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Evaluation de l'activité antioxydant des composés phénoliques par la

réactivité avec le radical libre DPPH

Article · January 2009

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Cristina Popovici
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 Revue de génie industriel 2009, 4, 25-39
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Revue de
Génie Industriel
ISSN 1313-8871
[Link]

Evaluation de l’activité antioxydant des composés phénoliques par la

réactivité avec le radical libre DPPH
1 2* 2
Cristina Popovici , Ilonka Saykova , Bartek Tylkowski
1
Université technique de Moldova, Kisinew, Moldavie
2
Université de technologie chimique et de métallurgie, Sofia, Bulgarie

* Auteur correspondant: Ilona Saykova; Université de technologie chimique et de métallurgie, bul.

Kliment Ohridski 8, 1756 Sofia, Bulgarie ; e-mail : [Link]@[Link]

Révisé et accepté le 20 novembre 2009 / Disponible sur Internet le 20 décembre 2009

Résumé

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation des extraits des pépins de raisin en
tant qu’antioxydants. La méthode appliquée pour mesurer une activité antioxydant est
celle du piégeage des radicaux libres à l'aide du DPPH• Les facteurs qui influencent
la réactivité au radical libre DPPH• et les protocoles publiés ont été discutés. À des
fins comparatives sont testées des solutions modèles de composés appartenant à des
familles phénoliques distinctes (solutions d’acide gallique, d’épicatéhine, d’acide
tannique et de leurs mélanges). Les propriétés antioxydantes ont été mesurées et
mises en évidence par la concentration efficace CE50 et par la cinétique de réduction.
•
Les résultats indiquent une variation de CE50 de 30.8÷86.6 mg antioxydant/g DPPH
et des temps de réaction TCE50 entre 5 et 30 minutes, corrélés avec leur structure
chimique et la teneur en composés phénoliques.

Abstract

This works is inscribed in the frame of valorization of grape seeds extracts as

antioxidants. The method applied to measure the antioxidant activity was the free
radical scavenging by using DPPH•. The factors that influence DPPH• radical
reduction kinetics and the analytical protocols published are discussed. For
comparison purposes, model solutions of compounds of distinct phenolic families
(single solutions of gallic acid, epicatechin, tannic acid and their mixtures) were
tested. The antioxidant proprieties were measured and evidenced in terms of their
efficient concentration EC50, as well as their reduction kinetics. The results indicate a
variation of EC50 between 30.8÷86.6 mg antioxidant/g DPPH• and times of reaction
TEC50 from 5 to 30 minutes, in correlation with their chemical structure and the
content of phenolic compounds.

Mots-clés: antioxydant, polyphénols, DPPH, activité anti-radicalaire, cinétique de

réduction
Keywords: antioxidant, polyphenols, DPPH, radical scavenger, reduction kinetics

Introduction
Ces dernières années, l’intérêt porté aux antioxydants naturels, en relation avec leurs
propriétés thérapeutiques, a augmenté considérablement. Des recherches scientifiques

26
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dans diverses spécialités ont été développées pour l’extraction, l’identification et la

quantification de ces composés à partir de plusieurs substances naturelles à savoir, les
plantes médicinales et les produits agroalimentaires [1,2,3].
L’activité antioxydante d’un composé correspond à sa capacité à résister à l’oxydation.
Les antioxydants les plus connus sont le β-carotène (provitamine A), l’acide ascorbique
(vitamine C), le tocophérol (vitamine E) ainsi que les composés phénoliques. En effet, la
plupart des antioxydants de synthèse ou d’origine naturelle possèdent des groupes
hydroxyphénoliques dans leurs structures et les propriétés antioxydantes sont attribuées
en partie, à la capacité de ces composés naturels à piéger les radicaux libres tels que les
radicaux hydroxyles (OH•) et superoxydes (O2•) [4-7].
Plusieurs méthodes sont utilisées pour évaluer, in vitro et in vivo, l’activité antioxydante
par piégeage de radicaux différents, comme les peroxydes ROO• par les méthodes
ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) et TRAP (Total Radical-Trapping
Antioxidant Parameter) [8] ; les ions ferriques par la méthode FRAP (Ferric ion
Reducing Antioxidant Parameter) [9]; ou les radicaux ABTS• (sel d’ammonium de l’acide
2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique) [10], ainsi que la méthode utilisant le
radical libre DPPH• (diphényl-picrylhydrazyle) [11].
Compte tenu de la complexité des processus d’oxydation et la nature diversifiée des
antioxydants, avec des composants à la fois hydrophiles et hydrophobes, il n’y a pas une
méthode universelle par laquelle l’activité antioxydante peut être mesurée
quantitativement d’une façon bien précise. Le plus souvent il faut combiner les réponses
de tests différents et complémentaires pour avoir une indication sur la capacité
antioxydante de l’échantillon à tester [12,13,14].
De point de vue méthodologique, le test au radical libre DPPH• est recommandé pour
- - -
des composés contenant SH , NH et OH groupes [15]. Il s’effectue à température
ambiante, ceci permettant d’éliminer tout risque de dégradation thermique des
molécules thermolabiles. Le test est largement utilisé au niveau de l’évolution des
extraits hydrophiles en provenance de thé vert, des jus de fruits et de raisins, pépins et
pulpes, très riches en composés phénoliques [16-27].
Dans ce cadre, l’étude s’est intéressée à l’évaluation des activités antioxydantes
d’extraits de pépins de raisin en vue de leur valorisation en tant qu’antioxydants. Une
étude comparative a été réalisée à partir des protocoles analytiques publiés afin
d’évaluer l’effet des facteurs qui influent sur la méthode de mesure de la capacité anti-
radicalaire à l’aide du DPPH•. Comme exemple d’illustration les cinétiques de réduction
du DPPH• réagissant avec l’acide gallique, l’épicatéchine et l’acide tannique ont été
étudiées afin d’estimer la différence d’efficacité entre différentes familles de composés
phénoliques présents dans les pépins de raisins.
L’objectif de l’étude est de proposer une technique rapide et reproductible permetant de
comparer les extraits vis-à-vis de leur action sur les phénomènes du piégage des
radicaux libres. Cette classification permettra de choisir les conditions les plus
adéquates lors des différentes étapes de la valorisation de la matière première:
extraction, purification et concentration en fonction d’un critère de qualité optimal :
d’une part la teneur en composés phénoliques et parallèlement, leur activité anti-
radicalaire.

Principe de la methode
Réaction entre le radical libre DPPH• et l’antioxydant
Le composé chimique 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (α,α-diphényl-β-picrylhydrazylе) fut
l’un des premiers radicaux libres utilisé pour étudier la relation structure-activité
antioxydant des composés phénoliques [28,29]. Il possède un électron non apparié sur
un atome du pont d’azote (Fig.1). Du fait de cette délocalisation, les molécules du
radical ne forment pas des dimères, i.e. DPPH• reste dans sa forme monomère
relativement stable à température ordinaire. La délocalisation provoque aussi la couleur

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bleue bien caractéristique de la solution de DPPH•. La mesure de l’efficacité d’un

antioxydant se fait en mesurant la diminution de la coloration bleue, due à une
recombinaison des radicaux DPPH•, mesurable par spectrophotométrie à 515-518 nm.

Figure 1. Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-Picryl-Hydrazyle)

Le piégeage des radicaux libres par des antioxydants est tributaire de deux types de
mécanismes: (i) la libération de l’atome d’hydrogène du groupement hydroxyle
(cinétique rapide de certaines acides et dérivées phénoliques) ; (ii) la libération d’un
électron (cinétique lente des dérivées glycosylées et des anthocyanes) [3,18].
Dans le cas des composés phénoliques (Φ-OH), le mécanisme principal d’action est le
piégeage des radicaux libres par le transfert de l’atome H sur le DPPH• alors transformé
en une molécule stable DPPHH [30,31] :

DPPH•+ ΦOH → DPPHH + ΦO•

Plusieurs voies réactionnelles sont alors possibles qui forment des structures plus au
moins stables :
ΦO•+ ΦO• → ΦO-OΦ

DPPH•+ ΦO•→ ΦO-DPPH

- H•
ΦO• (semi-quinone) → Φ=O (quinone)

La capacité anti-radicalaire (capacité à fixer des radicaux libres, donc à arrêter la

propagation de la réaction en chaîne) ne peut être mesurée directement, mais par
contrôle de l’effet de la réactivité. Plusieurs facteurs influent sur le potentiel antioxydant
et la cinétique de réduction, notamment les conditions de la réaction (temps, rapport
Antioxydant/DPPH•, type de solvants, pH) et le profil phénolique en particulier [30].

Evaluation du potentiel anti-radicalaire

Pour l’évaluation de l’activité antioxydante, deux approches sont appliquées : d’une part,
la détermination de la réduction relative du radical DPPH•à un temps de référence ou la
détermination de la quantité d’antioxydant nécessaire pour réduire 50 % de DPPH• et
d’autre part, le suivi de la cinétique de la réduction [31,32].
Dans la première approche, l’activité est définie par l’indice de la réduction de l’activité
anti-radicalaire en pourcentage %RSA (Radical Scavenger Activity), où l’absorbance du
mélange réactionnel qui contient le radical libre et l’échantillon de l’antioxydant est
reliée avec l’absorbance du mélange sans aucun antioxydant (solution témoin ou
contrôle) à un temps t : [%RSA=(Abscontrôle – Abst)/ Abscontrôle x 100%].
Comme il n’existe pas de mesure absolue de la capacité antioxydante d’un composé, les
résultats sont souvent portés par rapport à un antioxydant de référence, comme l’acide
ascorbique (vitamine C), les antioxydants synthétiques BHT (butyl-hydroxy-toluène) ou
®
le Trolox (acide-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique), dont la
structure moléculaire cyclique est similaire à celle de la vitamine E [30].

28
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L’indice relative %RSA montre seulement la capacité de l’échantillon, à une

concentration fixée, de réduire ou non les radicaux et dans beaucoup de cas,
l’augmentation de la concentration de l’antioxydant amène l’augmentation de ces
indices relatifs [31].
Pour s’affranchir de l’influence de la concentration, dans la majorité des études, la
réactivité est estimée par la concentration effective CE50 (ou l’inverse 1/CE50) de
l’antioxydant, qui correspond à une réduction de 50% de l’activité (de l’absorbance) du
DPPH• dans le milieu réactionnel. La capacité antioxydante d'un composé est d'autant
plus élevée que sa CE50 est petite. L’indice CE50 montre les concentrations de
l’antioxydant qui sont nécessaires pour faire décroître la concentration initiale du
DPPH• avec 50% (exprimée en mol Antioxydant/mol DPPH• ou mg Antioxydant/g
DPPH•), mais ne prennent pas en considération l’influence de la concentration sur le
temps de la réaction [31].
Pour mieux caractériser le pouvoir anti-radicalaire, dans la deuxième approche des
paramètres cinétiques sont introduits, tels que le temps TEC50 nécessaire pour atteindre
l’équilibre à CE50, la constante de vitesse de la réaction ou le coefficient directeur de la
courbe cinétique [32,33,34]. L’estimation de TCE50 permet d’introduire la classification
suivante: TCE50 < 5 min (réaction rapide), 5÷30 min (réaction intermédiaire) et TCE50 >
30 min (réaction lente) [29,32]. L’indice de l’efficacité anti-radicalaire [EAR
=1/(CE50.TCE50)] relie la concentration du DPPH• et le temps TEC50 dans l’essai avec la
concentration effective CE50 de l’échantillon, et résulte dans un paramètre constant
pour chaque solution ou extrait.

Activités anti-radicalaires d’extraits de pépins de raisin (Vitis Vinifera L.)

Une étude comparative des protocoles analytiques publiés a été réalisée, focalisée sur
l’évaluation des extraits issus des pépins de raisin (Tableau 1). Il est à noter que les
pépins de raisin présentent de très fortes teneurs en composés phénoliques, qui peuvent
se regrouper de la sorte: (i) les composés non-flavonoïdes dont font partie les acides
phénoliques (ex. acide gallique) ; (ii) les flavonoïdes qui comprennent les flavonols, les
anthocyanes responsables de la couleur et les flavan-3-ols dont les molécules de
catéchine et de l’épicatéchine et leurs dérivées glycosylées sont très abondantes ; (iii)
les tannins condensés avec un degré de polymérisation faible, inférieur à 3
(procyanidines dimères et trimères et leurs esters galliques) [24].
Bien que l’extraction à partir des pépins de raisin soit extrêmement étudiée, il est
relativement difficile de comparer les données de la littérature (Tableau 1). En effet, il
existe une diversité des variétés, maturité, conditions climatiques et conditions de
stockage des raisin et de leur déchets, d’une part et une assez grande variation dans les
procédés d’extraction d’autre part : type de solvants (eau, éthanol, méthanol, acétone,
éthyle acétate), température (20-60°C) et temps d’extraction (de 5 minutes à 24 heures).
Les tests au DPPH• fournis dans la littérature sont basés sur le même principe que celui
décrit par Brand-Williams et al. [29], mais les protocoles analytiques diffèrent dans
plusieurs paramètres. Dans la méthode originale des solutions de DPPH• à 50-100 µM
(les absorbances à 515 nm autour de 1) et un temps de réaction de 30 minutes ont été
recommandés, et ces conditions sont utilisées dans plusieurs travaux récents
[14,23,25,38,39]. En même temps, des solutions de DPPH• variant de 25 à 600 µM
(faites le plus souvent avec du méthanol ou éthanol) et des temps de réaction plus courts
(5, 10 et 20 min) ou plus longs (60 min, 100 min et 120 min) sont également rapportés
[24,35-38].

Toutefois il est important de noter que l’utilisation de différents protocoles de mesure et

de différents indices d’évaluation de l’activité antioxydante réduit la fiabilité d’une
comparaison des valeurs.

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Tableau 1. Synthèse de l’étude bibliographique sur l’activité anti-radicalaire d’extraits de pépins de raisin
*
Conditions du test au DPPH• TCP Indice d’évaluation de Ref.
Conditions d’extraction l’activité anti-radicalaire

VAO /VDPPH• (25 µM dans MeOH) 6.71-7.04 % RSA=90.2-92.6% [35]

=1 ml/2 ml; t=5 min; λ=517 nm (Et[Link]u, 60°C, 8h) (des extraits de 25, 50 et
100 µg /ml)
VAO /VDPPH• (60 µM dans MeOH) 7.5-40.4 CE50=3.35-11.8 mg/ml [14]
=0.1ml/4 ml; t=30 min ; λ=517 nm (70%EtOH, 70%Ac,
MeOH, H2O, 45°C, 2h)
VAO /VDPPH• (120 µM dans MeOH) 50.3-87.1 CE50=1.74 -3.49 µg [24]
=0.1ml/3.9 ml; t=Teq; λ=515 nm (70% EtOH acidifiée, GAE/ml
Tamb, 4h)
VAO /VDPPH• (63 µM dans MeOH) 79.2-154.6 CE50=2.71-4.62 µg/ml [25]
=0.1ml/3.9 ml; t= Teq; λ=515 nm (Ac 70%, 50°C, 2h)
VAO /VDPPH• (500 µM dans EtOH) 12-20 (moyen de 9 CE50=22.9-32.90 µg /ml [36]
=0.2ml/3 ml; t=15 min; λ=517 nm variétés)
(EtOH, 50-90°C, 1-12 h)
VAO /VDPPH• (600 µM dans EtOH) 1.43-22.28 (9 variétés) CE50=0.24-0.92 µg GAE [37]
=0.025ml/0.975 ml; (EtOAc, Tamb, 5 min) /µg DPPH•
t=120 min; λ=515 nm
VAO /VDPPH• (63 µM dans MeOH) 171.45 (moyen de 24 CE50=0.66 µg /µg [38]
=0.025ml/0.975 ml variétés) DPPH•
t=120 min; λ=515 nm (H20, Tamb, 4 h)
VAO /VDPPH• (73 µM dans MeOH) 79.57-137.56 AAR=4.57-8.85 mM [23]
=0.025ml/0.975 ml (Et[Link]H20, Tamb, TRE/g MS
t=30 min; λ=515 nm 10min + macération)
VAO /VDPPH• (60 µM dans MeOH) 3.6-54.9 (moyen de 9 AAR=16.8 -92.2 mM [39]
=0.025ml/0.975 ml; variétés) TRE/g MS
t=30 min; λ=515 nm (MeOH acidifiée, Tamb,
12 h)
*Teneur en Composés Phénoliques, (mg Antioxydant/g matière sèche)

Partie expérimentale
Matériaux
À titre d’exemple nous avons évalué la capacité antioxydante de produits classiques,
représentatifs du profil phénolique des pépins de raisin [40]. Trois composés
-
phénoliques aux propriétés différentes sont testés: acide gallique AG (Mw=170.1 g mol
1 -1 -1
), épicatéchine EC (Mw=290.3 g mol ) et acide tannique AT (Mw=1700.1 g mol ).
L’acide gallique est présent dans les pépins de raisin sous sa forme libre et surtout
faisant partie d’une molécule phénolique (Fig.2). L’épicatéchine, un stéréo-isomère de la
catéchine, appartient à la classe des flavan-3-ols. Ils possèdent tous une même structure
de base à quinze atomes de carbone, constituée de deux cycles aromatiques (A et B) en
C6, reliés par un hétérocycle (C) en C3 (Fig. 2). Le deuxième cycle (B) se lie à
l’hétérocycle en position 2 ou 3. A l’état naturel, un ou plusieurs de leurs groupements
hydroxyles sont glycosylés. Ainsi, on retrouve les flavanols communs avec une
configuration -cis dans les positions 2,3 : épicatéchine, épigallocatéchine, épicatéchine
gallate, épigallocatéchine gallate, et avec une configuration -trans dans les positions
2,3 : catéchine, gallocatéchine, gallocatéchine gallate.
L’acide tannique est un mélange complexe de gallotanins qui sont des esters de l’acide
gallique ou/et de ses dimères d’acide digallique et d’acide ellagique avec des
monosaccharides, essentiellement la glucose. Il faut noter que la structure de l’acide

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tannique n’est pas bien établie et elle peut contenir un nombre différent de
groupements gallyol glycosylés. Néanmoins, une structure de base (C76H52O46) similaire
à sa masse molaire est présentée sur la Fig.2.

Acide gallique
(3,4,5-trihydroxybenzoique acide)

Epicatéchine
(-) cis-3,3',4',5,7-penta-
hydroxyflavane
Acide tannique (acide gallotannique)
Figure 2. Structure chimique des composés phénoliques testés.

Activité anti-radicalaire par le test au DPPH•

La solution de DPPH• à 63.4 µM (25 mg dans 100 ml de méthanol 90%) est préparée à
l’avance (au moins 1-2 heures) car la solubilisation est difficile, et elle ne se conserve
pas plus de 4-5 jours à -5°C et à l’obscurité. Chaque composé phénolique a été dissous
dans une solution de 70% éthanol-30% eau distillée. Des volumes de 0.1 ml de la
solution à tester ont été mélangés avec la solution du DPPH• (3.9 ml; absorbance de
0.68 ± 0.03 à 515 nm). Le mélange réactionnel est agité vigoureusement pendant 10
secondes. Le contenu est ensuite transféré dans un micro-tube de 4 ml et puis incubé
dans la cavité du spectrophotomètre pendant le temps nécessaire pour atteindre le
plateau avec ce type d’échantillon. A des intervalles de temps réguliers, les absorbances
à 515 nm ont été enregistrées (contre le méthanol) sur un spectrophotomètre UV-VIS
Bueco S-22.
Les écart-types ont été calculés à partir de trois séries d’expériences. Une erreur
moyenne de ±3% sur les concentrations restant à l’équilibre [DPPH•]eq a été obtenue.
Par contre, une incertitude de reproductibilité sur le temps à atteindre l’équilibre Teq et
les absorbances dans les premières secondes de la réaction a été détectée (dispersion
supérieure à ±10%)

Courbe d’étalonnage de la solution du DPPH•

Dans un premier temps, la stabilité et l’intervalle de linéarité des solutions du DPPH•
ont été évalués et les résultats sont présentés sur la Fig.3. Cinq solutions du DPPH•
faites dans du méthanol dans l’intervalle 3.37-63.4 µM (15-250 µg/ml) ont été testées.

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0,8
Abs= 0,0108[DPPH] - 0,0004
0,646
0,6
Absorbance, nm

0,4
0,321

0,2
0,159
0,08
0,042
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70

Concentration de la solution du DPPH, uM

Figure 3. La courbe de calibration du DPPH•.

Il n’y a pas de différence significative dans l’absorbance entre 0 et 90 min pour les
concentrations testées et une bonne linéarité concentration - absorbance a été observée.
Ce résultat est confirmé dans des études précédentes qui ont rapporté que l’absorbance
du DPPH• à 515 nm dans du méthanol a diminué avec 20% pour 120 min à 25°C et sous
l’action de la lumière, pourtant, à l’obscurité, il n’a pas été observé un changement
significatif pendant 150 min [41].

Résultats et discussion
Activité anti-radicalaire des composés phénoliques testés
La cinétique de réduction du DPPH• à différentes concentrations en antioxydant testé
est suivie au cours du temps jusqu’à l’obtention d’un plateau au temps final (Teq). La
réduction des radicaux libres est évaluée par le rapport relatif de la concentration
résiduelle [DPPH•]t=Teq restant en fin de cinétique par rapport à sa concentration
initiale :

[ DPPH • ]t =Teq
•
%( DPPH ) R = x100 (1)
[ DPPH • ]t =0
L’indice %(DPPH•)R diminue jusqu’à atteindre un plateau, cette cinétique variant selon
l’antioxydant utilisé (Tableau 2).

Tableau 2. Test d’activité anti-radicalaire au DPPH•

Concentration mg Antioxydant/ mol Antioxydant/ Teq %(DPPH•)R à
mg /ml g DPPH• mol DPPH• min l’équilibre

Acide 0.01875 20.44 0.0474 20 75.10

gallique 0.0375 40.93 0.0949 30 53.56
(AG) 0.0750 81.83 0.1897 30 10.63
0.150 158.53 0.3675 3 2.93
Epi- 0.03 20.32 0.0276 60 85.17
catéchine 0.06 40.63 0.0552 60 69.99
(EC) 0.1 108.37 0.1472 25 39.59
0.5 541.99 0.7362 5 8.11

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Acide 0.07 75.88 0.0176 30 76.09

tannique 0.13 140.55 0.0326 30 37.76
(AT) 0.19 205.22 0.0476 20 36.78
0.5 538.9 0.125 5 3.91

Les profils cinétiques obtenus révèlent une activité anti-radicalaire fortement

dépendante des rapports molaires Rm=[Antioxydant]/[DPPH•]. Plus le composé
antioxydant est concentré, plus la baisse de l’absorbance est importante. Les Figures 4
et 5 illustrent cet effet dans le cas de l’acide gallique pour la variation de la
concentration entre 0.01875÷0.15 mg/ml (rapports molaires Rm=0.0474÷0.3675 mol
AG/mol DPPH•).

100
0.3675 0.1897 0.0949 0.0474 mol AG/mol DPPH

80

60
%DPPH

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60

temps, min

Figure 4. Effet des rapports molaires Rm=[acide gallique]/[DPPH•] sur la cinétique de réduction.

Pour un Rm=0.3675 mol AG/mol DPPH• dans le mélange réactionnel, le radical est
presque totalement consommé. Le temps nécessaire pour atteindre l’équilibre Teq varie
en fonction des concentrations entre 3 minutes (réaction très rapide) et 10-30 minutes
(réactions intermédiaires). A partir de la courbe traçant la relation entre le pourcentage
de réduction %(DPPH•)R et la teneur en composé phénolique on en déduit par
interpolation graphique la concentration CE50 et le temps TCE50. La courbe est linéaire à
faibles concentrations et logarithmique à concentrations élevées (Fig.5). La
concentration efficace CE50 dans le cas de l’acide gallique est atteinte pour Rm=0.1 mol
AG/mol DPPH• (43.8 mg AG/g DPPH•).

En considérant le pouvoir anti-radicalaire (1/CE50) et le temps de la réaction TCE50 pour

atteindre 50% réduction, l’indice de l’efficacité anti-radicalaire EAR a été calculé [32] :
1
EAR =
CE50 (mg AO g −1 DPPH )TCE50 (2)

Les solutions testées ont été classées suivant la classification proposée par Sanchez-
-3
Moreno et all. [32] : l’activité anti-radicalaire est faible pour EAR<1.10 , intermédiaire
-3 -3 -3 -3 -3
entre 1.10 ÷5.10 , élevée entre 5.10 ÷10.10 , et très élevée pour EAR>10.10 .

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100

80

% (DPPH) residuel
60

40

20

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4

rapport molaire, mol acide gallique/mol DPPH

Figure 5. Détermination de la concentration efficace CE50 en cas de l’acide gallique.

Les paramètres caractéristiques de la cinétique de réduction du DPPH• pour les trois
composés testés sont présentés dans le Tableau 3. Parmi les trois composés, l’acide
gallique représente le composé le plus actif, le pouvoir antioxydant de l’épicatéchine
n’est pas significativement différent et l’acide tannique a donné les valeurs environ 5
fois plus faibles. On obtient ainsi l’ordre décroissant de l’activité antioxydante suivant
l’indice EAR : acide gallique > épicatéchine > acide tannique.

Tableau 3. Paramètres caractéristiques de la cinétique de réduction du DPPH•

CE50 CE50 TCE50 EAR (eq.2) Classification
-3
mg AO /ml mg AO/g DPPH• min x 10
AG 0.03 43.8±1.31 10 2.279 intermédiaire
EC 0.05 54.18±1.62 10 1.845 intermédiaire
AT 0.08 74.33±2.22 30 0.448 faible

Les résultats obtenus sont similaires à ceux obtenus par Sanchez-Moreno et son équipe
[32] : l’acide gallique s’est rélevé avoir une activité anti-radicalaire intermédiaire
-3
(CE50=26 mg AO/g DPPH•, TCE50=14.69 min et EAR=2.62 x 10 ) et l’acide tannique -
-3
une activité faible (CE50=59 mg AO/g DPPH•, TCE50=29.55 min et EAR=0.57 x 10 )
[32].Dans l’étude citée, c’est l’acide ascorbique qui a affiché une activité anti-radiculaire
très élevée du fait du temps de réaction très court (CE50=76 mg AO/g DPPH•,
-3
TCE50=1.15 min et EAR=11.44 x 10 ) [32].
L’étude confirme également une certaine corrélation entre la teneur en composés
phénoliques et l’activité anti-radicalaire, mise en évidence dans un grand nombre des
travaux [14,22,23,25,35,36]. Des études sur la relation entre la structure chimique des
composés phénoliques et leur pouvoir piégeur des radicaux libres ont montré que
l’activité anti-radicalaire est dépendante du nombre, de la position et de la nature des
substituants sur les cycles B et C (groupements hydroxyles, metaxylés, glycosylés) et le
degré de polymérisation [12,18,42,43].
Ces mêmes paramètres sont liés également à la polarité des composés. L’activité plus
élevée de l’acide gallique (groupement 3,4,5-tri-OH sur le cycle aromatique) peut être
attribuée à sa plus forte polarité (log P=0.06) par rapport aux flavaloïdes (log P=0.8)
[27,42].
L’épicatéchine, caractérisée par la présence du groupe 3-OH en combinaison avec la
double liaison C2-C3, est considérée également comme un antioxydant fort [43,44]. En
comparant la capacité à piéger les radicaux libres du DPPH• par les catéchines, Nanjo
et collaborateurs ont montré que la capacité de piégeage des catéchines ne dépend pas

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de leur stéréo-isomérie, mais les dérivés galloylés de catéchines sont des piégeurs plus
puissants que les non-galloylés dans l’ordre : gallocatéchine gallate > épigallocatéchine
gallate > épicatéchine gallate > épicatéchine = catéchine [12,18]. Il y a une information
contradictoire à propos du degré jusqu’au quel la polymérisation a un effet positif sur
l’activité anti-radicalaire. Des résultats comparatifs montrent que l’activité antioxydante
croît à un degré de polymérisation faible, inférieur à 3 (Oligomeric Polyphenols
Compounds OPC) [24].

Interaction entre les antioxydants des solutions modèles

Une série de tests a été effectuée pour évaluer les interactions possibles entre les
antioxydants. Différentes combinaisons de composés phénoliques AG:EC, AG:AT et
AG:EC:AT à des concentrations différentes ont été testées afin de couvrir la plage de la
réduction de DHHP•. Chacun de ces composés , en fonction de ses différentes
propriétés, contribue à l’activité antioxydante des extraits suite à des interactions plus
au moins complexes.

100
AG EC AT AG+EC AG+AT AG+EC+AT
80

60
%DPPH

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60

temps, min

Figure 6. Cinétique de réduction de [DPPH•] 63.4 µM avec l’acide gallique, l’épicatéhine, l’acide tannique et
leurs mélanges.
AG (0.1 mg/ml) ; EC (0.5 mg/ml) ; TA (0.5 mg/ml) ; AG:EC (0.1:0.5 mg/ml); AG:AT (0.1 : 0.5 mg/ml);
AG:EC:AT (0.1:0.5 :0.5 mg/ml).

Des profils très identiques sont observés à des concentrations élevées, quel que soit le
type de composés étudié : plateau atteint vers 6-8 %DPPH• pour 10 min maximum (Fig.
6). On peut conclure que l’activité antioxydante augmentera avec la teneur en composés
phénoliques, jusqu'à atteindre un plateau.

Par contre, il y a des différences significatives dans les cinétiques de réduction dans le
cas des solutions à plus faibles concentrations provoquant une réduction partielle de
DPPH• (Fig.7).

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100
AG EC AT AG+EC AG+AT AG+EC+AT
80

60
%DPPH

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60

temps, min

Figure 7. Effet de mélange des composés purs : acide gallique, épicatéchine et acide tannique
AG (0.05 mg/ml); EC (0.25 mg/ml), AT (0.05 mg/ml); AG:EC (0.05:0.25 mg/ml); AG:AT (0.05:0.05 mg/ml);
AG:EC:AT (0.05:0.25:0.05 mg/ml).

Les mélanges présentent une activité anti-oxydante nettement supérieure à celle des
composés purs EC ou AT, mais inférieure à l’AG. De même, l’instabilité de l’acide
tannique après 15 minutes est établie par une augmentation de l’absorbance, très
marquée en cas du mélange ternaire AG:EC:AT. Il existe donc des différences
qualitatives dans la nature de ces composés phénoliques, d’une part, et probablement,
des réactions de décomposion et d’interaction induisant un effet pro-oxydant
(antagoniste) à celui du piégeage des radicaux libres d’autre part.

Conclusions
Bien que le test au DPPH• soit considéré comme une méthode simple, rapide et facile à
mettre en œuvre, les expériences ont montré certaines difficultés de la mesure de l’état
de réduction: un phénomène dynamique à fable concentration (traces d’antioxydant en
ppm) et accompagné de nombreux composés formés, dans certains cas instables.
De plus, il existe une hétérogénéité structurale au sein des composés phénoliques,
hétérogénéité qui se traduit par des propriétés différentes. C’est pourquoi, en effectuant
des tests de mesure de la cinétique de l’activité anti-radicalaire, on peut générer une
évaluation plus globale des propriétés des échantillons étudiés. L’estimation simultanée
du pouvoir anti-radicalaire 1/CE50 et du temps de réaction TCE50 permettent d’estimer
d’une meilleure façon l’activité antioxydante par l’indice de l’efficacité anti-radicalaire.
Le test au DPPH• n’est pas quantitatif, il permet de comparer différents extraits entre
eux selon leur capacité à piéger le DPPH• et ainsi, d’apprécier les variations qualitatives
des composés phénoliques. . L’évaluation de l’activité anti-radicalaire doit être
interprétée avec précaution du fait que l’absorbance du DPPH• à 515-520 nm diminue
sous l’action de la lumière, de l’oxygène, en fonction du pH et le type du solvant
additionné à l’antioxydant.
La structure chimique et la polarité de l’antioxydant sont déterminantes pour sa
capacité à piéger les radicaux libres. Des effets synergiques mais aussi antagonistes ont
été observés dans des solutions modèles qui contiennent plusieurs composés
fonctionnels à activité anti-radicalaire. Néanmoins, ces observations sont basées sur une

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simple estimation des activités des composés purs, et des études plus poussées seraient
à mener avec des extraits réels.

Remerciements
Ce travail a été effectué grâce à l’appui financier de l’AUF dans le cadre du projet Pôle
d’excellence régional: Centre Interdisciplinaire de Formation et de Recherche "Sciences
et Techniques" (CIFR SciTech) et en coopération avec le Fonds «Science» à UTCM-
Sofia, dans le cadre du contrat 10163/09.

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