Introduction à la microbiologie

 La microbiologie médicale :

Est la science qui étudie les organismes microscopiques

(micro-organismes ou microbes) pathogènes pour l'homme.

- Elle a pour principal objectif le diagnostic spécifique des infections, mais embrasse
également l'épidémiologie, la pathogenèse, le traitement et la prévention des
maladies infectieuses.

 Les bactéries :
Sont des procaryotes et ne possèdent donc pas de noyau, mais un seul chromosome
circulaire d'ADN.
-Elles ont une taille comprise entre 0,5 et 10-15 μm et une forme qui varie selon le
genre.
-Les bactéries se reproduisent par scissiparité.
-La majorité d'entre elles possèdent une paroi composée de peptidoglycane.
-ils doivent être observés au microscope (photonique/optique ou électronique) et
cultivés dans des milieux permettant leur croissance et leur isolement.

 Dès 1546, Fracastor suggéra que des organismes invisibles pouvaient être
responsables des infections, mais jusqu'à l'invention du microscope par van
Leeuwenhoek au dix-septième siècle, il fut impossible de les voir.

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 TP 01 :
L’examen direct
Introduction
-L'examen microscopique permet d'établir une pré identification du micro-
organisme étudié.
-Il peut être effectué à l’état frais sans coloration ou après coloration :

 État frais :

- Correspondent à l'observation sous microscope

optique (G × 40) d'une suspension bactérienne
entre lame et lamelle sans fixation préalable.

- Permet d’apprécier la forme et la mobilité.

 Apres colorations :

Les colorations sont indispensables à l'étude précise de la morphologie des

bactéries.
Préparation du frottis :

❶L’étalement: à l’aide de l’anse de platine, on étale une

goutte de la suspension bactérienne sur une lame propre et
dégraissée en une couche mince par un mouvement
circulaire et régulier.
❷Le séchage: effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis
présente un aspect mat.
❸La fixation: En faisant passer 3 ou 4 fois la lame au-
dessus de la flamme d'un bec Bunsen avec des mouvements
lents de va et vient afin de tuer les bactéries et les coller sur
la lame, sans en altérer la structure.
-Il faut attendre le refroidissement de la lame avant de
commencer toute coloration.

 coloration simple : utilisation d’un seul colorant sur le frottis

-coloration simple au bleu de méthylène :
Cette coloration consiste à déterminer la morphologie des bactéries qui sont toutes
colorées en bleu sombre ainsi que leurs groupement et disposition (intra ou
extracellulaire)

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Méthode :
-Après avoir effectué le frottis bactérien.
-Placer la lame sur un support de coloration et l'inonder de bleu de méthylène.
-Laisser agir pendant 1-3 minutes.
-Laver doucement la lame avec de l'eau distillée ou l'eau du robinet jusqu'à
élimination du colorants en excès.
-Egoutter l'excès d'eau, éponger sans frotter
avec du papier absorbant et laisser les lames
sécher complètement à l'air.
-Examiner sous microscope optique objectif
x100 à immersion (avec une goutte d'huile)
avec diaphragme ouvert.

 coloration double :
-Coloration de Gram :
C’est la coloration de base en microbiologie, permettant de colorer les cellules
bactériennes et de déterminer le type de Gram (positif ou négatif) en fonction de la
structure de leur paroi.
Elle permet d’orienter le traitement et le choix du milieu de culture…
Méthode :
La coloration de Gram est basée sur l'action successive de plusieurs substances :
NB : Entre chaque étape il faut rincer la lame avec de l’eau.

-Après avoir effectué le frottis bactérien

❶Coloration : Recouvrir le frottis d'une solution de violet de gentiane et laisser agir
1 minute.
❷Fixation : Recouvrir la lame de lugol et laisser agir 1 minute.
❸Décoloration : Décolorer la préparation à l'alcool à 95° pendant 30 secondes en
versant l'alcool sur la surface de la préparation et laisser agir 30 secondes
❹ Contre coloration : Recouvrir la lame de solution de fuschine et laisser agir 1
minute.
- Rincer à l'eau et sécher entre deux feuilles de papier filtre.
-Observer sous microscope en immersion (objectif X100).

Résultats :

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A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactéries colorées en violet foncé : →Dites Gram positif
Elles ont conservé le violet du fait de l’imperméabilité de leur paroi due à la présence
d'une couche épaisse de peptidoglycane interdisant le passage d’alcool.
- Des bactéries colorées en rose : →Dites Gram négatif
Elles ont perdu le violet due à la présence d’une membrane externe riche en lipides
et une très fine couche de peptidoglycane qui autorise le passage d’alcool, donc le
cytoplasme coloré en violet se décolore puis se colore en rose suite à la contre
coloration avec la fuschine.

-Coloration de Ziehl-Neelsen :
Elle permet de visualiser les bactéries dont la paroi est acido-alcoolo résistante.
Cette propriété remarquable est due à la présence, dans leur paroi, d'acides
mycoliques .

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 TP 02 :
La mise en Culture
Introduction :
-Les milieux de culture contiennent les substances nutritives
indispensables à la croissance des microorganismes ce qui
permet par la suite l’identification ainsi que l’étude de la
sensibilité aux antibiotiques .
-Ils sont disposés dans des récipients en verre de différentes
formes préalablement stérilisés.
-Les milieux de culture sont liquides ou solides.

-Si les cellules bactériennes sont isolées, leurs descendants s’accumulent en une
masse souvent bien délimitée appelée « une colonie » et dont l’aspect, les
dimensions, les contours, la structure sont autant de caractères précieux permettant
son identification.
-Comme les besoins nutritionnels des microorganismes et les conditions de leurs
développements sont très variés il n'existe évidemment aucun milieu universel sur
lequel tous les microbes soient capables de se multiplier.

-le choix de tels milieux repose sur la connaissance de l'habitat naturel et de la

physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver. D'une manière
très générale, on peut distinguer :

❶ Les milieux de culture simple (usuels, de base) :

-Sont des milieux comportant les éléments chimiques

strictement nécessaires à la croissance bactérienne,
utilisés pour la culture de bactéries non exigeantes
(enterobacteries, staphylocoque, pseudomonas..)

-La composition de ces milieux est simple et sans effet de sélection.

-Généralement utilisé dans le diagnostic de routine en laboratoire pour l'isolement
primaire des bactéries.
Exemple: Bouillon nutritif, gélose nutritive et eau peptonée..

❷ Les Milieux d'isolement : Les milieux d'isolement peuvent être :

 Des milieux de base
 Des milieux enrichis de produits biologiques : Ils contiennent, outre les
composants de base, des composants indispensables aux bactéries, que celles-ci
ne peuvent pas synthétiser.
-utilisés pour l'obtention des bactéries dites exigeantes.

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 Exemple : les milieux au sang frais « gélose + 5% de sang de cheval ou de
mouton » (streptocoque), au sang cuit (Haemophilus influenzae, klebsiella..).

 Des milieux électifs: Ce sont des milieux de culture permettant un

développement particulièrement abondant et rapide de certains germes, alors
que la plupart des espèces bactériennes s’y développent peu et lentement.
Exemple : milieu BCP « gélose au brome de crésol pourpre » de couleur violette
(permet la croissance des entérobactéries et inhibe le reste)
Bactérie LAC + «BCP devient jaune » / Bac LAC - «BCP reste violet »

 Des milieux sélectifs : permettent d'isoler une espèce bactérienne dans un

mélange poly-microbien .Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un
inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le développement
de la plupart des bactéries excepté celui de l'espèce recherchée.
La nature des inhibiteurs est variable, il peut s'agir :

- de NaCl : milieu de Chapman de couleur rouge,

contient 7,5% de NaCl, du mannitol et in indicateur
de Ph « rouge de phenol »
Ce milieu favorise la croissance de Staphylococcus.
Mannitol « + » la couleur rouge devient jaune
Mannitol « – » la couleur reste rouge

- de sels biliaires(désoxycholate): Hektoen : C’est

un milieu de couleur verte servant à l’isolement et
à la culture d’acynetobacterie et Enterobactéries,
en particulier à l’isolement des espèces Shigella et
Salmonella issues d’échantillons fécaux.
Milieu Hektoen
Il repose sur l'utilisation de sels biliaires pour l'inhibition sélective et de deux
systèmes indicateurs :

 Le bleu de bromothymol et la fuchsine acide comme indicateurs de la

dissimilation des glucides (lactose, saccharose, salicine)

LAC « + » (Ph acide) → jaune / LAC « – » (Ph neutre) → verte

 Le fer ferrique comme indicateur de la formation d'hydrogène sulfuré (H2S) à

partir de thiosulfate.

Si H2S « + » → colonies verte avec des points noir.

- d'antibiotiques: gélose au sang + ANC (acide nalidixique, colistine) pour les

Streptococcus.
- d'antiseptiques : gélose au cétrimide pour Pseudomonas.

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❸ Les Milieux d'identification :
Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques des
bactéries et donc de résoudre les problèmes d'identification différentielle qui se
posent entre des espèces ou des genres voisins.

Ensemencement et méthode d’ensemencement :

 L’ensemencement doit être effectué dans des conditions d’asepsie rigoureuses à
partir d’un prélèvement d’une colonie ou d’un bouillon bactérien avec une anse
de platine ou une pipette de pasteur sur un milieu liquide ou solide.

 Sur les milieux de culture solides coulés en boites de Pétri, plusieurs techniques
d’ensemencement peuvent être proposées.

Technique d’isolement ou d’épuisement :

-C’est la technique des 4 quadrants qui consiste à
disperser le microorganisme à la surface d’un milieu
solide afin d’obtenir des colonies séparées.

- permet de retrouver tous les microorganismes d’un

mélange et de vérifier la pureté d’une souche
bactérienne.

(1), (2)=Stries très serrées / (3),

(4)= aérées.

Méthode :
❶ Dessiner 4 quadrants sur le couvercle de la boite de pétri contenant le milieu de
culture adéquat préalablement préparé et séchée
❷ Bien homogénéiser la suspension bactérienne.
❸ Prélever à l’aide de l’anse de platine préalablement stérilisée une fraction de
l’inoculum qui sera déposée sur gélose à la périphérie du 1er cadrant de la boite de
pétri puis réaliser des stries très serrées, fines et parallèles.

❹ Passer au 2e quadrant sans toucher le 1er, ou stériliser l’anse et reprendre du

1er quadrant.

- Réaliser des stries serrées perpendiculaires aux premières stries.

❺ Passer au 3e et au 4e quadrant en desserrant légèrement les stries a chaque fois

afin d’avoir des colonies isolées bien séparées au niveau du 4e cadrant.

-Les boites de pétri sont toujours incubées renversées.

-L’incubation se fait à 37°C pendant 18 à 24h.

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-La culture se traduit par des colonies sur les stries.

-Sur ce milieu, on pourra définir l’aspect des colonies, mais aussi la présence ou non
de l’hémolyse complète ou incomplète lorsqu’il s’agit d’une GSF

 Il y a évidemment d’autres méthodes d’ensemencement par quadrants ; et

d’autres méthodes d’ensemencement de milieux en boites (ensemencement
en nappe, par piqûre, en masse, par touches,…).

Résultats :

-Apres 24h, retirer les boites et les tubes de l’étuve.

-Observer la culture bactérienne.

-Remarquer la présence de colonies sur milieu, leur nombre, leur morphologie dans
le 3e et 4e cadran, leur taille, bordure et couleur, présence d’hémolyse.

1/Staphylocoque : Cocci gram + disposées en diplocoque, en amas (grappe de

raisin), en chainettes.

-Germe non exigeant, pousse sur milieux ordinaires.

-Sur milieu Chapman :

Les staphylocoques pathogènes forment des colonies lisses, rondes, bombées,

luxuriantes, pigmentées, entourées d’une auréole jaune due à la fermentation
du mannitol.
Les staphylocoques non pathogènes forment en général de petites colonies de
1mm lisses, rondes, bombées et rouges qui ne modifient pas la teinte du milieu
à contour régulier

 mannitol « + » → staphylocoque aureus, colonies jaunes (coag +)

 mannitol « - » → staphylocoque blanc, colonies blanches (coag -)

S. coagulase négative (à gauche) et S. aureus (à droite)

-Sur gélose au sang frais, les colonies de [Link] sont beta hémolytique.

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2/Streptocoque : Cocci gram « + » disposées en chainettes.

-Bactérie exigeante.

-Sur gélose au sang frais : donne des colonies fines de 1-2mm, bombées, opaques et
bien délimitées, peut également avoir une zone d’hémolyse :

→Alpha hémolytique : donne une zone verdâtre et étroite (1-2mm)

→Beta hémolytique : donne une zone claire due à une hémolyse totale (3-4mm)

3/Pseudomonas : BGN

-Bactérie non exigeante, aérobie strict, ne fermente pas les sucres.

-Oxydase positive à la différence des entérobactéries.

-Possède une odeur caractéristique de jasmin.

-Pas de pousses sur Chapman.

 sur milieu Hektoen :

Donne des colonies sèches plissées de 3mm de diamètre, à contour irrégulier et ne

provoque pas de virage de la couleur (lactose – et H2S -).

 Sur gélose nutritive :

Donne des colonies de même aspect (grosse colonies), verdâtre due à la libération
de pyocyamine.

4/Klebsiella :

-Pousse sur milieux ordinaires.

-Les colonies sont lactose « + » sur les milieux utilisés pour les entérobactéries qui
contiennent du lactose.

 Sur gélose nutritive (GN)

Donne des colonies de (3-4mm), bombées, brillantes, muqueuses (bactérie

capsulées)

 Sur gélose au sang cuit

Donne des colonies lisses, brillantes d’une façon nette.

5/Escherichia coli : BGN

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-Pas de pousse sur Chapman.

 Sur gélose nutritive : Donne des colonies rondes de 2-3mm non pigmentées
bombées sèches.
 Sur Hektoen (milieu lactosé) : Elle est Lactose « + ».
 Sur GSF : Hémolytique.

6/Proteus :

-Bactéries non exigeantes. Elles poussent bien sur des milieux ordinaires tels que les
géloses BCP, Drigalski, Mac Conkey et autres.

-Les colonies diffusent sur les milieux riches et donnent un

aspect en vague concentrique (mobilité)
-Ces bactéries présentent une odeur désagréable
caractéristique.

7/Serratia :

-Fermenteur de lactose tardif

-Donne des colonies bombées luisantes à contour régulier.

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 TP 03 :
Galerie biochimique
Introduction
-L’identification du genre et de l’espèce d’une souche bactérienne doit se poursuivre
par la recherche de caractères biochimiques du métabolisme glucidique et
protidique, en ensemençant une galerie d'identification qui est un ensemble de
milieux de culture, pouvant se présenter soit :

 En tubes (macro-galerie)
 En système miniaturisé (micro-galerie)

-Pour effectuer une galerie biochimique on doit procéder à un examen direct, une
culture et un isolement de germes car la galerie biochimique nécessite des souches
pures.

Les differents milieux utilisés :

Milieu TSI : Triple Sugar Iron Agar

C’est un milieu solide coulé en culot + pente et qui est utilisé pour l’identification des
entérobactéries.

Composition :

-Glucose a faible titre (0,1%) -Saccharose et lactose (1%)

-Indicateur de Ph : le rouge de phénol -Thiosulfate de Sodium ou de Fer
→Rouge en milieu neutre -Peptone
→Jaune en milieu acide
→Rose en milieu alcalin

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  L’ensemencement se fait en stries au niveau de la pente, et en piqure au
niveau du culot.
 Lorsque l'un des glucides est fermenté, le milieu devient acide et passe donc
de la couleur rose (couleur originale) au jaune.
 Une couleur rose foncé indique une alcalinisation des peptones.
 Ce milieu permet l’étude de 5 caractères :

→ La fermentation du glucose en anaérobiose au niveau du

culot qui devient jaune et la pente rose (bactérie Glu «+»,
Sac/Lac «–»).

→L’utilisation du glucose, saccharose et/ou lactose: le culot

et la pente deviennent jaunes (bactérie Glu «+», Sac/Lac
«+»).

-La production de gaz (CO2 et O2) : détectée par le

décollement de la gélose et les bulles d’air.

-La production d’H2S qui apparait sous forme d’un précipité

noir.

Milieu de citrate de Simmons :

C’est un milieu de culture solide coulé en pente seulement, permettant la
différenciation des bactéries gram-négatives selon l'utilisation du citrate qui
constitue l'unique source de carbone.

L'utilisation de ce substrat est une utilisation aérobie, et se traduira par une

alcalinisation.

 L’indicateur de Ph : le bleu de bromothymol

 La pente est ensemencée par des stries réalisée à l'anse de bas en haut juste
dans les 2/3.

-Si il y a Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu

alcalinisation du milieu «la souche
est citrate de Simmons + ».
-Si il n’y a Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a
pas eu alcalinisation et le milieu ne présente pas de
culture «La souche est citrate de Simmons – ».

 le caractère étudié est le caractère citrate + ou -

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Milieu Mannitol-Mobilité :

C’est un milieu de culture semi solide coulé en culot seulement, caractérisé par
l'utilisation de mannitol.

Composition :

-Mannitol

-Indicateur coloré : rouge de phénol.

 L’ensemencement du milieu se fait par piqure centrale.

 Ce milieu permet l’étude de 2 caractères :
 La mobilité (caractère morphologique) :

-Les bactéries mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement, créant un

trouble dans le milieu (formation de vague).

- les bactéries immobiles poussent uniquement le long de la strie d’ensemencement

(zone de piqure identique).
 L’utilisation de mannitol (caractère biochimique):

-L’utilisation du mannitol acidifie le milieu qui est révélé par

le virage de l’indicateur de pH à sa teinte acide
(jaune) «bactérie mannitol + »

Milieu Urée Indole :

C’est un milieu liquide qui contribue dans la mise en évidence des caractères
d'identification des Entérobactéries.

-Indicateur coloré : rouge de phenol.

 Ce milieu permet l’étude de 3 caractères :

❶ l'hydrolyse de l'urée (par une uréase) :

La coloration rose fuchsia du milieu traduit une alcalinisation du milieu, suite à

l'hydrolyse de l'urée et formation de carbonate d'ammonium: « bactérie uréase + ».

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 ❷ la production d'indole :
-Après la lecture de l’urée, on procède à la lecture de
l’indole sur le même tube.
-Certaines bactéries dégradent le tryptophane (présent
dans la plupart des protéines)
en indole grâce à une tryptophanase.
-L’indole produit est révélé par des réactifs divers (virage
non spontané nécessitant l’addition de réactif, le plus
utilisé est le réactif de Kovacs).
→si l’espèce bactérienne est indole (+) : un anneau rouge
apparait à la surface du milieu.
→si elle est indole (-) : il y a un anneau jaune ou le milieu
demeure inchangée.

❸ La désamination du tryptophane par la tryptophane

désaminase :
-La présence de tryptophane désaminase (TDA) est mise en
évidence par addition de perchlorure de fer qui provoque
une coloration brun rouge du milieu en cas de réaction
positive.

Milieu Clark et Lubs :

C’est un milieu liquide qui permet l’étude de la voie de fermentation du glucose en

acide pyruvique (tests RM et VP) des bactéries de la famille des Enterobacteriacée
(BGN, oxydase -).

 L’ensemencement se fait par l’ajout de quelques gouttes de la suspension

bactérienne.

-Apres l’ensemencement on partage le milieu en 2 pour réaliser 2 tests.

 Ce milieu permet l’étude de 2 caractères :

 L’utilisation de la voie des acides mixtes ou 2,3 butyréne glycol

(butane2,3dione)

-Test RM (rouge de méthyle)

Ce test permet la mise en évidence, grâce au rouge de
méthyle, de la fermentation du glucose en acides mixtes
par acidification d'un milieu glucosé (coloration rouge du
milieu).
- Test VP (Vosges-Proskauer)
Ce test permet la mise en évidence de la production
d'acétoïne (ou 3-hydroxy-
butanone) au cours de la fermentation butylène glycolique:
En présence d'une base forte (soude ou potasse) et d'α-
naphtol, l'acétoïne donne un anneau rouge en milieu très
oxygéné.

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 TP 04 :
Antibiogramme
Introduction

L’antibiogramme :
est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un
ou plusieurs antibiotiques par compétition entre la
diffusion d’ATB et la croissance bactérienne sur
milieux gélosé.
-Il permet d’orienter le choix d’un antibiotique
pour traiter une infection bactérienne

Principe :

1/Préparation de la suspension bactérienne :

-A partir d'une culture de 18h sur milieu d'isolement en prend à l'aide d’une anse de
platine 4 à 5 colonies bien isolées.

-Décharger l’anse dans 5-10ml d'eau physiologique stérile à 0,9%

-Homogénéiser la suspension bactérienne qui doit être calibrée à de 0,5

MF(McFarland) sinon elle doit être ajustée par l’ajout d’eau physiologique ou de
colonies.

-L'ensemencement se fait dans les 15 minutes suivant la préparation de l'inoculum

standardisé de bactéries .

2/Ensemencement du milieu Mueller Hinton :

-A l’aide d’un écouvillon stérile trompé dans la suspension bactérienne puis essoré
contre les parois du tube, on réalise des stries serrées de haut en bas dans la totalité
de la boite pour former un tapis.

-On répète la manipulation trois fois après avoir pivoté la boite de pétrie à un angle
de 60° à chaque fois puis on passe l’écouvillon sur la périphérie de la boite.

3/Application des disques d’antibiotique :

-Les disques d’antibiotiques sont placés sur la gélose avec un distributeur ou

manuellement avec une pince stérile : Ces disques sont fabriqués à partir de papier

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 filtre imprégné d’agents antimicrobiens à des concentrations précises. Ils sont
clairement identifiés par un sigle, comportant 1 à 3 lettres (Exp : AM pour
Apmicilline, ETP pour Ertapéneme..) imprimé de chaque côté du disque.

-Les disques doivent être espacés de 24mm centre à centre.

-Le choix d’ATB utilisé dépend de chaque bactérie.

-Ne pas mettre plus de 6 disques par boite de 90mm(r pour ne pas avoir de
chevauchement entre les zones de diffusion.

-Incuber en étuver à 37°C pendant 16-24h.

4/Lecture et interprétation de l’antibiogramme :

-Après 16 à 18 heures d'incubation, examinez chaque

plaque.

-Si la plaque a été striée de manière satisfaisante et que la

concentration d'inoculum est correcte, les zones
d'inhibition résultantes seront uniformément circulaires et
il y aura une pelouse de croissance confluente.

- Si des colonies individuelles sont

apparentes, la concentration de l'inoculum
était trop légère et le test doit être répété.

-Mesuré sans enlever le couvercle de la boite à pétri

les diamètres des zones d'inhibition complète
(comme jugé à l'œil nu), y compris le diamètre du
disque au millimètre entier le plus proche, à l'aide
d'étriers coulissants ou d'une règle.

-Le diamètre des zones d’inhibition doit être comparées au tableau d’interprétation
des tailles des zones selon CLSI ou EUCAST et notées en fonction des catégories
suivantes : sensible (S), intermédiaire (I) et résistant (R) pour chaque antibiotique
testé.

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E-test :
C’est une technique rapide et simple en milieu gélosé qui permet une estimation
indirecte de la CMI grâce à l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient
exponentiel continu de l'antibiotique à tester (colistine).

Le principe :

-Ce test est basé sur l’association des caractéristiques des méthodes de diffusion et
de dilution en milieu solide.

-Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5

mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont
appliquées sur la surface d'un milieu gélosé
préalablement ensemencé avec un inoculum de la
souche à étudier.

-Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition

dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI.
-Une échelle de lecture imprimée sur la bandelette, permet une interprétation
rapide.

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