ARTICLE ORIGINAL
EVALUATION DES PERFORMANCES ANALYTIQUES
DU RÉACTIF BIURET.
Alloui AS(1,2), Amokrane E(1), Settah A(1), Abadi N(1), Ben-
latreche C(1).
1)Laboratoire de Biochimie CHU Constantine.
2)Laboratoire MEDPREVAC.
Résumé:
Le choix d’une technique et sa validation constitue une préoccupation majeure pour le biologiste dont le souci permanent est de
garantir la fiabilité des résultats. Ce travail expérimental, est une évaluation des performances analytiques d’un réactif Biuret destiné
au dosage manuel des protides totaux dans notre laboratoire. Nous avons utilisé une gamme de solutions croissantes d’albumine et
des contrôles du commerce. Le Biuret éprouvé est proche de celui proposé par Gornall. Le protocole suivi est inspiré du protocole
de Validation des Techniques Valtec. La limite haute de linéarité est à 100g/L et l’étalonnage montre une courbe linéaire. La limite
de détection est à 1,28g/L et le seuil de quantification à 4,25g/L. Les coefficients de variation (CV) ou de reproductibilité sont infé-
rieurs à ceux de la Société Française de Biologie Clinique (SFBC), de même pour la justesse et l’inexactitude dont les valeurs sont
inférieures aux limites de la SFBC. Le réactif éprouvé présente d’excellentes performances analytiques en termes de détectabilité,
de stabilité, de reproductibilité, de justesse et d’inexactitude sauf pour la limite de linéarité. Cette méthode est introduite dans notre
laboratoire comme technique manuelle de dosage des protidémies aux concentrations basses et moyennes.
Mots clés: Biuret, Protides totaux, Validation, Performances analytiques, Dosage manuel.
Abstract: ANALYTICAL EVALUATION OF THE REAGENT BIURET’S PERFORMANCES.
The overall determination of proteins’ plasma concentration is an analysis of first intention. Only the variations of the most abun-
dant proteins (albumin and immunoglobulins) have a significant effect on the total concentration. Currently, most labs use for the
dosage of serum proteins (or plasma) a colorimetric technique based on the Biuret’s color reaction according to the method deve-
loped by Gornall et al. in 1949. We conducted an experimental study in our lab in which we evaluated the analytical performance
of Biuret reagent done manually for the determination of the total protein in accordance with the validation protocol recommended
by the technical guidelines of VALTEC’s SFBC. The experiment yielded positive results which allow us to argue that this reagent
has excellent analytical performance in terms of detectability, the reaction stability, reproducibility, and accuracy and inaccuracy.
We can also argue that a linearity limit of only 100g /L leads to the systematic implementation of dilutions at high concentrations.
These technical characteristics have encouraged us to introduce this method in our lab’s daily routine as a manual technique for the
determination of the dosage total proteins at low and medium concentrations.
Key words: Biuret, Total protein, Validation, Analytical performance, Manual dosing.
Tirés à part: ALLOUI A.S, Service de Biochimie, C.H.U Constantine.
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ALLOUI AS. & Col.
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Introduction de la linéarité et de l’étalonnage, de la limite de détection ana-
L e choix d’une technique et sa validation, a toujours constitué
une préoccupation majeure pour le biologiste dont le souci
permanent est de garantir la fiabilité des résultats, compte tenu
lytique, du seuil de quantification et de la sensibilité analytique.
•Une évaluation de la stabilité de la réaction.
•Une étude de la reproductibilité à partir de résultats obtenus
des moyens mis à sa disposition [1,2]. sur les spécimens de contrôles pendant une période de 15 jours.
Le respect des règles d’assurance qualité des laboratoires oblige •Une appréciation de la justesse et de l’inexactitude par l’étude
à procéder à la validation des techniques en préalable à leur uti- de solutions du contrôle interne de la qualité suffisamment ca-
lisation [1,2]. ractérisées dans notre laboratoire.
La détermination globale de la concentration plasmatique des
3.Tests statistiques
protéines est une analyse de première intention. Seules les va-
riations des protéines les plus abondantes (albumine, immuno- L’exploitation statistique des résultats a été réalisée à l’aide du
globulines) ont un effet significatif sur la concentration totale. logiciel Statistica StatSoftR.
Le dosage des protéines totales plasmatiques est utilisé pour ap- La droite de régression linéaire et le coefficient de corrélation r
précier les fonctions hépatique et rénale, le dysfonctionnement ont été utilisés pour l’étude de la corrélation.
du système immunitaire et pour surveiller les maladies métabo- La limite de 5% (p<0,05) a été fixée comme limite de signifi-
liques et nutritionnelles [3]. Actuellement la majorité des labo- cativité.
ratoires utilisent pour le dosage des protéines plasmatiques une
technique colorimétrique reposant sur la réaction de coloration Résultats
du biuret d’après la méthode développée par Gornall et al. en 1.Domaine de mesure
1949 [4].
L’objectif de ce travail etait l’étude des performances analy- a.Linéarité et étalonnage
tiques d’un réactif Biuret destiné au dosage manuel des protides Nous avons vérifié la limite supérieure annoncée du domaine
totaux dans notre laboratoire. de mesure (120g/L), puis nous avons étudié l’étalonnage.
Ainsi, nous avons dosé en triple les 36 solutions d’albumine
Matériel et méthodes dans une même série, puis nous avons calculé les coefficients
1.Matériel d’exactitude CE. Ensuite, nous avons tracé la courbe d’étalon-
nage et réalisé une corrélation entre les valeurs observées et les
a.Spécimens biologiques valeurs théoriques.
Nous avons eu recours à une gamme de 36 solutions d’albu- Avec une limite de significativité fixée à 5%, nous situons la
mine obtenue à partir d’une solution mère à 200g/L préparée limite haute de linéarité à 100g/L. L’étalonnage a montré une
à son tour à partir d’albumine bovine cristallisée (Fluka, lot courbe linéaire à la longueur d’onde de lecture (figure 1) selon
n°Code S13448806) contre de l’eau distillée. l’équation suivante: Protides totaux (g/L)=193,65 A540+0,216
Ces solutions étaient de concentrations croissantes: 2, 2.5, 3, 4, (r=0,9975 ; p<0,05).
5, 6, 7, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 145 Absorbance à 540nm
et 150 g/L.
Nous avons utilisés des spécimens de contrôle du commerce,
ExatrolR BIOLABO, à deux niveaux de concentration (niveaux
1 et 2), lots n° 061119E1 et 031115E1 respectivement.
b.Réactif et technique
Le réactif évalué est un réactif Biuret, prêt à l’emploi, d’un seul
lot, proche de celui proposé par Gornall [4].
En milieu alcalin (hydroxyde de sodium) les liaisons peptidiques
des protéines réagissent avec les ions cuivriques pour former le
complexe du biuret caractéristique rose à violet, présentant un
maximum d’absorbance à 540 nm. L’intensité de la coloration Concentration
dépend du nombre de liaisons peptidiques impliquées. Figure 1. Courbe d’étalonnage des protides totaux à 540nm
Le protocole opératoire de la méthode éprouvée consiste en sur spectrophotomètre BIOLABO.
l’addition de 20µL de spécimen à 1mL de réactif, puis une incu- La corrélation entre les valeurs observées Y et les valeurs théo-
bation pendant dix minutes à température ambiante et enfin une riques X (figure 2) obéit quant à elle à l’équation suivante:
lecture contre le blanc réactif. Y= 0,9787 X-0,2965 (r=0,9987 ; p<0,05).
c. Appareillage Y valeurs observées
Cette étude de performance a été réalisée sur un spectrophoto-
mètre UV-Visible BIOLABO.
2.Méthodes
Le protocole suivi pour cette évaluation est inspiré du protocole
de Validation des Techniques Valtec de la Société Française de
Biologie Clinique SFBC [2,5].
Nous avons réalisé dans la période allant d’Avril à Mai 2013
au niveau du Laboratoire Central de Biochimie du CHU de
Constantine une étude qui consiste en: X valeurs théoriques
•Une évaluation du domaine de mesure qui comporte une étude Figure 2. Corrélation entre les valeurs mesurées Y
et les valeurs théoriques X.
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Evaluation des performances analytiques du réactif Biuret.
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b.Limite de détection analytique L’étude de la limite de détection et du seuil de quantification
Nous avons dosé trente fois dans une même série de l’eau dis- nous permet d’affirmer que les résultats des dosages de spéci-
tillée de qualité analytique, puis nous avons recueilli les résultats mens de patients peuvent être rendus avec une précision et une
en unités d’absorbance [6]. Après calcul, la limite de détection justesse satisfaisantes à partir de 4,25g/L, tandis que l’étude de
obtenue était à 1,28g/L. la sensibilité analytique démontre le défaut de sensibilité du
c.Seuil de quantification
réactif Biuret qui n’est dons pas adapté au dosage des protéines
de l’urine et du LCR.
Après calcul au cours du même précédent protocole [7], le seuil La stabilité de la réaction est excellente à température ambiante
de quantification obtenu était de 4,25g/L. et à l’abri de la lumière. Les CV obtenus aux deux niveaux de
d.Sensibilité analytique concentration sont excellents et sont inférieurs aux CV limites
Nous avons pris les deux concentrations situées aux 2 bornes définis dans le protocole Valtec [1].
du domaine de mesure (5 et 100g/L) [7]. Après calcul, la sensi- L’étude de solutions du contrôle interne de la qualité retrouve un
bilité obtenue était à 0,050 m Abs/10 g/L. biais satisfaisant au niveau 1 et très satisfaisant au niveau 2, cela
en tenant compte de l’intervalle de confiance de la moyenne.
2.Stabilité de la réaction Par ailleurs la justesse et l’inexactitude observées sont satis-
Nous avons étudié la stabilité de la coloration du complexe en faisantes aux deux niveaux de concentration surtout au niveau
fonction du temps après dosage de plusieurs échantillons de élevé avec des valeurs largement inférieures aux valeurs limites
concentration située entre 20 et 100g/l, en mesurant l’absor- définies dans le protocole Valtec.
bance de la réaction à 540 nm toutes les quinze minutes. Nous
Conclusion
avons fixé comme limite de stabilité le temps Ti ne dépassant
pas une variation de 5% entre l’absorbance mesurée à T0 et Ti. A la suite des résultats que nous avons obtenus, nous pouvons
La coloration, après la fin de la réaction, était stable pendant une affirmer que ce réactif, pour le dosage des protides totaux,
heure à température ambiante et à l’abri de la lumière avec une présente d’excellentes performances analytiques en termes de
diminution de 2,7% de l’absorbance à 540 nm. détectabilité, de stabilité de la réaction, de reproductibilité, de
3.Reproductibilité justesse et d’inexactitude. Cependant une limite de linéarité à
100g/L seulement impose des dilutions aux concentrations éle-
Nous avons analysé chaque échantillon pour chaque niveau de
vées.
concentration dans quinze séries différentes, en début et en fin
Ces caractéristiques techniques ont fait que cette méthode ait été
de série.
introduite en routine quotidienne dans notre laboratoire comme
Les résultats de l’étude de reproductibilité sont regroupés dans
technique manuelle de dosage des protides totaux plasmatiques
le tableau I.
aux concentrations basses (15-63 g/L) et moyennes (64-83 g/L).
Tableau I. Résultats de l’étude de reproductibilité (n= 30).
ET CV CVlimite SFBC Références
1.Vassault A, Grafmeyer D, De Graeve J, Cohen R, Beaudonnet A,
Niveau 1 1,27 1,74 2,4 Bienvenu J. Analyse de biologie médicale. Spécifications et normes
Niveau 2 1,15 1,36 2,4
d’acceptabilité à l’usage de la validation de techniques. Ann Biol Clin
CV: coefficient de variation. 1999; 57: 685-95.
4.Appréciation de la justesse et de l’inexactitude 2.Alloui AS. Mise en place d’un système Assurance Qualité au Labora-
Nous avons analysé de façon répétée chaque échantillon pour toire Central de Biochimie Clinique, Thèse de Doctorat de Spécialité de
chaque niveau de concentration dans quinze séries réalisées Sciences Médicales, Faculté de médecine de Constantine, Avril 2014.
dans des conditions de répétabilité. 3.Estepa L. Protéines totales, EMC-Biologie Médicale. 2006 [Article
La moyenne calculée pour chaque niveau de concentration 90-10-0790].
a été comparée à la valeur cible attribuée de l’échantillon de
contrôle (assimilée à la valeur vraie) avec calcul de l’intervalle 4.Gornall AG, Bardawill CJ, David MN. Dertermination of serum
de confiance de la moyenne (Icm), du biais, de la justesse et de proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem. 1949 Feb;
l’inexactitude [8]. 177(2): 751-66.
Les résultats de l’étude de l’inexactitude sont présentés sur le 5.Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C et al. Protocole de validation
tableau II. des techniques. Ann Biol Clin. 1986: 686-745.
Tableau II. Résultats de l’étude de la justesse et de l’inexactitude.
Icm Biais g/L Biais% Justesse Justesse Inexactitude Inexactitude
limite SFBC limite SFBC
Niveau 1 72,86±0,46 0,54 0,73 3,83 3,8 4,21 4,5
Niveau 2 84,36 ± 0,42 0,03 0,04 2,40 3,2 2,76 4
Discussion 6.Baud M, Cohen R, Dumont G, Mercier M, Naudin C, Vassault A.
Protocole d’évaluation de la limite de détection d’une méthode analy-
La limite supérieure du domaine de mesure trouvée, inférieure tique, Immunoanal Biol Spéc. 1986; 14: 17-27.
à celle annoncée par le fabricant, n’est pas satisfaisante.
L’étalonnage est validé, en effet les critères d’acceptabilité pré- 7.Ducauze C, Baillet-Guffroy A, Bui T.X. Choix et validation d’une
déterminés pour l’étalonnage d’une méthode linéaire sont am- méthode d’analyse. AgroParis Tech.
plement satisfaits avec une pente à 0.9787, un intercepte clini- 8.Hainque B, Baudin B, Lefèbre P. Bonnes pratiques de laboratoires,
quement négligeable à -0,2965 et un coefficient de corrélation Appareils et méthodes en Biochimie et Biologie Moléculaire. Edition
r à 0,9987. Médecine Sciences Publications. 2008: 52-56.
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