‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

UNIVERSITÉ DE SETIF
Département Sciences des Matériaux

(HPLC)
« La chromatographie liquide haute
performance»

Réalisé Par :

 MIHOUBI Dhiab.

Année universitaire 2021/2022

Introduction:

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est un processus de séparation

des composants dans un mélange liquide. Un échantillon liquide est injecté dans un flux de
solvant (phase mobile) circulant dans une colonne garnie d'un milieu de séparation (phase
stationnaire). Les composants de l'échantillon se séparent les uns des autres par un processus
de migration différentielle lorsqu'ils s'écoulent dans la colonne.

Figure 01 : La chromatographie liquide haute performance (HPLC).

I- L’objectif de TP:
Cette manipulation a pour objectif de nous initier à :

 Comprendre les principaux mécanismes de la séparation chromatographique,

 Comprendre pratiquement comment améliorer la séparation en chromatographie

liquide,

 Identifier les constituants principaux d’un appareil de chromatographie liquide, y

compris leurs caractéristiques importantes.

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 II- L’HPLC (ou chromatographie en phase liquide haute
performance ou haute pression):
L’HPLC (ou chromatographie en phase liquide haute performance ou haute pression)
est une technique d’analyse séparative, basée sur une migration progressive des composés
dans une colonne supportant les hautes pressions.

Les interactions servant à retenir et éluer les composés vont se jouer entre :

• Le composé : C

• La phase mobile : PM

• La phase stationnaire : PS

Il existe différents modes possibles en HPLC. Le mode de séparation choisi dépend

des propriétés des molécules à séparer.

Les différents types de chromatographie communément utilisés sont :.

II- 1. Chromatographie de partage:

En chromatographie de partage, les composés sont partagés entre la phase mobile et
une couche de solvant organique qui imprègne les greffons de la phase stationnaire. Selon
le type de partage, les interactions principales mises en jeu sont basées soit sur
l’hydrophobicité, soit sur l’hydrosolubilité.

La chromatographie de partage repose sur le principe de « like dissolves like » qui

signifie que des composés et des solvants de même nature auront de fortes affinités.

• Si le composé est hydrophile, alors la phase stationnaire sera hydrophile et la phase

mobile hydrophobe ⇒ Partage dit en phase normale,

• Si le composé est hydrophobe, alors la phase stationnaire sera hydrophobe et la

phase mobile hydrophile ⇒ Partage dit en phase inverse.

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 En fonction de la composition de la phase mobile, le partage des composés se fera
soit en faveur de la phase stationnaire (rétention des composés) soit de la phase mobile
(élution des composés). Les composés ayant le moins d’affinités avec la phase
stationnaire seront élués les premiers.

II- 2. Chromatographie ionique:

La chromatographie ionique permet de séparer les composés ionisés. Il existe deux
types de chromatographie ionique :

1) Rétention des anions : La phase stationnaire est composé d’un groupement

cationique et la phase mobile est anionique,
2) Rétention des cations : La phase stationnaire est composé de groupement
anionique et la phase mobile est cationique.

C’est toujours le contre-ion associé à la phase stationnaire qui est échangé avec les
composés ionisés à séparer (voir figure).

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 II- 3. Chromatographie d’exclusion stérique:
La chromatographie d’exclusion stérique, également appelée chromatographie
d’exclusion de taille, permet de séparer les composés en fonction de leur taille moléculaire
à partir de particules de gel d’exclusion.

• Les petites molécules pourront pénétrer à l’intérieur des pores des particules de gel,
et seront ainsi fortement retenues dans la colonne

• Les grosses molécules ne pourront pas du tout pénétrer dans les pores : elles seront
exclues et migreront donc rapidement avec la phase mobile.

II- 4. Chromatographie d’adsorption:

En chromatographie d’adsorption, les composés d’intérêt vont pouvoir s’adsorber sur
la surface de la phase stationnaire. Les interactions mises en jeu dans ce cas sont
majoritairement des interactions électrostatiques (liaison hydrogène, interactions de van
der Waals, π-π).

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 Le schéma simplifié ci-dessous vous permettra d’appréhender le mode d’HPLC le
mieux adapté à la séparation des composés selon leurs propriétés.

La qualité d’une séparation chromatographique peut être évaluée grâce à différents

paramètres chromatographiques que vous retrouverez dans le tiroir « Paramètres
chromatographiques ».

III- Les paramètres chromatographiques:

III- 1. Le Temps de Rétention (TR):
Le temps de rétention est le temps nécessaire à un composé pour éluer de la colonne
et être détecté. Conventionnellement, le temps de rétention est déterminé au sommet du pic
chromatographique qui correspond généralement à la moitié de l’élution du composé.

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 III- 2. Le Facteur de Rétention (k):
L'énoncé de la loi de Beer-Lambert peut être écrit comme suit : lorsqu'un faisceau de
lumière monochromatique est incident sur une solution qui contient une substance qui
absorbe la lumière monochromatique, la vitesse à laquelle l'intensité du faisceau diminue
le long de l'épaisseur de la solution est directement proportionnelle à la concentration de la
substance absorbante dans la solution et est également directement proportionnelle à
l'intensité du rayonnement monochromatique incident.

Selon la loi de Beer-Lambert, plus le nombre de molécules absorbantes (qui ont la capacité
d'absorber la lumière d'une longueur d'onde spécifique) est élevé, plus le degré
d'absorption du rayonnement est important.

IV- Le spectrophotomètre à UV visible:

Le facteur de rétention k (anciennement appelé facteur de capacité et noté k’) permet
d’appréhender la capacité de la colonne à retenir le composé dans les conditions d’élution
paramétrées. Pour déterminer le facteur de rétention, il faut pouvoir connaitre le temps
mort* (tm) et le temps de rétention du composé concerné (trx). Le facteur de rétention se
détermine avec la formule suivante :

où

tri : temps de rétention du composé i

tm : temps mort de la colonne

Si

k ≤ 1 : l’élution est trop rapide

1 k ≥ 5 L’élution est trop lente

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 *Temps mort (tm) : le temps mort est le temps minimum, après injection, nécessaire
à un composé pour traverser la colonne et être analysé. Pour déterminer le temps mort de
la colonne, il faut utiliser un composé qui n’est pas retenu par la colonne et qui éluera avec
la phase mobile sans interaction avec la phase stationnaire.

III- 3. Efficacité de la colonne ou nombre de plateaux (n)

L’efficacité d’une colonne se détermine généralement par le nombre de plateaux
théorique que la colonne aura vis-à-vis du composé considéré. Le nombre de plateaux
théorique correspond au nombre de fois qu’un composé sera échangé entre la phase mobile
et la phase stationnaire. Ainsi le passage d’un composé de la phase mobile vers la phase
stationnaire puis le retour vers la phase mobile représente un plateau.

Le nombre de plateaux théorique peut se déterminer avec la formule suivante :

Où
tri : temps de rétention du pic i

Ii : largeur à la base du pic i

Plus le nombre de plateaux est élevé et plus l’efficacité de la colonne est importante
et plus le pic du composé sera fin.

III- 4. La Résolution :
La résolution RS d'une colonne est la mesure quantitative de son aptitude à séparer
deux analytes A et B. Elle se calcule avec la formule suivante :

Où :

tr1 : temps de rétention du pic 1 (ou2)

I1 : largeur à la base du pic 1 (ou2)

La résolution ne se calcule qu’entre deux pics adjacents - plus la résolution sera

élevée et plus la séparation des deux pics sera bonne.

Une résolution supérieure à 1 voire supérieure à 1,5 est nécessaire pour avoir
une bonne intégration des pics et donc un bon calcul de l’aire du pic.

Rs ≤ 0,75 Mauvaise séparation

Rs ≈ 1 Séparation incomplète

Rs ≥ 1,5 Séparation complète

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 IV- Les appareils HPLC:
IV- 1. La phase mobile :
En HPLC, la composition de la phase mobile est primordiale pour favoriser les
interactions avec la colonne ou au contraire favoriser l’élution des composés.

La majorité des appareils d’HPLC La majeure partie des appareils HPLC sont
composés de différents modules jouant tous un rôle dans la séparation et l’analyse des
composés d’intérêt.

Les pompes en HPLC jouent un rôle majeur. Elles permettent la circulation de la

phase mobile dans l’ensemble du système. Ce sont également elles qui vont contrôler la
composition de la phase mobile à travers plusieurs modes de fonctionnement. Peuvent soit
maintenir la composition de la phase mobile durant toute l’analyse : mode isocratique,
soit faire évoluer la composition de la phase mobile au cours de l’analyse : mode
gradient.

En chromatographie de partage en phase inverse (qui est la plus utilisée), les solvants
utilisés sont souvent une phase aqueuse (appelée solvant A) et une phase organique
(appelée solvant B).

La rétention et la séparation des composés en HPLC dépend du couple phase

stationnaire (la colonne) et phase mobile (le mélange de solvants). Le mode de

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chromatographie le plus utilisé actuellement est la chromatographie de partage dit en phase
inverse (phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire).

La phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie de partage dit en phase

inverse est composé de silice greffée C18 qui offre de nombreux avantages, mais possède
aussi des limites.

LE COMPARTIMENT À COLONNE THERMOSTATÉ

Bien que cela puisse paraître anecdotique, posséder un compartiment thermostaté pour
la colonne chromatographique joue un rôle important dans la rétention ou l’élution des
composés.

En effet, une variation de température dans la colonne pourra modifier le temps de

rétention des composés et perturber leur analyse.

E. Choix du solvant :

Le choix du solvant se fera en fonction des interactions soluté solvant. En général

ces interactions sont dues à des forces de Van der Waals (interactions dipôle-dipôle ou
électrostatiques…) et aux liaisons hydrogène qui vont définir les paramètres de solubilité
des composés dans la phase mobile.

On classe donc les solvants par leur polarité, et la modification de la polarité. Parmi
les solvants utilisés on a l’hexane (ou les hycdrocarbures saturés (pentane, cyclohexane…)
pour les solvants les moins polaires et l’eau pour les solvants le plus polaire. Entre les
deux, on a toute une série de composés qui peuvent être utilisés.

Pour modifier la polarité de la phase mobile, on peut réaliser des mélanges de

solvants (à condition que ceux-ci soient miscibles) Le réservoir de solvant Les appareils
sont équipés d’un ou plusieurs réservoirs en verre ou parfois en acier inoxydable de
contenance d’environ 1 litre, ce qui permet de réaliser un nombre important d’analyses
sans interruption.

Ces réservoirs sont souvent étanches afin d’éviter l’évaporation des solvants (et ainsi
la modification de la composition du mélange) ou leur contamination.

Ils peuvent être équipés de dispositifs de dégazage (barbotage d’hélium ou mise sous
vide) permettant d’éliminer les gaz dissous et en particulier l’oxygène.

L’oxygène est souvent nuisible à l’analyse chromatographique :

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 • il augmente le risque de dégradation des échantillons et abrège la durée de vie des
colonnes car les phases stationnaires sont facilement oxydables.
• il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le détecteur ce qui
conduit à un bruit de fond important et rend l’analyse impossible.
• il diminue le seuil de détection lors d’une analyse par spectroscopie d’absorption à
faible longueur d’onde, par fluorimétrie ou par électrochimie.
• il contribue à la corrosion des pièces en contact avec la phase mobile. La corrosion
augmentant avec la pression, les pistons et les joints des pompes sont souvent en
saphir, agate, Téflon ou en alliages spéciaux.

Il est donc préférable de dégazer les solvants soit par ultrasons soit par barbotage d’hélium
soit par filtration avant d’introduire les solvants dans leur réservoir.

IV- 2. La phase mobile :

Détecteur est nécessaire pour voir les bandes de composés séparées lorsqu'elles
éluent de la colonne haute pression. Les informations sont envoyées du détecteur à un
ordinateur qui génère le chromatogramme. La phase mobile sort du détecteur et est soit
envoyée vers un déchet, soit collectée, au choix.

De nombreux détecteurs peuvent être utilisés en HPLC. Toutefois, trois détecteurs

sont aujourd’hui majoritairement utilisés pour la détection de la chromatographie liquide :

Le détecteur UV à barrette de diodes

Le détecteur UV à barrette de diodes est un spectromètre qui va mesurer

l’absorbance de l’échantillon à des longueurs d’onde généralement comprises entre 190 et
400 nm (Ultra-Violet).

Cette absorption se fait grâce aux groupements chromophores qui ont la capacité
d’absorber l’énergie du rayonnement ultraviolet.

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 Le principe de la détection de fluorescence se base sur la propriété que possèdent
certaines molécules organiques de pouvoir émettre un rayonnement lumineux après
excitation par un rayonnement ultra-violet ou proche visible. Un exemple commun de
fluorescence se retrouve dans les vêtements réagissant à la lumière noire que l’on peut
trouver en boîte de nuit.

En fluorescence, la longueur d’onde du rayonnement émis par la molécule (appelée

longueur d’onde d’émission ou λem) est différente et toujours plus élevée que la longueur
d’onde du rayonnement d’excitation (appelée longueur d’onde d’excitation ou λex).

Ainsi, l’analyse se fera à l’aide d’un couple λex/λem qui est bien plus sélectif que la
longueur d’onde d’absorption UV. Cette méthode permet donc des analyses plus
spécifiques et bien plus sensibles qu’avec un détecteur UV (lorsque les molécules
fluorescent, ce qui n’est pas le cas de toutes les molécules absorbant en UV).

Le spectromètre de masse Contrairement aux autres détecteurs de spectrométrie, le

spectromètre de masse (souvent noté MS pour mass spectrometer) n’analyse pas les
analytes en fonction de leur propriété vis-à-vis de la lumière, mais par rapport à leur masse
moléculaire.

Pour cela, la spectrométrie de masse a besoin de générer des ions qui seront ensuite
analysés selon le rapport entre la masse moléculaire (exprimé en Dalton ou Da) et la
charge de l’ion généré. Ce rapport s’écrit conventionnellement m/z.

Tout spectromètre de masse se compose de trois compartiments visibles sur le

schéma ci-dessous (plus de description en cliquant sur le module)

IV- 3. la colonne:
La rétention et la séparation des composés en HPLC dépend du couple phase
stationnaire (la colonne) et phase mobile (le mélange de solvants). Le mode de
chromatographie le plus utilisé actuellement est la chromatographie de partage dit en phase
inverse (phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire).

La phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie de partage dit en phase

inverse est composé de silice greffée C18 qui offre de nombreux avantages, mais possède
aussi des limites.

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LE COMPARTIMENT À COLONNE THERMOSTATÉ

Bien que cela puisse paraître anecdotique, posséder un compartiment thermostaté

pour la colonne chromatographique joue un rôle important dans la rétention ou l’élution
des composés.

En effet, une variation de température dans la colonne pourra modifier le temps de

rétention des composés et perturber leur analyse.

IV- 4. la colonne:
L’injection est une étape importante dans la chromatographie. Comme son nom
l’indique, l’objectif est d’injecter l’échantillon à analyser dans le système d’HPLC.

De manière générale, deux systèmes d’injection vont être disponibles, soit une
injection manuelle, soit une injection automatique.

En HPLC, que l’injection soit manuelle ou automatique, l’injection se fait avec une
boucle d’injection qui doit être remplie puis sera injectée dans le système. Le
volume de la boucle d’injection joue un rôle majeur dans le volume d’échantillon
injecté. De manière générale les boucles d’injection vont de 1 à 100 µL.

INJECTION AUTOMATIQUE OU MANUELLE ?

L’injection automatique en HPLC revêt de nombreux avantages et limites:

+ Programmation d’une séquence (plusieurs injections successives sans intervention

du manipulateur)

+ Possibilité de programmation de dilution ou dérivatisation automatique

- Demande une rigueur organisationnelle lors de la préparation de la séquence

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 - Conservation des échantillons lors de longues séquences (nécessite un compartiment
réfrigéré)

L’injection manuelle, comme son nom l’indique, implique une manipulation de

l’utilisateur pour pouvoir injecter l’échantillon dans la boucle, souvent à l’aide
d’une seringue, puis basculer la vanne en mode injection (voir plus bas). Il existe
deux façons pour basculer la vanne :

1. Si la vanne est manuelle, le basculement se fait en pivotant la vanne de la position

« chargement » à la position « injection » (voir plus bas). ATTENTION : dans ce
cas, il faut faire attention à ce que le basculement de la vanne corresponde avec le
temps 0 d’analyse en l’activant sur le logiciel de l’appareil

2. Si la vanne est électronique (électrovanne), alors le basculement est automatique et

piloté par le logiciel de l’appareil qui calibre le début de l’injection.

V- Le Principe de TP:
Principe de la chromatographie

Principe de la chromatographie La chromatographie est une méthode de séparation

des constituants d'un mélange même très complexe. Il existe trois principaux types de
chromatographie: • la chromatographie en phase gazeuse (CPG) • la chromatographie en
phase liquide à haute performance (HPLC) • la chromatographie en couche mince (CCM).
Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des théories
communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé
colonne.

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 Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être
recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne
est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée
de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la
phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les
solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène
appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins
vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi
élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet

d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal
constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque
soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic. Dans des conditions
chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé
est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude
de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base
permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté.

VI- Inconvénients et avantages d une HPLC:

 HPLC et similaires Techniques Comme les autres formes de Chromatographie, HPLC
permet la séparation des constituants chimiques grâce à l utilisation d une phase mobile
et une phase stationnaire. La phase mobile est liquide et la phase solide est stationnaire,
et en raison des différents composants se déplacent à des vitesses différentes se séparent
destination. D'autres techniques comprennent l'électrophorèse capillaire, dans lequel des
substances dans des solutions migrent à travers un champ électrique, et d'autres

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 méthodes chromatographiques telles que l'extraction en phase solide (SPE),
chromatographie en phase gazeuse (GC) et chromatographie sur couche mince (CCM).

 Rapidité, efficacité et précision Comparativement à d'autres techniques de

Chromatographie, telles que TLC, HPLC est extrêmement rapide et efficace. Il utilise
une pompe, plutôt que de la gravité, pour forcer un solvant liquide à travers un matériau
adsorbant solide, avec différents composants chimiques à séparer qui se déplacent à des
vitesses différentes. Le processus peut être complété en environ 10 à 30 minutes, et il
offre une haute résolution. Il est précis et hautement reproductible. Parce que c’est en
grande partie automatisé, HPLC pistes de base peuvent être effectuées avec un
minimum de formation.

 Coût et la complexité Malgré ses avantages, HPLC peut être coûteux, nécessitant de
grandes quantités de matières organiques coûteux. Des techniques telles que SPE et
l'électrophorèse capillaire peut être moins cher et même plus rapidement, en particulier
pour l'analyse en vertu de bonnes pratiques de fabrication (BPF). Aussi, même se il est
relativement facile d'utiliser des méthodes HPLC existantes, il peut être complexe pour
résoudre les problèmes ou pour développer de nouvelles méthodes. C’est en grande
partie en raison de l'éventail de différents modules, des colonnes et des phases mobiles.

 La sensibilité et la résolution En général, la CLHP est polyvalent et extrêmement

précise en ce qui concerne l'identification et la quantification des composants
chimiques. Il existe un grand nombre d étapes, et la précision de HPLC est en grande
partie vers le procédé étant automatisé et donc hautement reproductible. Cependant,
HPLC n’ont une faible sensibilité pour certains composés, et certains ne peut pas être
détecté comme ils sont irréversiblement adsorbées. Les substances volatiles sont mieux
séparées par GC. Le domaine d’application :

Le domaine d’application de la technique HPLC est très vaste :

 Industries chimiques et para chimiques

 Agro –alimentaires

 Environnement

 Pharmacie

 Biochimie

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Il y aussi d’autres applications récente :

 Contrôle de la pureté optique des molécules thérapeutiques

 Analyses des résidus et des traces dans le domaine environnemental

 Suivi des concentrations composes cytotoxiques (chimiothérapie anticancéreuse)

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I- Préparation des solutions:

 On a mesuré 0.025mg de 3-hydroxyacetophenone

 Mettre dans fiole 100 ml qui contient un petit volume de

 méthanol.

 on est versé le méthanol jusqu’à trois quart de volume de la fiole et on est agité pour

solubiliser le 3-hydroxyacetophenone.

 Après, on est versé le méthanol.

 On a obtenu une solution mère . Les mêmes étapes pour préparation d’une solution

mère de 4hydroxyacetophenone.

 Le Logiciel :

a) Après quelques min d’allumer l’appareil, sur l’ordinateur clique 2 fois sur l’icône du
logiciel Lc solution pour enter de dans

b) Login on

c) Logiciel ouvrire conecter

d) Cliquer sur Analysis 1 Ok ` le logiciel se connecte à la chaine HPLC (2 bips se fait

entendre ) ‘LC Ready’doit apparaître

e) File new méthode

f) Pressur ( Pump A et B ) : Max : 20 Mpa ; Min : 0.0 Mpa

g) Détecteur A fluoresçant ): longueur d'onde d'excitation : 360 nm ; longueur d'onde

d’émission : 450nm

h) Détecteur B : longueur d'onde : 253 nm Download

i) Nommer le fichier : OK Data créer un dossier M1 chimie pharmaceutique

ouvrire analyse de 3-hydroxyacetophenone enregistrer

j) Chaque fois on fait une modification on clique sur Download

k) LC Times prong : LC stop Time 15 min ( temps d'analyse ) Dowload

l) Mode : binary gradient : Total flow : 1ml/ min ; pompe B conc : 30 ; Dowload OK

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m) Sauvegarder la méthode : File saveur méthode file saveur as dowload Ok

n) Pour l'injection : clique sur SINGLE START dans la barre verticale d'assistance ; une
fenêtre apparaît : Simple stat sample name méthode file : C/labsolutions / Ok
(puis on inject)

o) Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n'est pas à 0 : faire une auto 0 , en appuyant sur
le bouton 0 de détecteur

p) Cliquer sur data analysis une fenêtre apparaît , clique sur program

q) Retier les pics parasites se trouvent généralement dans la ligne de base (clic sur
intégration Off/On) Cliaue sur simulate Ok

r) l'analyse sera commencée puis on attend 15 min.

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I- Résultat et discussion:1
D’après les pics des spectres, on a

 tr de caféine est 5 min,

 tr de 3-hydroxyacétophénone est 7 min .

tr (3-hydro) tr (caféine)

donc la caféine est mieux retenue que 3-Hydroxyacétophénone.

II- Discussion:
L'idéal est d'obtenir une résolution élevée en un temps très court.

 On peut envisager d'augmenter la longueur de la colonne (la vitesse

d'analyse va augmenter ainsi que la perte de charger.
 On peut diminuer le diamètre des particules (HEPT diminue, mais la perte de
charge augmente On peut augmenter la vitesse de la phase mobile (HEPT
augmente, la pression.

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 Conclusion :
L'HPLC est donc une technique d'analyse à la fois qualitative et quantitative, très
utilisée en chimie analytique puisqu'elle permet une étude précise et complète d'une espèce
chimique.

Références bibliographiques pour approfondir

Le cours M1 : spectroscopie et chromatographie Dr. Zaidi

[Link]

[Link]

[Link]

[Link]

[Link]

[Link]

27