecte par voie intravei-
neuse chez Ie lapin dans la veine marginale de l'oreille.
chez Ie singe et chez Ie chien dans la saphene externe, a la
dose de 0 gr. 15 par kilogramme d'animal. Cette substance
doit alors etre dissoute dans de l'eau salee physiologique
(it 7 gr 5 de NaCI par litre). Sa solubilite est faible, - de
7 gr. 5 seulement par litre, - de sorte que la quantite it.
injecter 'est toujours assez considerable : 20 centimetres
cubes de solution par kilogramme d'animal. C'est Ie seul
inconvenient de cette methode.
Lorsqu'il s'agit d'effectuer une laparotomie chezlJ cobaye,
Ie lapin ou Ie singe, il vaut mieux recourir '3. l'injection
intraperitoneale d'un melange d'hydrate de chloral ct de
morphine:
Hy;drate de chloral. . • • 10 gr. 0
Chlorhydrate de morphine. o gr, 05
Eau distilIee, • . 100 cc.
(Sterilisation inutile it cause du pouvoir antiseptique du
chloral.)
On en injecte 2 centimetres cubes au plus par kilo-
gramme d'animal chez Ie cob aye ou chez Ie lapin, - gene-
ralement 1 centimetre cube est une dose suffisante ; - 3 a
4 centimetres cubes (suivant la taille) par kilogramme chez
Ie chien.
La meme solution, injectee dans Ie muscle pectoral chez
les oiseaux, peut parfaitement etre employee.
 ANESTHBSIE. - INFECTION. - PoNCTIONS 183

L'anesthesic ohtenue par ce _procede est tout it fait inof-

fensive et complete. Elle est seulement un peu lente a s'eta-
hlir : 10 a 20 minutes . .Mais elle persiste assez longtemps et
permet' de pratiquer tres commodement les operations les
plus deli cates sur les organes de l'abdomen. On evite les
accidents d'asphyxie,.qui viendraient it se produire, alb
moyen de la respiration artificielle et des inhalations d'oxy-
gene.
Chez Ie cheval, on emploie les inhalations de chloroforme
(animal solidement entrave, couche sur un lit de paille
recouvert d'une bache impermeable), mais on doit, 3 ou
4 heures avant l'anesth~sie, administrer it l'animal 0 gr. 50
de chlorhydrate de morphine en injection sous-cutanee.
Dehenedetti a recemment preconise Ie somnifene pour
les anesthesies de longue duree chez les petits animaux de·
labdratoire.
Chez les rats hlancs de 130 a 150 gr., on ohtient une
anesthesie complete de 4 it 5 heures, sans choc consecutif,
en pratiquant des injections sous-cutanees de somnifene
(solution pour injections intramusculaires) it raison de
o cc. 043 pour 100 gr. de rat, so it pour un rat de 140 gr.
o cc. 06 a,O cc. 07. II est necessaire d'employer une serin-
gue it graduation precise. Le sommeil se produit ad- bout
d'une 1/2 heure it 3/4 d'heure. Une heure apres l'injection,
Ie sommeil et l'insensibilite sont completes. Ils durent 4 it
5 heures. Aucun choc au reveil.
La dose anesthesique est assez voisine de la dose toxique
(0 tc. 06 pour 100 gr.). A la dose de 0 cc. 03, l'insensibili-
sation est incomplete. Un dosage precis est donc neces-
saire.
N0la. - Les animaux it sang chaud qui ont ete anes-
thesies par l'ether ou par Ie chloralose doivent toujours etre
main tenus dans 'un endroit chaud et sec, - au voisinage
d'une etuve par exemple, - pendant quelques heures apr~s
l'operation, car leur temperature est constamment abaissee
et il faut en favoriser Ie relevement progressif. Sans ceUe
precaution il arrive souvent qu'ils succombent a des acci-
dents pneumoniques.
184 EXPERIMENTATION 8UR LES ANIMAU,&

D. ~ Differents modes d'inf~ction

experimentate.
Lorsqu'on etudie experimentalement lao virulence d'U11e
culture microbicnne, il est souvent neeessaire de precis-er
Ie poids des ge:rmes employes.
Pour peser des microbes, on preleve, avec une anse au
une spatule sterilisee, une petite quan tite de culture qu' on
porte a la balance de precision, sur un petit carre de papier
a fiItrer sterile, prealablement tare dans un verre de mon-
tre. On en prend ainsi 10 milligrammes pat exemple. .
ees microbes, essores sur Ie papier-filtre, sont alors depo-
SeS dans nIl verre conique, sterile, et on les emulsionne so i-
gneusement avec de l'ean physiologique sterile, ajoutee
d'abord, goutte a goutte, a la pipette effilee. On evite de
faire des grul11ea ux.
On doit tablet, pour les calculs de dilution, sur Ie I10mbre
moyen de microbes con tenus daJ1s 1 milligramme de cul-
ture. Avec Ie bacille tuberculeux (sur bouillon glycerine ou
patnme de terre glycerinee), ce nombre moyen est de
40 millions par milligramme. Done 0 mgr. 000.000.1 de
culture = 4 bacilles ef chaqtte baeille pese environ 25 cent-
'millioniemes de milligram me.
L'il1fection esperimentale des petits animaux generale-
ment utilises dans les laboratoires, en particulie~ Ie cobaye
et Ie lapin, est Ie plus souvent realisee par simple inocu-
lation SOlls-cutanee en plongeant l'aiguille a injection, s11r
Ia moitie de sa longueur environ, dans Ie tissu tellulaire, it,
la base d'un pli fait a la peau entre deux doigts, ou entr~
l.es mors d'une pince. ,
II est toujours necessaire de couper les poils aussi ras
que possible et d'aseptiser la peau, soit par lavage al'alcooI,
soit par badigeonnage a la teinture d'iode (effe'ctue quelques
minutes avant l'injecti<'ln).
Les autres voies d'infectiou Ie plus commodement utili-
sees sont :

a) Voie intraperitoneale.
Ne doit etre employee que pour les emulsions d'organes
frais ou pour les cultures pures. Il ne faut j'amais en faire
 ANESTHBSIE. - INFECTION. - PONCTIONS 185

usage pOut eprouver la virulence de crachats, de matieres

fMales, d'urines, de pus ou de prodnits de broyage d'organes
provenant de cadavres putrefies, car il en resulterait lille
peritonite mortelle, due aux microbes de Itt putrefaction.

b) Voie inlravasclllaire.
La veine marginale de l'oreille est tres fnciletnent
accessible chez Ie lapin.
Chez Ie cobaye, il faut pratiquer l'injectioh dans la veine
jugulaire qu'on met a nu par une incision et une dissection

Fig. lG. - !noculation intravcineuse chez Ie lapin (dans In veine marginal. d.!'!·oreiIJe),

prealables. Ati~sitot apres, on pratique l'hemostase, soit

·au moyen d'une ligature, soit a l'aide d'une petite pince
qu'on laisse en place pendant quelques minutes avant de
refermeI'la plaie avec 2 ou 3 agrafes de Michel (Fig. 16 et 17).
L'illfection du rat et celIe de la souris par voie s~nguine
peut etre aisement realisee grace a l'existence, chez ces
petits rongeurs, de deux veines superficielles qui sont
visibles lateralement a la base de la queue. 11 faut faire
usage de tees fines aiguilles analogues a celles <}u'em-
ploiellt les delltistes pour les injections de liquides anes-
thesiques dans la gencive. On peut introduire dans Ia
186 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX

veine d'une souris jusqu'a 1 centimetre cube de liquide.

L'animal etant immohilise par un aide, l'operateur saisit,
avec la main gauche, la queue dont il appuie Ia hase

A~,"-__
~o::::"...,~~~.?
:-<:: #;;-~
--_,:7l>
--:_.-=-

I ~------== - -~ ,......~

Fig. 17. - Inoculation illtravcineuse chez Ie cobaye (dans Ia vein. juguIair. mise
a nu).

sur son index et pique parallelement au vaisseau. En reti-

rant lentement la pointe de I'aiguilIe, on evite la sortie du
sang.
c) Voie intl'acranienne el voie inil'aracilidienne. I
On injecte Ies Iiquides so us Ia dure-mere, ou dans I'Ul~
des hemispheres cerehraux qu'on atteint aisement en prati-
quant sur Ie vertex, sur line ligne transversale passant par
la commissure posterieure des deux yeux, une petite inci-
sion de la peau et un minuscule trou a la hoite cranienne,
au moyen d'un foret pourvu d'un curseur de reglage. Par
cet orifice, qu'on a soin de percer un peu a droite ou a gau-
che de la ligne mediane (pour ne pas atteindre Ie sinus vei-
neux longitudinal superieur), on plonge l'extremite de l'ai-
guille a 40u 5 mjIlimetres de profondeur et on pousse tres
doucement l'injection, dont 1e volume ne doit pas depasser
4 a 5 ~outtes.
Une autre methode, beaucoup p~us inoffensive et plus
elegante, est l'injeclion post-orbitale. En voici Ia technique:
L'animal, cobaye ou lapin. ayant la tete b,ien immobi-
 ,.-
ANESTHEsIE. - INFECTION. - PONCTlONS 187
lisee horizontalement, Qn glisse, par un mouvement s~mi­
circulaire; la pointe d'une aiguille de seringue it injection,
tenue par son pavilIon, de dehors en dedans et d'avant en
arriere, Ie long de la cavite orbitaire, en suivant la face
interne du globe de 1'00iI et sans piquer celui-ci. Lorsque
Ia pointe arrive tout it fait a la partie PQsterieure de l'orbite,
un Ieger mouvement de bascule de bas en haut fait penetrer
l'aiguiIle par Ie trou orbitaire jusque sous Ie chiasma des
nerfs optiqpes et sans que ceux-ci puissent etre leges. L'ai-
guilIe est en bonne place lorsqu'elle joue librement da,ns
Ie trou orbitaire, sans buter contre une paroi osseuse.
On pousse alors l'injection qui, penetrant entre la dure-
mere et la pie-mere, se melange au liquide cephalo'-raehi-
dien. L'aiguille brusquement retiree ne laisse aucune plaie
et l'operation ne cause aueun trouble it l'animal.
Les injections iransorbitaires (trou optique ou fente sphe-
noidale) ont ete egalement preconisees par Remlinger et
Bel, chez Ies grands animaux.
Le chien peut servir de type pour la description. Chez
cet animal, l'orbite forme une sorte de cone dont la hau-
teur, dans les races moyennes, est d'environ 5 centimetres.
Vers Ie sommet, se trouvent rassemhles, sur une ligne
oblique d'avant en arriere et de haut en bas, 3 orifices:
irou oplique, grande rente sphenoidale s'ouvrant run et l'au-
tre dans la cavite cranienne, irou grand rond conduisant
dans Ie canal pterygoldien. Le chien etant fixe sur un
plateau, et sa tete reposant soli~ement sur celui-ci, une
aiguille de 5 a 7 centimetres est introduite Ie long du bord
inferieur du corps clignotant, sous Ie globe oculaire. et
dirigee un peu en bas et en dedans. Apres quelques taton-
nements on sent son extremite s'engager dans l'un des
2 premiers orifices precites Vne seringue chargee est
adaptee a l'aiguille et l'injection poussee dans la cavite
cranienne. Chez Ie chat. Ie cheval, Ie boouf, Ie mouton, Ia
chevre, Ie pore, Ies injections transorbitaires s'effectuent
de fa~on presque identique.
, L'inoculation inil'al'achidienlle se fait par ponction lom-
baire en i,ntroduisant une aiguille d'acier d'arriere en..avant,
entre tes lames vertebrales de l'av,ant-derniere v~rtebre
Iombaire, jus que dans Ia cavite medullaire dans Iaquelle
'" floUe Ia queue' de cheval. II est indispensable d'inciser
188 EXpERIMENTATION SUR LES ANIMAUX!

prealablement Ia peau sur une longueur d'environ 1 centi-

metre, au niveau de l'apophyse epineuse de la 4· vertebre
lombaire. Avec l'ongle de I'index de Ia mltin gauche, on
determine exactement celle-ci et, immediatement en avant,
on plonge d'arriere en avant l'aiguille dont Ie pavillon doh
rester libre pour permetire l' ecoulement au dehors de quel-
ques gouttes de liquide cephalo-rachidien. Cet ecoule~~!1t
atteste que l'aiguille est bien en place. II ne reste plu,S 'Iu'a
y adapter Ie bee de la seringue chargee de suhstftqce iniec-
tante et a pousser doucement l'injection dont Ie volume ne
doit pas depasser 0 cc. 5 pour Ie (whaye, 1 centimetre cube
pour Ie lapin. torsque celle-ci est terminee, on retire brus-
quemel1t l'aiguille, on ferme la petite plaie cutanee aveC'_une
agrafe de Michel et on touche a la teinture d'iode.

d) Voie oculail'e.
L'inoculation par cette voie se realise, so it en introoui-
sant directement Ie virus daI1s ]a chambre anterieure .de
fail, soit par simple instillation Sllr la conjonctive. '
L'inoculation dans la ~hambre anterieure' de t'rei! se (ait
Ie plus cornmodement chez Ie lapin. •
On fixe Ie globe ocu1aire en enserrant, au mqyen d'une-

Fig. 18. - Instillation snr r reil d' un cob.ye.

a
pince dents de souris, un pH de fa conjonctive un peu en
dehors du bord superieur de la cornee, et, avec la pointe
 ANESTHESIE. - INFECTION. - PONCTIONS 189

d'une aiguiIle fine, on pique celle-ci tres obliquement, de

manier~ it ne pas blesser l'iris, On laisse eeouler libreinent
quelques gouttes d'humeuraqueuse, puis on adapte la serin-
gue sur Ie pavilIon de l'aiguille et ()n pousse doucement 1'e-
mulsion microbienne' dans la chambre ant~rjeure de l'ceil,
en ayant spin de n'injecter qu'une quantite de liquide assez
faible pOllr n~ pas produire de s~rpression.
Si 1'0n retire brusquement l'aiguille, la petite plaie cor-
-neenne s'e referme aussitOt et il ne reste plu$ qu'a laver la
surface de I'ceil avec un peu d'eau sterile ou une solution
boriquee a 3 p. 100.
L'instillation simple se fait en laissant tomber, avec la
pointe d'une pipette effilee, une goutte d'emulsion micro-
bienne a la surface du globe oculaire, un aide tenant les
paupieres de l'animal ecartees. On attend quelques InS-
tants et on remet l'animal dans sa cage (Fig. IS,.

e) Voies digestives.
L'infeetion par les voies digestives est, a proprement
parler, Ia plus naturelle.
Sa technique consiste, so it a faire, dans la cavite buccale
ouverte, un simplebadigeonnage de Ia face interne des joues
avec un pinceau impregne de substance virulente, soit it
faire absorber les microbes en les introduisant directement
dans l'estOlpac au moyen dOune seringue et'd'une sonde
cesophagienne qui, pour Ie cobaye, est une sonde urethrale
de petit calibre, en gomme. Pour en;Ipecher que celle-ci
soit coupee par les incisives de l'animaI, on tient les
machoires convenabl~ment ecartces au moyen de deux
lacets plats et, la tete etant dirigee en hllut, on glisse dou-
cement Ie bee de la sonde Ie long du voile du palais. On est
sur d'avoir penetre dans l'cesophage si les mouvements res-
piratoires restent bien reguliers et soil ne se produit pas
d'efforts de toux.
On peut egalement administrer per os les ,emulsions
microbiennes, au moyel1 dOune pipette graduee .dont l'extre-
mite effilee est introduite dans Ja bouche de I'animal, contre
une des joues. vers la base de la langue. En ouvrant et
fermant Ia pipette, a l'aide du doigt pose sur son extremite
superieure, on fait couler Ie liquide lentement, goutte it
goutte. L'animal sera solidement maintenu, les pattes' et la
190 .EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX!
tete immobilisees, mais fa m€ichoire inferieure doit rester
libre pour faciliter la deglutition.
Quantites maxima a faire ingerer : () ceo 2 a 0 ce. 3 pour Ie
cobaye; 1 cc. pour le lapin. .
f) Voie reciale.
Pour eviter l'expulsion immediate des emulsions micro-
biennes injectees dans Ie rectum, il convient de porter cel-
les-ci aussi haut que possible (a 5 centimetres environ chez
les cobayes) avec une petite sonde tres fine et tres flexible
en caoutchouc rouge.
g) Voie vesicale.
On realise ee mode d'infection en introduisant sans vio-
lence dans l'urethre, jusqu'a une profondeur de 3 centime-
tres chez Ie cobaye, une petite sonde moUe de Gaillard du
modele Ie plus fin. La sonde doit avoir ete prealablement.
sterilisee par Ie formol, puis trempee dans de l'huile asep-
tique. On aUend I'ect'lulement de l'urine et on injecte, sous
Ie plus faible volume possible. l'emulsion microbienne.
h) Voie respiratoire.
L'infection par inhalation peut se realiser dans chacun
des segments de l'appareil respiratoire : nez, bouche, pha-
rynx, larynx, bronches, alveoles pulrnonaires. et il est tres
difficile, - on peut meme dire impossible, - de la locali-
ser dans l'un quelconqve de ces segments. IOn parvient
cependant a eviter les premiers (nez, bouche, pharynx,
larynx) en injectant directement, au moyen d'une seringue.
Ie virus dans la trachee, o~ en pulverisant l'emulsion micro-
bienne dans l'arbre br<;)llc~ique, apres tracheotomie.
L'inoculation intratracheale se fait en incisantla peau sur
la ligne mediane du cou, puis en denudant la trachee avec
une sonde cannelee. On pousse alors l'injection en enfon-
~ant l'aiguille de la seringue entre deux anneaux. Chez les
petits animaux, il est plus pratique de 'Passer un fil sous la
trachee et de l'attirer au dehors.
L'inhalation simple peut etre realisee en immobilisant
l'animal, cobaye ou lapin, sur une planche, de telle sorte
que sa fete penetre a travers la fente etroite d'une mem-
brane de caoutchouc ten due sur l'ouverture la plus
large d'une allonge en verre pourvue de deux tubulures.
 ANESTHESIE. - INFECTION. - PONCTIONS 191
Par l'une de celles .. ci, situee en f~ce de Ia tete, on fait pene-
trer, dans les conditions que l'on desire, les poussieres.infec-
hintes melangees a de l'air.comprime. L'exces d'air et de
poussieres est entraine au dehors par l'antre tubulure pIa-
cee en haut de I'allonge, apres avoir barbotte dans de
l'acide sulfurique contenu dans un flacon Iaveur.

i) Voie transcu(anee.
On rase ou on epile soigneusement (voir ce chapitre, B)
une etendue variahle de la partie superieure et posterieure
du cou, de teUe sorte que l'animal ne puisse se lecher,
et on etend l'emulsion microbienne, avec une spatule sterile
'Ou un tampon de coton sterile fixe it l'extremite d'une
baguette de verre, sur la surface fraichement rasee ou epilee.

j) Voie inlra-mammazre.
Chez Un cobaye femelle en lactation, on plonge l'aiguille
de la seringue dans Ie tissu glandulaire, it Ia base de la
mamelle.
Chez la vache ou la chcvre, on se sert d'un tube trayeur
ou d'nne sonde flexible en caoutchouc qu'on introduit dans
les canaux galactophores, de te11e sorte qu'avec une serin-
gue on puisse injecter directement la substance infectante
.dans les acini glandulaires.

k) Voie inlrauesiculaire ou intra-inteslinale, apres laparo-

lomie.
Chez Ie cobaye, et plus facilement chez Ie lapin, on peut
introduire directement Ie virus dans la vesicule biliaire
prealablement mise it nu, ou dans une anse intestinale. II
est alors essen tiel d'anesthesier completement l'animal (par
injecti\)n intraperitoneale de chloral-morphine, comme il
a ete uit plus haut dans ee meme chapitre, en C) avant de
.proceder a Ia Iaparotomie, afin d'eviter les efforts qui
entraineraient Ia propulsion des intestins hors de la ca,vite
abdominale.
L'animal etant attache sur un plateau, Ia region it operer
est rasee, puis aseptisee a l'alcool et a Ia teinture d'iode.
On incise d'abord les teguments, _puis la ligne blanche. On
deehire avec Ie bee d'une sonde eannelee Ie peritoine, et Ie
foie apparaiL On l'attire en bas et on Ie renverse de has en
192 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAU~

haut et d'arriere en avant: sa face posterieure (par rapport

(l. l'animal) est ainsi mise ajour (technique de VioUe).
En interppsal1t des tampons de ,gaze entre la coupole
diaphragmatique et.le fole, puis en bourrant l'espace inter-
mediaire entre Ie foie et les infestins, on « cale » Ia masse
hepatique: On passe, sous Ie col de la vesicule ainsi degage,
un fil de soie monte sur une aiguille de Reverdin et on
lie Ie canal choledogue.
A l'aide d'une seringue sterile de 5 cc. on ponctionne la
'vesictile it son pole libre, on aspire Ie contenu qui, dans
beaucoup de cas, est un'liquide cpais et visqueux. En
diluant ce liquide et en lavant la poche a plusieurs reprises
avec de l'eau physiologique jusqu'a ce qu'elle sorte complc-
tement incolore, on a un reservoir de 1/2 a 1 ce. 1/2 de
capacite, pret a recevoir l'emulsion microbienne.
Celle-ci est aspiree d;m~ une seconde seringue. L'aiguille
de la premiere etant toujours en place, on pousse I'injection
doucement. On passe un £II de soie comprenant dans sa
boucle l'ai.guille et la paroi vcsiculaire Iegerement SQulevee'
et tendue par une pince. Tout en degageant l'aiguil1e on
serre Ie fil, de telle sorte que, celle-ci etant completement
retiree, aucune goutte du liquide ne puisse sortir. Enfin, pour
plus de surete, on met une pointe 4_e feu sur l'orifice avec
t:lne tige de platine rougie a la flarnme. On enleve les tam-
pons, on suture la ligne blanche a l'aide cle trois o? quatre
points de catgut. Les teguments sont reuniJ ensuite par quel-
ques agra£es de Michel: On bildigeonne a la t~inture d'iode
la plaie suturee et on recouvre ~elle-ci d'un peu de collodion.
On opere de la meme maniere pour l'injection directe
dans une anse intestinale.

m) Voies intrapl(!urqle, intra-articlIlaire, etc.

On peut etre amene a varier les conditions d'infection en
s'adressant a d'autres modes d'inoculation exception nelle-
ment usites. C'est ainsi qu'il est parfois utile d'introduire
une emulsion de culture directement dans la cavite pleu-
rale ou dans une articulation. Le lieu d'election pour Ja
ponction de la pl~vre, effectuee avec l'aiguille Jibre ou mon-
te~ sur 1a seringue, est Ie 'fuatrieme espace intercostal dlJOit.
Les eavites articulaires s'atteignent facilemeht en 'plat;ant
Ie membre en extension forcee.
 ,
ANEStfll!§IE. ,___. INF'P.ctl0lV. - PO'lVC1'lONs 19Z

A"Vec' urt'pE!u d'exetclce, on aI'tive tres facilerttent a efroo-

taet, chez Ie ~<1baJe et l-e lapin', Iii pO'nction iIiftl1catdi§qae
sa'rts> que ees' aItitttaux err sdtiffrent. C' est un pf(1C'ede tr'e~
C'Ot'n'tttode poUr'se procurer, sal1s opet'ation S1iI1glanM et
sans' sacrifief les arlirnaox, du sang fntis, aseptique, soir
pM't' en separer' le serum pal' centrifugation imm~dittte et.:
o"l>ti!I1ir' airtsi de l'alexine fl'aichEl, soit pot'll' 1e i1lelarlg~'t a
divers miliertx de culfiIre (par' exetnple Ie rtiilieu de No(ffJ-
Nt!al-eh. Ni'cdllf!).
L'arritllal e,{grtt fille SUI' Ie dos, brert hdrizonta:lemeiH, dn
a~'eptise' ta te$iorl steI'nale p:lr un badigeonhage r(J& atpl'es>
nt'S"l1ge. C)i1 plollge d'un COl'lP brusque, et 1111 pen fYbliqu~t

Fig. 19. - Ponelion du emu.. du cobaye au lieu d"eleeti6rt.

mtfit de bag. en l1aut et d'a~a'nt en atrfere, dans l'tnt ails

ve'rttric'O.lesl du creur', ,la p~itrre dlutic aiguiUe dd'l1t Ie' prrvit·
Ion e~t libre. Si Ie sang sort aussitot par ceoJt~ei e'd s':r!X}t.
des, on y' a'd«PM r'apid~meltt Ie bee' d'ur1e'gei'ingtte' sterile-de
10 a 20 centimetres cubes et on ~s}lir'e' a~ee len.t~u1"le"san.s
jUS'CfQ'a'ce qud le' CD'rp-s de' pompa soit rempli, puis ml' Fettre
brusqU!ement l'aiguiUe.
Le meiUeUli' point de rcrpaire- poor 131 pO'l'l'c\ion ibtra.-
cardiaque est, chez le lapin, dans Ie 30 espace intercostaJ
lIICROBIOLOf,UE 13
194 EXPERIME!'lTATION SUR LES ANIMAUXJ

~auche, a 3 millimetres en dehors du bord du sternum:

l'aiguille plonge, it ce niveau, dans Ie ventricule droit.
Chez Ie cobaye, Ie lieu d'election se trouve sur Ie bord
gauche du sternum, de 8 a 10 millimetres au-dessusdu som-
met de l'angle forme par la base de l'appendice xyphoide
et Ie dernier cartilage costal articule avec Ie sternum. L'ai-
guilIe, - qui doit etre enfoncee a 15 ou 17 millimetres de
profondeur, - penHre ainsi au-dessus de l'avant-derniere
articulation chondro-sternale et va piquer Ie ventricule
gauche. Plus haut, elle atteintI'oreillette. Plus bas, elle tra-
verse Ie diaphragme et va piquer Ie foie.II faut incliner l'ai-
guille Iegerementen dedans vers Ia ligne mediane (Fig. 19).
Cette petite operation est tout a fait inofIensive lorsque la
quantite de sang prelevee ne depasse pas 10 centimetres
cubes pour les cobayes de 500 grammes et 25 a 30 centimetres
cubes pour les lapins adultes. Si I'on emploie des aiguilles
dont Ie biseau n'est pas' trop allonge ni trop coupant, on
peut la repMer plusieurs fois, a quelques jours d!intervalle,
chez les memes animaux, sans qu'il en resulte d'hemor-
ragie intra-pericardique.
F. - Ponction du foie, de la rate et des os \longs.
a) Ponclion du {oie. PROCEDE DONATIEN ET LESToQuAHn
de l'Institut Pasteur d'AIgcrie. - Point d'clection chez les
bovides : avant-dernier espace intercostal droit, sur la ligne
horizontale passant par repine iliaque. Riser la peau. Tou-
cher a la teinture d'iode. Percer la peau avec un bistouri
court. Enfoncer une grosse aiguille longue de douze centi-
metres environ, en avant, en dedans et en bas. Lorsqu'on
I'a retiree, chasser avec un mandrin la pulpe hepatique
qu'elle contient.
PROCEDE CHARLES NICOLLE (chap. XLII, B).
b) POllction de fa rate. Chez les ruminants, procede ana-
logue au precedent. Point d'election : avant-dernier espace
intercostal gauche.
Pour la ponction de la rate chez l'homme, voir Ie procede
de Charles Nicolle (chap. XLII, B).
c) P011ction des os 1011gS.- PO!lr Ie diagnostic de la 1eishma-
niose canine, par exemple: ponctionner 1'08 avec un foret de
Borrel, prelever de la moelle osseuse avec une seringue
sterile.
 ANESTlfESIE. - INFECTION. - PONCTIONS 195

G. - Autopsies animales.
,
Eiles doivent etre faites Ie plus tot possible apres la mort.
Avant tout examen, les' cadavres des animaux sont fixes
dans une immobilite aussi absolue, que possible.
Les souris sont placees ventre en l'air, sur une plaque de
liege a laquelle on les fixe par les pattes et par Ie museau, a
l'aide d'epillgles.
Les cobayes et les lapins sont attaches par les patte~ aux
bords des plateaux de zinc dont nous avons deja indiquc
les dimensions. Les poules et les pigeons sont maintenus
de la meme fa90n par Ie cou et les deux pnttes.
Les animaux une fois fixes, les poils des parois thoraci- •
que et ventrale ou. doit porter l'incision, sont coupes aux
ciseaux ou les plumes arrachees. Les poils ou les plumes
des regions voisines sont imbibes d'eau de falton ales ren-
dre adherents et a les empecher de s'envoler ou de se fixer
sur les instruments et les organes au cours de l'autopsie.
On explore alors les diverses parties du corps en obser-
vant specialement Ie point d'inoculation et ses alentours.
Puis on fait une incision cutanee mediane, du cou au
pubis, qu'on complete par quatre incisions laterales jus-
qu'aux membres. On detache alors lapeau des parties sous-
jacentes et on la rabat exterieurement.
La paroi musculaire du thorax et de l'abdomen etant
ainsi mise a nu, ouvrir Ie venLre avec des ciseaux, exami-
ner retat du peritoine et en recueillir tout de suite l'epan-
chement si cela est necessaire.
Apres Ie peritoine, to us les organes de la cavite abdomi-
nale (foie, rate, reins, capsules surrenalcs, intestins, vessie,
organes genitaux) doivent etre passes en revue. Noter l'etat
des ganglions mesenteriques.
LOautopsie de l"abdomen elant terminee, Ie thorax est
ouvert en sectio.nnant, de chaque cOte, la cage osseuse.
(Pour la poule, Ie lapin et les plus gros animaux, employer
Ie costotome.) On observe l'etat des plevres, des poumons,
du pericarde, des ganglions mCdiastinaux.
Pour prelever sterilement du sang du creur, on en saisit
l'extremite avec une pince, on brule sa paroi anterieure avec
une tige chaude ou avec une large spatule, on introduit par
19(1 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX!

Ie-meme point une pipette dans Ia cavite cardiaque et on

aspire doucemenHesang en donnant a la pipette un Ieger
m.ouvement de va et vient, puis on la retire.
Les prelevements dans Ie foie, la rate, 113 rein, etc., sont
faits de la mfune fa90n.·Pour prelever Ia moelte 0sseuse.
sectionner un os long transversalement, cauteriser l'unede&
surfaces de section, introduire dans Ie canal medullaire
¥extremite d'une pipette sterilisee et aspirer.
Pour les prelevements des centres ner-veux, voir Rage.
(chap. XL, A).
L'autopsie terminee, on detruira les cadavres par UI1' des
procedes ci-apres et on sterilisera les pl-ateaux qui les. oot'
contenus, soit en les portant a l'autDcIave a 120<>, sDit eales.
immergeant pendant nne heure dans nne solution cresylee
a 5 gour 100.

H. Technique pour l'enfouissement et pour

l'incineration, sans f.our cremetoire, des cadavres-
d'animaux d'experiences.

a) L'enfouissement des cadavres des petits anima-wI: d'ex-

periences dDit tDujDurs etre effectue a.vec les precautions.
suivantes : .on creuse dans Ie sol un trou de dimensions
convenables, a 0 m. 50 de profondeur au m9ins, et on en'
garnit Ie fond d'un lit de chaux vive de 0 m. 02 d'epaisseur
environ. Sur ce lit, .on dispDse les cadavres (qu'on aura pu
accumuler depuis quelques jours dans une poubelle metal-
lique fermee, remplie de solutiDn de cresyI'a 5 p.l00), et .on'
'les,recouvre d'une nDuvelle quantite de chaux vive, puis de
t-erre meuble.
La quantite de chaux vive a emplDyer est, au tofal,
1 kilogramme par 10 kilogrammes de cadavres,
S'il s'agit de cadavres d'animaux morts' de maladies tres
contagieuses (peste, charbon, etc.), il est indique de melan-
gel' a la chaux vive envirDn 10 p. 10c) de chlorure de chaux
sec du commerce.

b) On pratique tres commodement l'incineranon· des

cadavres d'animauX' d/experiences, PaFtDut au ron,. ne dis-
pose pas d'un four crematoire, en creusant dans Ie sol une
 A'NESTH-ESIE. ..._ INFECTYON. - P(}NCTUlNS 197

c.aJ/lte rectan'galaire.a bords .evases, au fond de laquelle on

Mend Ulle rouche de branchages aU-5si sees que possible, ou
de copeaux de bois, sur 15 a 20 centimetres d'epaisseur, et
de telle sorte que l'air ait un facile acces sous ce petit
bucher. Sur ce lit combustible on etale les cadavres. On les
arrose ensuite. d'abord d'une petite -quantite de goudron (300
grammes environ pour 10 ki~ogrammes de cadavres), puis
de 20 centilitres environ de pctroIe, et on enflamme. La
combustion est rapide et totale.

1. - Tempchatures normales des animaux

d'experiences.

Les oscillations de temperature autour de Ia moyenne

normale obeissent a un rythme variable pour chaque espece
et meme pour ehaque animal. D'ou la necessite d'etabIir
ees variations avant chaque experience.
La temperature rectalc moycnne pour les di vers animaux
est, d'apres Gh. Richel :
Mammiferes. Pore.
Boouf. .
Cobaye. 39 0 2 Cheval. •
Lapin . . 39 0 5
Chien • . 39 0 2 Oisea'ux.
Singe. • 38 0 3
Chat. 38 0 8 Poules et pigeons.
Mouton. 38 0 6 Canards. . • .

J. - Poids moyen des cobayes sux divers ages.

A In naissance, poids moyen .• 74 gr.

1 e< jour » •. 72 gr.
5· » » 98 gr.
10· 137 gr.
15 e » 173 gr.
20· » 196 gr.
25· » 221 gr.
1 mois 240-250 gr.
2 » 350·400 gr.
3 " » 450-500 gr.
4 » 550·600 gr.
"
6 » » 650-700 gr.

Les cobayes uniquement nourns du lait de Ia mere ne

198 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAU~

tardent pas it mourir. Les cobayes non allaites Se deve-

loppent moins hien pendant Ie ler mois. II leur faut done
un regime mixte.

K. - Rapport du sang au poids du corps chez

diverses especes anlmales.
Bovides. 1 p. 30
Solipedes. 1 p. 18
Mouton. 1 p. 24,5
Chien. 1 p. 18
Chat . • 1 p. 35
Oiseaux. 1 p. 29
Rat. • 1 p. 29
Cobaye. 1 p. '30
Lapin .. 1 p. 31,5
 CHAPITRE XV
MBTH_ODES DE CULTURE IN VIVO
(ProeM!} des sacs de collodion ou de moelle de roseau.)

A. - Preparation des sacs de collodion pour

cultures in vivo.
La meilleure techniqhe pour preparer les sacs de collo-
dion consiste a utiliser comme moules soit, comme l'a fait
Maurice Nicolle, des cylindres en sucre candi fondu, bien
secs et lisses. auxquels il est facile de donner les formes et
les dimensions les plus variables, soit des .tubes a essai ou
des tubes fermes en cul-de-sac a l'une de leurs extremites,
puis perfores de dehors en tiedans, au milieu de cette extre-
mite, d'uD. senl orifice de 1 a 2 millimetres de diametre.
On bouche ce trou du verre avec une solution epaisse de
gelatine. On laisse secher a l'etuve a 37°.
Lorsque la gelatine est bien seche, on plonge Ie tube dans
un bain de collodion, en evitant avec soin de faire des bulles
d'air, on Ie retire aussitot pour l'egoutter et on lui imprime
un mouvement de rotation trflnsversale entre les doigts,
pour que l'evaporation de l'ether s'effectue rapidement et
regulierement.
Des que Ie ,collodion est sec, on plonge Ie tube dans de
l'eau tiede, a 40 0 environ, et on en remplit l'interieur. L'eau
dissout peu a peu la gelatine et on attend que Ie sac de collo-
dion apparaisse libre a·la surface du verre. En souillant
lege-rement par l'extremite ouverte du tube, on Ie de)TIouie
avec Ia plus grande facilite.
II ne reste plus qu'a fixer Ie sac sur un support forme, par
exemple, d'un tube-de verre de meme diametre, etrangle et
pouvant etre sceBe au obture par un bouchon, avec une
couche de collodion appliquee a sec, au pinceau, au' avec
une ligature au fil de lin au de soie. On Ie sterilise ensuite
dans un tube a essai oontenant un peu d'eau.
200 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAU1G

ProcedtJ d'Auguste Lumiere el Jean Chevrolier :

Pour eviter les ruptures qui se produisent au moment du
decollementdu sac, ces auteurs ont modele. au moyen d'une
pate plastique, consistante et soluble dans l'eau, de petits
mouies ayant laforme,etle~ gimens,ions quel'ondesire don-
ner aux sacs. Le melange est constitue par 1 partie de sirop
de glucose I'),t 2 pa,r~ie~ de ,5\lc,re en pop.prtl dii!<.sucre glace ».
La manipulati,on et Ie modelage de ces moules doivent
s'effectueravee ~es «!oigts, legerement impregnes d'eall, ou
des instruments mouilles, pour eviter l'adherence de la pate
aux m#/M d.~ J'.op~.rat~J1r o,lJ. au/{ .outj,ls 4.e mQ~lage,
Ces mouies sont fixes _a r~x!r~mjte d'agitateurs en verre
ou de tiges "metalliques et immerges dans un collodion a
1 p .. 1QO q,epjtTJ;l-~HlJ)P.se. O)J. impriw.e a la.1i,ge dtl soutien
I1n ll1Plwt m?nt i).~ r.otatipn pOUT rep.~r#r 1,Illj,£orm.eAJent Ia
Fm:j.C)t~ d~ c,q]}R•.diQn ; .on )a~~e :;~.cher, puj!;> ,:)n :;usp,end Je
q.i.spp~i#f ainl>~ prepare #. If! p.arti~ sJlP~ritlp..re d'up recipient
reIppU d'e.a\l
~ liqp.iqp trfJ.?l~rsf;! l'jepv.e!oppe pf;!rm.eable. cJiS!i9ut la
1J1.l}~s.e ~pW'e,e e~, U\l bQ»tq,e 2 h.eur,es f»v~ron, le§ac ~e tr.ouye
lib~r~.
L'orip<;e ap ~es s:).~s pel)t etr.e ,tres pt:t)t, per,mettre ~eule­
ment Ie passage d'une a,iguilltl creus,e. de 'sQrttl q\le wur
qFplu.:j>~RP est .ai~e1Ptlnt realise#! pt l~\1r ~t.an.cheit~ pent etre
.a)?~\1r~ef

B. - PreparatIon du ~oUl>dioJ1 pour dillques

et sacs dialyseurs.

Pour uq litre:
.caton azotiqup (bien echarde, .sal)s gru-
. rneaux ni }lrnas). . . . • . • . . 40 gr.
~lC9P) aRsoh,l, . . • . • . . . . , 3J)0~,

Laisser tremper au minimum 24 hellrps, aait!)r pe temp:;

1:;,..,. temp:i. 4jout~r;
Efber. . . . . , . . . . . . . • ~oo CI!.

La .dis&pluti(m s~ fait ell une dpmi-n.eure envirop. R~l}nj.er

IlY~C une bag}lett~ 4e vel're. AjQJlte r :
Glycerine
. , 3 3.{)0 -a~. , .
, , ...,~ .
 METHODES DE CULTV.J(8 IN ¥IVI) .201

~gile,r ay.e.c W}.e baguette.. P<m.r hien m.eltloger. Comple1e.r

~n ;ljoutant :
Alcool absolu. . . • , . . . , . . 4ll0~.

Laisser ensui~e m.urir 8 jours.

Les ,Pro,P.ortjons ci-dessl,ls so~t les plus favor.ables p.our les
membranes Ires pernuEables.
Pour diminuer la permeabilite, on augmente la quantite
d'ether jusqu'a 800 centimetres cubes d'ether pour 200
d'alcool.
Pour avoir des membranes minces, on peut rcduire jus-
gu'a 20 grammes ia quantHe de coton azotique par litre.
La permeabilite des membranes est en raison directe de
Ia quantite d'alcool et t;n raison inverse deJa quantite d'ether
que renferme i.e collodion.

C. - Sacs .de collodion 'filtrants de L. Michel.

L. Michel aPIlPl'eparl3r des sacsdecollodiop susceptihI.es

de resister a une pression interieure de 20 a 30 centim.etrel>
de mercqr.e.et de se,rvir a l'ultra-filtrfltio,l). microscopiqu.e.
On emploie a cet eifet un collodion obtenu en disilolvant
2 gr. 5 de coton azotique dans 100 centimetres cubes d'un
melange a parties egales d'ether a 66 0 et d'acide acetique
cristallisable.
Les toxines microbiennes ne sont pas retenues par ces
membranes, tandis qu 'elles Ie sont en partie ou en totalite
par les bougies Chamberland et Berkefeld.

D. - Denitrification des sacs de collodion.

On peut, comme 1'0nt montre J. Duclaux et A. Hamelin,

denitrer les sacs en collodion et les rendre ainsi plus com-
modement sterilisables par la chaleu.r sans trop diminuer
leurpermeabilite, au moyen du sulfhydrate d'ammoniaque
du commerce Hendu de 4 volumes d'eau et tiedi a 40 0 • On
remplit Ie man chon filtrant de ceUe solution tiede et on Ie
plonge dans un tube contenant Ia meme substance, de teIle
sorte que la denitrification se fasse simultanement sur les
4e~x faces. L'operation est achevee en une demi-heure. On
 202 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUXJ

rince ensuite Ie filtre avec de l'eau ammoniacale (pour em-

pecher Ie depOt de sOl1fre qui pourrait se produire par oxy·
dation), puis avec de I'eau distUIee.
Les filtres ainsi denitres ne sont pas modifies par l'ebulli-
tion. lIs peuvent et~e sterilises a l'autoclave et conserves
sees. Des qu'on Ies plonge dans I'eau, ils redeviennent ins-
tantanement permeables.

E. - Sacs en moelle de roseau.

Au lieu d'employer Ie collodion pour Ia preparation des
'sacs dialyseurs, on peut utiliser parfois tres commodement,
comme l'a propose MetchnikofJ, les tubes de moelle de
roseau commun (Phragmites communis), qu'on ferme a leurs
extremites avec un fil impregne de gomme-Iaque. Ces tubes
,de cellulose presque pure peuvent etre sterilises a l'auto-
clave aussi facilement que les sacs de collodion. '
Ils sont plus resistants, plus minces et plus souples, par
suite souvent preferables pour les inclusions intra peri to-
neales.
Ils ont servi, en particulier, a Ia culture in vivo du microbe
de Ia peripneumonie.
 CHAPITRE" XVI

LIQUIDES" PHYSIOLOGIQUES ET LIQUJDES

CONSERV;ATEURS DES PIECES ANATOMIQUES

A. - Liquides physiologiques (employes pour Ie lavage

et la conservation des organes frais) :

1 0 Liqllide de Ringer·Locke :
Eau distillee. .. . . . 1 litre
NaCI. . " . . . . • 8 gr.
Chlorure de potassium. . 0 gr. 2
Chlorure de calcium. . 0 gr. 2
Glucose pure. ", . . . 1 gr.
Steriliser a froid par filtration au Chamberland.
2 0 Solation trichlorllree de Carrel:
Chlorure de sodium. . 9 gr.
Chlurure de calcium .• o gr. 25
Chlorure de potassium. o gr. 42
Eau distillee. . . . 1.000 gr.
3 0 Eall sa/ee physiologique (serum artificiel simple).
NaCI pur. • • . . . • . • • . . 8 gr. 1
Eat!. distilJee. .. ..
. . . . . ~. . 1.000 cc.
Steriliser a 120 0 a l'autoclave, 20 minutes.

4 0 Semm saM et SllCre (Ch. Richel).

NaC!. . . . . . 7 gr.
Lactose ou glucose. . . . . . . .- 5 gr.
Eau distiIli:e. . • 1.000 cc.

50 Eall de mer arlificielle CE. Perrier).

Cblorure de sodium. . . 18 gr.
Chlorure de magnesium. 11 »
Chlorure de potassium. 3 »
Sulfate de magnesium. • 5 »
Sulfate de calcium. • . 3 »
Eau. ., •.... 3.000 cc.

Steriliser a froid par filtration au Chamberland.

204 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX>

6 0 Serum de Trunecelc (hypertonique, medicamenteux).

Sulfate de soude. . o gr. 44
'Chlorure de sodium. 4 gr. 92
Phosphate de soude. o gr. 15
Carbonate de soude. o gr. 21
Sulfate de potasse .. o gr. 40
Eau distillee.. • . 100 cc.
St6riliser a l'autoclave a 115 0 , 20 minutes.
7 $erafl1. artificiel de Hayem.
0

Chlorure de sodium pur. . 5 gr.

Sulfate de soude. . . . . 10 gr.
Eau distillee. • . . . . 1.000 re.
Filtrer et ~teriliser it rauto.clave.
8 Liql1ide physiologiql1e de DeIbel.
0

Chlorure de magnesium. . . . . 12 gr.

Eau distillee.. . . . . . . . . 1.000 cc.
9 0 Vernis de Carrelpollr Ie pansement des greffescutanees.
ParalIine fusible a 52 0 • 189 gr.
Paraffine fusible a 40 0 • 6 gr.
Cire blanche. • • . 2 gr.
Hulle de ricin. . . . 1 gr.

B. - Liquides .conservateurs des pieces

anatomiques.
a) Liquides de !{ayserling, modifies par Be1l1er (pour les
pieces frlliches) :
10 Jer bain. Immerger allssjt6t que possible In piece et l'y
noyer tout entiere en s'assurant qu'eHe est 'bien couverte
d'ouate hydrophile:
Azolate de potas~e. 45 gr.
Acetate de· potasse. 90 gr.
Eau. . •.•. 3.000 cc.
Formol. • . • . 600 (l.C.

Sejour 1 a 3 jours suivant volume, retirer, laver rapide-

ment it l'eau et plonger dans:
2 0 Alcool it 90 0 , 3 ou 4 fois Ie volume. de Ia piece.
Sejour 1 a3 jours, suivant voIume,puis passage direct dans:
3 0 Liquide conservateur :
(a) E{lu distilIee. . • '. 1,000 ce.
Glyc,:;rine pure.". . 1.000 cc.
Alcool a 90 0
• 250 cc.
Acetate de potllsse. 250 ce.
 ./
LIQUlDES PliYSIOLOGIQUES ET CONSERVATEURS 20'&

Lorsque la piece ~ des coute1l'l's ~res delic:rles qu' on desire

bien conserver, a'll lieu de 3 0 (a) 0l1' les immerge dans 3 0
(b) 7
(b) 6l'yc6rine. 0 0 • 0 1.600 ee.
Eau distillee. 800 CCo
A':cetate de potasse. 800 gr.
,
Enfin. si l'on desire garder la piece dans un liquide qui
I?ermettl'a d'y pratiquer ulterieurement des coupes micros-
copiques parfaites et colOJ;ables, on les immerge dans 30
(c)
(c). Aleoal. it 95 0 • • • 2.6000 ce.
Eau distillee. . 4.000 ce.
Glycerine.. . . • 80d ce.
A.cetilte de' potllsse. 40() gr:-.
Mai's ce d'epn,ier liquide conserve malles couteurs.
b) Liquides de J. Binot (Institut Pasteu~).
10 Ac~tale de soude fondu .. 40 gr.
Cblorate de potnsse. 5 gr.
Azotate de potasse. 100u 20 gr.
Formol it 40 %. 0 100 ce.
Eau. • ..•. 1.000,ce.
plus:
ou bien: Sulfale de· soude et azotate de
potusse.. , . . . . . , . . . 20 it 30 gl·.
ou bien : Sulfate de soudel senr. . •0 2U it 30 gr.
Les Rieces sont imm'ergees dans Ie liquide et recouvertes
d'ouate hydrophiie.
Agi'ter de temps en temps Ie liquide.
11 est necessaire de sttpprimer dans- la piece hmt ce qui
It'esb pas utile a conserver; en p::!rtieulier, de vider
les'intestins si possible (i,isrepandent ulterieUFement, dans
Ies liq.uides, des, matieres cO'lorantes genantes): :Be merne
pour la -vesicule biliaire.
Si la piece est volumineuse, on injectera ce memeli'luidc
da-ns Ie systeme vascnlaire.
L,a duree de l'immersion est un tempg;deiicm. II £'aut qoe'
la piece soit compfetement penetree, mais· qu' eUe reste aus:si
pen que possible dans Ie bain, sans quoi, 13. cOllleuJ.1 D6
reviendrait pas bien.
De toutes petites pieces"'Seront laissees immergees qu_el-
ques heures. Un rat par ex:emple. 24 ou 18 heures. Enfin, de
206 EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUXJ

plus grosses pieces,48 heures ou 3 jours, mais il ne faut

guere de passer cette duree. (La piece se dec%re dans 10.)
2 0 La piece est egouttee, puis immergee dans l'aIcool a'
90 0 ou elle reprend sa couleur. A cet alcool on ajoute :
Acetate de soude fondu.. . . . . . 20 gr.
Sulfate de soude. . • • . • . . . 20 au 10 gr.

par litre.
(Mieux vaut cependant commencer par l'alcool a 60 0 , puis
alcool a 90 0 .)
Duree de l'immersion dans Ie ou les aIcooIs : a peu pres
Ia meme que dans 10. Cependant, tant que Ia cou]eur aug-
mente en intensite, on peut, en suryeillant, y laisser la piece
plus longtemps. Par contre,. - et c'est important, - si
la picce baisse de couleur, arreter, bien egoutter et plonger
sans laver .dans: .
i:!0 Liquide difinili(:
Acetate de potasse .. " . 150 gr.
Glycerine neutre. . 250- ce.
Formol it 40 ,,/... . 2 a if cc.
Eau. . ...• I :000 cc.

Les pieces sont definitivement conservees dans ce liquide

Oll Ie' formal a pour elfet d'empeche.r les contaminations
par les moisisst\res, en particulier,
Si la piece ~eut etre recoupee, on ffra une coupe
fraiche, car la surface :est toujours plus decoloree. 11 suffit
d'enlever 2 ou 3 millimetres avec un couteau a c'erveau,
Remarques sur 10 :
Le chlorate de potasse avive Ia conleur, mais tend a
ternides pieces. Ppur les muscles, en particulier, on pent
en diminuer la dos~ ou mieux Ie supprimer.
Pour les visceres, et principalement pour Ie foie, on ajoute
it la solution 1 0 , telle queUe, 2 gr. 50 a 10 grammes d'eau
oxygenee fraiche.
Pour Ie foieon se trouve hien d'ajouter, par litre, 10 a 20
grammes d'hydroqllinone prealablement dissoute dans un'
peu d'eau chaude (bocal plein et aussitot ferme, poureviter
une rapide reduction).
c) Methode de Sheridan Deiepine,
Particulierement recommandabIe pour conserver les
LIQUIDES PHYSIOLOGIQUES ET CONsERVATEURS 207

pieces entieres coupees en tranches de 1 a 2 centimetres

d'epaisseur, avec leurs couleurs.
On commence par fixer les pieces en les laissant immer-
gees pendant ~ jours a 2 semaines (scIon leur epaisseur)
dans la, solution suivante :
Formol (sol. commercinle it 40 ·/0). 100 cc.
Enu . . . . . . . . . . . . . 900 cc.
Sulfate de soude. • . . . . • . 20 go'.

On porte en suite pendant quelques hellres dans un bain

d'alcool a 90 0 , jusqu'ace que la teinte initialesoit recuperee.
Puis on immerge pendant au moins 2jours (il n'y a aucun
inconvenient a prolanger davantage, jusqu'a 2 ou 3 semai-
nes) dans:
Solution d'acide arsenieux (sat. it l'ebullition
et prepnree depuis nu moins 12 heures). . 400 cc.
Glycerine pure.. . • . . . . . . • 600 cc.

On prepare finalement une gelatine glyeerinee, arsenicale

en faisant sepa!;,cment les deux solution.s suivantes :
1) Gelntine Coignet (etiquette doree). • . . 425 gr.
Solution saturee it chaud d'acide nrsenieux. 1,500 gr.

On fait dissoudre la gelatine dans la solution chaude d'acide

arscnieux.
2) Solution 1. . . . . . . . . . 1 925 cc.
Glycerine pure. chaude.. . . . . 5.760 cc.

Les deux solutiQns s.ont melangees, puis refroidi~s aux

environs de 20 0 • On y verse alors, en agitant fortement avec
nne baguette en verre, 6 blanes d'reufs battns et leurs .co-
qui lIes broyees a part. On reporte sur Ie feu et on chauffe
jusqu'au voisinage du point d'ebullition pour eoaguler l'al-
bumine et on maintient a la temperature d'environ tOOopen-
dant 2 heures. Le liqllide chand est filtre a travers une fla-
nelle, puis surun papier Chardin •.a l'interieur d'un autoclave
dans lequel on entretient une temperature d'environ 50 0 •
CeUe filtration est assez longue.
Le milieu ainsi prepare est parfaitement transparent.
On en remplit Ie vase dans lequel on a dispose la piece ef
on obture Ie bouchon avec de la colle adhesive an caout-
chouc (voir chapitrevll, 10 ) qu'on recouvre d'une bande de
papier d'etain.
Ce procede de Sheridan Delepine derive de celui propose
 ,
20& EXPERIMENTAT!ON SUR l.:ftS ANIMAUX

ell:' 189& par Nicolas pour rirtcfusi6n des pteparatiarts alfa-

tomiques, lequel consiste a: irt1m~I'ger r~s pMces, d'~.Botd
pertdimt 2'4· a 4'~ heureS' dans uM soPution aqueuse dt! gelk-
tine a 4p. 100, maiI1tenuea25o, puis, pendantle II1eItte temps.
dans une solution it 10 p. 100, et finalernent da~s une solu-
tion it 2() on 25 p. 100 additionnee de 8 it 10 p. 1{)0 de glyce-
rine et maintenue it 35 0 • A pres 48 heures on laisse refroidir
clans un moule et on conserve la piece dans du formol it 10
[I. 120' d'eau distillee.

c. - ~evivification des aouleurs par la methode

de Fornario pour les petites pieces anatomiques
conservees depuis longtemps dans Ie formol.

Ces piece'S reprennent une couleur vive en les traitant

camme suit:
Bain de 48 heures dans une solution de formol it 4 p.l00.
Bain de 24 heures (au plus) dans l'alcool it 90 0 (douze
heures seulement pour les organes de petits animaux ou les
fragments d'organj:.\s).
Reporter l'a pi(!ce dans I'aIcool it 900, neuf (3 on 4 lois Ie
volume de la piece), auquelon ajoute, goutte it goutte, une
quantite vatrable de la solution suivante (pas plus de 10 cen-
timetres cubes par litre) :
Acide' pierique (sol. aq. slI.turee·).. • lOa cc.
Acid~ acetiq).le glacial. • . . . . 4 cc.

ta couleur reapparalt en quelques minutes. Laisser les

PIe'Ce's' darrs'cette soliftion.pendant quelques jours-, puis les
reporter dans l'al'cool a 90 0 • La coulenr ne s'y modifie plus.
Orr pent avnntageusement aj,outer a I'a solution picrd-llcc'-
tique nne tres petite quantire d'hemoglobi.ne.

D. - Conservation des cada'Vr'eS' de's petits anlimau,,"

entie'lfS' 00 '(1uver.1fS', ow de' grt>slS'eSl1iece'S aR'atomique'S.

a.) Mi-xlure de Goadby:. Dans 10 lrtres d.'eau, on ajoute' Ies

doses S'l.i1.vantes de :
Sel de cuisine. . . 1.250 '~r'.
Aiun. ordinahe.. . v 60 gr.
Bichlorure de mercure. 2 gr.
LIQUIDES PHYSIOLOGIQUES ET CONSERVATEURS 209

On peut rem placer lebichlorure de mercure par 1 gramme

d'acide arsenieux ; on supprime ulors I'alun.
!h) Liquide de Miiller.
Bichromate de potasse. 20 gr.
Sulfate de soude. . . 10 gr.
Eau distillee. 1.000 cc.

c) Preparation desyieces anatomiquesvolumineuses deslinees

a eire conserVlies ulterieurement a Niai
sec.
Le liquide d'impregnation se prepare comme suit:
Eau. . .•.. 18 litres.
Alun . • . . . . 600 gr.
Nne!. . . . . . 150 gr.
Nitrate de potnsse .• 72 gr.
Potasse. . . . . 360 gr.
Acide nrsenieux. 60 gr.

Faire bouillir jusqu'a dissolution complete, fiItrer .it

froid, puis ajouter :
Glycerine . . . 8 litre •.
Alcool a 95 0 • • 2 litres.

Conserver en bonbonnes. Vne grosse piece (comme une

tete entiere) doit etre immergee pendant 15 jours dans ce
liquide. Vne piec~ moyenne, de 5 a 8 jours, On l'egoutte
ensuite et on peut la conserver a I'etut sec, a I'abri des pous~
sieres, sous vitrine par exemple.

E. - Injections intravasculaires de nlatieres

solidiiiables:
Blell de PrusseglHaiine. Solution aqueuse saturee de bIeu,
additionnee d'une solution a 4 p. 100 de gelatine fondue,
tiede. On filtre a travers une flanelle au moment de l'usage.
Carmin gelatine. Solution de carmin dans I'ammoniaque,
a saturation. Pour bien colorer. on en verse une quantite
con venable dans une solution un peu plus concentree
(a 6 ou 8 p. 100) de gelatine fondue, tiede. On filtre a tra-
vers nne flaneIIe au moment de l'nsage, apres avoil' pris soin
de nentraliser I'exces d'ammoniaque par addition de quel-
ques gouttes d'acide acetique. Mais il faut qu'il reste encore
un peu d'ammoniaque libre, sans quoi Ie carmin se pl'eci-
piterait.
MICROBIOLOGIE 14;
 TROISIEME PARTIE

MICROBES DE L'EAU, DE VAIR

ET DU SOL

CHAPITRE .xVII

ANALYSE ET PURIF1C4TION DES EAUX, POT.tl.BLES

A. ~ Attttly!e. ~ Prelevert'lE!nt des ecl'il1f1ti1loM

degtinc;g aUK analyses:

2 flacons de 150 centimetres (lubes chacun t>our 1'unalyse

ba~teriologiqlle (flacons prenlaDlemellt sterilises et cnve-
JDppM de pilpjer steJ'j]e),
1 touria de 10 litr~s pour I'analyse c!himiquc complete
pat un lab6ratoire special de chimie analytique.
(Tottrie bi~n propre, lavee a l'cau acidnlee, puis rincM a
I'Mu bouillie plusieurs fois et fermce avec un b()uchon
neuf bietl ctanchf!) j I "

Ou bien d0UX litre!! pour analyse' chimique partielle

(analyse sattitaire), faite au laboratoite de microbiologie.
PO\lr l'analyse bacMriologique, transport aussi rapide
qUE! possible des fl::tccms dans une caisse farmant a clef, gar-
nie de sciure de bois et de glace concassee en meum; m'or-
ceaux. Les eehantillons doillent rester dans la glate jllsql1'au
{IUJmellrde 1'I1nalyse pour eviler la multiplication des germes
ttlicT'tJbien~ •
Lorsqu'il s'agit d'nne captation nouvelle d'eau destinee a
l'alirt'lerttatiOrt; l' envoi des echantillons devra toujours ~tre
tlceompagne d'Ul1e fiche de renseignemenfs d'ordre geolo-
giqrte et geographiquo, indiqu:1nt le mode de captage, la
nature du sol et du sous-sol, la nature et I'etendue pro-
bable du pl!tim~tre d'alimentation de la source ou de la
212 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU SOL

nappe aquifere envisagee, Ia situation du captage par rap-

port aux habitations, aux cimetieres, aux depOts de fumiers
ou d'immondices, aux Iavoirs publics ou prives, aux puits
perdus, etc., qui peuvent se trouver dans .le voisinage plus
ou moins immediat.

B. - Analyse chimique.
Elle doit porter, au point de vue sanitaire, sur la recher-
che et Ie dosage de la matiere organique, de l'ammoniaquc,
des nitrites, des chlorures et sur la determination du degr~
hydrotimetrique '(total et permanent). Les methodes indi-
quees ci-apres sont celles adoptees par Ie laboratoire du
Conseil superieur d'hygicne publique de France.

1 Evaluation de La matiere organique par Ie per-

0

manganate de potassium. - Certaines matieres orga-

niques enlevent plus d'oxygene au permanganate en solu-
tion acide qu'en. solution alcaline. Le sucre cristallise, Ie
glucose, la dextrine, l'acide tartrique, l'acide' oxaliql1e,Jes
macerations de substances vegetales en absorbent davan-
tage en solution acide. L'urine, les matieres fecales, les pro-
duits de putrefaction des alburriinoides en absorbent au
contraire davantage en solution alcaUne. L'albumine non
desintegree et l'uree n'ont que peu d'action. LI'! proc.ede
dont il s'agit ne fournit done que des indical\ions compara-
tives et non des chiffres exacts. Quandon dit qu'une eauren-
ferme x milligrammes de matieres organiques par litre, cela
s~gnifie qU,e l'ensemble des matieres organiques d'origines
diverses, contenues dans un litre de cette eau, est exprime
par x milligrammes d'oxygene emprunte au pertnanganate
soit en solution acide, soil en solution alcaUne.
La reaction est basee sur les donnees suivantes :
1 gramme de permanganate de potassium peut fournir
o gr. 253d'oxygene capabled'oxyder, par exemple, 1 gr. 994
d'acide oxalique cristallise.
Pra,tiquement on emploie une solution a 0 gr. 5 de per-
manganate par litre. 1 centimetre cube de cette solution
correspond a 0 gr. 125 d'oxygene et a 0 gr. 997 d:acide
oxalique cristallise, pur.
On introduit respectivement 100 et 50 centimetres cubes
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAU~ POTABLES 213

de l'eau a essayer dans deux floles coniques d'Erlenmayer.

On ajoute 10 centimetres cubes d'acide sulfurique au
quart dans la preIIJ.iere fiole et 5 centimetres cubes dans la
seconde.
On introduit, d'autre part, respectivement 100 et 50 cen-
timetres cubes de la meme eau a essayer dans deux fioles
coniques. On les alcalinise, la premiere par 10 centimetres
cubes, la seconde par 5 centimetres cubes d'une solution
saturee de bicarbonate de soude.
On verse dans chacune des 4 fioles exactement 10 centi-
metres cubes de la solution de permanganate de potassium
a 0,5 p. l. 000.
Les 4 fioles sont alors portees doucement a l'ebullition
pendant 10 minutes. On laisse refroidir. Les deux epreuves
alcalines sont .rendues acides, en vue du titrage, par 20 cen-
timetres cubes et 10 centimetres cubes d'acide sulfurique
dilue volume a volume.
Chaqile epreuve cst alors successivement additionnee
exactement de 10 centimetres cubes de sulfate ferreux.am-
+
moniacal (solution a lOgrammes par litre 10 grammes d'a-
cide sulfurique).
On revient immediatement a la teinte rose faible en lais-
sant tomber du permanganate a 0 gr. 5 p. 1000 contenu dans
une burette graduee.
La' difference volumetrique de permanganate trou,:ce
entre une epreuve. de 100 cc. et celle de 50 centimetres
cubes qui lui correspond, represente I'oxygene consomme
par la matiere organique dans 50 centimetres cubes d'eau.
On exprime les resultats en ox.ygene et en acide oxalique par
litre. Toute cau qui consomme plus de 2 a 3 milligrammes
d'oxygene par litre doit etre cansideree camme suspecte .
•
20 Azote ammoniacal. - La seule presence de l'ammo-
niaque dans I'eau est Ie plus souvent suffisante pour faire
rejeter celle-ci de la consommation. On la :recherchera done
simplement avec Ie reactif de Nessler.

AMMONIAQUE. REACTIF DE NESSLER POUR LA RECHER-

CHE DE L' AMMONIAQUE. - Dissoudre 5 grammes
d'iodure de potassium dans 5 grammes d'eau distilIee
chaude. Ajouter une solution chaude concentree de bi-
214 MICROBES DB L'EAU, DE L'AIR ET DU saL

chlorure de mercure jusqu'a ce que Ie precipite rouge

qui se forme cesse de se dissoudre par agitation. Filtrer.
Ajouter une solution de 15 grammes d'~ydrate de potasse
dans 30 grammes d'eau distillee et diluer a 100 centimetres
cubes par addition d'eau distillee. Ajouter encore 0 ·ce. 5
de la solution de bichlorure dt( mercure. Laisser repo'Ser.
Decanter soigneusement et verser Ie liquide dans un flacon
bouche a l'emeri.
Quelques gouttes de ce reactif donnent une coloration
jaune ou jaune rougeatre dans les eaux qui contiennent de
I' ammoniaque.
On acidule au moyen de 5 a 6 gouttes d'aeide sulfurique
par 250 centimetres cubes d'eau a essayer. On can centre a
environ 30 centimetres cubes en chauffant a l'ebullition
dans une fiole a fond plat. On laisse refroidir. Certaines
eaux donnent un depOt cristaIIise de sulfate de chaux.
On alcalinise a I'aide de potasse caustique pure: il se
forme souvent un pnicipite de chaux e. de magnesie qu'il
n'est pas necessaire de separer. On ajoute 2 centimetres
cubes du reactif de Nessler qui praduit un precipiM ou
une coloration jaune bruno d'autant plus foncee qu'il y a une
quantite d'ammoniaque plus grande. Dans les eaux calcai-
res et magnesiennes, il se forme un preejpire blanc lorsqu'il
n'y a pas d'ammoniaque, et colore par l'entrainement du
sel de mercure-ammonium lorsqu'il y en a. \
On fait un temoin dans les memes conditionsnvee de l'eau
distillee pure.·
Si la 'reaction est accentuee, on dose l'ammoniaque en
utilisant les deux solutions titrees snivllntes:
Acide sUlfLl1:ique a 0 gr. 98 de SO~H~ par litre. Un centi·
metre cube correspond a 0 mgr. 98 de SO'H'il ou a
o mgr. 28 d'azote. •
Soude a 0 gr. 80 de NI;lOH par litre, ~'eat·a~dire ~quiva­
lent~ a la solution acide r;i·dessus.
Vappareil se C0\11pOSe d'un ballQu QU d'Que fiQl~ a fond
plat de 2 litres, ferme par un bouchon de caoutchQuc p~fce
de deux trous ; dans l'un passe la tige d'un entonnoir a robi-
net; dans l'autre un tube a degagement relic it un refrige-
rant. On fixe a l'extremite du refrigerant un tube a bQut
effilQ. On introduit dans Ie recipient L500centime.tr(ls cuhes
d'eau et un lait de 10 grammes de magnesie calcinet) que
ANALYSE>ET, PURIFICA:rION DES EAPX PQ'l(ABhE$ 215"

l'on a ell; Ie. soin,de. faire' prealablement._ bouillir. On PQr,te1

ens)lite douceme~t1d'ebullition, eton,dil>till~ IepteJIleIlt t'lp-,
viron 100 a 150,oentimetres cubes. On rej:!U(:lille,le liq»j.de.
distille dans une fiole coni que renfermant 20 centime-
tres cubes de solution d'acide sulfurique. a. 0,98, par
litre, additionnes de quelques gouttes de, solution alcooli·
que de phenolphtaleilJe dans laquelle plong~, d~s l~.debut,
l'e:JStremite efIilee du refrigerant.
On prepare un temoin avec les memes quanti'i:es d'eau
distillee purC',. diacid-e e1: de pltenolphtalein_e"
On dose. avec la solution de soude a O. 80 par litre, le
temoin e.t: l'epreu ve, en p,reof}nilla pl;'ecaut-ion de (ai,r~ ~quilJir
et re.froidir les. solutio,ns acide:; aVqnt Ie. t~tI:ag~ .. ~g d.itrk.
renee: dOJllue.. la q,uantite d'acide suJ{ur~qu.e sp.-,t,q.ree l?ax
l'ammo.n.iaque.de l'ef,ltu. On en.deduit la quql}.ht.e cQJ:J;es1?on,~
dante. d'awte ammoniacal par litre.

3° Nitrites. - On l'es, reda.~I1(}~ Jil.ar leo F~~til4e, 'I):qllhS....

dorff ou par la reaction a la naphtylamine.
a) Reaclij de Tromsdor/f, Ie plus sensible ~
Chlorure de zine pur. . 20, gr.
lodure de zinc pur. . • . • • . . . :!!i gr.
Amidon soluble,. . . , • . . . . . 4 gr.
Eau d'i"liUee. q. s. pour. . . • • . • un libe.~

Dissoudre d'abord Ie.chiorure de zinc dans 100 centi-

metres cubes d'eau, y ajouter l'amidon, puis faire houi'llir l
ajoater l'iodure de zinc, completer a 1 Htre et :flltrer sur
coton de verre. Conserver dans un Racon en verre br-un.
A 10 centimetres cubes d'ean on ajoute 0 cc. ~ de ee- ~ae~
tif et V gouttes d'acide sulfurique. Si }'eau conHent des ni-
trites, on observe tres rapiclement une coloration bleue
plus ou moins intense.
Preparation de ['amidon soluble:
Pour preparer l'amidon soluble ou amylodt)J.trin~, Ull
fait macerer pendant 6 a.8 semain{)s 100 graqllnefl de f~cule
de pommes de terre dans 600 centimetres cubes d'acide
chlorhydrique etendu, de denslte l,op.
Au bout de ce temps, les grains qui semblen!: inalten!!!
ne se colorevt plus en bleu par node, me.ii? e,n iaune. On
les recueille par centrifugation ou sur un filtre Q\ on l(!s
216 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU so1.
fait secher. Apres dissolution dans l'eau chaude. ces grnins,
donnent urie coloration violette. L'amidon soluble a'insi
obtenu peut se conserver sec pendant tres Iongtemps.
b) Reaction a la naphlylamine.
On verse dans un tube:
Sol. de naphtylamine B it 1 % filtree et
acidifiee par 10 % d'acidc acetique. 5 ce.
Solution it 1 " d' Beide suIranilique • 5 ce.

Coloration rose en presence de traces de nitrites.

40 Nitrates. - La recherche des nitrates

interet au point de vue sanitaire. La pres!'
qui peuvent n'etre que les temoins de r

cation tres anciens, est frequente dar

ment parfaitement filtn\es ou dan~ •• les.
On peut determiner leur presence, par les
reactions it h diphenylamine ou a la brL~ •.
a) Rea,ction d la diphenylamine.
Acide sulfurique pur it 660 Be. . . . . 100 ce.
Sol. a I) % de sulfate de diphenylamine. . 5 cc.
Acide chlorhydrique pur it 10 %. . . . 5 ce.
Coloration bleu fonce sur Ie resid~ de l'cvaporation
dans une capsule de porcelaine.
b) Reaction de la brucine:
On delaye Ie residu de l'evaporation dans une ou deux
gouttes d'acide sulfurique concentre et on ajoute quelques
milligrammes de brucine. S'il ya des nitrates, il se proquif
une coloration rouge, virant it i'orange, puis au jaune.

5° ChZore des chlorures. - On en effectue]e dosage

volumetrique avec les deux solutions suivantes, bien exacte-
ment titrees :
a) Solution de nitrate d'argent a 2 gr. 9075 par litre. CI:JU-
que centimetre cube correspond it 1 milligramme deNaCl
ou a 0 mgr. 607 de chI ore .
b) S~lution de chromate -de potassium neutre et pur a
10 p. 100.
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAUX POTABLES 217
On verse dans une fiole coni que 250 centimetres cubes
de l'eau a analyser, que l'on additionne de 0 cc. 5 de la solu-
tion de chromate de potassium. On titre a la burette, au
moyen de la solution d'argent, jusqu'au virage du jaune
vert au jaune orange (lres deiica t, mais tres net et sensible
pour un reil exerce). On deduit du volume de la solution
titree d'argent ainsi'ajoute, Ie volume de la meme liqueur,
employe pour obtenir Is meme teinte dans une solution de
chromah~ jaune de meme concentration dans reau disti11ee.
Si I'eau etait alcaline, on la rendrait neutre en ajoutant la
quantite d'acide sulfurique necessaire, determinee par Ie
titrage alcalimetrique.
Si I'eau eta it tres riche en chlorures, on emploierait la
solution a 29 gr. 075 de nitrate d'argent, correspo.ndant a 10
milligrammes de NaCI ou6 mgr. 07 de chI ore par centimetre
cube.

6 0 Titrages hydrotimetriques. - Ne sont utiles que

pour determiner la richesse de l'eau en sels calcaires si ron
suppose que ceux-ci, se trouvant en exces, peuvent pre-
senter des inconvenients On deterJ?1ine alors les degres
hydrotimetriques avant et apres ebullition. C'est ce que ron
appelle _Ie degre hydrotimetrique total et Ie degre hydroti-
metrique permanent.
Cette determination s'eITectue avec une liqueur titree de
savon qu'on prepare en saponifiant 30 centimetres cubes
d 'huile d'amandes douces par 10 centimetres cubes de les-
sive de soude:i 360 en presence de 10 centimetre$ cubes d'al-
cool a 95°, enchauITant aU bain-marie et agilant la masse.
Lorsque la reaction est terminee, on complete a 1 litre
avecdel'akool a 00° en -remnant constammenL On filt-re.
L~ titrage de la liqueurs'effectue au moyen d'une solution
de chlorure de baryum a 0 gr. 55 de BaCl~ 2H2 0 par litre.
On mesure exactement 40 centimetres cubes de cette
solution, que l'on introduit dans un flacon de 100 centi-
metres cubes bouchant a l'emeri. On fait tomber Ia: li-
queqr de savon contenue dans la burette speciale jusqu'a
ce que ron obtienne par l'agitatign une mousse qui doit
occuper tout l'espace libre du fla'con au debut, et persis-
ter avec une epaisseur dOun centimetre au moins pendant
4 a, 5 minutes, tout _en imprimant des mouvements de
!!18 MIC1WhES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU Sol.,

rotation a l'eau du flacon. Dans ces conditions, on doit

obtenir 22 degres, sinon on corrige la liqueur titnSe de
savon. II est plus simple de noter Ie titre trouve et d'en
teDir compte dans l' evaluation des degres hydrotimetriques.
Degre hydrolimetrique lotal. - On determine de la ma-
hi~re qui precede Ie degre hydrotimetrique de .reau, sans
dilution, Iorsque Ie degre ne dcpasse pas 25, ou hien sur
des fractions de 20 centimetres cubes, 15 ceptimetres
cubes, 10 centimetres cubes, 5 centimetres cubes, ·de l'eau
a essayer, en completant chaque fois it 40 centimetres
cubes avec de l'eau distilIee, fraichement bouillie, suivant
que cette eau accuse un degre de plus en plus- cleve. 0n
tient compte, bien entendu, ou volume d'eau distmee
ajoute.
Deyre hydrotimerrique permanent. C'est eelui de l'eau
apres ebullition et separation du precipite.
100 centimetres cubes de l'eau sont portes a l'ebulli.:
tion pendant 10 minutes. On refroidit; on compl~te a 100
centimetres 'cuDes avec de l'ea" distiJlee boui-llie,.on agite et
on filtre. On prend Ie degre hydrotimetrique dit perf11u-
neffl du liquide filtre.
Un degn hydrotimetrique equivaut, pour un litre d'eau, 0..::
MiHigr.
Chaux en CaO. . . . • . . . 5.••7
Carbonate de chaux en CaC03. . 10,3
Sulfate de· chaux en CaSO·. . . . n,o'
Magnesie en MgO. " . . . . " 3(6,
Carbonate. de magnesie en MgC03. 7.5
Sulfate de magnesie en MgSO·. • . 10,8
Nitrate de chaux (AZ03) 2Ca. . . 17,0

Au-dessus de 360 hydrotimetrique (total).l"usage de'l'eau

devie-nt difl!.ciIe pour les emplois domestiques.

C. - Analyse microbiologique.
EIle a pour ohjet la numeration et Ia s.peej,£i~ation des
germes microhiens. contenus: dans les eam\. C'est dle qui
fom"nit les renseignements les plus utiles. sur la valeur
:bygienique d'nne caD snpposee potable. alb moment §)U dIe
a eM recueiHie.
Mais, pour que les resultats ahte-Jilus soient comparable.s,
il est necessai:l'e d'employer des. m,ethodes toujours iden-
ANALYSE ET PURIFICA.TlON DES EAUxi POTABLES 219

tiques. Celles indiquees par l'instruction du service de sante

militaire du 13 janvier 1909 paraissent encore actuellement
les plus recommandables I
P"O\lf la numeration des microbes. elles prescrivent rem-
plqi d'un milieu simple, facile a preparer: la gelatine-pep-
tone Ii ['eau, sans bouillon, composee comme suit:
G~latine extr~ (I?oulel\c freres), 100 gr. en France
(180 gr. dans jes pays chauds)
Peptone sache (Poulenc fd)res). 20 gr.
N!\Cl. • . • . . . . . . . 5 gr.
Eau . • • . . • . • . • . 1.000 gr.

Neutraliser, puis alcgIiniser tres faiblement, repartir en

tubes par 10 centimetres cubes et steriliser.
On peut egalement employer un milieu a I'eau de levure
aUlolysee de P. Dienert el A. Guil/erd, qui fournit, pour les
numera.tiQns totales des gcrmes, des resultats equivalents
a ceux que donne la geilltine peptonee.
Un kilo de levure de distillerie pressee est mis a sec dans
un cristaUisoir et porte pendant 24 heures a l'etuve a 50°.
Apres ce &ejour, Ie bloc de levure s'est resolu en un liquide
epais que I'on reprenu par l'eau, environ trois litres ; on
fait bouillir une ] /2 heure, on neutralise jusqu'a alcalinite
legere. On colle la preparation avec un blanc d'reuf, comme
pour Ia preparation de Ia gelatine ou de la gelose, pour faci-
liter les filtrations ulterieures qui, sans cette precaution.
seraient longues et diffidles. Porter a l'autoclave If2 heure
a 105·, filtrer sur Chardin, filtrer une deuxieme fOls, Sf
cela est necessaire, sur filtre Laurent.
Les filtrations sont rllpides et Ie magma s'essore seul et
completement. On verine definitlvement Ia reaction du
milieu que ron aluste au pH = 7,5. On ~mpl.at~a Ii litt'es.
Les auteurs appellent ceUe concentration : dilution nor-
male.
A 10 grammes de peptone du milieu gelatine-pep tone-
sel, on substitue 100 centimetres cubes de dilution normale
d'eau de levure.
On ensemence trois tubes de cette gelatine fondue:l
30 degres avee respeetivement, I, a,et·3 gouttes de l'eau a
analyser (ou, s'il y a liett, avec 1,2,3 gouttes d'nne dilutiolll
de 1 centimetre cube de cette eau dans 9 centimetres
cubes d'eau sterile) et on coule dans des boites de'
220 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU SOL

Petri steriles, de 14 centimetres de diametre. Des que la

gelatine s'est solidifiee, - ce qu'on peut nater en pla~ant
les boltes sur une surface refroid~e, on les porte dans une
etuve reglee a 18- 20 0 e-t on les examine taus les jours a
partir du 2" jour et ce, pendant 15 jours, pour faire la
numeration apres ce del ai, ou des que Ie developpement des
colonies liquefiantes menace d'envahir une partie du milieu.
Le tableau ci-apres represente Ie coefficient par lequel
doit etre multiplie Ie nomhre des colonies constatees, si l'on
veut evaluer la teneur approximative de reau en microbes
apres 2, 3, 4, etc., jours jusqu'a 15jours :
Coefficient.
2 jours HI,6
3 8,82
4 5,61
5 3,86
6 3,05
7 2,40
II 1,82
9 1,52
10 1,33
11 1,19
12 1.10
13 1,06
14 104
15 1,00

Par exemple, si la numeration des colonies a (Ill etre in-

terrompue au 4e jour et si ron a compte a ce moment
2.000 colonies, Ie chiffre approximatif des colonies q\Ji se
seraient developpees dans les cultures est de: 2.000 X 5 61 =
11.220.
Les moisissures sont comptees a part.
La numeration des colonies se fait aisement au moyen
d'un numerateur a secteur, quadrille en centimetres carres,
place sur un fond noir et sur lequel on pose la plaque
a examiner.
On compte successivement les colonies visibles dans un
secteur qu'on delimite sur Ie verre avec un trait de plume,
puis celle d'un second secteur. et ainsi de suite jusqu'a
ce que toutes les colonies developpees sur la plaque
aient ete denombrees. On en fait Ie total et celui-ci corres-
pond au nombre de germes cultivables en gelatine qui se
trouvaient dans la quantite d'eau ensemencee. Par un cal-
cui tres simple, on evalue des lors Ie nombre de microbes
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAUX R6TABLES 221

contenus dans un centimetre cube ou dans un litre de l'eau

etudiee.
La specifiwlion des germes ne peut se faire avec quelque
precision qu'apres l'isolement de ceux-ci sur les plaques' de
gelatine et leur reensemencement sur milieux appropries.
Toutefois, par l'examen microscopique direct de prepa-
rations non colon~es et colorees, on ·peut souvent determi-
ner les especes bien cQnnues par leurs caracteres morpho-
logiques (cocci, sarcines, spirillt~s, levures, moisissures,
etc.).
Oli devra mentionner ainsi, dans les rapports d'analfse,
certains microorganismes qui proviennent des matieres en
putrefaction: Bac. fluorescens liquefaciens, Bac. pyocyanique,
Proteus vulgaris, Bac. megalherium, Bac. prodigiosus et les
especes spirillaires qu'il y aura souvent intenH a isoler par
ensemencement dans l'eau gelatinee peptonee, salee (voir
vibrions choleriques, chap. XXXIV) pour les mieux etudier.
La determination du bacille typhique, du Bacterium coli
et des paratyphiques, des bacilles dysenteriques, etc., sera
faite d'apres les methodes indiquees, pour chacune de ces
especes, aux chapitres XXXII et XXXIII.
Pour la recherche du Bacterium coli, l'instruction du
servi~e de sante militaire prescrit ~e l'effectuer, non seule-
ment sur des quantites minimes d'eau (I a XXX gouttes),
mais encpre sur 2,5, 10,20,50, !QO, 150 cenpmctres cubes
et davantage. C'est pourquoi il est necessaire que les prises
d'echantillons portent sur deux flacons de 150 centimetres
cubes pour chaque eau a analyser.
On ensemence successivement d'abord I, II, V, XX, XXX
gouttes d'eau dans des tubes d'eau peptonee alp. 100,
salee a 0, 5 p. 100. On ensemence de meme 2 et 10 centime-
tres Cttbes dans des ballons contenant 50 et 100 centimetres
cubes d'eau peptonee.
Pour les volumes plus considerables, on repartit l'eau
(20, 50, 100, 150 centimetres cubes) dans des ballons ste-
riles et on la rend directement nutritive en l'additionnant
de proportions variables d'une solution concentree de
pepto-sel :
Peptone seche I'oulenc. 50 gr.
Nne!. • • ... 25 gr.
Eau dislillee. . . . . 100 gr.
222 MICROBES DE I.'HAU , DE L'AIR ET DU SOL

Cette solution doit avoir eM sterilisee d'avance en tubes

fractionnes contenant chacun 5 centimetres cubes. EIle est
trol1ble, mais il est inutile de la filtrer.
A Ia place d'eau peptonee, on pertt sO setvir d'eau de
lev-ure autolysee, scIon Ie procede de Dienert at Guillerd
precedemment indique.
On etnploie :
Eall d6 ll!l'lIre (dilution tlOrrtUtlll) •• 20 (ie.
Edu sterile.. • . • • • • . . 3() cc.
Eau d'ensemencement.. . . . . 50 ce.

L'eau de lavure, comme ort Ie voit, est employee au 1/5

pour Ie B. coli.
En cas d'autolyse defectueuse, qui proviaflt sul'tout de la
temperature inconstartte de l'etuve dans les laboratoires oft
la pression est variable, on. a toujours Ia latitude d 'augmen-
ter la quantite indiquee de le~ure.
Le melange d'eau it analyser at de milieu J.1utritif doit
etre tel que Ie tllUX; de peptone qu'il renferme soit ega.l it
1 p. 100. Par exemple. pour 20 centimetres cubes d'eab.,:il
faut ajouter 0 co. 4 de solution concentree ; pour 50 centi·
metres cubes, 1 centiqll!tre cube. Pout 100 centimetres
cubes, 2 centiItletres cubes, etc.
La proportion d'acide phenique qu'il convient d'incorpo-
rer Itu melange d' eau et de solution peptonee-est de 0 gr. 85
p. 1.000,
Pratiqueme'nt, on obtient un melange phenique cpnforme
en bissant tomber, it l'aide d'uue pipette jaugeant 30 goutUs
au centimetre cube, une goulle de solution pheniquee a
5 p. 100 poUr deux centimetres culJes du melange eau it ana-
lyser +Mu peptonce ; done, par exemple, 25 gouttes pour
50 centimetres cubes. On agite et on porte a l'etuve it
41°5.
II ne faut pas ajouter l'acide phcnique aux milieux de
culture avant de sMriliser ceux-ci, car Ia teneur en acide
varierait heaucoup par suite de l'evaporati6I1 it l'autoclave.
Les pretnieres culthres faites it 41 0 5 sont verifiees 14 it
16 heures apres. D'apres leurs rcsultats, on peut deja con-
clure, so it it l'absence du Bacterium coli dans l'ean experti-
see, soit a sa presence dans 1/20,1/10, 1/5 ou 1 centimetre
cube de l'eau, ou bien dans une quantite plus elevee.
(Pour les eaux tres souillees, ort opere aU prealable une
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAU» P6TABLES 228
I
di'l.ution 'plus au mains forte de reau, afin de fixer lllur
teneur en B. 'Coli).
Des qu'un au 'plusieurs tubes on flacons renfermant Ie
melange phenique d'eau a llnalsser et de solution peptonee
s'est trouble, On proce!le it un secoml et~ au besoio, a un
troisieme passage en eau peptonee pheniquee it 41°5.
Quatre ou cinq heures apres, m~me 5i cetlc deuxieme ou
troi5ieme culture est encore limpide, on en fait un preleve-
ment avec l'extremite du fil de phttine et on identifie Ie
microbe en reensemengant :
en bouillon simple,
en bouillon lactose carbonate,
en bouillon au rouge neutre.
en lait tournesole,
La culture en bouillon simple, qui est' elle~m~me trouble
aU bout de 4 a 5 heures, sern reportee sur pomme de terre,
sur gelose et sur gelatine inclinee.
L'examen microscopique, la non-coloration parle Gram
et la recherche de l'indol completeront les moyens d'iden-
tification du B. coli.
On peut faire Ie diagnostic rapide de la Soumute des
eaux de boisson par Ie B. coli, en employant la technique
tres simple de A. ,Braun. Celle-ci utilise Ie milieu de cul-
ture de Savage que l'on prepare comme suit:
Dans un demi-litre d'eau, on fait cuire 125 grammes de
vi~nde de brnuf. Apres cuisson et tefroidissement, on fil-
tre pour separer les graisses et on ajoute :
.Peptone \Defresne). 10 gr.
Sel . • . . . • . . 10 gI'.
Glucose. • . . . . . 2 gr. 50

On ramene au volume de 500 centimetres cubes avec de

reau. On fait bouillir de nouveau. Oil decante apn3s refroi-
dissement, puis on ajoute 5 centimetres cubes de la solu-
tion suivante :
Rouge neutre. • . • . . . . . • •. 5 gr.
Euu. . • . • • . . • • . . . • • 100 cc.

On repartit par fractions de 6 centimetres cubes dans des

tubes it essai qu'on sterilise a l'autoclave a 115° pendant
30 minutes.
224 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU SOL

Le bouillon a une couleur rouge rubis. Le developpe-

ment du Bacterium coli lui donne une belle fluorescence
verte ou, s'il est tres abonda"nt, jaune canari avec reflets
fluorescents. sur fond sombre. Le bacille d'Eberth ne pro-
duit aucune modification de la couleur du milieu.
Deux tubes de 6 centimetres cubes de bouillon au rouge
neutre ainsi prepare sont ensemences respectivement avec
1 et 10 centimetres cubes de I eau a Mudier. On porte a
l'etuve 24 heures a 37 0 . Si l'eau ensemencee renferme du
B. coli, il se forme des buIles gazeuses a la partie superieure
du bouillon qui devient fluorescent ou jaune canari, sui-
vant l'abondance de ces germes.
Si la coloration n'a pas vire apres 48 heures d'etuve, on
peut affirmer que l'eau ne renferme pas de B. coli en
quantite appreciable.
Quelques autres microbes peuvent determiner la colora-
tion vert fluorescent, mais pas Ie jaune canari. Ce sont
d'ailleurs des microbes intestinaux : Bacillus mesenlericus,
B. ellieritidis Gaertner, Bacillus cloacre, certaines urobac-
teries; les bacilles du tetanos et de 1'redeme malin, en cul-
ture anaerobie, la determinent aussi.
Cette methode est sensible et tres pratique.
Anaerobies. - La determination de l'indis;.e unaerobique,
c'est-a·dire du rapport entre Ie chitTre des anaerobies vrais
et celui des aerobies, est utile a faire, surtout pour les
eaux de puits, de citernes, de reservoirs et de rivieres.
Le milieu nutritif ado pte pour la culture des anaerobies
est Ie suivant :
Gelatine. . 100 U 200 gr.
(suivant la temp. exterieure).
Glucose. · . .• 10 gr.
Nael. . 5 gr.
Glycerine. · . ., 5 gr.
Eau . . • • . . • 1.000 gr.

On neutralise en alcalinisant ires legeremeni et on steri-

lise en tubes droits qu'on fait fondre a 30 0 au moment d'en-
semencer et apres avoir aj()'ute a chacun d'eux quelques
gouttes de solution ste'rile de sulfo-indigotate de soude.
Chaque tube contenant 10 ou 20 centin:etres cubes de
milieu de culture rec;oit 0 cc. 1, 0 cc. Q, 0 cc. 5, 1 centime-
tre cube et 2 centimetres cubes de l'eau a analy.ser. On
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAU~ POTABLES 225

incorpore l'eau au milieu de culture sans trop agiter, pour

eviter les huIles d'air, et on aspire Ie contenu de chaque
tube dans de longs tubes-pipettes (pipettes de Vignal) pre-
pares et flamhes it l'avance, d'un diametre interieur de 3 it
4 millimetres et d'une longueur de 0 m. 50 environ. Ces
tuhes-pipettes son t en suite scelles it leurs deux extremites et
portes sous un rohinet d' eau froide pour solidifier la gela-
tine. On les maintient ensuite dans une etuve reglee it 18-20°.
Apres 3 it 6 jours, on peut compter les colonies anaero-
hies, qui apparaissent sous forme de petites masses flocon-
neuses ou granuleuses, avec ou sans huIles de gaz, au
milieu de la gelatine decoloree.
Les anaerohies facultatifs donnent des colonies ramas-
sees, denses, opaques, qui n'offrent pas l'aspect caracte-
ristique des anaerohies vrais. 11s ne doivent pas etre com-
pris dans Ia numeration.

..
D. - Interpretation des resultats d'analyse.
L'analyse chimique fournit d'utiles indications sur la pre-
sence et la proportion de certains elements qui peuvent
resulter de souillures permanentes ou accidentel1es, ou qui
dependent de la provenance geologique de l'eau it exami-
ner ; mais l'analyse hacteriologique est indispensable pour
permettre de conclure si une eau est, au peint de vue
sanitaire, bonne, mauvaise ou suspecte.
La numeration des germes conteftus dans cette eau
fournit surtout d'utiles renseignements pour la surveillance
des appareils de filtration et pour savoir si une eau est plus
ou moins parfaitement epuree dans son parcours souter-'
rain. Mais certaines eaux de fleuves ou de rivieres peuvent
vehiculer un grand nomhre de germes inoffensifs provenant
des couches superficielles du sol, tandis que d'autres,
surtout celles de puits ou de sources, se montrent parfois
tres pquvres en germes saprophytes etabritent cependantcer-
taines especes microhiennes particulierement dangereuses.
La specification des especes est done' de louie premiere
importance. Les souillures provenant de fumiers, d'infil-
trations de fosses d'aisances, etc" sont revelees par
MICROBIOLOGIE 15
 ~~ MIellOiiss DE L'EAU, DB VAIR ET DU SOL
t'&bond~nce des mitcrobes de ta pntrefactl'On, bacilles iique-
till.ots, B. mega!hel'ium, Pf-Ofeas, ·etc., et par la ,proportion
~ &reterltll1'1.>coii.
Lllrsqu\me ean renfurme 100, MO, 1.000 B. roli 'Par
litre 'el, l! fortiori. un cbiffre .ptus eleve encore, on doit
ge~\"Ia.~ruent in conside1'er comme.tre:s suspecle et dange-
re\1l'ire iJ'OUl' l'.a1imcntation.
Le ta'U.x de 1.6 a roo BaoJerium coli par litre indiqne que
l~n:\l est en pe'ri'Ode d'infe-ction iegere, peut--'Ctre au debut
0'0. '~n d~lin d'nne oO'ntaminati'On plus .grave. Etro d.'Oit etr<!
consid\!ree comme sQspeci-e.
La presence de quelques B. coli par litre ne suffira
j1l.~i'S a mire classer une eau comme a.angereuse, car
<ils tp'eQ'Ve'nt !p'l'Ovcnir de contaminati<ms accideatelles, pal'
~ excrements d'oiseaux, par exemple. Mais Sl ces
ge1'mes sont accompagnes de nombreux micl'()bes de 'Ia
putrefaction,la suspicion est alo1's fondee et l'eau doit etre
etroitement surveillee.
Du reste, pour 'juger de la valeur alimentaire d'une eau,
il est t(1u~urs indispensable de 'faire port-er les analyses
sur des echantillons preleves a des intervalles variables, en
-di"gerses saisons -et en periodes de secheresse ou de pJ..uies
\}....oiongees.
Us di'Vel's<cs ·echeUes qui ont ete proposees pour ·etablir fa
. pm-et:e chim.ique 'et bacteriologique d'une eau pOlable a'ont
'd.>Ohe, d'apl'l~s ce qui vient d'etre'lilt, qu'une valeur toute
l't!ltJ.ii~e. V'Oici neanmoins eelle qu'on peut cOflsiderer
comme la meilleure.
'Ecltelle d'appr-eciation de la pUTere chimique
~t miaobiolQ,gi.que <i'une ~au poiabte.

Non{bTe Nombre Chlorures

de germes Degr'; Nitrates
de hydroti- en NaCI.
'Cultivables en h. coli mgr. mgr.
gelatin" metrique par
en 15 jours 'Imr total par
11 t r e
htr.!! lit ,."
. ---
(paT litre)

-
~ '~f'es Jpul'e. tl a 1(')1l {) 5 a 1'50 max. 27 mgr. 0
~po1trble.. 1{)() it 1.000 1 ~ M, 15 it .30 0 rna". 66 mgr 0(} it 15-
&.u ·....pect~ . . 1.eOO il 10000,10 a 50/+ de 80· 85a 165 mgr. 15 a 30
Ellll11l'alt'l1alSe. + ae lo.oool~de 50: + aetOO· +de'l1l5blgr. + ae-3U
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAUX POTABLES 227

E. - Agents chimiques recommandables pour la

purification extempo.ranee des eaux potables.

a) Nitrate d'ar_gent et Fluorur{;l d'argent (ou

Tachiol). - () gr. 1 de run Q.e ces deux sels suffit pour
detruire en une demi-heure la plupart des microbes conte-
nus dans 5 'litres d'eau de riviere ou d'etang. Le vibrion
\cholerique .est tue en 5 minutes, Ie Bacterium coli et Ie sta-
phylgcoque .d.ore en 30 minutes ; les chlorures et les
matieres organiques en exce~ dans reau a steriliseI' retar-
nent l'effet du seI d'argent, mais on peut corriger ce retard
en ajoutant prealablement a l'eau quelques gouttes d'ammo-
niaque (2 a 5 gouttes pour 5 litres) qui dissout Ie precipite
forme par les sels .d'.argent.

b~ lode. - Ajouter, par litre .a'eau, 8 a 16 gouttes de tein-

ture d'iode du Codex. Agiter. Laisser en contact 30 minutes.
Neutraliser l'iode restant par infusion de the, de cafe ou par
addition de vin, ou par l'hyposulfite de soude. (Ii se f9rme
dans ce dernier cas une petite quantite de tetrathionate de
soude, sel inoffensif.)

c) Chlore. Chlorure de chaux. - Normalement, Ie

chlorure de chaux du ,commerce doit avoir une teneur en
chlore actif de 100 litres ou 321 gr. 5 (Ie poids d'un litre de
.chlore est de 3 gr. 125) par kilogramme. 10 grammes de
chiol'ure du commerce suffisent donc pour degager 1 litre
de chlore.
Pour steriliser l'eau potable, il faut, suivant la teneur de
celle-ci en matieres organiques, de 0 mgr. 3 a I milIi-
gramme de chlore actif par litre, c'est-a-dire 0 gr. 3 a
1 gramme par metre cube avec trois heures de contact;
ou bien 4 a 8 milligrammes par litre avec 15 minutes de
contact. On peut detruire l'exces de chI ore par addition
d'une petite quantite de bisulfite de soude ..
Pratiquement, on emploiera 1 a 3 gJ,'ammes de ,chlorure
de chaux du commerce "Par metre cube, avec un conlact d'au-
mains 15 minutes. En voyage, on peut commodement
employer nne soLution de chlorure de chaux it 1 p. 100.
228 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU SOL

dont 10 centimetres cubes suffisent pour steriliser en

10 minutes 10 litres d'eau.
d) Bau de Javel (hypochlorite de soude). - Si l'eau
de Javel contient 100 grammes de chlore actif par litre, on
en emploiera au plus 10 centimetres cubes par metre cube
ou 0 cc. 01 par litre (1 milligramme de chlore actif). soit
10 litres d'eau de Javel par 1.000 metres cubes d'eau
(1 kilogramme de cblore actif).
Le produit ordinaire du commerce ne renferme habi-
tuellement guere plus de 60 grammes de chlore actif par
litre, quelquefois beaucoup moins. 11 faut alors compter, en
moyenne, sur une depense de 18 litres d'eau de Javel
(1 k. 800 de chlore actif) par 1.000 ·metres cubes et, pour
'assurer une sterilisation efficace dans les grands reservoirs
d'eau d'alimentation, un contact de 1 a 2 heures (0 cc. 018
pour 1 litre, ou pratiquement 2 centimetres cubes d'une
dilution d'eau de Javel a f p. 100 p6ur 1 litre d'eau a st~ri­
liser) .
e) Chlore liquide comprime, Tres employe en
Amerique depuis quelques annees. On assure son conta~t
suffisamment prolonge avec l'eau dans une sorle de colonne
de Gay-Lussac contenant du coke. La. dose moyenn~ neces-
saire pour reduire de 98 p. 100 Ie nombre des microbes de
l'eau de riviere est de 0 gr. 2 de chlore parlmetre cube, soit
orriiUigr. 2 par litre.
f) Reactif decelant 4!> presen.ce de traces de chlore
libre dans les-eaux po'i<,.bles sterilisees par les com-
poses chlores.
Solution d'amidon it 1 p. 100.
Solution d'iodure de potassium it 10 p. 100.

Quelques gouttes de ce reactif ajoutees £1 l'eau slerilisee

dans un verre a experiences developpent une coloration
bleue lorsqu' eUe renferme des traces de chiore Iibre.

". .
F. - Desinfection de reau des puits.
Apres avoir etabli Ie volume d'eau contenu dans Ie plli ls,
ANALYSE ET PURIFICATION DES EAUX POTABLES 229

on y \rersera environ 10 litres d'eau dans laquelle on aura

delaye Ie melange suivant (dose par metre cube) :
Permanganate de chaux.. . • . o gr. 5 it 1 gr.
on, a derant: permanganate de potasse. 5 gr.
Sulfate d'alumine. . • • • • . 50 gr.
Kaolin lave. . . • • • • • • 14,5 gr.

Ne pas pomper d'eau pendant 4 jours, puis pomper jus-

qu'a ce que l'eau d~vienne incolore.
Ou bien:
Enu de Javel. . • . • • . • 50 gr. par mHre cube.

On peut encore, plus simplement, eteindre 10 kilogrammes

de chaux vive dans 40 litres d' eau et projeter ce' melange
dans Ie puits, en agitant avec une longue perche. On attend
3 jours et on pompe jusqu'a ce que l'eau sorte claire, La
chaux restant dans Ie puits est inoffensive. II faut pomper
rieanmoins jusqu'u ce que toute saveur styptique ait dis-
paru.
Nota.: La desinfection des puits ne peut etre efficace que
si ces,puits ont ete prealablement cures et debarrasses de
boues. Sans cette precaution, elle serait illus.oire.
 CHAPITRE XVIJI

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE L'AIR ET D'U SOL,

,
A. - Analyse. ~icropiol~gi!lue de-l'air.

Les deux procedes de choix pour I'analyse bacleriolo-

gique de l'air sont la methode de Miquel hasee sur l'emploi
des hourres solubles, et la methode de Laveran bas{!e sur
l'emploi du harhotage.
Methode des bourrt!s solubles de Miquel.
Miguel utilise comrne bonrre Ie sulfate de soude desse-
che. Ce sel est chauffe it 200 0 • II se dissout d'abord dans son
eau de condensation, puis se solidifie a noU'veau et se
desseche. Le sulfate desseche est pulverise grossierement
au mortier et tamise.
On etrangle.un tube de verre ouvert aux deux extremi-
tes ; on tasse sur l'etranglement un tampon de coton et on
verse au-dessus 1 ou 2 grammes de sulfate prepare comme
ii vient d'etre dit. Boucher aux deux bouts av~c du coton et
steriliser a sec.
Pour se servir de l'appatt!il ainsi prepare, on place Ie
tube verticalement, en ayant soin que Ie sable soit en haut.
On dehouche l'extremite inferieure et on la relie a un aspi-
rateur. On ate Ie bouchon de coton qui obture l'extremite
superieure et on met en marche l'aspirateur. On fait passer
un certain nombre de Jitres d'air, 10 litres habituel1ement.
Lorsque l'operation est terminee, on verse la bourre so-
luble dans 10 centimetres cubes d'eau sterile et on fait des
plaques de gelatine ou de gelose.

Cette methode est la seule pratique lorsque l'analyse

bacteriologique ne peut pas etre faite sur place.
Methode de Laveran basee sur l'emploi du barbotage.
L'appareil de Laveran est forme de deux tubes a essai de
 ;-
ANALYSE M.ICR:OBlOLOGIQUE. DE L'AtH ET F>TJ SOL 23\

grande dimension, verticaux, reunis au niveau de leur tiers

superieur par une hranche horizontale. Us sEmt obtures par
un bouchon de caoutchouc portant une pipette qui plonge
au fond. L 'un des tubeS' pOYte un trait de jauge a'10 centi-
metres cubes. On y verse 10 centimetres cubes dleau. Dans
l'autre tube, la pipette est graduee en dixiemes de centi-
metres. oubes. On garnit d'ouat~ les. extremi.h~s &Uil~.e\lies
des pipettes e\ on sterilise l'appareil a l'auto.cl~ve.
Pour s'en servir, on debouche la pipette. gfadu~e. et on la
relie a un aspirateur. On enleve'le coton <\e }"autre pipette
et on fait fonctionner I'aspirateur. L'air pa&.s.e ~\' 4l.pipette
non graduee, barbote-,dans l'eau et s'eehappe par l~ pipette
graduee. Quand 10 litres d'air ant traverse l'l;lp.p,areil,_ on
arrete l'aspirateur, on rinee avec l'eau la p.ipette par laquclle
rail' est arrive et Ie tube correspondant, puis par la branehe
horizontale on la fait passer dans Ie tube qui contient 11,1,
pipette graduee. Avec cotte derniere, on aspire I'eau et en
In. repartit dans les milieux de culture.
Le nombre de gerI\les eS,t rapporte aU metre cube. Con~
naissantle volume d'air qui a passe dans l'appareU, la quan-
tite d'eau ensemencee et Ie nombre de colonies obtenues
sur les plaques, il est facile d'en deduire 1~ nombre de gor-
mes par metre cube d' air.

B. - Analyse bacteriologiq\le du sol.

Pour les prelevements faits a la surface du sol, recpeillir

I'echantillon de terre avec une cuiller au une spatule stc-
riles.
Pour les prelevements a faire en profon4eur, se servir
d'une sonde a cuiller pourvue d'une fermeture a,utoq1a-
tique, telle que la sonde de Fraenkel.
Quand l'echantillon de terre aura etc recueilli, Ie broyer
finement dans un mortier sterile et Ie diluer dans une
grande quantite d'eau sterile. Agiler fortement et, avec cette
emulsion, ensemencer des plaques de gelatine <lou de
gelose.
Connaissant.Ie poid~ de terre .dilu¢e dans un volume
d'eau determine, la numeration se fait pOIIlme PQur une
analyse d'eau.
232 MICROBES DE L'EAU, DE L'AIR ET DU SOL

C. - Milieux de culture pourles ferments du sol.

FERMENTS NITREUX, NITRIQUES, DEN.ITRIFICATEURS

ET FIXATEURS DE L'AZOTE ATMOSPHERIQUE

a) Milieux d' Omefiansky pour fa culture des ferments nilreux

Eau distillee. . . . 1.000 ce.
Sulfate d'ammoniaque. 2 gr.
Chlorure de sodium .. 2 gr.
Phosphate de polasse. 1 gr.
Sulfate de magnesie. . o gr. 50
Sulfate ferreux.. . . O.gr. 40

On met 50 centimetres cubes de ce liquide dans un vase

d'Erlenmeyer de 250 centimetres cubes, ii. moitie rempli de
scories concassees (Boullanger el L. M(1sso1). On ajoute
ogr. 5 de carbonate de magnesie sOU's forme d'rm lait sterilb
et on ensemence avec un peu de delayure de terre de jardin.
On fait des passages successifs tres nombreux et on elimine
~insi les microbes etrangers. On isole finarement sur pla-
ques de silice gelatineuse.
Pour preparer celle-ci, ajouter lentement a 125 centi-
metres cubes d'acide chlorhydrique a 130 Baume, un volume
egal d'une solution ii. 80 Baume de silicate de potasse bien
pur. Verser Ie melange sur un dialyseur en parchemin •
animal, bien debarrasse de chaux par lavqges.ii. l'acide
chlorhydrique etendu, puis ii. l'eau distillee. La aialyse doit
se ·faire dans un courant tres lent d'eau distillee, jusqu'a
ce que Ie liquide ne donne plus qu'une reaction imper-
ceptible a l'azotate d'argent.
Apres 48 heures de dialys~, on preleve toutes les 3 ou 4
heures un petit echantillon qu'on chauffe a 120· jusqu'a ce
qu'on n'observe plus de coagulation. On arrete alors la dia-
lyse, on sterilise a 1200 , on repartit en tubes steriles, par
fractions de 10 centimetres cubes, et on ajoute a chaque
tube:
Sulfate d'ammoniaque a 4 p. 100. • o ee. 5
puis, 0 cc. 5 de :
r Chlorure de sodium. . . 4 gr.
Sol. de ) Phosphate de potassium. 2 gr.
I Sulfate de magnesie.. . 1 gr.
( Enu distillce. . . . • 100 ee.
ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE L'AIR ET DU SOL 233

puis encore :
o cc. 5 d'une solution de sulfate Cerreux ii 0,8 p. 100

et enfin :
Lait de carbonate de mag[lesie ii 10 p. 100, 1 cc. (tres Ieger et bien
tarnise).

On coule en 'boites de Petri apris auoir ensemence

chaque tuhe avec une gouttelette de ferment nitreux puri-
fie comme il a et6dit ci-dessus. La silicefaitprise enquinze
a quarante;cinq minutes. On maintient les boites dans' une
cloche humide pour eviter la dessiccation de la silice, a la
temperature de 30 0 , et on voit apparaitre, au bout de 8 a
10 jours, des petites colonies refringentes qu'on prelcve
avec un fil de verre 'Sterile pour les ensemencer dans Ie
milieu d'Omeliansky. Le bouillon de viande ensemence
avec ces colonies doit rester sterile: les ferments nitreux
ne s'y deyeloppent pas.
Dans Ie milieu d'OmeIiansky, les cultures pures donnent
In reaction des nit'rites (Tromsdor/f. voir chap. XVII, 30)
du 3e au 5e jour.

b) Milieu d~ Winogradsky pour la culture du ferment

nitrique. (Nitrobacterie.) Isoler d'ahord par Ie milieu d'Ome-
liansky ci-dessus, en rempla<,;ant Ie sulfate d'ammoniaque
par du nitrite de soude, tous les autres sels restant les
memes; puis par Ia silice g6latineuse, dans laquelle on
remplace egalement la solution a 4 p. 100 de sulfate d'am-
moniaque par une solution a 4 p. 100 de nitrite de soude.
Les colonies sont ensuite ensemencees dans I'un des
milieux suivants :

~
Nitrite de potasse. . . • 1 gr.
Sulfate de magnesie. • • o gr. 3
Milieu
Phosphate de potasse. . . o gr. [I
Carbonate de soude calcine. 1 gr.
]iquide. Chlorure de sodium. o 'gr. 5
( Sulfate de fer.. . . o gr. 4
Eau qistil!ee. . • • 1.000 cc.

~
Nitrite de soude. . . 2 gr.
Carbonate de soude .. 1 gr.
Milietf Sulfate de magnesia • traces
solide. Phosphate de potasse. traces
Gelose. . . . . • 15 gr.
Eou·du robinet. • • 1.000 ce.

'
~4 MI'CROBES.DE L'EAU, »E L'Am EX DU SQL

Ensemencer d'ahord des scories sterilisees (en.vase d'Er-

lenmeYeI:') ct mouillees de liquide d'OmeIiansky avec un
peu d'eau de delayure de terre ou, mieux, avec Ie produitde
lavage d'un fragment de scorie de Ia surface d'un lit b.acterieu..
On opere ensuite, comme pour les ferments nitreux, l'isole-
ment sur plaques de silice gelatine use.
Les colonies ne se developpent qu'apres '2 semaines,
sous. forme de peti tSo corps ronds ou ovales, hriUants, hlju-
n~ltres it l'air. On peut augmenter lev.( grosseur en depo-
sant.dans leur voisinOlge, une.goutte de solution a.2p.l00 de
llitrite de soude. Les repiquer et les :reenseme.lJcer en
tubes ou en mat:ras en milieu liquide ou soli de.
c) Milieux de culture pour les ferments denitriticateurs.
Enu. . . . . . . 1.000 ee.
Nitrate de potasse. • 10 gr.
Aoide eitrique.. . . 7 gr.
Asparagine.. • . . ~ gr.
Liquide Phosphate de potasse. 5 gr.
de Sulfate de magnesie. 5 gr.
Gayon, Cblorure de calcium. 0 gr, Ii
Sulfate d'alurnine. • 0 gr. 02
Silicate de soude.. . 0 gr. 02
Sulfate de fer.. . . . . • 0 gr. 05
Arnmoniaque q. s. pour faihle reaction alcaline.
,
Repartir en couche epaisse dans des tubes ou des matras
et recouvrir Ie liquide d'une mince couche ~'huile dc vase-
line., Ensemencer avec un peu de fumier, de c~eval et por-
ter a 35°. La culture se den once par un degagement gazeux
abondant. Or fait une serie de passages dans ce milieu
liquide et on isole en suite sur Ie meme milieu, gelose it
15 p. tOO, en anaerobiose.
d) Milieux de culture pour les microbes fixateurs de I'azote
atmospherique.
Milieu ~ Ean. • . • . • . . • . 1.000 cc.
de Bredemann Asparagine.. . . . . . . 10 gr.
pour Clostridium Sacchar!>se.. . . . . . • 20 gr.
et Amylobactcr. Gluc,?se.. . • . . . • . 16 gr.

Filtrer apres dissolution et ajouter :

Phosphate d~ potaase. . 1 gr.
Chlorure $Ie cllicium. . o gr. 1
Sulfate de magnesium •• o gr. 3
Chlorure de sodium. . o gr. 1
Perchlorute c;1e fer. . . o gr. 01
 /'

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE £lAIR ET DU SOL 235

Neutraliser par carbonate de soude.

Milieu ~ Eau distillee. . . • . • 100 cc.

de Beyerinck Mannite........ 2 gr.
pour Phosphate monopotassique. o gr. 02
Azotobacter Gelose........ 1 gr. 5

Ensemencer avec terre de jardin.

Milieu de Zikes ( Phosphate tripotassique. • . o gr. 25
pour les algues , Sulfate de magnesie. . . • o gr. 37
fixatrices , Chlorure de sodium. . • . o gr. 20
de l'azote, type I Traces de sulfate de calcium et
Chlorella vulgaris \ de phosphate de fer. . . . o gr. 20

Impregner de milieu liquide du sable siliceux reparti en

couche mince dans des vases d'Erlenmeyer. Suivant les
conditions de l'experience, ajouter un peu de sucre avec
ou sans nitrates.
e) Milieux pour la culture des microbes des nodosites des
Legumineuses.
Milieu de Beyerillck (modifie par Maze).
Infusion de haricots blancs (sans nller jusqu's In
cuisson complete). .' . . • 100 gr. p. 1.000 cc.

Filtrer, ajouter :
Chlornre de sodium. 10 gr.
Bicarbonate de soude. traces
Saccharose. . . • . 20 gr.
Gelose. • • . . . . 15 gr.

Repartir en couche mince dans des vases d'Erlenmeyer.

Ensemencer Ie contenu d'une nodosite. On obtient de
petites colonies ressemblant a une goutte de stearine.
 QUATRIEME PARTIE

REACTIONS HUMORA.LES
ET HEMATIMETRIE

CHAPITRE XIX

TECHNIQUE POUR LA PREPARATION ET LE TITRAGE

DES SERUMS AGGLUTINANTS, BACTERIOLYTIQUES,
PRECIPITANTS ET HEMOLYTIQUES

A. - Serum agglutinant et. bacteriolytique pour Ie

bacille typhique.
(Pour Ie titrage des serums agglutinant Ie bacille typhique,
voir chap. XXXII e~ XLIV.)

10 Preparation au moyen des cultures (uees par 1 heure de

chauflage a 59 0 •
On peut vacciner une chevre par deux injections intravei-
neuses chacune de 1 culture en tube incline, sur gelose, .de
24: heures, raelee et emulsionnee dans l'eau physiologique
(environ 5 centimetres cubes), puischauffeeentubesscelles,
1 heure it 58 0 au bain-marie. Les deux injections sont faites
a dix jours d'intervalle.
Pour Ie lapin, injecter par voie intraveineuse, d'abord
environ un cinquantieme de culture chauffee a 58°, puis 8
a 10 jours apres, un vingtieme et, 8 ou 10 jours plus
tard, un dixieme. Saignee 8 jours apres la derniere injec-
tion.
On peut aussi preparer les lapins .par injections sous-
cutanees suivies d injections intraperitoneales: 2 injections
sous-cutanees de 1/2 culture d':ibord. puis d'une culture
sur gelose, raelee, emulsionnee dans reau physiol,ogique
238 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

et chauffee 1 heure a 58', en fin deux injections intraperito-

neales de 1 et 2 cultures sur gelose, respectivement it
10 jours d'intervalle.
Pour les cobayes, injecter 4 fois a 12 jours d'intervalle:
1/4 et 1/2 culture par voie sous-cutanee, 1/4 et 1/2 culture
par voie intraperi!f:one'aie.
2 0 Au moyen des cultures vivantes.
On vaccine ies cohayes en leur injectant dans Ie peri-
toine, d'abord 0 cc. 1 d'une emulsion faite avec une culture
sur gelose de 24 ~euTes dans 1'{} centimetres cubes d'eau
salee physiologique; puis, 8 jours apres, et de 8 jours en
8 jours, successivement 0 cc. 2 et 0 cc. 5 d'une emulsion
semblable.

B. - Serum antiparatyph.ique B.
Inoculer Ie lapin par voie intraveineuse avec 0 cc. 1 d'une
cul:iuTe sor gelose de 20 it 24 heures, raclee et ennrlsionnee
dans 10 centimetres cubes d'eau saMe physiologique, puis
cllituffee 1 heure a 56·.
5 a 7 jours apres, on inocu1e de nouveau, par la meme
voie intraveineuse, 0 cc. 2 et 5 a 7 jours apn3s, 0 cc. 5
d'emulsion chauffee. I
Pour obtenir un serum agglutinant et bacteriolytique, il
faut injecter au lapin, apres les cultures tuees par la cha-
leur. ulle ou deux fois, par voie peritoneale, des cultures
vlvantes (1/2 centimetre cube d'une culture emulsion-
nee dans 10 centimetres cubes d'H 20 physiologique), a
8 jours d'intervalle. On attend dix jours et on saigne rani ..
mal. .
For-net, Muller et TSU=llki ont obtenu un serum aggluti-
nant Ie para B au 30.GOGe en soumeUant un lapin a 3 series
d'injections intraveineuses de cultures vivantes, reparties
comme suit:
-Premiere serie :
2 jain. . . 1(1:0 culture lIur gelose
3 juin. • . 1/.10)) »
4 juin. . . 1/5 » »
ar.e saignee Ie 13 juin. Le serlUll.agglutine il. 1 p. 100.
 PREpARATION ET TITRAGE DES S1!:npMS 239

Dearieme serle:
23 juin. . • 1/5 culture sur gelose
24 juin. . • 1'2 » »
25 jnin. ~ . 2/3 » »

'2csaigneele 4 juillet. Le serum agglutine alp. 20.MO.

'liroisieme serie :
13 jui1let. . 2,3 culture sur gelose
14 juillet . . 1 ~ »
15 juillet . . 2 » »

3e .saignee Ie 24 juillet. Le serum agglutine alp. 30.000.

C. - Serum antiparatyphique A.
Meme methode que pour Ie Paratyphique B, malS oen
employant d'emblee les cultures vivantes.

D. - Serum agglutinant les bacilles dysenteriques.

Lapins: Injection intraveineuse, it 5 ou 6 jours d'inter-

valle, de cultures vivantes, soit du bacille Shiga, seit.Qu
bacll1e Flexller, pour obtenir un serum specifique<lnti-S.higa
ou anti-Flexne!".
Repeter les injections au moills 6 fois. Dose initiale:
o cc. 01 d'une emulsion d'une culture sur gelose de
24 heures d.ans 10 ceRtimetres cubes d'eau salce physiolo-
gique. Doses ulterieures: 0 cc. 02. 0 ce. 05, 0 ee. 1 et
o ce. 2. Saigner 10 jours apres la derniere injection.
E:-Serum agg1utinantet "acMrioly-tique aI1'ti..cholet<a.
f.npins: I'l1jecter une premiere fois dans res vellreS
-0 'Ce.:01 d'une emulsioll de culture sur gelose t1gee de
'2i4 heures (lans 10 centimetpe~ cubes d'eau physiologiquel
'Chauffee 1 heure it 56°.
Renouveler l'injection tous les 7 jours avec, successive-
240 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE
ment : 0 cc. 02, 0 cc. 1 puis, dans Ie peritoine, 1/2 et 1 yen-
timetre cube.
Saigner 7 a. 10 jours apres la derniere injection.
D'apres Fornet et Miiller, on peut obtenir en 13 jours un
serum anti-cholera agglutinant au 10.000e en inoculant, par
voie intraveineuse au lapin, Ie 1 er jour, '1:/3 de cultlJre sur
gelose, Ie 2e jour, 1 culture, et Ie 3e jour, 1 culture et demie.
On saigne l'animal Ie 10 e jour apres la de~niere injection .

. ....
F. - Serums precipitants.
On injecte par voie veineuse ou intraperitoneale, par
kilogramme d'animal, environ 1 centimetre cube au liquide
antigene. On renouvelle l'injection to us les 5 a. 6 jours.
Apres 3 ou 4 injections, on a~tend 8 jours et on saigne.
Fornel et Miiller ont indique une methode encore plus
rapide. Elle consiste a. injecter, par voie peritoneale, 5 cen-
timetres cubes du serum ou de la solution albumineuse anti-
gene, puis, Ie jour suivant, 10 centimetres cubes, et Ie jour
suivant encore 15 centimetres cubes. On attend 12 jours et
on saigne.
Mesure du pouDoir precipitant. - La mesure du pouvoir
precipitant d'un serum anti s'effectue, soit vis-a.-vis d'une
dilution de microbes (de titre connu et legerement opales-
cente), soit vis-a.-vis d'une dilution d'antigene albumineux
quelconque. de la maniere suivante:
On repartit dans une serie de tubes a. essai steriles, de
preference dans des tubes de petit diametre a. fond rond
(0 cent. 5 X 10 cent.), 10 meme quantite (1 centimetre cube)
d'emulsion microbienne ou albUJ;nineuse bien homogene.
A chacun de ces tubes, - sauf dans Ie premier qui sert
de temoin, - on ajoute une quantite variable et pro-
gressivement croissante, par exemple 0 cc. 1, 0 cc. 2,
occ. 3 ... 1 cc. du serum actif pur ou du meme serum prea-
lablementdilue a. 1/10, ou a. 1/100 (s'il est tres ~ctif), dans
l'eau salee physiologique. On porte les tubes a. l'etuve a.. 37 0
et on les observe aprcs 2 heures, 6 heures, 12 heures et
24 heures. On note chaque fois les tubes dans lesquels la
clarification du Ii quide est complete.
 PREPARATION ET TITRAGE DES SERUMS 241

G. - Propriete$ bactericides et bacteriolytiques de~

serums. Leur determination et leur mesure.
Les proprietes bactericides et bucteriolytiques d'un
serum d'animal vaccine, ou naturellement immun, sont
dues a la presence, dans ce serum, d'une sensibilisatrice
specifique dont l'action vient s'ajouter a celle de I'alexine
normale.
Lorsqu'on se propose de rechercher ou de mesurer Ie
pouvoir bactericide ou Ie pouvoir bacteriolytique d'un
serum, on doit se servir de ce serum prealablemenl ,:hauffe
30 minutes a 560 en tube scelle. On Ie diJue generalemcllt
au dixieme dans l'eau salee p~ysiologique. Supposons qu'il
s'agisse de mesurer Ie pouvoir bactericide in vitro d'qo
serum de convalescent typhique, par exemple, vis-it-vis dl.l
hacille typhique.
On doit disposer d'une culture de ce bacille, sur gelose
inclinee, et agee de 24 heures. On introduit un centimetre
cube d'eau salee pbysiologique dans Ie tube qui renferme
cette culture dans laquelle Ie poids des bacilles (essorl3sj
correspond a environ 0 gr. 10 et on delaye celle-ci avec
soin au moyen d'un fil de platinc. On transvase ensuitc,
uu moyen d'une pipette sterile, ce centimetre cube
d'emulsion a 1/10 dans un autre tube a essai contenaot
9 centimetres cubes d'eau salce physiologique sterile. Ou
agite avec soin et on transvase, avec une autre pipette ste-
rile, 1 centimetre cube de cette premiere dilution dans un
second tube contenant cgalemen t 9 centimetres cubes d:eo\l
salee physiologique sterile. On agite de nouveau, et c'est Sur
cette-dilution au milliemc de la culture sur gelose que pon-
tera I'experience.
Celle-ci doit etre conduitc de la maniere suivante :
Dans une serie de tubes it essai steriles, bouches a l'ouate
et con tenant chacun 1 centimetre cube d'eau salce physioll)-
gique sterile, 00 verse une meme dose de dilution de cuI,..
ture, par exemple un dixieme de centimetre cube, ou 2 Bout-
tes de Ia dilution au millieme, preparee comme il a etc diJ
ci-dessus. On introduit ensuite, dans chacun de ces tubes
une meme quantite de serum frais de cobaye (alexine):
generalement un dixieme de centimetre cllbe au 2 goultes, pui<s
MICROBIOLOGIll 16
242 REACT IONS HUMORALES ET HEMAT IMETRI E

(sauf dans Ie premier tube qui sert de temoin) une quantite

progressivement"croissante de la dilution au, dixieme du
serum a etudier, par exemple 0 cc. 1, 0 cc. 2, 0 cc. 5, 0 cc. 8 et
1 centimetre cube. On complete partout avec de reau phy-
6iologique pour que Ie volume 'soit de 2 centImetres cubes
ou 2 cc. 5 dans tous les tubes; on agite legerement et on
porte a l'etuve a 37°, ou mieux dans un bain-marie a tempe-
rature con stante, egalement a 37°.
Apres des temps variables, 1 heure,2 heures ou plus,
generalement 3 heures (avec Ie bacille typhique 5 heures),
on fait un prelevement a la pipette dans chaque tube, et on
laisse tomber une goutte de chaque echantillon au centre
d'une boite de Roux d'un tube plat de Legroux contenant de
Ia gelose nutritive solide. Cette goutte est immediatement
etalee sur toute la surface de la gelose, au moyen d'un
petit cat:re de papier glace sterile tenu entre les mol'S
d'une pince flambee. (On doit avoir plusieurs de ces petits
carres de papier, prepares d'avance, dans un flacon a large
ouverture, bonche a 1'0uate ct sterilise it l'autoclave.)
Les boites de Roux, de Petri ou les tubes de Legroux, ainsi
ensemences chacun avec nne goutte de dilution de culture
ayant subi, pendant des temps variables. Ie contact du
serum, sont laisses a l'etuve a 37 0 pendant 24 ou 48 heures,
apres quoi on les examine et on compte les colonies de
bacilIe typhique qui se sont developpees sur chaqne tube
ou boite. 11 ne reste plus qu'a etablir la proportion du nom-
bre de ces colonies par rapport au volume de dilution
microbienne ensemence et au temps de contact de cette
dilution avec Ie serum.
Le pouvoir baclerio/yliqllc pent, dans certains cas, etre
. observe directement so us Ie microscope. On fait alors deux
preparations: rune avec du serum normal; l'aut're avec
Ie serum frais non chauffe ou avec du serum chauffe active
par addition d'alexine fralche de cobaye. Au centre de deux
lames. on depose une gouttelette de dilution de culture et, a
cote de celIe-ci, une gouttelette de serum actif. On recou-
'vre d'une lamelIe ; les deux gouttelettes se melangent. On
porte les lames a l'etuve pendant 5 ou 10 minutes et on les
.examine comparativement l'une apres l'autre.
A vec Ie bacille typhique, et aussi avec plusieurs autres
microbes pathogenes, la determination et la mesure du
 PREpARATION ET TITRAGE DES SERUMS 243

pouvoir bactericide d'un serum anti peut eire faite in vivo.

On effectue alors, dans des tubes a essai steriles, des
melanges d'une quantite fixe de dilution microbienne
avec des .proportions variables du serum aetif. On laisse en
contact, a l'etuve a 37°, pendant un temps fixe, - pal'
ilxemple 3 heures, - et on inocule 1 centimetre cube de
chacun de ces melanges sous la peau ou dans Ie peritoine
d'une serie d'animaux sensibles, de meme poids .

..
H. - Titrage du pouvoir bactericide des serums
antimicrobiens.

(TECHNIQUES DE JOUAN ET STAUB, M. NICOLLE, FIlASEY,

DEBAINS ET NICOLAS.)

Premier procede. - On cultive les germes sur gelose,

pendant 6 heures a 37°. On les emulsionne dans l'eau phy-
siologique additionnee de bouillon Martin au vingtieme, it
raison de 1 centigram me de microbes pour 20 centimetres
cubes de liquide. On fait alors, en partant de cette premiere
emulsion, une dilution telle qu'elle contienne de 400 a
1.500 germes vivants par 1/20 de centimetre cube. Pourcela
on etend d'abord au quart la premiere emulsion avec l'eau
physiologique + bouillon Martin et on porte ensuite 1/20 de
centimetre cube de la seconde dilution ainsi obtenue dans
100 centimetres cubes d'eau physiologique + bouillon Mar-
tin. On repartit en tubes d'apres Ie schema suivant :
10 Emulsions ie/les queUes,
Pour ensemencement immediat ;
Pour ensemencement apres 2 heures it ~J70.

°+
2 0 Emulsions
° ° °
serum (rais de cobaye (alexine)
Selon les cas cc. 01, cc. 02, cc. 05, ee. 1.
3 0 Emulsions + serum (rais de cobaye + serum normal non
chauffe,. .
0,01,0,001,0,0001, 0,00001,,0,000001.
On fait autanl de series qu'on a ehoisi de doses d'alexine.
4 0 Emulsions + Sel'Um (rais de cobaye + serllm anti, non
challffe :
0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001, ,0;000001, 0,0000001,
0,00000001, 0,000000001.
~44 Rl1Mi'T/'GJNS nUMORALBS B'r H.eMATIM_gTIUE
On fait autlmt de series 'qu'on a choisi de doses d'ille~iti(l'.
Bien agittlr. Ensement:er 1/00 de centim'etre cube de 1A
premiere des en'iul'sions telltls queUes. Porter les bU'ttN;
pendant 2 hehtes a 3'7 0 , agiter ehsnite et ens'ehlencer.l/20
de centimetre cube de chaque tube dans uh lube 'de gelose
Martin fohduc, que COIl conle eh bolte. L.a repartitioh
homogene des germes est assuree par llgitation de Ia Seluse
dans Ia bolte I Apres 24 heures, oh lit a Ia loupe. Si Ie n6mbi'e
des colonies ne depasse pas Ia centaine, on les compte indi-
viduellement. Lorsqu'elles sont plus nombreuses, on pra-
tique Ia numeration qe plusieurs centimetres carres, au
moyen 'd'un carton perfote. On fait h\ thoyenne et on tnul-
tiplie par Ia valeur de In surface, l:)valuee egalement en cen-
. timetres carres.
Deuxieme procede. - bans cett~ methode, on se propose
d'operer sur un nbmbre de germes constant. Pour main-
tenir ce nombre invariabIe~ iJ convient d'operer a la tem-
perature de 440 qu'i arrete tout developpement mi'Crobien,
et de faire usage tie houillon Martin rcgMl:ire par l'ebul~
lititln, milie\i qui empeche Ia diminution numerique des
bacteries.
Ort cultive les germes pendant 6 a 24 heures it 0.7\ sur
gelose Martin. Oh Ie§! emulsionne dans Ie bouillon M!i.tlih
prealablement bouilli pendant un quart d'htmteJo puis
refrGidi, it raisort de 1 centigmmme par 20 centimetres cubes
de liquide, etc., comme plus huut, mais on opere a 21:40. On
aj'Oute immeui'atem-ent Ie serum, normal ou anli, et Ie com-
plement apres une demi-heure. On ensemehce apres une
heure, sauf la premiere des emulsions.
La dose d'alexine est consid'e.ree comme bonne l'OI"SqUc'la
quantite de ge.rmes obtenu'e apres 24 heures avec h~ premier
procede, ou une heure avec l-e seC'Ond, dans Jes emuisibns
additionnees'de serum d~ cohaycl represehte au moins Ie
tiers de 'CelIe que contiennent les -emulsions temoins, aph~s
Ie meme temps.
Un serum normal bu 'anti 'e'si lCohsider.e cofil1'l1e btzt(l(!ri-
cide .z'OTsque fa quanWe de games obtenue eh fin d' e±pe-
rience IIlvec les emulsions addifionnies d'alexine ci de 'serum
represente, all plus, Ie cinquieme de celle que contiennent~
aP'fes Ie medII! l~fup~, l~ t!JnU'lsion's temoins ttdditirJI'lh-ees
d'ane dose identique d'alexine.
 CHAPITRE XX

SERUMS HEMOLYTIQU~S. - TITRAGE DE L'ALEXINE·

DES ANTI GENES ET DES ANTIOORPS,

A. - S~rUmlj l\~m~lytjqq~s.

10 Pr~par~tion. - On ilJ.ocul~ 4: QU 5 fpi~l A 6 jPllfs

d'interv;lJl(}, sous la p~aq, a un Iflp\n pijf e:ll.e!ll'Pl~, 2 QU
3 centimetres cub~s d'h~m~tiei:i de rooutpn QP'- AI') op~vn~,
pr¢al!!blemen't lflvees au lPoillS dans trois el}m~ physiplQ-
giques 15uccessives.
Ppur faire ce laY?ge, 011 centrif\lge }e sang d~fi.brin~;
on dei:ante Ie serum, on rem place C~lui-~i Pill' H. 2 0 phy~jo~
logique; on remet l~s pematies en suspfm~iQn, QI1 oentri-
fqg~ de n<m"e~\}., ~m <l~c\\~te e\ ~i\}'l>i M suite.
Le serp,m pptppu par slilign~1l (S joP,fs apr~s If! peVllierll
injection d'hematies) d'un animal ainsi trait6 est ina~tiye
par chautrage un~ demi-h(}lJre a J55°.

2Q Titrffg e . ~ Dans une :;erie q!l 10 tll-htl~ ~ ~!j:;fli, q1.)

iptrQdllit, a\l moyen .d'IJ.l)~ pipettl} gl'a9.u¢jl, ~ ceMirpMr~
yube d'ilroul~ip,l} all vipgtiilWll A'ht'wJ.at!flS l!!ye~!j 9.jl mqll-tol}
ou qe ~.hevr~ I et ensJ.lit~, dilPS phaqqe tuqe, d~" gl~ilQ.tHes
VFlrial;>lcs de serum hemoJytig:ue pl'~alapleJIl~nt dHJl4 fJq
1/100, ~;oit par ~4emple 0 cc. 1, 0 ~c. 2, 0 ~c. 3, etc, I ju~qlJ.'A
1 Ctlntim¢trc cul;>e.
:puil) ot} iptroduit dans tOUl> lei? tp.be~, sa\l.f df1J1s fe der~
nier, nne quantite fixe d'al~xine ; 46l+i} Q,QS!!S ll1inilPa q,'a-
lexine prealablement titr~e ,a:vep 1111 &erum ¢tpl.on.
On egalise dans tous les tubes (2,5 centimetres cubes) par
addition d'eau salce physiologique et on porte a I'etuve a
37 0 pendant une demi-heure;

1. On peut stabiliser les hematies de u1ammifer.es .et ies cons,crver penda,nt au nloi.ns
deux semaines it. Ia temperature dtJ_ labor~toire en les Il)ett;tnt el). ~lJspenslQn da.ns de
l'eau physiologique additionnee de 2 p, 1.000 de formol (Armand-D.tille et Launoy).
246 REACTIONS HUMORALES ET;_HEMATIMETRIE

Apres ce delai, on note a partir de quel taux de serum

hcmolytique l'hemolyse est totale.
Pour les reactions de Wassermann ou les titrages d'anti-
corps et d'alexine, on utilisera toujours, comme dose nor-
male de serum hemolylique, une dose egafe d 10 {ois fa dose
minima hemolytique.
Le seru\ll hemolytique chauffe sera reparti en fla,cons ou
en ampoufes, et conserve a Ia glaciere. II garde pendant
tres longtemps Ie meme pouvoir hemolytique. 11 n'est done
pas necessaire de Ie titrer avant chaque serie d'experiences,
mais seulement chaque mois environ.
On peut ohtenir plus rapidement des serums hemoIy-
tiques lapin anti-chevra ou anti-mouton par exemple, en
inoculant au lapin. par voie veineuse, 3 a 5 centimetres
cubes d'emulsion d'hematies de chevre ou de mouton lavees,
puis, 6 a 8 jours apres, encore par ,voie intraveilleuse,la meme
dose, et enfin, 6 a 8 jours apres, 5 centimetres cubes de Ia
meme emulsion, ceUe fois par voie peritoneale. On attend
8 jours et on saigne l'animal.
H. Sachs injecte deux fois, a 8 jours d'intervalle, 30 centi-
metres cubes de sang defihrine et lave dans Ie peritoine.
9 a 10 jours apres la seconde injection l'animal peut etre
saigne.
Pour preparer a la fois de grosses quantites de serum
hemolytique, on a recours, dans les granqs lahoratoires,
au cheval, qu'on charge avec des globules d~ mouton. Il est
necessaire de pratiquer 5 a 7 injections sous-cutanees de 10
a 15 centimetres cubes de globules, tous les 6 jours environ.
On saigne Ie cheval 8 jours apres Ia derniere injection.
Pour avoir Ia plus grande quantite possible de serum sans
recharger Ie cheval, on peut lui faire une premiere saignee
de 6Iitres, puis deux saignees de 4 litres a 4 jours d'inter-
valle. Les serums des deux premieres saignees presentent a
peu pres Ie meme pouvoir hemolytique. Celui de la troi-
sieme saignee est legerement inferieur.

B. - Titrage de l'alexine.
On dispose d'un serum hemolytique inactive de puis-
sance hemolytique exactement connue.
 TITRAGE DE L'ALEXINE ET DES ANTIGENES' 247

L'alexine est fournie par Ie serum frais de cobaye .. Nous

avons deja indique comment on pouvait se Ie pro'curer:
L'activite de cette alexine doit etre titree avant chaque
reaction, car sa valeur varie d'un cobaye a l'autre. Par cetle
operation, on determine la dose minima, variable avec
chaque alexine, qui permettra de deceler les plus faibles
traces d'anticorps ou d'hemolysine.
Pour titrer l'alex.ine, on fait une dilution au 1/15 du
serum de cobaye dans de l'eau salee physiologique a 8,5 de
i?el marin p. 1.000. On introduit, dans une serie'de tubes,
occ. 05, 0 cc. 1,0 cc. 2, jusqu'a 0 cc. 5 de cette dilution. On
ramene, dans chaque tube, Ie volume total a 2 cc. 5 en com-
pletant avec de l'eau salee physiologique. On agite chaque
tube pour assurer Ie melange et on porte les supports a
l'etuve pendant 1 heure 1.
On ajoute :1lors partout 10 doses minima de sensibilisa-
trice hemolytique et une goutte de l'emulsion de globules.
Au bout d'une demi-heure de sejour a l'etuve a 370, on lit
les resultats. La dose d'alexine active est indiquee par Ie
premier tube de la serie OU l'on constate l'hemolyse. On
prend cette dose comme dose minima dans les experiences
de fixation.
Si on conserve une provision d'alexine pendant plusieurs·
jours it la glaciere, il est indispensable de la titrer avant
chaque operation.

••*
C. - • Titrage des antigenes.
Tout anti gene doit eire titre aU point de vue de. son pouvoir
anlicompiemenlaire et au point de vue de sa valelll' antigene.
a) Titrage du pouvoir anticomplementaire (absor-
bant ou empechanl). - Avant de pratiquer toule reaction de
deviation, il faut determiner la dose a laquelle l'antigene
fixe a lui seulla quantite d'alexine employee pour produire
l'hemolyse.

1. It est neccssairc de procedcr ainsi, Calmclle, Massol et Gryse::. ayant monfni que
falexine dll"ee. conservee d l'eluvc pendant une heure (temps exige pour In fixation du~
comple..'(e : anticorps-alexine, dans In reaction de deviation du complement), pel'd enui ..
ron la moitie de son activite.
24~ REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

Pour operer ce titrage, on dilue l'antigenc (extrait ou

emulsion concentree de microbes) avec des quantites crois-
santes d'eau physiologique : 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40,
1/50/ etc. On prend une quantite fixe de chacune de ces
dilutions, soit 1 centimetre cube, qu'ou met en presence de
doses croissantes d'alexine a partir de la dose minima. On
complete au volume total de 2 cc. 5 avec de l'eau sah\e phy-
siologique et, apres avoir agite les tubes, on les porte a
l'Huve a 37 0 OU on les laisse une heure. Au bout de ce
temps de contact, on ajoute Ie systeme hemolytique :
1 goutte d'emulsion de globules et 10 doses mipima de sen-
sibilisatrice hemolytique. On agite chaque tube et on reporte
les supports a l'etuve it 37 0 • Apres un sejouf d'une demi-
heure, on les retire et on lit les resultats.
On prend, pour effectucr les reactions de deviation, la
dilution d'antigene qui n'a pas exerce de pouvoir empechallt
a partir de la dose minima d'alexine.
Les extraits (alcooliques, glyceriniques, etc.) peuvent
Mre titres une fnis pour toutes au point de vuede leur pou-
voir anticomplementaire. Cependant, il est prudent' de
recommencer Ie titrage de temps en temps, car, pour les
extraits alcooliques, Ie pouvoir empeehant peut legerement
augmenter apres un certain delai de conservation.

b) Titrage de la valeur d'un antigene. - Pour mesu-

rer la valeur d'un antigene, il faut dispose~ d'un serum type
dont on connait la richesse en anticorps. De deux antigenes,
Ie meilleur sera celui qui permettra ..de deceler la plus
grande quantite d'anticorps dans un serum,donne. Le titrage
de la valeur d'un antigene peut se faire par deux methodes
i:lifferentes :
1 0 En faisant croitre les doses d'alexine en presence d'une
dose fixe d'antigene ;
!.!o En faisant decroitre les quantites d'antigene en pre-
sence d'une dose fixe d'alexine.
10 bose fixe d' anligene, doses croissanles d' alexine. - Pour
ne pas etre oblige d'cmploycr de trop grandes quantites
d'alexine, il est prudent de prendre une dilution d'antigenc
assez ¢tendue, sinon on risquerait de ne pas arriver a la
limite du pouvoir deviant de l'antigene.
On fait agir une quantite fixe de la dilution de l'antigene,
 ;-

T1TRAGE, DE L'ALEXINE ET DES AN1'lGENES 24!)

par exemple 1 centimetre cupe de la dilution au 1/100, et

une quantite fixe, par exemple 0 cc. 5 d'uu serum connu,
chauffe 30 minutes a 56 0 , en presence de doses croissantes
d'alexine, a partir de la dose minima. Des tubes temoins
revoivent separement l'antigt'me seul et Ie serum seul avec
les memes doses d'alexine. On complete partout au volume
total de 2 cc. 5 avec de l'eim salee physiologique ; on place
les tubes a l'efuve a 37 0 pendant une heure. On les en retire
pour ajouter Ie systeme hemolytique ; on les replace a
l'etuve pendant une demi-heure, puis on lit Jes resultats.
La valeur de l'antigene s'apprecie par Ie rapport
N nombre de doses d'alexine deviees.
V = volume de l'anligene employe.

Si 0 cc. 01 d'antigene a devie 8 doses minima d'alexine,

l'unite de volume de cet antigene devie 800 unites d'ale-
Xlne.
Si Ie systeme hemolytique reste constant, la valeur d'un
antigene, determinee en presence d'un serum type, reste
constante.
2 Do~es dicroissanies d'antigene ; doses fixes d'alexine.-
0

Dans une serie de 10 tubesl on introduit des doses variables,

0,1,0,2,O,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,lcentimetrecubede
la dilution d'antigene dont on veut determiner la valeur.
Chaque tube revoit en suite la meme dose d'un serum a anti-
corps, inactive par un chauffage de 30 minutes a 56°, et Itt
meme dose d'alexine de cobaye, prealablement titree, soit
deux doses minima. On fait des tubes temoins avec Ia dose
fixe de serum et avec les doses decroissantes d'antigene
employees, puis on procede comme il a ete dit plus haut.

.,. * ,.

D. - Titrage des anticorps ou sensibilisatrices

dans un serum anti.
(TECHNIQUE DE CALMETTE ET MASSOL.)

A. - Un~ premiere serie comprend trois tubes qui

revoivent chacun une dose fixe d'antigene titre (par exemple
1 centimetre cupe de dilution au 1/20 d'antigene tubercu-
leux).
250 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

B. - Vne deuxieme serie de trois tubes dont chacun

re<;oit 0 cc. 5 du serum a anticorps a etudier.
C. - Uoc troisieme serie comprend cioq tubes .au moins.
Chacun re<;oit la dose d'antigene de la serie A, plus la dose
de serum a anticorps (0 cc. 5) de la serie B.
Dans chacun des tubes des trois series on ajonte des
doses d'alexine allant en croissant de tube en tub~, en pre-
nant pour dose initiale la dose minima active, c'est-iJ.-dirc
celie qui permet l'hemolyse du complexe hematies plus
serum ,hemolytique inactive (10 doses minima de ce
dernier) ; par exemple 0 cc 1, 0 cc. 2, 0 cc. 3, ..... 0 cc. 5.
On complete partout au volume de 2 cc. 5 avec H20
physiologique a 8 gr. 5 de NaCI pour 1.000, en ayant soin de
faire tourner les tubes entre les doigts, de maniere a entrai-
ner toute l'alexine dont une partie ,aurait pu rester adherente
ala paroi.
Le support con tenant ainsi les trois series de tubes est
porte a l'etuve a 37 0 pendant une heure, puis on ajoute, dans
chaque tube, une goutte de l'emulsion d'hematies lavees de
mouton et ensuite une quantite de serum hemolytique
inactive anti-mouton representant 10 fois la dose minima
hemolytique (par exemple 0 cc. 1 d'un serum dont 0 cc. 01
est la dose minima hemolytique). '
On reporte a l'etuve a 37 0 pendant une demi-heute. On
lit alors les resultats. I
La reaction de fixation est posilive, - donc demontrant
la presence d'anticorps, - si l'alexine deviee par Ie melange
antigene plus serum a etudier (serie C) est superieute aux
volumes d'alexine devies respectivement par l'antigene et
par l'anticorps (series A et B).
Si un volume VduserumetudiedevieN doses minima d'a-
lexine, Ie rapport ~ represente Ie nombre de doses minima
d'alexine que peut devier 1 centimetre cube de serum anti.

E. - Conglutination globulaire"
BOl'del et Gay ont montre la presence, dans Ie serum de
bamf, d'une substance capable d'agglutiner divers globules
rouges prealablement soumis a l'action d'une sensibilisatrice
 TITRAGE DE L'ALEXINE ET DES ANTIGENES 251
hemolytique et d'une alexine. Ils I'ont appelee conglutinine
et Ie pbenomene a pris Ie nom de conglutination. Ce dernier
constitue un procede de sero-diagnostic au meme titre que
l'hcmolyse dans Ia fixation du complement.
D'apres Brocq-Roqsseu, Urbain et Cauchemez, la technique
de la reaction est la suivante : on met en presence Ie serum
suspect, challffe 30 minutes a 550 (serum humain) ou 60-
(serum animal), un extrait ba<:illaire, du serum frais de
cheval, du serum de beeuf chauffe 30 minutes a 60 0 et des
globules de mouton.
Le serum de beeuf conglutine les globules de mouton it
condition que ceux-ci aient cte sensibiIises et alexines; Ie
serum frais de cheval remplit ce double office.
Le mecanisme de la reaction est Ie meme que celui de la
deviation du complement; Ie serum a examiner 'renferme
une sensibilisatrice; celle-cise fixe surl'antigene utilise, qui
fixe a son tour I'alexine. Si on ajoute ensuite Ie serum de
beeuf et les globules de mouton, la conglutination ne se pro~
duit pas, l'alexine n'etant plus libre pouragir sur les globules
de mouton. Cctte absence de conglutination signifie donc
que Ie serum provient d'un sujet infecte. Dans Ie cas con-
traire, si Ie sujet est sain, son serum ne renferme pas de
sensibilisatrice, l'alexine reste Iibre et eUe peut se fixer sur
les globules, en meme temps que l'ambocepteur heniolytique
du serum de cheval normal. Les globules ainsi sensibilises
et alexines sont conglutines par Ie serum de beeuf. Le phe-
nomene de conglutination signifie donc que Ie serum pro-
vient d'un sujet sain.
On dispose les divers elements selon Ie tableau de
la page suivante.
La conglutination apparaU quelquefois au sortir de
l'etuve, mais, orqinairement, il faut un temps de sejour
de quelques heures a Ia tempe"rature du laboratoire, pour
qu'elIe se manifeste. Elle doit toujours apparaitre dans les
tubes 2, 3, et quelquefois 4 de Ia reaction type, et dans
6, 7, et parfois 8, des temoins antigcnes; elIe ne doit
pas exister dans les tubes 1 (temoin alexine seule) et
1 bis (temoin serum seul) (Brocq-Roll.,sseu, A. Urbain et
Cauchemez) .
Cette reaction a ete appliquee avec de bons resultats au
diagnostic de la morve.
252 REACTIoNS HUMORALES BT HEMATIMETRIE

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Temoiu 1\-
lexine ..•.. 1 0,1 0,9 0,1
Temoin se
rum seIl1 .... lbis 0,01 0,99 O,l
Tem()in rEi-) 2 0,1 0,9 0,01 0,1
action de 3 0,1 0,9 0,02 0,1
•c.ong1 utina - 4 0,1 0,9 0,03 0,1
lion type .. 5 0,1 0,9 O,O~ 0,1
6 0,01 0,1 0,89 0,01 0,1
Temoins an'\ 7 0,02 0.1 0,88 0.02 0,1
ti_gene ..••. ( 8 0,03 0,1 0,87 0,03 0,1
9 0,01 0,01 0,1 0,88 0,01 0,1
ItEiac t i"u 10 0,02 0,02 0,1 0,86 0,02 0,1
propremenl 11 0,03 0,03 0,1 0.84 0,03 0,1
dile._ ..... 12 0,04 0,1)4 0,1 0.82 O,o~ 0,1
 CHAPITim XXI
REAC'T1tJN bE BOhbET-WASSERMANN Et PREPARATION
- DES ANTI'G,:P;NES SYPHlLITIQUES.

A. - Preparation de l'nntigene syphilitique.

a) Extrail alcQoliq'l1e de ./oie de nouveau-nes syphiiitiques•
._ On triture soigneusement au hache-viande d'ahord, pui~
,au hroyEtur Latapie 1, des fragm,ents de foie. On etale cette
pulpe en couche mince. dans des cuvettes en verre ou en
'porcelalne pt;ealabiement sterilisees par flambage rapide, e't
on les porte dans 1a cloche a vide sulfurique pour les desse-
,cher dans Ie.plus bref deIai possible.
On recolte 1a _pulpe seche qu'on reduit en poudre par
hroyage au mortier. ~tte poudre est traitee par l'alcool
absolu a raison de lOsrammes de poudre pour 100 grammes
d'alcool. '
On Jais-se macerer au moins 24 heures dans un flacoQ.
houche qu'on agite . de temps en temps, puis on filtre. 01]
abtient ainsi nne solution mere qu'on repartit en flacons et
.gu'on peut conserver pendant tres Iongtemps.
Pour s'en setvlr, on l'etend d'eau physiologique dans 1a
p,roportioR de 1 partie de solution mery pour 3 ou 4 parties
d'eau salee. 11 faut, eu general, 0 ce. 2 a 0 ee. 25 de eeUe di...
lution pour chaque reaction, mais on doit s'assurer, par un
titrage prealable (voir cbapitre xx, pouvoiF fixateur des
antigenes), que cet~e -dose ne fixe pas a eUe seule nne trop
grande quantite d'aJexine. Si c~est lH~cessaire, on dilue
davantage 1a solution mere.
b) Extrail alcoolique de camr de veau. Methode de Bordel
et Ruelens. - Ces auteurs traitent d'abord 1e creur de v~au
par l'acetone, rejettent ce prem~er !xtrait et epuisent ensuit~
254 R£ACTIONS HUMORALES fT H£MATIM£TRIE

Ie meme organe par de l'alcool; ce second extrait est uti-

lise pour les serodiagnostics.
On commence par hacher Ie tissu musculaire cardiaque,
en prenant soin de ne pas en exprimer Ie suc. On ajoute
125 centimetres cubes d'alcool a 95 0 a 100 grammes de
cceur hache, et on agite. Cet alcool, ajoute en proportion re-
lativement faible, n'a pas de pouvoir dissolvant sensible sur
les lipoides; il coagule les albuminoides. Apres quelques
jours de contact a la temperature ordinaire, on jette Ie tout
sur un filtre. Apres egouttage, on enleve du filtre Ie tissu; on
I'etale sur un cristallisoir qu'on porte a l'etuve a 37 pendant
0

un jour: Ie tissu, coagule et antiseptise par l'alcool, se desse-

che tres vite sans subir aucune alteration. Le tissu sec est
mis dans un flacon dans lequel on introduit 200 centimetres
cubes d'acetone; il y sejourne environ une semaine a une
temperature de 18 a 20 0 • On elimine alors l'acetone, on
laisse egoutter, on ajoute encore un peu d'acetone, on
maintient un jour dans ce reactif qui, rin~ant Ie tissu,
enleve les dernieres traces des substances solubles. On
jette de nouveau sur un fiItre; Ie tissu egoutte est deharrasse
completement de l'acetone'par un sejour de quelques heures
a l'etuve, puis transporte en flacon dans lequel on verse
200 ~entimetres cubes d'aicool a 95 0 • On maintient pendant
8 a 10 jours a la temperature de 200 environ. Le liquide
ainsi obteI1U, filtre, est l'antigene. II a une teintejaune d'or.
Au moment de l'emploi, cet antigene doit ~tre emuisionne
dans de l'eau physiologique, determine par Ie titrage:
entre Ie 1/20 et Ie 1/40.
Avoir soin d'ajouter l'eau physiologique ~ l'extrait alcoo"-
lique, d'ab6rd goutte a goutte en agitant constamment,
puis, plus rapidelJlent, quand Ie precipite louche apparait,
en agitant toujours Ie melange.
Le liquide n'a aucun pouvoir -anticomplementaire. Cet
antigene est considerablement plus actif que l'extrait alcoo-
lique total.

c) Ext/'ait afcoolique de cam/' hllmain additionne de chofes-

tiI·ine. - On peut aussi, selon Ie procede de Walke/' et
Swift, preparer un antigene avec du cceur humain addi-
tionne de cholesterine, en operant de la maniere suivante':
Le creur, soigneusement deharrasse de graisse, estdecoupe
 PREPARATION DES ANTIGENES SYPHILITIQUES 255

en mince~ fragments, pese et immerge dans de l'alcool

absolu. La proportion doit etre de 1 gramme de tissu car-
diaque pour 10 centimetres cubes d'aicool. On Iaisse mace-
rer pendant deux semaines a 37°, dans un bocai bouche
a l'emeri qu'on agite piusieurs fois chaque jour. Apres ce
deIai, on sort Ie bocal de l'Ctuve et on Ie conserve 'jusqn'a
refroidissement a Ia temperature du Iaboratoire. On filtre
sur papier Berzelius et on ajoute au liquide nne quantite
de cholesterine pure, correspondant a 0 gr. 4 pour 100 cen-
timetres cubes d'extrait alcoolique.
Cet extrait s'emploie dilue au dixi~me dans l'eau salee
physioIogique a 9 gr. 50 de NaCI par litre, a la dose de
occ. 25 pour chaque reaction.

B. - Technique de Calmette et Massol pour la reaction

de Bordet-Wassermann.

La reaction de Bordet-Wassermann, pratiquee selon la

technique de Calmette et Massol, necessite la preparation
et Ie titrage des divers elements suivants : hematies lavees,
serum hcmolytique, alexine de cobaye et antigene (au point
de vue de son pouvoir anticomplementaireet de son pouvoir
antigene)~ Pour ces diverses operations, se reporter aux
techniques precedemment indiquees.
Pour avoir 4 ou 5 centimetres cubes de serum, il faut pre-
lever 10 a 12 centimetres cubes de sang. On chauffe Ie serum
a 56 0 pendant ·30 minutes pour l'inactiyer. II est inutile de
chauffer Ie liquide cephalo-rachidien, a moins qu'il ne con-
tienne du sang. Si on dispose d'une quantite de serum suf:
fisante, il y a avantage a employer 0 cc. 5 de serum par tube
pour conipenser les alterations qui peuvent etre causees
par Ie chauffage, sinon on prend 0 cc. 3 ou 0 cc. 2.
Comme nous l'avons deja expose, Ie principe de la
methode consiste a meUre une dose fixe de serum a ctndier,
accOl;npagnee d'nne dose fixe d'antigene syphilitique, en
presence de quantites croissantes d'alexine.
La reaction se fait de la maniere suivante :
Le serum inactive a etudier ou Ie liqnide cephalo-rachi-
251l IU5AC1'loNS HUMORALES ET HEMf11'IMETRIE

g = :: PI! A ...... ""' .

1"""4~""....-4"'"'
00000"

...............

J PI: ::: ::: =

"
~C'I":)C't....-l
,....; rl""'-';"-;''I""'l

J A ~ ~ ~
"
..... e-.O'o-!l'1.ti>
00000

U A A ::::; ~

"
tt:I'-OlC~~
00000

d :: ~ ~ A

"
~\OlO\.!)tn

0000(;:)"

\
~

«<
....
 DILUTION GLOBULAIRE FRAICHEMENT FAITE OU AGITEE

Int acte. H emolysee.

Liqu ide opaque. Liquide la que tra nspare nt.

DILUTION GLOBULAIRE
APRES SEDIMENTATION OU CENTRIFUGATION

,.
.....'

H emo lyse nulle. H emolyse legere. H emolyse inco mplete. H emolyse tot ale.
Deviation co mpl et e. Deviation part iell e. Deviation legere. Deviation null e.
+++ ++ +

Pl anc he extr ai te de : A IL\1.\;,\D- L) ELlLLE ET ='J E(j RE .

T cc1l1Jiq ll c d e J.l rC.lclioJl d e! dCl'i Jtio ll dll {'u mp lcm eIlL
 PREPARATION DES ANTIGENES SYPHILITIQUES 257

dien a la dose constante de 0 cc. 5 et l'antigene it Ia dose

°
constante de 0 cc. 5 de la dilution, determim!e par Ie titrage
prealable, sont mis ~n presence de 0 ce. 1, cc. 2, 0 cc. 3,
o cc. 4, 0 cc. 5 d'alexine diluee (0 cc. 1 Mant la dose
minima). On fait trois tubes temoins serum et trois ,tubes
temoins antigene avec 0,1, 0,2 et 0,3 d'alexine. On com-
plete dan!) chaque tube, avec de l'eau salee physiologique,
au volume total de 2 ce. 5. On agite chaque tube et op.
porte it l'etuve a 37 0 pendant une heure.
On ajoute ensuite Ie systeme hemolytique (1 goutte -de
globules et Hfdoses de sensibilisatriee hemolytique) et on
porte a l'etuve a 37 0 pendant une demi-heure.
La lecture· des resultats est faite a ce moment. Elle inai-
que Ie nombre d'unites d'alexine deviees separement par l,e
serum et par l'antigene d'une part (tubes temoins) et par
Ie melange serum-antigene d'autre part; en cas de reaction
positive, elle donne Ie nombre d'unites d'alexine deviees.
La quantite d'anticor.ps contenus dans Ie serum s'exprime
par Ie rappor t N .,
V qm represente Ie nom Bre _dOd "
e oses nllmma
d'alexine que ,peut devier 1 centimetre cube de serum anti.

C. - Technique de l'Institut Pasteur par Ie procede

rapide, Hecht, Levaditi, Latapie, remanie par
Weinberg et Mutermilch.

I. Reactifs. - 10 Anligene de Bordet ,et Ruelf;ns. -

Avant ~on emploi, cel antigene sera emulsionne dan~ de
l'eau physioIogique, dans des proportions variant de 1/20 a
1/40. Toutefois, avant de mettre un nouvel antigene en
~irculationl il est preferable de Ie titrer et de Ie comparer
avec un antigene deja eprouve.
Ce titrage sera fait comme il a ete indique (chap. xx, C).
Un bon antigeqe ne doit pas posseder de proprietes
anticomplementaires meme en solutions concentrees; il doit
etre suffisamment sensible pour fixer l'alexine en presence
des serums syphilitiques, meme quand il est tres dilue-.
Pour preparer une emulsion de l'antigene dans de l'eau
MJCROBIOLOGIE 17
258 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

physiologique, iI faut ajouter de l'eau it l'antigene (et non

!'antigene it l'eau), d'ahord tres lentement, par gouttes, en
agitant constamment l'emulsion. Quand la quantite d'eau
ajoutee a deja. atteint 2 a. 3 {ois Ie volume de l'antigene, on
peut continuer avec moins de precaution, un peu plus
rapidement. mais en agitant toujours Ie melange.
2 0 Les serumshumains soumisa l'examen seront emproyes
a 1'etat actif, c'est-a-dire frais.
30 Emp~oyer nne emulsion a 5%, dans l'eau physiolo-
gique. de globules de mouton laves.

II. Reaction de fixation de I'alexine. - Six tubes a

hemolyse sont necessaires pour chaque'reaction : la serie
des trois premiers tubes servira pour Ia reaction de fixation' ;
celle des trois autres tubes, qu'on disposera de preferenqe
derriere la premiere serie, servira pour Ia determination
de I'index hemolytique.
Les deux premiers tuhes de Ia premiere serie re~oivent
respeetivement 0 ce. 1 et 0 cc. 2 d'antigene, 0 cc. 2 et 0 cc. 1
d'eau physiologique et 0 cc. 1 de serum a examiner; Ie troi-
sieme tube, qui sert de temOln, re~oitO cc. 1 de serum humain
et 0 cc. 3 d'eau salee. chacun des trois tubes de la seconde
serie, qui servira pour 1a determination de l'index hemoly-
tique, re~oit tout d'abord 0 ce. 1 de serum a,examiner. Puis on
ajouteachaquetube respeetivemcl?t Oee. 3,0 ce. ~ etOce. ~
de globules de mouton a. 5%; Ie tout est agite et mis a l' etuve
a 37 0 pendant une heure et demie. On ajoutera ensuite aux
trois t.ubes de la premiere serie des quantites de globules de
mouton variables seion que l'index hemoIytiqu!l est fort ou
faible : en effet, si 0 ce. 1 de serum humain n'hemolyse que
oce. 3 de globules de mouton au maximum, op ajoutera, a
ia fin de la reaction, it chacun des trois premiers tubes, 0 c~. 1
de sang de mouton; si 0 ce. 1 de serum humain est capable
d'hemolyser 0 cc. 6 de globules, c'est-a.-dire si l'index hemo-
lytique du serum est egal a. 6, on ajoutera 0 cc. 2 de globules
de mouton ; si enlin l'index hemolytique est egal a. 9, on
ajoutera toujours un tiers du maximum, c'est-a-dire 0,3
d'emulsion globuIaire.
Si !'index hemolytique du serum soumis a l'exam()n est
egal a zero, cela signifie que ce serum ne renferme pas
d'alexine normals (cas Ie plus frequent), ou de sensibi-
 PREPARATION DES ANTIGENES SYPHILITIQUES 259

lisatrice anti-mouton, ou enfin ces deux substances a la

fois.
Dans ce cas, on est oblige de recourir aux methodes basees
sur la reaction classique de Bordet-Wassermann (methode
Calmette et Massol) OU l'on se sert d'alexine de cobaye et de
sensibilisatri~e anti-mouton. On peut aussi employer l'a-
lexine et l'hemolysine normales contenues dans un serum
humain negatif, frais.

Reaction de fixation de l'alexine par Ie procede

dit rapide.

_Eau physiologiq:ue Antigen. Serum a exa"miner Globules de mouton a 5 %

0,2 0,1 0,1 0,1 ou 0,2 ou 0,3

0,1 0,2 0.1 0.1 on 0,2 au 0,3
0,3 0.1 0,1 on 0.2 on 0,3
1 h. 1/2 a 37· selon qllO I'jndexhtlmoly.
ti<Jue est egal a 0.3·0.6
on a 0,7
30' :i 40' ii. 370.

Tableau d'une determination de l'index hemolytique.

SerLJUl it exalPiner Globules de mouton it 5 %

0,1 0,3
0,1 0,6.
0,1 0.9
 CHAPITRE XXII

RECHERCHE ET TITRAGE DES ANTICORPS

TUBERCULEUX,

A. - Preparation des anti genes tuberculeux.

a) Extrait peptone B2 de Calmelle el Massol. - On fait

macerer, penda,nt 48 heures, au bain-marie a 65 0 , 5 grammcs
de baeilles sees, prealablement laves, dans 100 centimetres
cubes d'une solution de peptone de Witte a 10 p. 100 dans
l'eau distillee (Ia teneur en peptone dela tunerculine brute de
Koch est de 10 p. 100), On separe ensuite Ie liquide des mi-
crobes par filtration, et on Ie repartit en flacons ou en am-
poules,
Cet antigene est un veritable extra it de bacilles de Koch,
depourvu des substances complexes inactives ou empechan-
tes que renferme la tuberculine, II decele les moindres quan-
tites d'anticorps contenues dans les divets serums de sujets
tuberculeux, I

Pour l'emploi, on Ie dilue au 1/10 dans l'eau physiologique

et on ajoute, a chaque tube de reaction,l centimetre cube
de ceUe dilution.
b) Anligble a ['amf de Besredka, - La culture en profon-
deur du bacille tuberculeux, dans un milieu liquide a l'amf. a
permis a Besredka de preparer un an tigene doue d'une gra nde
sensibilite. On emploie, a cet effet,une culture de quatre jours
de bacilles tuberculeux humains dans Ie bouillon a l'reuf
reparti a raison de 50 centimetres cubes par boitede Roux.
Apres sterilisation par un chauffage de trente minutes a
1000 , on laisse pendant vingt-quatre heures les bacilles se
deposer au fond de'la boite, puis on decante et on centrifuge
Ie depOt; Ie culot ainsi obtenu est dilue dans 4 centimetres
cubes d'eau physiologique. La suspension nllcrobienne est
ensuite sou mise, au moins pendant deux heures, a une agi-
 TITFlAGE DES ANTICORPS TUBERCULEUX 261

tation mecanique dans un tube de verre muni de billes de

verre. Finalement, ttIle est diluee dans trente fois son volume
d'eau physiologique a 9 p. 1.000.
D'apres Urbain, la partie active de l'antigene a l'reuf
recemment prepare avec une culture de quatre jours, est
constituee par les corps microbiens emulsionnes. Au con-
traire, dans une emulsion ancienne, c'est Ie liquide separe
par centrifugation qui devient seul actif, comme nous
l'avons constate: les bacilles tuberculeux, remis en emulsion
dans l'cau physiologique, ne devient plus que tres faible-
ment l'alexine.
L'antigene de'Besredka prepare depuis 2 ou 3 mois se
comporte donc comme un extra it bacillaire. Sa sensibilite
se conserverait intacte pendant au minimum 15 mois.
c) Anligene melhylique de Boqp.el et Negre. - Des ba-
cilles humains et bovins provenant 'de cultures sur bouil-
lon glycerine, agees de 6 semaines, sont sterilises par
un chauffage de trente.minutes a 120 0 , filtres sur papier
et melanges en parties egales. Les corps bacillaires sont
en suite laves a l'eau distillee sur Ie filtre, puis desse-
ches. a l'etuve ou dans la cloche a vide.
Les microbes secs sont traites par de l'acetone pendant
24 heures (1 centimetre cube d'acetone par centigram me
de bacilles), desseches de nouveau et, finalement, mis a
macerer dans l'alcool methylique a 99 0 (1 centimetre cube
d'alcool par centigramme de bacilIes) I.
On laisse en contact pendant dix a douze jours a 37 0 -38 0 ,
en agitant frequemment. Le liquide, separe du depOt micro-
bien par filtration, constitue l'antigene tuberculeux qui doit
eire employe a la dose d'un vingtieme de centimetre cube,
soit 1 centimetre cube de la dilution au vingtieme dans l'eau
pbysiologique. Le pouvoir anticomplementaire de ceUe dilu-
tion est a pen pres equivalent a celui de l'antigene de Bes-
redka. Comme pour ce dernier, il disparait en presence du
serum normal.
Les extraits methyliques doivent etre conserves a l'abride
la lumiere et de l'air, it cause de leurpouvoir hygroscopique.
11s fournissent, a froid, un precipite assez abondant qui se

1. II est indispensable d'employer de l'alcool methylique a 99', l'action dissolvante

des alcools it titre plu .. faible etant presque nulle.
262 REACTIONS HUMORA'LES ET HEMATIMETRIE

d6pose sous la forme de peti tes masses blanches; et se redis-

sout entierement lorsque Ie Iiquide est porte it 45°-:50 0 1 '
Au moment de l' emploi, 1'arttigene methylique, rerldu lim-
pide par un sejour dt\ quelques minutes al'etuve ou au l!ain-
marie a 50 0 , est preleve avec une pipette seche et verse dans
un verre sec. II est additionne, d'ahord goutte a gouue, puis
plus rapidement; d'eau physiologique; dans les proportions
indiquees. L'emulsion doitetretrouB}e et opalescente. Pour
eviter les echecs. il est indispensable de se conformer it cette
technique.
Les extraits ainsi prepares ont une flctivite pluS grande
que-les extraits tnethyliques directs tels que'Petrof les avait
realises. Leur sensibilite est equivalente·a celle de l'extrait
peptone de Calmelie et Massol et de l'antigene a l'mat de Bes-
redka. lIs f()urnissent une reaction positive avec les serums
des trtberculeux, 1:1ler1J.e en presence de tres faibles quantites
d'ahticorps. lIs offrent I'd vantage d'une prepatll.tidt1 facil~ et
<t'une cohServatioh indefinie. On pertt se les procurer ti
l'Irtstitut Pasteur.

.. ....
B. - Technique de Calmette et Massot pour la recherche
. des anticorps tuberculeux.
I
La methode de Calmetle el Ma~sol, appliquee au Wrage des
anticorps tuberculeax darts ie serum des rnaiades, C()tnpotte
trois sMies de tubes: In premiere, de 5 tube!; ou davahfage,
l'c«;Dit une quantile fixe, soit 0 cc. 2 du serum a eptouver,
iMctive par chautfage pendant II'}. heute a 55 0 et une quan-
tite fixe de l'antiget1e methylique, soit 1 centimetre cube de
Ia dilution au 1/20; Ia 26 serie de trois tUbes (temoins Serultl)'
r~<;-oitlatheme quarltite de serUlit queles tubes de In 11'11 serie,
soit 0 ce. 2. La 3" serie de 3 tubes (temoins antigene) tec;oif
ld meme quantile d'antigene que les -tubes de la 1ra setie,
soit 1 centimetre cube.
Dans chaque tube des trois seties, on ajoute ensuite d~s
doses croissantes d'alexine:1 partir de fa dose minima.
On complete partout aU volume total de 2 cc. 5 avec' de
l' cau salee physiologique a 8,5 p. 1.000 et on agite soigneu-
sement chaque tube pour assurer l'homogeneite du melange.
TITRAGE DES ANTICORPS TUBERCULEUX 263

e• A" " • " A

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1"""11"""11"""11"""11"""1
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Wn.IllS 'W\lJj Im\JS!luu ·WllJ.
264 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

• Les supports contenant les trois series de tubes son_t pla-

ces a l'etuve a 37 0 pendant une hel4re. puis on ajoute. dans
chaque tube, une goutte d'emulsion d'hematies lavees et une
quantite de serum hemolytique, representant 10 fois la dose
minima active, Les tubes sont de nouveau agites, reportes
a l'etnve a 37 0 et examines au bout d'nne demi-heure.
Le pouvoir anticomplementaire de l'antigene methylique
est pratiquement negligeable, puisqu'il disparait SOllS la
seule action du ser,um normal chauf}"e (serums negatifs), II
n'y a donc pas lieu d'en. tenir compte. Les seuls serums
consideres comme pCtlsitifs sont ceux qui fixent nettement
une quantite d'alexine superieure it Ja quantite d'alexine
deviee dans les tubes temoins ne contenant que du serum.
Si un volume V du serum it etud-ier devie N doses minima
d'alexine, Ie rapport ~ exprime Ie nombrc de doses d'a-
Iexine fixees par l'llnite de volume du serum, en l'cspecc Ie
centimetre cube: soit, par exemple, un seru~ fixant 3 doses
minima, Ie rapport ~ = 0~5 = 6 represente Ie nombre de
doses minima d'alexine fixees par 1 cc. de serum:
Les divers serums, titres avec un meme antigene et un
meme systeme hemolytique, peuvent etre ainsi compares
entre ellX d'apres Ie nombre d'unites d' alexine qu'ils devient.

Temoin" Serum Temoins Antigene

_,_____ ~-----

Fig. 20. - Di~Eositif pour Ia reaction de deviation du complement par In methode de

CalmeUe et Massol. Le melange Serum + Antigime n dcvie 4 doses minima d'u-
lexine. Toll'S les tubes temoins sont hemolyses.
 TlTRAGE DES ANTICOflPS TUBERCULP;UX 265

C. - Application de la technique de I'lnstitut Pasteur

pour Ia reactioh de Bordet-Wassermann par Ie pro-
cede rapide 'au diagnostic de Ia tubercuIose.

Valtis a adapte Ie procede rapide de Hecht-Levaditi-Lata-

pie, remanie par Weinberg et Mutermilch, au diagnostic de
la tuberculose.
II prend pour chaque reaction six tubes a hemolyse, divi-
ses en deux series de trois.
La premiere sert pour la reaction de fixation et la seconde,
qu'on dispose de preference derriere la pr«miere serie, est
destinee a deternliner l'index hemolytique du serum a exa-
miner (Weinberg). Vne troisieme serie de trois tubes est
reservee a la reaction de Bordet-Wassermann, selon la me-
thode de Mutermilch.
Les dcux premiers tubes de la premiere serie re90ivent rcs-
pectivement 0,5 et 1 ccnt. cube d'antigene methylique dilue
au 1/20 avec de l'eau physiologique et 0,1 du serum a exa-
miner,.11011 inactive par chauffage, et ne datant pas de plus de
quarante-huit heur·es. On complete Ie volume du premier
tube a 1 cc. 1 en ajoutant 0,5 d'eau physiologique.
Le, troisieme tube, qui sert de temoin, re90it 0,1 de serum
frais a examiner et 1 cent. cube d'eau physiologique.
Chacun des trois tubes dela 'seconde serie, qui servira pour
la determinat~on de l'index hemolytique, re90it tout d'abord
0,1 de serum frais a examiner. Puis on ajoutedans chacun de
ces derniers tubes, respectivementO,3, 0:6 etO,9 d'emulsion
d'hematies de mouton a 5 p. 100.
On agite et on porte a l'etuve a 37 0 pendant une heure et
demie. On ajoute ensuite aux trois premiers tubes des quan-
tites d'hematies de mouton plus ou moins grandes, selon
que l'index hemolytique est fort ou faible.
Si 0,1 de serum humain frais n'hemolyse que 0,3 d'hema-
ties de mouton, au maximum, on ajoutera, a la fin de la
reaction, a chacun des trois premiers tubes, 0,1 d'hematies
de mouton au 1}20.
Si 0,1 du meme serum h~molyse 0,6 de globules (index
hemolytique egale 6), on ajoutera 0,2 d'hematies aux trois
premiers tubes.
Si enfin 0,1 du serum humain hemolyse 0,9 de globules,
266 REACnONS HUMORALES ET HEMA1'lMETRIE

on ajoutera aux tubes de la reaction Ie tiers, soit 0 cc. 3

d'hematies de mouton.
Apres avoir agite les tubes additionnes de la quantite con-
venable de globules rouges1 on les porte a l'etuve ~ 370,
pendant une demi-heure.
Au bout de ce temps, si Ie contenu -des deux premiers
tuhes n'est pas hemolyse, htDdis que Ie ttoisieme (tube te-
moin) est hemolyse, la reaction doit elre consideree comme
fo1'lement pasitive.
Elle doit etre consideree C01ume positive s'il y a hemo-
lyse dans Ie premier et Ie troisieine tube, et don dans Ie
deuxieme.
Enfin, elle est negative si 1'11emolyse s'est produite dans
les trois tubes.
II arrive parfoi5 (dans 12 p. 100 des cas) que l'hemolyse
ne se produise dans aucun des tubes de la deuxicmc serie.
Cela signifit! que l'index hemolytique eSt inferieur it 3, c'est-
a-dire qile Ie serum ne renferme pas asseztl'ale:!d-ne normale
(cas assez frequent), oU de sensibilisatrice normale ahti-
mouton. soit de l'une et de 1'autre, pour la quantite de glo-
bules rouges employee.
Cette proportion peut etre ramentie a 5 p. 100, selon Mu-
termilch, elant donM que In plus grande partip des serums
qui n'ont aucun pouvoir hemolytique v,is-a-\,is de 0,3 de
globules de moutol1 sont cepel1dant doues d'un pouvoir !:e-
molyHque !;uffisant pour dissoudre au moins 0,1 des memes
herul1ties.
On tontinrlEl done l'exan1en M ajOl1taht 0,1 de globules
rouges dans les trois tubes dllla reaction.
I;orsque Ie pvuvoir ltemolytitJ:ue.du serum ~st ndl, 011 est
oblige de tecbul'ir it ht ~aciiotl de fixation au moyen du 56-
ru.tb inactive d~ Ctl.l1t1lm~ et Masso!.
 CHAPITRE XXIII

SERO-REACTION DE L'ECHINOCOCCOSE-

On emploie, comme antigene, Ie liquide de kyste hyda-

tique recdeilli aseptiquement. On utilise de preference des
kystes du foie ou des poum<ms de breuf ou de mouton que
I'on peut se procurer facilemenf dans les abattoirs.
On prcleve ascptiquement Ie liguide hydaHque par ponc-
tion du kyste, en steritisant la paroi au moyen d'un fer porte
au rouge. Le liquide est reparti en tubes scelles qui sont
conserves a la glaciere.11 peut lservir pendant plusieurs
anii~es, {ant qu'il consi'!rve sa Ii!i1pidite. Les tribes sduilIes
se tt-oublen!, degagertt une mauvaise odeur et doivent etre
rejetes.
Les extraits alcooliqdes ott etheres de liguide hydatique,
moins constants que les Hquides purs, sont abandonnes.
Mais comme les liquides hydatiques ont un pouvoir anti-
g~ne trfls vrtt-ianie, il est indispensable d'ett faire tin titt-age
prealable en presence d'un_serum connn pout ne edrlstlrver
que les plus actifs.
Les liquides hydatiques d'origine animale ne sont jamais
spontanement _eIDPechants au-dessous de Ia- dose de 0 cc. 8.
II faut donc toujours se tenir au-dessous de ceUe dose.
Au contraire. les liquides d'origine humaine ne peuvent
ctre 'emIHoyes que dans des !imites tres rcstreintes, en rai-
son de l'ecart minime elHre leur pouvoir antidomplemen-
taiN~ ptc:>pre (fl la dose de 0 cc. 1) et leur pouvoir fixateur
specifique (a la dose de 0 cc. 05).

Methode de Weinberg.
Weinbt!I'9 recommaI1de de faire toujours paraiIelement Ia
reaction avec Ie serum a eprodver non chauffe et chauffe,
car Ie sHum chauffe it 56 0 perd une partie de ses anti-
corps: la moitie et meme les deux tiers.
268 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIME:rRIE

Serum non chauffe.

On utilise deux doses ,d'antigene, 0 cc. 1 et 0 cc. 2, en
'presence d'une dose fixe de serum, 0 cc. 1. Un troisieme
tube de serum sert de temoin.

a) Methode de Weinberg all serum non chauffe.

,Tubes -----------
1 : 1 heure It i'etuve it 37.

Serum
non
chauffe
r Eau
Antigene )hy.~io-
oglque
II : 30 minutes d'etuve it 37'

Globules de mouton Ii 5 p. 100

- - - --- - - - - -
I 1 ' 0,1 cc. 0,1 cc. 0.2 cc. dans 1: 0,1 cc. dans 1': 0,2 cc
2 2' 0,1 .. 0,2 " 0,1 » », 2 : 0,1 » )) 2': 0 2 »
T,ST'S' 0,1 » 0,3 T. S: 0,1 » » T' S'; 0,2 ..
" »

Ayec Ie meme serum, op fait 2 rangees de 3 tubes, car

on interprHe les resultats d'apres la force hemoly'tique des
serums.
Apn':s un contact d'une heure a l'etuve a 370 , on ajoute
o cc. 1 de globules dilues it 5 p. 100 dans la 1re rangee et
o cc. 2 'dans la 2e rangee.
En meme temps, on determine.- l'index hemolytique du
serum a eprouver, c'est·a-dire sa teneur en sensibilisatrice
hemolytique naturelle, de la fayon suivantte :

Index bemol'ytique du serum.

Tubes
a
Serum
eprouver
Globules de mou'ton
il5 p. 100
I E,w
physiologique
I
1 0,1 cc. 0,1 cc. cc.
2 0,1 » 0,2 » 09 »
3 0,1 » 0,3 » 0,8 »
4 0.,1 » 0,4 » 0,7 »
5 0.1 » 05 " 0,6 )J
6 0,1 » 0,6 0,5 )J
7 0,1 » 0,7 ") 0,4 ))
'8 0,1 )J 0,8 )J 0,:-1 )J
9 0,1 » 0,9 )J 0.2 )J
10 0,1 » I,D ) 0,1 »
 /'
SERO-REACTION DE L'ECHINOCOCCOSE 269

On lit les resultats apres r heure d'etuve a 37 0 • Si la

teneur du serum en hemolysine est faible, c'est-a-dire si
o cc. 1 de serum hemolyse. une quantite de globules
inferieure a 0 cc. 5, on ne tient compte que des resultats
donnes p.ar la Ire rangee de tubes (0 cc. 1 de globules).
Si la teneur du serum en h~molysipe est elevee, c'est-a-
dire si 0 .cc. 1 de serum est capable d'h~molyser 0 cc. 5 et
plus de globules, on neglige les resultats donnes par la
1re rangee (0 cc. 1 de globules) et on lit Jes resuJtats donnes
par la 2e rangee (0 ee. 2 de globules).

b) Methode de Weinberg all serum challffe.

Dans ,cette methode, qui complete la preeedente, on
emploie une dose fixe : 0 cc. 3 de serum a eprouver,
chaufTe 30 minutes a 56, et une dose fixe d'alexine diluce de
moitie': 0 ee. 1 en presence de doses croissantes d'antigene,
o cc. 2,0 cc. 3, 0 ce. 4. .

II: 30 minutes ctu\'e

--
I: 1 heul'c etuve it 37- il 37°

Tubes Serum a Antigen. Alexine

-------- -
Enu
----~-
. eprouver,
chauffe
hydatique diluee
it 1/2
physio-
logique
Globules dilues
:\ 5 % bensihilises
- - - --- ---
I 0,3 cc 0,2 CC. 0,1 cc: 1,4 ec. I cC.
2 0,3 }) 0,3 0,1 » 1,3 » I »
.
I)

3 0,3 » 0,4 » 0,1 » 1,2 » 1 »

Temoin serum. 0,3 » 0,1 » 1,6 » 1
Temoin nnt. A 0,4 » 0,1 » 1,5 » 1 »
A 2 0,6 » 0,1 » 1,3 » 1 )'
A3 0,8 » 0,1 » 1,1 » 1 »
Temoin alexine. 0,1 » 1.9 » 1 »

On double les doses d'antigene : 0 cc. 4, 0 ce. 6, 0 ec. 8,

pour les tubes temoins antigene, afin d'climiner Ie pouvoir
antieomplementaire.
Le systeme hemoly,tique est constitue par des globules
de mouton et un serum hemolytique lapin-mouton.
On sensibilise prealablement les globules en ajoutant, Ii
la dilution 3e globules au 1/20, la quantite de serum
hemolytique suffisante pour produire une hemolyse rapide;
puis on complete avec]a quantite d'alexine indiquee.
270 REACTIONS HUMORALES ET H&MATIMETRIE

Les rea!!tions positives faibles avec Ie serum chauffe ne

sont a retenir que si Ia reaction se montre franchement
positive avec Ie serum non chauffe.
Si les resultats des deux reactions sont completement
opposes. il vaut mieux conclure pans Ie sens negatif. it
tuoins qu'on n'obtiltnne des resultats diiferents avec l10
autre antigene.
 CH;1fITR1j1 XXIV
REACTIONS DE FLOCULATION POUR LE DIAGNOSTIC
DE LA SYPHILIS

A. - Methode de Sachs et Georgi.

On emploie, co~me 'antigene, u'n: extrait de creur de
breuf cholesterine, de c<cur de cobaye ou de foie syphi-
Iitique.
Cet antigene· peut etre prepare de If! fa!;on suivante :
a) 1 gra,mme de coour frais +5 centimetres cubes
d'alcool ;
b) 100 centimetres cubes d'extrait· + 200 centimetres
cubes d'1l1cooI ;
c) 13 cc. 5 de cholesterine ~ 1 %.
bet c varient suivant les echantillons.
Technique. - 1 centimetre cube de Ia dilqtion au 1/10,
dans I' eau physioIogique, du serum chauffe 30 minutes !I 56 0

est mis eO'presence sie 0 cc. 5·d'antigene djIue 6 fois.

Tubes temoins: serqm positif, serum negatjf, antigeqe +
eau.
Les tubes sont laisses 2 heures a 37 0 et 18-20 heures it la
temperature de Ia chambre, ou 18-20 heur~s a l'etp.ve.
La fl~culation est observee a l'agglutjnoscope de Kuhn
+ + ; + +;
et W oithe et appreciee suivanJ: Ies degres : -f
+;+;-.

B. - Methode de Dreyer et Ward (Reaction Sigma).

Ces auteurs ont publie en 1921 une methode de sero-
reaction pour Ie diagnostic de Ia syphilis qui est hasee
272 'REA'CTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

comine ceIle de Sachs et Georgi, sur la floculation, Leur

but a ete d'et~blir une methode simple n'exigeant ni alexine
ni systeme hemolytique. PQuvant s'effectuer toujours
dans les memes conditions, et permettant d'apprecier la
quantite d'anticorps et de I' exprimer en unites par centi-
metre cube, lIs ont, depuis lors, legerement modi fie leur
technique en prolongeant Ie sejour des tubes au bain-marie,
mais Ie principe de la methode n'a pas change.

ANTIGENE, - C'est un extrait cholesterine de creur de

veau mis en suspension -dans l'eau physioI.ogique, it deux
concentrations differentes.

a) L'extrait alcoolique de creur de vean est prepare sui-

vant la methode de Borde! et Ruelens :
100' g~a~mes de ~reur' de veau depouiIle de sa graisse
sont coupes en petits' morceaux et mis en contact avec
125 centimetres cubes d'aI~ocil ordinaire it 94, 96 p, 100,
Ce melange est abandonne pendant cinq jours it la tem-
perature du Iaboratoite', puis l'alcool est filtre. Le residu
est desseche it 37° pendant 24 heures. On ajoute 200 centi-
metres cubes d'acetone pur et .on,laisse Ie melange pen-
dant sept joms it 20 0 • L'acetone est alors filtre et Ie residu
est de nouveau traite p';Jr 100 cent,i'inetres cubes d'acetone
pend~nt une journee., On elimi~e l'acetqne par filtration et
on desseche Ie resi(lu a ;200 pend\int deux heures. Qn
aJoute 200 centimetres cubes d'alcool it 96°. Le melange est
laisse it 20· pendant dix jOUl;S, puis filtre sur papier.
Le filtrat limpide et jaune d'or est pret a etre employe, II
contient les substances du creur de veau insolubles dans
l'acetone, solubles dans l'alcool.
Conserve it l'abri de la lumiere et a la temperature du
Iaboratoire, en flacon bl)uche it l'emeri, il reste limpide pen-
dant longtemps.

byLa solution alcoolique de cholesterine est preparee en

di~solvant 1 gramme de cholesterine pure dans 100 centi-
metres cubes·d'alcool absolu. ,

c) L'euu physioIogique est preparee ,en dissolvant

9 grammes de chlorure de sodium dans un litre d'eau
 REACTION DE FLOCULATION BT SYPHILIS 273

distillee, recemment preparee et sterilisee immediatement

it l'auto'clave.
Les auteurs utilisent comme anti gene deux suspension~
es eau physiologique~ a des concentrations differentes, de
cet extrait de creur choiesterine, preparees de Ia fac;on sui""
vanIe :
A 5 centimetres cubes d'extrait alcoolique de creur de
veau, ajouter dans un verre bien sec, 0 cc. 25 de solutiorl
cholesterinee. Pour Ia suspension a, prendre 1 centimetre
cube de ce melange et 10 centimetres cubes d'eau physiolo-
gique; pour Ia suspension b : 1 centimetre cube de ce
melange et 34 centimetres cubes d' eau physiologique.
Dreyer et Ward attachent une tres grande importance
a Ia fac;on dont Ie melange (extrail: alcaalique-choles-
tcrine) est incorporc a l'eau physiologique. lls ant cons-
truit un appareil a siphon qui permet de faire cduler
goutte a goutte I' eau physiologiqoe dans Ie cyIibdre de verre
qui contient Ie centimetre cube d'extra:it alcaaIique de cteur
de veau cholesterine. Pour avoir des resultats toujouts coriJ-
parables, l'eau physiologique doit tomber dans Ie recIpient
d'une hauteur de 36 centirnetres dans un temps co'bstarft. Pour
Ia suspension d,les 10 centimetres cubes d' eau physio}ogique
doivent s'ecouler en 1 minute 25 secondes ; pour Ia suspen-
sion b, Ies 34 centimetres cubes d'eau physiologique doivent
s'ecouler en 4 minutes 30 secondes.

SERUM. - Les serums a eprouver sont chaoffes it. 550,

au bain-marie, pendant une heure et demie.

DISPOSITIF DE LA REACTION. - On utilise 9' tubes

serums + antigene et 2 tubes temoins antigenes. Les
quantites de serum et d'antigene sont mesurees a I'aide
d'une pipette compte-gouttes a tetine, de n"reyer. Oans Ie
tableau ci-dessous, Ies quantites respectives de serum,
d'antigene et d'eau physiologique, qui entrent dans Ia r~ac­
tion, sont exprimces en gouttes :

MICROBIOLOGIE 18
 274 [lEACTJONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

Numeros Gouttes Gouttes Dilution finnJe

d'eau Gouttes de suspension
des It I"quell.
tubes physiologique de serum d'"ntigene "Sit Ie serum

1 0 20 pur 6 suspension a 1( 1,25

2 0 10 » 15 suspension b, 1( 2,5
:l 5 5 » 15 - 1/ 52
4 8 2 » 15 -- 1/13,1
5 9 1 » 15 - 1(264
6 0 10 dil. 1/20 15 - 1/46
7
8
5
8
5
2
»
»
15
15 -
- 1(92
1(232
9 9 1 » 15 - 1/462

Le tube temoin antigime a contient 20 gouttes d'eau phy-'

siologique et 6 gOllttes de Ia suspension a.
Le tube temoin antigene b contient 10 gouttes d'eau phy-
sioIogique et 15 gouttes de la suspension b,
Apr~s chaque prei(wement, Ia pipette est Iavee a l'eau
dis\iUee et sechee soit avec l'acetonc, soit avec I'alcool
suivi de l'ether.
Les portoirs contenant les tubes sont places au bain-
. marie a 37 0 OU ils doivent sejourner pendant 20-22 heures,
Les deux tiers de la colonne liquide des tubes doivent eire
immerges dans l'eau. Apres ce sejour de 20-22 heures au
bain-marie a 37 les tubes sont Iaisses une dizaine de
Q
,

minutes a la temperature du laboratoire, On \ procede alors

a)a lecture en disposant un ecran sombre derriere les tubes.
EXPRESSION DES RESULTATS EN UNITES. - Les termes
employes par les auteurs pour exprimer' les ditIerents
degres de floculation sont :
Fioculation totale ;
Stand'ard-floculation ;
Trace de floculalion ct tloculation nulle,
Dans la floculation totale, Ie liquide est devcnu clair: de
gros floculats tombent au fond du tube,
Dans la floculation standard, la floculation peut etre
constatee a l'~il nu : les petits floculats sont reglllierement
distribues dans la masse du liquide, tous de meme dimen-
sion et bien separes les uns des antres.
Quand il y a trace de floculation, les floculats sont tres
fins et ne peuvent etre aper~us qu'a la loupe.
 · ,.-
REACTION DE FLOCULATION ET SYPHILIS 275

Pour exprimer les degres de floculation entre ces quatre

termes, on peut leur accoler les segnes + ou - .
Le calcul de la teneur en unites d'un serum est base sur
Ie principe suivant : « La quantite d'un serum qui, ramene
au volume de 1 <-:entimetre cube avec de l'eau physiolo-
gique, determine la floculatio,n « standa_rd » avec Ia suspen-
sion d'antigene b, apres un sejour de 7 heures a 37°, est con-
sideree comme rtmfermant 4 unites. ))
Comme souvent aucun tube, dans lesseries examinees, ne
prt!sente la floculation « standard I), Ie cal cuI des unites doit
etre fait d'apres les tubes OU Ia floculation s'est produite
a d'autres degres. On se sert, pour cela, d'unl;' table qui
exprime les relations numeriques existant entre les autres
degres de floculation et la floculation « standard ».
Comme la sensibilite des extraits de c<eur peut Ivarier.
1a valeur de chaque extrait est exprimee par un coefficient
qui represente sa sensibilite par rapport a celIe d'un extrait
de cccur etnIon.
Enfin la duree du sejour des tubes au bain-marie eiant
portee de 20 a 22 henres et meme, si eel a est necessaire, de
40 a 44 heures, Ie coefficient de chaque extrait sera corrige
par un coefficient de temp~ ~ 1,56 pour un sejour de 20 a
22 heures au bain-marie et 2,6 pour un sejo'ur de 40 a 44
heures...
Pour ]a pratique courante, une table numerique a ete
dressee, qui tient compte de tous ces coefficients, a l'excep-
tion du coefficient de suspension qui. naturellement, varic
avec l'extrait de crnur employe.
Le cal cuI des unites d'anticorps par centimetre cube se
fait immediatement, grace a Ia tabl~ suivante. On prend
Ie nombre se rapportant au degre de floc~Iation observe
dans Ia colonne du tube correspondant et on Ie muitiplie
par Ie coefficient de sllspensiq'n de l'extrait de crnur
employe.
 '276 REACTIONS !J,UMORALES E1' ilEMA1'IME:1'hIE

Table pour 20-22 heures de sejour au 'bam-marie.

N umeros du tube
Degf"
d. £loculation
1 :l 3 4 5 6 7 8 9

-- - -- -'_ -- -- -- --' --
Total. ..•••. 1,60 3,20 6,7 1&,8 33,9 59, 118 298 592
'rotl1l- .•.. 1,29 2,58 5,4 135 27,2 47,5 9"5 24(1 477
Stand.lt- .... 1,01 2,02 4,2 10,6 21,3 37,2 7( 187 373
Sta'nd ....... 0,80 1,60 3,3 8.4 16,9 29,5 59 149 ~96
Stand- .•.. 0,61 1,3'5 28 7,1 14,2 24,8 49~5 125 248
Trac'e + .... 0,57 1,14 2,37 6,0 12.6 20,9 42 1&6- 210
Tl'ace .•..... 0,4& 0,96 2,00 5,0 lO,2 17,7 35,4 89 178
Trace- .... 0,42 0.83 1,73 4,4 8,8 15,3 30,7 77 154
Trace ......• 0,33 0,66 0,37 3,4 6;9 12,1 24,2 6f i:t1

Si, au bont de 20 a 2'2 heures, nn setUill bl'! cl1ttftenf que

1,5 unites ou moins, il est remis au bain-marie pour une
trt}ITveUe pe'l'iode de 20' it 22 heutes. On lit ~ddt!; les t'esul-
fats sur les deux pretnier's f(l'bes et les unites qu'i1s co'rt..
fiennent sont calculees d'aprbs la table sUIvante, en Se rap--
pelant que les chiffres doivent etre multiplies par Ie coeffi ..
dent de suspension de l'extrait de Cc;l!ut elhplOj"e,
.
I

,
N um"ros des! tubes
;1
:
Degr"
de floculatioll - 1 2 3
1
i
I
Totale ................ 0,83 1,65 3,44
Totale- .....••....•.. 0.70 1,40 2,9:l
Stand -I'- ............. 0,58 1,15 2,4u
: Stann. ............... 0,48 0,.96 2,aO
Stand - .............. O,4~ 0,85 1,76
i Tra'Ce + ............. 0,3 0,75 1,5'6
,

PRECAUTIONS A OBSERVER. - Si un serum infecte donne

'une reaction negative, Ie resultat peut etre considere comme
'exact, car un serum a reaction positive qui s'infecte ne
'donne jamais une reaction negative. Au contraire, si/un
'serum infecte donne une reaction positive,l'experience doit
l etre recommencee avec un nO,uvel echantillon.
 /'
REACTION DE FLOCUJ-ATJON'IBT SYpHILIS v,n
II ne flJl}.t p~s qjOijter au serum des antisl'lptiques, comme
l'qs::iqe ,pij¢nique, Ie fonpol, etc" qui p~uvent fnusser Jes
resJlltats.
TOlls les tubes .cJoivent etre tres minutiellsement laves a
l'eau distiliee, car une trqce q'acide peut provoqUl'lr une flo-
culation OilU& le m.elange serum-antigene.
INTERPRETATLoN DES RESULTATS. - Les serums eonte-
nant moin"s d'une unite sont consideres comme negatifs.
Les serums con tenant plus de 1,5 unite sont consideres
comm{) positifs. Les serums eontenant de 1 a 1,5 unite ne
sont consideres eomme positifs que dans les cas reconnus
de syphilis.
Avec Ie Iiquide cephalo-raehidien, la reaction est consi-
deree comme positive avec plus de 4 unites et negative avec
moins de 1 unite.
D'une fa<;qn generale, les auteurs ont trouv!! que les cas
non traites de syphilis congenitale presentent dans leur
SerUIl! une teneur clevee en anticQrps de 50 a 1.000 unites.
Au contraire, les cas non traitcs a Ia periode primaire, 0].1
les cas traites aux periodes primaire, secondaire et tertiaire
ont un SeFUm p~u riche en unites d'al1ticorps ou donnent
une reaction negative. Le liquide cephalo-rachidien contient
peu d'unites d'anticorps comparativement au serum.

••*
C. - Methode de Dujarric de la R.iviere et GalleFRlHI.

Ces autflurs ant penEle que la flooulation qui se prodl1it

Jorsqu'Qn melange un !1erum syphilitique avec d~s el'traits
alcooHqnes d'organes deviendrait phl& apparente si ron
ajoutait flU melal1ge upe SUQstflnce qui jQu'erait Ie role de
sensibilisatellr. Ils ont choi!1i la teinture de benjoin prepartie
suivilnt Ill- teohniqne d,e Guillllin, LarQche et Lechelle :
1 gramme qe res\ne de henjoin de Sum~tra pans 10 c. c.
d'alcool absolll; lais~e]l macerer 48 heur~s i filtrflr Sl1r papi~r
(6t non decanter) pour avoir un liquidfl absolument limpide,
Dilns un tube a e!lsai 'parfa'itement propre, on melange
1 partie de solution lllcoolique de benjoin de Sumatra pre.,
paree comme il vient d'etre dit. avec 5 parties d'antigene de
278 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

Bordet et Ruelens, on agite : Ie melange est tres homogene.

Dans un tube a hemolyse plus grand que les tubes ordi-
nairement en usage (12 cm. hauteur X 12 mm. diametre) et
parfaitement propre, on verse' 5 cc. d'eau physiologique
a 9 p. 1000, puis 1/10 de cc. ciu melange initial, on agite;
la suspension est homogenc, on ajoute alors 0,8 cc. ou
1 cc. du serum a examiner prealahlement chauffe pendant
30 minutes a 55°. On meIf ll1ge soigneusement, on lit les rt\-
sultats apres 3 heures d'etuve it 37°. La floculation est tres
apparente, visible facilement sans l'aide d'un appareil d'op-
tique. D ne autre emulsion, faite dans les memes- conditions,
mais sans serum, servira de temoin .

..
D. - Methode syphilimetrique de Vernes.
Lc point de depart physique de la methode est Ie sui-
vant :
I. - Dne suspension de granules tres petits (de l'ordre
du millionieme de millimetre), dans un liquide approprie,
possede des proprietes qui varient suivant Ie poids de la
matiere ,en suspension et son degre de division.
II. - Le melange d'une suspeg_sion de granules tres
petits avec du serum humain peut produire un trouble; ce
trouble augmente au diminue selon qu'on1fait varier; a) la
proportion du serum dans Ie melange; b) Ie nombre et ]a
dimension des granules en suspension '; c) les conditions de
temperature.
La suspension e~t faite avec un extrait alcoolique de coour
de cheval prepare de la fac:;on suivante (perethynol) :
Prendre un coour frais. Hacher ce qui est muscle; mettre
Ie hachis dans l'aicool absolu et laisser en contact nne heure
en agitant de temps en temps: exprimer, mettre en couche
mince et dessecher a 37°. Broyer finement au moulin.
Epuiser al'appareil de Soxhlet 30 grammes de cette poudre
(melee a 60 grammes de sable lave et epuise a I'alcool) avec
250 centimetres cubes de perchlorure d'Mhylcne (distille
entre 115 0 et 121°) et dans les condition)s suivantes ; Ie
ballon qui contient Ie perchlorure est chauffe au bain-marie;
la douille de l'appareil est surmontee d'un refrigerant de
Vigreux relie a une pompe :i vide (boucher au liege, luter it
 REACTION DE FLOCULATION 'ET SYPHILIS 279

la paraffine, etc.). Distiller Ie perchlorure sans depasser

350, et de fa<;on it produire 40 siphonnements en 6 heures et
demie (bain-marie 60 0 it 65 0 , pression 4 centimetres cubes).
Seeher la poudre ainsi traitee it 37°, puis l'epui~er de nou-
. veau it l"appareq de Soxhlet avec 200 centimetres cubes
d'alcool absol u dans les conditions suivantes : distiller au
bain.marie sans depasser 30 0 et de fa<;on a avoir 30 siphon-
nements en 5 heures (bain-marie 60° it 65 0 , pression 5 it 6
centimetres de 'mercure). Recueillir Ie liquide du baIlon,
laisser reposer 24 heures, filtrer sur papier. Determiner
l'extrait sec en portant 10 centimetres cubes de liquide it
60 0 pendant 8 it 9 heures jusqu'au point constant. Ramener
au titre de 15 grammes d'extrait sec par litre, soit par addi-
tion d'alcool, soit par evaporation dans Ie vide au-dessous
de 30°.
Technique de la reaction, - Le serum it eprouver doit
.etre chauffe it 55 0 pendant 15 it 20 minutes. La temperature
doit etre rigoureusement contr6lee. .
Les manipulations doivent se faire it une temperature
d'environ 200 , les variations de temperature pouvant avoir
un effet sur les resultats de l"experience.
Le perethynol est dilue it 1 pour 6,5 (1 + fi,5) dans l'eau
distillee au moyen de l'appareil melangeur (Leune, cons-
tructeur). Cett'e dilution se fait en deux temps;
1° Dilution au tiers (1 de perethynol + 2 d'eau). Dans un
verre cylindrique it fond plat (30 millimetres de diametre
interieur) introduire 6 cen.timetres cubes d'eau bidistilIee,
descendre l'helice (15 millimeires de diametre) dansleverre,
de maniere qu'elle soit entierement recouverte d'eau sans
toutefois qu'elle touche Ie fond. Mettre en marche Ie
~oteur et, en suivapt les indications du tachymetre fixe
sur l'appareiJ, agir sur Je rheostat, jusqu'it ce que la vitesse
de rotation de l'heJice soit de deux cents tours it la minute,
puis au moyen de la pipette de 3 centimetres c,!-!bes, dont
l'ecoulement est regIe par un robinet special it un centimetre
cube par minute, laisser couler la dose de perethyiiol. La
position de la pipette doit etre telle que les gouttes tombent
dans l'eau d'une hauteur de 3 it 4 centimetres, que Ie
capillaire inferieur soit vertical et qu'il ne touche ni les
parois du verre, ni la tige de I'helice.
2" Pour amener la suspensioll it sa dihltion definilivt)
280 REACTIONS HUMORALEB ET HEMATIMETRIE

(1 p. 6,5) enlever In pipette et verser en filet mince 10,5

centimetres cubes d'eau bidistillee ; alors seulement, arre-
ter l'agitateur. '
Pour ia preparation de cette suspension, on peut
employer )-me pipette de 6 centimetres cubes (doubler les
quaI}tites d'ean et se servir d'un verre de 40 millimetres de
diapHHre et d'une helice de 35 millimetres), mais on ne peut
oper~r avec moins de 3 centimetres cuhes de perethynol,
car au debut de Ia dilution l'eau ne couvrirait pas I'helice ;
4e pIps, ~ela entrainerait une augmentation d'opalescence_ de
la suspension obtenue, et par suite fausserlj.it les resultats.
L,a suspension doit etre employee dans les deux heures
qui suive'nt s~ prep aration ~t seulement apFeS avoir repris
la temperature du laboratoire, Ia dilutioJl ayant produit un
echauffement .
. Apres avoir retire les serums du bain-marie a 55°, les
laisser refroidir dans Ie laboratoire pendant cinq a dix
minutes. Pour chaque examen, deux tubes seulement sont
indi'spensables : un tube a perethynol et un tube tcmnin;
cependan t il est preferable, toutes les fois que Ia quaRtit~ de
serlf)ll sera s,?-ffisante, de preparer des tubes en double,
com me controle.
Avec un rheometre regIe a 0,4 centimetre. <mbe, distri-
buer 0,8 centiIlletre cube de serum E-2-cylindrees) dans Ies
quatre f)lbes. Ces distributions doivent etre faites dans Ie
laboratojre a teIllpera~ure con stante (200) ou, ~out au moins,
les tubes deyront y eire portes aussitOt apres.
-Trente minutes apres la fin ~u chauffage, ajouter, dans
deux des tubes 0,4 'centimetre cube de la suspension de
perethynol e~ dans les deux autres (temoins) 0,4 centime-
tre cube d'eau hidistillee alcoolisee f;\ 1 pour 6,5 d'alcool
absolu.
Agiter soigneusement les porte-tubes plusieurs fois s'il
est h'e~oin pour assurer Ie melange intime des deux Iiquides
(a ce moment de l'experience ne pas boucher les tubes avec
Ie dqigt pour les agiter par renversement).
Boucher les tubes au caoutchouc et les placer pendant
qU,atre heures a 25° dans un bain-marie.
Les lectures des result,ats se font dans Ie laboratoire a
telllperature con stante ; on qetermine en densite optique, a
l'aide du photometre, l'absorption du tube a perethynol et
 REACTION DE FLOCULATION ET SYEHILIS 281

celIe du tube temoin ; Ie temoin parmettantdl' tenir compte

de Fopalescence propve du s€rum at de sa coq.leur (presence.
des pigments biliai);'es ou d'hemoglobine), la difference des
deux lectures mesure bien Ie trouble forme par Ie melange
du serum et du per.ethynol (absoq~tion du precipite en SUSr
pensiop). Cette differellli:e, exprimee ~n centiemes, est ins,..
crite sur Ie dossier du malade. Les mesures repetees avec
les tubes dt) cOI1troie doivent donner Ie meme vesultat (ii
trois centiemes pres). Pour les serums normaux, Ia diffe-
rence est nuUe pp. au plus egale a 6 .

..
E. - :geaction de Gate et Papacostas.
Formol-gelification des serums syphilitiques.
Ajouter :) 1 centimetre c!J.P~ de S~rUl1J tref) ~Iair deux
ou trois goultes de formol du commerce, et abandonner Ie
tout 24-30 heures a la temperature du ]aboratoire. Les
senj"ms a Wassermann positif forment une gelee, alors que
]es SeFUmS a Wassermann neg!ltif restent ]iquidhs. Cette
reaction concorde avec celIe de WasseFmann dans 85 %
des cas.
La Feaation est independan~e de l'ina.clivatjon des serumll
pap Ia chaleur. Les serums peuveOt etre anciens de 48 heures
ou meme plus slils ne sont pas contamines.

F. - Re~ction de la meiostagmine.
Lorsqu'on ajoute a un serum dilue un extrait alcooIique
de microbes, la tension superficielle cst abaissee comparati-
vement a un melange SCTum dilue et eau pnysiologique. La
diminution de ]a tension superficielle, faible ou peu mar-
quee pour les serums normaux, cst d'autant plus intense que
les serums aontiennent plus d'anticorps vis-ii-vis de Fextrait
alcoolique antigene. On ]a mesure par l'augmentation du
nombre de gouttes compte au stalagmomBire de Traube.
Pour Ie diagnostic de la fievre typholde. par exemple, on
emploie une serie de tubes contenant 9 centimetres cubes
de serum dilue au 1/20; dans Ie Ifr tube on ajoute 1 centi-
metre cube d'eau physiologique a 8,5 p. 1.000 (temoin) ;
282 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

dans Ie 28 , on ajoute 1 centimetre cube d'extrait aicooIique de

lmcilles lyphiques dilue au 1/10; dans Ie 3", 1 'Centimetre
cube uu mime exlrait dilue au 1[100 ; dans Ie 4", 1 centi-
metre cube du meme extrait diIue au 1/] .000 et dans Ie 5",
1 centimetre cube du meme extrait dilue au 1/10.000. On
melange intimement par agitation. On compte les gouttcs
immediatement au stalagmorpetre ou apres 2 heures a 37°.
Suivant Ia dilution d'antigene, Ie nombre de gouttes aug-
mente de 1,8 it 3,7.
La reaction de la meiostagmine a ete appliquee au dia-
gnostic d'un grand nombre de maladies : tuberculose,
syphilis, echinococcose, cancer, etc., mais ses resuitats
sont discutabies.
..
G. - Reaction du benjoin colloidal.
Cette reaction ne peut etre recherchce qu'avec Ie liquide
cephalo-rachidien. N' employer que de la verrerie tres propre,
lavec dans l'acide chlorhydrique a 2 % dans reau, puis
rincee deux fois it 1'eau distillee.
Les reactifs sont : 1 0 une solution de NaCl chimiquement
pur a 0 gr. 10 p. 1.000; 2 0 1 gramme de benjoin (resine de
benjoin pure dans 10 centimetres cubes d'alcool absolu) ;
laisser en contact 48 heures jusqu'a dissolution, decanter.
Pour la reaction, prelever 0 cc. 3 de la solution alcoolique
claire. qui sont verses lentement dans 20 centimetres cubes
d'eau distillee tiedie it 35°.
Avoir soin de n'employer que de l'eau recemment dis-
tillee et une suspensiol1' de benjoin fraichement prepa-
ree.
Technique originale : 16 tubes.
1 0 Tube 1 ; 0,25 centimetre cube de la solution de NaCl ;
tube 2 : 0,5 centimetre cube de la solution de NaCl ; tube
3 : 1,5 centimetre cube de la solution de NaCI ; tubes 4 a
16 : 1 centimetre cube de la solution de Nae!.
2° Ajouter Ie liquide cephalo-rachi.dien dans la propor-
tio!). suivante: tube 1 ! 0,75 centimetre cube; tube 2 :
0,5 centimetre cube; tubc 3 : 0,5 centimetre cube.
Prelever dans Ie tube 3 (1,5 centimetre cube de solution
NaCI + 0,5 centimetre cube de liquide cephalo-rachidien)
 REACTION DE FLOCUL:ATJON ET SYPHILIS 283

1 centimetre cube du melange,. que I'on reporte dans Ie

tube 4 en brassant, et ainsi de suite jusqu'au tube 15. Reje-
ter Ie centimetre cube provenant du tube 15. Le tube 16 ne
re~oit pas de Iiquide cephalo-rachidien.
30 Dans chacun des 16 tubes, verser 1 centimetre cube de
Ia suspension aqueuse de benjoin. Le tube 16 sert de temoin.
Laisser a Ia temperature du Iaboratoire et lire les resultats
aprcs 12·heures.
Technique simpli{z¢e : 5 tubes, pas d'eau chloruree, de
l'eau distillee :
10 Tube 1.: 0,5 centimetre cube d'eau distilIee ; tube 2:
1,5 d'eau distiIIee; tubes. 3 a 5 : 1 centimetre cube d'eau
distillee.
2 0 Ajouter Ie Iiquide cenhalo-rachidien. Tubes 1 et 2 :
0,5 centimetre cube.
Dans Ie tube 2 prelever 1 centimetre cube du melange et
porter dans Ie tube 3 ; proceder de meme pour Ies tubes
3 et 4, mais rejeter Ie centimetre cube preleve dans Ie tube
4. Le tube 5 ne re90it pas de liquide cephalo-rachidien.
Les dilutions du.Iiquide cephalo-rachidien sont les sui-
vantes : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.
3 0 Verser dans chacun des 5 tubes 1 centimetre cube de
·Ia suspension aqueuse de benjoin. Lc tube 5 sert de temoin.
Laisser it la temperature du.laboratoire et lire les resultats
apres 12 heures. .
Resuilais. - Dans les tubes positifs, la precipitation d u
benjoin est totale, Ie liquide Cflt clair. La resine est sedi-
mentee au fond du tube. Dalls les tubes negatifs, Ie liquide
reste trouble. II n'y a pas de precipite.
Dans les reactions positives. la precipitation s'observe
dans les 5 premiers tubes (d' Oll l'emploi de la technique sim-
ptifiee pour un diagnostic rapide) et peut meme s'6tendre
aux tubes \) et 10.
Le liquide cephalo-rachidien normal donne souvent une
precipitation dans les tubes 6, 7, 8, jamais <h"tns les tubes
1a 5.
La reaction ne peut etre pratiquee avec des liquides
xanthochrorriiques ou hemoglobiniques qui precipitent Ie
benjoin dans la zone syphilitique.
 CHAP ITRE XXV

RECHERCHE ET TITRAGE DES LIPOIDES Lll3RES ET

DES FERMENTS SPECIFIQUES DE DEFENSE DAJ'iS J..BS
HUMBURS ET DANS LES OR GANES.

A. - R.eaction d'activation du venin de cobra.

( Calmeite).
,
Cette reaction a pour objet la recherche et 1.6 titJJage des
lipo/des li"bres dans les humeurs (serum, liquide caphalo-
rachidien, etc.), Ie venin de cobra n'Hant susceptible d'he-
molysell les globules rouges de mammiferes qu'en pr~senc~
de quantites variables de ces lipoides.
On doit avoir it sa disposition:
l o U ne solution mere de venin de cobra au centieme,
chauffee SO minutes a 75 et filtree sur papier (0 gr. 1 de
0

venin sec dans 10 centimetres cubes d'eau sale8 physiolo~

giqne), fraichement preparee et ne datant pas de plus de 10
jours (conservee it la glaciere);
2 0 Une diIution au 1/500 de venin, faitel au moment de
s'en servir en diluant 1 czell'timetre cube de solution mere
qui contient 0 gr. 01 de venin sec, dans 4 centimetres cubes
d'eau salee physiologique (3. 8,5 de NaCI par litre) ;
30 Une solution de lecithine au dix- millieme, preparce en
dissolvant 1 gramme de lecithine .pure dans 100 grammes
d'alcool methylique pur. On pr.end 1 centimetre cube de
cette solution qu'on porte dans 99 centim~tres cubes d'eau
salee physiologique ;
40 Une emulsion an 1/20 d'hematies de cheval debarras-r
sees de serum par trois centrifugations et lavages a l'eau
physiologique successifs.
Dans une serie de tqbes it essai, on 'vers~ 1 centimetre
cube d'nne solution de venin de cobra au 1/500, soit 2 mill;,
grammes, puis 1 centimetre cube d'emulsion au vingtie~e
d'hematies de cheval soigneusement lavees.
 LlPOIDES LlliRES El' FERMiNTS DE DEFENSE 285
Chaque tube, sauf Ie premier, qui sert au controle,
te\:Uit enStIite respectivement 0 cc~ 01, 0 cc. 05, 0 cc. 1,
o cc. 5 et 1 centimetre cube du serum it etudier (prealable-
mell1 ihactive par 30 minutes de chauffage il. 580 au bain-
marie).
On complete partout it 3 centimetres cubes avec H20
physiologique.
On porte a l'etuve a 37 0 pendant 30 minutes et on lit les
resuHatl;.
Darts une autre serie de tubes temoins, on verse }a meme
quantite de venin de cobra (2 tnilligrammes), la meme
qmtntHe d'efilulsiun d'hematies de cheval lavee's et (sauf
dans Ie premier tube qui sert au cohtri'ile) des proportions
.,ariables de lao sdlution de lecithine pure au dix-millieme,
p'ar exe-mple: (} cc, 03, 0 cc, 05, 0 cc, 08, 0 cc, 1 ,.etc, On cl:1m-
p'lete partOl1t it 3 centimetres cubes ct on porte egalentent it
l'Muve' pendant 30 minutes it 370, On lit les resultats.
8i}e tube de }g premiere serie, cantellant () CC: 1 du
serum:l etudier, donne une hemalY'se complete daps Ie
meme temps que Ie tube de la seconde serie qui contient
occ, 05 de solution de lecilhine au dbi-millieme, par ex~tn­
pl~, on en dMnit que'1 centimetre cube de ce serum ren-
ferme'O gr. 000'05 de }e<iithiIie ou d'autTes lipoides snscep-
}iDles d'activer Ie venin. La part de la 'lecithine dans ceUe
activation peut MFe sep-aree par l'additian de quelques gottttes
de solution au dix-millieme de :chiorure de calcium qui
etnpl!che l'action activante de's acides gras et des savons.
On t:rmtve de la lecitlIine libre dans Ie serum des tuber-
tu}e'ux.~ parfbis des syphilitiques, ties dements, des paraly-
tiques gen(mtux (ps!Jcho~reactian, dite de Much), etc., et
dans- celui des s·ujets ariesthes-ies par Ie chloroforme OU par
rether.
Le- serum (ru~e inactive par chauffage a 5&» de certaines-
eSp"ec~s animales (chevali chien, tat, chevre, mbuton,
lapin) est actr"9"ant pour Ie venin de cobra. I.e serum
d'homme1 lie singe, de bumf, de pore, ne l'es-t ~ne lol'sqi.l'tl
n'a pas ete ina-ctive par Ie chauffage.
286 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

B. -Methodes d'Abd$!rhalde~l et de Wollman .pour Ia

mise en evidence'dela proteolyse.

a) REACTION D'ABDERHALDEN

La reaction d' Abderhalden permet, d'apres son auteur, de

deceIer, dans Ie serum, des ferments speci/iques, ferments
protecleurs, au ferments de defense qui attaquent les pro-
teines deversees dans la circulation. C'est ainsi que, pendant
Ia grossesse, des ferments apparaissent dans I~ sang mater-
nel, qui attaquent les albumines et les peptones d'origine pIa-
centaire. Lorsqu'on met en contact, dans un dialyseur place
dans l'eau distillee,le serum contenant un ferment specifique
et l'aIbumine correspond ante, la molecule aIbuminoide de-
gradee donne naissance a des produits diaIysables qui pas-
sent .dans l'eau distillee, OU ils sont decelables par les
reactifs des peptones. des polypeptides et des acides amines,
la ninhydrine en particulier. Les albumines non· attaquees
ne dialysent pas.
On opere sur une petite quantite de matiere aIbuminoide :
tis sus prives eTe sang, corps microbiens prives des peptol'!es
du milieu et degraisses. On fait bouillir pendant 5 minutes,
on filtre. et a. 5 centimetres cubes de filtrat, on ajoute 1 cen-
timetre cube de ninhydrine alp. 100. On fait bouil1ir de
nouveau pendant une minute. Si, apres 30\ minutes, il ne se
produit aucune coloration violette, on essore les fragments
de tis sus ou les microbes entre plusieurs epaisseurs de pa-
pier filtre, sans les toucher avec les doigts. Dans Ie fond
d'un dial:yseur dont la permeapiljte a,ux peptones et l'im-
permeabilite aux albumines Ol1t ete prealablement eprou-
vees, Qn depose 0 cc. 25 du tis~u au des microbes, essores
comme il vient d'etre indique, et 1 centimetre cube du serum
a eprouver non chauffe ; dans un second dialyseur temoin,
on verse 1 centimetre cube de serum seulement et dans un
troisieme, 1 centimetre cube de serum chauffe 60 minutes a
580, et on couvre Ie tout de toluene. Les trois dialyseurs
sont introduits dans trois flacons d'Erlenmeyer contennnt
20 centimetres cubes d'eau distillee sterile qu'on co~vre
ensuite d'une mince couchede toluene (1/2 centimetre cube).
On bouche sterilement les flacons et on les porte it l'etuve
 LlPOIDES LIBRES ET FERMENTS DE DEFENSE 287

a 37 OU on Iaisse Ia dialyse se poursuivre pendant 16

0

heures. Apres ce temps, on enleve les dialyseurs avec une

pince £lamMe, en agitant Ie dialysat. On preleve ensuite
dans chaque flacon 10 centimetres cubes de Iiquide qu'on
verse d'abord -dans des verres steriles, sees, OU Ie toluene
entraine s'evapore, puis dans des tubes a essai contenant
o ce. 2 d'une solution de ninhydrine a 1 p. 100. On intro-
duit dans cliaque tube une petite baguette de verre bien
seche,lpour obtenir une ebullition reguliere, et on fait bouil-
, IiI' pendant une minute dans Ia flamme d'un bec Bunsen.
On laisse refroidir ; apres une demi-heure on lit les resul-
tats. La reaction est positive guand les temoins-serum res/enl
incolores et gue Ie dialysat du melange Serllm tissu ou microbes'
pl'esenle une leinte bleu violet pIlls au mains intense.
eeUe technique com porte tant de causes d'erreur et les
renseigl)ements qu'elle fournit sont d'une imprecision telle,
qu'il est preferable dans la pratique de rechercher les pro-
duits de la prot~olyse par la methode suivante :

b) REACTiON DE WOLLMAN AU BAG TERIUM COLl

Le principe de Ia methode est Ie suivant :

Ensemence dans divers milieux albuminoldes : blanc
d'reuf, caseinate ou albuminate de sou de, serum sanguin
(dans certaines conditions), Ie Bacterium coli se multiplie
sans produire d'indol. Mais lorsque les pro.teines des milieux
ensemences avec Ie B. coli ont subi auparavant une action
proteolytique quelcpnque et qu'elles contiennent du trypto-
phane, l'indol apparait dans Ie liquide de culture. II suffit
done de rechercher l'indol avec Ie reactil d'Ehrlich au para-
dimethylamidobenzaldehyde, apres extraction au moyen de
I'ether, pour deceler la protoolyse.
Technique. - Le milieu dans lequel on veut rechercher
l'indol est ensemence de B. coli et place a l'etuve a 37 0 pen-
dant 36 a 48 heures. On en preleve une partie qu'on me-
lange en agitant legerement avec un volume egal d'ether;
on decante ensuite 1'other ot on ajoute Ie quart environ de
son volume d'une solution a 4 p. 100 de paradimcthylami-
dobenzaldehyde ; on fait arriver doucement, au fond du
tube contenant ce II?-elange, 1 a 2 centimetres cubes d'acide
ehlorhydrique a I'aide d'une pipette effilee. Lorsqu'il existe
 288 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

de l'indoI I un anneau rouge vio'let se forme it la limite lle~

liquides (voir la technique {Ie A. Berthelot pour la recher-
che de l'inddl, chaIt. xxxn).
Avant d'app1iql.ler cette reactiO'n it l'etude d'une proted-
lyse donnee, on doit s'assurer que l'albumine employee
tontientdu trJ ptophane, acide amine generateur de l'indol.
Pour cela, on soumet cefte albumine a la digestion tryp-
siqde, a l'hydrolyse acide bu a l'attaqtte par un microbe
proteolytique. Dans Ie milieu ainsi digere (et neutralise iii
. ron a en recours it l'hydrolyse acide) on ensemence un B.·
cali tres indologene et on techerche, suivant 1a techniqd~
precedenle, s'il y a formation d'indol.
La presence de tryptophane dans l'alhnmirre elant eta-
hlie, on procede a l'experrence prO'prement dite : on ajoute
eette albnmine au milieu qu'on Suppose contenir des fer-
ments proteolytiques. Apres quelques jours, on y ense-
mence dn B. co'li, puis on fait la reaction de l'indol. Un
tube contenant l'albumine seule dans l'ea'u physiolog.iqrre
et un autre contenant Ie milieu seul servent de temoins~
 CHAPITRE XXVI

HEMATIMETRIE ET HliMATOLOGIE.- CYTOLOGIE ET'

CYTODIAGNOSTlC. - VITESSE DE l:OAGULATlON. - '
INDIeE OPSONIQUE. ~ MESURE DE LA RESISTANCE
GLOBULAIRE.

A. - Solutions conservatrices des bematies.

,

~
Solution de sulfate de·soude de den-
Liquide site 1.020. • . . . . . • . 100 ce,
de Marcano. Formol du 'commerce (it ~o %). . Icc,
( Eau distilled. . • • • 200 gr,
l.iquides I NaCI chimiquement pur. I gr,
deHayem.- Sulfate de soude pur. . 5 gr.
a) ( Bichlorure de mercure. o gr. i)
200 gr.

~I
Eau distilJee. . • . .
a) his NaCl pur . . • • • . 1 gr.
modijie. Sulfate de soude pur. • 5 £r,
Sol. iodo-ioduree (b). • a CC, 5
b) Sol. Eou distilIee. • • . . • . 100 gr,
iodo-ioduree 5 gr,
(de Hayem). ( }o~~ e~ p;i1iett~s,' Ii ~at~r~tio·n.
Le nombre moyen des hemalies chez l'homme adulle esl de
5 millions par millimetre cube. de 4.500.000 chez /0 femme
el de 6.900.000 chez le notiveau.-ne.

B. _ Emploi de l'bematlmetre 1.
Cet appareil se compose:
10 D'un tube melangeur-aspirateur gradue (de P.olairi)
pourVll d'un ajutage en caoutchouc, avec JequeJ on re-
cueille, par piqure au lobule de l'oreille ou au do\gt, une
goutte de sang qn'on aspire jusqu'a la division 1. On es-
suie la pointe du melangeut:· avec un papier buvard et,

1. COl'ltptc-gldbulc(; de Mnlasacz; conslruit par Stinssnic j 204, houle"al"\l nnspnit.

Pnris.
lucnORIOLOG1" HI
290 RSACTIONS HUMORALES ET HSMATIMSTRiE

aussitot, on aspire Ie liquide conservateur jusqu'a ce que Ie

melange de sang et deliquide, remplis~ant Ia petite ampoule
qui contient une perle de verre, arrive au trait 101. On
agite pour que la masse de liquide, soit bien homogene; on
expulse, en souffiapt ~Quceme:pt par l'ajutage de caout-
chouc. ce qui restait dans la partie capillaire du melangeur
et on ver!?e nne goutte du liquide·de I'ampoule slir lil partie
~entrale dll porte·opjet qUlldrille form<lnt c1}ambre hu-
wi.de;
2° D'un porte-objet chambre humide constitue par une
cellule creuse it rigole et portant une lamelle couvre-
objet it n'.s!'lOJ;t. Lfl goutte de !'lang dilu~ au 1)100 a
examiner se trouve ainsi tres egalement etalee enite la
partie centrale du porte.objet et 1a lamelle CQuvre-
objet.
La partie centrale du porte-objet presepte un quadrillage
gradue it A. Chaque re~tangle de ce quadrillage correspon'd
it un dix-millieme de'millimetre cube de sang, On compte
les hematies con!eQues ,d~ns l}n nQmbre x de c~rrfs, 20
par exemple, On additionne les chiffres ainsi obtenus, en
comptaQt pour urie demie les hematies qui sont a .cheval
sur les traits limites. On multiplie ensu,ite ce chitrre l~ par
10.000 et on divise par Ie nombl'fr x de carres examines. Le
nombre n d'hematies par millimetre cube de sang est alors
fourni par Ja formule :
N = n X 10.?OO.
x carres

Si, au lieu de diluer Ie sang au 1/100, on veut Ie dilu~r au

1/200•. au au 1/300, au au 1/500, on aspire seulement jus-
qu'a la gradqatiQU 2, 3 ou5 dans la pipettt:. capillaire avant
d'aspirer Ie liquide dilueur jusqu'au trait 10l.
Pour la dilution ,au 1/200 au 1/300. la formule. devient
a.lors :
n X 20.000 n x 30.000 l
~ = '" (carr<~s) ~u ~ = x (carres) • ~ c.

Avee I'hema\in1etre de Thomas-Ze~s, chaque carre de

quadrillage, recouvert de 1a lam ell e) 'correspond a 1/40000
de millimetre cube.
 CY'f(JI.Q.GIE. VI'JEf?Slj; J){E C(J.JlGllLJj.TIQ)V ~~l

Si fl r~pr~~IJie Ie nptQ.l>j:'e .d'.hAnwties cQ.lJJ"pt#1l (It $! Ie

p~hJ,"~ ~,carres", Ja fprtnule ,~~t qlon; :
J)T F .40.000_1>< '10.0 !X n
~

......
j:.. -.,Numerati()ll et determin.at:ion deli leucocytes.
Cytodj~&,nosti,.;. •
1

.L9rsqp'oq etudie les ieucocytes viv.ants provenant d'exsu·

~t;>, IPflT exelP,ple,.en VU(l de. r\lcherch~s relatives au pou-
voir-phagocytaire, il est a1lantageuK, pour .eviter la 'coagu-
htion'de la fi~~ine, de mettre ces elements en suspension
dans Ie liquide suivant, prealablernent sterilise par la
chaleur:
Chlorure de sodium pur. o gr. 63
Citrate de soude. • . . 1 gr.
~ll' dl$~il!ee. • . . , '}.QO ,"c.
,
, )pour fa Qumeration des qlobllies blqncs, au lieu du liquide
oe Haye'm on emploie :
Acide aclltiqlle. . I • 2 gr.
• • • • • •

J:;all di~tillee. , . . . • . . • . . 100 cc.

~ol. aid. sllturee de bleu cle metbyltlne. • ice.

L'acideacetique Mtruit les hematies et ttl hieu colo.r~ les

noyaux des ltmcocytes, de soyte que,ees rl.erniers s'o411 bien
visibles.
O~ peue egalement employerle liquUle.de Toisson :
Ellu distillee. . J . . . . 260 ce.
rny~eri{je pure a 300 H'. . 3D gr.
SllJ{jlt'1' #e .soupe. . . f • . , ·6 IU.
Chlorure . de &odium. . • I gr.
Molet'de methyle 5 ou 6 B. ·0 gr. 0~5

La proportion normale des leuClJlJyte:; aux Mfll{f;li~s d{1J1{J Ie

'sallg humaiti.e$l de ,1 p. 1130 ; 5,oit :
is.OOO leucocytes '11"_' ....
"(I(J 1 pll,r JDIM)Ul,dre cu ... e.
5 :000 ''''" g. rouges

~
Polyd'uc!eaiI'es. • 66 ~
l!of[!'ule leucocp- Monon'hcleaiI;e~. • ,33 pour
talre norll!al.. Eosinophilcs...' .1 100 leucocytes
292 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

Chez Ie chien, Ie nombre moyen des leucocytes est de

7.500; chez Ie hamf, de 1l.000; chez le lapin, de 11.300 ;
chez la grenouille, de 180 seuletnent.
Chez l'homme Ie nomhre moyen s'eleve souvelft a 7.200.
Le pourcentage des diverses varietes de globules blancs dans
Ie sang Ilormal hurilain est Ie suivallt :

1
•
P,lynn"""M ""',o,hil"
(10 a 15 micf<!ns). • • 2 a 4 %
Moyenne.
3 p. roo
a) formes Mastzellen ( basophiles )
myeloides. (8 a 12 microns).. . . o it 1 % 0,5 p. 100
Polynucleaires neutrophiles
(10 it 14 microns).. • . 42 a 75 % 67.0 p. 100
~ Lymphocytes(5it8micronsl. 21 it 25 % 23,0 p. 100
b) Formes Grands mononucleaires (10
lympholdes. a 25 microns). . • . . 411 8% 6,0 p. 100

••
Cylodiagllostic. '- Po~r efIectuer Ie ~ytodiagnostic ou
sang ou d'un exsudat, on eta Ie sur trois lames Ie culot de
centrifugation, en couche mince. On laisse secher un instant
et on fixe:
Une lame par l'alcool-ether, 4 a 5 secondes.
Une lame par l'alcool absolu, [5 minutes; ou par racide
chromique alp. 100 une a deux minutes\.XAptes ce Jemier,
lavage in:tmediat a l'eau courante.)'
Une lame par Ie sublime iode, 1 a 2 secondes. (Lavage
immediat a l' eau cOUl'ante.)
On seche en position verticale pour ~viter les poussieres
et Oil colore:
La premiere 'lame par hi'!mateine-eosine qui decele les
granulations eosinophiles : bemateine filtree, 4 it 5 minutes;
lavage a 1'eau, puis :solution aq'ueuse d'eosine alp. 200,
1 minute; laver a l'eau, essorer, secher et examiner direc-
teruent dans une goutte, d'huile de cedre.
La deuxieme lame par .la thionine pheniquee ou par l~
bleu polychrome de U nna qui colore les granulations haso-
philes et metachromatiques (colorati<:m 1 minute, puis la-
vage a l'eau). ;; J
Lp tJ'oisieme lame par Ie trjacide j Ehrlich qui colore it
la fois les granulations eosinophile'S et neulrophiles.
 CYTOLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 293

..
*

Pour Ie cytod"iagnostic des exsudats pleuretiques ou des

liquides cephalo-rachidiens, dans lesquels il s'agit surtout
de rechercheI'. la proportion des lymphocytes, il suffit de
prepareI' une seule lame que I'on fixe a l'alcool absoln ct
qu'on colore a la thionine ou au bIeu p01ychrome de Dnna,
ou mieux au Giemsa dilue ~) 1 centimetre cube de colorant
pur pour 9 centim~tres cubes d'eau distillee, 30 minutes, puis
lavage a l'eau: les hematies sont colorees en rouge brique.
les cellules endotheliales en bleu fOl\ce violace, les granu-
lations neutrophiles en brun fonce, les eosinophiJes en
rouge brun, les basophiles en violet.

D. - Numeration des leuGocytes et de~ parasites du

sang par Ie procede de la pipette d~ Thompson.

Les pipettes Thompson 1 se font en deux modeles : l'un

de 1/8 de.millimetre cube, l'autre de 1/4 de millimetre cube
entre chaque division. Le second est plus commode pour
les debutants. 1:e premier est plus approprie au travail ra-
pide et precis
Piquer avec une aiguille Ie lobule de l'oreille ou la puIpe
du doigt ; laisser exsuder un~ goutteIette de sang sans com-
primer les tissus, car la compression force la Iymphe et les
lymphocytes a sortir des vaisseaux Iymphatiques.
AspireI' Ie sang dans la pipette. En expulser aussitOt une
partie jusqu'a ce que la colonne coincide avec l'une des
lignes de Ia ghduation.
Essuyer la pointe de Ia pipette et expulser 1/8 ou 1;4 de
millimetre cube de sang sur une lame tres propre. Expulser
.aussitot, dans un verre contenant un peu d'eau distillee, Ie
reste du sang contenu dans la pipette et laisser tremper la
pointe de celle-ci dans l'eau, afin d'empecher qu'eJIe se
bouche par suite de la formation d'un caillot.
Expirer la bouche ouverte sur la gouttelette de sang de-
posee sur la lame, afin d'empecher qu'elle se desseche sur
les bords, et l'etaler a,:ec la pointe d'une aiguille (posee a

1. Chez C. Bakel'. opticien, 244, High Holbarn, Landre. W, C.

M4 RltACrJoNS ilUMOI1AtES itt H£MATIME'tRIE
plat) en un petit earrt~ d'environ 4 millimetres de cote:. Ce
carre doit etre aussi net et uniforme que possible. Si ron
utilise la pipette de 1/4 de millimetre cuhe, Ie carre dQit
avoir 5 milIimMres de cote. (On en deIimite, au prealable,
lletendue par un trac~ a l'enore ou au crayon gras, sous la
lame porte-objet.) .
S~cher Ie carre i'l. l'air pendant quelques secondes. Fixer
deux minut~s a {'aleool absolu (20 minutes pour les para-
sites malariques) et coh>rer par exemple pendant !20 a gO
minutes avec Ie Giemsa au 1/20), Laver et secher sut un.
papier buvard.
Sll'tm desire c<?mpter les paras~tes malariques, Ie earrt~
sera (aIt un peu plus petit et plus epais, puis on fixera It
1'alcool abs01u acMique (5 eentim~tres cubes d'acide aeetique
dans 95 centimetres cubes d'alcoo1 absolu). Les hematies
sont aiiHli dMoldrees ·et r~hdMt les parA~ite!! p1u~ visibles.
P{J'ur ctltflpfet leI> I~Ucocytes, les, tI'ypanosOlties et les
corps en croissants, la decoloration des hematies n'est pas
hMessai~.
Netloyer et s~d1er inlffiedil1~h1ertt la pipette eh aspitaht
Ili feftmla:nt cil! l'etltl plusilluts (ois dans Ie, tubl:! eapilfail'e.
rtJpetet ce lavage avec de l'aftdol absolu et de fetber, puis
aspirer de l'air et essuyer I' extremitc avec soin.
Si ht pipeH~ "VtUil1it a ~tte obstrtlee, rill\merger, port!' dis-
soudre Ie cai11ot, darts dlt tube a clisi1! cot'ltefIfit1t de l'!rCide
nitl'iqa:e. Placer 1e tUbe art hrti11-trtatie, Ie porter a l'ebUlIi-
tion et reftditlil' plttsieu!'li t6i~.
L6l'st]u~ 1a pipt!tte est en usage constant, il est bon d'y
a!;pitM un peu d'l1~ide tlittique fott et de 1'1 \aisSllr route Ia
nuit. Avant de s'en servir de nouveau Ie lendetnain, on 1a
lave ~n ~ouff1a11l dans l'tilcdttl poul' s'i1sSurer que 1M; huIles
d'ai!' s'M:happettt HbreftIMt.
POUt ~tltrtptet les leucbCytes tiu les parasites, il faut dis-
a
poser d'tln microscope phttitl.e gtadU~e et d;un o~ulaite a
diaphtaghle cart6.
On depose tlfte gouhe d'hrtile a imnlersi6rl ditectemeht
stir ll:! sllHg seche et colortl, sllns lamelle. et od examine
aVec l'objettif i'l. immersion. Ort chetche 1e bord supenetlt
dtl carte de sang ct, aU thoyen de la graduation de ra
platine, on compte combien il y a de champs jusqu'au cin-
quieme, it partir drt Mtd §b.}Jetiel1J.'. Stu' eette ligne, on pm!se
 CY'/OLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 29!i
en reVUe ch:1que champ transvers:11 d'Un hard tl l'autre.
On revieht a la, bande verticale et, au dixietne champ a
partir du nord superieur, on examine une nou~lle banda
horizontale. On repete Ia meme manreuvre au quatric)me
champ a partir du bard superieur et\ finalement, on revient
it la bande verticale jusqu'au bord inferieur.
Snpposons que ie nombre de champs microscopique&
entre les bords superieur et inferieur soit de 30 et que 1e
nambre moyen de leucocytes au de parasites' dans les troi"
bandes completes soit de 40, on en deduit que Ie nombre
total dans Ie carre de sang est de 30 X ~o = 1 2001 Mais 1~
carre de sang represente 1/8 de millimetre cube (ou 1/4
sllivttnt Ia pipette employee). DoHc Ie naI11brtl, par mllli-
metre cube, est de 8 X 1.200 = 09.600. ,
Si Ie carre de sang est de 1/4 de miliimette cube, alors
Ie nombre sera de 4 X 1.200 = 4. SOD.
II va de soi que, plus Ie nombre de leucocytes ou de pa-
rasites est petit, plus grand sera Ie nombre de bandes trans-
versales a examiner.
Mais, ell tegle g~Mrale, il ~uffit de comptet l~s ll':lU~ocytes
sur 3 bandes transversales seulemon t, si Ie sang est bien
uniformement etale. Si l'on veut compter toutes les bandes
transl'ersales, il ~aut environ 10 minutes.
L'erreur ne depasse pas 5 p. 100 sur 200leucocytes com-
ptes. .
Gette meth<1de evite la dilution du sang et l'emploi de
lames quadrillees speciales. Elle rend possible la mise en
reserve de preparations de sang sechees et coloree,;, que
ron peut gnrder par devers soi pour faire les numerations
plus tard. Elle permet de conserver les preparations pour
efTectuer ulterieurement des nutnerations cOI~paratives.
Elle permet enfin de faire la numeration des diverses es-
peces de leucocytes.

.
'"'"
E. - CMgulatloIt du satt~.
Reactifs empechanl la coagulation:
Oxaldte de sodium. 1 gr. p. 1,000 ce, de ~ang.
Fluoruredesodium. 3 gr. p.l.OOO .....
 290 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE
Citrate de soude. • 4- gr. p. 1.000 cc. de sang.
Hirudine' (extrait
de teles de sang-
sues). o gr. 040 mgr. p. 1.000
On re\(oit, par exemple, directement Ie sang dans un
vase contenant, pour 100 centimetres cubes de sang, 5 cen-
time,tres cubes d'une solution d'oxalate de sodium a 2 p. 100
ou 10 centimetres cubes d'une solution de fluorure de
&odium U 3 p. 100. Le chlorure de calcium (5 centimetres
cuhes de solution a 10 p. 100 pour 100 centimetres. cubes
du sang oxalate) coagule Ie plasma oxalate. II ne cOMu]e
'pas Ie plasma fluore.
A la dose de 2.600' Ie sulfate de zinc empeche comple-
tement Ia coagulation sanguin in vitro. In vivo, il suffit d'in-
jecter 2 mgr. de sulfate de zinc dans la circulation du
cobaye pour que Ie sang ne se coagule pas (Augu.~{c
Lumiere et Henri Couturier).

METHODE DE WRIGHT POUR MESURER LA. VITESSE DE

COAGULATION DU SANG

L'instrumentation necessaire consiste en

- Plusieurs ~ubes capillaires de 30 centimetres de lon-
'gueur, dont une extremite, effilee en pone et ouverte, est
tlx~e au moyen d'un peu de eire dans l'extremite, egalement
effilee en cone, d'un bout de tube it essai formant enton-
noir;
- Plusieurs tetines it soupapes de Wright;
- Vn bain-marie regIe it 37 0 et assez profond pour que
'les tubes puissent y etre entierement plonges en po~ition
-oblique, Ia tetine seule depassant a ]'ext~rieur ;
- Vne petite quantite de mercure bien propre.

1 On peut prepUl'er soi-mem.e un extrait de tetes de sangsues de Ia maniere sui-

vante : On coupe avec des ciseaux et, dans un flacon contenant 100 centimHres cubes
a'alcool absolu, on fait tomber Ie segment anterieur (Iete ot cou) d'une dizaine de
snng"ues. On bouche Ie flacon et on agile it pln"ieurs reprises. Apres 24 heures on
recueille les tetes de sangsues sur un flltre, on Ies seehe clans Ie vide et on ]es hroie.
On obtient ainsi une! poudre, que ron pcut conserver it l'abri de l'air et de In. lumiere,
pour en preparer une maceration aqueuse pal' trituration avec quelques centimetres cubes
d'eau physiolol,(ique au fur et It mesure des besoins. L'exl"'it oblonu avec .trois.tetes de
sangsues par kllogramme de lapin sumt a empecher la coagulation du sang pendant
.plusieurs heures quand on rinjecte dans les veines. In vitro; une tete par 30 it 50
centimetres cubes de sang represente, ell general, nne dose con venable. En presence
de cet extrait, )c sang l:e.ste inuefiniment fluide.
 CYTOLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 29-7

Les·tubes capillaires etant fixes par l'une de leurs extre-

mites, au moyen d'un peu de cire Golaz, sut Ie bout" du
tube qui porte'la tHine a soupape, on les marqul'!, avec de
I'encre a ecri"re sur Ie verre, de deux traits bien vlsibles a
-5 centimetres de chacune des ouvertures.
On prend un premier tube ainsi monte. On en presse Ia
tHine pour chasser l'air, on plonge l'extremite libl'e du
tube dans du mercure et on en aspire, a l'aide de la tetine,
juste la quantite suffisante pour remplir Ie premier espace
de 5 centimetres de longueur. .
On plonge, aussitot aprils, la meme extremite du tube dans
nne goutte de sang frais prlHeve par piqure (an doigt on
au lobule de l'oreille chez l'homme). On prend soin de
laisser Ie moins de temps possible cette g.outte au, contact
; de I'air.
On aspire Ie sang dans Ie tube capillaire, de telle sorte
qu'il occupe tout l' espace compris entre les deux traits.
L'intervalle compris entre l'ouverture libre et Ie premier
trait sera donc occupe par de l'air, et l'intervalle compris
entre Ja tetine et Ie second trait sera' occupe par Ie mer-'
cure.
Immediatement apres, on plonge Ie tube dans Ie bain-
marie, en position oblique, pour eviter la projection brus-
que du mercure (s~us l'effort de dilatation) dans Ie petit
entonnoir porte-tetine. On l'y laisse un temps determine
(Ie te~ps de coagulation moyen est de 2'30 pour Ie sang de
l'homme adulte, de l' a 1'20 pour Ie sang de cobaye),
compte par un indicateur a secondes Le delai qu'on s'etait
fixe (1, 2, 3 minutes ou fractions de minutes) etant, expire,
on sort Ie tube du bain-marie, on en essuie rapidement
l'extremite libre avec Ie doigt et, par pression sur la !etine,
on projette tout son contenu, mercure et sang, sur un carre
de papier a filtrer blanc.
Si Ie sang n'est pas coaguIe, il forme sur Ie papier buvard
nne large tache rouge.
S'il est coaguIe partiellement, on trouve sur Ia tacbe des
filaments de fibrine plus ou moins volumineux.
Si Ia coagulation est ~omplete, Ie bloc de sang projete
s'etale en un petit tube de meme diametre que Ie diametre
interieur du tube capiIlaire et tache a peine Ie papier-
filtl'c.
298 R:SA01'tONS HUMORALES ET HEMA1'IMEtRIE

Si In coagulation est trop complete (ce qu'il fant e'Viter),

Ie satlg ne peut plus etre projete par pression sur la teHtte
hors du tube. capill~ire et on est altlrs oblige de cObper
celuiAci.
II est toujours avurttageux de faire ceUe epreuve avec au
'moifiS deux tubes, pour preciseI' Ie Mlai de coagulation.
Lrt tnesure, aifisi effeciUee, de hi. coagdlabilite du sang,
Mt t6ute relative, ntais elle fdtirnit des resultats aSsez eltac-
tern ant compa~ables entre eUx .

.
....
F. - Potivoit l>hagocytaire des leucooytes.
Mesure de l'indice opsonique.

Pour effectuel' In mesure de I'indice opsonique d'tln

serum, il faut meitre el1 presence:
1d Des letlcot~ytes ;
20 Une emulsion microhienrie cOfiVElnablemertt preparee;
30 Le serum a Mudier.
Cas trois elements Mant melanges en patties egales. on
1es pol'te dal1s tine pipette, it I'MuV'e a 37°, pendant quinze
ott -vingt minutes. On fait en suite des preparations colo-
rees. Ort compte Ies elements microbienb COtHenus dans
un certain l10mbre de leucocytes et on etablit In moyentle
du IHHnbte de microbes phagocytes par leucocyte. On
dbticnt ninsi un chi.£1re qui indique Ie pouvoir op!wnitjue 'tIq
serum c()nsider~. Mait;, cornme les conditions (concentI'd~
tiott de la susp~nsion de leucocytes I'll de I' emutsit:Jn micto-
bienne) chnngetlt d'une experiertce a l'autre, les resuHats
obtehuS ne sont comparables et 'ne ptennenf une valeur cftle
si on les rapporte a un facteur constant, toujours Ie tneitle
dans loutel:1 serie-des experiences. C~ facteur constant
est represente par un SCI'um normal, celui de l'observateur,
pal' exemple. Au pbuvoit opsonique de cEl setum ietl1oin;
on compare Ie pduvoit opsonique du serum pathologiqtle
Mudic.
Le chiffre tepreseI'ltaflt Ie pouvoir opsonique d'Un de ces
serums, divise par Ie chiffre representant Ie podvoir opso-
nique du serum normal temoin donne l'indice opsoniql1e.
 CYTOLOGIE. VI'fESM's DE COAGrJLA1'IDN 299
a) Prepatatlort d~s leuco';!Jtes . ..... L~!l Iertcocytes
habituellement elilployes sont empruntes so it au sang
humain, soit a 1'exsudat peritoneal du c9baye. L'experi-
mentateur utilise gen#al~n1tmt s~s propl'es hmcocytes.
Il lui stillt de se piquer avec 1m vaccihbstyle la face
dorsale d'un doigt, pres de 1'bI1g1e, apres avoit ligature Ie
doigt a sa hMe. 'Environ :20 gonttes de sl1ng sortt recueiIlies
dans Ull petit tUbe cehtrifugeur a forid eftH~, ptealable-
ment garni d~ Itt solUtion anticoagulante dOtH voiti la
formuIe:
Epu distill<l'e. • • • • 1.000 cc.
Chlornre de sodium.. . 8 gr. 5
Cittate de Mude. • . . 15 gr.

If faut 8 ()u 10 patties de cette s6IutiM, au miftimmh,

potu' une pal:'tie d~ saIig.
ali fait Ie melaflgll en rel1vetsant et redrt:lssaf1fpli.Isie'urs
fois Ie tube dMt bn a bbtllr61'orifictnl.vec Ia pulpe du pcltlce'.
n tatU avoir 80in d'evitei' de secoUel' btustt\ien1~nt, pour ne
pas alter'el:' les leucocytes.
On cehtt'ifuge, pUis on lave Ie cuiOt. Porti' MIa ()f1 aspire
avec bIte pipette a houle Ie IiqUide qui surtulge. On verse
duns III lube 10 ceriti1tl~tres cubes d' eart saMe physiolo.
giqUe que 1'on h1elaI'lge au culot en relivel'saht Ie tube
comme precedemment, et l'on centrifuge de noUveau.
Cette operation est i'Cpetee trois fois. Prtis 011 enI~ve tout
Ie lieruiae. La partie la plus superficielle du culot contiedt
les glbhules bhlIics. Aflt1 de la sepatet de la couche plus
In'dfoucic fothlee des globules rouges, on incline Ie tube.
Les leuCocytM de la sUrface s'elalent. Ils sont reclleillis
par hspiratitm dans une pipette effilee gal'nie de Ia tetine
speciale de Wright. et portes dans un tube a essai Cburt,
de tres petit calibre (60 millimetres de longueur, 6 ou
7 mmi1nHr~s de dial11etre).
OIi petit encore se procurer des Ietlcocytes ell prcl-
voquant, chez Ie cobaye; la formatiot1 d'Uh 'Elxsudat
peritoneal par injection d'eau salee, de bouillon, etc.
UM ou de"\iX herltes api'es, en piquant 1'abdomen au cobaye
teriU par t111 aide, Ie ventre tendu dirige en bas, on pteleve,
a l'alde d'um! pipette ctrlIdee, a pclinte elllee, utI peu de
l'exsudat tiehe t\I1 leuMcytes; Oli tetUeille celrti·ci dan!';
300 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

1'eau citratee et on Ie traite comme il a Me dit ci-dessous

pour Ie sang.

b) Preparation" de Z'emulsion micl1obienne. - On

prend une jeune culture en milieu solide de 12 a 24 heu-
res. On en emulsionne une anse de pIa tine avec une
baguette de verre dans un tube dans lequel on verse
goutte a goutte quelques centimetres cubes d' eau salee
physiologique. de telle sorte que I'emulsion soit hien
homogene et lcgerement opalescenle.
S'il s'agit de bacilles tuberculeux, on prend une jeune
culture en bouillon glycerine agee de 10 a 14 jours. On la
sterilise Jt l'autocrave a 100() pendant 20 minutes. On jette
sur un filtre en papier et on lave les bacilles en versant sur
Ie filtre de l'eau sa lee physiologique jusqu'a ce que celle-ci
s'ecoule incolore., Une petite quantite de hacilles ,(environ
1 centigramme) est alors prelevee sur Ie filtre et deposee
dans un mortier d'agate. On hroie doucement et on emul-
sionne en versant goutte a gouttc (tout en continuant Ie
broyage) dc l'eau physiologique a l'aide d'une pipette
effiIee. On obtient ainsi une emulsion laiteuse que l' on
rend encore plus homogene en l'agitant dans un flacon
sterile avec des perles de verre. On la centrifuge ensuite
(pendant quelques minute'S seulement) pour la debarrasser
des grumeaux. \
Cette emulsion homogene est diluee avec de l'eau salee
hypertonique it'1 gr. 5 de NaCl pour 100 (c'~st Ie taux Ie
plus favorable), jusqu'a l'obtention d'une concentration
microbienne determince qu'on apprecie d'apres son opales-
cence, laquelle doit, etre tres legere. II faut pour cela envi-
ron 50 cen~imetres eubes d'eau salee pour 1 centigramme
de bacilles.
L'cl}1ulsion ainsi preparce peut etre sterilisee Ii ]050 et
conservee en tubes seelles qu'on aura soin de bien secouer
avant chaque experience, pour mettre les. baciJIes en sus-
pension aussi fine que possible.

c) Preparation du serum a etudier. - On se pro-

cure Ie sang chez l'homme par piqure de la face dorsale du
pouce ou du bord posterieur du lobule de l'oreille. Le
sang est aspire par capillarite dans un petit tube a extre-
 CYTOLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 301

mites effilees dont I'une est recourbee. Quelques gouttes

suffisent. pn laisse pendant deux ou trois heures Ie serum
se separer du caillot et on sectionne Ie tube au couteau a
verre au mom~nt de l'usage. Chez Ies animaux de Iabora-
toire ;(Iapins, cobayes) et aussi chez le bomf, c'est par
piqtire de l'oreille qu'on preleve Ie sang, en piqual,lt au
niveau d'une des veinules que l'on voit par transparence.
Chez-Ia souris et Ie rat, c'est par section au ciseau du
segment terminal de la queue.
II faut que Ie serum soit clair, pal'faitement exempt de
globules r;ouges, car Ia presence de ceux-ci fausse comple-
tement les resultats. II peut Ctre conserve II Ia glaciere
pendant 6 a 7 jours, ce qui permet d'utiliser en une
seule seance les serums recueillis pendant toute une
semaine, par exemple, chez Ie meme sujet ou chez divers
malades.

d) Technique de la reaction. - Possedant les trois

elements necessaires, leucocyles, emulsion microbienn~
Se/'l[nt, il reste ales mettre en presence.
·On prepare un certain nombre de pipettes capillaires. II
est commode et economique d'employer pour cela des
segments de tube de verre de 10 a 12 centimetres de lon-
gueur, tels que ceux qui servent a fabriquer les pipettes dans
les laboratoires. On les etire en leur milieu, en prenant soin
que l'effilure soit bien regulierement calibree. On sectionne
au milieu de la partie effilee et on obtient ainsi deux pipetles·
de calibre ega!.
A deux centimetres de Ia pointe ouverte, on marque un
trait au crayon bleu. On ada pte a Ia pipette une tetine a
soupape (de ·Wright) qui sert a I'aspiration et au refouIe-
mcnt. On aspire une petite colonne d'cmulsion bacillaire
jusqu'a ce qu:elle afileure au trait de crayon bleu. On
laisse alol's penetrer une bulle d'air. On aspire ensuite une
egale quantite d'emulsion de Ieucocytes et on Iaisse pene-
trer une nouvelle bulle d'air. On aspire enfin une egale
quantite de serum.
Le tout est aIoI's refoule sur pne lame de verre et melange
pat une serie d'aspirations et de refoulements successifs
et, la pipetteetant tenue bien vertical,e, on y reintroduit Ia
totalite du melange. On scelle l'extremite du tube ~ Ia veil-
302' REAG'I'IONS HUMORALES ET nE.MATIMETRIE

lelise d'un bec ·Bunsen et oU'I101'te a l'e\,uve a 370, eN. p'osi-

tion'inclinee, pendant '20 minutes 1, . '
Au sortir de l'etuve, on brise la ,pointe de Ill. pipette, on
refoule son contenu sur une lame de verre bien propr;e en.
hrassant de. nouveau" et on fait des etalements sur lames
avec Je bord d'une autre lame rodee.
Les preparations, sechees pendant quelques minutes:it.
l'etuve, sont alors fixees pal"l'alcool absolu, puis lors.qu'il
s'agit du bacille, tuberculeux, colort~es a froid, pendant demt
heures a 37'1, par une solution de Ziehl -oontenant seu-
lem~nt 3 p. 100 d'acid~ phenique. On deoolore ensuite
par l'alcool acetique, on lave ~ l'eau, on reoolore pendflnt
30 secondes au blen de methylene ou a l'hematoxy}ine.
S'il s'agit d'autres microbe.s facilement colQrobles, on
se sert du bIen Borrd a l'oxyde d'argent au, simp!ement,
de la thionine ou du bleu de toluidine. On lave a l'eau 6t on
evite la decoloration par l'alcool.
La preparation lavee et sechee (lentement a l'etuve) est
pOI'tee en fin sous 1e microsco"pe. On passe en revue 100
leucocytes polynucleaires 6t on noJe au craY()Jl Ie nombre
de bacilles contenus dans chaque leucocyte, en iuscrivant
o pour ohaque leucocyte qui n'a rien phagocyte.
Si l'emulsion miorobienne n'a pas Me faite a use dilution
convenable, la phagocytose est tro.p ab9ndante ou 11e 1'esj:
pas assez, c'est alors une cause d'erreur dans la nume-
ration. II faudra done recommencer' l'experien~e en cher-
tt:hant a ohtenir une emulsion qui dQnae en moyenl).e de 2
a 4 microbes phagocytes par leucocyte, en ,presence d\lU
serum de.sujet normal.
Dans la numeration, il ne faut pas tenir co.mpte des
amas de microbes. On ne devra noter que les leueo.c'y~es
bien distincts et bien colort~s·.
Certains p.olynucleaires renferment une grande quantite
de microbes qu'il est impossible de compter. Dans ce cas,
Wright et ses eleves ant adopte Ie chiffre 9 invariable·
ment.

1. Si l'on .. sOil-vent it eff~ctuer des deterlIjinations d'indices. op"llniques, il est

recomm,,-udablc de se servir de la p.,etite etuve speciale construite pour cet 'Objet, sur
leo indicatiQ,IlS, de Sir A. .•\Vright, par l:unaison Hearson, de L.Qnql)eS <~35, Reges>t
Street). On l"eut se procurer ceUe etuve, ~ins~ gue les tetines a soupapcs pour pipettes
de 'W"ight, chez Cogit, 86, boulevard Saint-Michel, a Paris.
 C,¥TOLOOIS. VItESSE De CO~GULA'l'ION a03
OJ,1 f;)taplit Ie pouuoir pp~()lliQ1,le Qll qllotient leQcocgt(1ire
de chl,lq\le serum, en divisant p~r WO Ie l10mbre de micro-
bes co~nptes daps 100 polynucleail~&. L'illdice opscmique est
I;lnsuit~ d~ten~in~ ~n divi~ant Ie pouvoir 0Plionique ·d'\ln
slirqrn patholDgiquc, ou Sl,lPPOlie tel, par Cf,.llui d'un liefllm
normal temoin qu'on l,ltilise dans toute la serie des expe-
riences.
Soit Ie serum temoill T, dont Ie pouvoir opsonique est,
par .c"emple, d~termine ainsi :
200 microbes _ _ 2
100 polynucleaires -

at les Serums iI. eludier A et B. Si nous avons :

400 Qa.~illes
Pouvoir opsonique de A :
100 polynucleaires
= 4,
1 00 bacilles
Bonvoir opsouique de B : = 1
100 polynucleaires

Les indices opsoniques seront :

Ppuvoir opsonique de A _ ! _ 2 00
pour Ie serum de A : Pouvoi,r opsonique de T - 2 - •
Pouvoir opsonique <ie B _ ~ = 0 "
POl1r Ie serum de B : Pouvoir op'l,onique de T - 2 ,0

Nota. - Vis-a.-vis du bacille tuherculeux, l'indic(l opSO-

nique des serums normaux varie de 0,80 a 1,20. Chez les
malades il s'abaisse au-dessous de 0,80.
La determination d'un indice pris isolement n'offre aucun
interet. C'est seulement l'.etude de la courbe opsoni,que
d'un. malade ou d'un animal qui peut permettrede tirer des
conclusions utiles au diagnostic, au pronostic ou a1,lx dIets
d'une medication.

••
G. - Mesure de la resistance globulair~. H~molyse.

La mesure de la resistance globulaire a pour objet de

determiner la fragilite propre des hematies soit vis-ii-vis
des solutions salines ou n1edicamenteuSeSj ~iOit vis-il...vis
.des serums normaux ou pathologiques.
3M REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

a) Resistance des hematies aux solutions salines.

- Pour determi'n~r la fragilite propre des hematies
provenant du sang' d'un malade vis-a.-vis du chlorure de
sodium par exemple, on preleve, par ponction aseptique it
]a seringue, 10 centimetres cubes de sang dansune veine du
pli, du bras et on defibrine aussitot ce sang par agitation
dans un petit flacon sterile contenant des perles de verre.
LOIlsque'la defibrination est achevee, - ce qui ne demande
que quelques minutes, - on aspire 5 centimetres cubes du
liquide avec une pipette graduee sterile et on les verse dans
un ,tube centrifugeur'prealablement tare. On marque id'ex-
terieur du verre, par un trait de crayon gras, Ie volume
ainsi occu.p~ par Ie sang defibrine et on centrifuge jusqu'a
separation complete du serum.
On decante alors celui-ci; on remplit Ie tube avec de l'eau
salee physiologique a 9 p. 1.000 ; on agite pour remettre
les hematies en suspension et on centrifuge de nouveau.
On repete trois fois ceUe operation qut a pour but de
laver les hematies et de les debarrasser completement du
serum.
Apres la troisieme centrifugation etdecantation du ]ictuide
de lavage, on verse dans Ie tube une nouvelle quantite d'eau
salee physiologique correspondant, aussi exactement que
possible, au volume primitif du sang m\s en ceuvre (5 centi-
metres cubes), jusqu'au trait de.crayon gras marque a l'exte-
rieur du tube. On agite une derniere fois pour remettre les
hematies en suspension bien homogen~, et c'est cette emul-
sion d'hematies lavees dans l'eau physiologique qui sert a
efl'ectuer la mesure de la resistallce globulaire.
On aura prepare d'avance :
1 .serie de 12 petits tubes centrifugeurs de 10 centimetres
cubes de capacite sur un porte-tubes; .
1 solution de chlorure de sodium pur, rondu, a lOp. 1.000,
sterilisee a l'autoclave ;
2 pipettes. effiIees steriles permettant de repartir I~s
liqu·ides par gouttes egales.
Dans chacun des 12 tubes, on versera d'abord un nombre
progressi vement croissant de gouttes d' eau dis'till~e en 'C9m-
men<;ant par 10 gouttes dans leler tube eten augmentant de
2 gouttes d'un tube a l'autre. Le 12" tube Tecevra' ainsi
32 gouttes.
 CYTOLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 305

Avec Ia meme pipette, on versera ensuite dans 'chaque

tube un nombre progressivement decroissanl de gouttes de
solution salee a 10 p. 1.000, en comment;ant par 40 gouttes
dans Ie ler tube et en diminuant de 2 gauttes d'un tube a
I'autre. Le 126 tube recevra ainsi 18 gouttes.
La propor:tion de chlorure de sodium pur contenue dans
chaque tube se trouve etre ainsi de 0,80 p. 100 dans Ie
Ier tube, puis successivement 0,76. 0,72, 0,68,0,64,0,60,
0,56,0,52, 0,48, 0,44, 0,40, et enfin 0,36 p. 100 dans le dou-
zieme.
On agite Iegerement Ie support pour melanger les liquides,
puis. avec fa seconde pipette. on aspire l'emulsion de sang
defibrine lave et on en laisse tomber une gontte dans chaque
tube. Une petite secousse assure Ie melange des liquides.
On laisse en contact 30 minutes it la temperature de 370,
puis on centrifuge rapidement taus Ies tubes et on lit Ies
resultats.
Suivant que l'hemolyse est nulle, partielle, intense au
totale, on la note par les chiffres 0, 1, 2 et 3, au par 1 a
3signes+.
A 1'etat normal, I'hemolyse se produit a partir de Ja con-
centration moyenne de 0.44 a 0,48 p. 100 de NaCI.
Dans certaines maladies, principalement dans les icteres
hCtnolytiques, Ia fievre bilieuse hemoglobinurique, Ja chlo-
rose, etc., les hematies sont particulierement fragiles. L'he-
molyse se produit alors parfois avec des concentrations
salines supericures mcme a 0,80 p. 100.
On pent mesurcr par la meme methode Ia fragilite ou
Ia resistance des hematies en presence de differents sels
au de substances medicamenteuses, par exemple de In qui~
mne.
Lorsqu'on effectlle Ia mesure de Ia resistance globulaire,
if y a toujours interet a eludier separemenlies hemalies et Ie
serum d'un meme sang pathologique ; fes hemaltes vis-a.-vis du
chlorure de sodium; fe'serum vis-a-vis d'hCmaties d'un sang
lmmain normal.

b) Resistance des hematies a faction hemoly-

tique des serums. - Les serums normaux sont toujours
anli-hemolgtiques. Au cours de certains etats pathologiques
ils deviennent, au contraire, himolytiques.
MICROBIOLOGIE 20
306 REACTIONS HUMORALES ET HEMATIMETRIE

Pour mesurer Ie pouvoir hemolytique d'un serum, on se

sert d'une methode tout a fait semblable a celIe qui a ete
decrite ci-dessus. Mais il est indispensable que les hematies
lavees dont on doil faire usage proviennent d'un sujet normal.
C'est sur ces hematies lavees et emulsionnees dans l'eau
salee physiologique qu'on fera agir des quantites progressi-
.vement decroissantes du serum pathologique it etudier.
Ce serum sera employe soit frais, non chauffe, soit apres
inactivation par 30 minutes de chauffage au bain·marie
a 56 0 ; mais, dans ce dernier cas, il faudra l'activer par
addition d'une quantite constante de serum frais de cobaye
.(alexine), par exemple 2 gouttes pour chaque tube.
Cette derniere maniere de proceder est la plus precise,
tar si ron fait usage du serum pathoIogique frais, Ia quan-
tite d'alexine qu'il contient varie pour chaque tube.
On operera done de la maniere suivante :
Dans chacun des douze petits tubes on verse d'abord un
nombre progressivement croissant de gouttes d'eau salee
phgs,iologique a 9 p. 1.000, en commenc;ant par 10 gouttes
dans Ie 1 er tube et en augmentant de 2 gouttes d'un tube :\.
l'autre. Le 12e tube recevra ainsi 32 gouttes.
Avec la meme pipette, on versera ensuite dans chaque
tube un nombre progressivement decroissallt de gouttes du
serum pathologique a etudier I serum inactive par chauffage
a 56o }, en commenc;ailt par 40 gouttes dans Ie 1er tube et en
diminuant de 2 gouttes d'un tube a l'autre. Le 12" tube rece-
vra ainsi 18 gouttes.
La proportion de serum contenue dans chaque tube se
.trouve etre ainsi de 8 p. 100 dans Ie ler tube, puis success i-
.vement de 7,6,7,2,.6,8,6,4, 6,0,5,6,5,2, 4,8, 4,4,4,0, et
entin de 3,6 p. 100 dans Ie 12".
I Avec nne seconde pipette, on laisse ensuite tomber dans
chaque tube 2 gouttes de serum frais de cobaye (alexine).
On agite legerement pour assurer Ie melange. Puis, avec
llile troisieme pipette, on introduit dans chaque tube une
goutte d'emulsion homogene d'hematies normales, Iavees,
preparees comme il a ete dit ci-dessus. .
Vne petite secouss'e assure Ie melange des liquides. On
laisse en contact penda.nt 30 minutes a la temperature de
37 0 et on lit les resultats qui sont generalement deja assez
apparents pour .qu'il ne soit pas necessaire de centrifuger.
 CYTOLOGIE. VITESSE DE COAGULATION 307

Suivant que l'hemolyse est nulle, partieiIe, assez i!1tense

ou totale, on Ia note par les chiffres 0, I, 2 et 3 ou par 1 a
3 signes +.
CeUe methode peut etre egalement employee pour la
mesure du pouvoir hemolytique des serums hemolytiques
specifiques (voir chapitre xx), - mais il faut alors operer
sur des dilutions au dixiimre (dans l'eausalee physiologique)
de ces derniers, - et aussi pour l'etude des hemolysines
produites par certains microbes pathogenes da.,,!!s les
humeurs de l'organisme ou dans les milieux artificiels de
culture.
 CINQUIEME PARTIE

TECHNIQUES .SPECIALES
POUR

L~ETUDE D;ES MALADIES INFECTIEUSES

DR L'HOMME ET DES ANIMAUX

CHAPITRE XXVll

RECOLTE DE PRODUITS V1RULENTS POUR LE DIAGNOS-

TIC DES MALADIES INFECTIEUSES DE L'HOMME ET
DES ANIMAUX.

A. - Maladies des animaux.

10 Pdievemeni de sarlg pour ensem~ncemenl, inoculation

experimentaie ou sero-diaynostic.
Le sang est recolte dans la jugulaire (Equides, Bovins.
Ovins et Caprins) ou dans la saphene (Chiens).
Couper les poils dans Ia zone d'election de la saignee.
Laver a I'eau bouillie, puis a 1'alcool; toucher avec la tein-
ture d'iode, operer avec des,instruments et de la verrerie,
steriles. Ponctionner Ia veinc avec un~ aiguille un peu
fort~, adaptee a une seringue de 10 ou de 20 centimetres
cp.hes, recueillir Ie sang dans un flacon sterile. Boilcher
solidement Ie flacon; etiqueter, emballer, expedier.
2 0 Prelevemeni de sallY pour exam en microscopique. -
Essuyer avec un linge fin et proprc ou un tampon d'ouate
la region choisie (levres pour -Ie cheval, pointe ct face
interne de l'oreille pour les aut res an,irnaux); puis, avec Ia
pointe d'une lancette, piquer une veine superficielle, ou,
avec les ciseaux, entamer Ie bord de l'oreille. Toucher avec
310 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

l'extremite·d'une lame porte-objet propre Ia goutte de sang

qui sourd. Appuyer Ie bord d'une lamelle ou d'une carte de
visite sur Ia gouttelette qui s'etend sur toute In Inrgeur de
Ia lame. Incliner la lamelle sur In lame en l'appuyant ·lege-
rement et etaler la goutte de sang jusqu'a l'autre extremite.
Secher immediatement la lame par agitation, l'envelop-
per en suite dans une feuille de papier etiquetee comme il
est indique plus haut.
30 Exsudats. - Pratiquer les prelevements avec la seringue
ou l'aspirateur Potain, en observant les me'mes precautions
que pour Ie sang.
4 0 Pus. - Cauteriser superficiellement au fer rouge un
abces clos, ou, a defaut, laver aI' eau savonneuse apres avoir
coupe les poils. rincer a reau bouillie, puis a l'alcool, tou-
cher a la teinture d'iode qu'on Iaisse seeher. Ponctionner
avec une seringue sterile. AspireI' une certaine quantite
de pus que 1'0n introduit ensuite dans un flacon sterile.
Etiqueter, etc.
. 50 Fragments d'organes pour ensem'i!ncements et inocula·
tions. - Prelever avec des pinces et des ciseaux bouillis,
au niveau de Ia lesion, un fragment du volume d'une noisette
qu' on introduit dans un flacon sterile ou (pour Ie -diagnostic
de Ia rage) dans un flacon contenant de la glycerine neutre.
Pour Ie diagnostic post mortem des xvaladies septi-cc-
miques, on preleve, chez les gros ani'maux, un os long, de
preference un metacarpien ou un metatarsien et, chez les
volaiIles, rextrcmite de Ia patte coupee au-dessus de I'articu-
lation tibio-tarsienne.
{)o Frotlis d'organes pour examen microscopique. - Le
fragment d'organe tenu entre les mors d'une pince est ccrase
sur la lame et froue une senle fois sur la moitie de In
surface de Ia lame. Sceher par agitation a l'air. Etique-
tel', etc.
7 0 Secretions purulentes de la pituilaire et de la conjonclive.
- NeUoyer la region avec un tampon de coton imbibe d'eau
bouiIlie et fixe a l'extremitc d'une baguette de bois. Attendre
In formation d'une secretion nouvelle (apres toux provoquee
pour Ie jetage) qu'on preleve avec l'ecouvillon du flacon
special. A defaut de ce flacon, preleverle produit avec une
cuiller ou une spatule bouillie et refroidie, et recueillir
dans une fiole sterile.
 RECOLTE D'ES PRODUITS VIRULENt'S 311

8° Expectorations. - Les expectorations sont recueillies

de preference le,matin, Technique : attirer et immobiliser
la langue du sujet hoI'S de la cavite buccale, exercer une
pression sur les premiers anneaux de la tracbee, et, apres
la toux, recueillir avec I'ecouvillon ou la spatule les muco-
sites deposees sur la base de la langue.
9 0 Lail . ..:;_ Savonner Ie trayon et Ie quartier malades,
rincer a l' eau bouillie tiede ; traire avec les mains aseptisees
ou pratiquer Ie catheterisme. Recueillir directement
10 a 50 centimetres cubes de lait dans des fioles steriles
maintenues a 10 centimetres de l'extremite du trayon. Bou-
cher, etc.
10 Urine. - Recueillir l'urine au moment Qes mictions,
0

ou pratiquer Ie catheterisme.
11 0 Squames et croiites cula/U!es. - A l'aide du bistouri
sterile, gratter la lesion jusqu'au sang. Recueillir dans un
flacon sterile les croutes et les poils adherents.
12 0 Ecoulemenl vaginal et malieres excremenlielles. -
Recueillir une petite quantite de ces matieres dans un flacon
sterile.

B. - Maladies de l'homme.
10 Prelevemenl de sang pOllr ensemencemenl, reaction de
fixation ou inoculation experimeniale. - L'operation ne-
cessite : 10 Ie milieu de cuI ture ou un tube sterile
dans lequelle sang sera recolte ; 2 une seringue en verre
0

graduee de 20 centimetres cubes avec em bout de metal,

sterilisee prealablement a l'autoclave dans un gros tube;
3° une aiguille en platine de 8/10 a 11/10 de millimetre, ste-
rilisee a I'autoclave dans un tube; 40 un tube de caoutchouc
qui sert de lien.
Pour prelever Ie sang, on serre Ie bras avec Ie lien de
caoutchouc un peu au-dessus du pli du coude. On desin-
fecte Ia region du pli avec de Ia teinture d'iode,
Si la veine n' est pa,s saillante, on prie Ie sujet de saisir
un objet et de Ie serreI' fortement,
On monte I'aiguille sur Ia seringue en Ia saisissant par
sa base avec une pince flambee ; on l'enfonce fortement,
puis, apres ajustage, on la passe rapidement dans' la'
flamme.
31~ MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

Avec Ia main gauche. on fixe la peau, et avec la seringue

tenue dans la main droite, on pique Ia veine de bas en haut.
Des que l'aiguille a penetre dans Ia veine, Ie sang coule
dans Ia seringue et refoule Ie piston. On recolte Ia quantite
de sang voulue (10 ~ 15 centimetres cubes en general). On
desserre Ie lien de caoutchouc et on retire I'aiguille de Ia
veine. On l'enleve ensuite de l'embout metallique qu'on
flambe Iegerement et on verse Ie sang dans Ie recipient.
(Tube a essai sterile ou flacon con tenant des perles de verre
pour defibtiner.) Eviter soigneusement de toucher l'embout
avec les doigts.
2· Prelevement de sang pour sero-diagnostic ou examen
microscopique. - Choisir, pour prelever Ie sang, la face
dorsale de la phalangette, region peu sensible et bien irri-
guce. On peut piquer aussi Ie lobule de l'oreillc. Laver it
l'alcool Ie point choisi. Flamber une cpingle ordinaire ou
un vaccinostyle. Des que l'instrument. est refroidi, piquer
d'un coup sec. Si Ie sang ne sourd pas de lui-meme, com-
primer Ie doigt pique par une pression partant de sa base,
tandis que de l'autre main on fait flechir la phalangette sur
Ie reste du doigt.
Si Ie sang est recueilli pour un ser~-diagnostic, faire cou-
leI' les gouttes dans un petit tube sterile.
Si Ie sang doit etre examine au microscope, toucher
Une goutte avec I'cxtrcmite d'nne lame., Appuyer Ie bord
d'nne 1amelle snr 1a gouttelette qui s'etend sur toute 1a
Iargeur de la lame. Incliner la lamelle sur la lame en
l'appuyant legerement et elaler la goutte de sang jusqu'a
l'autre extremile. Secher immediatemenl Ia lame par
agitation.
3 0 Prelevemenis pour analyse de liquides retires pal' ponc-
tion (liquide cephalo-l'achidien, serosites pleurale, perical'-
dique, peritoneale). - Les recneillir dans des tubes ordi-
naires au dans des tubes it centrifugation sterilises et
bouches it l'ouate. A deraut, se servir de petits flacons soi-
gneusement nettoyes, laves, rinces, essuyes. puis sterilises
dans de I'eau 1egerement salCe maintenue 10 minutes it
l'6bullition.
Seringue et aiguille passees a l'autoclave au au mains
sterilisees dans de l'eau salee portee a l'ebullition pendant
1b minutes.
 RECOLTE DES PRobuITS Vli:WLENTS 31~.

Laisser s'ecouler les premieresgouttes du Iiquide cephalo-

rachidien qui peuvent contenir du sang.
Recueillir dinktement Ie liquide qui s'ccoule ensuite
dans Ie tube, ou bien l'aspirer dans Ia seringue que ron
videra en suite dans Ie.tube.
4 0 Prelevemenis pour analyse de fausses membr.anes, de
mucosi/es. - On se sert d'un fil de fer dont l'extremite
inferieure, Icgcrement recourbce, est entouree d'ouate de
maniere a former un tampon ctroit et allonge (fig. 21).

Fig. 21. - Ecou.illon de colon monte ~ur Ii! .te rer p<>ur Ie pr<Hcvemenl du mucus
rhinopharynge.

L'extremite superieure esttordue en boucleet forme mahche.

Le fit de fer ainsi prepare est introduit par son extremite
inferieure dans un tube a cssai qU'OD bouche a l'ounte et
qu'on sterilise au four a tlamber.
Ne toucher avec l'ecouvillon que Ie produit pathoIogique
a prclever. .
Pour une angine diphtcrique, prelever avec l'ccouvillon

Fig. 22. - Schema de Dopter, pour monlrer 13 region au Ie prelevement du mucus

doit etre pratique.
 314 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

un fragment de fausse membrane typique ; pour les autres

angines, prelever I'enduit Ie plus epais.
Pour la recherche du meningocoque, faire Ie prelevement
Ie plus loin et 'Ie pI us hau t possible dans Ie rhinopharynx:
(fig. 22) .
. Des que Ie prel~vement a ete fait, remettre l'ecouvillon
dans son tube en evitant de souiller l'ouverture du tube
a essai.
5°·Prelevemenl de crac1zals. - Choisir de preference les
crachats expulses Ie matin au reveil.
Faire cracher dans une boite de ·verre sterilisee qu'on
fermera aussitot. Chez l'enfant ou les personnes qui n'ex-
pectorent pas, prelever les mucosites de l'arriere-gorge avec
l' ecouvillon.
Si les era chats doivent etre envoyes par la poste, les
recueillir dans un flacon sterilise par ebullition de 10 minu-
tes dans I'eau sa lee et bouche avec un bouchon de liege ou
de caoutchouc.
6 0 Prelevemeni de pus. - Le pus est preleve par aspira-
tion avec une pipette dans Ie cas d'un ahces ouvert.
Si la collection est fermee, desinfecter la peau a la tein-
lure d'iode, Jl'onctionner et aspirer Ie pus avec une setingue
sterile.
Si Ie pus doit etre expedie a un Iaborat6ire. Ie transvaser
dans une pipette fermee ou dans un tub~ ou flacon steriles.
7 0 Prelevemenl de malieres fecales. - 'Se servir, pour les
recueillir, de flacons sterilises, fermes au liege et dont Ie
bouchon est muni d'une petite cuiller. A dMaut de ces fla-
cons, employer des flacons a large ouverture fermes par un
bouchon de liege, et sterilises par ebullition de 10 minutes
dans l'eau salee.
Recueillir les selles du malade dans un vase lave a reau
salee bouillante puis refroidi.
Si Ie malade est constipe, lui donner un lavemeni a l'eau
bouillie -av~ un injecteur sterilise dans l'eau sa tee
bouillante. La petite cuiller sert au prelevement. Sur Ie
cadavre, ouvrir avec precaution nne anse intestinale, prele-
vel' avec la cuiller. Si l'autops~e n'est pas possible, on peut
preJever les feces dans Ie rectum avec la cniller. Les opera-
- tions sur les cadavres doivent, si possible, etre pratiquees
avec des gants de caoutchouc.
 RECOLTE DES PRODUrfs VIRULENTS 315

Ne pas salir les bord ... du flacon. II sl.lffit d'envoyer Ie

volume d'un de it coudre de matieres f~cales. Vne plus
grande quantite serait inutile et meme daqgereuse it cause
des fermentations qui produisent des gaz ~t font sauter Ie
bouchon.
Prelever de preference, quand il y en a, des grains riz;-
formes, des pqrlies sanguinoientes, des parcell,s contenanl du
mucus. Bien bO-llcher Ie flacon. Attacher Ie bouchon au gou-
lot avec de la ficelle par un nreud de caviste.
8 0 Prelevements d'urine. - Recueillir rurine dans un fla-
con de 50 centimetres cubes ou plus grand (sterilise dans
de I'eau salee b'duillante), avec des sondes sterilisees.
Laver1e meat urinaire a l'eau bouillie ; ne pas recueiIIir
la premiere partie de la miction, mais seulement la fin, ou
bien se procurer J'urine par un catheterisme aseptique.
 CHAPITRE XXVIII

ANALYSE MIGROBIOLOGIQUE\ DU SANG, DU LiQUIDE

CEPHALO-liACHIDIEN, DES SEROSITES, DU LAITI
DES URINES ET DES SELLES.

A. - Analyse microbiologique du sang.

L' examen Ii [' etat fruis d'une goutteleHe de sang ecrasce
entre lame 6t lamelle est surtout indique pour la recherche
de la hacteridie charbonneuse, des trypanosomes et des
spirilles de la fievre recurrente. Pour l'examen apres colo-
ration, se reporter a la technique generale des colorations'
(chap. III).
Disposilif pour l'hemoculture anael'Obie en milieu solide. -
Le dispositif utilise par Boez comporte deux cuvettes de
24 cm. de diametre, s'emboitant l'une dans l'autre, mcna-
geant entre elIes une cavite d'environ 130 cc., dont Ie volume
est regIe par trois nervures disposees en rayon et faisant
saillie sur la face concave du verre inferieur (modele realise
par la maison Leune). L'intervalle qui ~epare les deux verres
est de 3,5 mm. au centre et s'aUenue vers la peripherie. Le
milieu de culture employe est constitue par de la gelose a
2 p. 100, glucosee it 1 p. 100 et repartie en ballons a raison
de llOcc.
Avant d'etre incorpore it la gelose, Ie sang recueilli dans
un tube it essai contenant 1 cc. d'une solution de citrate de
soude a 5 p.100 (pour un preh~vement de 10 cc.) doit etre
hemolyse de maniere it conserver au milieu sa transparence.
Dans ce but Ie sang est tran~vase dans un tube contenant
20 cc. d' eau di stillee sterile, puis de la, des que Ie laquage
cst total, dans Ie ballon de gelose prealablement fondue et
maintenue au hain-marie it 45 0 • La gelose est en suite intro-
duite dans la boite et s'insinue entre les deux surfac~s, for-
mant un disque regulier qui s'etale au dela de l'angle.externe
des rainures du verre inferieur.
 ANALYSES MICROBIOLOGIQUES 317

Apres quelques minutes, la gelose fait prise. Pour eviter

Ia dessiccation et Iii contamination du milieu ainsi que pour
assurer des conditio.ns, favorables a l'anaerobiose, l'inter;-,
stice circulaire Iib~e entre les deux 'verres est rempli avec
un melange de deux pa rties de paraffine ordinaire a 550
pour une partie de vaseline.
Les coloni~s apparaissent Ie plus souvent apn!s 24 heures
d'etuve, mais tl est indispensable de prolonger l'observation
pendant une semaine.
Recher.che des bacilles tuberculeux dans Ie sang. - La
technique Ia plus conveuabIe consiste a extraire a Ia serin-
gue, d'une veine du pIi du bras, 10 ou 20 centimetres cubes
de sang qu'on projette aussitot dan,S u~ tube contenant
10 ou 12 centimetres cubes' de solution de citrate de soude
a 2 p. 100 dans l'eau salee physiologique. On ferme Ie tube
avec un houchon de caoutchouc sterile, on Ie retourne 30u
4 fois et on Ie porte a Ia glaciere pendant 24 heures. On
decante en suite Ie Iiquide avec precaution et on recueille
Ie sediment a Ia pipette pour en faire des preparations
colorees, ou pour l'inoculer :i des animaux.
L. Bernard, R. Debre et Baron preferent traiLer imme-
diatement Ie sang., au sortir du vaisseau, par 20 centime-
tres cuhes d'alcool a 300 (pour 10 centimetres cubes de sang).
Le laquage des globules est ensuite complete par addition
progressive de 30 centimetres c~bes d'alcoo.l pur a 40°. On
agite vigoureusement et on centrifuge pendant une demi-
heure. Apres decantation, on reprend Ie culot par 40 centi-
metres cubes d'alcool a 40°, on agite, puis on ajoute. une ou
deux gouttes d'une solution alcoolique de soude au 1/10.
On centrifuge de nouveau. Le cuI at minime ainsi obtenu
est etale sur lmne et colore.
Homogeneisation. - Inoscopie (Joussel). On recueille-Ie
cailIot en filtrant sur une compresse b6uillie dans l'eau
alcaline, puis on lave a reau distillee et on fait digerer la
fibrine au moyen d'un sue gastrique artificiel. _.
Pep sine en pailleltes (titre 50 du Codex). 1 it 2 gr.
Glycerine pure. . . • . . . • { aa 10 gr.
Acide chlorhydrique it 22 0 Bauroe. 5 •
Fluorure de sodium. • . '. . • . , 3 gr.
'Eau distilJee... •...• f • 1 litre.

On melange 10 a 20 volumes de ce liquide a un volume

-318 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

de caillot, on porte a l'etuve a 37 0 pendant 3 heures et on

centrifuge.
Technique de Bezan!:on, Griffon et Philibert. - On broie
Ie caillot dans un mortier; on ajoute 20 centimetres cubes'
a'ean. et Va VI gouttes de Iessive de soude, on fait bouillir.
orr centrifuge et on examine le-culot e.tale sur. des- hones de
verre.
Technique de Gustave Marlin et Lebamf pour la recherche
des trypanosomes et des spirilles. - Recueillir Ie sang dans
un tube a sedimentation contenant 1 centimetre cube de
solution citratee. On centrifuge pendant 8 a 12 minutes en
verifiant frequemment l'etat du tube a partir de la 7e miuute
et on arrete la centrifugation des que la mass~ est nette-
ment separee en deux couches. On recueille toute la cou-
che superieure que l'on verse dans un deuxieme tube a cen-
trifugation et on centrifuge de nouveau pendant 10 minutes.
On decante Ie liquide et on centrifuge une lroisieme fois
pendant 20 minutes. Le sediment renferme quelques leu-
cocytes, quelques hematies, les gloDulins et les trypano-
somes. L~s filaires sont generalement retrouvees dans Ie
deuxieme s,ediment.

B. - A.nalyse microbiologique du liquide

cephalo-rachidien.
Les germes I~s plus frequemmentl rencontres dans les
liquides ccphalo.rachidiens pathologiques sont : les menil1-
gocoque5 A, E, C, D, agents de la meningitecerebro-spinale
epidernique ; Ie pl1eumocoque, Ie bacille 'tuberculeux, 1e
bacille de Pfeiffer; Ie streptocoque et Ie staphylocoque. Plus
rares sont Ie Diplofocclls crassus, Ie pl1eumo-bacille de Fried-
lander, Ie tetragelJe, l'el1lerocoque, Ies bacilles typhiques et
paratyphiques, Ie Bacterium coli. Exceptionnellement Ie
bacille pyocyaniquc, Ie bacille diphterique, Ie gonocoque et Ie
bacille de La peste. La recherche de ces germes s'effectue
selon -1a techniqlle suivante, simple et rapide, qui donne
des resultats tres generalement exacts.

Technique d'O. Jupille.et R. Legroux. - II est

necessaire d!operer Sur 5 ce';,1ti:metres' cubes de Iiquide,
quantile moyenne des ponctions lombaires
') ,
:
 ANALYSES MICROB(OLOGIQUES 319

1· Le liquide est. Ie plus tot possible apres la ponction,

cel}trifuge (10- minutes a 5.000 tours, centrifugeur Juuan).
Les tubes de centrifugeur sont sterilises it l'avance.
20 Le liquide clair, decante est mis en tube sterile et place
au frais (glaciere si possible), en attendant qu'il puisse etre
examine.
3 0 ' U ne partie du culot de centrifugation prelevee asepti-
quement est etalee sur lame, ~xee a l'alcool methylique, puis
examinee au \llicroscope, apres colorations superposees :
methode de Gram, puis fuchsine en solution aqueuse (cette
derniere solution doit etre faible et son action prolongee
pendant 3 if 4 minutes, pour faciliter l'identifica tion des
variete~ de reucocytes). Si ce premier examen ne montre
pas Ia predominance des polynucleaires, ou si les lym-
phocytes semblent plus abondants, il est indispensable
de faire un deuxieme etalement de peu d' etendue, au centre
de Ia lame, afin de rechercher les bacilles acido-resistants ;
ceUe recherche etant de grande importance, on doit Ia faire
patiemment. EIle est plus souvent positive qu'on pourrait Ie
/
penseI'.
4 0 L'ensemencement sur gelose-serum. fait avec Ie res'te
du culot de centrifugation preleve au moyen de l'anse de
platine, sera Iargement pratique en tube plat qu'on porte
~137°.
5° Avec Ic Iiquide clair mis de cote au debut des opera-
tions, on recherche, sur 4 centimetres cubes exactement
mesun~s, Ie poids d'extrait sec de cendres d'apres Ia
tcchnique suivante (lV. Mestrezat): tarer it vide une
capsule de nickel ou mieux de platine, y verser les
4 centimetres cubes mesures, evaporer Ie liquide au bain-
marie bouillant jusqu'a ce que Ie poids de la capsule reste
constant lors de deux pesees successives. Le poids trouve est
multiplie par 250, et Ie produit obtenu indique Ie poids
en grammes de I'extrait sec par litre: liquide normal,
10 gr. 50 a 11 grammes ; liquide tuberculeux, 11 grammes
it 13 grammes ; liquide de menin9ile ai9ue non tuberculcuse,
13 gr. 50 a 16 grammes.
Ensuite l'extrait sec est incine£e dans une flamme. jusqu'a
ce que la capsule prenne une- teinte voisine du rouge
cerise; laisser refroidir sous. une cloche en presence
d'acide sulfurique, peser les cendre~, multiplier Ie poids
 ..
320 MALADIES INFECTIEVSES. TECHNIQUES SPECIALES
.
par 250 pour avoir Ie poids--.par litre: liquide normal,
8 gr. 60 a' 8 gr. 80, liquide' lubeI:culeux; 7 gramlVes
it 7 gr. 50; ligulde de meniI]gile'ui.gue nO{l lubercu{cuse,
8 grammes a 8gr. 90.
60 Examiner apn!s 15 a 1~eurcs a 370 les tubes de ge-
lose ensemences. Prele"X~e trace des colonies suspectes
pour en faire I'exar~n~icroscopique sans coloratio'n et
aprcs coloration; suivant les donnees de cet examen on
identifiera, par l'agglutination rapide au moyen des serums
specifiques, soit les differentes races de meningocoques,
soit les pneumocoques des races I, II on III. S'il Ya des
streptocoques dans Ie liquide de ponction, les bacteries
pour~ont eire agglutinees par Ie serum antipneumococcique
type II. Les indications therapeutiques n'en seraient pa~
faussees, puisque Ie serum antipneumococcique II est
valable dans ces cas.

..
C. - Analyse cytologique du liquide cephalo-rachtdien.
10 Exdmen a fa cellule de Nageolle du liguide non centri-
fuge. - La cellule de Nageotle se compose d'une cellule de
verred'une capacite de 50 millimetrcscubes, divisee par des
traits espaces de 250 iL • Sa hauteur est de 500 fL et chaque
division correspond a 1,25 millimetre 'cube. Pour denom~
hrer les elements cellulaires qu'il contient, on depose une
au deux gouttes de liquide cephalo-rachidien frais dans Iq
cellule. on couvre d'une lamelle, on porte sous l'objectif et
on laisse reposer pendant 10 a 15 minutes. On examine
avec 1'0bjectifna4 au nO 5 et all compte les leucocytes dans
un certain nombre de rectangles. On divisc Ie nombre de
ces leucocytes par Ie nombre de rectangles et Ie quotient
obtenu par 1,25. On determine ainsi Ie nombre de leuco-
cytcs par centimetre cube de liquide.
Pour faciliter Ia recherche des globules blancs, on add i-
tionnc au prealable Ie liquide cephalo-rachidien d'un me-
lange a volum~s egaux de, violet de methyle a 5 p. 100 et
d'acide acetique pur, dans Ia proportion d'une gouttelefte
(1/30 de centimetre cube environ) pour 10 goutte~ de liquide.
On attend quelques minutes, puis on depose une ou deux
 ANALYSES MIC!WBIOLOGIQUES 321

gouLles du liquide colore dans la cellule de Nageotte et on

opere comme precedemment.
Le liquide cephalo-rachidien normal contient 1 a 3 elc·
ments, generalement des lymphocytes. par millimetre cube.
20 Examen du liquide centrifuge. - Centrifuger a grande
vitesse (5.000 tours) pendant 10 minutes dans des tubes
stcriles a extremite efIil~e et bouches avec des capsules
d'Main. Decanter. Maintenir Ie tube incline, Ia pointe en
haut. Introduire une pipette effilee dans laquelle Ie culot
encore humecte monte par capillarite. Repartir Ie culot
sur des lames de verre, a raison d'une gouttelette par lame.
Etaler Iegerement, sauf sur la lame destinee a la recherche
du bacille de Koch. Secher a l'etuve. Fixer a l'alcool ab-
solu pour la coloration ulterieure au bleu ou a la thioninc,
a l'alcool:ether pour l'hemateine-eosine. Colorer et exa-
miner suivant les techniques habitueIIes .

..
1). - Disposition generale d'un examen de \iquide
cephalo-rachidien (d'apres Mestrezat).
ler cas: L'examen est fait d~s les 2 heures qui suivent
la ponctiol1.
A faire sur 1 0 Noter raspect (limpide, opalescent, purulent. forte-
Ie liquid. com- ment purulent. la presence ou l'nbsence de voile fibrineult
plet. et de flocons en suspension).
20 Numeration, it l'eta! frais, des leucocytes (X goulles
C.-R. 1 gouttelette violet methyl-acetique: violet addi-
tionn'" de son volume d'acide actHique. Numeration it In
cellule de Nageo1le Le pn\hivemenl des X goulles sera
fait avec les precautions d'asepsie habituelles et opres
avoir longuement agite Ie lube.·
Centrifl1ga ler tube. le r cas. Liquides l r • lame.
tion duliql1ide: (Exa men d'appaI'ence 1I0r- Gram·Nicolle avec re-
.Centrifuga- microsco· male .anseu/otim- coloration 0: Ia fuch"ine-
tion dllns des pique di- portall!. Ziehl diluee (examen mi-
tubes SI<\riles reot et for- (Decanter it fond crobien direct: indications
sans epaule- mule cylo- et prclever Ie culot premieres sur la formule
ment, de Ra· logique.) a I aide d'une pi- cytologique);
vaul (.deux lu- pelte efSlee, letube Desire-t-ob une colora-
bes de prHe· etant maintenu lion plus differenciee des
rence). 10 min. renverse. Reparlir noyaux, apnis lecture du
it 5 000 tours it sur 3 lames. Se- Gram, on decolorc q!1el-
la min. Les cher. Fixer 3 mi· ques ihstants it 1'alcool, on
tubes mUllis nutes it I'alcool lave ct on fait agir 3 a 4
d'une capsule methylique.) secondes un bleu basique
d'clain ont ele (Legroux).
lllcnOBIOLOGIE 21
322' MALADIES IN.FECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES
stecilises.'ir au- 2'" cas. Liquiaes 2" lame.
toclave (1/2 h. purulents. Ziehl (b. tuberculeu;x}-ou
a 120·/. (MelangeI' Ie cu- coloration speciale ..
rot a la pipette; (Giemsll'dans re cas de
en deposer une 'parasites).
gouttelette &U1' 3
lames. Sur 2 lames
Mater avec un peu
d'eau.)
3' lame.
Hemateine, eosine ou
Giemsa (formule cytologi-
que) et. accessoirement,
parasites.
2. tube. Cultures.
(Cultures, On cltnserve, -On ensemence aussit6t
i·n (} e ul a - dans Ie tube,. 2.ir 3 que possible et ausstlarge-
tionSo). millimetres de li- ment. que possible (liZ du
quiae dans. les- culot) Ie eulot sur deux
q.uels on emul- tubes gelose nutritiv~ (ge-
Slonne Ie tulot.. lose-serum - formoM Oil'
gelose-ascite) sur laquelle
poussent to Us les hotes
habituels du C.-R. Le·b.
de Koch ne pousse pas; Ie
b. de Pfeiffer peu (utiliseI'
pour lui un; milieu .au
sang) (1.),
Aprils culture, les colo-
nies seront etudiees pour
I'identification . (caracleres
extt~riE"urs, examen micros ..
eopique, essais d'aggluti-
nation, repiquage. sur mi-
!jeux speciaux).
Inoculations.
Inoculation eventnelle
au cobaye, a la souris, nu
lapin, selon les renseigne-
ments fournis par les l'e-
cherches prm:edentes.
R,!lmion de. liquides decantc.. Examen chimique ..
0Examen-chimique6'a 10 cc.) Albumine. . 1 a 2- cc.
Chlorure~. • 2 ye.
SUClle. •• 2 cc. 5.
Gendres (mc-
ningite t11.-
be1'euleuse). <1 cc.

1.. lJ.a demonstration du caract"re aseptique d'un liquide C.-R. comporlermt,:

1 0 La-prise du liquide a l'aiguille de_ponction a raide·d'une seringue sterile;
2" nes essais de culture en bouillon Martin glucose (2 p. C.-R. pour 1 p. bouillon,
Ie melange ctant fait au lit du malade), et l'ens.mencement de tubes de gelose
Veillon.
 ANALYSES MICROBIOLO(};lQVES 323

Urea (~ote'
mie). . 2 cc.
Reactions colioidales.
B(l'njoin colloi-
dal.
Bord-e·f-Wns-
sermaIt.. # 1 cc .

. 2 8 cas: L'examen du liq,llide est differe ou ne peut cfre

fait que loin du lieu de son prefevemeI1t. On aevra prevoir,
dans ces circonstances, les difficultes d'lnterp:cetation q,ui
entouren.t les e:xamens oacfe.riologi.que et cyto1ogfque (fra-
gilite. des germes" culture d'elements etranger.s,. d'igesfion
des elements cellulaires). L"axamen chimi'q.ue sur res
liquides clairs conserve, par contre, toute sa valeur.
N, B. - A tout rensei'gnement d.lagnm~tique demande.(m
fera- jeiridre d-es l'enseigllemenls' cliniques. s-Ul' la date au
debut de l'affection, l'e'vo~uti()fl dlt eas et lesdraittlments
intr:t-Fachi:di:e1lS pratiql1es.
La liquId'e dh l er culot. "e punnel! (!ulol ~, ebl:l'il' ..ot dllUll.ludft'ls
ponction lom- a l'nid'e d'l1l'le pipette eflile6. OIl sccbe a I'air
baire est centri- 'et on fixe a fa flamme. L'envoi sera fitif, fes deux
fuge 15 minutes frottis se regardant, une languetLe de papier
a la mainou 10 separant Ies deux lames.
dans un cen- l ro lame:. Examen microbien direct el
trifugeur clec- formule cytologique.
trique. si pos-. 2- lame:. Zi-ehl ou recherehe speciale.
sible dans Jes 2~ eulOt. O"n .recaute parlieltement, de maniere a
tubes de Ra- laisser 2 cc. de Ii qui de environ au conlact du
vaul sterffises-. ·cul~t. On ferme tg tube a ct!lJCvifttg.er .. la
lamve et on, Ie joint. a l'en1'oi pr{!ce3ent '.
(Culture!>. Inoculations.)
30 Les liqu'i.des d'ecantes sonf, ..ennis darts un,
Licplides tjlbe- a.
~ai prollre. On ferme Joe. tube ii la
decantes, lamJle 1ft on !'immerge lq
minutes da~s. ('OOU
- bouillanflf. Sa conservabon mlt assuree' JYOu't
plusieu'l:s.semaines (Suere examcn ohimique);
N. B. - A d'Uaut de materiel sterile, Ie premier culo!
et les liquides decantes seront seuls utifise-s.
*
E. - Analyse mi~:a:obiolo&fque des.serosites.
()n e"amine Ie'S exsud'ats- nun- coagl.'danles., purrrl~ents· ou
1>. Dans Ie ells d'un Iiquid~ suspe,,!'de Ulenil'lgpcoccie; on' aj"utera avec avnnfll'ge au
2' eulot, avant de fermer Ie tube, 1 ce. d·une. solution .f...ile de glucose 1\ 5 p. 100
(Legron,.).
324 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPBCIALES

non, apres etalement, fixation et coloration du culot de cen-

trifugation, par Ia thionine, Ia methode'de Gram ou la me-
thode de Ziehl-Nielsen. ~our les exsudats fibrineux coagu-
lables, iI est necessaire de dissocier, au prealable, Ie caiIIot
dans un ballon sterile contenant des biIIes de verre, ou de
l'homogeneiser avec de Ia lessive de soude (methode de
Bezan<;on, Griffon et Philibert, methode de Petrof) ou en-
core de Ie mettre a digerer avec du sue gastrique artificiel
(voir analyse du sang, homogeneisation).
Les serosites seront ensemencees directement ou apres
homogeneisation dans les milieux nutritifs ou dans les
milieux speciaux : gelose ascite pour Ie gonocoque, milieu
T pour Ie pneumocoque, milieux de Petrof pour la tuber-
culose.
On inoculera les produits morbides au cobaye, dans Ia
cavite peritoneale s'ils sont pui's, sous'la peau s'ils sont
contamines par des microbes etrangers.
La recherche des anticorps et des antigenes sera effectuee
par les methodes habituelles de la serologie: deviation dli
complement, precipitation, floculation.

F. - Analyse microbiologique du lait.

\
QueUes que soient les precautions prises, tous les laits
frais destines a la consommation contiennent un grand
nombrede microorganismes: bacteries, moisissures,levures.
La plup!lrt de ces germes sont des microbes saprophytes,
mais il en est un certain nombre, comme Ie bacille tuber-
culeux, Ie Bacterium coli, des streptocoques, Ie Micrococcus
melitensis qui sont pathogenes pour l'homme et qu'il im-
porte de mettre en evidence par les techniques du Iabora-
toire.

10 Recherche qualitative des microbes du rait.-

a) Bacille tube/"culeux. -On centrifuge pendant 1/4 d'heure
a 5.000 tours25 centimetres cubes, de lait, additionnes de 50
centimetres cubes d'eau sterile, on recneiUe la creme et on
decante. On etaIe separement Ie culot et la creme, sur des
lames de verre. On fixe en plongeant la lame pendant. quel-
 ANALYSES M1CROBIOLOGIQUES 325

ques minutes dans l'alcool methylique absolu.apres dessic-

cation a l'etuve, puis on colore suivant la methode de
Ziehl-Nielsen. On peut egalement employer nne des me-
thodes d'ensemencement indiquees au chapitre de la tuber-
culose et l'inoculation au cobaye.
b) Bacterium coli.- Memes techniques que pour la recher-
che du Bacterium coli dans l'eau.
c) Micrococcus mtilitensis. - On recueille Ie lait asepti-
quement dans des tubes steriles debouches sous Ie jet de
traite. Trois gouttes de lait sont ensuite ensemencees par
tube de gelose inclinee qu'on porte it l'etuve et qu'on ob-
serve pendant 10 a 15 jours: On dilue une goutte du memc
lait chauffe 1/2 heure a 56 0 dans IX 'ou XIX gouttes d'eau
distillee sterile contenues .dans un verre de montre flambe,
on ajoute IX gouttes d'une emufsion, dans l' eau distillec ste-
rile, d'une culture jeune d'un M. melitensis d'origine hu-
maine, ce qui donne une dilution du lait au 1/20 ou au 1/30.
On repartit dans des tubes de 6 millimetres de diametre et
apres6 heures a l'etuve, 24-48 heures a la temperature du la-
boratoire, on observe les resultats macroscopiquement et
microscopiquement (Sergent, Gillot et Lemaire, Sejollrnanl).

2 0 Recherche quantitative des microbes du lait.

a) Numeration paries cultures. - On fait une serie de dilu-
tions au 1/100, 1/1.000, 1/10.000,1/100.000 dans l'eau ste-
rile, de lait bien homogeneise par agitation et on incorpore
1 centimetre cube de ces dilutions dans un tube de gelose
nutritive, liquefieea 45 0 • On melange intimement en roulant
les tubes entre les doigts et on coule rapidement dans une
boitede Petri qu'on porte al'etuve it 37 0 • Apres48 heures, on
compte les colonies qui se sont developpees a Ia surface des
milieux et on rapporte a 1 centimetre cube. Certains auteurs
preferent cultiver les germes du lait a 20° en boites de ge-
lose ou de gelatine nutritives. On compte alors les colonies
apres 4 joms.
b) Numeration directe des germes au microscope. - La
methode preconisee par Prescott et Breed consiste a etaler
o cc. 01 de lait sur une surface de 1 centimetre carre d'une
lame de verre. On sechc a rair par agitation ou a l'etuve et
.326 MALADIES INFECTJEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

on fixe ,en plongeant Ia lame pendant quelques m-inutes:dans

i'alcool methyliqa-e absol~ On colore ensuite a:v,eC une so~
Jution a-queuse de bkll.de methylene. II fant eyiter d',em··
ploy.er un colorant alcalin qui.a I'inconvenient d'.a1tCrer la
pellicule de caseine. On compte les bacterie.s au micrGs-
cope avec l'objectif a immersion.ll est indique de combiner
objectif et oculaire de maniere que Ie diametre du champ'
microscopique soit exactement de 0 cm. 0016, correspon-
dant a une sm:face de 0 cm 2 .o05. Chaque champ microsco-
pique correspond ainsi a 5~O~00 de .centimetre cube
de l'echantillon de lai.t,
On compte les bacteries de 8 a 10 ~hamps et on prend la
moyeQne" qu'il suffit de multiplier. par 500.000 pour deter-
miner Ie nombre des bacteries contenues dans 1 centimetre
cuhe.de lait.
Bien qu'elle ne permette de deceler que les ba.cteries
coIc)fables par Ie bleu de methylene aqueux, ceUe methode
tn)sprecise et tres simple donne, dans la pratique, d',excel-
lents resultats.

~ .
"

G. - AnalY"se micr..ohiologiqlle des mines.

L~s urines destinees aux ensemqncemeIlts .et aux inocu-

lations doivent etre recueillies aseptlquement par sandage
de la vessie.
On recherchera directement les elements cellulaires
anormaux par l'.examen" a l'etat frais, d'une goutte de liquide
_entre lame et lamelle, .ou apres coloration du.culot de cen-
triJugation eta1e et fixe sur des lames de verre. Une .de ces
preparations sera coloree a J.a thionine, une deuxieme par
la methode de Gram et une troisieme par la methode de
Ziehl-Nielsen pour la recherche des bacilles tuherculeux.
I.e culot de centrifugation se'rvira egalement a!'inoculation
sous-cutanee au cobaye et a l'ensemencement sur Ie milieu
de Petrof apres traitement par Ia soude (voir 1:uber.cui()se,
chap. X'Xxvn).
Recherche.du B. Doli. - Ensemenoer 1 !Centimetr.e cub.e
d'urine ft'al:ohe .da.ns.9 ,centimmr.es cubes d'eau.peptonee,
 ANALYSES MIOROBIObOGIQUES a~7

1\jouter ensuite une quantile suffisante ,d'.eau .pheui.quee..a

-5 %llour que 1e titre de 'Ia solution soit de 0;85,a:t -p.
1.000. Porter it J'etuve. Si. ~pres 24 heures, la .cu.I.ture..est
devenue trouble, on la reensemence dags un nou,v.eau
tube d'eau peptonee pheniquee. Huit heures a,p,res,
reensemencer .en bouillon ordinaire. Identifier .Ie
microbe suivant les techniques habituelles (voir B. coli,
chap. XXXII).
1:echnique speciale POllT la recherche dll Sp. iclerohemor-
,·agire. - Recueillir aseptiquement 250' it 300 centimetres
cubes .d'urine. Centrifuger dans plusieurs tu.bes .dont on
vecu.eiIIe les culots. Examiner pa,r Ie procede a 1'encr.e ,d.e
Burri ou.apres -coloration par les methodes de Fontana .et
Tribondeau ou de .Ravaut et Ponselle . .A defautde cenm-
fugeur,ou emploiera Ie procede de P. P. Levy el Liobar-
dy : Additionner l'urine fraiche de'5 it 6 centimetres .cubes
pour lOB de formol -3. 40 pour 100. Agi:ter. Ver.ser dans
de grands tubes.6 centimetres cubes d'aleool it 950 let
40 it 50 centimetres cubes d'urine formolee. Melan_gex.
Couvrir de ligroine sur une epaisseur de 2 a.3 milJimeu-es,
boucher au liege . .Agiter violemment pendant une minute.
Laisser reposer en position verticale pendant 30 :minutes.
Px:elever.a.vee une pipeUe et "erser dans nn vel're.de man-
tre la masse emulsionnee, sans aspirer Ie liquide sous~a­
cent. Deposer III gouttes de I'emulsion sur des lames de
verre bien flambees et refroidies. Ajou,ter II it III gouttes
d'alcool absolu, melanger et etaler en couche minee ; secher
it l'etuve et colorer par Ie procede de Fontana- Tribondeau.

H .. - Analyse microbiologique des selles.

Examiner directement, entre lame et lamelle, une-goutte
de dilution de selle dans l'eau sterile, ou apres coloration:
thionine, Gram, Ziehl-Nielsen.
Pour la recherche des baeilles typhique et paratyphique,
dysenterique, du vibrion cholerique et de l'amibe dysen-
terique, voir les chapitres relatifs a ces microbes. ,
Technique de Calmette et Guerin pOllr la recherche du ba-
rille tllberClllellx. - On pese dans un flacon d'Erlenme;yer
328 MALADIES INFECTJEUSES, TECHNIQUES SPECIALES

30'grammes de matiere que l'on meiange en suite avec 55

centimetres cubes d'eau sterile et 15 centimetres cubes
d'antiformine. On agite a plusieurs reprises et on laisse en
contact pendant 3 ou 4 heures, puis on centrifuge, on de-
cante, on recueille Ie depot dans un vase sterile et on Ie
dilue dans 8 a 10 centimetres cubes d'eau sa lee physiolo-
gique. On Ie filtre ii. travers 2 ou '3 doubles de gaze sterile
et on J'inocule a la dose de 2 iJ. 3 centimetres cubes sous ]a
peau, it 3 ou 4 cobayes, au voisinage de la region ingui-
nale
Technique de Moreau. - Broyer dans un v.erre ou un
mortier steriles 50 grammes environ de matieres, en ajou-
tant peu a peu de la solution de chlorure de sodium a 25 p.
100, jusqu'a ce que la masse devienne semi-liquide. On
filtre sur gaze et on repartit Ie filtrat dans des tubes a cen-
trifugerqu'on remplitjusqu'aux deux tiers.. Chacun de ces
tubes reyoit ensuite 2 centimetres cubes d'un melange d'e-
ther sulfurique et de ligroYne a parties egales. On agite et
on centrifuge pendant 10 minutes a 4.000 ou 5.000 tours. Les
micro-organismes etrangers sont en grande partie detruits
par l'ether. et les bacilles tuberculeux sont rassembles a In
limite de separation des liquides. On les recueille avec
l'anse de platine pour les etaler sur lames et les inoculer au
cobaye.
 CHAPITRE XXIX

TECHNIQUES SPECIALES AUX MICROBES PATHOGENES.

- BACTERIDIE CHARBONNEUSE. - COCCO-BACILLE
DU CHOLERA DES paULES. PASTEURELLlE. - BACILLE
DU ROUGET DU PORCo

A. _:_ Bact~ridie charbonneuse.

EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - BMonnet immobile, non cilie,
formes en bambou. Capsule seulement dans les humeurs de
I'organisme ou dans les cultures en serum liquide, eniiquide
cerebro-spinal ou autres milieux riches en albumines.
Spores refringentes hors de I'organisme vivant.
COLORATION. - Toutes les couleurs basiques. Prend Ie
Gram. Coloration des capsules par la safranine, par la
methode de Friedlander, ou bien par la methode de Jones
(chap. VII, III, E).
On peut encore faire la double coloration des bacilles et
des capsules d'apres Ie pro cede de Kaufmann: traiter la
preparation pendant quelques minutes par Ie )lIeu de
methylene alcalin de Laffier, laver rapidement a I'eau et
plonger pendant 4 minutes dans une solution a 0,25 p. 100
de protargol. La preparation ainsi differenciee est en suite
coloree pendant 5 a 10 secondes par un bain de fucbsine de
Ziehl diluee alp. 20 dans I'eau. Apres un dernier lavage
on examine. Les bacilles apparaissent colores en bleu fonce,
les capsules en rouge.
La coloration du sang se fait Ie mieux par Ie Gram-eosine;
celle des spores dans les cultures, par les methodes indi-
quees au chapitre VII (C).
CULTURE. - Aerobiose stricte. Elle s'obtienf sur tous les
milieux usuels legerement alcalins; pH limites = 6,0-8,5.
pH optimum = 7,0-7,4.
Temperature optimum.30 a 40°, mais Ie developpement
s'effectue a partir de 15°, jusqu'a 43 0 • La sporulation n'a
plus lieu entre 42 et 43',. Le bouillon reste limpide. Les
::30 MALADIES INFECT lEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

bacteridies y poussent en flocorls formant de legeres houp-

pes qui tombent au fond des vases et se dissocient facile-
ment par agitation.
Gelatine; liquefaction, developpement en meduse ou en
branche de sapin.
Serum coagule : lentement liquefie.
Lait: coagwe, puis digere.
Ne forme ,pas d'indol.
Les cultures en bouillon cQntiennent une hemolysine qui
dissout les hematies de lapin ou de mouton et aussi, muis
un peu moins vite', celles des autres mammiferes.
Detruit Ie .,glycogene in·vilJD at in vitro. Saccharifie lege-
rement l'amidon et attaque Ie glucose en formant des acides
lac.tique 'et acetiq.ue.
P£oduit «lans des milieux ·de -culture un ferment proteo-
lytiqu'e tres 2ctif qu'on -se.pare en tuant les bacterid-ies
,par Ie toluol at en centrifugeant Ie liquide (s~ns filtrer~.
Les bacilles non sporules sont tues par 40 minutes d.e
.chauffage it ,55 0 dans les cultures; par 1 heure de chauffage
]l 5O-§5 o .da.o.s Je sang frais.
Les spores sont ,tuees -seulemeut apres 10 minutes a '95 0
ou 3 minutes it 100· dans la vapeur d'eau.
RECHE,RCHE DE LA 'BACTERIDIE CHARBONNEUSE .DANS
LES :PllODUITS ORGANI<QUES. - Les prelevements de sang
et de f:ragmen{s ;visce.raux doivent etre ,effectuM .Ie plus ·tOt
po,ssih1e ap~s Ia mort p<9ur eviter l.es infect\oDs secondair.es,
par -Ie vibnion septiq:ue Dotamment. 00 examinera ,Ies
fn0;t.tis.colores s-uivant une des methodes indiquees ci-dessus
d!9;u cllerchera a identifier Ia bacteridie(Jar les cultures en
,gel~se et 'bouillon et par inoculation sous-cutanee ou intra-
cutane.e au coh.aye.
Pour l'envoi de produits charbonneux, il est recem-
·m~~,de.de prelev.er un metacarpe ou un metatarse dont la
-w.:o,eIle osseuse renferme des bacteridies .a reta·t de parcle,
meme lorsque les cadavres dont jls proviennent sont en
'V.oi.e .doC.putrefaction: 11 t>ufiitell'suite de scier.l'os perpcudi-
.cu{a'iTemeu,t a t>a longueur. de cauMriser a la flamme ()u an
fer rouge la surface de section et d'asp'irer avec une pipette
s-tc:rjle unc petite quantite de moeIle qu'-on ensemence
~n~ un tube de bouillon ou qu'on ¢tale a la surface d'im
tube de gel.ose,
 PASY'EV-RE,+-'LOSES SIB

Coloration des cqupes d'organes d'animaux charbonneux.

- Diss6udre 1a paraffine a:vec k «ykll, puis alcoal ahsolu,
eau. Brasiline, eau ·ordina.ire, solution aqueuse de violet
de gentiane, Iiquide de LugoI, alcool-acetone presque a
;decolorati.on, ~au ordinaire, aurantla, alcool a !)(j)o, 11)0°,
xylol, ~haum~, lameHe. .
Reaction de precipitation d'Ascoli. - On addith:mne les
produits -suspects finement hroyes (rate, foie, etc.~ de 4 a
5 fpis leur poids .d'eau ph'YsioIogique .et .on faiti>ouiltilr
pendant 5 minutes. On fikre a froid sur papier }usqu'a ce
que ~e 'li~uide devienne clair. Dans un petit tuhe a
essa:i·de 3 a 4 mi;l.limetr.es de diametve, on v.erse e oc. 5 Ge
·s(lrom pr~cipi1ant anticharbonneux, puis ~yec une pipette
a efUIure tres 'fine, on ~jollte dans Ie m~me :tube 0 .cc. 5 <Iu
flIt-rat procMeat, .en prenant 1a precaution d'ap:piiquer l:ex-
tremite de Ia pipette CQntre Ia pami <Iu tube 'Pour .que i1es
liqui<Ies ~estent nettement 'Superposes. Si les organes PTo·
viennent d'un animal tIllort de charbon, un tr.ouble annn-
1a"ire caracteristj.q-ne se forme au contact des deux.liquides.

,. .
B. - Pasteurellw.

~ARA,CTERES Gi!:NERAUX (d',apres Ligfl,ieres). - Ce groupe,

auquel appartient Ie microbe, du cholera des ponIes, com-
pr.end une seJ'je de Dacteries pathogenes pour les Ilnimaux,
pr.i.noipalement ponr les r.ong~urs.et 10$ 'ruminants ,et pour
rhomme. (Septicemie OU a-apin, pneumo-enterites du mou-
ton, :de ila che1fr.e, pleuro-pneumonie.du .buflle .ou barbone.
Pasteurellose du pore (Schweinseuehe), pneumouie inf-ee-
tieu6(l ,Elu che:vai, peste humaine, ,etc,
T.ou-s .ces microbes sont des oocoo-bacilles presentant la
ooloration hi pola ire , tres poiymorphes, immobiIes, .non
.spor.mes, <surtout aerohies; non colorables par Ie Gram. ills
Ge'Pousse-nt pas sur ia :p.omme.de ter.re natur.eUe, acide,:ne
coagulent pas Ie lait, ,ne,.donnent pas ,d'indol. lIs sont ious
p:l,us .on moius .agglutiuahles par nn pasteurella-serum
tres actif, prcpar:.e par exemple avec 1a Pasteurella poxcine
,de P",eis,.;.
332 MALADIES INFECTlEUSES. TECHNIQUES SP:ECIALES

COCCO-BACILLE DU CHOLERA DES POULES.

(Pasteurella aviaire).
EXAM EN A L'ETAT FRAIS. - Cocco-bacille immobile;
formes plus courtes, isolees ou en diplocoques dans les
cultures.
COLORATION. - Facile avec toutes les couleurs basiques,
thionine phcniquee. Ne prend pas Ie Gram. Poles plus
colores, centre clair (Pasteurella).
CULTURE. - Aerobie. Tres facile dans les bouillons
Iegerement alcalins, de veau ou de poule qui se troublent
dans toute leur masse. En gelatine. pas de liquefaction:
colonies petites, transparentes, en gouttes de. rosee. Pas de
culture sur la pomme de terre (Garactere differentiel avec les
microbes de Ia typhose aviaire). Le microbe du cholera des
poules, comme la Pasteurella du lapin et les ·Pasteurell~
humaines, ne se developpe pas dans l'eau de levure. Pou I'
Ie differencier des germes de la typhose aviaire, on ense-
meneera un milieu Iiquide prepare de la maniere sui-
vante (Staub et Truche):
Delayer 100 grammes de levure de boulangerie dans un
litre d'eau de conduite en ajoutant reau peu a peu. Faire
bouillir pendant 5 minutes. Filtrer sur papier double. Ver-
ser Ie filtrat dans un ballon et steriliser a 110°-112° p~n­
dant 15 minutes. Laisser deposer pendant 15 j6urs, decan-
ter et repartir Ie liquide clair.
Ce milieu..ne doit etre ensemence qu'a partir d'une culture
sur gelose ou en bouillon. Le microbe de la typhose aviaire
s'y developpe abondamment, de meme que Ie Bacterium
coli; la Pasteurella du cholera des poules ne s'y developpe
pas.
Pour l'ensemencement des produits organiques, il est
preferable de prelever un os long, une patte desarticulee ou
eoupee au-dessus de l'articulation tibio-tarsienne. On sec-
tionne transversalement l' os a l'aide d'un costotome ou d'un
secateur, on brule a la flamme la surface de section et on
plonge une pipette sterile dans le,conduit osseux pour aspi-
rer une petite quantite de moelle qu'on ensemence en suite
sur de Ia gelose Martin ou du bouillon Martin. On peut se
con tenter de plongcr un fil de platine flambe dans la moelle
 CHARBON BACTERIDIEN 333

ct de Ie promener a la surface de la gelose inclinee. On

porte ensuite aJ'etuve a 37 0 (Truche).
Le virus, detruit en quelques minutes a 58°, resiste a Ia
glycerine. On 'peut conserver virulents pendant plusieurs
mois (surtout a la glaciere) des fragments assez volumi-
neux de rate immerges dans la glycerine pure a 300 Be .
Nola. - C'est dans Ie filtrat d'une culture en bouillon du
cholera des poules que Pasteurdecouvrit la premiere toxine
soluble, en 1880.

**'*'
C. - Baeille du rouget du pore.
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Immobile. Elements isoles
ou groupes par deux dans les tis sus ou en am as souvent
inclus dans les phagocytes. Chainettes dans les ·cultures en
bouillon:
COLORATION. - Toutes les couleurs basiques. Thio-
nine pheniquee. Prend Ie Gram.
CULTURE. - Aerobie. En bouillon legerement alcalin
a :no, trouble uniforIPe en 48 heures. Colonies flocon-
neuses. L'addition de 2 p. 1.000 de glucose ou de liquidc
d'ascite favorise la culture.
En gelatine, par piqure, developpement rayonne en
brosse a bouteille, caracteristique. Pas de liquefaction.
Sur gelose, colonies petites, blanches ou grisiHres.
La culture sur pomme de terre ne reussit que dans Ie
vide. Elle est peu abondante.
Microbe virulent pour Ie pore, Ie. lapin, la souris, Ie
pigeon; cobaye et poules refractaircs. Tue par chauffage
30 minutes a 50°, en quelques minutes a 580, exalte par pas-
sages. sur Ie pigeon, attenue pour Ie pore par passages suc-
cessifs sur Ie lapin.
 CHAP IT RE XXX

S'l'AI?HY:LOCOQUE. - STREPTOCOQUE. -PNEUMOPOQrJE.

- MENINGOCOQUE. - GONOCOQUE. - MICROCOCCUS
MELITENSIS ET BACILLUS ABOR·TU'S.

A. - Staph-ylocoque.
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Diplocoq.ues, couries
chainettes ou petits amas da-ns les p'l'oduits paj_)hologiques.
Formes en grap,pes et elements isoles dans .les cultures.
Immobile. Non cilie. N'e sporule pas.,
COLORATION. - ' Prend' Ie tiram, se colore egalement
avec les couteurs basiques d'aniline, Ie- brun de Bismar.ck,
Ie vert malachite et aussi avec certaines couleurs acides,
par exemple [orange G, ou l'aurantia, en solution aqueuse
concentree.
Les coupes doi.vent etre traitees par Ie pic];o-carmm.
et Ie Gram~ ou bien d'abord par Ie Gx;am-Nicolle-,. puis par
Ie 'eaWl'in. I
CULTURE. - Temperature opt. 24. a. 38 0 , ruais pousse
ellcoue it 60. Aerobie facultatif.
Les ruilieuiX solides usuels con"ienneni parfaitement. 11
est utile de les alcaliniser· un peu. L'optimum d'alcali-nisa-
tio'll esb de 6 ce. 8' de lessive normale de soude paJ: litre,
ajoutes a partir du point de neutra:iisat:iol1. au. tourn-esol.
pH limites,= 5,6-8,1. pJiI uptimum = 7,2-7,6.
Le lait est coagule.
DansIe bouillonrascite, les cultures agglutirrecs paussent
enamas.
La gelatine est tiquefiee assez rapidement (ferment tryp-
sique)._
Les pigments colores se developpent Ie mieux sur
serum de bamf gelatine-, sans glycerine, et sur pomme de
terre.
Les cultures sont tuees par 2 ou 3 heures de chaufIage
a 52·53°, en 10 minutes a 62°, en 5 minutes a 70 0 •
 STREPTOGOQUE 335

le filtrat contient une leucocidine et une ltemol'gsine 1>.

eette derniere est detruite par Ie chauffage a_·6&O et reap-
parait a_ 1000 • (Landsteinel' et von Rauchenbiehlel'.)

.*.
B. - Streptocoques.
10 STREPTO,COQ'OES AEROBI~S,.

La privcipale varie1e pathogene est Ie Sir. longus pyo-

genes.
EXAM EN A L'ETAT FRAIS. - Chainettes plus ou morns
Iongues, encapsulees dans IeS' exsudats.
COLORATION. -Partoutesles couleurs basiques d'llniline.
Prend le Gram.
CULTURE., - Temperature opt. 24-38°. Tres tente de 1'2
a_, 150 , Anaerobie facultatif. pH Hmi'tes = 5,8-8',O~ pH opti-
mum = 6,2~1,0.
L~ gefose-peptone de Witte Iigeremerrt aIcaIlne, en tubes.
inclmes, arr:osee a_ sa surface de quelques gouttes d'e sang
huma-iu, convient surtout pour l'isolement.
6el'Ose lactosee tournesolee. ~ Fines cohmies bleufees en
21J: henres, surelevees legerement au centre en suite, avec
bord~ sinueux. Virage en 2'4 neures.
Lait. - Coagule en 24-48 heures, avec tassement du caiJ:...
lot. '
Bauillon serum de M'armorek.
Bouillon fraichemenl prepare et alcalin. 1 p.
5 cc environ de lessive de soud& par litre
it partir de lit neutralile.
Serum humain frais.. . . • . . • . 2 p.

ou bien:
Bouillon 2 p. Liquide d'aseite, 1. p"

01L bien ~
Bouilhm Marlin 1- p. Seru):U de ehev.al
iooctive par 30 minutes-de chauflnge it 58<> 1 p.

1, Pour In recherche des hemolysines des stuphylocoques ot streptocoques, voir la

technique deerite U pl'OpOS du cholera (chapitl'e "XXIV).
3_3S-:MALADIES INFECT IEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

On melange aseptiquement Ie serum ou Ie liquide d'ascite

au bouillon prealablement sterilise a l'autoclave ou mieux au
filtre Chamberland. .
ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES STREPTOCOQUES DEs
PLAIES DE GUERRE. •
a) Milieu d'enl'ichissemenl de Weisseflbach (eau peptonac
glue osee a I'albumine d'reuf; alcaline) :
Eau. . . • • • . . . •• • 100 cc.
Peptone Chapoteaut. . • . . . . . • 4 gr.
Sel. . . . • . . . • . • • . • • o gr. 50
Glucose. . . • . . • . . . . ' . . o gr. 20
Alhumine d'reu( alcalinisee par la soude et
diluee it raison d'une partie de blanc
d'reuf pour trois d'eau distillee. . . . 100 ce.

b) Gelose ordinaire en tubes inclines.

c) Gelose de Veillon pour ensemencement anaerobie (voir
chap; III et XXXIX).
Les streptocoques pyogimes attaquent l'amidon soluble,
Ie saccharose et Ie lactose en formant des acides. Ils n'atta-
querit pas I'inuline, la mannite et la glycerine. Le mililEu
de Saloinon permet de les differencier des autres groupes de
streptocoques et des pneumocoqu_!:)s: A 10 centimetres
cubes de gelose nutritive a 3 p. 100, fondue a 58°, on
ajoute 1 ce. 5 d'une solution d'amidon soluble a 10 p. 100
faite dans la teinture de tournesol, puis 5 c6ntimetres cubes
de liquide d'ascite frais, inactive par 30 minutes de chauf·
fage au bain-marie.
On melange et on coule en boites de Petri qu'on ense-
mence en etalant en surface une goutte de liquide au moyen
d'un petit earn~ de papier glace sterile.
On peut incorporer a ce meme milieu les divers sucres a
la place de I'amidon.
(Pour la preparation de I'amidon soluble voir chapitre:xvlI
reactif de Tromsdorff.)
Hemolysine. - 'Pres fragile, disparait rapidement dans les
cultures. On l'obtient Ie mieux en bouillon-serum apres 8 a
10 heures d·etuve. Elle est detruite par une demi-heure de
ehauffage a 55°. Son action est paralysee par 2 p. 100 ae
chlorure de sodium.
(Pour la technique de titrage voir chapitre XXXIV, Cho-
lera.)
 STREPTOCOQUE

VARIETES DE STREPTOCOQUES PATHOGENES

S. [ol1gissimus"(amygdales de sujets sains).

S. conglomeratus (Kurth, amygdales de sujets sains).
S. brevis (non hemolysant, cavite buccale de sujets
sains).
_ Les enterocoques se differencient difficilement des strep-
tocoques non hemolytiques. Us produisent une toxine tres
resistante a la chaleur.

STREPTOCOQUE DE LA GOURME OU CHEVAL

(Streptococcus ·equi).
EXAMEN A L'ftTAT FRAIS. - Cocci jsol~s, diplocoques
au chainettes plus au mains longues dans Ie pus. Longues
ehainetles sinueQses, enchevetrees dans Ie bouillon-serum.
COLORATION. - Facile par les c.ouleurs basiques d'ani-
line. Prend Ie Gram.
CULTURE. - Aerobie indifferent. Temper. opt. 37Q.
Bouillon. -. Culture rapide sous forme de petites mas~es
blanches qui se deposent peu it peu. pendant que Ie Iiquide
s'cclaircit. Se developpe mieux dans Ie bouillon de cheval
que dans Ie bouillon de breuf. Hemolyse en quelques heures
Ie sang defibrine de cheval ajoute au milieu (Brocg-Rous-
seu, Forgeot et Urbain).
Gelose. - Culture directe difficile en partant du pus. En
24 heures, colonies arrondies. punctiformes, transparentes.
Puis strie ,etroite; blanc grisatre ou jaunatre (Lignieres).
Gelatine. - Culture difficile. Liquefaction faihle 0"
Serum coagule. - Goutlelettes grise.s, transparentes,
nulle.

bientot confluentes.
Lait. - Barement coaguIe.
Att~que dextrose, saccharose, maltose et lactose, mais
non raffinose et mannite.
Pathogene pour Ia souris, 'Ie rat blanc, Ie cohaye (surtout
lorsqu'on l'inocule dans 1a cavite peritoneale). Ie Japin (sur-
tout par la voie veiq_euse) et Ie cheval (par toutes les voies).
On peut infecter Ie cobaye et Ie lapin par la voie digestive
(Brocq-Rousseu, Forgeot et Urbain).
Peu toxigene.
MICROBIOLOGI2 22
338 MALADIES INFECTIEUSES, TECHNIQUES SPECIALES

2 0 STREPTOCOQUES ANAEROBIES.
(d'apres Prevot)
A) Stl'epi'ocoques producteurs de gaz et {elides.
Micrococcus fcetidulJ (Veillon).
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Gros coccus arrondi ou
ovoide ; diplocoques ou chainettes courtes dans les sero-
sites; chainettes de 6 a 8 elements dans Ie bouiJIon neutre
(Prevot).
Coloration. - Prend Ie Gram.
Culture. - Anaerobie strict.
Bouillon Martin glucose. - Culture en grumeaux sans
trouble. Degagement de gaz'fetides, inllammables.
Gelose Veillon. - En 48 heures, coionies punctiformes.
Uegagement gazeux, plus ou moins abondant.
Gelatine. - Non liquefiee.
Lait. - Non coagule.
N'attaque aucune proteine chaufIee (blanc d'reuf coagule,
foie, viande, fiorine, serum coagule).
Pouvoir pathogene inconstant. Non toxigene.
St. anaerobius (Kronig;-Natvig.)
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Courtes chainettes dans les
produits morbides'et Ie bouillon alcalin ; lohgucs chainettes
dans Ie bouillon neutre.
Coloration. - Prend Ie Gram.
Culture. - Anaerobie strict.
Bouillon glucose. - Grumeaux sans trouble. Degagement
gazefiX', -fetide, Acidification.
Gelose Veillon. - En 24 heures, colonies regulieres,
lenticulaires. Dcgagement gazeux.
Gelatine. - Non liquefice ..
Lait. - Non·coagule.
Aucun pouvoir protco}ytique.
Proprietes' pathogenes et toxigehes faibles et transitoires.
Sf. pUfridus (Schottmiiller). ~.
E:itAMEN A L'ETAT FRAIS. - Courtes chainettes dans les
serosites et les milieux.alcalins, longues chainettes dans les
bouillons neutres.
 STREPTOCOQUE 339

Coloration. - Prend Ie Gram.

Culture. - Anaerqbie strict. Bouillon glucose. Trouble
rapide. puis depot. Pas de degagement gazeux. Odeur
putride.
Gelose Veillon. - En 24 heures, colonies lenticulaires.
Pas de gaz.
Gelatine. _ Non liquefiee.
Lait. - Non coagule.
Aucun pouvoir proteolytique.
Pouvoir pathogene variable selon les cchantillons. Non
toxigene.

Slreptocoques ni producleul's de gaz ni (elides f!'revot).

St. micros.
EXAMEN A L'ETAT FRAIS'. - Fin streptocoque en longues
chainettes 'dans les bouillons neutres.
Coloration. - Prend Ie Gram.
Culture. - Anaerobie strict.
Bouillon glucose-. ~ Trouble bomogene. Acidirication.
Gefose Veillon.·- En 2 ou 3 jours, colonies puncti-
formes, puis lenticulaires, arborescentes.
Gelatine. _ Non liquefiee.
Lait. - Non coagule.
Aucun pouvoir proteolytique.
Pyogene pour Ie cobaye. Non toxigene.

St. intermedius (Prevot).

EXAM EN A. L)\:TAT FRAIS. - Diplocoques dans les cra-
chats ; Jongues chainette~, parfois bifurquees. dans les
bouiIIons neutres.
'Coloration. - Prend Ie Gram.
Culture. _ Anaerobie strict. Ni gaz, ni odeur.
Bouillon glucose. - Culture abondante, depot, acidifica-
tion.
Gelose Veillon. - En 48 heures, colonies regulieres.
limticulaires.
Gelatine. - Non liquefiee.
Lait..- Co.agule sans retrait ni digestion ulterieure du
~aillot. Acidification.
340 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

Aucun pouvoir proteolytique.

Pyogene pour-Ie cobaye et la souris. Non toxigene.

'St. evolutus (GrOf et Wittneben, Prevot).

EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Tres polymorphe. Longues
chainettes dans les bouillons neutres.
Coloration. - Prend Ie Gram.
Culture. - Anaerobie au .moment de l'isolement, Ie mi-
crobe s'accoutume a l'oxygene et devient faiblement aerobie
fa cuI ta tif.
Bouillon, - Grumeaux sans trouble.
Gelose Veillon. - Colonies lenticulaires:
Gelatine. - Liquefiee.
Lait. - Coagule en 24 heu'res avec retrait du caillot.
Pyogene pour Ie cobaye et la souris, mais irreguliere-
ment.

C. - Pneumocoque.

EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Diplocoque lanceole (grain

d'orge, flamme de bougie), encapsu\c -dans les produits
pathologiques et les milieux de culture albumineux. Non
capsule, en courtes chainettes ou petits amas dans les
mjlieux non albumineux.
COLORATION. - ?ar toute'S les couleurs basiques d'ani-
line. Prend Ie Gram.
La capsule est decoloree par Ie Gram et colorable par
l'eosine (voir technique de coloration des capsules; cha-
pitrevn). _
CULTURE. - Ne pousse pas a 20°. La gelatine ne peut
done pas etre utili see. Le milieu de choix est la gelose:pep-
tone arrosee de sang de lapin ou de sang ·humain, ou Ie
bouillon-serul1], comme pou~ Ie streptocoque. pH limites =
7,0-8,3.pH optimum = 7,8.
Milieu de Salimbelli et d'Herelle (liquide). :- On fait Jige-,
rer pendant 7 a 8 heure,s (pas plus), a 50°, des estomaes de
pore degraisses et haehes eomme pour la preparation de la
peptone de Martin. L'eau est d'abord portee vers -55 0 •• Oh
 PtvEUMOCOQUE 341

ajoute ensuite, par litre, 10 centimetres cubes d'ijCl pur (22°

Be) et, en agitant, 3.00 grammes de hachis d'estomac. On
regIe la temperahfre. vers 50°. Apres 7 a 8 heures, on monte
celle-ci a 80-90° -afin de detruire la pep sine et d'arreter la
qigestion. La peptone ainsi ohtenue se conserve, sans pre-
cautions, pI-p.sieurs semaines.
Pour prepare):' Ie milieu destine a la culture du pneumo-
coque, on rend la peptone legerement alcaline au tournesol,
par addition de soude, et on sterilise it 1200 • On filtre sur
papier Chardin mouille et on ajoute 2 grammes de glucose.
On sterilise apres repartition vers 1120 a 115 0 •
Pour conserver les pneumocoques virulents, Ie milieu
sUlvatit est excellent:
Milieu T(de Truche) liquide
Peptone Chapoleaot 4 gr.
Chlorure de' sodium. o gr. 5
Glucose. . . . . o gr. 2
Eau disliIlee.. . • 100 ce.

Faire dissoudre a 800 • Alcaliniser legerement j IIsqu'u

reaction legerement rose avec Ia phtaleine de phenol. Fairc
bouillir pendant 5 minutes, filtrer, repartir et steriliser
1/4 d'heure a 1100 •
II est bon, pour les premieres cultures, d'additionner
cc milieu de 1/3 de liquide d'ascite.
Gelose T. - Meme composition que Ie milieu T liquide.
On ajoute 20 grammes de gelose par litre. Apres dissolu-
tion de la gelose, on alcalinise jusqu'a vix:age legerement
rose de la phenolphtaleine. On repartit en tubes sans filtrer
et on sterilise it 110 0 pendant 20 minutes. On laisse les
tubes en position droite pendant 30 minutes dans l'auto-
clave chaud ouvert, puis on les incline com me les tubes de
gelose ordinaire.
Nota. - Les pneumocoques virulents sont solu~les dans
Ie. bile (0 cc. 1 a 0 cc. 2 d'un melange de bile de lapin
et de glycerine dans 1 ,centimetre cube de culture de
24 heures en bouillon ou-d'emulsion de culture sur gelose),
Ie milieu s'cclairciten quelques minutes a la temperature du
laboratoire (phlmom€me de Neufeld). Le taurocholate de
soude, en solution a 10 p. 100 dans l'eau salee physiQlo-
gique sterilisee, a la meme action a 1a dose de 1 volume
pour 100 volumes de culture.
342 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

Milieu differentiel.
1 vol.
M {'l'leu de H'ISS ft Eau
Serum de bamf.
distillee. . 2 vol.

Ajouter 1 p. 100 de teinture de tournesol a 5 p. 100,

chauITer a 100°, filtrer. Ajouter 1 p. 100 d'inuline.
Steriliser par chauITage discontinu a 100 0 •
Le pneumocoque fermente l'inuline. Le milieu rougil et
se coagule. Le streptocoque ne fermente pas.
CONSERVATION DE LA VIRULENCE. - Procedi ala gela-
tine(M. Nicolle, Cotoni et Truche). - Dans un litre de milieu
T chauffe au bain-marie, faire dissoudre 150 grammes de
gelatine portee a 550 , ajouter un blanc d'ceuf; alcaliiiiser ;
chauffer 1/4 d'heure a 1150, filtrer, repartir en tubes; steri-
liseI' pendant 20 minutes a 1100 • Au moment de l'emploi,
on fait fondre un fube de gelatine Tau bain-marie et on y
.introduit la culture a conserver dans la proportion de
2 parties de gelatine pour une de culture. On melange
intimement en roulant Ie tube entre les mains et on porte
a la glaciere. Les microbes conservenl ainsi Jeur vitalite ~t
leur virulmtte pendant plusieurs mois. Pour les repiquer,
il suffit de fluidifier la gelatine a 370 et d'ensemencer 2 it
3 centimetres cubes de son contenu dans un tube de
milieu T. I
Sera-agglutination (M. }Yicolle). - Centrifuger une cul-
ture en bouillon T de 16 hel1rl:ls. Emulsionner Ie culot dans
reau chloruree s6'dique a 10 p. 1.000, a raison de 1 centi-
gramme de germes par centimetre cube de liquide. Verser,
dans une ser:ie de petits tubes a essai steriles, de 4 a 5 milli-
metres de diametre.l centimetre cube d'emulsion et ajouter
dans chacun d'eux des doses decroissantes de serum: 1/20,
1/50, 1/100, 1/200 de centimetre cube. Boucher a rouate,
agiter pendant5 minutes. Si l"agglutination n'est pas imme-
diate, Iaisser les tubes a Ia temperature du laboratoire pen-
dant 12 heures et lire les resultats.
Les pneumocoques serepartissent en agglutinables (43 %);
hyperagglutinables (agglutinables par Ie serum normal
frais) (7 %) ; inagglutinables par les methodes ordiI}aires
(45 %) mais agglutinables apres avoir ete traites par la
methode suivante de Porges: ajoufer 1/10 d'Rel n'ormal a
10 centimetres cubes d'emulsion de pneumocoques. Plon,({er
 MJJ:NINGOCOQUE 343
5 minutes dans l'eau bouillante, refroidir.a l'eau cour~mte,
neutraliser avec1/10 de NaOH normale. Repartiret opereI'
com me precedemment. Selon les echantillons, il est parfois
necessaire de porter de 2/10 a 5/10 la quantite d'HCl.
Streptococcus mucosus capsulalus - Simple variete de
pneumocoque du type III; facilement agglutinable par Ie
serum anti-pneumococcique Ill; forme des capsules tres
cpaisses meme dans les milieux non albumineux.. Dis-.
position frequente en chaflletles courtes et rectilignes. En
bouillon, trouble uniforme avec ondes Sur gelose, colonies
visqueuses, Ctalees. En gelatine, colonies globuleuses.
Soluble dans la bile.
On Ie trouve dans 10 pour 100 environ des pneumonies
(cas graves, souvent mortels) et surtout dans les.suppura-
tions oto-mastoidiennes.
Pathogene pour Ie cobaye (M. L'evy-Bruhl), la souris
et, parfois, Ie lapin.
Produit une hemolysine assez active ct comme presque
to us les pneumocoques, transforme l'hemoglobine en me-
themoglobine.

D. - Meningocoque.
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Cocci isoles ou diploco-.
ques en grains de cafe dans les produits pathslogiques. Les
preparations faites avec le depot centrifuge de liquide cere-
bro·~pinal preleve par ponction lombaire montreni la plu-
part des elements microbiens inclus dans les leucocytes.
C;occi isoles, tetrades et formes geantes d'irwollltion dans
les milieux de culture. surtout a Ia premiere generation.
COLORATION. - Bleu Loffier ou hi en Borrel. Ne prend-
pas Ie Gram. Le meningocoque se trouve souvent associe'
au DiplococclIs crassu.> ou psclldo-merzingocoquc de Jaeger,
qui est plus epais, plus arrondi, et reste colore par Ie-
Gram. Le meningocoql1e vrai ne peut etre differencie
des parameningocoques que par l'etude complete de ses
diverses reactions biologiques.
CULTURE. - Aerobie strict. Temperature optimum 37°,
Ne se developpe pas au-dessous de 22°,
Bguilloll ascite. - 3 volumes de bouillon, 1 volume d'as-
344- MALADIES INFEC7;'IEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

cite.Le meningocoque ne commence a troubler ce milieu

que vers Ie 5~ ou Ie 6e jour. Voile mince it la surface.
Gelose-asci/e.
Bouillon gelose .• 3 vol.
Ascite •. ' • • • 1 vol.
"
Faire Ie melange a la -temperature de 50°. Couler en
boites de Petri. Laisser solidifier.
0).1 ensemence ces plaques directement'au lit du malade,
avec les tampons d'ouate qui ont servi a prelever les exsu-
dats nasopharynges; on les porte 36 heures it l'etuve, puis
on repique les colonies sur les milieux differentiels. S'il
s'agit d'un liquide de ponction lombaire, on e!ale sur ce
milieu une partie du depOt centrifuge: Les colonies du
meningocoque se developpent en 20 it 24 heures it 370.
Si ron ne peut se procurer du liquide d'ascite, on
emploiera Ie milieu suivant, preconise par SacqUl!pee .et
DelateI' :
On melange, dans un vase d'Erlenmeyer prealablement
gradue, deux blancs d'ceuf entiers. On y ajoute 3 fois leur
volume d'eau distillee et 0 cc. 5 p. 100 centimetres cubes
d'une solution de soude caustique a 10 p. 100. On sh~riHse
a l'autoclave a 115° pendant 15 minutes. On ajoute 1
partie de ce liquide a 5 parties de bouillon gelose neutre
sterile, fondu it 55°, et on coule en plaques. \ .
M. Nicolle, E. Debains et C. .louarz recommandent l'em-
ploi de la gelose Truche (ou Mlose T) comme milieu habi-
tuel.
Gelose au serum [ormole (M. Nicolle, E. Debains et .louan).
- Pour preparer Ia gelose-Martin-serum (formole), on
ajoute, a 500 centimetres cubes de serum de cheval, 1 centi-
metre cube de formol du commerce. On mele. On verse
apres quelques instants 1 centimetre cube d'ammoniaque a
220 Be pour neutraliser la formaldehyde, on etend de deux
parties d' eau dislillee et on sterilise pendant 15 minutes a
l'autoclave a 110°. Le milieu contient ainsi Hne partie de
serum pour 9, ce qui suffit.
Dans Ie bouillon preconise par Salimbeni et d'Herelle
pour Ie pneumocoque, Ie meningo pousse egalement tres
bien et reste vivant pendant une quinzaine dejours.
Presque tous les meningos, d'apres M. Nicolle et .ses
 MENINGOCOQUE 34t>

collaborateur's, attaquent Ie glucose, Ie maltose et, moins

energiquement, Ie levulose.
Pour l'isolement, on ens~mence, sur gelose-serum et en
milieu de Salimbeni et d'Herelle, Ie culot de centrifugation
du Iiquide cephalorrachidien preleve par ponction lombaire.
Milieu MM. (Panse glucosee). - Prendre, par exemple~
un litre de peptone Martin obtenue par digestion courte
(6-'8 heures); elle est fortement. acide. Alcaliniser, pre-
cipiter par chauffage a" l'autoclave pendant 15 minutes
a 120°. Filtrer sur papier, ajouter 2 grammes de glucose
par litre, repartir et steriliser par chauffage a l'autoclave
15 minutes a 112-115°.
Gelose au placenta (de Kutscher:). - Preparer un litre de
bouillon en faisant macerer 500 grammes de placenta bache
dans 1 litre d'eau:
Ajouter:
Gelose .. 2,5 p. l{)O
NaC!. {).5
Glucose. 1
Nutrose. . • . . 2
Peptone Chapoteaut. 2

A 3 volumes de cette gelose, legcrement alcalinisee ct

sterilisee., ajouter 1 volume de serum de brouf inactive par
chauffage a 60 0
•La gelose et Ie serum steriles doivent
etre portes l'un et l'autre fila temperature de 50° au b'ain-
marie avant d'en faire Ie melange.
CONSERVATION DES SOUCHES DE MENINGOCOQUES eM. Ni·
1;011e, D_ebains -et Joua/l). - On prend de gros tubes a
essai de 25 mm. de diametre et on y verse de la gelose-
Martin au serum formole, de fayon a obtenir un culot de 5
a 6 centimetres de hauteur. A la surface de ce culot solidifie,
on depose une anse de germes sans trap en lamer Ie milieu.·
On etale, afin d'obtenir, au centre de la surface Jibre, un,
disque d'epaisseur partout egale et on porte a l'etuve a 37 0 •
Les microbes ne tardent pas it se developper : Ie disque
d'ensemencement gagne lao paroi du lube 'et se sureleve
progressivement. Ils demeurent vivants pendant deux mois,
en general. Les repiqllages mensllels suffisent.
Pour l'envoi des cultures, on fait fondre un tube de
gelatine, on emulsionne. une grande quantite de germes
jeunes dans Ie milieu, on refroidit et on scelle.
~ MALADIEB.INFECT.LEUSES. rflCHmQUES SPEC/ALES

- A. Dujarric ,de la Riviere el A. Roux preconisent la tech-

nique suivante :
1. - On prepare: 10 de la gelose-foie selon la formule :
Foie de cheval (foie coupe en morceaux). • 500 gr.
Eau. . . • . . • . . . . . . . . 1.000 cc.

Faire bouillir a petit feu pendant 2 heures dans une

marmite fermee; filtrer sur papier; ajouter la 'quantite
d'eau qui s'est perdue par evaporation; mettre 20 grammes
de peptone Chapoteaut par litre; neutraliser, alcaliniser
faiblement ; meitre 20 grammes de gelose par litre; auto-
clave a 1150 pendant 30 minutes ; repartir sans fiJtrer;
sterjliser a 112 0 pendant 20 minutes.
2 0 Le melange suivant:
Gelatine (au bouillon). . . . . . • . • 200 cc.
Extrait globulaire(formule Agulhon-Legroux). 40 cc.

On s'assure par un sejour de 48 heures a l'etuve que ces

milieux sont steriles.
II. - La souche a conserver est d'abord semee a Ia surface
d'un culot de gelose-foie (repartie en tubes de 22 mm. pour
avoir une large surface de culture). Apres 48 heures d'etuve
on verse directement sur la culture (sur une hauteur de
4 centimetres environ) Ie melange gelatine-extrait globu-
laire prealablement fondu a une douce cpaleur: quand la
gelatine a fait prise, on ferme Ie tube a lit lampe.
III. - Au moment OU l'on veut pratiquerle repiquage on
commence par mettre Ie tube a l'etuve a 37 0 pendant quel-
ques heures. On ouvre en suite Ie tube en cassant Ie verre
Ie plus loin possible de la culture, puis on bouche avec un
coton sterile. En inclinant Ie Iiquide (gelatine liquefiee), on
prend aseptiquement avec une spatule Ie plus possible de la'
culture qui est sur la surface plane de la gelose-foie; avec
Ie fragment ainsi preleve on ensemence largement, et sans
trop etaler, un tube de gelose-ascite inclinee et on met a
l'etuve a 37°. On remet de meme a l'etuve, apres l'avoir capu-
chonne, Ie tube otigine afin de pouvoir pratiquer d'autres
repiquages.
DIAGNOSTIC B'ACTEnIOLOGIQUE DE L'INFECTION MENIN-
GqCOCCIQUE. - Recherche du meningocoque.
A) Dans Ie liquide ceplzalo-rachidien (chap. xxvnr, B). -
 MENINGQCOQUE 347

Le liquide cephalo-rachidien, preleve par ponction lom-

baire, est centrifuge pendant \5 it 20 minutes.
Examen microscopique. - Decanter Ie liquide clair.
Avec bne pipette effilee, prelever quelques gouttes du culot
de centrifug~tion, et les etaler sur plusieurs lames de verre.
Dessecher, fixer par la chaleUl: ou l'alcool ether; faire un
Gram et colbrer Ie fond par Ie Ziehl dilue.
Le meningocoque se presente sous la forme de cocci
en grains de cafe intraleucocytaires ou libres, ne prenant
_pas Ie Gram.
IsoIemenl du meningocoqlle.
10 Procede classique. - Ensemencer abondamment Ie
culot de centrifugation sur gelose-ascite, en tubes ou boite
de Petri. Mettre it l' etuve it 37 0 pendant 24 heures, exa-
miner les colonies qui ont pousse.
2° Procetle de Tribondeau. - Apres la ponction Iombaire,
prelever de 5 it 10 centimetres cubes dfl Iiquide cephalo-
rachidien. Le reste sera centrifuge pour l'examen micros-
copique et l'ensemencement du culot.
Couler de la gelose-ascite dans une grande boite de
Petri. Lorsqu' eUe est prise, verser sur Ie milieu les 5 it 10
centimetres cqbes de Iiquide cepl)alo-rachidien qui ont
ete preleves. La boite de Petri ainsi ensemencee est placee
~ plat it l'etuve it 37°. Au bout de quelques heures, incliner
legerement la boite de fayon que Ie liquide cephalo-rachi-
dien laisse a decouvert une bonne moitie de la surface du
milieu."
Vers la 18" heure, examiner les colonies de meningoco-
ques qui ont pousse dans la zone seche. Ie plus souvent it
la limite du liquide.

B) Dans Ie mucus rhino-pharynge. Le mucus doit ltre

preleve dans Ie rhino-pharynx avec l'ecouviIlon d_'ouate
sterile:
Deposer une parcelle de mucus recueilli sur une' boite
de Petri contenant de la gelose-ascite. Avec une pipette
coudee, l'etaler sur la boile. Sans la recharger-on peut faire
une 20 et une 3" boite semblables.

C) Dans Ie sang. 5 centimetres cubes de. sang ensemences

dans un ballon de 250 centimetres cubes de bouillon
348 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

ascite ou d'un autre milieu favorable. Isoler en suite sur

gelose-ascite.
IDENTIFICATION. - Les epreuves d'identification per-
mettent de reconnaitre : 10 si Ie germe isole est un menin-
gocoque j 2 0 a quel type de meningocoque il appartient.
Epreuve des fermentations SUCl'ees parle milieu diffel'en-
tiel au rouge lleulre (Dopier, R. Koch).
Dans une serie de matras con tenant chacun 75 centi-
metres cubes de bouillon gelose it ~ p. 100'fondu au bain-
marie a 55 0 , on fait dissoudre 1 gramme de ~hacun des
sucres suivants (chaque sucre dans un matms different) :
Glucose.
Saccharose.
Maltose.
Lactose.

" On chauffe 20 minutes a l'autoclavea 1050, on laisse refroi-

dir a 50", on ajoute a chaque matras 25 centimetres cubes
de liquide d'ascite et 1 centimetre cube de solution aqueuse
de rouge neutre alp. 100. Le milieu prend une couleur
orangee. On Ie mainticnt au bain-marie pendant 1 heUl"c.
An bout de ce temps, un precipite se forme. On agite les
inatras et on coule chaque milieu en boites de Petri. Sous
une faible epaisseur, il prend une teinte jaune et rougit
nettement sous les colonies qui fermentent les sucres.
Voici les resultats de la reaction avec Ie me'ningocoque et
avec les principaux microbes dont il s'agit de Ie diiIeren-
cier:
Glucose" Sacchal'ose Maltose Lactose
Meningocoque el Parameningocoque. + 0 + 0
Diplococcus crassus. • • . • . .
Microc. catarrhalis. . . .
+0 +0 +0 +0
Diploe. pharyngis flavus 1. + 0 + 0
II'» II. + 0 + 0
» III. + 0 +0 0
Gonocoque. + 0 0

DIAGNOSTIC PAR LA SERO-AGGLUTINATION~. - On prend

3 tubes a essai et on verse dans l'un, 1 centimetre cube d'une
dilution alp. 100 de serum anti-meningo (non chauffe),
dans les deux autres, respectivement, 1 centimetre..cube de
dilution aLp. 100 de serum de cheval normal {non chaufIe
et 1 centimetre cube d'eau salee physiQlogique a 7 gr. 5
p. 1.000.
 MENINGOCOQUE 349

On emulsionne dans chaque tube 1 ans~ de culture au

d'emulsion concentree d'une colonie agee de 24 heures du
meningoccrque a identifier. On porte a l'etuve a 37°, L'ag-
glutination est cbmpli~te au bout de quelques heures
(24 heures au plus) da!ls Ie premier tube s'il s'agit d'un
meningocoque. Beaucoup de pseudo·JTlcningocoques s'agglzz-
tinenl spontanemenl el presque instantanement dans ['eau
salCe physiologique. C'esl le cas, en particzzlier, pour Ie
lIfieroe. eatarrhalis.
11 est souvent commode d'effectuer Ia reaction d'aggluti-
nation directement sur lames (S. Costa):
On depose au centre d'une,lame deux gouttes d'enn salee
physiologique dans lesquelles on emulsionne, avec une anse
de .platine, un fragment de colonie suspecte. O~'J'ajb{Ite
une anse (representant environ 1/25 de goutte) de serum
agglutinant. On melange fortement pendant quelques
secondes, puis on recOUvre d'une lamelle et on examine.
Si, au bout de deux a trois minufes, l'agglutination ne se
produit pas, Ie sero-diagnostic est negatif. On fait ega-
lement une epreuve de conirole ayec du serum normal et
une autre avec de l'eau salee physiologique.
M. Nicolle, E. Debains el C. Jonan ant signare l'existenc'e
de plusieurs types de meningocoque (A, B, C) plus speoi.
fiquement agglutinables par un serum. .
Dans la region parisienne, Ie type B est Ie pIlls commun.
Pour determiner chaque type, on cultive les germes sur la
gelose Truche (voir chap. xxx, C) et, apres 24 heures
d'etuve, on les emulsionne dans de l'eau physiologi'que
additionnee de 1/20 de bouillon Martin, a raison de 1 centi-
metre cube de microbes pour 20 centimetres cubes de
liquide. On prepare 4 groupes de 4 tubes contenant 1 cen-
timetre cube d'emulsion et on verse respectivemerit poor
chaque groupe 1/20, 1/50, 1/100, 1/200 de centimetre cube
de chaque serum anti A, Bet C au de serum equin nornlal
(il est exceptionnel qu'on soit oblige d'emplQyer plus de
1/200 de centimetre cube de serum specifique). Oh agite
environ 10 minutes et on note]e taux auquel I'agglutination
se produit dans chaque lube. '/'
Sero'agglutination par la' 'methode de Porges modifiee
(M. Nicolle, Debain:~ cl JOllanj. - "Emulsionner les germ€s
provenant d'une culture recente sur gelose T, a raison de
350 MALADiES iNFECTiEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

1 centigramme 'de microbes pour 20 cc. d'eau physiologique

a10 p.1.000. Ajonter 0 cc. 1 d'acide chlorhydrique normal
pour 20 cc. d'cmulsion. Plonger 5 minutes dans l'eau
bouillante. Refroidir sous un courant d'eau et neutraliser
avec 0 cc. 1 de soude normale. '
Verser 1 cc. de l'emulsion ainsi traitee dans une serie
de tubes steriles et ajouter respectivement do, 10' 1~0'
2~0" .,. du serum etudie. Boucher les tubes a ronate.
Agiter quelques instants en indinant et redressant Ie porte-
tubes, alternativement, et lire.
On abandonne en suite les tubes pendant 24 heures.a ]a
temperature du laboratoire et on fait une seconde lecture,
]aquelle donne parfois des va]eurs ]egerement superieures
nux premieres.
La meme methode est applicable a t{}US. I.es..microbes.
PROC)~;DES INDIRECTS : PRECIPITO-DIAGNOSTIC (VINCENT)
POUR'LE LIQUIDE DE PONCTION LOMBAIRE. - Le liquide
centrifuge et decante est verse dans un tube sterile. A
50 gouttes de ce liquide on ajoute 1 a 3- gouttes de serum
antimeningo non chaufJe. Boucher Ie.tube au caoutchouc.
Preparer un tub,e de controle avec Ie Iiquide cephaIo-
rachidien seul. Porter a l'etuve a 37" ou mieux au bain-
marie it 550 • Au bO\lt de 15 it 16heures, ]e tube contenant Ie
serum anti est opalescent si Ie meningocoque est en cause,
L'autre tube reste ge~eralement Iimpide. Toutefois la reac-
tion n'est pas rigoureusement specifique. Elle est souvent
positive avec Ie param~ningocoque et avec Ie pneumocoque.
RECHERCHE DE L'AGGLUTINATION AVEC UN MENINGO-
COQUE TYPE. - Elle s'-effectue, avec Ie serum .du malade
suspect, vis-it-vis d'une culture type de meningocoque en-
tretenue au ]aboratoire. Elle doit,etre positive it 1 p. 40 ou
alp. 50. La reaction n'I"Pparait qu'au 8" ou 10· jour de .l~
maIadie, ce qui diminue beaucoup son importance.
FIXATION DU COMPLEMENT. - Elle se fait seIon la
technique des reactions pe Bordet-Gengou (voir chap. XXI),
soit avec Ie serum inactive du malade et un meningocoque
de culture-type entretenu au laboratoire, soit en meUant
en presence 1 centimetre cube de Iiquide cephalo-rachid~en
cOll!me antjgene et du serum antimeningococcique.
 (IONocOgUE 351
EPREUVE DU PERITOINE. - On prend deux cobayes de
250 a 300 grammes. L'un rec;oit, dans Ie peritoine, 1/2 cen-
timetre cube de jierum antimeningo non chauffe ; l'autre
1/2 centimetre cube de serum normal de cheval non chauffe.
Apres 24 heures, on injecte a tous deux, dans Ie peritoine,
1/6 environ d'une cuI'ture sur gelose, agee de 24 heures,
emulsionnee dans l'eau physiologique. 25 minutes plus tard
on preleve, a la pipette capillaire, par ponction (I'animal
etant tenu par un aide, Ie ventre en bas, saillant transver-
salement), quelques gouttes d'exsudat qU'on etale sur
lame. On seche et on fixe par l'alcool-ether. Colorer par
thionine pheniquee. Les menlngos vrais ont disparu ou
sont a peine visibles dans l'exsudat du premier cobaye,
tandis qu'ils se montrent nombreux et bien colores dans
celni du second. S'il s'agit de parameningocoques, l'exsu-
dat du premier cobaye est anssi riche en cocci bien colores
'que celui au second.
EPREUVE DE GRYSEZ (inoculation intra-rachidienne au
cob~ye). - On inocule directement dans la cavite rachi-
dienne, au niveau de la 4e ou5 evertebre lombaire, par ponc-
tion d'arriere en avant, avec une forte aiguille de seringue
de Pravaz, 0 cc, 5 du liquide cephalo-rachidien suspect,
non centrifuge. S'il s'agit de meningite cerebro-s'pinale a
meningo, la mort snrvient entre 2 et 24 heures avec nne
hypothermie tres caracteristique. Les animaux pr~alahle­
ment vaccines par Ie serum antimeningo ne succombent
pas et n'ont pas d'hypothermie .

••

E. - Gonocoque.

EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Diplocoques en grains de

cafe, opposes par leur face plane dans les produits patholo-
giques. Generalement intracellulaires. Plus arrondis ou
ovalaires dans les milieux de culture. I

COLORATION. - Elle s'obtiel1't tres aisement avec les

methodes simples. La plus recommandable est celIe de
Maurice Nicolle a la thionine pht'miquee ou bien Ie melange
352 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

de Pick et Jacobsohn, qu'on doit preparer au moment de

s'en servir avec des solutions meres:
Eau. . ....•.•.... 20 CC.
Sol. de fuchsine ~e Ziehl. • . • • XV gouttes.
So!. alcoo!. sat. de bleu de methylene. VIII goutles.
Colorer 30 secoudes. La'ver. Secher.
On peut aussi employer la methode de Pappenheim. qui
est tres alegan'fe. Elle consiste a colorer la preparation
pendant 1 minute avec une solution de vert de methyle et
de pyronine faite de la maniere suivante :
On met dans un flacon.O gr. 15 .de vert- de methyle,
o gr. -25 de pyronine, 2,5 -cent. cubes d'alc.ool absolu, 20
~entimetres cubes de glycerine, 100 centimetres cubes d'eau
ph'eniquee a 0,5 p. 100. Ce liq~ide est d'une belle- couleur
bleu ·violet. On Ie fait agir sur les preparations (fixees par
simple dessiccation lente et passage a travers Ia flamme)
pendant 2 a 5 minutes, puis on lave a,l'eau et on seche. Les
gonocoques apparaissent rouges et les noyaux cell!llaires
bleus.
La methode de Lesscynski est aussi tres bonne. On colore
ala thionine pheniquee pendant 30 a 60 secondes, puis on
lave a l'eau et on fait agir sur la preparation, pendant
1 minute, la solution suivante :
So!. sal d'acide picrique dans l'eau . • 1 vol.
Sol. nqueuse de potass"caustique a 1 p.1.000. 1 vol.
Ensuite, on passe a l'dlcool, on lave a \'eau, on seche et
on examine dans l'huile a immersion.
Les cellules sont jaune paille, les noyaux rouge violace,
les gonocoques violet noir, les autres microbes jaunes ou
rose rouge. Il y a toujours avantage a faire une prepara-
tion coloree au Gram pour deceler les cocci autres que Ie
gonocoque, par exemple Ie synocoque de Ch. Nicolle, qui
peuvent coexister ~vec celui-ci daJ,1s un pus urethral.
On fera alors un Gram-Nicolle et une coloration de con-
traste 'avec de la safranine DU du brun de Bismarck ott de
la fuchsine de Ziehl. . . ' .
CULTURE - Aerobie strict. pH limites = 6,0,8,3, pH
optim. = 7,3. Temperature optima: 37 0 ; ne pousse p,as
au-des~ous.
Pour isoler Ie gonocoque on peut se servir de. bouillon..
ascite (1 partie de liquide d'ascite, 3 parties de bO\lillon Oll
 GONOCOQPE 353

de gelose p-eptonee legerement 'alcaline), ou bien de III

gelose au serum de pore, de Wassermann.
Milieu gelose de Wassermann:
Serum de pore.. . . • 150 cc.
Ean distillee. . . . . 150 cc.
Glycerine. '" . 20 cc.
NutIOse (sol. a 2 p. 100). 9 ce.

Faire ce melange dans un vase d'Erlenmeyer et Ie por-

ter a 'l'ebullition en agitant constammerit, puis ajouter,
apres refroidissement a 55 0 , parties egales de gelose pep-
tonee a 2 p. 100 fondue, et couler en boites de Petri.
Les col~nies se 'developpent bien en 24 heures a 37 0 •
On peut encore employer Ie milie~ suivant :
Milieu de Sabou,raud eL Noire : Faire bouiIlir pendant
5 minutes 1 litre de lait frais. Precipiter la caseine par
addition de 2 centimetres cubes d'RCI et recueillir Ie'
serum par simple passage sur uh tamis recouvert de coton
h.ydrophile.
Ajouter moitie du volume d'eau. Neutraliser avec solu-
tion de soude a 10 p. 100. Porter it l'autoclave a 120 0 pen-
dant 10 minutes. Filtrer. Ajouter :
1 p. 100 de peptone.
l' p. 100 de glucose ou saccharose ..
0.30 p. 100 d'uree.
1.60 p. 100 de gelose.
Faire dissoudre a l'uutoclave. Filtrer Sur Chardin.
Repartir en tubes. Steriliser 10 minutes a110 0 •
Le milieu de Ch. Nicolle est aussi tres recommandable.
II permet de cultiver Ie gonocoque et Ie synocoque pour
la preparation du vaccin mixte :
Bouillon de viande. • . 100 ce. •
Uree . . • . . . . o gr. 40
Glucose pure. . . . . 2 gr.
Phosphate d'ammoniaque. o gr. 05
Sel marin. .• . •. 1 gr.
Gelose . . • 1 gr. 5

Plus, gour Ie gonocoque, a cc. 5 de.serum de lapin pour

5 centimetres cubes de milieu.
Apres 24 heures, retirer les cultures de l'etuve.
Pour la preparation de son vaccin mix~e, Ch. Nicolle
emulsionne les cultures dans nne solution a 7 p.,l.OOO 'de
MICROBIOLOGIE 23
354 MALADIES INFECTIEpSES. TECHNIQUES SPECIALES

fluorure de sodium, sterilisee par filtration a la bougie

Chamberland. On lave et on centrifuge plusieurs fois les
microbes avec la solution fluoree. Finalement 011 melange
1 partie de gonocoques a ~ parties de synocoques et on
titre a 500 millions de microbes par centimetre cube.
48 heures de sejour a la gI-aciere suffisent pour detruire
la vitalite des microbes.
Milieu de Lebamf. - L'auteur se sert d'un bouillon de
foie de cheval ou de boouf a 500 gr. par litre, additionne de
20 gr. de peptone Chapoteaut. D'autre part on melange
une par.tie de blanc d'oouf et 10 d'eau distilIee; porter a
l'ebullition, puis filtrer et steriliser a 120 0 • Le milieu com-
prend 400 cc! de cet extrait de blanc d'oouf pour 4 litres de
bouillon au foie; on ajoute 20 gr. de fecule de pomme de
terre et on gelose a 20 gr. par litre. Les cultures sont tres
abondantes en 24 heures. Pour conserver, on ensemence
par piqure ou culots de 30 mm. de diametre.
Le milieu ne, convient pas pour l'isolement .. mais pour
la recolle ou la conservation du gonocoque.

Nota. - Les cultures .de gortocoqueS' sont tres sensibles

ala dessiccation.
La plupart perdent leur vitalite sur Jes mi\ieux artificiels
en 5 a 9 jours. Cependant, ensemencees sur gelose-ascite
en tubes droits (en eulots) et maintenues a l'eiuve constpm-
ment entre 35 et 390, bien .capuchonnees plour eviler la
dessieeation, on., peut les conserver vi'Vantes pendant plus
d'une'annee ( V. Morax).
DIFFERENCIATION AVEC LE MENINGOCOQUE. - Sur
gelose ascite additionnee de teintnre de tournesol et de
2 p. 10Q de maltose, Ie meningocoque donne des colonies
rouges; celles ?e gonocoque restent i,ncolores. Le menin-
gocoque apres isolement pousse tres abondamment sur
gelose T; Ie gonocoque ne pousse pas.
FIXATION DU COMPLEMENT. --:-11 .resulte. des travaux de
nombreux auteurs que la reaction de Bordet-Gengou appli-
quee :it la recherche des anticorps gonococciques peut
fournir 100 p. 100. de reactions positives dans certaines
manifestations gonococciques (arthrites, orchi-epididy-
mites, affections gynecologiques).
D'apres Rubinstein et Jauran, il faut employer eomme
 MICROCOCCUS MELITENSIS

antigene un melange de plusieurs souches de gonocoques

apres 24 heures de culture sur ge!ose-ascite. Les memes
auteurs ant observe que Ie serum chauffe donne des resul-
tats plus specifiques .que Ie serum non chauffe.

F. - Micrococcus melitensis.
EXAMEN A L'ETAT FRAIS. - Cocco-bacille immobile,
tres fin, isole ou en diplocoques. Non cilie, non capsule,
non sporule.
COLORA'rION. -- Par toutes les couleurs basiques d'ani-
line. Ne prend pas Ie Gram.
CUL'I'URE. - Toujours lente. Temperature optimum 37°.
Sur plaques au tubes de gelose, ressemble it des gouttes
de rosee apres 48 a 72 heures (sur serum coa-gule,
colonies blanchiltres, humides). Aerobie.
Sur gelatine, n'apparait qu'apres 5 jours a 220. Pas de
liquefaction.
En bouillon legerement alcalin, faible trouble apres
4 heures, mais la culture ne se developpe bien qu'en 8
jour.s. Aroas peu denses au fond des tubes. Ne fermente pas
les,sucres. Tue par 10 minutes de chauffnge it 58°.
SERODIAGNOSTIC. - L'epreuve doit toujours etre effec-
tuee avec Ie serum des malades chautIe 30 minutes a 560
pour eliminer les agglutinines nOn specifiques. Employer.
autant que possible, des races de M. melitensis non agglu-
tinables par les serums normaux.
Pour eviter Ies contaminationsfrequentes de laboratoires
on peut se servir aussi.<iu b acille de Bang au bacille de
l'avortement epizootique qui se comporte exnctement·
comme Ie M. melitensis dans les epreuves d'agglutination.
Si les rcsultnts sont negatifs ayec ces microbes, essayer
Ie pouvoiI' agglutinant du serum sur une race de M. para-,
melitensis.
En prenant les precautions indiquees, jes titres d'aggru-·
tination superieurs a 1 p. 250 permettent d'ctablir Ie dia-
gnostic.
Le serum reste agglutinant apres In con'Vales'cence pen-
dant longterops, parfois apres 10 tms.
356 MALADIES INFECTIEUSES. TI!CHNIQUES SPE(JIALES
\
DIAGNOSTIC PAR L'INTRADERMOREACTION. - Ce pro-
cede, propose par Burnet, consiste dans l'injection d'une
goutle du filtrat d'une cnlture de M. melitensis en bouillon,
agee d'un mois (MeIitine). La'culture est filtree sur bougie
Chamberland La. A la suite de !'injection, on voit, a partir
de la sixieme heure, une reaction locale' caracterisee par de
l'redeme et de la rougeur. Cette reaction n'apparait que
chez les sujets infectes par Ie M. melilensis.-Elle sert au
diagnostic de la me]itococcie chez l'homme, mais non chez
]a chevre.
HEMOCULTURE. - Le diagnostic doit toujours etre
appuye d'une hemoculture portant sur 5 ~ntimetres cubes
de sang qu'on preleve aseptiquement dans une ve~ne, au
moyen d'une seringue contenant 8 a 10 gouttes de solution
it 10 p. 100 de citrate de soude sterilisee et qu:on pro-
jette aussitOt dans un gros tube de bouillon nutritif.
Le tube est porte a I'etuve et, a partir du 3e jusqu'au 10"_
jour. on en preleve, a la pipette, quelques gouttes pour
ensemencer des tubes de gelose et isoler des colonies dont
on verifie ]a purete.
L'urine des ma]ades, surtout a partir du 15" jour et pen-
dant la convalescence. contient frequemment des me]ito·
coques qu'on peut cultiver en partant d'urine recueillie
aseptiquement a ~a sonde.

...."*
G. - Bacillus I abortus, (Avortement epizootique.)

Morpho]ogiquement, rien ne distingue]e bacille de l'avor-

iement epizootique du MicrocOf;CU$ melitensis.
~~s ~ulture~ sont identiques ; .elle& brunissent reguliere-
ment ; cette propriete est plus marquee pour ]e coccoba-
cille de Bang.
Les deux microbes developpent dans Ie bouillon un~
alcalinite identique ; i]s decbmposent l'uree et ]'aspa~a­
gine; ni run ni l'~utre u'attaquent les sucres.
Le serum des individus attcints de fievre ondu]ante' et Ie
'serum des animaux (chevres, cobaye~) infectes. par]e meli-
tensis agglutinent au meme titre Ie melitensis et l'aborlus.
 BACILLUS ABORTUS 357

Les cobayes infectes avec Ie M. melitensis sont seni>ibles it

l'intradermoreaction a l'aborline comme ceux qui ilnt etc
inocules avec Ie B. abortus repondent it l'injection de
melitine.
Si l'on excepte I'action pathogene pour J'homme, rien ne
permet, en l'etat actuel de nos connaissances, de distinguer
Ie Micrococcus melitensis du Bacillus abortus.
Le serum des vaches infectees agglutine Ie Bacillus
abortus it un taux variable de 1 p. 100 alp. 10.000. Le
diagnostic de l'infection peut etre fait par l'epreuve de
l'agglutination.
 CHAPITRE XXXI

BAClLLE PYOCYANIQUE. - BACILLE DE LA COQUELU-

CHE. - BACILLE DE DUCREY. - BAClLLES DES
CONJONCTIVITES. - BACILLE DE FRfEDLANDER.-
BACILLE DU RHINOSCLEROME. - BACILLE 00 BORDET
(DIPHTERIE AVIAIRE). '

A. - Bacille pyocyanique (Gessard).

Tres polYmorphe. Mobile, 1 seul cil. Non sporule.

Formes isolees ou en chainettes.
COLORATION. - Par to utes les couleurs basiques. Ne
prend pas Ie Gram.
CULTURE. - Aerobie facultatif. Temperature opt. 20-38°.
pH limites : 5,6-8,0; pH optimum 6,6-7,0.
Se developpe bien sur tons les milieux usuels, peptones.
Sur gelatine, donne des colonies bIen verdatre, fluores-
centes, lentement liquefiantes. Sur gelose, ii forme un pig-
ment vert bleuatre, qui penetre peu a peu toute la masse,
brunit en vieillissant et donne naissanc,e a des cristaux en
forme d'aiguilles.
II pousse abondamment sur bouillon alcalin en formant, a
la surface, nne membrane mucilagineuse qui s'epaissit peu
a peu et reste flottante dans la masse liquide. II y developpe
une odeur aromatique assez intense, rappelant celie des
fleurs de jasmin ou de tilleul. A la longue, Ie milieu brunit
et les bacilles s'autolysent. Cette antolyse se continue et
s'acheve lorsqu'on ajoute au bouillon dn chloroforme ou
du toluol.
Coagule Ie lait; Ie coagulum est peptonise et digere
lentement.
Le b. pyocyanique acidifie les milienx glucoses mais ne
les fermente pas. II est tres fortement denitrifiant, de-
compose les nitrates et aussi les nitrites en degageant de
l'azote.
 13ACILLE PYOCYANIQUE

Le milieu de culture propose par GessarG. convient Ie

mieux a l'etude des proprietes tres curieuses de ce microbe:
Gelose hnchee en petits morceaux. 12 gr. 50
Peptone. • 5 gr.
Enu. . . • . . . • • 250, c:!c.
Glycerin". • . • . . • • • 10 gr.

On dissout la peptone dans reau chaude, ort ajoute ia

glycerine puis Ia gelose. On fait fondre a 1000 dans I'auto-
clave non boulonne et on repattit en tubes, sans fiItrer.
Steriliser 30 minutes a 1150 et laisset reftoidit les tubes
Inclines, ' .
Dans ce milieu, Ie bacille produit avec intC"llsite sOri pig-
ment bleu et certaines varietes y produisent Ut1 pigment
jaune verdiHre, puis rouge v:if (vin ou groseille), ou un
pigment noir (varieies eryihrogenes et vur. melunogenes).
Dans Ie blanc d'reuf pur, liquide (preleve aseptiquement
"par ponction de l'reuf a travers Ia chambre a air et reparti
en tubes a essai steriles), il ne donne que du pigment vert
fluorescent.
Le pigment bleu (pyocyanine} est soluhlt; dans 1e chloro-
forme. On peut l'extraire en agitant, avec quelques goultes
de chloroform6;' Un tube de culture en bouilldtt papton~. Le
pigment vert, 1luorescent est insoluble dans Ie cnlororotme
et dans l'alcool, soluble dans reau.
La pyocyanine cristallise (par evaporation du chloro'"
forme) en longues aiguilles bleues. Les aoidas dilues (Hel)
la rougissent, tandis qne les substances rcdtictrice~ (HiS)
la transforment en leucobase jauniHre ; Ies alcnlis la blouis-
sent de nouveau. .
Les cultures de b. pyocyanique contienlIent un ferment
lipolytique tres aetif, une hemolysine thermdstabile li~e it
In presence de lipd'ides et qui n'est pas susceptibl~de jouer
Ie role d'antigene, une catalase qui decompose I'6mJ,oxyge ..
nee, un ferment trypsique, un ferment lab, une casease, une
invertine et un ferment bacteriolytique.
Cet ensemble constitue la pyocyanase. Celle-ci dissout
Ia gelatine, la fibriI1e l la caseine, Ie Serum coagtile. et l'al-
bumine d'reuf. Ella dissout aussi les bacteridies charbon-
neuses et tue rapidement les bacilles diphteriques, les
pneumocoques, les staphylocoques, les streptocoques, les
vibrions cboleriques et les bacilles de la dysenteric.
360 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SPECIALES

B. - Bacille de la Coqueluche (Bordel el (iellgou).

Tres petit bacille aerobie, intra ou extracelluhiire, ne

prenqnt pas Ie Gram, immobile.
II prend difficilement 'les couleurs. On Ie met cependant
en evidence pade bleu phenique de Kuhne, Ie bleu Borrel,
Ie bleu de toluidine ou la thionine pheniquee, en prolon-
geant quelque peu l'action du colorant. II se teint davan-
tage aux poles qu'au centre. ~
On Ie cultive sur gelose arrosee de sang humain-ou mieux
sur Ie milieu suivant de Bordet el Gengo,!- :
Pommes de terre conpees en trnnches.. • 100 gr.
Ean glycerinee Ii 4 p. 100.. • . . . . 200 cc.

Cuire a l'autoclave 30 minutes a 120 0 ; separer Ie Iiqriide

par expression a travers un linge. Filtrer sur ouate hydro-
phile.
A 50 centimetres cubes de ce liquide, ajouter:
Ean salCe a 6 p. 1.000. • . 150 cc.
Gelose. ••...•. 5 gr.

Faire fondre a l'autoclave a 100°, rcpartir en tubes et

steriliser a 120°.
A chaque tnbe contenant ce milieu liquide a 50°, ajouter
parties egales de sang defibrine d'homme IOU de lapin
recueilli aseptiquement. Agiter legerement sans faire de
bulIes et coaguler en 'position inclinee.
Le developpement du microbe ne devient visible qu'a-
pres 24 a 48 heures. Colonies tres petites, blanches, proe-
minenles, a bords tailles a pic. ElIes sont fragiles et ne
se conservent guere plus d'un mois vivantes.
Le b. de Ia coqueluche est hemolysant. II contient une
endotoxine necrosante.

C.- Bacille de R. Pfeiffer (non specifique de l'inflncnza,

mais presque constant dans cette maladie).
Ce bacille aerobie, tres petit, abonde dans les crachats des
malades. On Ie col0rc facilement par Ia fuchsine diluee, Ie
 BACILLE DE DUCRE'Y 361

bleu de methylene alcalin ou la thionine pheniquee. II ne

prend pas Ie Gram. II est recommandable de traiter d'abord
la preparation, avant de la colorer, par une solution a
1 p. 100 d'acide a(_!ctiqueo On voit alors mieux les amaS de
microbes parmi les cellules.
On Ie c'ultive sur gelose arrosee ou melangee de sang
humain, ou addition nee d'extrait 'd'henJalies (Legroux)
(voir milieux vitamines). pH limites: 6,2-7,6; pH opti-
mum: 7,0.
Les colonies se dcveloppent en gouttes transparentes,
homogenes, coniluentes, seulement entre 27 et 42" (opti ...
mum 37 0 ) en 18 a 24 heures. II faut les reensemencer taus
les 4 ou5 jours, car elles sont tres fragileso
Le microbe n'est pathogene que pour les tres jeunes
cobayes; il est tue par 15 a 20 minutes de chauffage a 50° .

..
Do - Chancre mou (Bacille de Dllcrey).
Petit diplobacille en chainettes, tres grele, ne prenant
pas Ie Gram. On Ie colore tres elegamment par la methode
de Unna-Pappenheim. Les coupes de tissu, fixees par 1'al-
.cool ou Ie formol a 4 p. 100, sont traitees pendant 10 minu-
tes par la solution suivante:
Vert de methyle. . . • o gr. 15
Pyronine.. 0 0 0 0 • o gr. 25
Alcool absoluo . • 0 • 2 ceo 5
Glycerine.0 • 0 • • • 0 0 20 cc.
Eau phCniquee a 0,5 po 100. 200 ce.

On lave a l'eau, puis a l'alcool et au xylol. On monte

en suite dans l'huile de cedre ou Ie baume. Les diplobacilles
sont colorcs en rouge pourpre fonce, les tissus en vert
bleu:Hre.
Oulture assez difficile a obtenir. Pour l'isolement, par-
tir d'un chancre d'inoculation protege par un pansement
aseptique, ouvertau second jour et bien nettoye. Prelever
ponrla culture Ie tissu du fond de I'ulceration.
Le meilleur milieu est la gelose peptonee, a 3,5 p. 100
d'agar, additionnee du tiers de SOn poids de sang defibrine
de lapin (Reerzslicrna) Repartir en tubes d'assez gros volume
0
362 MALADIES INFECTIEUSES. TECHNIQUES SP~CIALES

qu'em incline et prepares Ie jour meme. (Ce milieu peut

etre legerement modifle en sterilisnnt dans tme.fiole d;Er~
lenmeyer90 grammes de gelose nutritive a 3 p. 100 d'agar
et en y ajoutant 20 grammes seulement de sang defibrini!
de lapin. Ch. Nicolle et P. Durand.)
Ensemencer une douzaine de tubes, les mettre a-l'etuve a
35°. La culture s