ISPITS RABAT

Filière : Techniques de Santé

Option : Laboratoire
Année Universitaire : 2021-2022

Examen cytobactériologique des

urines -ECBU-

DR F. EL MEHDAOUI
 Plan
• INTRODUCTION
• CONTEXTE CLINIQUE
• PRÉLÈVEMENT
• DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE
• EXAMEN MACROSCOPIQUE
• EXAMEN MICROSCOPIQUE: Etat frais
Etat fixé et coloration de Gram
• UROCULTURE
• EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE ET RESISTANCE
• INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE
• LES ESPÈCES MICROBIENNE QU’ON PEUT RENCONTRER
DANS L’INFECTION URINAIRE
• LES INFECTIONS URINAIRES
• CHOIX DE MILIEU DE CULTURE
• ENSEMENCEMENT ET ISOLEMENT
• ETUDES DES CARACTÈRES CULTURAUX
• COLORATION DE CONTRÔLE
• TEST DE DIFFERENCIATION
• LA GALERIE BIOCHIMIQUE
• ANTIBIOGRAMME
 Introduction

L'examen cytobactériologique des urines ou

ECBU est l’un des examens les plus prescrits.

Il permet de diagnostiquer une infection

urinaire et d’identifier le microorganisme
responsable afin de prescrire le traitement le
plus efficace.
 Examen cytobactériologique des urines : ECBU
CONTEXTE CLINIQUE: Circumstances de prescription
 Symptomatologie d’infections urinaires,
 Bilan pré-opératoire en Urologie,
 Examen systématique chez la femme enceinte,
 Contrôles post-thérapeutiques ( rares).
PRELEVEMENT - CONSERVATION - TRANSPORT ECHANTILLON
1- Objectif : Etape pré-analytique essentielle, prélèvement de
qualité pour une Biologie de qualité
 Eviter toute contamination par des bactéries de l’environnement fécal ou
périnéal.
 Eviter de laisser proliférer les bactéries contaminantes peu abondantes.
 Recueillir les urines vésicales (bactéries infectantes qui se sont multipliées donc
abondantes).
 2- En pratique: Prélèvement victime de son apparente
simplicité
 Nécessité d’une toilette intime soigneuse : ASEPSIE +++
Prélever les urines du matin, idéalement en milieu de jet (10 ml) ou
bien
par sondage si problème chez l’adulte, au moyen
d’une poche stérile chez le nourrisson (Urinocol®),
 à la seringue dans l’opercule des tubulures chez les patients
sondés par système clos.
Circonstances particulières: Urines du 1er jet si suspicion
infection urétrale ou prostatique et recherche de Mycoplasmes
et Chlamydia trachomatis.
 Les urines doivent séjourner dans la vessie au moins 3H avant le
prélèvement.
 Fermer hermétiquement le flacon, l'identifier très précisément et le
porter immédiatement au laboratoire accompagné de sa prescription
et de l’heure de prélèvement.
• Chez les sujets avec une sonde urinaire, le prélèvement pourra se faire
directement par ponction de la sonde qui sera au préalable désinfectée à
l'alcool iodé.
• Chez le nourrisson, le prélèvement se fait en laboratoire. Après une
toilette et une désinfection locale, une poche stérile adhésive adaptée à
son anatomie est maintenue autour de ses organes génitaux pendant
une demi-heure. Au-delà de ce délai, si l’enfant n’a pas uriné, il faudra
recommencer l’opération pour éviter une contamination par les selles.
 EXAMEN MACROSCOPIQUE
Aspect et couleur des urines
Couleur Interprétation
jaune ambrée état normal

Jaune très pale polyurie

Grisâtre L’urine contient de pus

rouge ou rose L’urine contient du sang

Brune hémoglobinurie

jaune canaris fluorescent avec Urine ictère

tendance au vert

urine a l’état normal urine rouge urine brun urine vert

 • Aspect:
Les urines troubles sont le plus souvent le témoin d'une infection
urinaire haute (pyélonéphrite) ou basse (cystite, prostatite).

Urine trouble à
l’émission

Urine neutre Urine très acide L’urine contient

ou alcaline et concentrée du pus

le trouble provient de la Du a la présence des

présence des nombreux
précipitation des urate et cristaux d'acide
globules blancs
phosphates urique
- Urine trouble après l’émission: Du a la présence de
bactérie qui se sont développées étant donné que l'urine
constitue un excellent milieu de culture dans ce cas l'urine
présente une odeur ammoniacale caractéristique due a la
fermentation
• Odeur:
L’urine à l’état normal n’a pas d’odeur désagréable
- Odeur ammoniacale dans le cas de fermentation
bactérienne
- Odeur de chaire purifiée lorsqu’elle contient de sang .
• pH:
l'urine a un pH qui va varier entre 5 et 6.
 EXAMEN MICROSCOPIQUE
Délai inférieur à 2h pour éviter toutes altérations des éléments cellulaires.
Apport des milieux avec borate de sodium: Conservation des urines à +4°C
possible.
Rôle du Laboratoire:
Cytologie des urines :
Présence de leucocytes (réaction de l’hôte), leucocyturie significative si > 104/ml.
Présence d’hématie: Hématurie
Présence d’éléments type cristaux (dépend état physico-chimique des urines lié à
l’alimentation et aux médicaments) ou cylindres (atteinte tubulaire)
Présence de bactéries, Bactériurie significative si > 105/ml.

La bandelette urinaire n’a qu’une valeur d’orientation, intérêt de la

valeur prédictive négative.
 Examen microscopique
1. Etat frais :
1.1 - Aspect quantitatif (nombre/ mm3):
A l'aide d'une cellule de Malassez on dénombre les globules blancs et
les globules rouges contenus dans un volume donné de l'urine à
étudier.
 Technique :
• Mélanger les urines par retournement du
tube pour avoir un échantillon homogène.
• Déposer une goutte entre lame et lamelle.
 Lecture :
• Examiner au microscope au faible
grossissement (x10), puis au grossissement
moyen (x40).
 Les globules rouges :
o A l'état normal le nombre de hématies est
inférieur à 1 000/ml (ou 1/mm3) ;
o En cas d'infection urinaire, le nombre
d’hématies augmente :
 plus de 10 000 hématies/ml (ou >10/mm3).
On parle alors d’hématurie.
Observation microscopique
 Les globules blancs : des GR dans les urines.

o A l'état normal le nombre des leucocytes est

inférieur à 10 000/ml (ou 10/mm3).
o En cas d'infection urinaire, le nombre des
leucocytes augmente :
 Plus de 10 000 leucocytes/ml soit > à
10/mm3). La leucocyturie traduit une réaction
inflammatoire suite à une infection urinaire.
Observation microscopique des
leucocytes dans les urines
1.2 - Aspect qualitatif (absence ou présence; nombre
/champ) :
On centrifuge l’urine et on étale une goutte du culot entre lame et
lamelle et on observe :
 Bactéries :
o La découverte de microbes n’a de valeur que si l’examen est
pratiqué juste après l’émission. Il est indiqué de faire un étalement
coloré au bleu de méthylène ou au Gram.
 Les cylindres :

o Les cylindres hyalins sont normaux, s’ils sont < 8 /µL.

o Les cylindres leucocytaires : traduisent une maladie infectieuse.
o Les cylindres granuleux s’observent dans toutes les pathologies rénales. Ils
sont normaux s’ils sont < 1 /µL
o Les cylindres hématiques : indiquent une probable atteinte des glomérules.
o Les cylindres graisseux sont retrouvés en cas de glomérulonéphrite.
 Les cristaux :
• Dans la majorité des cas, la présence de cristaux ne correspond pas à un
état pathologique, et, selon le pH de l'urine, on pourra mettre en évidence :
 Dans l'urine acide :
o Des urates (normaux en quantité modérée, leur nombre augmente au cours
de la goutte et chez les malades sous chimiothérapie.)
o Cristaux d'acide urique (Normaux en quantité modérée, leur nombre
augmente au cours de la goutte, où leur présence peut témoigner d'une
néphropathie.)
o Oxalates de calcium (Normaux en quantité modérée, leur nombre augmente
au cours de certaines maladies rénales chroniques)
 Dans l'urine alcaline :
o phosphates, carbonates de calcium, urates d'ammonium (normaux en
quantité modérée).
Mais les plus fréquents sont :

Acide urique urates amorphes

 Les cellules épithéliales :
o Elles sont en général de grande taille
avec des noyaux petits.
o Dans le cas normal < 3cellules /µL, au-delà
de cette valeur on suggère une possible affection
tubulaire. Observation microscopique des
cellules épithéliales

 Trichomonas vaginalis mobiles, œufs de bilharzies, levures et

filaments mycéliens, spermatozoïdes.
 Coloration de Gram
Premiers éléments d’orientation des bactéries observées (quantité, morphologie, mode de
regroupement, Gram positif ou négatif).

2- L’état fixé et la coloration de gram :

o Permet d'observer les différentes bactéries présentes et oriente le
choix des milieux de culture.
 Technique :
 Placer 15 ml d’urine dans un tube
 Centrifuger pendant 5 minutes à 1500 tours/minute
 Verser doucement le liquide surnageant
 Mélanger avec la pipette Pasteur le culot, et on dépose une goutte
dans la lame ,étaler , sécher, fixer , et colorer.
Les étapes de coloration de Gram
 Lecture de la coloration de Gram

o Après la coloration de gram on examine la lame au

microscope a l’objectif x100 pour différencier entre
les bactéries Gram positifs et les bactéries gram
négatifs dans un échantillon d’urine.
o Elle permet aussi de déterminer les différents types
de bactéries présents selon leur Gram (+ ou -), leur
forme ( Cocci, bacille, coccobacille …), et leur mode
de regroupement (isolé, diplocoques, en grain de
café, en chainette, en grappe de raisin …)
o Si on trouve :
 Des Bacilles Gram Négatifs (coloration rose) on suspecte alors soit :
La famille des entérobactéries :

La famille de Pseudomonas :
 Coccis gram positifs : (coloration violettes) on suspecte soit :

 Bacilles Gram Positifs : on suspecte

Listéria monocytogènes :
  Coloration de Ziehl Neelsen ou à
l’auramine :
o Si on a absence de germes +
une leucocyturie est supérieure
à 104/ml, il faut rechercher des
mycobactéries.
 Préparer un frottis à partir du culot
de centrifugation des urines et le
colorer par la coloration de Ziehl
Neelsen.
o Si on trouve des BAAR, il faut
procéder à une décontamination
Observation microscopique
des urines et ensemencement des des BAAR
milieux spécifiques: MGIT,
Loewenstein Jensen et Colestos.
 UROCULTURE
Importance capitale de la méthologie
 Quantifier la bactériurie et identifier la bactérie infectante après incubation à
37°C pendant 24 h.

Dénombrement des unités formant colonies (UFC) par ml.

Apprécier la bactériurie entre 103-105/ml sur le milieu ensemencé.
Si suspicion de bactérie à croissance difficile, ajouter un milieu riche type
gélose au sang(GS).
Si recherche inhabituelle, dialogue clinico-biologique indispensable: Recherche
de Gonocoques, Chlamydiae, Ureaplasma, anaérobies ou Mycobacterium
tuberculosis.
 EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE ET RESISTANCE

% Infections communautaires Infections nosocomiales

Escherichia coli 85 50

Proteus et groupe KES* 10 25

Staphylococcus sp. 3 5

Streptococcus sp. 2 7

Pseudomonas aeruginosa - 10-20

* Klebsiella-Enterobacter-Serratia
 INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE

[Link]ésentation des résultats:

Doivent être précis et comporter La nature du prélèvement.

Le mode de prélèvement la cytologie :
Hématurie et Leucocyturie
Présence éventuelle de cellules épithéliales (témoin contamination vaginale chez
la femme)
Présence éventuelle de cristaux ou de cylindres
La culture et l’identification :
Numération en culture de la bactérie identifiée (DGU), Identification bactérienne
et Antibiogramme Standard
NB Commentaires éventuels notamment si mesures d’hygiène et bactéries multi-
résistantes.
Interprétation fonction du contexte Clinique
Bactériurie < 103/ml :

sans signes cliniques exclut une infection urinaire à germes

banals.

Bactériurie > 105/ml : Infection urinaire probable (critères de Kass)

et Colonisation.
Bactériurie 103-105/ml : véritables infections urinaires si cystite de
la jeune femme, si prostatite, si malade sondé, si bactérie qui
s’agglutine ou bien si infection à Staphylococcus saprophyticus.
 INTERPRETER LES RESULTATS DU LABORATOIRE EN FONCTION DE LA
REACTION LEUCOCYTAIRE ET NOMBRE DE GERME

GERMES < 10 3 ET LEUCOCYTES < 104 PAS DE COLINISATION

GERMES > 10 3 ET LEUCOCYTES < 104 CONTAMINATION
PLYMICROBIENNE

GERMES < 10 3 ET LEUCOCYTES > 104 (Leucocytes dans le sang):

 BK, Bilharziose
 Tumeur, Calculs, Opération
 ATB
 NTIC(Néphropathie chronique)
GERMES > 10 3 ET LEUCOCYTES > 104 COLINISATION OU

INFECTION (monomicrobienne)
Les espèces microbienne qu’on peut rencontrer dans
l’infection urinaire:

Bactérie gram positif Bactéries gram négatif

Staphylocoque Escherichia coli

Corynebacterium urealyticum klebsiella

mycobactéries Proteus mirabilis

Streptocoque B et D Serratia

Pseudomonas

Enterobacter

On peut rencontrer le parasite Trichomonas et les levures.

 Les infections urinaires
• La cystite infectieuse, quand on retrouve la bactérie
Escherichia coli dans les urines . touche presque uniquement
les femmes.
• L’urétrite infectieuse : Il s’agit souvent d’infections
sexuellement transmissibles sexuellement (IST) courante chez
les hommes. Les plus communs sont la chlamydia et le
gonocoque (la bactérie responsable de la gonorrhée).
• Une pyélonéphrite est une infection du rein par une bactérie.
La plus fréquente parmi elles Escherichia coli (70 à 80 % des
cas)
• Le Proteus mirabilis est souvent en cause dans les infections
des voies urinaires, des brûlures lors des mictions, des envies
fréquentes d’uriner, une urine trouble et parfois malodorante, si
l’infection concerne la vessie (cystite) ou l’urètre (urétrite) ;
 Le choix des milieux de culture :
 Milieux non chromogènes :
o Milieux ordinaires:
o Milieux sélectifs :
 Le choix des milieux sélectifs est en fonction de l’observation
microscopique de la coloration de gram.
 Si présence de BGN :
 Si présence de CGP :
 Si Présence des BGP :
o on suspecte Listéria monocytogéne et on ensemence la gélose
PALCAM Listeria pour différencier entre Listeria monocytogenes et les
autres Listeria sp.
o Composants du milieu :
 Agents nutritifs :
o Peptone: 23,0 g/l
o Chlorure de sodium : 5,0 g/l
o Mannitol : 10,0 g/l
o Fer-III-citrate : 0,5 g/l
o Esculine : 0,8 g/l
o Glucose : 0,5 g/l
 Agents inhibiteurs :
o Chlorure de lithium : 15,0 g/l
o Ceftazidime : 10,0 mg dans 500 ml
 Indicateur coloré :
o Rouge de phénol : 0,08 g/l
o Réactions :
o la différenciation est basée sur :
 L’hydrolyse de l'esculine : Toutes les Listeria spp. Hydrolysent
l’esculine, (présence d’un noircissement). Le produit de l'hydrolyse,
l'esculetine lié aux ions ferriques en formant un noircissement.
 La fermentation du mannitol : un changement de coloration du
milieu, du rouge au jaune (acidification du milieu) à l’aide du rouge
phénol (indicateur coloré) qui permet de différencier des
microorganismes présents dans l’échantillon (staphylocoques,
entérocoques…) autres que Listeria et qui fermentent le mannitol.
 Les levures :
o Parfois on peut noter la présence
des levures dans les urines : il faut utiliser
un milieu Sabouraud sélectif pour les levures.

 Milieux chromogènes :
o Les milieux chromogènes consacrés pour la mise en évidence d'activités
enzymatiques par l'apparition d'une coloration spécifique à chaque espèce
bactérienne.
Ensemencement et isolement :
Incubation à 37°C pendant
24H
 LECTURE DES CULTURES
COLONIES OBTENUES APRES L’ENSEMENCEMENT DES MILIEUX DE
CULTURE
 Les milieux non chromogènes :
 Pour les milieux ordinaires : on étudie la dégradation ou non du lactose par la
bactérie.
 Pour les milieux sélectifs :
 Pour les BGN :
  Pour les CGP :

noter bien que streptocoque D est non hémolytique ( hémolyse gamma).


 Pour les BGP :
- Listéria monocytogéne : la gélose PALCAM Listeria
-Présence de Listeria monocytogène :
• Couleur gris-vert des colonies + la présence
d'une auréole ou halo noir (à confirmer par une
identification biochimique/sérologique)
-Présence d’autres microorganismes fermentant
le mannitol :
• Couleur jaune des colonies + la présence
d'un halo jaune.
 Pour les levures :
On observe des colonies blanchâtres
sur le milieu Sabouraud
 Les milieux chromogènes :
 Pour les BGN :

 Pour les CGP : :  Pour les BGP :

 Listéria monocytogène



 Les levures :
 Coloration de contrôle

 Le but de cette méthode est de confirmer la présence des

espèces des bactérie qui sont à Gram positif ou à Gram négatif
pour éviter toute sorte d’erreurs, soit:

• A partir des boîtes de pétri

ensemencées lors de la séance
précédente.
• A partir d’une suspension bactérienne
ou bouillon de culture.

 La coloration de contrôle en deux

étapes :
- Réalisation du frottis .
- Technique de coloration .
 Réalisation du frottis

1. Stériliser l’oese 2. Dépôt sur la lame

4. Sécher et fixer le frottis 3. Réaliser le frottis par mouvement circulaire

Test de différenciation
 Catalase:
La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation du peroxyde
d’hydrogène (H2O2) selon la réaction :

Technique:
Bulles d’oxygène, la bactérie possède la catalase Catalase +
Pas de bulle, la bactérie ne possède pas la catalase Catalase –

• les bactéries des genres Staphylococcus, Listeria, Corynebacterium et

Micrococcus (catalase +) ;
• des bactéries des genres Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus,
Leuconostoc (catalase -).
 Oxydase
• Le test consiste à mettre en évidence une enzyme : la phénylène diamine
oxydase que possède la bactérie pour oxyder un réactif incolore (la NN-
diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé.

Technique:
 Positive Négative

- Présence d’une teinte rose, violette oxydase +

- Si la colonie reste incolore oxydase –

• Principaux bacilles oxydase positive : Pseudomonas

• Principaux bacilles oxydase négative : la famille des Entérobactéries,
Acinetobacter.
 La galerie biochimique
• Pour l’étude des caractères biochimiques des bactéries ( métabolisme glucidique
,protidique et énergétique), on ensemence une galerie d'identification :
 soit en tubes (macro-galerie)

 soit en système miniaturisé (micro-galerie)

 ou
Colonies isolés

Ensemencements des milieux de

la galerie biochimique :

Mannitol- Citrate de
Kligler-Hajna Urée Indole MRVP esculine
Mobilité-Nitrate Simmons
 Kligler-Hajna
Généralement pour les entérobactéries :[Link] , Klebsiella, Proteus…et aussi
pour les pseudomonas.

Ensemencer à l’aide d’une

pipette Pasteur fermée:
• la pente par stries serrées
• le culot par piqûre centrale

Incuber 24 heures à 37°C

 Le test d’ONPG :

Le test ONPG permet de recherche directement la présence d’une

β-galactosidase en fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme
Une bactérie lactose (-) peut avoir l’absence de :

• une β-galactoside-perméase
• une β-galactosidase

incuber 30 min à 37°C

 Urée indole:
• Un milieu urée indole est un milieu permettant l'identification de germes,
particulièrement des entérobactéries, par la recherche de 3 activités
enzymatique:

Recherche de l'uréase Recherche de la Recherche de la TDA

tryptophanase(indole)

Ajout de réactif Ajout de chlorure

de Kovacs de fer III

Urée - urée + indole+ indole -

 Mannitol-Mobilité-Nitrate

• Le milieu Mannitol-Mobilité-Nitrate est utilisé pour l’identification des

entérobactéries basée sur la fermentation du mannitol, la mobilité et
sur la réduction des nitrates en nitrites.

Mannitol : Mobilité :
Nitrate réductase :
 MRVP:
• Mise en évidence des voies fermentaires des entérobactéries :
o Réaction de vosges-proskauer(VP) : explore la voie de fermentation
butandiolique de la bactérie .
o Réaction ou rouge de méthyle (RM) : explore la voie de fermentation
lactique.
 Citrate de Simmons
• Le citrate de Simmons est un milieu de culture utilisant le citrate
comme seule source de carbone.
• Seules les bactéries possédant une citrate perméase seront
capables de se développer sur ce milieu.

Généralement pour les entérobactéries et

Pseudomonas :
Citarte - : [Link]
Citrate +: Enterobacter, Citrobacter, Serratia
Si le milieu :

 Reste vert citrate –

 Bleu citrate +
 bactérie [Link] Klebsiella Proteus Serratia
caractère

Lactose + + - -

glucose + + + +

gaz + + + +

H2S - - +/- -

urée - + + -

indole + +/- +/- -

TDA - - + -

citrate - + +/- +

MR + + + +/-

VP - + - +

Mobilité + - + +
 Identification des staphylocoques

1. La coagulase :
2. DNase :
• La mise en évidence pour un Staphylocoque sur milieu Dnase.

Par bleu de toluidine par HCL

 Identification des streptocoques :

- Gélose au sang.

- test a la bacitracine

- test a l’optochine

- Le sérotypage a une
importance capitale
dans le classement
des Streptococcus, la
plupart des antigènes
recherchés sont des
antigènes de paroi.
 La galerie API :

• C’est une galerie de 10

microtubes prêts à l’emploi
contenant un susbtrat
déshydraté, permettant de
réaliser 10 tests biochimiques
afin d’identifier des bacilles à
Gram (–) appartenant à la
famille des
ENTEROBACTERIACEAE
 Antibiogramme :

• Le milieu de culture est MULLER

HINTON pour toutes les bactéries sauf
les streptocoques et les gonocoque
(on utilise le gélose au sang) .

antibiogramme de Proteus
 Cas particuliers dans ECBU :
• LA PRÉSENCE D’UNE LEUCOCYTURIE SANS GERME
IDENTIFIÉ
• Dans ce cas, on soupçonne :Le patient a déjà reçu un
traitement antibiotique. On parle alors d’une d’infection
urinaire "décapitée".
• Dans ces cas précis, le délai de culture sera prolongé de 24
heures avant de conclure à l’absence de germe.
• Les urines ont pu être contaminées par des leucocytes du
vagin, en cas de vaginite lors d’un problème lors du recueil
des urines.
• Ces résultats peuvent traduire chez l’homme une prostatite
(inflammation de la prostate), une urétrite (inflammation de
l’urètre) ou une posthite (inflammation du prépuce).
Fréquence globale des germes isolés
 Conclusion
• L'ECBU est un examen simple et peu
coûteux Il peut donner une première
indication dés le 1er jour
• Les bactéries les plus fréquemment
rencontrées sont des entérobactéries
([Link] +++).
• l'infection urinaire est très fréquente
généralement peu grave... sauf chez
certains patients à risque