LES TECHNIQUES

CHROMATOGRAPHIQUE
S
Pr. M. SAFI
Département de CHIMIE
UNIVERSITE HASSAN II – MOHAMMEDIA
FST MOHAMMEDIA
2017-2018
LST-Chimie Appliquée (LST-CA)
LST-Techniques d’Analyses et Contrôle de Qualité

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 PLAN
I / INTRODUCTION
II / PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE
III / CHROMATAGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PRESSION
IV / CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
V / GRANDEURS CARACTERISTIQUES EN CHROMATOGRAPHIE
VI/ ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE

2
 I / INTRODUCTION

• La chromatographie a été inventée par le

botaniste Mikhail Tswett en 1903.
• Une colonne de CaCO3 permet de séparer
des pigments végétaux . Par un mélange de
solvants, on obtient des bandes colorées qui
se déplacent le long de la colonne à des
vitesses propres.

3
• 1952 : Martin et Synge ont contribué au
développement de la chromatographie en
phase Gazeuse ( CPG) .
• A partir des années 70, la réalisation de
colonnes très efficaces et le progrès
technologiques conduisent à un
développement spectaculaire de la
chromatographie en phase liquide à haute
pression( HPLC)

4
 II / PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

• La chromatographie est une méthode de

séparation des constituants d'un mélange même
très complexe.
• Il existe trois principaux types de
chromatographie:
-la chromatographie en phase gazeuse (CPG)
-la chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC)
-la chromatographie en couche mince (CCM) et
sur Colonne.

5
• La chromatographie est une technique dans
laquelle les constituants d'un mélange se
séparent en fonction des vitesses auxquelles
ils sont entraînés à travers une phase
stationnaire par une phase mobile.

6
• La phase stationnaire est une phase qui reste en
place, soit dans une colonne, soit sur une surface
plane.

• La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à

travers la phase stationnaire, entraînant l'analyte
avec elle.

• L' élution est un processus au cours duquel les

analytes sont entraînés à travers une phase
stationnaire par le mouvement d'une phase mobile.

7
• De ce phénomène appelé rétention il résulte
que les constituants du mélange injecté se
déplacent tous moins vite que la phase
mobile et que leurs vitesses de déplacement
sont différentes. Ils sont ainsi élués de la
colonne les uns après les autres et donc
séparés.

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• Un détecteur placé à la sortie de la colonne
couplé à un enregistreur permet d'obtenir un
tracé appelé chromatogramme. En effet, il
dirige sur un enregistreur un signal constant
appelé ligne de base en présence du fluide
porteur seul ; au passage de chaque soluté
séparé il conduit dans le temps à
l'enregistrement d'un pic.

9
• Un chromatogramme est le graphique d'une fonction
de la concentration de l'analyte en fonction du temps
(ou volume) d'élution

• Dans des conditions chromatographiques données, le

"temps de rétention" (temps au bout duquel un
composé est élué de la colonne et détecté),
caractérise qualitativement une substance.
L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par
ces pics et la prolongation de la ligne de base permet
de mesurer la concentration de chaque soluté dans le
mélange injecté.

10
11
 III) CHROMATOGRPHIE LIQUIDE A HAUTE
PERFORMANCE ( CLHP)

La Chromatographie Liquide Haute

Performance, initialement chromatographie
liquide haute pression (HPLC), est basée sur
les mêmes principes que la chromatographie
sur colonne et met en oeuvre, selon la nature
de la phase stationnaire, aussi bien des
phénomènes de partage que d'absorption,
d'échange d'ions ou d'exclusion.

12
13
 A / SCHEMA DE PRINCIPE D'UN APPAREIL D'HPLC

Dans tout appareil de chromatographie liquide

haute performance (HPLC) on retrouvera
toujours les éléments de base suivants :
– un ou plusieurs réservoirs de phase mobile
contenant soit des solvants purs soit des
mélanges de solvants dans des concentrations
connues.
– un système d'injection comportant une boucle
d'échantillonnage calibrée (généralement une
vanne RHEODYNE).
14
– une colonne remplie, en acier inox, de quelques
centimètres de long.

– un détecteur permettant à la fois, de mettre en

évidence la sortie des solutés de la colonne et de
donner un signal proportionnel à la quantité de
chacun de ces solutés, dans un mélange.

15
Les principaux détecteurs utilisés sont les
suivants : détecteur réfractométrique,
détecteur U.V. (classique ou à barrette de
diodes), détecteur électrochimique...

16
Dans tous les appareils de HPLC, on retrouve un
ensemble de modules reliés entre eux par
des tubes de faible diamètre. Une ou
plusieurs pompes assurent le débit du
solvant d'élution. En amont de l'injecteur se
trouve la ou les colonnes où s'effectuera la
séparation puis en bout de chaîne le
détecteur.

17
Système classique de HPLC avec un détecteur à
barrettes de diode

18
19
• L'utilisation d'un solvant pur ou d'un mélange
de solvants de composition constante dans le
temps correspond à une étude en mode
ISOCRATIQUE.

• L'utilisation d'un mélange de solvants dont la

composition est variable dans le temps
correspond à une étude en mode GRADIENT

20
 B /ETUDE DETAILLEE DES ELEMENTS D'UN
APPAREIL D'HPLC ( ou CLHP).

1 / Réservoirs

• Un appareil de HPLC comprend un ou plusieurs

réservoirs, en verre ou en acier inoxydable résistants
à la corrosion et contenants les solvants.

• Les poussières en suspension peuvent perturber les

séparations et gêner le bon fonctionnement des
pompes et des détecteurs. Il est donc souhaitable de
dégazer et de filtrer les solvants.
21
• Plusieurs techniques sont utilisées : Le dégazage
peut être effectué par une vive agitation
thermique , par ultrasons, par barbotage
d'hélium.

• Des filtres permettent d'éliminer les poussières,

afin d'éviter que ces particules n'endommagent
la pompe, le système d'injection ou ne bouchent
la colonne.

22
 2 / Pompes

La présence d'une ou plusieurs pompes

constitue sans doute la particularité qui rend
reconnaissable toute installation de HPLC. La
pompe est nécessaire pour faire circuler la
phase mobile à travers la colonne . Les
pompes débimétriques , conçues pour
maintenir un débit stable et non pulsé.

23
 3 / Injecteurs d'échantillon

L'échantillon est injecté à l'aide de vanne à

boucle d'échantillonnage. Les vannes
peuvent être utilisées soit manuellement,
soit commandées par un passeur
automatique d'échantillon.

24
Dans la position chargement (Laod) , la vanne fait
communiquer pompe et colonne. On introduit
avec une seringue, l'échantillon dans un petit
volume tubulaire appelé boucle, puis
l'échantillon gardé dans la boucle à pression
atmosphérique, est inséré dans le flux de la
phase mobile. A cette fin on actionne un levier
qui permet par une rotation de 60° de passer
rapidement de la position de chargement à la
position introduction (Inject) dans la colonne.

25
1re étape de l'injection avec une
vanne à six voies

remplissage de la boucle :
le solvant d'élution circule librement de
la pompe (en 1) à la colonne (en 2).
L'injection est réalisée (en dans la
boucle. Le surplus de solvant est évacué
dans l'effluent, communément appelé
l'évier (en 4). 26
2e étape de l'injection avec une
vanne à six voies

injection de l'échantillon :
on bascule la vanne par action d'un levier et
le solvant va alors balayer la boucle (de 1 à 4)
et entraîner l'échantillon dans la colonne.

27
Schéma d'une vanne rhéodyne

28
 4 / Colonnes

Elles sont le plus souvent en acier inoxydable :

-Le diamètre intérieur des colonnes

conventionnelles varie de ~ 4 à 10 mm

- la longueur de ~ 5 à 30 cm.

- La granulométrie du support de ~2 à 10μm.

29
Il existe des microcolonnes à haute
performance et à grande vitesse:
- d(intérieur) ~1 à 4,5 mm,
- L ~ 3 à 7,5 cm
- d(particules) ~3 à 5μm.

30
• Avantage: une colonne courte permet de
faire des séparations plus rapidement; elle
permet une économie de la phase mobile, ce
qui est important car les solvants de haute
pureté exigé en HPLC sont très chers.

31
 - Colonne de garde

• Une précolonne courte (0,4 à 1 cm) précède

la colonne. Elle sert à retenir des impuretés
en provenance de l'échantillon, de la pompe
ou de la vanne d'injection. La durée de vie de
la colonne principale est ainsi allongée.

32
 - Colonne thermostatée

Les variations de température ont une

influence sur les temps de rétention. Les
appareils de chromatographie HPLC sont
alors équipés avec des dispositifs de
régulation qui contrôlent la température à ±
1°C jusqu'à 150 °C.

33
 5 / Détecteurs

• En HPLC, les détecteurs sont spécifiques à

chaque application.

34
 Détecteurs d'absorption dans UV-Vis

Cette détection est basée sur l'absorption d'une lumière

monochromatique. Elle suit la loi de Beer Lambert:

A=Ɛ.l.c
• λ= longueur d'onde dans UV Vis;
• c = concentration molaire
• A = absorbance du soluté; sans dimension
• Ɛ = coefficient d'absorption molaire du soluté
• l = épaisseur (cm) de la solution traversée ou de la
cellule.

35
 Il existe plusieurs types d'appareils:

● à longueur d'onde fixe : ex: λ=254 ou 313 ou 365

nm

● à longueur d'onde variable: 200 à 700 nm

● à barrettes de diodes, qui donnent les valeurs

des chromatogrammes en 3 dimensions
A = f(λ,t)

36
 Détecteurs de fluorescence

• Certains solutés sont fluorescents ou le

deviennent suite à des réactions pré ou post
colonne. Des détecteurs de fluorescence à
laser permettent des détections de 1 à 10 pg
et même en dessous

37
 Détecteurs réfractométriques

• Ils mesurent la différence d'indice de

réfraction entre la phase mobile et la phase
mobile avec l'échantillon. Ils nécessitent une
température régulée à 0,01°C, car les indices
de réfraction varient avec la température.

38
- Détecteurs d'absorption dans l'infrarouge
- Détecteurs électrochimiques

39
 C) LA PHASE STATIONNAIRE ET MOBILE

1) Phase stationnaire
a) Phase normale
La phase normale est constituée de gel de
silice. Ce matériau est très polaire. Il faut
donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de
l'injection d'une solution, les produits
polaires sont retenus dans la colonne,
contrairement aux produits apolaire qui
sortent en tête.
40
 b) La phase inverse ou Phase
greffée
La phase inverse est majoritairement
composée de silice greffées par des chaînes
linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8
et C18). Cette phase est apolaire et nécessite
donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20).
Dans ce cas, ce sont les composés polaires
qui seront élués en premier.

41
Exemple de Colonne C18 :

Avec phase stationnaire: octadécylsilane C18

42
 2) La phase mobile

• L'interaction plus ou moins forte entre la

phase mobile et la phase stationnaire
normale ou à polarité inversée se répercute
sur les temps de rétention des solutés. La
polarité de la phase stationnaire permet de
distinguer deux situations de principe :

43
• si la phase stationnaire est polaire, on
utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;
• si la phase stationnaire est très peu polaire,
on choisira une phase mobile polaire ( le plus
souvent des mélanges de méthanol ou
d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse.

44
45
 D) LES TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

• La chromatographie d'adsorption (liquide/solide)

• La chromatographie de partage (liquide/liquide)

• La chromatographie d'échange d'ions

• La chromatographie d'exclusion

• La chromatographie d’affinité

46
 1) La chromatographie d'adsorption

Dans cette chromatographie, la phase

stationnaire consiste en une matière solide à
grand pouvoir d'adsorption par exemple les
gels de silice, Les composants sont
simplement plus ou moins retenus à la
surface de la phase stationnaire. C'est une
technique qui prend en compte la polarité
des composés

47
Chromatographie d’Adsorption :
Phase polaire

48
 2) La chromatographie de partage

Le mécanisme de partage correspond à ce que

l'on appelle souvent la chromatograhie de
partage liquide -liquide. Le partage est basé
sur la différence d'affinité du soluté entre la
phase mobile liquide et la phase stationnaire.
Cette dernière est une phase liquide.

49
 Chromatographie de partage :
Phase apolaire (Exemple : Colonne C18)

50
Ces dernières années, on a assisté au
développement des phases greffées
chimiquement : la phase stationnaire est liée
au support par l'intermédiaire de pont
siloxanes Si-O-Si.

51
 3) La chromatographie par échange d'ions

Les échangeurs d'ions sont des macromolécules

insolubles portant des groupements
ionisables, qui ont la propriété d'échanger de
façon réversible certains de leurs ions, au
contact d'autres ions provenant d'une
solution

52
53
54
 4) La chromatographie d'exclusion

Le mécanisme correspond à la séparation par

perméation sur gel est un mécanisme
d'exclusion. Les molécules les plus grosses ne
peuvent pas pénétrer dans les pores les plus
petits de la phase stationnaire; elles ont donc
une rétention plus faible. La séparation
résulte ainsi de la différence de taille des
molécules de solutés.

55
Cette technique a été surtout utilisée pour des
masses moléculaires élevée mais, depuis peu,
on tend à l'employer également pour des
solutés de faibles masses.

56
57
 5 – Chromatographie d’affinité
La chromatographie d'affinité consiste à
greffer, sur un support solide inerte, un
ligand présentant une interaction
ligand-molécule conduit à une fixation ou
une rétention de cette dernière.

58
59
60
 IV /
LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE
( CPG )
C’est une méthode de séparation de composés
susceptibles d’être vaporisés par chauffage
(sans décomposition).
La séparation se fait dans une colonne soit par
partage soit par adsorption. Elle permet :
-la microanalyse (du µg au mg)
-la séparation de mélanges complexes
-une analyse qualitative et quantitative aisée
des analyses dans de nombreux domaines
d’applications.
Ses limites d’applications : elle ne convient pas
pour les produits
- qui se décomposent à chaud (thermolabiles)
- qui sont peu volatils
- ionisés.
 1 - APPAREILLAGE ET
CARACTÉRISTIQUES

1-1 - Schéma d’appareillage

Un appareil de CPG comprend
schématiquement 3 modules spécifiques : un
injecteur, une colonne contenue dans une
enceinte thermostatée (four) et un détecteur
relié à un intégrateur ou un ordinateur sur
lequel apparaît le chromatogramme .
Schéma d’un appareil de CPG

66
• Le mélange à analyser est injecté sous forme
d’un fluide et est vaporisé dans l’injecteur. Le
gaz vecteur l’entraîne dans la colonne de
séparation thermostatée.

• Les composés se répartissent différemment

dans les 2 phases, se déplacent donc à des
vitesses différentes puis sortent à des temps
différents. A leur sortie, ils sont détectés et un
pic apparaît sur l’enregistreur.
 2 - Injecteur

Il permet : l’introduction de l’échantillon, son

évaporation et son entraînement par le gaz
vecteur vers la colonne. Le gaz vecteur arrive
par l’une des extrémités de l’injecteur et
entraîne les solutés vaporisés vers la
colonne.
 2-1 L’injection :
• se fait par le biais d’une seringue de faible
volume (microseringue de 1 à 10 µL).

• L’aiguille de la microseringue entre dans

l’injecteur en traversant un septum (une
pastille d’élastomère siliconé) qui évite les
fuites de gaz au niveau de l’entrée. L’état du
septum doit régulièrement être contrôlé.
 2-2 Température de l’injecteur :
• L’injecteur est thermostaté à une certaine
température de manière à ce que le solvant
et les différents solutés de l’échantillon
soient vaporisés.
• Pour éviter la condensation des produits
injectés
⇨ T°injecteur = T°produit le moins volatil + 20°C
 3 - Four

• Les colonnes sont placées dans des enceintes

chauffées appelées four dont la température
peut-être régulée au 1/10ème de °C près.
• La température du four peut-être :
- stable et identique du début à la fin de la
manipulation ( conditions isothermes)
- programmée par palier successif (en
gradients)
 4 - Colonnes

Elles contiennent la phase stationnaire. Elles se présentent

sous forme de tubes fins enroulés.
• Il existe deux types de colonnes :

4.1. Les colonnes remplies

• Diamètre de 2 à 6 mm et longueur de 1 à 3 m. Elles sont
en tubes d’acier .
• Elles sont remplies d’un support poreux et inerte sous
forme de grains sphériques ( d’environ 0,2 mm de
diamètre) sur lequel est imprégnée la phase stationnaire.

Exemple de supports : Chromosorb® ; Sphérosil® ;

Porapak®
 4.2. Les colonnes capillaires

• Diamètre de 0,1 à 0,53 mm et longueur de 10

à 100 m.

• La phase stationnaire est directement

déposée sur la paroi interne de la colonne sur
une épaisseur de 0,05 à 5 µm.
 5 - Phases

5.1. Phase mobile

• Elle constitue le gaz vecteur. Il s’agit d’un gaz
inerte et pur tel que l’hélium, le diazote ou
l’argon. La nature du gaz ne modifie pas de
manière significative la séparation des
composants du fait de l’absence d’interaction
entre le gaz et les solutés, seul le facteur
température est important.
 5.2. Phase stationnaire

• Choix de la phase stationnaire

• Une phase apolaire retiendra d’autant plus un composé qu’il sera
apolaire (et inversement)
• Exemple : Squalane (apolaire) ; Carbowax (polaire)

• Une phase apolaire retiendra les composés dans l’ordre de leur

température d’ébullition (donc sortie des composés dans l’ordre
de leur température d’ébullition croissante)
• Une phase phénylée retiendra mieux un composé aromatique
• Ex. : phases OV225 ; DC550

• Une phase fluorée retiendra mieux les cétones

• Ex. : phase QF1
 Différentes phases stationnaires

• Les phases les plus courantes sont formées

de deux principaux types de constituants :
• Les polysiloxanes
• Les polyéthylèneglycols (PEG) : polymères
polaires ( colonne Carbowax®)
 6 - Détecteurs

6.1. Généralités
• Ils peuvent être plus ou moins spécifiques des
composés à détecter.
• S'il n’y a pas de spécifications sur la notice de
l’appareil
• ⇨ T°détecteur = T°produit le moins volatil + 20°C

• Il existe différents types de détecteurs :

 6.2. Principes des principaux
détecteurs

- Détecteur à ionisation de flamme (FID)

Le plus utilisé pour les composés organiques et de
grande sensibilité.
• Les composés (gazeux) qui sortent de la colonne
pénètrent dans la flamme du détecteur. Leur
combustion entraîne la formation d'ions et de
particules chargées qui sont alors collectés par 2
électrodes. Le courant très faible qui en résulte
est fortement amplifié et transformé en une
tension mesurable par un électromètre.
 Détecteur à conductibilité
thermique (Catharométre)
Détecteur universel
• Il est formé d'un catharomètre composé de 2
thermistors (= filaments chauffés) dont un est balayé
par le gaz vecteur seul et l'autre par le gaz en sortie
de colonne; Quand un courant gazeux passe sur les
filaments, ils sont refroidis en fonction de la
température, du débit et de la nature du gaz; la
température et le débit sont les mêmes pour le gaz
arrivant sur les 2 filaments mais la présence d'1
composé en sortie de colonne modifie la nature du
gaz qui alors refroidi moins le 2ème filament. Il en
résulte une variation de résistance proportionnelle à
la concentration du composé.
- Détecteur thermoionique (NPD)
• Spécifique aux composés azotés ou
phosphorés.
- Détecteur à capture d'électrons (ECD)
• Spécifique des dérivés halogénés et très
sensible.
 V / GRANDEURS CARACTERISTIQUES EN
CHROMATOGRAPHIE

Le résultat observable d'une analyse se

présente sous la forme d'une courbe du
signal détecté en fonction du temps : c'est le
chromatogramme. Il comporte plusieurs pics
de forme gaussienne, de caractéristiques
différentes.

82
• le temps de rétention ou tR, temps du
maximum du pic. On appelle t0 ou temps de
rétention nulle le temps correspondant à un
composé non retenu .
• la largeur du pic, mesurée à mi-hauteur :
w1/2, ou à sa base, par l'intersection des
tangentes du pic à ses points d'inflexion avec
la ligne de base: w.

83
• De là peuvent être calculées plusieurs
caractéristiques de la colonne pour la
séparation des pics :

• le facteur de rétention k' du pic, par la

formule

84
• l' efficacité N ou nombre de plateaux
théoriques, reliée à la largeur du pic par la
formule

85
• Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir
de cette valeur peut être calculée la hauteur
équivalente à un plateau théorique (HEPT) H,
qui permet de comparer des colonnes de
longueur différente

86
• la sélectivité α entre deux pics 1 et 2 (2 étant
plus retenu que 1), Elle mesure la capacité
de la colonne à séparer les maxima des pics.
Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de
rétention sont éloignés

87
la résolution RS entre les pics 1 et 2

Cette valeur mesure la qualité de séparation et

d'absence de recouvrement entre les 2 pics
considérés.

88
• La résolution ainsi définie est l'objectif de la
séparation chromatographique. C'est une
fonction des trois caractéristiques (efficacité,
sélectivité et rétention), elles-mêmes
définies ci-dessus, dont l'expression est :

89
 VI/ ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE

Le but de la plupart des séparations

chromatographiques est de fournir une
analyse de l'échantillon. Celle-ci est dite
qualitative si elle permet de déterminer le
nombre et la nature des composants de
l'échantillon et quantitative si elle permet de
déterminer la quantité d'un ou plusieurs des
composants présents.

90
 1) Etalonnage externe

• Avec cette méthode, on analyse séparément

une solution standard et une solution
contenant le composé i à ci connue
• On effectue un calibrage afin de connaître le
facteur de réponse du composé i en
analysant une solution à ci et mi sont
connues.

91
• On a mi = ci vinj = Fi Ai --------> Fi = vinj ci/Ai

• On peut alors déterminer la concentration

cech des solutions à analyser

cech = Fi Aech/vinj

92
 2) Etalonnage interne
Cette méthode est basée sur la comparaison
des aires des pics correspondant aux produits
à quantifier à l'aide d'un composé de
référence (l'étalon interne). Ce dernier est
introduit à une concentration connue dans
l'échantillon et dans les solutions de
calibrage. On effectue tout d'abord un
calibrage afin de connaître le facteur de
réponse du constituant Fi.
93
• On prépare les solutions de calibrage de la
façon suivante :
• Une masse mi à ci connue du composer i à
doser
• Une masse me à ce connue de l'étalon
interne
• On injecte un volume de la solution de
calibrage et on obtient un chromatogramme
contenant 2 pics de surface Ai et Ae.
94
• On a les relations suivantes :

• mi = ci vinj = Fi Ai
• mi/me = ci/ce = Fi/e Ai/Ae
• me = ce vinj = Fe Ae

• on détermine ainsi Fi/e

95
• On peut alors procéder à l'analyse
d'échantillons préparé de la façon suivante :
mech du composé i à cech inconnue
me de l'étalon à ce connu

On a donc cech/ce=Fi/e Aech/Ae

cech = Fi/e Aech/Ae ce

96