Cours de génie génétique

L3 biochimie

Par Dr. GUENDOUZE A.

1
 Génie génétique
• Grâce au génétique, les gènes peuvent être isolés,
lus, copiés, modifiés, combinés de manière
différente et transmis d'un être vivant à un autre.
• Le génie génétique est utilisé en recherche et en
médecine, ainsi que pour le développement de
plantes génétiquement modifiées.
• Un tel transfert de gène fonctionne également
entre êtres vivants non-apparentés. Ainsi, il est
possible d'introduire un gène de bactérie dans
l'ADN d'une plante.
2
 Pré-requis
• L'ADN contient toute
l'information génétique,
permettant le développement, le
fonctionnement et la reproduction
des êtres vivants.
• Les molécules d'ADN des
cellules vivantes sont formées de
deux brins antiparallèles enroulés
l'un autour de l'autre pour former
une double hélice.
• Chacun de ces brins est un
polymère appelé polynucléotide.
3
 Pré-requis

acide désoxyribonucléique/ acide ribonucléique

4
Pré-requis
Liaison
phosphodiestere

5
 Pré-requis
La réplication de l’ADN
• La réplication a lieu lors de la division
cellulaire.
• Elle permet, de former, à partir d’une
molécule d’ADN, deux molécules d’ADN
identiques.
• Ce mécanisme explique comment
l’information génétique est conservée dans
toutes les cellules de l’organisme,
6
 Cours 1

Outils enzymatiques du génie

génétique
Pour chacune des enzymes utilisées dans le génie
génétique, connaître la spécificité de l’activité
enzymatique

7
 Polymérases
Les DNA polymérases
• Tous les êtres vivants ont besoin d’une DNA
polymérase pour la réplication de leur ADN. Ce
sont en général des protéines d’environ
100000 daltons.

8
 Les ADN polymérases

• Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN

dépendantes.
• Elles ne sont pas capables de synthétiser le brin
nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce
d’acide nucléique.

9
 Les ADN polymérases
• Toutes les ADN polymérases possèdent les
caractéristiques suivantes:
- Elles ont besoin d’une amorce avec une
extrémité 3’-OH libre.
- La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée
dans le sens 5’à 3’.
- La chaîne nouvelle est complémentaire de
la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.
• Certaines ADN polymérases possèdent une
activité exonucléase
10
 Les ADN polymérases

• L’activité exonucléasique, leur permet en particulier

d’hydrolyser le dernier nucléotide en 3’ du brin
synthétisé si celui-ci ne s’apparie pas correctement
avec le nucléotide complémentaire du brin modèle.

11
Les DNA polymérases

12
 Les ADN polymérases
1. L’ADN polymérase I (extraite de E. Coli)
• Elle possède des propriétés polymérasiques, mais aussi
des propriétés exonucléasiques.
• DNA pol I est douée d’une double fonction
exonuclésique :
-exonucléase 5’→3’ pour digérer le deuxième brin à
partir de son extrémité 5’ (nick translation)
-exonucléase 3’→5’ pour digérer l’extrémité 3’ d’un
brin (correction immédiate des misappariements)

13
 Les ADN polymérases
2. Fragment de Klenow
La digestion de la DNA polymérase I par une
protéase (subtilisine) donne deux fragments :
celui de 76 kD (fragment de Klenow) possède
encore deux des activités catalytiques de la
polymérase : - 5’→3’ polymérase
- 3’→5’ exonucléase.
Ce fragment peut-être utilisé pour synthétiser le
deuxième brin à partir d’un ADN simple brin et
d’une amorce.
14
 Les ADN polymérases

3. T4 DNA polymérase
Comme le fragment de Klenow elle est
dépourvue d’activité 5’→3’ exonucléase, mais
elle possède une activité 3’→5’ exonucléase
200 fois plus grande.

15
 Les ADNpolymérases
4. La Taq polymérase
• La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de
Thermus aquaticus (bactéries ), présentes dans les sources
chaudes.
• Elle permet de travailler à des températures plus élevées que
les températures usuelles (ambiante ou 37°C).

• Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification

génique et également dans les réactions de séquençage de
l’ADN.

• Elle est dépourvue de l’activité exonucléasique 3’5’ et 5’ 3’

16
 Les ADN polymérases
5. La séquenase
• Les séquenases sont une famille d’enzymes issues de la
DNA polymérase du bactériophage T7
• Elles sont dépourvues par une modification du gène de
toute activité exonucléasique (5’→3’ exonucléase et
3’→5’ exonucléase).
• Les séquenases sont les plus rapides de toutes les DNA
polymérases.
• Les séquenases sont utilisées dans les techniques de
séquençage (Sanger). Elles sont responsables de quelques
erreurs à défaut d’activité d’édition : de l’ordre de
1 misappariement pour 1000 paires de bases.
17
 Les ARN polymérases
• Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des
deux brins d’ADN en un brin d’ARN. Elles sont extraites des
bactéries. Ces ARN polymérases possèdent les propriétés
suivantes:
- Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à 3’.
- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse
(à la différence des ADN polymérases).
- Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs)
et également (comme les autres polymérases) des ions Mg2+.
- Elles sont dénuées d’activité d’édition.
- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN
polymérases ne peuvent démarrer la transcription que si
l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique
correspondant 18
 Les polymérases
Poly(A) polymérase
• L’extrémité 3’OH terminale du dernier exon du transcrit est
d’abord coupée par une nucléase
• Ensuite, une polymérase additionne des nucléotides à adénine
(plusieurs centaines) pour constituer une « queue » polyA. La
réaction se fait sans matrice
• La queue polyA est indispensable à la sortie du mRNA du noyau
vers le cytoplasme. Elle protège le mRNA au cours de la
traduction.
• Les mRNA désadénylés ne sont plus traduits et seront
rapidement digérés par la ribonucléase.

19
 Les ADN polymérases
Transcriptase inverse ( RT: reverse transcriptase)

• Sont des DNA polymérases qui peuvent synthétiser un brin

d’ADN complémentaire (ADNc ou cDNA) en prenant un
ARN comme matrice.

• Elles catalysent donc la réaction inverse de la transcription,

d’où le nom de transcriptases réverses.

• Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus

à ARN).
• Elle permet de fabriquer à partir d’un ARN messager
(mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire
d’un mARN). 20
• Elle possède les propriétés suivantes:
- C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau
fragment dans le sens 5’à 3’.
- Elle est ARN-dépendante. ( contrairement aux autres
ADN polymérases)
- Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à 5’,
donc de fonction d’édition. Elle peut donc insérer des
bases par erreur.
- Elle a une activité RNAse.
21
 Transcriptase inverse ( RT: reverse transcriptase)

ARNm avec queue polyA 5’ AAAAAA 3’

TTTTT
2) Élongation de
l'amorce par la 1) Hybridation avec un
transcriptase oligonucléotide
réverse complémentaire de la
queue polyA

La transcriptase réverse est utilisée pour l’étude des ARN. Après

la synthèse de l’ADN complémentaire, on détruit l’ARN
matrice, puis on soumet l’ADNc à l’amplification par la PCR,
qui fournit une grande quantité d’ADNc hybridé avec une copie
ADN de la séquence de l’ARN de départ.
22
Les ligases

23
Les DNA ligases sont des enzymes qui sont
capables de reconstituer la liaison phosphodiester
entre le 3’-OH et le phosphate-5’ de deux
nucléotides voisins sur un brin d’ DNA.

24
 DNA ligase de E. Coli
• Elle catalysent la liaison de l’extrémité 5’-phosphate
terminale d’un brin d’ADN avec l’extrémité 3’-OH
terminale d’un autre brin.

• La DNA ligase de E. coli ne lie les bouts francs de

l’ADN que dans certaines conditions mais elle est
toujours active pour souder les fragments d’ADN
double brin à extrémités collantes, ou pour fermer une
brèche dans un brin d’ADN dont la re-synthèse est
achevée.
25
 DNA ligase de E. Coli

• Elle n’a pas d’activité sur les RNA.

• Les DNA ligases sont utilisées dans le clonage
des fragments d’ADN et dans la construction
des vecteurs.

26
 DNA ligase du phage T4

• Elle est moins spécifique que celle de E. coli : elle

lie bien les fragments de DNA à bouts francs et
fonctionne dans la plupart des tampons utilisés par
les enzymes de restriction.
• La T4 DNA ligase agit aussi mais moins rapidement
sur les ARN.

27
Les nucléases

28
 Définition

les nucléases dégradent les molécules d'ADN

en rompant les liaisons phosphodiesters liant
un nucléotide au suivant .
Il existe 2 types de nucléases.

29
 Exonucléases
• hydrolysent le premier ou le dernier nucléotide au
bout d’un brin d’acide nucléique
• Il en existe différents types, par exemple
 la Bal 31: élimine des nucléotides à partir des 2
extrémités de l’ADN double brin
 l'exonucléase III (obtenue à partir de cultures
d'E. coli) catalyse l'hydrolyse séquentielle des
nucléotides d'un ADN à partir d'une extrémité 3'
libre.
 Exonucléase de phage λ: hydrolyse de
préférence les extrémités 5’-phosphate des DNA
double-brin en continuant vers le côté 3’.
(5’→3’ exonucléase).
30
 Endonucléases
1. A clivages non spécifiques:
• Ces enzymes sont capables de rompre des liaisons
phosphodiesters internes.
• La DNase I:
- Elle hydrolyse les ADN double ou simple brin.

- Elle agit comme une endonucléase, préférentiellement sur

les liaisons adjacentes aux nucléosides pyrimidiques (C et
T).

31
 Endonucléases

• La nucléase SI:
-extraite de culture d'Aspergillus oryzae
-exerce une activité endonucléase sur l’ADN
et l’ARN simple brin.
-Elle est utilisée pour supprimer les boucles
d’ADN simple brin lors de la synthèse de
l’ADNc.

32
 Endonucléases
2. A clivages spécifiques: enzymes de restriction:
• Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des
endonucléases,
• Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître
spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10pb, et de
cliver l'ADN au site reconnu.
• Elles permettent de fragmenter l'ADN en segments de
taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site désiré.

33
 Enzymes de restriction
• Différentes enzymes de restriction ont été caractérisées et elles sont

classés en 3 types :

type I: l'enzyme reconnaît sa séquence puis se déplace sur l'ADN et

s'arrête de manière aléatoire 1000 à 5000 paires plus loin et libère

quelques dizaines de nucléotides.

type II: une fois la séquence reconnue, l'enzyme coupe l'ADN au

niveau de cette séquence (les plus courante en biologie moléculaire).

type III: après reconnaissance de la séquence spécifique, ces enzymes

découpent l'ADN une vingtaine de nucléotides plus loin.

34
 Séquences d’ADN reconnues par les enzymes
de restriction.
• Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de
restriction sont habituellement des séquences dites
palindromiques.

• Les séquences palindromiques sont des séquences où la

succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche-
droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans
le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à3’).
35
36
 Origine des enzymes de restriction.
• Les enzymes de restriction sont extraites de micro-
organismes, le plus souvent des bactéries.
• Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à
ADN. Les bactéries fabriquent des enzymes de
restriction qui sont capables de cliver les ADN
étrangers.
• Pour éviter une auto-destruction de leur propre
ADN, elles se protègent contre leurs propres
enzymes de restriction par une modification des sites
de restriction correspondants.
37
 Nomenclature des enzymes de restriction
Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4).
• La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite
en majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où
a été extraite l’enzyme.
• La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules)
correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme est
extraite.
• On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule
correspondant à la souche bactérienne.

38
 Nomenclature des enzymes de
restriction
• Enfin pour terminer, un chiffre romain indique
l’ordre de caractérisation de ces enzymes.

39
Exemples des enzymes de restriction de type II

40
41
 Enzymes de restriction
• Le site de coupure, compris dans le site de
reconnaissance est représenté par une flèche verticale
(tab.1), et les produits de la digestion d’un génome par
les enzymes de restriction sont appelés les fragments
de restriction.
• Selon la position de la coupure (dans l'axe ou loin de
l'axe) on distingue deux types de coupure:
- Coupure franche : Dans l’axeExtrémités
franches
- Coupure cohésive (collante) : N’est pas dans
l’axeExtrémités cohésives
42
HaeIII génère de extrémités sans simple brin dépassant : des bouts francs ;
PstI et BamHI génèrent des extrémités simples brins susceptibles de s'apparier
avec d'autres simples brins en suivant la règle de complémentarité des bases,
ce sont des extrémités cohésives (« bouts collants »). PstI a une extrémité 3'
qui déborde alors que BamHI en a une 5'
43
 Méthylation des sites de restriction et inactivation des
enzymes de restriction

• L’ADN bactérien présente des sites de restriction

susceptibles d’être repérés par les enzymes de
restriction que possèdent la bactérie.
• Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de
modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces
enzymes de modification sont des méthylases
bactériennes (ou enzymes de méthylation).

44
Méthylation des sites de restriction et inactivation
des enzymes de restriction
• La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5)
ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des
sites de restriction aboutit à une inactivation de
l’enzyme de restriction correspondante.

• Cette méthylation peut se réaliser sur une base ou

sur plusieurs bases appartenant au site de
restriction.
• Les méthylases bactériennes sont très spécifiques.

45
46
 Isoschizomères
• En général, des enzymes de
restriction différentes
reconnaissent des séquences
différentes.
• Cependant, plusieurs enzymes
isolées d'organismes différents
reconnaissent des séquences
identiques. On les appelle
isoschizomères.
• Ceux-ci ne coupent pas toujours
la séquence reconnue au même
endroit.
47
 La phosphatase alcaline:
• Elle retire le phosphate en 5' sur l'ADN, l’ARN
et les nucléotides libres.

• L'élimination des phosphates en 5' empêche

toute action des ligases.

• Un vecteur ouvert ainsi traité ne pourra pas se

refermer sur lui-même.

48
 Les kinases

• La T4 polynucléotide kinase: elle transfère le

phosphate d'un ATP sur le phosphate en 5' d'un
polynucléotide.

• Ce marquage en 5' s'effectue en vue de

déterminer la séquence d'un ADN.

49