Annexes

Annexe 1. Les milieux de culture

Milieu 1 (M1). Solution peptone-sel

Reconstitution : 9,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre d'eau distillée

Peptone…………………………………………….. 1

Chlorure de sodium………………………………. 8,5

 pH final : 7,0 ± 0,2 à 25°C

Milieu 2 (M2). Plate Count Agar (PCA)

Reconstitution : 20,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone…………………………............................ 5

Extrait autolytique de levure……………………… 2,5

Glucose………………………………...................... 1

Agar agar bactériologique………………………… 12

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2.

 Annexes

Milieu 3 (M3). Gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBG)

Reconstitution : 39,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : porter à ébullition (à ne pas autoclaver).

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Digestat enzymatique de tissus animaux……………... 7

Extrait autolytique de levure ………………………….. 3

Glucose ………………………………………………... 1

Sels biliaires……………………………………………. 1,5

Chlorure de sodium……………………………………. 5

Rouge neutre…………………………………………… 3mg

Cristal violet…………………………………………… 2 mg

Agar agar bactériologique ……………………………. 13 g

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,4 ± 0,2.

Milieu 4 (M4). Gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBL)

Reconstitution : 38,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : porter à ébullition 2 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

 Annexes

Peptone pepsique de viande …………………………….. 7

Extrait autolytique de levure…………………………….. 3

Lactose…………………………………………………… 1

Sels biliaires…………………………………………….. 1,5

Chlorure de sodium…………………………………….. 5

Rouge neutre…………………………………………… 30 mg

Cristal violet……………………………………………. 2 mg

Agar agar bactériologique……………………………... 12

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,4 ± 0,2.

Milieu 5 (M5). Gélose de Baird-Parker avec plasma de lapin et fibrinogène (RPF = Rabbit Plasma Fibrinogen)

Reconstitution : 58 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone …………………………………………………. 9

Extrait de viande………………………………………… 4,5

Extrait autolytique de levure……………………………. 0,9

Pyruvate de sodium……………………………………… 9
 Annexes

Glycine…………………………………………………. 10,8

Chlorure de lithium……………………………………... 4,5

Agar agar bactériologique……………………………... 13,5

Fibrinogène bovin……………………………………… 5

Plasma de lapin, EDTA ………………………………. 25 mL

Inhibiteur de trypsine…………………………………. 25 mg

Tellurite de potassium………………………………… 25 mg

 pH du milieu complet prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.

Milieu 6 (M6). Gélose Tryptone-Bile-X-glucuronate (TBX)

Reconstitution : 30,6 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone ……………………………………………… 20

Sels biliaires…………………………………………... 1,5

BCIG

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronate)………. 75 mg

Agar agar bactériologique…………………………….. 9g

 Annexes

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.

Milieu 7 (M7). Bouillon cœur-cervelle (BHI : Brain Heart Infusion)

Reconstitution : 37,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Extrait cœur-cervelle………………………………….. 17,5

Peptone pancréatique de gélatine……………………… 10

Chlorure de sodium……………………………………. 5

Phosphate disodique………………………………….. 2,5

Glucose………………………………………………… 2

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,4 ± 0,2

Milieu 8 (M8). Bouillon Rappaport-Vassiliadis Soja (RVS)

Reconstitution : 26,60 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Peptone papaïnique de soja………………………….. 4,5

 Annexes

Chlorure de sodium…………………………………... 7,2

Phosphate monopotassique…………………………… 1,26

Phosphate dipotassique……………………………….. 0,18

Chlorure de magnésium anhydre……………………... 13,4

Vert malachite (oxalate)………………………………. 36 mg

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 5,2 ± 0,2.

Milieu 9 (M9). Bouillon Müller-Kauffmann au tétrathionate-novobiocine (MKTTn)

Reconstitution : 89,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : ne pas autoclaver

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone………………………………………………. 8,6

Extrait de viande………………………………………. 4,3

Sels biliaires…………………………………………... 4,78

Chlorure de sodium……………………………………. 2,6

Carbonate de calcium………………………………….. 38,7

Thiosulfate de sodium anhydre…...…………………… 30,45

Vert brillant……………………………………………. 9,6 mg

 Annexes

Iode…………………………………………………….. 4

Iodure de potassium……………………………………. 5

Novobiocine ………………………………………….. 40 mg

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,0 - 8,0

Milieu 10 (M10). Gélose Xylose-Lysine-Désoxycholate (XLD)

Reconstitution : 55,2 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : ne pas autoclaver, couler rapidement les boites

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Extrait autolytique de levure………………………….. 3

L-Lysine………………………………………………. 5

Lactose……………………………………………….. 7,5

Saccharose……………………………………………. 7,5

Xylose………………………………………………… 3,5

Désoxycholate de sodium…………………………….. 2,5

Chlorure de sodium……………………………………. 5

Thiosulfate de sodium………………………………… 6,8

 Annexes

Citrate ferrique ammoniacal…………………………… 0,8

Rouge de phénol………………………………………. 80 mg

Agar agar bactériologique…………………………….. 13,5

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,4 ± 0,2.

Milieu 11 (M11). Eau Peptonée Tamponnée (EPT)

Reconstitution : 20 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

 Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Peptone………………………………………………… 10

Chlorure de sodium…………………………………….. 5

Phosphate disodique anhydre………………………….. 3,57

Phosphate monopotassique anhydre…………………… 1,5

 pH des milieux prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,0 ± 0,2.

Milieu 12 (M12). COMPASS Listeria Agar

Reconstitution : 71,90 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

 Annexes

- Peptone pepsique de viande…………………………… 18

Tryptone…………………………………………………. 6

Extrait de levure…………………………………………. 10

Pyruvate de sodium……………………………………… 2

Glucose………………………………………………….. 2

Glycérophosphate de magnésium………………………... 1

Sulfate de magnésium anhydre…………………………… 0,5

Chlorure de sodium……………………………………….. 5

L--phosphatidyl-inositol………………………………… 2

Hydrogénophosphate disodique anhydre………………… 2,5

Chlorure de lithium……………………………………….. 10

5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucopyranoside………. 0,05

Acide nalidixique…………………………………………. 0,02

Ceftazidime……………………………………………….. 0,02

Polymyxine B (sulfate)………………………………… 76700 UI

Cycloheximide…………………………………………….. 0,05

Agar agar bactériologique…………………………………. 12

 Annexes

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.

Milieu 13 (M13). Gélose TSAYE (Tryptic Soy Agar Yeast Extract)

Reconstitution : 47,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone……………………………………………………. 17

Peptone papaïnique de soja…………………………………. 3

Extrait autolytique de levure………………………………… 6

Glucose………………………………………………….. 2,5

Phosphate dipotassique………………………………….. 2,5

Chlorure de sodium………………………………………. 5

Agar agar bactériologique……………………………….. 11

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,3 ± 0,2.

Milieu 14 (M14). Gélose Tryptone-Sulfite-Cyclosérine (TSC)

Reconstitution : 42,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

 Annexes

Tryptone…………………………………………………. 15

Peptone papaïnique de soja ………………………………. 5

Extrait autolytique de levure……………………………… 5

Métabisulfite de sodium………………………………….. 1

Citrate ferrique ammoniacal……………………………….1

D-cyclosérine……………………………………………. 0,4

Agar agar bactériologique……………………………….. 15

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,6 ± 0,2.

Milieu 15 (M15). Gélose sélective pour Bacillus cereus selon Mossel

Reconstitution : 44,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Tryptone…………………………………………………... 10

Extrait de viande…………………………………………... 1

D-mannitol………………………………………………... 10

Chlorure de sodium………………………………………... 10

Rouge de phénol…………………………………………… 25 mg
 Annexes

Polymyxine B……………………………………………… 1x105 UI

Emulsion de jaune d’œuf stérile………………………….. 100 mL

Agar agar bactériologique………………………………... 13,5

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.

Milieu 16 (M16). Gélose glucosée à l’oxytétracycline (GC)

Reconstitution : 40,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée

Stérilisation : à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

Ingrédients en grammes pour un litre de milieu

Extrait autolytique de levure……………………………… 5

Glucose…………………………………………………… 20

Oxytétracycline……………………………………………0,1

Agar agar bactériologique………………………………... 15

 pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 6,6 ± 0,2.

 Annexes

Annexe 2. Liste du matériel

1. Matériel de l’échantillonnage
 Sacs plastiques alimentaires stériles
 Plaques eutectiques (accumulateurs de froid)
 Boite isotherme
 Gants stériles

2. Matériel de laboratoire
 Brûleur à gaz (Bunsen) : produit une flamme nue étroite et est alimenté par du gaz de ville, principalement utilisé pour stériliser les
anses en métal et d’autres petits éléments de matériels résistants.
 Autoclave : utilisé soit pour stériliser le matériel propre (et/ou les milieux de culture), soit pour décontaminer le matériel usagé (et/ou les
milieux de culture utilisés).
 Bain thermostaté : utilisé pour maintenir en surfusion des milieux gélosés stériles pendant la préparation des milieux , dont la
température allant de 44°C à 47°C.
 Bain marie : permet la fusion des milieux gélosés dans un bain d’eau bouillante.
 Réfrigérateur : permet de conserver au froid positif des milieux de culture non ensemencés, des réactifs, des échantillons pour essai, des
cultures de micro-organismes et des milieux incubés. La température doit être de (3±2) °C.
 Congélateur : permet de garantir une conservation en froid négatif. La température doit être inférieur à -15°C, de préférence inférieur à -
18°C pour les échantillons alimentaires.
 Plaque chauffante : équipée de système d’agitation mécanique, utilisée pour chauffer les milieux de culture.
 Etuve : appareil d’incubation, permet de maintenir une température stable et uniformément répartie.
 Annexes

 Stomacher : assure un mélange et une homogénéisation rapide et fiable des échantillons d’essai.
 Agitateur vortex : instrument facilite l’homogénéisation de milieux liquides ou la mise en suspension de cellules bactériennes dans un
liquide.
 Dispositif de comptage des colonies
 Pipettes et pipetteurs
 Anse stérile
 Râteaux stériles
 Boites de pétri
 Béchers
 Tubes à essai
 Ecouvillons
 Annexes

Annexe 3. Les critères microbiologiques indicateurs d’hygiène des procédés, du Règlement

(CE) 2073/2005, pour les préparations contenant du poisson cru

Tableau 1. Critères microbiologiques et valeurs seuils applicables aux denrées alimentaires

(«Sushi»/ «Gravlax»)

Catégorie de denrée Micro-organisme m Remarques

Microorganismes
100 000
aérobie 30°
Escherichia coli 10

Préparations contenant Staphylocoques

100
du poisson cru destinées à coagulase +
la consommation en l'état
(Carpaccio, «Sushi », Bacillus cereus 100
Critère valable pour les
Tartare, etc.) Salmonella/25g Absence produits de moins de 5 jours,
sinon l’interprétation selon le
Listeria règlement (CE) n°2073/2005
pour
monocytogenes 100 Listeria monocytogenes est :
Absence/25g

Microorganismes
100 000
aérobie 30°
Poisson crus marinés
Escherichia coli 10
règlement (CE)
Staphylocoques
100 n°2073/2005
coagulase +
Salmonella/25g Absence

Listeria
monocytogenes 100