TE;CHNIQU&;S D bXIPKuCTIOH ET DE DOSAGE;

-\I-

+$ -)(.
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% *

t
. -
 - 2 -
Les matières grasses végétales - essentiellement'constituées
par des triglycerides simples et mixtes - sont extraites, 8. partir
des tissus, par des solvants appropries.
Dans le C ~ d'une S étude sur le métabolisme d'une plante et les
mécanismes de lipogenèse et de ligolyse, il est impossible de se
contenter des rGsul-tats obtenus par p e d e de l'extrait total apres
épuisement par un solvant. kn effet,'cet extrait, non seulement
risque de ne pas contenir la totalité des glycérides des tissus
traite's,mais il renferme en outre d'autres substances n'ayant que
peu.ou pas de rapports avec les glyc&rides, surtout quand il s'agit
d'organes chlorophylliens. Les erreurs peuvent ê%re enormes dans
certains cas (jusqu'à 9Oy0 de la matière grasse engage'e). Pour cet
ordre de recherches il faut utiliser des méthodes plus complexes
et plus selectives qu'une extraction simple par solvant: saponifi-
cation de l'extrait alcoolique;'separation et dosage des acides gras
totaux, libres, ou combines à l'etat de glycérides; se'paration et
dosage de l'insaponifiablesdes matibres grasses (alcools gras su-
pe'rieurs; s t é r o l s ; alcools triterp6niques; vitamines liposolubles:
A , D,,E;, K ; caroténoEdes; autres hydrocarbures; etc.) On complete
ces dosages par ceux des stGrols, 6valués à part (complexés avec
la digi-tonine); du phosphore lipidique des phosphoaminolipides,
etc. Quelques indications bibliographiques concernant ces techni-
ques applicables 8. de vraies recherches de physiologie ou de chimie
végétale figurent ci-dessous (re'f. Il] [2J et ).
On n'envisagera ici que le cas d'organes non chlorophylliens
très riches en lipides, c'est 8. dire l'estimation de la teneur
globale en matières grasses des gr'aines ol6agineuses ou'des fruits
oléagineux, forme pratique sous laquelle pourra se poser l e plus
souvent le problème du dosage des lipides pour des g6neticiens.
Dans ce cas, le dosage par pese'e de l'extrait total apres épuise-
ment par un solvant est valable.
On peut utiliser divers solvants: &her, ether de pétrole,
trichloréthylène t6trachlorure de carbone , etc. On peut opérer
p a r percolation à froid (cette niéthode peut presenter un .interet
dans le cas d'une matiere grasse particulièrement oxydable). O n '

opere le plus gen6ralement par extraction à chaud au Soxhlet OU au

Kumagawa. On emploiera ici cette m6thode sous sa forme classique,
utilise'e couramment pour ce genre de travail et admise dans les
normes officielles d'analyse des matières grasses (ref, f4] et b] ).
 - 3 -
Cette me'thode - sûre e t précise dans l e domaine oÙ e l l e e s t
~ applicable - e s t longue, assez d i f f i c i l e B appliquer en s é r i e , e t
exige un m a t é r i e l coateux e t d é l i c a t . I1 y a des cas (dosages sur
l e s graines o u l e s f r u i t s & c o l t é s dans l e s champs d'expérience
pour l e t r i des v a r i é t g s l e s plus i n t e r e s s a n t e s , e t c . ) ou des mé-
thodes de dosage p r a t i c a b l e s en s e r i e avec w e approximation suf-
f i s a n t e peuvent rendre d ' u t i l e s s e r v i c e s (ref. [6] e t 573 ):

Prkparation de l i e c h a n t i l l o n
Eliminer, p a r un -triage à l a main, l e s f r u i t s a v a r i é s , l e s
graines b r i s e e s , les matiëres Btrangères. Mélanger avec s o i n l'e'chan-
t i l l o n i n i t i a l dont on dispose, a f i n de l'homogénkiser, ? r e l e v e r ,
p a r reductions successives, un l o t moyen de 100 fruits'sur l e q u e l
on déterminera l a valeur du r a p p o r t arain,e Si
I graine t enveloppe
l ' é c h a n t i l l o n i n i t i a l e s t t r o p important, prélever de l a meme ma-
n i è r e w? é c h a n t i l l o n r 6 d u i t (Pour l ' a r a c h i d e , opérer sur 500g,
environ de graines d-cortiqu6es). Décortiquer. Broyer dans un
broyeur approprié, de façon à o b t e n i r , en p l u s i e u r s s t a d e s , l a
mouture l a plus f i n e possible compatible avec des conditions ne
provoquant n i p e r t e d ' h u i l e , n i per& s e n s i b l e d 1 h w n i d i t 6 ( l ' o p & -
r a t i o n d o i t e t r e f a i t e sans &chauffement).
Dosage de 1 1 h w n i d i t 6
Aussitôt après l e broyage, p l a c e r une p r i s e de 59. environ
de graines broyées dans une b o f t e à t a r e séchee e t pesée, Nettre
8. l ' e t u v e à ?00-105°pendant 3 heures, l a i s s e r r e f r o i d i r dans un
dessicateur e t peser. Remettre l l & t u v eune heure. Laisser r e f r o i -
d i r e t peser Bans l e s memes conditions. S i n & c e s s a i r e , recoamencer
llop6rakion jusqu'à p o i d s constant.
P o i d s i n i t i a l prise-Poids p r i s e séche'e x loo= p eau d e s , g r a i n e s
Poids i n i t i a l p r i s e dee ortiqu6 e s ,

Dosage de l ' h u i l e
AussitBt aprBs l a f i n du broyage, peser 10 g, environ d e
graines broye'es, B l a balance de precision, P l a c e r im6diatemen-b

* * a
 - 4 -
la prise d'essai dans la cartouche de l'appareil d'extraction (pour
Qviter les variations d'h izidité ou l'oxydation de la prise d'essai)
bkbi icLt *canL*Jc', &zL GLEcr&ìLlL 3-Lct & c o d o & & *
Les extracteurs continus sont recoimandés. Le meilleur solvant
serait un solvant carbure d'hydrogène pur: pentane ou héxane normal.
Actuellement le commerce ne le fournit pas couramment. Utiliser
donc de l'éther de petrole distillant entre 40 et 6 O o C et ayant
un indice de brorne inférieur B 1.
i

La suite des opérations telle qu'elle est décrite ici s'en-

tend pour un extracteur de Soxhlet de faible capacité (dimensions
du ballon extracteur pour la pesée), Si l'on dispose d ' u n appareil-
lage différent, les niatières grasses extraites ne peuvent ê-tre
pes6es directement dans le ballon extracteur. I1 fau% les -brans-
vaser pour la distillation (appareil de Kumagawa), ou pour la
pesée finale. I1 est gvident qu'on évite des risques d'erreur en
évitant les transvasements,
Le ballon devant recueillir les produitSIdel'extraction
H
est préalablement &ch6 et pesé 8. la balance de précision, prati-
quer l'extraction pendant 4 heures. bortir alors la carhouche de
l'appareil et la placer dans un courant d'air afin que la majeure
partie du dissolvant qui imprègne la farine de graines soit expul-
sée. (Dans le cas d'huiles siccatives ou semi-siccatives qui ris-
quent de s'oxyder à l'air, il vaut mieux opérer dans un courant
de gaz inerte,)
Vider la cartouche. Triturer aussi finement que possible la
farine dans un mortier,,aprks addition d'un peu de sable siliceux
firì. Placer 8. nouveau la farine ainsi trituree dans la cartouche,
puis dans le meme extracteur, en utilisant le ballon fi. Extraire
pendant deux heures.
Dans des conditions identiques, triturer 8. nouveau la farine
et procéder à une troisième extraction d'une durée de deux heures,
le produit de l'extraction étant recueilli à part dans un ballon B
pr6alablemen-t &ché et taré.
De chacun des deux ballons A et B, chasser par distillation
sur bain-marie bouillant, ia majeure partie du dissolvant,
Eliminel: les dernières traces en chauffant .( A l'etuve p a r
exemple) 8. une température voisine d e l u O ° C et n'excedant pas
1 0 5 O C (il peut etre efficace aussi, 2 la fin de la distillation,
de plonger brusquement le ballon jusqu'au col dans l'eau bouillante,
...
 - 5 -
pendant quelques instants) Faciliter l'expulsion, soit en insuf-
flant par instants de l'air (ou un gaz inerte), soit en soumettant
le ballon au vide, Le chauffage ne doit pas etre prolongé plus d e
20 minutes. Laisser refroidir dans *undessicateur et peser. Renou-
veler l'operation dans les mêmes conditions, jusqu'à ce que deux
pesées successives ne diffèrent pas de plus de 10 mg,
Si la masse de l'huile contenue dans le ballon B n'est p a s
sup6rieure à IO mg. , on peut considerer 1'operation comme terminé'e.
Si la masse.de l'huile contenue dans le 'ballonB est superieure
à 10 mg, recommencer le cycle des opérafions: nouvelles extractions
pr6c6dées de nouveaux broyages, jusqu'à obtention d'une masse
d huile nouvelle au plus égale à 1 O mg.

Vérifier que l'huile extraite est bien limpide.'

Déterminer la masse' de l'huile extraite en tenant compte de'la
dernière pesee. La masse d'huile ,contenue dans la prise d'essai
est la some des masses des huiles recueillies dans les ballons A
et B.
( Lorsque le dosage de l'huile est effectué SUT un materiel trks
humide, souaettre la cartouche remplie, avant de la placer dans
l'extracteur, 8. un séchage par'tiél r8menm-b le taux d'humidite &
I' O@ environ),

Pour obtenir des données'sur la composi-kiion et le degr6 de

puret6 d'une matihre grasse et, dans certains cas, p o u r l'identifier,
on procède B l'e'tude de ses propriét6s physiqueset chimiques,
Les methodes physiques d'examen pour l'analyse des corps gras
s'attachent surtout 8. la détermination de la densité, du point
de fusion, des points de solidification et de congélation; 8.
l'indice de r6fraction;.à la solubili%& et B la température critique
de 'dissolution;à la viscosité; etc...
Les me'thodes chimiques d'examen, à côté de l'étude approfondie a

des constituants de la matière grasse, comportent la détermination

de certains "indicesf9, dont la valeur dépend de la nature et des
proportions des différents constituants.
 - 6 -
Les methodes d'examen physique ne seront pas abordees ici. Bt
seules seront décrites les techniques de deterraination de trois d e s ,
principaux indices, P o u r les méthodes d'étu.de des caractères phy-
siques, les définitions et les techniques relatives auxi autres in-
dices, se reporter au chap. III du Tome III du Traité pratique de
chimie végétale de Brunel et aux publications relatives aux m6thodes'
c47
normalisges ( r e f , et t5-j >. .

Détermination de l'acidité et de l'indice d'acide.

(Réference: kFflOH - NF - T - 60 - 204 )

La determination de l'aciditi:des c o r p s gras renseigne sur leur

degré' d'hydrolyse. Les matières grasses fraîches ne;contiennent que
trhs peu d'acides gras libres. L'aciditG est une variable qui depend
essentiellement des conditions de conservation et d'extraction.
Il y a deux manières d'exprimer la teneur d'une matière grasse
en acides gras libres: l'acidite et l'indice d'acide,
Ces deux caracteristiques d'une meme propriété sont mesur6es
de la meme façon. Seuls les rksultats du dosage sont exprim6s dif-
féremment. Dans tous les cas, ces déterminations se font sur la ma-
%ihre grasse sechge et purifiée.
Cependant, pour les produits contenant des acides gras volatils,
on détermine l'acidité sur le produit tel quel, en precisant, 8.
part, le degre d'hmidit6 et en rapportat l'acidit6 au produit sec,
Bn présence d'acides mingraux librea ou combines, on peut @tre'
conduit 8. faire des déterminations spéciales.
D6finitions. L'acidité est le pourcentage d'acides gras l i b r e s expri-
mé conventionnellement, selon la nature des corps gras,
en acide oléique, palmitique ou laurique.
L'indice d'acide est le nombre de milligrammes de potasse caus-
tique KOH nkcessaire pour neutraliser ltacidit6libre de un gramme
de matibe grasse séchie et purifige.
Principe. Titrer l'acidit6 de produit dissous par une solution alca-
line alcoolique en presence de phénol-phtaléine,
Réactifs. Pielange 8. parties &gales d'alcool e'thylique à 95O et
d'oxyde d'gthyle, neutralis6 8. ll'aide d'une liqueur al-
caline dkcinormale (quelques gouttes devront suffire). Ou, à défaut,
 I

- 7 -
alcool ethylique 8. 9T0 neutralis&. bans le cas des substances à
haut point de fusion, il pourra etre bon de remplacer l'alcool
gthylique pdr l'alcool butylique]
- Solution alcaline alcoolique (got2sse ou soude) ii/2 (ou iV/lO
dans le cas d'une faible acidit&).
-.Phenolphtaldine en solution 8. I$dans l'alcool.

Mode opératoire. Pre'lever 10 g. environ de la matihre grasse St ti-

trer, d6cantde et filtrée sur papier. Les dissou-
dre dans 100cc. du m6lange alcool-oxyde d'hthyle (ou 1OOcc alcool).
Agiter et prockder au titrage avec la solution alcaline alcoo-
lique, en prLsence de ph&olphtaldïhe, à la temperature ordinaire.
La coloration rouge doit subsister quelques secondes apres
l'addition des demihres gouttes de rdactifs.
3 Xxpression d e s rGsu1t.;Lts.L'acidite peut etre exprimde convention-
nellement, selon la nature des huiles, en
acides oleique, palmitique ou laurique, d'après le tableau de cor-
rgspondance suivant:
Poids moleculaire de l'acide olkique: 262
I1 II I!
palmitique: 256
II II 11 II
laurique: 200
Soient u la masse en grambs de la prise dtessai,
n le volume de liqueur alcaline neceasaire 8. la neutralisa-
tion et exprim4 en cc. de liqueur norffiale;
Les diff6rentes expressions de l'acidits seront données par les
formules:
*(oliique) = n x 0,282-x 100
lìì

'(palmitique) = n x 0,256 x I00

m (concerne particulièrement l'huile
de palme)
A (laurique) = El x 0,200 x 100
m (concerne particulierement les huiles
de coprah, de palmiste e t de laurier)

,
 I

- 8 -

(Dans le. cas oÙ le resultat fait mention du terme "acidit6"sans

indication du mode d'expression, il s'agit toujours, par convention,
de l'acidite" exprim6e en acide algique).
L ' indice d'acide est donne' avec une approximation suffisan-bepar
la formule:
n x 56#
m
&ant donne' que le poids moleculaire de la potasse caustique e s t
56,ll.
(Il se trouve que l'indice d'acide est le double du nombre exprimant
l'acidite, quand celle-ci est exprim6e en acide oléique),
Précision des résultats_. La pr6cision des r6sultats est de l'ordre
de O,O% avec une solutLon alcaline alcoo-
lique iT/-lO et de l'ordre de 0 , 2 0 avec une solution 17' ou B/2,

-.----
Piesure de l'Indice d e Saponification
(R6fe'rence:hFBOR - ïW - T - 60 - 206)
L'indice de sa2onification est une constante des huiles et des
graisses, mais il ne permet p a s leur identification, la plupart ayant
un indice compris entre 190 et 2 0 0 , I

I1 est d'autant plus &leve' que les' glycérides sont formes

d'acides gras de faible poids mol&culaire. I1 de'pend de la teneur
en insaponifuable, en acides gras libres et de la proportion de
mono-, di- et tri-glycerides. I1 permet, lorsque la matière grasse
renferme uniquement des triglycérides, de determiner la teneur
p o u r cent en acides gras totaux,
1

De'finition et PrinciiE. L'indice de saponification e s t le nombre

de milligrammes de potasse causti'que KOH
nécessaires pour transformer en savon les acides gras et les glyc6-
rides d'un gramme de corps gras,
&éactifs, +$ Solution d acide chlorhydrique R/2
- Solution B/2 de potasse dans ltalcoo1éthylique h Y 5 G
exempt d'aldéhyde, Cette solution est décan-tee apres repos et conser-
ve'e dans un flacon en verre brun ou jaune convenablement bouché,
-.. Ph6nolphtaléine en solution à 1% dans l'alcool,
 Diode op6ratoire. Peser au milligram", dans un erlen ou dans un
ballon 8. fond plat taré, deux grarmss de matières
grasses (dont on a élida& l'eau et les irn&xre-ks).
Ajouter 25 ce, exac-bement Desure's, d e potasse alcoolique i!/2
et porter à lfébullitionsous Un rifrigkrant 8. reflux. Ajouter dans
l'erlen ou le ballon un regulateur dt6bullition(billes de v e m e ,
etc.) haintenir lfébu1lition,pendantune heure en agitant d e temps
en temps (prolonger 1'6bullition dans le cas des corps B haut point
de fusion), Titrer l'excès dcalcali dans la solution savonneuse
chaude avec H C l li/2 en psGsence de phénolphtal6ine.
(Faire un essai B blanc dans les mêmes conditions pour titrer la
liqueur alcoolique de potasse).
Bxpression des r6sultats. Soient la masse en grames de la prise
d essai,
'
C le nombre de ce. dC1 utilises
dans l'essai à blanc,
C2 le nombre de cc. i l C l utilises
dans l'essai avec matières grasses.
L'indice de saponification est donne' par la formule:
(C., - C), x 28

( 1 cc HCL N/2 -4 28 mg KOH)

(On l'exprime sans dtcimales)
Precision de la methode. Ji& raison de 1Iinfluence de la duree
d'ébullition, elle est de l'ordre de 2 B
3 unités.
kesure de l'Indice dLIode
L'indice d'iode exprime le degré d'insaturation du c o r p s gras.
Sa valeur a pernis de classer grossièrement les hÙiles en 3
grandes categories:
- huiles siccatives (indice d'iode compris entre 150 et 190)
-- demi-siccatives( . )? 150)
It
11 100
''
f f

f f

non- 91
ffi ( If ff 11
75 '' I O U )
hn principe, il suffit p o u r le déterainer de faire agir un
halogène en solution sur une matiere grasse, elle-même en solution
b 8 .

,
 - 10 -
dans un solvant indiffe'rent.
Cependant l'iode seul réagit trop lentement et l'on eïnploie
gene'ralement des combinaisons haloge'nees de l'iode (chlorure ou
bromure d'iode) pour accélérer la réaction tout en évitan% les
réactions de substitution.
Différentes methodes ont e'te proposges; elles diffèrent essen-
tiellement par la nature de la solution halogénante, Les trois prin-
cipales sont;
- La méthode de Hübl: qui utilise une solution d'iode et de chlorure
lvercurique dans l'alcool.
- I' 'I It Hanus:qui utilise une solution de monobromure d'iode
dans l'acide acetique.
- 1' !I Nijs :qui utilise une solution de monochlorure d'iode
dans l'acide acétique,
Les deux dernières &thodes donnent des r6sultats pratiquement
identiques, tandis que la première donne generalement des résultats
trop faibles. lin outre, le réactif de Hübl n'est pas absolument
stable.
DQfinition. L'indice d'iode est le nombre de grammes d'iode,fixe'
sur les doubles liaisons de I O 0 grarmes de corps gras.
I1 est habituellement d,esigne'par 1.1,
lvléthode de Hanus.
(He'ference: Brunel, 'ï'raitépratique de Zhimie Vegetale,
%IV! 2 . 2 6 2 ) .
Principe. On fait agir une solution halog6nante sur le produit prka-
lablement dissous dans du tgtrachlorure de carbone (ou
du chloroforme). On ajoute de l'iodure de potassium et on titre en
retour avec une solution de thiosulfate de sodium.
La solution halogenante est une solution de monobromure d'iode
dans l'acide ac6tique.
KBactifs. - Chloroforme ou tétrachlorure de carbone,
- &$actifde Hanus (log. de monobromure d'iode dans 500cc
d'acide acétique cristallisable, pur et exempt d'alcool -
se conserve en flacon bouche &eri, jaune de préf6rence)
 - 1 1 - .
- Iodure de potassium pur (exempt d'iode libre et ditiodate)
en solution à I O p ,
2 3-- 2 -
- S O Na IO
!hode operatoire. Dans une fiole conique bien sèche de 2 0 0 c c , bou-
chant à l'emeri, introduire une prise d'essai
convenable de la substance (le poids de la prise d'essai est ddter-
miné par l'indice d'iode de la substance, on prend de preference . '
32g./I.I,) exacten:ent pesée et 1Occ. de chloroforme ou de t8tra-
chlorure de carbone, Agiter le mélange jusqu'à dissolution complhte
et ajouter 25cc, exactement mesur6s de rkactìf, Boucher, agiter et
abandonner le mélange 1 heure ,à l'obscurit6, Puis ajouter 2Occ d'une
solution 8. I O ~ Od'iodure de potassiurn, 1OOcc environ d'eau distillde
et titrbr 1,'iodelibre au moyen d'une solution de S203Na2 H/lO.,
Bffectuer un essai 8. blanc dans les memes conditions.
2 3 2 .
Calculs. Soient n le nombre de cc de X O Na N / l O utilise pour
l'essai à blanc 2 3 2 -
n' le nombre de cc de S O Ba & / I 0 utilise' pour
la prise d'essai -
p le poids de cette prise d'essai
l'indice d'iode est égal 8 :
(n - n f )x 1,269
/"-
cc S2 O3&a2 N / 1 0 correspond 8. 926.mg d ' I . d'oh
(n - n'> x 0,0126 x 100
P
I
Remarquel,Pour l'indice d'iode, en &me temps que les rbsultats,
indiquer toujours la methode utilis6e.

!'
 Bibliographie
Techniques de dosages applicables à des recherches chimiques et
physiologiques sur le mgtabolisme des lipides,
[I] - Kiagarva - Suto, Biochem, Zeitschr. 8 - 1907.-
i21 - Leueland - Bull. S o c ; Ch, Bioli, 110-124 - 1923;-
[3) - Ch. Pontillon - Contribution h l'etude physiologique des lipides
du Sterigmatocystis nigra e

Rev. gén. B o t . 44 - 1932,-

Techniques de dosages applicables 8. l'estimation de la teneur en

matikres grasses des graines olgagineuses.
Analyse de ces matières grassGs,
[4] - BQthodes unifi8es pour l'analyse des matières grasses,
36me &apport de la cormission internationale pour 1'6tude des
matigres grasses -
1948 (8. la kaison de la Chimie, 28, rue
-
st Dominique, Paris VIIO actuellement épuisé)
[5] - íVormes de l'AFNOR: -- NF
BF - V - 03 - * g o 1
- T - 60 - 201
(Déc. 1950)
à 212 (Juin 1948)
(Vente: 19, rue du 4 Septembre, Paris, ILo)
[6f - E.AndrB -
et Msrie Carbou'eres Les methodes de dosage des Lipi--
des dans les graines oleagineuses (Méthode par lixiviation
Méthode par macgration - Me'thode par pesée des restes deshuile's-
-
Essais de détermination en série) -
-
Oldagineux f1°7 -
p.441-9 1953*- -
[7] - P.h.Rousseau - Un procede simple de dosage de la matiere grasse
des grignons d'olive (Dosage par flacons-doseurs)
Ol6agineu.x - iV06 - 13.651-655 - 1951.-