En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSE

Délivré par :
Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse INP)
Discipline ou spécialité :
Sciences des Agroressources

Présentée et soutenue par :

Mme DOUAA SALIM
le jeudi 12 décembre 2019
Titre :
Formulations écocompatibles d'extraits de l'algue verte Ulva Lactuca pour
la préservation des agrumes après récolte

Ecole doctorale :
Sciences de la Matière (SDM)
Unité de recherche :
Laboratoire de Chimie Agro-Industrielle ( LCA)
Directeur(s) de Thèse :
MME PASCALE DE CARO
MME ASMA CHBANI

Rapporteurs :
M. CEDRIC BERTRAND, UNIVERSITE DE PERPIGNAN
M. MARC EL BEYROUTHY, UNIVERSITE SAINT-ESPRIT DE KASLIK
Membre(s) du jury :
M. FAWAZ EL OMAR, UNIVERSITE LIBANAISE, Président
M. CHAKER EL KALAMOUNI, UNIVERSITE DE LA REUNION, Membre
Mme ASMA CHBANI, UNIVERSITE LIBANAISE, Membre
Mme PASCALE DE CARO, TOULOUSE INP, Membre
 Thèse en Cotutelle

Pour l’obtention du grade de Docteur délivré

par L’Université de Toulouse -Institut National Polytechnique de Toulouse

(Ecole Doctorale SDM - SCIENCES DE LA MATIERE - Toulouse)
Spécialité : Sciences des Agroresources
et
par L’Université Libanaise (Ecole Doctorale Sciences et Technologie)
Spécialité : Biotechnologies Appliquées
Présentée et soutenue publiquement par

SALIM Douaa

Le 12 Décembre 2019

Formulations écocompatibles d’extraits de l’algue verte Ulva lactuca pour la

préservation des agrumes après récolte.

Membre du Jury
M. Cédric Bertrand, Professeur, Université de Perpignan Rapporteur
M. Marc El Beyrouthy, Professeur, Université Saint-Esprit de Kaslik Rapporteur
M. Chaker El kalamouni, Maître de conférences, Université de La Réunion Examinateur
M. Fawaz El Omar, Professeur, Université Libanaise Examinateur
Mme Pascale De Caro, Maître de conférences, Toulouse INPT Directrice de Thèse
Mme Asma Chbani, Professeur, Université Libanaise Directrice de Thèse

1
 Dédicace
Je dédie ce travail
A l’âme de ma grande mère « Teta Fufu ».

A mes parents,
qui ont tout sacrifié pour me voir réussir.
Vous êtes la source de mes efforts et la flamme de mon cœur.
A mes frères, ma sœur et mon amour
Vous êtes la lumière de mes jours, mon soutien moral, source de joie et de
bonheur.
Vous m’avez toujours aidée et encouragée durant tout le chemin.
Douaa

2
 Remerciements

Nous y sommes, on est arrivé… Me voilà au bout de cette thèse qui a marqué ma vie avec ses
hauts et ses bas, ses rires et ses larmes, ses bonheurs et ses stress, ses rencontres et ses départs.
L’ensemble a constitué la meilleure expérience enrichissante et formidable de ma vie dans laquelle
j‘ai tellement appris et découvert. Ceci n‘aurait pas été possible sans toutes les personnes qui ont
contribué, de près ou de loin à ce travail de thèse, c’est avec ces quelques lignes que je vous
exprime ma reconnaissance.

Je tiens tout d'abord à remercier les professeurs Cédric Bertrand et Marc El Beyrouthy pour avoir
accepté de rapporter et d'évaluer mon travail de thèse, ainsi que pour l'intérêt qu'ils ont manifesté
à cet égard. Je remercie aussi Pr. Fawaz El Omar et Dr. Chaker El Kalamouni qui m'ont fait
l'honneur de participer au jury en tant qu'examinateurs.

Je tiens à exprimer mon immense gratitude envers mes directrices de thèse Mesdames Asma
Chbani et Pascale de Caro. J’ai beaucoup appris à vos côtés et les mots me manquent pour vous
exprimer ma gratitude. Vous avez été particulièrement disponibles et consciencieuses durant tout
mon travail de thèse. Merci pour votre soutien, votre encouragement et pour votre patience et vos
conseils menant toujours aux meilleures solutions.

Mes vifs remerciements à Dr. Asma Chbani, qui m'a choisi pour réaliser cette thèse avec elle. Un
grand merci pour son inestimable soutien, ses encouragements précieux et à la confiance qu'elle
a su me témoigner pendant ces trois années de thèse. Je vous remercie de bon cœur pour toutes
vos qualités humaines.

Mes vifs remerciements à Dr. Pascale De Caro, vous avez été toujours accessible et prête à
répondre à toutes mes questions tout au long de ces trois années. Depuis mon arrivée à Toulouse,
vous m’avez attribué une confiance immense et vous m’avez bien guidé pour mener à terme mes
travaux de recherche. Merci pour votre accueil chaleureux au LCA, pour votre persévérance et
votre franchise, votre écoute et vos conseils.

Je remercie fortement aussi les membres de l'équipe de Biotechnologie Appliquée dirigée par Dr.
Hiba Mawlawi, qui ont rendu le travail au laboratoire plus facile. Je tiens à remercier

3
particulièrement la plus belle assistante « Rayuna » pour son écoute, son attention et sa capacité
à régler tous les soucis rencontrés pour fournir un bon déroulement du travail au laboratoire.

Je tiens à remercier aussi tout le personnel du Laboratoire LCA à Toulouse, Monsieur Carlos
Vaca-Garcia, directeur adjoint du LCA, les enseignant-chercheurs, les doctorants, les techniciens
et les stagiaires. C’était un grand plaisir de vous connaitre.

Je voudrais exprimer ma reconnaissance envers les amis, spécialement Sidrine, Huy, Gabi, Alé,
Nicki, Tousaint, khouloud, Clément, Francisco, qui m’ont apporté leur support moral. Un très
grand merci à Issaad pour sa confiance et son support inestimable. Tu es plus qu’une amie, tu es
une sœur et un soutien dans les moments pénibles et agréables. Mon séjour à Toulouse n’aurait
pas été le même sans ta présence.

Une pensée particulière à mes belles amies, Khadija, Hiba, Fatima, Rayan, Reem, Manal, Bariaa
et Sara, pour leurs encouragements réguliers, leur merveilleuse sincérité, leur fidélité
exceptionnelle et leur présence inestimable à côté de moi aux bons et mauvais moments.

Enfin, ma reconnaissance et mes remerciements les plus distingués vont à ma famille qui a garni
mes chemins avec espoir, lumière et amour. Merci à papa, pour tout ce qu'il a fait et continue de
faire chaque jour. Merci à la plus belle perle du monde, mon ange "Maman", pour sa tendresse
inépuisable, son amour en or, ses sacrifices infinis, qui ont fait de moi ce que je suis aujourd'hui.
Un grand merci à mes formidables frères, ma sœur, qui n'ont pas cessé un jour à me soutenir
pendant tous les moments difficiles, merci pour leur tendresse, leur main-tendue et leur écoute
pleine de respect. Merci à « Mahmudi », l'amour de ma vie, qui a partagé avec moi tous les
moments de bonheur et de galère. Merci de me remonter le moral à chaque fois que je suis fatiguée,
à m'encourager quand je baisse les bras, et surtout d'être toujours là pour moi, même lorsque des
milliers de miles nous ont séparés. C'est à vous tous que je dédie ce mémoire, qui est le fruit de
leur amour, leurs encouragements et sacrifices.

Douaa

4
 Résumé

La culture des agrumes est l'une des plus répandues, dans les pays méditerranéens.
Cependant, ces agrumes sont exposés à de nombreuses maladies post-récolte, généralement
causées par le pathogène « Penicillium digitatum ». Plusieurs fongicides chimiques utilisés
pendant des décennies, se sont révélés nocifs pour la santé et l'environnement. Le contexte sociétal
et règlementaire évoluant, de nouvelles stratégies sont envisagées pour tendre vers des solutions
plus sûres. C'est pourquoi, les travaux visent à développer un biopesticide utilisant les molécules
naturelles issues d'une algue verte pour la protection des agrumes. Or, l'action des molécules
actives dépend de la méthode de formulation.
Les algues vertes Ulva lactuca sélectionnées pour cette étude sont présentes en abondance sur les
zones côtières Libanaises. Plusieurs extraits ont été réalisés par macération à l'aide de solvants
verts (eau, éthanol, acétate d'éthyle) pour obtenir différentes compositions en métabolites
secondaires. Parmi ces molécules lipophiles ou hydrophiles, certaines sont à l'origine de l'activité
anti-fongique détectée pour les extraits. Le mécanisme d’action des fractions actives (extraits bruts
et chlorophylles isolées) sur P. digitatum a été étudié en mesurant l’activité des enzymes de défense
des cellules des agrumes. Les enzymes β-1,3-glucanase et peroxydases ont été identifiées comme
étant responsables de la dégradation de la paroi cellulaire fongique. De plus, afin de préserver
l'activité des extraits aqueux pendant plusieurs mois, une microencapsulation par atomisation a été
réalisée à l’aide de biopolymères.
Afin de limiter la consommation en molécules actives et de faciliter leur adhérence à la surface
des fruits, l'extrait aqueux d'Ulva lactuca a été formulé sous forme d'une émulsion huile-dans-eau.
Pour cela, des émulsifiants biosourcés ont été synthétisés en respectant les principes de la chimie
verte. Le caractère amphiphile de ces aconitates ayant été mis en évidence, ils se sont avérés
capables de stabiliser une émulsion contenant l'extrait aqueux d’Ulva lactuca. Plusieurs tests
microbiologiques ont montré l'efficacité des nouveaux ingrédients (fraction aqueuse et agent
émulsifiant) vis-à-vis de la multiplication, de l’adhésion et de la germination du Penicillium
digitatum. Ainsi, la mise en émulsion de l'extrait aqueux optimise son activité anti-fongique, en
assurant une diffusion homogène des molécules actives vers la surface à traiter, puis en formant
un film d’huile protecteur. Enfin, des tests in vivo sur 6 semaines ont montré que les émulsions et
l’extrait aqueux permettent de réduire de façon importante le taux d’infection des oranges.
En conclusion, ces travaux proposent des ingrédients naturels ou biosourcés mis en œuvre par des
procédés écocompatibles pour apporter une solution alternative à la conservation des agrumes
après récolte.
Mots clés : Ulva lactuca, extraction, solvant vert, émulsifiant biosourcé, activité anti-fongique,
contrôle post-récolte.

5
 Abstract
Citrus cultivation is one of the most widespread in the Mediterranean countries. However,
these citrus fruits are exposed to many post-harvest diseases, usually caused by the pathogen
"Penicillium digitatum". Several chemical fungicides used for decades have proven to be harmful
to health and the environment. With the societal and regulatory context evolving, new strategies
are being considered to move towards safer solutions. Therefore, the work aims to develop a
biopesticide using natural molecules from a green alga for the protection of citrus fruits. However,
the action of the active molecules depends on the method of formulation.

The Ulva lactuca green algae selected for this study are abundant in the Lebanese coastal areas.
Several extracts were made by maceration with green solvents (water, ethanol, ethyl acetate) to
obtain different compositions of secondary metabolites. Among these lipophilic or hydrophilic
molecules, some are at the origin of the anti-fungal activity detected for the extracts. The
mechanism of action of active fractions (crude extracts and isolated chlorophylls) on P. digitatum
was studied by measuring the activity of the defense enzymes of citrus cells. The enzymes β-1,3-
glucanase and peroxidases have been identified as being responsible for fungal cell wall
degradation. In addition, in order to preserve the activity of the aqueous extracts for several
months, microencapsulation by atomization was carried out using biopolymers.

In order to limit the consumption of active molecules and to facilitate their adhesion to the fruit
surface, the aqueous extract of Ulva lactuca was formulated in the form of an oil-in-water
emulsion. For that, biosourced emulsifiers were synthesized respecting the principles of green
chemistry. The amphiphilic character of these aconitates gives them, the ability to stabilize an
emulsion containing the aqueous extract of Ulva lactuca. Several microbiological tests showed the
effectiveness of the new ingredients (aqueous fraction and emulsifying agent) towards the
multiplication, adhesion and germination of Penicillium digitatum. Thus, the emulsification of the
aqueous extract optimized its anti-fungal activity, ensuring a homogeneous diffusion of the active
molecules to the surface to be treated, then forming a protective vegetable oil film. Finally, in vivo
tests over 6 weeks indicated that emulsions and aqueous extract can significantly reduce the
infection rate of oranges.

In conclusion, this work proposes natural or biobased ingredients implemented by ecocompatible

processes to provide an alternative solution to citrus fruit postharvest preservation.
Keywords: Ulva lactuca, extraction, green solvent, biosourced emulsifier, antifungal activity,
postharvest control.

6
 Valorisation scientifique dans le cadre strict de la thèse

Publications

Douaa Salim, Pascale de Caro, Othmane Merah, Asma Chbani. Control of postharvest citrus
green mold using Ulva lactuca extracts as a source of active substances. Horticulturae, 2019,
Submitted.

Douaa Salim, Rayane Chahal, Josephine Al Alam, Maya Rima, Othmane Merah, Asma Chbani,
Pascale de Caro. Ulva lactuca induces defense responses against Penicillium digitatum;
postharvest green mold on citrus fruit. Postharvest Biology and Technology, 2019, Submitted.

Douaa Salim, Pascale de Caro, Vanessa Durrieu, Asma Chbani. Anti-fungal activity of
microencapsulated aqueous extracts from Ulva lactuca. Journal of Food Processing and
Preservation, 2019, Submitted.

Douaa Salim, Pascale de Caro, Asma Chbani, Xavier Chasseray, Alain Shum Cheong Sing.
Green seaweed extract formulated with biobased ingredients for postharvest citrus fruit
preservation. Crop Protection, 2019, Submitted.

Communications orales

Douaa Salim, Pascale de Caro, Asma Chbani. Élaboration des formulations à base des molécules
biosourcées et ecocompatibles. 2ème « Forum doctoral » à l'Ecole doctorale des sciences et de la
technologie de Beyrouth. September 27, 2017, Beirut-Lebanon.

Douaa Salim, Josephine Al-Alam, Ziad Fajloun, Maurice Millet, Pascale de Caro, Asma Chbani.
Green seaweed Ulva lactuca and green Plant Spinacia oleracea used as biocontrol agents for
postharvest citrus fruit. 7th edition CIPAM, International congress on medicinal and aromatic
plants. June 25-28, 2018, Toulouse-France.

Douaa Salim, Josephine Al-Alam, Ziad Fajloun, Maurice Millet, Pascale de Caro, Asma
[Link] Chemical Composition of Green seaweed Ulva lactuca and Green High Plant

7
Spinacia oleracea. 2nd CIMEE, Second International Symposium on Materials, Electrochemistry
and Environement. October 18-20, 2018, Tripoli, Lebanon.

Douaa Salim, Pascale de Caro , Asma Chbani , X. Chasseray, A. Shum . Biobased emulsions
including platform molecule derivatives for biocontrol applications. The 15th edition of the International
Conference on Renewable Resources & Biorefineries. June 3-5, 2019, Toulouse-France.

Communications par affiches

Douaa Salim, Josephine Al-Alam, Ziad Fajloun, Maurice Millet, Pascale de Caro, Asma Chbani.
Inhibition of germination of Penicillium digitatumconidia by seaweed extracts used as bio control
agent for post harvested citrus fruits. 24th International Scientific Conference “Sciences, Social
Equity and Sustainable Development”, April 25-26, 2018, Balamand Al Kurah- LEBANON.

Formations

Catégorie : International, Langues :

 Atelier : « Create your CV in English » : 1 jour (23 avril 2018) PROGRESS - 2 impasse
Michel Labrousse - La Maison des lois - 31100 Toulouse
Catégorie : Méthodologie de la thèse recherche documentaire et publication
 Atelier : « Personnaliser un style bibliographique pour Zotero ou Mendeley avec le codage
CSL » : 1 jour (29 mai 2017) Université Fédérale de Toulouse Midi-Pyrénées - Maison de
la Recherche et de la Valorisation (MRV) 118 route de Narbonne
 Atelier : « Publier dans les revues scientifiques » : enjeux et modalités pratiques à l’heure
du numérique - 1 jour (26 janvier 2018) Université Fédérale de Toulouse Midi-Pyrénées -
Maison de la Recherche et de la Valorisation (MRV) 118 route de Narbonne
 Atelier « Logiciel de traitement de texte professionnel LaTex» : 3 jours (12 octobre 2017)
Agence de la Francophonie (AUF)-Tripoli-Liban.
Catégorie: Poursuite de carrière
 Atelier « Savoir se présenter en 3 minutes devant un recteur » : 1 jour (08 mars 2018)
PROGRESS - 2 impasse Michel Labrousse - La Maison des lois - 31100 Toulouse
 Atelier « DOCTORIALES » : 6 jours pour préparer les doctorants à intégrer l'entreprise. ALBI
(17 juin 2018) Ecole des Mines d'ALBI - allée des sciences - 81000 ALBI

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 Catégorie: Scientifique
 Atelier : « Ethique et intégrité scientifique » : 1 jour (29 mai 2018) Université Fédérale de
Toulouse Midi Pyrénées - Maison de la Recherche et de la Valorisation (MRV) 118 route de
Narbonne
 Atelier : « Preterm Labor Detection » : 1 jour (1 février 2017) Université libanaise- Centre
AZM pour la Recherche en Biotechnologie et ses Applications
Rue El Mitein, Tripoli, LIBAN
Catégorie : Pratiques pédagogiques pour l'Université
 Atelier : « Découvrir ce qu’est apprendre pour enseigner plus efficacement » : 1 jour (18
février 2019) Université Fédérale de Toulouse Midi Pyrénées- Maison de la Recherche et
de la Valorisation (MRV) 118 route de Narbonne
 Co-encadrement des étudiantes 3èmes années (projet 3A) avec [Link] De Caro et Dr.
Vanessa Durrieu- (Decembre 2017-Fevrier 2018) ENSIACET-INP/ Toulouse-France

9
Table des matières

Chapitre 1 : Analyse bibliographique ..................................................................................................... 22

I. Partie 1 : ............................................................................................................................................. 22
A. Traitement post-récolte des agrumes au Liban ............................................................................. 22
1. La production d’agrumes au Liban ............................................................................................ 22
2. Les Pesticides ................................................................................................................................. 24
2.1. Définition ................................................................................................................................. 24
2.2. Classification............................................................................................................................ 25
2.3- Emploi intensif des pesticides à usage agricole ....................................................................... 26
2.3.1- Effets sur la santé humaine ............................................................................................... 26
2.3.2- Effet des pesticides sur l’environnement .......................................................................... 26
2.4- Usage des pesticides en France................................................................................................ 27
2.5- Usage des pesticides au Liban ................................................................................................. 28
3. Les maladies phytopathogènes..................................................................................................... 29
3.1. Définition d'une maladie de plante : ........................................................................................ 29
3.2. Les microorganismes attaquant les agrumes ............................................................................ 30
3.2.1. Penicillium digitatum ........................................................................................................ 30
3.3. Les approches de lutte contre les agents pathogènes. .............................................................. 31
3.3.1. Traitement thermique ........................................................................................................ 31
3.3.2. Traitement chimique ......................................................................................................... 32
3.3.3. Traitement biologique ....................................................................................................... 34
3.3.4. Utilisation des biopesticides.............................................................................................. 35
[Link]. Généralités ................................................................................................................. 35
[Link]. Classification des biopesticides.................................................................................. 36
4. Contexte réglementaire des pesticides et biopesticides .............................................................. 39
5. Utilisation des algues marines comme biopesticides .................................................................. 42
5.1. Généralités sur les algues marines ........................................................................................... 42
5.1.1. Les algues vertes ............................................................................................................... 43
6. La macroalgue verte Ulva lactuca ................................................................................................ 44
6.1. Généralités ............................................................................................................................... 44
6.2. Localisation géographique au Liban ........................................................................................ 45
6.3. Composition biochimique ........................................................................................................ 46

10
 6.3.1. Les minéraux ..................................................................................................................... 46
6.3.2. Les pigments ..................................................................................................................... 48
6.3.3. Les polysaccharides .......................................................................................................... 49
6.3.4. Les protéines ..................................................................................................................... 50
6.3.5. Les lipides ......................................................................................................................... 51
7. Méthodes de prétraitement et d’extraction appliquées aux algues .......................................... 53
7.1. Généralités ............................................................................................................................... 53
7.2. Prétraitement de la biomasse d'algues et de la procédure d'extraction..................................... 54
7.3. Extraction par solvant .............................................................................................................. 56
8. Activités biologiques de l’Ulva lactuca ........................................................................................ 57
8.1. Activité anti-oxydante .............................................................................................................. 57
8.2. Activité anti-microbienne ........................................................................................................ 58
8.3. Activité cytotoxique ................................................................................................................. 58
8.4. Activité antifongique................................................................................................................ 58
9. Contrôle post-récolte vis-à-vis de [Link] ............................................................................ 59
9.1. Mécanisme d’action des composés alternatifs aux fongicides dans les agrumes sur Penicillium
digitatum ......................................................................................................................................... 60
9.1.1. Induction des enzymes de défense dans les tissus des agrumes. ....................................... 60
9.1.2. Accumulation des espèces réactives oxygénées (ROS) .................................................... 62
9.1.3. La perte d’intégrité de la membrane ................................................................................. 62
9.2. Mécanisme d’action de Penicillium digitatum sur les cellules d’orange ................................. 64
II. Partie 2 : Procédé de formulation des extraits .............................................................................. 65
A) Formulation en émulsions végétales ........................................................................................ 65
1. Emulsions végétales....................................................................................................................... 65
1.1. Définition générale.............................................................................................................. 65
1.2. Types d'émulsion ..................................................................................................................... 65
1.3. Mécanisme de déstabilisation des émulsions ........................................................................... 67
1.4. Mécanisme de stabilisation des émulsions............................................................................... 69
1.5. Procédés d’émulsification ........................................................................................................ 71
1.6. Mesure de la stabilité d’émulsions. .......................................................................................... 72
1.7. Capacité émulsifiante d’un tensio-actif.................................................................................... 74
1.8. Rôle des émulsions................................................................................................................... 75
2. Synthèse des tensioactifs ........................................................................................................... 75

11
 2.1. Choix d’une molécule plateforme ............................................................................................ 75
2.1.1. Acide citrique : .................................................................................................................. 76
2.1.2. Acide aconitique ............................................................................................................... 76
2.2. Transformations en Chimie Verte ............................................................................................ 78
2.2.1. Indicateurs verts ................................................................................................................ 79
2.2.2. Réaction d’estérification ................................................................................................... 80
2.3. Synthèse et applications d’esters biosourcés................................................................................ 80
B) Formulations par microencapsulation ........................................................................................... 81
1. Microencapsulation....................................................................................................................... 81
1.1. Définition ................................................................................................................................. 81
2.2. Matière enrobant ...................................................................................................................... 82
2.3. Les procédés de microencapsulation........................................................................................ 83
2.3.1. Atomisation (ou spray-drying) .......................................................................................... 84
2.3.2. Efficacité de la matière enrobant et l’atomisation............................................................. 85
Chapitre 2 : Extraction de molécules d’intérêt et évaluation de leurs propriétés biologiques. ......... 88
Article I. Utilisation des extraits de l'algue verte Ulva lactuca comme source de substances actives
dans la lutte des moisissures vertes des agrumes après récolte. .............................................................. 88
Article II. Identification du mécanisme de défense contre Penicillium digitatum à l’origine de la
moisissure verte sur les agrumes........................................................................................................... 110
Chapitre 3 : Formulation des extraits aqueux d’Ulva lactuca. ........................................................... 137
Article III. Activité antifongique des extraits aqueux d’Ulva lactuca microencapsulés ..................... 137
Article IV. Extraits d’algues vertes formulés avec des ingrédients biosourcés pour la conservation des
agrumes après récolte. ........................................................................................................................... 162
Conclusion générale et perspectives ...................................................................................................... 194
Références bibliographiques .................................................................................................................. 198
Annexe...................................................................................................................................................... 214

12
Liste des figures
Figure 1: Composition des exportations du Liban (2016) - Source : Haut Conseil des douanes............... 18
Figure 2: Répartition de la superficie des agrumes au Liban (Moussa El hajj, 2010). .............................. 23
Figure 3 : Variation de la quantité d’agrumes produite en tonnes au Liban au cours des années. ............ 23
Figure 4: Evolution des quantités de phyotsanitaires vendus en France entre 2001 et 2015. .................... 27
Figure 5: Evolution des importations des pesticides au Liban (en milliers de dollars) entre 1985 et 2008
(FAOSTAT). ............................................................................................................................................... 28
Figure 6: Examen macroscopique d’oranges infectées par P. digitatum (a), Examen microscopique (x40)
P. digitatum en mycelium (b). .................................................................................................................... 31
Figure 7: Mode d'action des fongicides utilisés : (a) en préinfection, (b) en postinfection. ...................... 34
Figure 8: Carte des sites de collecte des algues le long de la côte libanaise (Kanaan et al, 2015). ........... 45
Figure 9: Teneur en pigments des algues étudiées par Ismail et al.2017. .................................................. 49
Figure 10: Schéma général du prétraitement de la biomasse algale et de la production d'extraits d'algues.
.................................................................................................................................................................... 55
Figure 11: Représentation schématique d’une émulsion a : Huile-dans-Eau, b : Eau-dansHuile, c : Eau-
dans-Huile-dans-Eau, d : Huile-dans-Eau-dans-Huile. ............................................................................... 66
Figure 12: Représentation schématique des différents mécanismes de déstabilisation pour une huile dans
l'eau émulsion. ............................................................................................................................................ 67
Figure 13: Mûrissement d'Ostwald. ........................................................................................................... 69
Figure 14: Représentation des différents procédés d’émulsification (Schubert et Engel, 2004). .............. 72
Figure 15: Représentation schématique de la distribution verticale des gouttelettes dans une émulsion
huile dans eau instable à la formation de crème : (I) système initial (couche unique) ; (II) temps
intermédiaires (trois couches) ; (III) système final (deux couches) (McClements, 2005). ......................... 73
Figure 16: Représentation schématique du crémage dans une huile dans l'eau polydispersée. ................. 74
Figure 17: Acide citrique. .......................................................................................................................... 76
Figure 18: Forme cis et trans de l'acide aconitique. ................................................................................... 77
Figure 19: Les douze principes de la chimie verte..................................................................................... 79
Figure 20: Présentation schématique du procédé d’atomisation (Murugesan and Orsat, 2012). ............... 85
Figure 21: Extraits réalisés par macération dans l’eau, l’éthanol, l’acétone et l’acétate d’éthyle. ............ 89
Figure 22: Rendements d’extraction de l’Ulva lactuca séchée (P= 240°C, 80 mg/min). .......................... 89
Figure 23:Teneurs en polyphénols totaux des fractions aqueuses et éthanoliques d’Ulva lactuca. .......... 91
Figure 24: Schéma de l'estérification de l'acide aconitique. .................................................................... 163

13
Liste des Tableaux

Tableau 1: Pesticides associés au cancer (Sadowska et al. 1994). ............................................................ 26

Tableau 2: Composés antifongiques et leurs sites d'action (Ben E De Pauw, 2000). ................................ 32
Tableau 3: Exemples d'extraits des plantes avec une activité antifongique (Ncama et al., 2019). ............ 38
Tableau 4: Composés majeurs des extraits d’algues (Mayer et al., 2009)................................................. 43
Tableau 5: Classification de l’algue verte Ulva lactuca (Guiry et al. 2008).............................................. 45
Tableau 6: Composition biochimique d'Ulva lactuca collectée de la baie d'Abu-Qir en Egypte (Ismail et
al.2017). ...................................................................................................................................................... 46
Tableau 7: Teneurs en éléments minéraux et en glucides chez l’Ulva lactuca issue des côtes égyptiennes
(El Said et al, 2013). ................................................................................................................................... 47
Tableau 8: Concentration en macroéléments et microéléments de l'extrait liquide aqueux d’Ulva lactuca
au Liban (Chbani et al. 2015)...................................................................................................................... 48
Tableau 9: Composition en monosaccharides de la macroalgue U. lactuca (Yaich et al.2011)................ 50
Tableau 10: Profil des acides aminés dans Ulva lactuca (Maehre et al.2014). ......................................... 51
Tableau 11: Teneur totale en lipides de différentes espèces d'algues Ulva (kendel et al.2015). ............... 52
Tableau 12: Profil en acides gras d'Ulva latuca (Yaich et al.2011). ......................................................... 53
Tableau 13: Extraction par solvant à partir de la biomasse algale............................................................. 55
Tableau 14: Procédés de microencapsulation (Ré, 2006). ......................................................................... 83
Tableau 15:Composition en acides gras de l’extrait d’Ulva lactuca réalisé à l’acétate d’éthyle (en %
relatifs). ....................................................................................................................................................... 90
Tableau 16: Economy d’atome (AE) calculées pour la synthèse des esters d’aconitate. ........................ 164
Tableau 17: E-factors calculés pour la synthèse des aconitates d’esters. ................................................ 165
Tableau 18: Calcul de l’efficacité massique de la synthèse des aconitates d’esters. ............................... 165

14
Liste des abréviations

Absorbance
A
AGS Acides gras saturés
ANSES Agence française de Santé et sécurité alimentaire
environnementale et professionnelle
AGPI Acides gras polyinsaturés
ARLA Agence de réglementation de lutte antiparasitaire du
Quebec
ATPase Adénosine triphosphatase
ATP Adénosine triphosphate cellulaire
BPIA Biopesticides Industry Alliance
CAZYmes Active-carbohydrate enzymes
CCM Chromatographie sur couche mince
Chl Chlorophylle
Ch Ul. PFe Chinese Ulva lactuca Feed powder
Ch Ul. PFo Chinese Ulva lactuca Food powder
CE Capacité émulsifiante
CFU Colony-forming units
CMC Concentration micellaire critique
CMI Concentration minimale inhibitrice
DGAL Direction Générale de l’alimentation
DPPH 1-diphényl-2-picrylhydrazyle
DW Dry Weight
EMR Efficacité Massique de Réaction
EPA Environmental Protection Agency
FAO Food and agriculture organization of the united stations
FTIR Fourier transform infrared spectroscopy

15
GSH Glutathion
HPLC High-performance liquid chromatography
IA Index adhesion

IMZ Imazalil
IDAL Autorité libanaise pour le développement des
investissements
Leb Ul. Lebanese Ulva lactuca
LSD Least significant difference
MEA Malt Extract Agar
MS Matière sèche
ND Non determine
PAL Phénylalanine ammoniac-lyase
PBT Persistant, bioaccumulatif et toxique
PBS Phosphate-Buffered saline
PDB Potato dextrose broth
PIB Produit intérieur brut
PLs Lyases de pectine
POPs Polluants organiques persistants
PR Protéines liées à la pathogenèse
Rf Rapport frontal
ROIs Intermédiaires d’oxygène réactifs
SAE Seaweed aqueous extracts
SFE Extraction par fluide supercritique
SLEs Seaweed liquid extracts
SOE Organic extracts (acetone, ethanol and ethyl acetate)
SOPP Sodium orthophenyl phonate
TBZ Thiabendazole
TBARS Acide thiobarbiturique

16
TLC Thin Layer Chromatography
UL Ulva lactuca
USAID Agence des Etats-Unis pour le développement
international.

17
 Introduction générale

Au Liban, le secteur de l’agriculture génère environ 4% du produit intérieur brut (PIB) selon
l’autorité libanaise pour le développement des investissements (IDAL) [1]. Il emploie environ 6%
de la main-d'œuvre libanaise et constitue le 5ème employeur du pays. Les exportations de produits
agricoles ont augmenté ces dernières années pour atteindre 465 tonnes en 2016, principalement en
raison de la demande croissante de produits frais des pays du Golfe. La composition des
exportations du Liban (2016) a montré que 22% des produits agricoles exportés étaient des
agrumes, ce qui représente le pourcentage le plus élevé (Figure 1).

Figure 1: Composition des exportations du Liban (2016) - Source : Haut Conseil des douanes

La culture des agrumes est une activité commerciale et industrielle agronomique importante. Les
agrumes sont largement consommés, à la fois en fruits frais et en jus, non seulement pour son goût,
mais aussi en raison de sa teneur en vitamine C et de son activité antioxydante.

Cependant, ces agrumes au Liban souffrent de deux problèmes majeurs depuis la récolte jusqu’à
leur mise en vente. Le premier se traduit par une diminution de l’humidité pendant la période de
stockage, ce qui entraîne une perte de poids aboutissant à une diminution des revenus et bénéfices.
Le deuxième problème, réside dans le fait que les agrumes sont caractérisés par une sensibilité

18
élevée aux infections microbiennes (les moisissures verte et bleue) causées par les champignons ;
Penicillium digitatum et Penicillium italicum respectivement.

Ces champignons sont responsables de la majorité des pertes post-récoltes des agrumes cultivés
dans des conditions de climat méditerranéen [2-3]. Les besoins des clients sont clairs. Les
scientifiques et les chercheurs ont développé de nombreuses solutions depuis le siècle dernier et
travaillent toujours sur des solutions différentes les unes des autres.

La solution couramment utilisée actuellement dans le monde, et au Liban en particulier, consiste

à utiliser des fongicides chimiques. Les produits frais sont normalement traités avec des fongicides
immédiatement après la récolte afin de prévenir les infections, la contamination et l’inhibition de
la germination des spores de champignons [4]. L'application de fongicides chimiques sur les
agrumes a soulevé des problèmes de santé [5]. La toxicité résiduelle, la cancérogénicité et la
pollution de l'environnement, ainsi que le développement de nouvelles souches fongiques
résistantes, atténuent le succès des fongicides chimiques [6]. Les chercheurs s'efforcent ainsi de
trouver l'équilibre dans lequel la qualité des aliments est préservée sans sacrifier la sécurité des
consommateurs [7].

Au cours de la dernière décennie, on note un regain d’intérêt pour les composés actifs d'origine
naturelle en tant qu'alternatives aux substances synthétiques. Bien que ces composés présentent
souvent une activité plus faible, ils ne laissent pas de résidus toxiques sur les végétaux et leur
environnement, ce qui répond aux dernières directives européennes (paragraphe 6 de l’article 3 de
la directive 2009/128/CE du 21 octobre 2009) [8].
L’utilisation des composés naturels est l'une des stratégies visant la réduction des fongicides
chimiques au cours de manutention post-récolte et de stockage des fruits et légumes [9].

Les extraits d’algues marines vertes riches en substances bioactives ont été déjà mentionnées
comme une alternative naturelle à des produits toxiques [10]. Parmi les composés fonctionnels
identifiés à partir d'algues marines, les pigments naturels ont reçu une attention particulière. Ces
pigments présentent différentes activités biologiques bénéfiques comme anti-oxydants, anti-
cancéreux, anti-inflammatoires, anti-obésité, anti-angiogéniques ainsi que des activités
neuroprotectrices [11].

19
Compte tenu de la richesse des côtes libanaises en algues, l’exploitation de cette matière première
végétale apparait comme une opportunité pour l’élaboration de formulations pour lutter contre le
Penicillium digitatum. Les composés naturels présents dans les extraits d’algues sont susceptibles
de répondre aux cahiers des charge d’un biopesticide destiné au traitement des agrumes.

C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail de thèse dont l’objectif principal est
d’évaluer l’activité antifongique in vitro et in vitro des extraits obtenus, contenant des pigments
(chlorophylles, carotènes et xanthophylles) et des polysaccharides sulfatés (ulvane) issus de
l’algue verte Ulva lactuca. Leur mécanisme d’action sur [Link] est également élucidé. Le
second objectif vise à proposer des formulations capables de stabiliser les extraits d’algues et de
faciliter leur application et leur action.
Ces objectifs justifient la co-tutelle de ce travail entre le Laboratoire de Biotechnologie
Appliquée : Biomolécules, Biothérapies et Bioprocédés (centre AZM) à l’université Libanaise et
le Laboratoire de Chimie Agro-industrielle de l’ENSIACET (Toulouse INP). L’expertise d’un
troisième laboratoire, le Laboratoire de Chimie des substances naturelles et des Sciences des
aliments (LCSNSA) de La Réunion a été sollicitée concernant les propriétés des agents
émulsifiants synthétisés.

Le manuscrit de thèse présenté dans ce document s’organise en trois chapitres répartis comme
suit :

Le chapitre 1 propose une mise au point bibliographique, tout d'abord, sur la répartition et la
production des agrumes au Liban, puis sur l’utilisation des biopesticides pour lutter contre les
maladies post-récolte des agrumes causées par le pathogène [Link]. Sont également
présentées les méthodes d'extraction usuelles, les compositions biochimiques des algues vertes
ainsi que les activités biologiques jusqu'alors détectées pour les extraits d'algues vertes. Les
méthodes pour préparer des émulsions végétales sont également abordées, ainsi que les voies de
synthèse conduisant à un agent émulsifiant. En dernier lieu, les procédés de la microencapsulation
sont évoqués dans le but de stabiliser les molécules actives.

Le chapitre 2 est consacré à la préparation d'extraits de l'algue verte Ulva lactuca provenant du
Liban et de la Chine pour lutter contre [Link]. Le chapitre se compose de cinq parties
distinctes : (i) L’extraction par des solvants verts (ii) l’identification des chlorophylles et des

20
ulvanes par analyses chromatographiques, (iii) Les mesures du potentiel antifongique des extraits
aqueux (SAE) et des extraits organiques (acétone, éthanol et acétate d'éthyle) (SOE) (iv) la
réalisation de tests in vivo à l'échelle laboratoire et industrielle (v) l'étude de l'activation des
mécanismes de défense des agrumes vis-à vis de [Link]

Quatre approches in vitro ont été mises en œuvre. L’inhibition de la germination des spores de
Penicillium digitatum sur le milieu de dextrose de pomme de terre (PDB), la viabilité des
champignons sur la gélose à l'extrait de malt (MEA), l’adhésion des spores sur les cellules
épidermiques des oranges et finalement, la méthode de diffusion sur disque gélosé.

Les résultats dans ce chapitre sont présentés sous forme de deux articles s’intitulant ; « Control of
postharvest citrus green mold using Ulva lactuca extracts as a source of active substances » et
« Ulva lactuca induces defense responses against Penicillium digitatum; postharvest green mold
on citrus fruit ».

Le chapitre 3 est consacré à la formulation des extraits aqueux obtenus. Tout d'abord, la
microencapsulation des extraits réalisée par atomisation a été évaluée pour conserver l'activité anti-
fongique des molécules actives. Un autre type de formulation a été envisagé, la réalisation d'une
émulsion à l'aide d'un agent émulsifiant biosourcé. Ce dernier a été synthétisé à partir d’une
molécule plateforme, l’acide aconitique, selon un procédé évalué par des indicateurs verts. Les
résultats dans ce chapitre font l’objet de deux articles s’intitulant : « Green seaweed extract
formulated with biobased ingredients for postharvest citrus fruit preservation » et « Anti-fungal
activity of microencapsulated aqueous extracts from Ulva lactuca ».

A la fin du manuscrit, une conclusion générale amenant à quelques perspectives est présentée.

21
 Chapitre 1 : Analyse bibliographique

I. Partie 1 :
A. Traitement post-récolte des agrumes au Liban
1. La production d’agrumes au Liban
Au Liban, les plantations d’agrumes représentent une superficie totale de 99,939 ha au titre
de la campagne agricole de 2010 et sont essentiellement localisées au niveau de la plaine côtière
de la Mohafaza du Sud et le littoral du Mont-Liban jusqu'à Jbeil. Selon les chiffres issus du
ministère de l’agriculture Libanais, la culture des agrumes se trouve majoritairement dans le Sud
avec près des deux tiers de la superficie cultivée (64%) suivie par la région Akkar (14%) et par le
Liban Nord (12%) (Figure 2).

Les principales variétés cultivées sont les oranges, les mandarines, les citrons et les
pamplemousses. Les agrumes sont un terme commun et un genre de plante à fleurs de la famille
des rutacées. Les agrumes sont l’une des cultures vivrières les plus populaires au monde. De
nombreuses espèces sont cultivées pour leurs fruits qui sont consommés frais ou transformés en
jus. Le jus contient une grande quantité d’acide citrique, ce qui lui donne cette saveur particulière;
il est également une bonne source de vitamine C et de flavonoïdes [12].

Les principales variétés d’agrumes cultivées au Liban sont les suivantes : la variété Valencia
représente 3 000 ha, tandis qu’environ 2000 ha de Navel Washington et 1200 ha de Sweet Blood
Java sont comptabilisés [13].

La production des agrumes au Liban s’élevait à 230 497 tonnes en 2013 (source l’Organisation
des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture, FAO) (FAOSTAT, 2016) [14]. La
production d’agrumes a atteint un maximum (464,318 tonnes) en 1991 puis entre 2004 et 2007,
avant d’entamer une diminution régulière pour se stabiliser à 306,924 tonnes en 2017.

Les principaux importateurs d’oranges libanaises sont les pays arabes dont l’importateur
majoritaire est l’Arabie Saoudite qui représente près de 45% des exportations libanaises [15].

22
Figure 2: Répartition de la superficie des agrumes au Liban (Moussa El hajj, 2010).

Figure 3 : Variation de la quantité d’agrumes produite en tonnes au Liban au cours des années.

23
Les agrumes sont traditionnellement l'un des produits agricoles qui s'exporte le plus à l'étranger.
Mais le secteur est en déclin au Liban : la production totale a baissé de 45 % entre 2007 et 2013,
d'après un rapport de l'Agence des États-Unis pour le développement international (Usaid), publié
en 2013. Comme tous les autres fruits et légumes libanais, qui sont exportés en grande partie vers
le Golfe, les exportations d'agrumes sont en chute libre depuis la fermeture de la frontière syro-
jordanienne en avril 2015. En 2016, les exportations avaient diminué de moitié par rapport à 2012
[16].

La faible rentabilité des agrumes est liée à des problèmes structurels qui minent le secteur depuis
longtemps, dus à des coûts élevés de production. Le rapport Usaid indique que si les agriculteurs
étaient organisés en coopératives, cela permettrait d’amortir certains coûts de production. De plus,
les agriculteurs libanais suivent des pratiques traditionnelles, pas toujours conformes aux normes
internationales.

Il faut être vigilent sur l’utilisation excessive et non contrôlée de pesticides cancérigènes qui
peuvent pénaliser la filière. Dans le quotidien L’Orient-Le Jour daté du 10 novembre 2009, Le
ministre de l'Environnement, Antoine Karam, a dénoncé l'usage « arbitraire » des pesticides par
les agriculteurs. En effet, les taux de pesticides contenus dans presque la moitié de la production
nationale de fruits et légumes sont anormalement élevés. Cette pratique peut être à l’origine de la
prolifération et la résistance de certains agents pathogènes fongiques post-récolte aux quelques
fongicides utilisés [17].

2. Les Pesticides
2.1. Définition

L’agence de protection environnemental (EPA) des États-Unis définit un pesticide

comme étant « toute substance ou mélange de substances destiné à prévenir, détruire, repousser ou
atténuer tout organisme nuisible » [18].

Les pesticides sont largement utilisés pour protéger les cultures contre les organismes
nuisibles tels que les mauvaises herbes, les plantes pathogènes ou les parasites. Toutefois,
l'utilisation de pesticides peut également être associée à des risques pour l'environnement

24
(pollution des sols et des nappes phréatiques) et la santé humaine principalement par l'exposition
des agriculteurs ou par la contamination des denrées alimentaires [5].

2.2. Classification

Les pesticides les plus courants sont classés selon leur rôle fonctionnel et selon la famille
chimique. Dans le premier cas, les pesticides sont répertoriés selon le type d’organisme à éliminer
et sont alors répartis comme suit [19] :

Les herbicides, le rôle est de détruire ou d’empêcher la croissance des végétaux indésirables et des
herbes qui peuvent entrer en concurrence avec les cultures agricoles. Les molécules actives des
herbicides englobent diverses catégories de fonctions chimiques: acides carboxyliques,
aliphatiques, amides, chloroacétanilides, benzonitriles, dinitrophénylamines, phénols et autres
[20].

Les insecticides : substances qui ont pour rôle d’éliminer les insectes considérés comme nuisibles
ou indésirables pour les plantes et cela en exerçant sur ces dernières des actions neurotoxiques,
régulatrices de croissance et inhibitrices de la respiration. Leurs principes actifs sont généralement
des composés organochlorés qui ont été progressivement remplacés par des organophosphorés et
des carbamates considérés moins toxiques [19].

Les fongicides : substances qui ont pour rôle de lutter contre les parasites comme les champignons
ou les moisissures.

La 2ème classification consiste à répartir les pesticides selon la nature chimique de la substance
active majoritaire :

Les organochlorés : issus de l’industrie du chlore tels que le dichlorodiphenyltrichloroéthane, le

lindane, le chlordane… Les organophosphorés : amides ou esters des acides phosphoriques,
phosphonique, thiophos-phorique et thiophosphonique (diazinon, dichlorovos, malathion...). Les
carbamates formés par des sels ou esters d’acide carbamique (carbaryl, propoxure...). Les triazines
(atrazine, propazine, simazine ...). Les urées substituées incluant plusieurs groupes fonctionnels :
phényluréases [21-24].

25
2.3- Emploi intensif des pesticides à usage agricole

2.3.1- Effets sur la santé humaine

La révolution verte nous a enseigné que l'emploi intensif de pesticides et d'engrais est nocif
pour les écosystèmes et par conséquent pour la santé de l’animal et de l’homme. Plus de 150 études
réalisées dans 61 pays et régions du monde ont abouti à la constatation de présence des résidus de
pesticides dans les tissus adipeux, le cerveau, le sang, le lait maternel, le foie, le placenta, le sperme
et le sang du cordon ombilical [25]. L’épidémiologie a ainsi montré que les personnes exposées
aux pesticides encourent plus de risques de développer de nombreuses pathologies telles que la
leucémie, l’asthme, l’allergie ainsi que les perturbations endocriniennes et les cancers [26]
(Tableau 1). De plus, maintes preuves suggèrent une relation entre les pesticides et les anomalies
congénitales, la diminution du poids à la naissance et la mort fœtale [27].

Tableau 1: Pesticides associés au cancer (Sadowska et al. 1994).

Type Cancer Pesticide(s) Famille chimique

Tous cancers Diazinon Organophosphate
Poumon Chlorpyrifos Organophosphate
Pancréas EPTC Thiocarbamate
Colon Dicamba Benzoic acid
Rectum Chlordane Organochlorine
Leucémie Fonofos Organophosphate
Mélanome Carbaryl Carbamate

2.3.2- Effet des pesticides sur l’environnement

Il a été estimé que moins de 0.1% des pesticides atteigne les organismes nuisibles cibles, le
reste passe dans l’environnement et contamine le sol, l’air et l’eau en affectant des organismes non
visés [28]. Il est indéniable que la contamination du sol est causée par les pesticides contenant des
polluants organiques persistants (POPs) qui peuvent rester dans la nature plusieurs années altérant
ainsi la biodiversité et la qualité du sol [29], [30].

26
 Le lessivage des particules polluantes dans le sol et la propagation des pesticides volatiles
par l’eau de pluie, assurent la contamination des eaux souterraines et superficielles. On assiste par
conséquent à une eau impropre à la consommation et à une perturbation de l’écosystème marin
[31].

2.4- Usage des pesticides en France

Sur le plan mondial, les systèmes actuels de gestion agricole et de production végétale
reposent sur l'utilisation d'herbicides, de fongicides et d'insecticides à une quantité d'environ
3,3×106 tonnes/an, dont 0,42×106 tonnes/an pour l’Europe [32].

Avec un chiffre d’affaires de 1,9 milliards d’euros, la France était considérée comme le premier
marché européen des phytosanitaires en 2010. Cette valeur a augmenté de 5% en 2012 pour
atteindre près de 2 milliards d’euros [33]. Les quantités de pesticides vendues en France entre 2001
et 2015 sont présentées dans la figure 4. On remarque que depuis 2009, les ventes stagnent. Les
fongicides représentent la famille des pesticides la plus vendue par rapport aux insecticides et aux
herbicides. Les quantités de fongicides vendus ont bien diminué entre 2001 et 2015, passant de
54000 tonnes à 27000 tonnes, mais ceci a été accompagné par une augmentation dans les quantités
d’herbicides et insecticides vendus [33].

Figure 4: Evolution des quantités de phyotsanitaires vendus en France entre 2001 et 2015.

27
Bien que les produits actuellement utilisés soient considérés moins nocifs pour l'environnement
que les pesticides organochlorés interdits, de nombreux pesticides encore utilisés dans le monde
sont assez persistants et toxiques. Ainsi, 150 des matières actives approuvées par l'Union
Européenne présentent une toxicité aiguë (niveau 1), neuf affectent négativement la reproduction
(niveaux 1A/1B) ou sont des perturbateurs endocriniens, six peuvent avoir des propriétés
cancérigènes et environ 50 composés correspondent aux critères PBT (persistant, bioaccumulatif
et toxique). Par conséquent, un plan qui visait à réduire de 50 % l’usage des produits
phytosanitaires en France à l’horizon 2018 a été mis en place en 2010 sous le nom de plan
Ecophyto 2018 [33].

2.5- Usage des pesticides au Liban

Au Liban, les chiffres de la banque de données « FAOSTAT » de l’Organisation des Nations Unies
pour l’Alimentation et l’Agriculture FAO (Food and Agriculture Organisation of the United
Nations) sur les importations de pesticides fournit une indication sur les pratiques d’utilisation des
produits phytosanitaires au Liban et de leur évolution. La figure 5 révèle une augmentation lente
et régulière des importations de substances actives phytosanitaires jusqu’à 1997. Finalement ceux-
ci ont remonté depuis 2001 pour doubler en 2008 avec un creux en 2006.

Figure 5: Evolution des importations des pesticides au Liban (en milliers de dollars) entre 1985 et 2008
(FAOSTAT).

28
En 1992, le ministère de l'Agriculture a établi une liste des pesticides officiellement interdits,
cependant, peu de contrôles sont effectués et les interdictions ne sont pas respectées. Même les
produits bannis sont disponibles par des moyens illégaux et utilisés par les publics non-formés, en
plus de l'utilisation abusive de plusieurs molécules, indépendamment de tout risque de toxicité
pour la santé et l'environnement [34-35].

En ce qui concerne les produits phytosanitaires interdits, on peut citer le malathion, un insecticide
organophosphoré interdit par la commission européenne (CE) dans la décision 2007/389/CE mais
encore utilisé au Liban. De plus, depuis 2012, les résidus de ce pesticide dans les aliments sont
réglementés en Europe. Selon l'Agence française de Santé et sécurité alimentaire,
environnementale et professionnelle (ANSES), ce pesticide n'est pas toxique par lui-même mais il
peut se décomposer en donnant le malaoxon qui est connu pour provoquer la leucémie et inhiber
l'acétylcholinestérase. Le zineb est un autre pesticide interdit par l'Union européenne (UE) mais
vendu au Liban sous forme de soufre micronisé pour échapper à toute poursuite législative. On
note également au Liban, l’utilisation abusive et la pulvérisation en grandes quantités des
pesticides sans tenir compte des doses préconisées ce qui conduit à des dépassements par rapport
aux limites maximales de résidus (MRLs) fixées pour les aliments (FAOSTAT).

3. Les maladies phytopathogènes

3.1. Définition d'une maladie de plante :

Une maladie chez les végétaux peut être définie par une succession de réponses invisibles
et visibles des cellules et des tissus d'une plante, suite à l'attaque d'un micro-organisme ou à la
modification d'un facteur environnemental qui provoquent des bouleversements de forme, de
fonction ou d'intégrité de la plante. Ces réponses peuvent induire une altération partielle voire la
mort de la plante ou de certaines de ses parties. Les maladies des plantes sont parfois regroupées
par type de symptômes (pourriture racinaire, flétrissements, taches foliaires, rouilles, brouissures,
niellure), par types d'organes qu'elles affectent (maladies racinaires, maladies des tiges, maladies
foliaires), par type de plantes affectées (herbacées, maraîchères, ...), mais le critère le plus utile
reste la classification par le pathogène responsable de la maladie [36].

On peut classer les maladies des plantes comme suit [37]:

29
-Maladies infectieuses (biotiques) causées par des champignons, des procaryotes, des plantes
supérieures parasites, des virus et viroïdes, des nématodes, des protozoaires.

-Maladies non infectieuses (abiotiques) causées par un stress en température, le manque ou l’excès
d'humidité ou de lumière, le manque d'oxygène, la pollution atmosphérique, les déficiences
nutritionnelles, la toxicité minérale, l’acidité ou l’alcalinité du sol, la toxicité des pesticides et les
mauvaises pratiques culturales.

3.2. Les microorganismes attaquant les agrumes

Les maladies et parasites des agrumes sont nombreux et beaucoup n'ont pas de traitement
efficace. Les infections peuvent survenir au verger et ne se révéler qu'après récolte, ou contaminer
les fruits au cours des opérations de triage, d'emballage et d’entrepôt, et parfois même à l'échelon
domestique quelques jours seulement avant leur consommation.

Sur les agrumes, plus de 25 espèces différentes de pathogènes peuvent exister mais les plus
fréquentes sont les champignons tels que : Penicillium digitatum, Penicillium italicum,
Geotrichum citri-aurantii et Phytophthora.

Certaines espèces peuvent pénétrer les épidermes intacts, d'autres n'envahissent les tissus qu'à
l'occasion de blessures plus ou moins profondes. Les sources de contamination en entrepôt sont
nombreuses ; les produits frais peuvent être contaminés par des champignons et des bactéries
pendant la saison de croissance, ainsi que tout au long du processus, de la récolte jusqu’à
l’entreposage. De plus, la présence de débris végétaux dans les entrepôts permet aux
microorganismes de se multiplier en grand nombre et de devenir une importante source de
contamination pour les produits entreposés [38]. Les contenants utilisés lors de la récolte et de
l’entreposage, les appareils de traitement et de conditionnement ainsi que l’air et les parois des
entrepôts sont aussi des sources de contamination [39].

3.2.1. Penicillium digitatum

Au niveau mondial, Penicillium digitatum est l'un des agents pathogènes les plus dévastateurs,
avec le Penicillium Italicum, causant à eux d’eux jusqu'à 80% des pertes en agrumes par pourriture
[40]. P. digitatum est un champignon pathogène qui attaque uniquement au niveau de l’écorce
fragilisée ou « blessée » du fruit dans le verger, lors de sa distribution ou de sa commercialisation

30
(Figure 6). Il se reproduit très rapidement, et ses spores sont omniprésentes dans l'atmosphère, sur
les surfaces de fruits et sont facilement disséminées par les courants d'air. Il est facilement
détectable par sa couleur caractéristique verte/grise. La source d'inoculum fongique dans les
vergers d'agrumes et fruitières est pratiquement continue au cours de la saison [41]. En outre, il est
connu que le flavedo, la partie colorée externe de l'écorce est plus résistant à P. digitatum que
l'albédo, la partie blanche intérieure [42]. Ce fait a été classiquement associé à la présence des
composés antifongiques préformés et induits dans le flavedo [43].

(a) (b)

Figure 6: Examen macroscopique d’oranges infectées par P. digitatum (moisissures vertes) (a), Examen
microscopique (x40) P. digitatum en mycelium (b).

3.3. Les approches de lutte contre les agents pathogènes.

3.3.1. Traitement thermique

Le traitement thermique est une technique couramment utilisée dans l'industrie alimentaire.
Les champignons sont inactivés par la chaleur, comme dans la pasteurisation ou la stérilisation.
Cependant, les ascospores de certains champignons sont résistantes à la chaleur et peuvent survivre
à des températures élevées (85 º C), par exemple celles de Talaromyces macrosporus [44] . En
outre, la germination et la croissance sont empêchées par une faible pression d'oxygène et un ajout
des acides organiques qui sont utilisés pour préserver le fourrage de l'herbe dans les silos avec ce

31
qu'on appelle le processus d'ensilage. La faible concentration en oxygène et les acides organiques
dans les silos réduisent le métabolisme des champignons empêchant leur croissance. Abaisser les
activités aquatiques prévient également la croissance fongique. Néanmoins, certains champignons
osmotolérants et xérophiles sont capables de croître en présence de fortes concentrations de sucre
et de sel et peuvent causer une détérioration dans ces conditions [45].

3.3.2. Traitement chimique

De nos jours, un large éventail d'agents antifongiques est utilisé dans la lutte contre la
biodégradation et dans la prévention ou le traitement des maladies fongiques des plantes et pour
le traitement des maladies chez les animaux et les humains (Tableau 2) [45].

Tableau 2: Composés antifongiques et leurs sites d'action (Ben E De Pauw, 2000).

Les polyènes antifongiques comprennent trois composés principaux : la natamycine, la nystatine

et l'amphoteracine B. Ces composés agissent en augmentant la perméabilité de la membrane des
cellules fongiques, après la liaison aux stérols (par exemple, l'ergostérol) causant la mort de la
cellule [46]. Plusieurs tests de susceptibilité in vitro pour des agents antifongiques ont été
développés afin d'établir de meilleures approches chimio thérapeutiques contre les infections
fongiques. La Nystatine est utilisée dans les pratiques médicales, vétérinaires et agricoles, mais
elle est insoluble dans l'eau et toxique, surtout par sa néphrotoxicité dépendante de la dose [47].

Le Sodium ortho-phenylphenate (SOPP), le thiabendazole (TBZ), et l’imazalil (IMZ) sont parmi

les fongicides les plus couramment utilisés dans le monde quant à la lutte chimique utilisée en

32
post-récolte sur les fruits d’agrumes. Chacun possède un mode d'action différent, ils sont utilisés
seuls, combinés dans des mélanges, ou appliqués séparément en séquence.
SOPP est un hydrocarbure aromatique, il a la caractéristique de pénétrer au niveau des blessures
sur les fruits mais il n’est pas systémique. Il se trouve sous forme de solutions aqueuses à une
concentration de 2% ou sous forme d’émulsion dans des cires hydrophiles à une concentration de
1%. Le produit est généralement appliqué sous forme de bain mousseux.
Le Thiabendazole (TBZ) est appliqué sur les fruits d’agrumes par pulvérisation au niveau de la
chaîne de conditionnement ou par douchage comme prétraitement et particulièrement avant
déverdissage. TBZ est utilisé contre les pourritures à Penicillium à une concentration de 2000 ppm
en solution aqueuse et à une concentration de 4000 ppm dans la cire. Sur fruits pourris, la
sporulation n’est inhibée qu’à des concentrations de 4000 à 6000 ppm. En ce qui concerne
l’Imizalil ou l’Enilconazole, C’est un fongicide de la famille des imidazoles, il agit par inhibition
de la biosynthèse de l’ergostérol, il peut être utilisé en prétraitement des fruits qui vont subir le
déverdissage, mais il est uniquement employé au niveau de la chaîne de conditionnement. Selon
l’agence de protection environnemental, US EPA « l’Imazalil est identifié comme susceptible
d'être cancérogène chez l'homme », puisqu’il conduit à des troubles du développement et de la
reproduction chez les souris. Il faut noter que d’autres inhibiteurs de la biosynthèse d’ergostérol
sont utilisés [48].

Il y a globalement 2 types de fongicides : ceux qui ne sont pas absorbés par les tissus de la plante
et qui affectent la germination des spores (protectants). Ceux qui sont absorbés par la plante et qui
affectent la croissance du champignon (curatifs).

Les fongicides peuvent être utilisés selon deux modes d'intervention, soit en préinfection, soit en
postinfection. Un fongicide utilisé en préinfection est appliqué avant le début d'une période
d'infection. Le produit sera efficace seulement sur les feuilles et les fruits présents au moment de
la pulvérisation en supposant qu'aucun délavage par la pluie n'ait eu lieu. La molécule active agira
sur les premiers stades de développement du champignon comme la germination des spores (figure
7.a). Les fongicides utilisés en postinfection sont appliqués après une période d'infection. Ces
fongicides agissent sur un stade de développement plus avancé du champignon et empêchent celui-
ci de coloniser le tissu végétal (figure 7.b). Cette approche est efficace contre une infection non

33
prévue ou contre les infections graves (risques élevés). Elle permet de pallier à un délavage du
traitement précédent.

(a) (b)

Figure 7: Mode d'action des fongicides utilisés : (a) en préinfection, (b) en postinfection.

Les modes d'action des fongicides peuvent être divisés en deux grandes catégories : les fongicides
unisites et les fongicides multisites.

Les fongicides unisites agissent à un stade spécifique du développement du champignon. Ces

fongicides sont plus sujets au développement de résistance. Une seule mutation ou changement de
la part du champignon lui permet d'éviter l'effet du fongicide. La biosynthèse de composés
essentiels au développement du champignon, la respiration et les processus de division cellulaire
sont les cibles les plus communes des fongicides unisites.

Comme le nom l'indique, les fongicides multisites agissent à plusieurs niveaux du développement
du champignon. Ces fongicides sont ainsi beaucoup moins sujets au développement de la
résistance. La plupart des fongicides de contact et les éléments comme le soufre et le cuivre
appliqués en préinfection font partie de cette catégorie.

3.3.3. Traitement biologique

Le contrôle biologique des maladies en post-récolte a été utilisé comme une alternative pour les
fongicides synthétiques. Son mécanisme est basé sur les interactions écologiques, telles que la
concurrence spatiale, la recherche de nutriments ou l'induction de défense de la plante [49-52].
Traditionnellement, les levures sont les organismes les plus fréquemment utilisé comme agents de
lutte biologique en raison de leur colonisation rapide de la surface des plantes et leur production

34
de polysaccharides extracellulaires qui améliorent leur survie pour restreindre la colonisation et la
germination des pathogènes [53].
Des études réalisées par Pimenta et al., (2008) [54] ont montré que la levure prédateur
Saccharomycopsis schoenii présente la capacité de réduire la gravité de la maladie provoquée par
Penicillium italicum, P. digitatum et P. expansum en empêchant la formation des lésions sur la
surface des oranges pendant 21 jours.
De même une substance antifongique : 2-phenylethanol (PEA), isolé de Kloeckera apiculata a
démontré des propriétés antifongique contre les moisissures phylopathogènes d’agrumes [55].

3.3.4. Utilisation des biopesticides

[Link]. Généralités

Les augmentations récentes de la population ont entraîné une augmentation de la demande

alimentaire et, par conséquent, une plus grande utilisation des produits agrochimiques. Les
produits agrochimiques comprennent deux grands groupes de composés : les pesticides et les
engrais. Rappelons que les pesticides sont des substances utilisées pour prévenir, détruire ou
contrôler les ravageurs dans les cultures végétales [56]. Malgré leurs effets inhibiteurs sur les
ravageurs nuisibles aux végétaux et aux animaux, les pesticides peuvent également être toxiques
pour l'homme et polluer l'environnement [57]. Les inquiétudes concernant la perte de cultures
végétales dues à la présence de parasites, la demande accrue d'aliments sûrs et les conséquences
environnementales causées par l'utilisation de pesticides synthétiques démontrent l'importance de
développer des recherches dans le domaine des biopesticides. Il s'agit d'alternatives plus sûres
comparés aux pesticides synthétiques, en particulier grâce à leur biodégradabilité et leur origine
naturelle, car dérivées d'organismes vivants ou de leurs métabolites [58].

Les pesticides d'origine biologique peuvent agir efficacement dans la lutte antiparasitaire à travers
divers mécanismes, par exemple en inhibant la croissance, la nutrition, le développement ou la
reproduction d'un parasite ou d'un pathogène. Pour cela, les biopesticides libèrent des endotoxines
et des enzymes capables de dégrader la paroi cellulaire des organismes invasifs ou même de
provoquer des infections virales chez les parasites [59].

35
L’utilisation des biopesticides est en croissance et la production de biopesticides augmente
actuellement de 16% par an, soit près de trois fois celle des produits agrochimiques classiques, qui
croît à un taux de 5,5% par an. Ainsi de nouvelles substances actives ont été introduites avec
succès, en tant que biopesticides, dans le processus de protection. Ces composants spécifiquement
actifs comprennent les protéines, les polysaccharides et les petites molécules (alcaloïdes,
flavonoïdes, phénols, huiles essentielles) provenant de plantes, de protéines et de polysaccharides
de microorganismes, de polysaccharides d'algues et d'oligochitosane d'animaux [59].

[Link]. Classification des biopesticides

Les biopesticides sont classés selon l’Agence de réglementation de lutte antiparasitaire du Quebec
(ARLA), Biopesticides Industry Alliance (BPIA) et Environmental Protection Agency des États-
Unis (EPA), en plusieurs catégories, à savoir :

Les biopesticides microbiens sont formés par des bactéries, des champignons, des oomycètes,
des virus et des protozoaires. De nombreuses substances actives sont dérivées de ces différents
microorganismes, ce sont principalement ces substances qui procèdent contre le bio agresseur
plutôt que le microorganisme lui-même [60]. Ces biopesticides ont habituellement des effets létaux
ou inhibiteurs résultant d'une interruption physique ou biochimique de la croissance et du
développement de l'organisme nuisible (parasitisme, antagonisme ou allélopathie) [61]. En fait,
pour tous types de cultures confondus, le marché des biopesticides se décline en : 74% de
biopesticides bactériens, 10% de biopesticides fongiques, 5% de biopesticides viraux, 8% de
biopesticides prédateurs, et 3% de biopesticides autres [59].

Les bactéries

Les espèces appartenant au genre Bacillus sont les pesticides les plus largement utilisés dans ce
domaine, en particulier Bacillus thuringiensis largement utilisé comme biopesticide microbien
[62]. Cette bactérie ne nuit pas aux vertébrés et est sans danger pour l’homme et son
environnement. Les pulvérisations de B. thuringiensis sont efficaces pour la lutte contre les
ravageurs des cultures de fruits et légumes, lorsque la sélectivité et la sécurité sont recherchées ou
lorsque la résistance aux insecticides chimiques synthétiques pose des problèmes [63].

36
Des bactéries autres que le genre Bacillus ont été aussi utilisées comme biopesticides. Comme
exemple la souche Pseudomonas chlororaphis est utilisée dans la prophylaxie et le traitement de
certains champignons. Cette bactérie est capable d’agir contre les phytopathogènes par antibiose
directe, par compétition spatiale et nutritive ou par activation des défenses des plantes [60].

Les champignons

Environ 750 espèces, appartenant à 100 genres de champignons entomopathogènes ont été
signalés, mais seulement une dizaine d'entre elles ont été ou sont actuellement développées pour
la lutte contre les insectes [64].

Les champignons entomopathogènes peuvent être classés en deux groupes principaux : les
champignons biotrophes et les champignons nécrotrophes. Le premier groupe renferme des
champignons nécessitant des cellules vivantes de leurs hôtes. Cette catégorie de champignons est
très répandue dans de nombreuses régions, mais ils ne sont pas largement utilisés pour lutter contre
les parasites, car ils sont soit asymptomatiques chez les insectes, soit les changements causés par
les pathogènes sont difficiles à observer. Cependant, les champignons appartenant au deuxième
groupe vivent au détriment des cellules mortes ; ils doivent tuer leurs hôtes avant de les
consommer. Les champignons appartenant à ce groupe sont très efficaces dans leur attaque, pour
cette raison beaucoup d'entre eux sont des agents potentiels de contrôle biologique des insectes.

Beauveria bassiana, Nomuraea rileyi et Metarhizium anisopliae peuvent infecter environ 100
espèces d'insectes d'une grande variété. Ces champignons sont formulés comme des produits
commerciaux et sont de bonnes alternatives aux pesticides organophosphorés et organochlorés
ayant des actions persistantes et nocives [64-65].

Les virus

Parmi les différentes familles de virus infectant les insectes, seuls ceux appartenant à la famille
hautement spécialisée Baculoviridae ont été considérés comme des pesticides potentiels. Ils sont
très sécuritaires pour les êtres humains et pour la faune. Leur spécificité est très étroite, souvent
limitée à une seule espèce. L’usage de ces composés comme biopesticides a été limité du fait de
leur lente action de destruction et ils ont été considérés comme inefficaces. Cependant, cette
attitude change avec le temps et la protection contre les baculovirus devient une méthode de choix
pour une protection à long terme des cultures [66].

37
Les biopesticides d’origine végétale / biochimiques :

Les plantes, source importante de biopesticides, produisent une grande variété de métabolites
secondaires qui manquent de fonction apparente dans les processus physiologiques ou
biochimiques. Ces composés jouent un rôle important dans la médiation des interactions entre les
plantes et leur environnement biotique. Ces substances ont des caractéristiques aseptiques,
insecticides, et même régulatrices de la croissance des plantes et des insectes qui défendent les
plantes des herbivores [67-68].

En effet, plusieurs plantes ont été testées in-vitro et in-vivo pour leurs activités antifongiques.
Citons à titre d’exemple : l’extrait aqueux des feuilles de Solanum nigrum ainsi que l’extrait
alcoolique de plusieurs parties de Capsicum frutescence (Chilly) et du rhizome de Zingiber
officinale (Ginger), qui ont montré une activité inhibitrice importante vis-à-vis de la croissance in-
vitro du champignon Penicillium digitatum [69-70]. De plus, Andreu et al., (2018) [71] ont trouvé
que les extraits éthanoliques de Salix alba et Artemisia absinthium se sont avérés les plus efficaces
contre Plasmopara viticola, avec une inhibition totale de la germination des spores lorsqu'ils sont
appliqués à 1000 mg/L.

Une variété des extraits de différentes parties de plantes se sont avérés fongicides vis-à-vis
de certaines souches (Tableau 3) [72].

Tableau 3: Exemples d'extraits des plantes avec une activité antifongique (Ncama et al., 2019).

38
 De plus, plusieurs preuves suggèrent l’activité antifongique intéressante des huiles
essentielles capables d’inhiber la germination des spores et la croissance mycélienne [73]. Les
terpènes et les huiles essentielles riches en terpène sont largement utilisés et contiennent une
diversité de molécules antifongiques. Ils sont homologues à l’eugénol, le géraniol, le thymol [74].
Popovici et al., (2008) ont étudié l’activité antifongique de l'huile essentielle et les composés
volatils des fruits Myrica gale contre Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides et
Penicillium expansum [75].

Ces composés interviennent dans les mécanismes de défense naturels de nombreuses espèces
végétales, montrant généralement une sélectivité élevée vis-à-vis des organismes nuisibles cibles
avec une faible toxicité pour les mammifères, les oiseaux et les poissons, en plus d'être
biodégradables [76].

Les biopesticides d’origine animale / semio-chimiques : Ces molécules sont impliquées dans la
communication chimique à l'intérieur et entre les espèces. Ce sont des signaux chimiques produits
par un organisme qui cause un changement de comportement chez un individu de la même ou
d'une espèce différente. Les produits sémio-chimiques ne soient pas des biocides par eux-mêmes,
les applications pour attirer ou repousser les insectes dans des zones spécifiques ou pour perturber
leur accouplement ont rapidement augmenté en tant que stratégie de lutte antiparasitaire [77]. En
outre, ces produits permettent de capturer les insectes qui propagent les maladies, de déterminer le
moment et la nécessité des applications d'insecticides, de suivre la population et la dispersion des
ravageurs, de détecter ainsi que de surveiller les ravageurs (attractifs ou synergiques) [78].

4. Contexte réglementaire des pesticides et biopesticides

L'évaluation, avant mise sur le marché, des produits phytopharmaceutiques et des substances
actives qui les composent est strictement encadrée et harmonisée au niveau européen par le
règlement CE n° 1107/2009.
Ce règlement fait partie, d’un ensemble de textes législatifs, appelé « Paquet pesticide ». Le «
Paquet pesticide » comprend également une directive 2009/128/CE instaurant un cadre
communautaire d'action pour parvenir à une utilisation des pesticides compatible avec le
développement durable [79-80].

39
On peut souligner le dynamisme du marché du biocontrôle en Europe. En effet, L'UIPP (Union
des industries de la protection des plantes) mentionne une croissance de 24% du marché du
biocontrôle en France en 2018. La dernière mise à jour de la liste des produits
phytopharmaceutiques de biocontrôle établie par la Direction générale de l’alimentation (DGAL)
au titre des articles L.253-5 et L.253-7 est parue le 18/06/2019 sur le site du BO du Ministère en
charge de l’agriculture. Cette liste compte désormais 481 produits, dont 332 sont des substances
naturelles et 92 des micro-organismes. Ce document précise également les phrases de risques
(mentions de danger pour la santé et l’environnement) qui sont interdites pour les produits
phytopharmaceutiques de biocontrôle.

En France, depuis 2009, le plan Écophyto vise à réduire l’utilisation des produits phytosanitaires
(communément appelés pesticides) tout en maintenant une agriculture économiquement
performante. La seconde phase (Ecophyto 2) met l'accent sur une meilleure diffusion des solutions
alternatives.[80-81].
Ce contexte est favorable au développement de produits alternatifs et signifie que les contrôles
effectués sur les productions d'agrumes exportées en Europe vont répondre à des normes plus
strictes.
Ainsi, ces dernières années, les restrictions à l'utilisation de nombreux pesticides synthétiques tels
que les organochlorés, les organophosphorés, les carbamates et les organophtalidés ont entraîné
une demande accrue en biopesticides jusqu’alors utilisés exclusivement dans l'agriculture
biologique [82].

En Europe, les agrumes sont soumis à la réglementation en vigueur sur l’étiquetage des fruits. Il
s’agit d’une disposition du règlement européen n°543/2011 du 7 juin 2011 relatif aux fruits et
légumes qui oblige les Etats membres de l’Union européenne à mentionner sur les colis des
agrumes qu’ils commercialisent la liste des agents conservateurs et/ou les autres substances
chimiques utilisés en traitement post-récolte. Il s’agit le plus souvent des substances suivantes :
- biphényle et diphényle, conservateur lisible sur l’étiquette sous le n° E 230 (quantité maximale
autorisée = 70 mg/kg) ;

40
- orthophénylphénol et orthophénylphénate de sodium, lisible sur l’étiquette sous les n°s E 231 et
E 232 (quantité maximale autorisée = 12 mg/kg seul ou en mélange exprimé en OPP) ;

- esters glycériques de résine de bois E 445 (quantité maximale autorisée = 50 mg/kg ;

- ajoutons les produits suivants : gomme Karaya (E 416), cire d’abeille (E 901), cire de candelilla
(E 902), cire de carnauba (E 903), shellac (E 904), esters de l’acide montanique (E 912), cire de
polyéthylène oxydée (E 914) etc.

Pour réduire les impacts sur la santé de la population et de l'environnement, l’utilisation des
biopesticides est encouragée et leur efficacité vérifiée pour conserver des rendements de récolte
élevés [60].

Grovermann et coll. (2017) ont étudié plusieurs stratégies [83], pour inciter à l’utilisation de
biopesticides, notamment des subventions ou des taxes sur les pesticides synthétiques en fonction
du degré de toxicité.

Toutefois, la spécificité élevée des biopesticides peut limiter leur action, comme les biopesticides
basés sur le champignon Coniothyrium minitans qui ne vise qu'un seul genre de pathogène
(Sclerotinia spp.) [84] et ceux basés sur la bactérie Serratia entomophila, qui ne contrôlent qu'un
seul insecte ravageur [85].

La biodégradabilité caractéristique des biopesticides réduit les problèmes environnementaux, mais

peut nuire au maintien de l'activité du produit après son application [86].

Malgré les difficultés rencontrées, l'utilisation de biopesticides devrait être priorisée par le fait que
les pesticides synthétiques génèrent des résidus qui causent des conséquences diverses sur
l'environnement [87] et causent des conséquences sanitaires diverses pour les agriculteurs qui les
manipulent [88].

Il y a donc un besoin en recherche pour optimiser la production de biopesticides en maintenant des

cultures végétales rentables et durables [89-90]. En France, la recherche dans ce domaine se
structure à travers plusieurs organismes dont une académie du biocontrôle et de la protection
biologique intégrée et un groupe francophone d’étude des pesticides organiques d’origine naturelle
(PO2N). L’association a pour vocation de fédérer les différentes expertises du biocontrôle et d’être
force de proposition de solutions alternatives respectueuses de l’environnement. Le groupement

41
francophone permet aux chercheurs de partager des connaissances et de diffuser les différents
travaux réalisés sur les molécules ou extraits naturels utilisés en protection des cultures.

L’objectif est d’identifier un réseau d’acteurs capable de proposer des solutions alternatives
respectueuse de l’environnement.

5. Utilisation des algues marines comme biopesticides

Les produits naturels recherchés visent notamment des propriétés antimicrobiennes, antifongiques
et antioxydantes. Les composés naturels présents dans les extraits d’algues sont susceptibles de
répondre aux cahiers de charge d’un biopesticide destiné au traitement des agrumes.
Compte tenu de la richesse des côtes libanaises en algues, l’exploitation de cette matière première
végétale apparait comme une opportunité pour l’élaboration de formulations pour lutter contre le
Penicillium digitatum.

5.1. Généralités sur les algues marines

Les algues marines constituent un groupe diversifié d’organismes et sont divisées en microalgues
et macroalgues. Le premier groupe comprend les cyanobactéries procaryotes et les microalgues
eucaryotes [91]. Les algues sont des organismes très diversifiés du point de vue de la taille (des
microalgues unicellulaires aux macroalgues multicellulaires) [92]. Les algues marines constituent
des ressources renouvelables. Elles sont définies comme des plantes non vasculaires qui forment
des producteurs primaires dans l'océan. Elles sont classées en trois grands groupes fondés sur la
pigmentation, l'anatomie, la morphologie et la composition biochimique comme les algues brunes
(Phaeophyta), les algues rouges (Rhodophyta) et les algues vertes (Chlorophyta) [93].

Les algues ont une grande diversité dans la composition biochimique qui est liée aux
caractéristiques physiologiques et biochimiques [94]. Il y a plus de 15 000 métabolites primaires
et secondaires qui ont été produits au cours de différentes voies métaboliques des algues avec
diverses applications (Tableau 4)
Il a été rapporté que les algues possèdent des composés présentant un potentiel antimicrobien contre
les pathogènes d'importance médicale, agricole et environnemental. Ainsi, les activités antivirales,
vermifuges, antifongiques et antibactériennes ont été détectés chez les algues vertes, brunes et rouges
[95].

42
Tableau 4: Composés majeurs des extraits d’algues (Mayer et al., 2009).

5.1.1. Les algues vertes

Les algues vertes constituent le plus grand groupe d'algues. Ce groupe d'algues, appartient à
l’embranchement des « Chlorophycées ». Il s’agit de 9 000 à 12 000 espèces poussant dans divers
habitats d’algues vertes, de taille et de forme variables, comprend les formes unicellulaires
(Chlamydomonas, desmids), coloniales (Hydrodictyon, Volvox), filamenteuses (Spirogyra,
Cladophora) et tubulaires (Acetabularia, Caulerpa et Ulva). En milieu aquatique les algues

43
produisent leur propre nourriture et constituent donc un groupe paraphylétique. Elles se trouvent
sur les niveaux supérieurs du littoral jusqu’à 10 mètres de profondeur dans l’océan Atlantique, la
mer Noire, la méditerranée et l’océan Pacifique.

Comme les plantes, les algues vertes contiennent deux formes de chlorophylle, qu’elles utilisent
pour capter l’énergie lumineuse nécessaire à la fabrication des sucres. Les pigments
photosynthétiques (chlorophylles a et b, carotène et xanthophylle) ont les mêmes proportions que
ceux des plantes supérieures. La cellule typique de l'algue verte, qui peut être mobile ou non,
possède une vacuole centrale. Les aliments sont stockés sous forme d'amidon (l’amylopectine et
l’amylose) dans des pyrénoïdes (noyaux plastifiés protéiques). Leur paroi cellulaire est constituée
de polysaccharides sulfatés, galactanes sulfatés, xylanes et ulvanes [96-97].

6. La macroalgue verte Ulva lactuca

6.1. Généralités

L’algue Ulva lactuca ou « laitue de mer » est une macroalgue verte comestible, à distribution
cosmopolite (très vaste) répandue dans l’océan atlantique et les mers attenantes. Elle peut se fixer
sur différents supports solides telles que sur les roches, dans les zones littorales et sublittorales des
régions côtières [98]. Espèce nitrophile, elle est un bioindicateur de l’eutrophisation d’un milieu.
Cette algue est visible surtout aux fortes périodes d'ensoleillement, la fin de l'hiver, le printemps
et l'été. Elle a une durée de vie assez courte, quelques mois en général, mais plusieurs générations
se succèdent au cours de l'année [99]. Elle appartient à la famille des Ulvacea (tableau 5) [100].

44
Tableau 5: Classification de l’algue verte Ulva lactuca (Guiry et al. 2008).

Embranchement Chlorophyta
Classe Ulvophycea
Ordre Ulvales
Famille Ulvacea
Genre Ulva
Espèce Ulva lactuca

6.2. Localisation géographique au Liban

Ulva lactuca a été trouvé pour la première fois en avril 1991 à Beyrouth (Bitar, 1999, sous le nom
d’U. fasciata). Kanaan et al. (2015) [101] ont identifié l'espèce à Batroun, El Manara, Saida, Tyre
et Barbara en 2014. L'espèce est envahissante le long de toute la côte libanaise sur les récifs de
Vermetid et dans des habitats peu profonds. Ulva lactuca a été le premier macrophyte marin
envahisseur exotique identifié au Liban. Kanaan et al, 2015 [101] ont identifié 94 espèces d’algues
qui poussent le long de la côte libanaise et on mit en place une carte des sites de collecte de ces
espèces d'algues (Figure 8). De façon générale, on trouve Ulva lactuca autant en mer du nord,
qu’en méditerranée ou en océan atlantique.

Figure 8: Carte des sites de collecte des algues le long de la côte libanaise (Kanaan et al, 2015).

45
6.3. Composition biochimique
La composition biochimique des algues marines est généralement connue pour être fortement
influencée par les conditions environnementales locales (saison, pollution…) et l'emplacement
géographique [102-103-104] . Riche en vitamine C (8 fois plus que l'orange), en vitamine A,
calcium, chlorophylle, fer (2 fois plus que les germes de blé), magnésium (10 fois plus que les
germes de blé), Ulva lactuca a une teneur élevée en protéines et est assez pauvre en lipides.
Signalons que la liste des ingrédients INCI répertorie un extrait d’Ulva lactuca par le numéro CAS
97281-59-9, en tant qu’agent de protection de la peau [102-104] .
Les constituants biochimiques d’Ulva lactuca ont été étudiés par certains auteurs tels que Ismail
et al. 2017 [105] qui a déterminé la composition du tableau 6.

Tableau 6: Composition biochimique d'Ulva lactuca collectée de la baie d'Abu-Qir en Egypte (Ismail et
al.2017).

Composition biochimique
d'Ulva lactuca (%)
Proteins 25.52±2.12
Lipides 2.85±0.72
Humidité 75.56±3.24
Cendre 70.28±2.54

6.3.1. Les minéraux

Les algues contiennent dans leur composition de nombreux micro et macro-éléments, tels que
l’iode, le zinc, le fer, le cuivre, le calcium et le magnésium, le sodium et le potassium, nécessaires
au bon fonctionnement de l’organisme humain. Leur teneur dans la biomasse atteint parfois 40%,
davantage que dans n'importe quelle plante terrestre comestible (10 à 100 fois plus élevée que les
légumes traditionnels) [104]. C'est pourquoi les algues constituent potentiellement une source
riche en macro et micro-éléments.

El Said et al, 2013 [102] ont effectué une étude montrant la variation de la composition chimique
de l’Ulva lactuca de la Côte égyptienne de la mer Méditerranée.
Les échantillons des algues étaient collectés dans sept sites (baie d'Abu Qir, El Montazah, Sidi
Bishir, El Shatby, Port Est, El Mex Bay et 21 km) le long de la côte Méditerranée égyptienne

46
(Alexandrie) en avril 2011. Les résultats présentés dans le tableau 7 indiquent que dans un même
emplacement géographique, la composition chimique est affectée par les conditions
environnementales.

Tableau 7: Teneurs en éléments minéraux et en glucides chez l’Ulva lactuca issue des côtes égyptiennes
(El Said et al, 2013).
Location Ca (mg/g) Mg (mg/g) Na (mg/g) K (mg/g) F (mg/g) Les
glucides
(mg/g)
Abu Qir 2.86 1.73 21.91 7.70 93.26 111.45
El Montaza 6.47 0.56 6.37 1.68 85.03 109.49
Sidi Bishir 1.89 1.14 21.69 7.23 89.20 115.39
El Shatby 2.34 0.28 1.46 1.21 88.94 112.76
Eastern Harbor 1.90 1.44 8.37 7.64 82.03 114.08
El Mex 2.79 0.28 6.04 1.45 128.23 111.45
21 Km 16.73 2.54 3.33 4.43 109.03 101.62

Chbani et al, en 2015 [106] ont analysé la concentration en macroéléments (éléments primaires et
secondaires), en micronutriments de l'extrait liquide aqueux de Chlorophytae Ulva lactuca au
Liban. La composition chimique est présentée dans le tableau 8.

47
Tableau 8: Concentration en macroéléments et microéléments de l'extrait liquide aqueux d’Ulva lactuca
au Liban (Chbani et al. 2015).
Concentration (mg/L)

Macroéléments

Macroéléments primaires Azotes (N) ×103 126.09

Phosphates (PO43-) ×102 3

Potassium (K+) ×102 16.34

Macroéléments secondaires Calcium (Ca2+) ×102 13.6

Magnésium (Mg2+) ×102 36.9

Sulfate (SO42-) ×103 0.262

Microéléments

Chlorure (Cl-) ×103 8.35

Sodium (Na+) ×102 13.02

Alcalinité

Carbonate (HCO-) ×102 10

Autres minéraux

Nitrite (NO2-) ×10 5.66

Nitrate (NO3-) ×102 7.24

6.3.2. Les pigments

Les pigments d'algues peuvent être divisés en trois groupes principaux: la chlorophylle (chlorines
et porphyrines) et les caroténoïdes (polyisoprénoïdes avec des cycles terminaux cyclohexane) et
les phycobiliprotéines (tétrapyrroles ouvertes) sont des pigments liposolubles [107]. Les
caroténoïdes (carotènes et xanthophylles) sont des pigments terpénoïdes produits par des algues
marines, des plantes, des champignons et certaines bactéries, et sont les pigments les plus répandus
dans la nature [108].

Ismail et al. 2017 [105] ont analysé les chlorophylles et les caroténoïdes dans Ulva lactuca
collectées de la baie d’Abu-Qir, en Égypte (Figure 9). La chlorophylle totale constitue le taux le

48
plus élevé (0,741 ± 0,374 mg g − 1) en pigments. Les résultats d’une étude réalisée par Turan et al.
(2015) [109] montre également que l'algue verte U. lactuca contenait des niveaux élevés de
chlorophylle.

Figure 9: Teneur en pigments des algues étudiées par Ismail et al.2017.

6.3.3. Les polysaccharides

Les polysaccharides les plus abondants présents dans les algues vertes et surtout dans Ulva lactuca
sont les ulvanes. Les ulvanes sont des polysaccharides sulfatés de la paroi cellulaire des algues
marines vertes appartenant aux Ulvales. Ces polysaccharides sont responsables d’un large éventail
d’activités physiologiques et biologiques telles que les activités anticancéreuses, anticoagulantes,
antioxydantes, antifongiques et antitumorales [110].

La structure et la composition de l'ulvane dépendent fortement des conditions d'extraction [111].

Ces ulvanes sont composées en majorité de rhamnose et d’acide uronique, unités majoritaires
auxquelles s’ajoutent du xylose et du glucose. Le taux de sulfates est assez élevé, autour de 30%
[112].

49
Yaich et al. (2011) [113] ont évalué le profil des monosaccharides dans Ulva lactuca, le tableau 9
montre que le glucose et le rhamnose sont les plus abondants dans cette algue. La présence de
rhamnose peut être attribuée au xylorhamnoglycuronane.

Tableau 9: Composition en monosaccharides de la macroalgue U. lactuca (Yaich et al.2011).

Neutral sugars Content (%)

Glucose 17.24 ± 0.20

Rhamnose 7.40 ± 0.21
Xylose 1.93 ± 0.03
Galactose 0.35 ± 0.01
Mannose 0.29 ± 0.00
Arabinose 0.08 ± 0.00

6.3.4. Les protéines

Les lectines sont les protéines les plus abandantes dans Ulva lactuca. Ces composés sont capables
de se lier aux glucides et participent donc à de nombreuses activités biologiques. Ils sont
responsables du transport des enzymes cellulaires, de leur synthèse et de la régulation de l'activité
des enzymes. Ils jouent également un rôle important dans la communication cellule-cellule. De
plus, ces composés procurent des propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires [114].

Ulva lactuca collectée au large de la Norvège était riche en protéines, allant de 90 à 120 g kg − 1
DW. Les teneurs en protéines varient d’une étude à l’autre, cela peut s'expliquer en partie par les
variations géographiques et saisonnières, mais aussi par les différences de méthodologie [115].

50
Tableau 10: Profil des acides aminés dans Ulva lactuca (Maehre et al.2014).

Essential amino acids of Ulva lactuca (g kg−1 DW.)

Threonine 6.2 ± 0.3d
Valine 7.1 ± 0.1d
Methionine 2.2 ± 0.1d
Isoleucine 4.4 ± 0.2c
Leucine 8.5 ± 0.3c
Phenylalanine 6.0 ± 0.2d
Lysine 5.1 ± 0.2c
Histidine 1.6 ± 0.1cd
Tryptophan n.a.
Non‐essential amino acides (NEAA)
Aspartic acide 9.0 ± 0.3c
Serine 5.9 ± 0.3c
Glutamic acide 12.2 ± 0.5c
Proline 5.8 ± 0.5c
Glycine 7.3 ± 0.2c
Alanine 10.1 ± 0.3de
Cysteine 1.0 ± 0.2de
Tyrosine 3.4 ± 0.4c
Arginine 6.0 ± 0.3d
Sum TAA 101.5 ± 3.9c
Relative amount 40.3 ± 0.4 g
EAA (%)
Chemical score 0.92

6.3.5. Les lipides

Kendel et al. 2015 [116] ont rapporté que la teneur en lipides dans les algues vertes et
spécifiquement U. lactuca est faible. Elle varie de 0.3% jusqu’à 3 % selon l’origine des algues
(Tableau 11).

Yaich et al. (2011) [113] ont étudié le profil des acides gras dans U. lactuca issue de Tunisie et
Chili (Tableau 12). Les acides gras saturés (AGS) et polyinsaturés (AGPI) représentent
respectivement 68,97% et 6,73% des acides gras totaux. Dans l'échantillon étudié, l'acide gras le
plus abondant est l'acide palmitique C16 : 0 (59,4%).

51
Tableau 11: Teneur totale en lipides de différentes espèces d'algues Ulva (kendel et al.2015).

52
Tableau 12: Profil en acides gras d'Ulva latuca (Yaich et al.2011).

Fatty acid Methyl ester (%)

Myristic C14:0 2.40 ± 0.10
Palmitic C16:0 59.40 ± 0.56
Palmitoleic 6.87 ± 0.23
C16:1
Stearic C18:0 1.87 ± 0.11
Oleic C18:1 15.93 ± 0.50
Linoleic C18:2 2.43 ± 0.05
α-Linolenic 3.20 ± 0.17
C18:3
Arachidic C20:0 1.13 ± 0.10
Eicosenoic 1.52 ± 0.05
C20:1
Behenic C22:0 4.17 ± 0.05
Docosahexenoic 1.10 ± 0.05
C22:6
SAFA 68.97 ± 0.86
MUFA 24.32 ± 0.78
PUFA 6.73 ± 0.27

Ortiz et al. (2006) [117] ont également rapporté que les principaux acides monoinsaturés présents
chez U. lactuca sont les acides oléique, palmitoléique et éicosénoïque. Les variations des teneurs
en acides gras sont imputables aux différences environnementales et génétiques.

7. Méthodes de prétraitement et d’extraction appliquées aux algues

7.1. Généralités

Les algues, riches en composés actifs, sont en mesure de contribuer à différentes activités
biologiques. Ces composés sont sensibles aux techniques d'extraction. De nos jours, les recherches
dans le domaine des algues marines visent à sélectionner des techniques d’extraction efficaces,
sélectives et respectueuses de l’environnement [118].

Le choix de la méthode d’extraction dépend notamment du type de composés bioactifs à obtenir

(huiles, polysaccharides, éléments nutritifs, fibres alimentaires, etc.).

53
Concernant les extractions par solvant, le choix de solvant (polaire, apolaire, protique, aprotique)
conduira à l'extraction de différents groupes de composés [119].

Les méthodes de production d'extraits d'algues peuvent être divisées en trois groupes : méthode
biologique (hydrolyse enzymatique), extraction par solvant et extraction physique (en autoclave,
par fluide supercritique).

7.2. Prétraitement de la biomasse d'algues et de la procédure d'extraction.

Dans le cas de la préparation d'extraits d'algues marines, la première étape (immédiatement après
la collecte) consiste à laver plusieurs fois la biomasse à l'eau de mer pour éliminer les particules
de sable et les impuretés qui y adhèrent [120].

Rhimou et al. (2010) [121] ont suggéré de supprimer la microflore de surface en trempant les
échantillons d'algues pendant 10 min avec de l'éthanol à 30%. Ensuite, les algues devraient être
rapidement transportées au laboratoire dans des sacs en polyéthylène placés dans une glacière. Les
algues devraient être à nouveau lavées avec de l’eau douce pour éliminer les précipités de sels. Il
convient de veiller au maximum à éliminer les épiphytes des macroalgues [118]. Après le
processus d'extraction, la matière végétale est filtrée, le filtrat (extrait d’algue) est recueilli et
conservé à 4 ° C.

Le schéma général du prétraitement de la biomasse algale et de la production d'extraits d'algues

par des méthodes biologiques et chimiques est présenté à la figure 10.

54
Figure 10: Schéma général du prétraitement de la biomasse algale et de la production d'extraits d'algues.

Le tableau 13 ci-dessous récapitule quelques exemples de solvants d’extraction utilisés pour

réaliser des extraits à partir de la biomasse algale.

Tableau 13: Extraction par solvant à partir de la biomasse algale.

Biological active compound Method of extraction Extractant

Polysaccharides Solvent extraction Organic solvent Ethanol
Methanol
Inorganic solvent CaCl2, HCl, Na2CO3
Distilled water
H2SO4, HCl, H3PO4
H2SO4
Phenolic compounds Solvent extraction Organic solvent Methanol
n-Hexane, Chloroform, ethanol, methanol, acetone
Proteins Inorganic solvent water
Lipids Solvent extraction Organic solvent Chloroform/methanol (1/2 or2/1)
Chloroform/methanol/50mM phosphate buffer
(1/2/0.8)
Dichloromethane/methanol (2/1)
Pigments Solvent extraction Organic solvent Acetone, ethanol, methanol

55
7.3. Extraction par solvant

Les techniques d'extraction utilisées pour obtenir les substances bioactives sont les procédés de
macération, d’extraction par Soxhlet ou l’extraction par fluide supercritique (SFE) [122-123].

Le choix d’une méthode d’extraction particulière dépend de la quantité et de la nature des

composés à isoler. La sélectivité dépend de la nature du solvant et des solutés.

Macération à froid :

La biomasse est mise en contact avec le solvant pendant au moins 3 jours avec une agitation
régulière. Le marc (matière solide) est filtré et pressé, le filtrat est clarifié par décantation [124].

L’efficacité de cette méthode est basée sur la récupération élevée des composés avec une durée
courte [125].

L’acétone est le solvant souvent le plus utilisé pour l’extraction des antioxydants et des
chlorophylles. Les composés lipophiles sont extraits avec des solvants organiques non polaires,
tels que l'hexane ou des solvants peu polaires tels que le dichlorométhane ou l’acétate d’éthyle.
Les constituants hydrophiles, y compris les lignines, sont extraits avec des solvants polaires tels
qu’un mélange acéto-méthanol ou avec l'éthanol [126].

Macération à chaud

Il s’agit notamment d’une macération avec de l'eau distillée préalablement portée à ébullition. Un
milieu aqueux est utilisé pour extraire les fractions hydrosolubles sans traitement à haute pression,
sans apport d’acide fort ou d’une base [127]. Des agents de conservation de qualité alimentaire, à
savoir l'acide acétique et / ou le carbonate de sodium, sont ajoutés pour stabiliser l’extrait [128].

Extraction de Soxhlet

L'extraction par Soxhlet à l’aide d’un solvant organique est une technique usuelle d'extraction de
composés bioactifs à partir de biomasse. Pour ces conditions, la matière végétale est placée à
l'intérieur d'une cartouche reliée à un ballon contenant l’extrait liquide, sous reflux de solvant.
[129]. Cette méthode présente l’inconvénient d’être assez longue, mais représente souvent la
méthode de référence.

56
Extraction par CO2 Supercritique

L’extraction est effectuée à partir d’une matrice solide en utilisant le dioxyde de carbone dans son
état supercritique, c’est-à-dire les conditions d'utilisation du dioxyde de carbone supercritique sont
au-dessus de ses points critiques (température critique 31°C et pression critique 74 bars).

Le CO2 à l’état supercritique permet de solubiliser des composés apolaires et de faibles masses
moléculaires. Sa faible viscosité dynamique favorise les phénomènes de transport et de convection.

Une extraction dans ces conditions possède certains avantages : une faible température critique
(Tc= 31,1°C), non inflammabilité et absence de toxicité et de solvant résiduel à la fin du traitement
(évacuation sous pression atmosphérique), chimiquement inerte, sans processus d’oxydation du
produit. La tension de surface et la viscosité sont plus faibles que celles des solvants organiques
ce qui favorise la diffusion des solutés. Néanmoins, le CO2 supercritique possède une très faible
polarité. On est donc souvent amené à travailler sous des pressions très élevées ou alors à accroitre
le pouvoir solvant par l’ajout d’un co-solvant polaire tel que l’éthanol [130].

8. Activités biologiques de l’Ulva lactuca

Comme évoqué dans les parties précédentes, les algues vertes et en particulier Ulva lactuca, sont
sources de composés désignés par métabolites secondaires tels que des caroténoïdes, des
chlorophylles, des composés phénoliques, des protéines, des polysaccharides et des acides gras
insaturés. Ces molécules ont déjà été signalées comme ayant diverses propriétés incluant l’activité
anti-oxydante, antivirale, antimicrobienne, anti-inflammatoire, anticytotoxique, anti-cancer ou
antifongique [131].

8.1. Activité anti-oxydante

Les algues contiennent des molécules antioxydantes réactives, telles que l'ascorbate et le glutathion
(GSH), ainsi que des métabolites secondaires, notamment les caroténoïdes (α et β-carotène,
fucoxanthine, astaxanthine), des acides aminés (mycosporine, glycine) et des catéchines
(catéchine, menton épigallociné), gallate, phlorotannins (phloroglucinol), eckol et tocophérol. Les
propriétés antioxydantes des extraits d’algues sont généralement évaluées par mesure de l’effet
inhibiteur sur le piégeage radicalaire de l’acide thiobarbiturique (TBARS) et du 1, 1-diphényl-2-
picrylhydrazyle (DPPH) [132].

57
Khairy et El-Sheikh (2015) ont évalué les teneurs en antioxydants de l’Ulva lactuca Linnaeus
(Chlorophyta) en utilisant la méthode du DPPH. Cette activité antioxydante a été corrélée à la
présence de β-carotène et de composés phénoliques [104].

Whankatte et al. (2016) [133] ont évalué l’activité antioxydante de l’Ulva lactuca collectées sur la
côte de Raigad à marée basse. Trois méthodes différentes ont été utilisées : le dosage par DPPH,
le pouvoir réducteur et le contenu phénolique total. Les analyses ont montré la présence de
flavonoïdes, de composés phénoliques, de saponines, tanins et carbohydrates. Les résultats
indiquent qu’Ulva lactuca est riche en métabolites secondaires avec un potentiel antioxydant.
Dans le travail de Yaich et al. (2017) [134], une extraction en milieu acide ainsi qu’une extraction
enzymatique ont été testées pour extraire les polysaccharides sulfatés d’Ulva lactuca.
Farvin et al. (2019) [135] ont comparé les activités antioxydantes de 26 espèces d’algues marines
récoltées sur la côte koweïtienne du golfe Arabo-Persique, montrant l’activité anti-oxydante
d’Ulva lactuca.

8.2. Activité anti-microbienne

Nan et al. (2008) [136] ont montré qu’U. lactuca présente des effets allélopathiques négatifs sur
les microalgues nuisibles. Deveau et al. (2016) ont montré l’intérêt des extraits méthanoliques
d’Ulva lactuca contre l’infection à Staphylocoques, en utilisant la méthode de diffusion sur disque
gélosé.

8.3. Activité cytotoxique

Thuy et al. (2016) [110] ont étudié la structure de l’ulvane (les polysaccharides sulfatés
hydrosolubles) de l’Ulva lactuca en utilisant différentes méthodes spectroscopiques et ont
identifié une activité cytotoxique contre certains cancer.

8.4. Activité antifongique

Plusieurs algues vertes sont connues pour leur activité antifongique. Alang et al. (2009) [138] ont
trouvé que les extraits par le n-hexane et par le chloroforme d’Ulva lactuca Linnaeus collectée
d’Inde ont une activité antifongique contre Aspergillus niger et Candida albicans. Une autre étude
58
faite par Aruna et al. (2010) a évalué les activités antifongiques d’Ulva lactuca et Ulva réticulata
contre les pathogènes fongiques Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatous,
Saccharomyces cervisiae et Mucor indicus [139].

Ertürk et Tas, 2011 [140] ont étudié l’activité antibactérienne et antifongique de l’extrait
éthanolique des 3 algues vertes récoltées de la côte de Turquie, vis-à-vis d’Aspergillus niger et de
Staphylococcus aureus. D’autres travaux ont montré l’efficacité de l’extrait méthanolique d’Ulva
lactuca pour lutter contre A. Niger, P. digitatum et R. Solani [141].

A ce jour, aucune étude n’a mentionné l’activité d’extraits d’Ulva lactuca sur Penicillium
digitatum.

9. Contrôle post-récolte vis-à-vis de [Link]

Les agrumes sont atteints par divers agents pathogènes pendant la récolte et le stockage post-
récolte, le transport et la commercialisation [142]. Les maladies fongiques post-récolte les plus
sévères des agrumes sont les moisissures vertes et bleues causées par Penicillium digitatum et
Penicillium italicum Wehmer, respectivement [143].

La résistance aux agents pathogènes a motivé la recherche d’alternatives aux fongicides

synthétiques. Cependant, les mécanismes de résistance aux maladies phytopathogènes des
agrumes ne sont pas encore clairs. Une compréhension plus approfondie des mécanismes de
résistance aux agrumes en réponse à des agents pathogènes communs est essentielle pour clarifier
les mécanismes des interactions hôte-microbe et développer de nouvelles méthodes pour le
stockage post-récolte, le transport et la commercialisation des agrumes [144].

Il a été rapporté que la résistance accrue des agrumes contre les infections à P. digitatum peut être
obtenue par l’application de moyens physiques (rayonnement gamma, rayons ultraviolets) [145].
Youssef et al., (2014) ont également vérifié l’efficacité du carbonate et du bicarbonate de sodium
comme inducteurs de résistance à la moisissure verte des agrumes [146]. Ainsi, Shi et al., (2018)
ont montré que la combinaison du chitosan avec l’acide salicylique contrôle la pourriture verte
dans les fruits du raisin [147]. Droby et al., (2002) ont montré que les microorganismes telle les
levures Candida oleophila ont une résistance contre le P. digitatum [148].

59
Les inducteurs de résistance sont des agents pathogènes ou des constituants végétaux qui
réagissent avec les récepteurs des plantes et activent les défenses végétales, empêchant ainsi les
infections pathogènes [149].

9.1. Mécanisme d’action des composés alternatifs aux fongicides dans les agrumes sur Penicillium
digitatum

9.1.1. Induction des enzymes de défense dans les tissus des agrumes.

Des recherches antérieures indiquent l’importance des substances naturelles pour lutter contre les
maladies phytopathogènes des agrumes. Par contre les mécanismes d’action de ces substances au
niveau des cellules végétales ne sont pas encore totalement élucidés.

Il a été décrit que certaines protéines liées à la pathogenèse (PR), comme les enzymes β-1, 3-
glucanases appartenant à la famille PR-2, les chitinases appartenant aux familles PR-3,-4,-8 et-11
[150], les peroxydases et les phénylalanine ammoniac-lyase (PAL) sont capables de dégrader les
constituants des parois cellulaires fongiques.

• β-1,3-glucanase

Les β -1,3-glucanases sont des enzymes hydrolytiques qui existent sous de nombreuses iso-formes
et se différencient par leur activité enzymatique, leurs propriétés physiques et leur localisation
subcellulaire chez les plantes. L’expression génique des glucanases peut être modulée en réponse
à de nombreux processus physiologiques chez des plantes saines, mais également en réponse à des
stress biotiques et abiotiques et les hormones végétales telles que l'éthylène [151].

La participation de β -1,3-glucanases dans la défense des agrumes contre les champignons

pathogènes a été démontrée [154] et l'induction de l'expression d'un gène de classe I β -1,3-
glucanases par blessure, irradiation à l'éthylène et aux UV qui pourraient favoriser la résistance
des fruits aux agents pathogènes, chez le pamplemousse a été rapportée [152]. Les glucanases
peuvent dégrader la paroi cellulaire fongique composée principalement de glucane, ce qui retarde
la germination des spores et l’élongation du tube germinatif.

• Les chitinases

60
Les chitinases végétales (EC [Link]) sont des protéines PR capables de dégrader la chitine de la
paroi cellulaire fongique [153].

• Les peroxydases

Les peroxydases jouent un rôle clé, lors de la synthèse de la lignine, qui agit comme un renfort de
paroi cellulaire améliorant la résistance contre de multiples pathogènes, et altérant la capacité des
agrumes à faire face à l’infection des Pénicillium par l’activité antioxydante [144].

• Phénylalanine ammoniac-lyase (PAL)

La phénylalanine ammoniac lyase (C.E. [Link]; PAL) (PAL) est une enzyme de la classe des
phénylpropanoïdes à partir de laquelle la scoparone et la scopolétine sont synthétisées. Par
conséquent, la scoparone a été considérée comme un bon marqueur de la résistance induite dans
les agrumes [154]. En dehors de jouer un rôle important dans les propriétés de qualité des fruits
(couleur, texture et saveur), les glucides sont impliqués dans la physiologie des agrumes, par
exemple en fournissant le substrat pour la synthèse de divers métabolites secondaires, y compris
celle des phénylpropanoïdes.

Ballester et al. (2010) [155], ont analysé l'activité enzymatique et les niveaux d'expression des
gènes, de la phénylalanine ammoniac-lyase (PAL), de la peroxydase, de la β-1,3-glucanase et de
la chitinase dans le flavedo (partie colorée externe de la peau du fruit) et dans l’albedo (la partie
interne blanche) du fruit afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la résistance des
agrumes contre Penicillium digitatum. 24 heures après innoculation des oranges avec P. digitatum,
les activités enzymatiques ont augmenté avec la résistance du fruit, en particulier chez l’albédo.
L'expression du gène codant pour PAL et celle des gènes codant pour les isoformes basiques plutôt
que pour les acides des protéines PR ont été induites dans les deux tissus, mais plus nettement dans
l'albédo.

Les tissus d’oranges traités par des sels de carbonates ont montré une augmentation du niveau de
l’activité enzymatique β-1,3-glucanase, peroxydase et PAL après 12 h de traitement [156]. En plus,
les analyses HPLC ont montré une augmentation de la concentration des sucres et phytoalexins,
particulièrment le saccharose et le scoparone.

61
De même, la moisissure verte des raisins a pu être contrôlée en induisant les activités des enzymes
de défense comme phénylalanine ammoniac-lyase (PAL), la peroxydase, la β-1,3-glucanase et la
chitinase [157].

9.1.2. Accumulation des espèces réactives oxygénées (ROS)

L’une des réponses de défense les plus rapides engagées à la suite de la reconnaissance des agents
pathogènes est la «rafale oxydative», qui constitue la production d’intermédiaires d’oxygène
réactifs (ROIs), principalement de superoxyde (O2-) et de H2O2, au site de tentative d’invasion
[158]. La demi-vie d’O2- est inférieure à une seconde. La protonation d’O2- peut produire le radical
hydroperoxyle HO2-, qui peut convertir les acides gras en peroxydes lipidiques toxiques, détruisant
les membranes biologiques. En outre, en présence d’ions métalliques divalents tels que le Fe2+ le
H2O2 peut subir la réaction de Fenton, produisant le radical hydroxyle (OHº), l’espèce la plus
réactive connue en chimie. Ce ROI peut initier la peroxydation lipidique auto-perpétuant et
endommager les acides nucléiques et les protéines [159]. Il est bien connu que dans des conditions
de stress différentes, des quantités élevées de ROS, y compris l’anion superoxyde (O2- ) et le
peroxyde d’hydrogène (H2O2) peuvent causer la mort de l’agent pathogène, en interférant avec son
cycle de vie, et provoquant plusieurs changements structurels [160].

Les mitochondries étant responsables de la majeure partie des ROS intracellulaires, leur niveau est
souvent accompagné d'un dysfonctionnement mitochondrial, caractérisé par un effondrement du
potentiel de la membrane mitochondriale et par conséquent une diminution de l'adénosine
triphosphate cellulaire (ATP).

9.1.3. La perte d’intégrité de la membrane

La perméabilité et l’intégrité de la membrane plasmique cellulaire servent de fonctions importantes

pour maintenir la viabilité fongique [161]. Des études antérieures ont montré que la lipophilicité
des huiles essentielles entraîne une perméabilité membranaire accrue (perturbation des protéines
membranaires), une inhibition de la respiration, une altération des processus de transport ionique
chez les champignons et induit la perte d’autres contenus cellulaires [162].

62
Pour les champignons, l’intégrité de la membrane plasmique joue un rôle crucial dans le maintien
des constituants cellulaires, car la membrane plasmique est généralement un site d’action pour les
substances organiques antifongiques, telles que les protéines antifongiques et le chitosane [163-
164].

Des études antérieures ont démontré le rôle important du citronellal qui est un composé volatil de
l’huile essentielle des arbres parfumé au citron. Cette molécule pourrait inhiber la croissance de
Candida albicans en affectant l’intégrité membranaire et en arrêtant le cycle cellulaire. La
croissance de P. adametzii et P. citrinum pourrait être complètement inhibée par le citronellal à
une dose de 112 mg/L [165].

En plus, Liu et al. (2010) [166], ont rapporté que le silicium (Si) qui est un composé inorganique,
inhibe la germination des spores, l’élongation du tube germinatif et la croissance mycélienne du
P. digitatum en perturbant la membrane plasmique des spores en les endommageant. Les pertes
en protéines et en sucres sont significativement plus élevées dans les mycéliums traités par le
silicium que pour le contrôle.

Dou et al. (2017) [167], ont démontré l’activité antifongique de l’octanal qui est un aldéhyde
aliphatique dans les huiles essentielles. Il représente une alternative potentielle aux fongicides
chimiques dans le contrôle de la maladie post-récolte des agrumes. L’octanal à différentes
concentrations (0, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 μl/ml) a inhibé la croissance des spores de P. digitatum
d’une manière dose-dépendante. La morphologie et la perméabilité membranaire des spores de P.
digitatum ont été visiblement altérées par 0,25 et 2,00 μl/ml d’octanal. D’autre part, l’octanal
diminue le contenu lipidique total des spores de P. digitatum, ce qui indique que l’intégrité
membranaire est endommagée.

Li et al. (2019) [168], ont montré que l’acide cinnamique a inhibé fortement la germination des
spores et la croissance mycélienne de P. italicum dans les mandarines’Orah'. Ils ont utilisé la
coloration fluorescente de l’iodure de propidium, et ont observé une perte d’intégrité membranaire
chez P. italicum après un traitement à l’acide cinnamique. En outre, l’acide cinnamique a conduit
à la fuite des constituants cellulaires, y compris les protéines solubles et les glucides des hyphes
de P. italicum.

63
9.2. Mécanisme d’action de Penicillium digitatum sur les cellules d’orange

Des études histopathologiques de tissus d’orange infecté par P. digitatum ont montré une
déméthylation de la pectine, un gonflement de la paroi cellulaire et une plasmolyse des cellules en
étroite proximité des hyphes. Barmore et Brown (1979) [169] ont attribué la plasmolyse cellulaire
à la libération de solutés osmotiquement actifs et à l'augmentation de la concentration en H+ qui
est optimal pour l'expression et le fonctionnement de polygalactorunases fongiques. Les étapes
initiales de développement des symptômes sont liées à une forte accumulation de l'acide D-
galacturonique, qui a atteint une moyenne de 12 mg/g de matière fraîche dans les tissus infectés
par P. digitatum. L'accumulation d'acide galacturonique et sa diffusion dans les tissus sains est
considérée comme un facteur essentiel dans la pathogénicité de P. digitatum. Ce composé est
capable d'induire le gonflement de la membrane cellulaire et contribue à la plasmolyse et d'autres
symptômes observés. Tantaoui-Elaraki et al. (1994) [170] ont mis en évidence un extrolite secrété
par P. digitatum, la phenylalanine-proline diketopiperazine ayant un rôle dans la pathogénicité de
ce champignon. Prusky et al. (2004) [171] ont signalé, lors de l’infection de l’agrume, que P.
digitatum produit des quantités élevées d'acide citrique qui bloque la production d'H2O2 secrété
par ces agrumes infectés. Cette propriété améliore la pathogénicité de [Link] puisque la
toxicité de H2O2 peut inhiber directement la croissance de ces agents pathogènes.

Pendant l’infection, les pathogènes végétaux nécrotrophes macèrent le tissu hôte en sécrétant des
quantités significatives d’enzymes glucidiques actives (Carbohydrate-Active enzymes CAZYmes)
qui contribuent à la dégradation des polymères de parois cellulaires végétales pour obtenir les
nutriments nécessaires à son développement [172]. Parmi ces CAZYmes, le type le plus abondant
de pectine est le homogalacturonan, un polymère linéaire de l’acide galacturonique D α-1, 4-lié,
qui peut être modifié par l’acétylation et la méthylestérification.

D’autres pectines comprennent rhamnogalacturonan I et II, et xylogalacturonan. Les enzymes

impliquées dans la dégradation du squelette de la pectine comprennent les polygalacturonases
(PGs), le pectate et les lyases de pectine (PLs), les rhamnogalacturonases et les lyases de
rhamnogalacturonase [173].

64
II. Partie 2 : Procédé de formulation des extraits

Les extraits d’algues sont riches en molécules actives dont les propriétés doivent être préservées
au sein d’une formulation adaptée à l’application. Une formulation adaptée conditionne également
les performances attendues.

A) Formulation en émulsions végétales

1. Emulsions végétales

1.1. Définition générale

L'émulsion est une classe de systèmes dispersés, composée d'au moins deux liquides non
miscibles, l'un dispersé dans un autre sous forme de gouttelettes. Ce sont des systèmes finement
divisés qui sont caractérisés par le développement important d’une interface entre les deux liquides
A et B non miscibles [174]. Ces systèmes sont thermodynamiquement instables et peuvent être
stabilisés cinétiquement par l’ajout d’un émulsifiant qui va ainsi conférer des propriétés
particulières à l’interface et jouer un rôle fondamental dans la stabilisation de l’émulsion. Les
émulsions ne se forment pas spontanément ; un apport d'énergie par agitation est nécessaire.

Les émulsions sont utilisées dans plusieurs domaines [175]. Les produits à base d'extraits d'algues
sont généralement destinés à l'industrie des engrais, des cosmétiques, de l’hygiène ou de la santé
animale. Une émulsion véhicule les principes actifs vers la surface cible (cellules végétales,
humaines ou animales).

1.2. Types d'émulsion

Les émulsions peuvent être classées en fonction de la répartition de la phase lipophile et hydrophile
[176]. Le type d'émulsion dépend de plusieurs paramètres, tels que la nature des émulsifiants et la
nature des phases [177]. Selon le choix de la formulation, et l’ordre d’ajout de ces composants, on
peut obtenir des émulsions avec des caractéristiques différentes.

Il existe deux types d’émulsions : les émulsions simples et les émulsions multiples.

65
Les premières sont constituées d’une phase dispersée dans une phase continue. Lorsque la phase
continue est une phase aqueuse et la phase dispersée est une phase organique (hydrophobe ou
huileuse), ces émulsions appelées des émulsions directes, désignées par « huile-dans-eau » (H/E)
(Figure 10 a). Les émulsions inverses « eau dans huile » (E/H) signifie que la phase continue est
une phase huileuse et la phase dispersée est une phase aqueuse. (Figure 11 b).

Les émulsions multiples, quant à elles, consistent en une émulsion dispersée à son tour dans une
phase continue externe. Elles sont alors du type E/H/E ou H/E/H (Figures 11 c et 11 d). Ce sont
des systèmes complexes où les émulsions E/H et H/E existent simultanément. Dans le cas des
émulsions E/H/E, les gouttelettes d'huile contiennent de plus petites gouttelettes d'eau, et les
gouttelettes d'huile elles-mêmes sont dispersées dans une phase aqueuse continue. Les émulsions
H/E/H consistent en de minuscules gouttelettes d’huile piégées dans des gouttelettes d’eau plus
grosses, qui à leur tour sont dispersées dans une phase huileuse continue.

Aux fortes concentrations en huile, une émulsion E/H a tendance à se former, tandis qu’aux faibles
concentrations en 'huile, une émulsion H/E se forme préférentiellement. Les émulsions multiples
nécessitent généralement deux tensioactifs ou plus, l’une est principalement une émulsion primaire
E/H stabilisante hydrophobe et l’autre est une émulsion secondaire H/E stabilisante hydrophile.
Les tensioactifs hydrophobes et hydrophiles sont ajoutés respectivement dans la phase huileuse et
dans la phase aqueuse continue, respectivement.

Figure 11: Représentation schématique d’une émulsion a : Huile-dans-Eau, b : Eau-dansHuile, c : Eau-

dans-Huile-dans-Eau, d : Huile-dans-Eau-dans-Huile.

66
1.3. Mécanisme de déstabilisation des émulsions

Au cours du temps, une émulsion évolue généralement vers l’équilibre thermodynamique, c'est-à-
dire vers une séparation appelée "démixtion" des phases, correspondant à une surface de contact
minimale entre la phase aqueuse et la phase huileuse.

Les principaux mécanismes de déstabilisation d’une émulsion sont la sédimentation ou le crémage,

la coalescence, la floculation, et le mûrissement d’Ostwald [178]. La vitesse et le mécanisme de
la rupture de l'émulsion dépendent des compositions, de la microstructure, ainsi que des conditions
environnementales (par exemple, la température, l'agitation mécanique et les conditions de
stockage). Les types de processus de déstabilisation sont présentés schématiquement à la figure 12
et décrits dans les sections suivantes.

Figure 12: Représentation schématique des différents mécanismes de déstabilisation pour une émulsion
huile dans l'eau.

67
La sédimentation et le crémage mènent tous deux à la séparation gravitationnelle. En général,
les gouttelettes dans une émulsion ont une densité différente de celle de la phase continue. Si
les gouttelettes ont une densité inférieure à celle du liquide environnant, elles ont tendance à
migrer en surface, ce qui est appelé crémage. Inversement, si leur densité est supérieure à celle
du liquide environnant, ils ont tendance à descendre, ce qui est appelé sédimentation.

Selon les masses volumiques relatives des phases, on aboutit généralement à un crémage
(ascension de la phase huileuse pour une émulsion H/E) ou à une sédimentation (chute de la
phase aqueuse pour une émulsion E/H) [179].

Ainsi, les gouttelettes dans une émulsion H/E ont tendance à crémer, tandis que celles d'une
émulsion E/H ont tendance à sédimenter.

Le mûrissement d’Ostwald est un phénomène irréversible de diffusion de molécules de la

phase dispersée au sein de la phase continue. Il est gouverné la différence de pression entre les
gouttelettes.

La surpression de Laplace (ΔP) (Equation 1) est supérieure dans les gouttes de petit rayon (R),
ce qui induit un flux de matière tendant à vider les petites gouttes au profit des plus grosses. Ce
phénomène est conditionné par la solubilité de la phase discontinue dans la phase continue et
par la polydispersité des tailles des gouttes de la phase dispersée. Ce phénomène a pour
conséquence la diminution du rayon des petites gouttes jusqu’à leur disparition complète et
conduit ainsi à l’augmentation de celui des plus grosses, modifiant considérablement la
granulométrie.
2𝛾𝛾
Equation 1: ∆𝑃𝑃 =
𝑅𝑅

Il est important de noter que la déstabilisation n’est pas toujours indésirable. Elle peut être
voulue et provoquée par exemple lorsqu’une molécule active doit être libérée au niveau de son
site d’action. Une modification de la pression osmotique, du pH, l’application d’un cisaillement
permet alors la déstabilisation de l’émulsion et la libération du principe actif qu’elle contient
au moment voulu [180].

68
Figure 13: Mûrissement d'Ostwald.

Les gouttelettes en émulsion sont continuellement en mouvement en raison des effets de

l’énergie thermique, de la gravité ou des forces mécaniques appliquées [181]. Après une
collision, les gouttelettes peuvent se séparer ou rester agrégées. Les deux conséquences
majeures de l'agrégation dans les émulsions sont la floculation et la coalescence [182].

La floculation est le processus par lequel deux gouttelettes ou plus se rejoignent. Lorsque la
force de répulsion n’est pas assez forte pour séparer les gouttelettes, il y a agrégation des
gouttelettes sans modification de la taille de la goutte principale. Tout facteur qui augmente la
fréquence de collision augmente le taux de floculation. Ces facteurs sont le mouvement
brownien, la séparation gravitationnelle et les forces mécaniques appliquées [183].

La coalescence est le processus par lequel deux gouttelettes ou plus se rassemblent pour former
une seule gouttelette plus grosse. Dans les émulsions H / E, la coalescence conduit finalement
à la formation d'une couche d'huile en surface [184].

1.4. Mécanisme de stabilisation des émulsions.

La stabilité des émulsions est gouvernée par de nombreux paramètres tels que le pH, la force
ionique, le ratio phase/volume, la viscosité et la température. La stabilisation et la durée de la
vie d’une émulsion sont conditionnées par la capacité de l’interface formée à maintenir la phase
liquide dispersée dans la phase continue.

La viscosité de la phase aqueuse, lorsqu’elle est augmentée, permet de ralentir la migration des
gouttelettes au sein de l’émulsion et donc de retarder la floculation, la sédimentation ou le
crémage. La granulométrie de l’émulsion (taille et distribution de taille) dépend de la fraction

69
volumique de la phase dispersée, du procédé de fabrication et de la nature des interactions
colloïdales (fréquence et efficacité des collisions).

Les émulsions ont besoin d’un agent stabilisateur pour stabiliser et réguler l’énergie en excès
contenu par l’interface : Les émulsifiants, ce sont des molécules tensioactives de petite masse
molaire ou des macromolécules capables de stabiliser les interfaces. Leur rôle est de faciliter la
formation des gouttelettes en s’adsorbant à l’interface entre les deux phases. Les émulsifiants
peuvent ainsi généralement diminuer la tension interfaciale, l’énergie à apporter au système
pour former des gouttelettes et réduire leur diamètre afin de retarder les phénomènes de
déstabilisation. Il existe différents types d’émulsifiants : les tensioactifs (TA), les particules
solides et les chaînes de polymères.

Les tensioactifs
Les tensioactifs (TA) sont des molécules amphiphiles qui abaissent la tension interfaciale entre
deux milieux non miscibles. Ils présentent au sein d’une même entité des groupements de polarités
différentes : l’une à caractère hydrophile, l’autre à caractère hydrophobe. Les tensioactifs se
rassemblent aux interfaces, en créant un film interfacial qui provoque la diminution de la tension
interfaciale. Selon le volume respectif de leur partie polaire et lipophile, les tensioactifs ont une
affinité plus ou moins grande avec l’eau ou l’huile.

Les TA sont répartis en quatre classes suivant la nature de leur partie hydrophile. La première
est constituée des TA anioniques ayant une tête polaire chargée négativement (ex : le dodécyl
sulfate de sodium ou SDS). La seconde classe comprend les TA cationiques dont la tête polaire
est chargée positivement (ex : le bromure de tetradecyltrimethyl ammonium ou TTAB). La
troisième classe contient les TA zwittterioniques ou amphotères dont la partie hydrophile est
chargée à la fois positivement et négativement, conduisant à une charge globale nulle (cas du
lauroamphodiacetate disodium). Enfin, la dernière classe est constituée des TA non ioniques qui
ne possèdent pas de charge sur leur partie hydrophile tel que polyoxyéthylène sorbitan de
monolaurate encore appelé Tween® 20).

Il existe une concentration seuil, appelée concentration micellaire critique (CMC), au-delà de
laquelle les molécules tensioactives s’auto-assemblent pour former des micelles, ou agrégats
supramoléculaires.

70
Lorsqu’un mélange d’huile, de phase aqueuse et de tensioactif est agité, l’émulsion qui se forme
préférentiellement est celle dont la phase continue solubilise le tensioactif, conformément à la règle
empirique de Bancroft [185]. Ainsi, l’émulsion préférentielle est de type H/E si le tensioactif est
hydrosoluble et de type E/H si le tensioactif est liposoluble.

Parmi les tensioactifs lipophiles disponibles sur le marché, qui stabilisent les émulsions inverses
(E/H) alimentaires, nous citerons les acides gras, les monoglycérides, le monooléate de sorbitan
ou la lécithine.

Le monooléate de sorbitan (Span 80) est un émulsifiant monomérique non ionique et biosourcé. Il
est obtenu à partir d’une réaction entre le sorbitol et les acides gras. Il est utilisé principalement
dans l’industrie cosmétique et pharmaceutique, ainsi que dans l’industrie alimentaire.

1.5. Procédés d’émulsification

La formulation d’émulsions se déroule généralement suivant quatre étapes [186]. La première

consiste à mettre les différents constituants à la même température et à additionner l’émulsifiant
dans la phase externe le plus souvent. La seconde comporte la pré-émulsification de la phase
dispersée au sein de la phase continue avec des tailles de gouttes assez grossières. La troisième est
une étape d’homogénéisation permettant la réduction de la taille des gouttelettes. Enfin, la dernière
étape est une étape de refroidissement où peuvent être ajoutés des additifs permettant de corriger
la viscosité, la brillance, la couleur...

La deuxième étape de pré-émulsification permet de disperser une phase dans l’autre. L’étape
d’homogénéisation assurée par des systèmes homogénéisateurs (rotor-stator, haute-pression ou
ultrasons) (Figure 14). Il existe également des procédés non mécaniques tels que la précipitation
de la phase dispersée au sein de la phase continue, ou l’inversion de phase obtenue en ajustant la
température [186].

71
Figure 14: Représentation des différents procédés d’émulsification (Schubert et Engel, 2004).

1.6. Mesure de la stabilité d’émulsions.

Des modèles mathématiques développés peuvent être utilisés pour prédire la stabilité des
émulsions vis-à-vis de la séparation par gravitation. Par exemple, la vitesse à laquelle une particule
sphérique isolée dans un liquide idéal (newtonien) est donné par la loi de Stokes (McClements,
2005)[189]:

2𝑔𝑔𝑟𝑟2 (𝜌𝜌2 − 𝜌𝜌1 )

Equation 2: 𝜐𝜐𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠 = −
9𝜂𝜂1

Où, υstokes est la vitesse de crémage, r est le rayon de la particule, g est l'accélération due à la
gravité, ρ est la densité, η est la viscosité de cisaillement, et les indices 1 et 2 se réfèrent à la phase
continue et dispersées, respectivement. Le signe υstokes détermine si la particule se déplace vers le
haut (+) ou vers le bas (-), c'est-à-dire si les particules crèment ou sédimentent.

La stabilité d'une émulsion alimentaire au crémage peut être estimée à l’aide de la loi de Stokes.
Par exemple, des gouttelettes de la phase huileuse de rayon 0,2 micromètre (ρ2 = 910 kg m− 3) en

72
suspension dans une phase aqueuse (η1 =1 mPa s, ρ1 = 1000 kg m− 3) crémera à une vitesse de 0,68
mm par jour.

La cinétique de la séparation gravitationnelle d’une émulsion peut être suivie visuellement [188].

Pour mesurer l’indice de crémage, l'émulsion à analyser est placée dans un tube à essai transparent,
doucement agité pour s'assurer qu'elle est initialement homogène, laissée pendant un certain temps
(ou exposée à un stress environnemental spécifique), puis à la hauteur des limites formées entre
les différentes couches est mesurée (Figures 15 et 16).

Idéalement, la couche du sérum doit être optiquement transparente, la couche d'émulsion doit avoir
une apparence similaire à celle de l'émulsion d'origine, et la couche de crème doit être optiquement
opaque. Le degré de crémage peut alors être simplement caractérisé par un indice de crémage
(équation 3) :
𝐻𝐻
Equation 3: CI = 100× 𝐻𝐻 𝑠𝑠
𝐸𝐸

Où, HE correspond à la hauteur totale de l'émulsion et HS à la hauteur de la couche de sérum.

L’indice de crémage commence à zéro et augmente avec le temps, à mesure de la migration des
gouttelettes.

Figure 15: Représentation schématique de la distribution verticale des gouttelettes dans

une émulsion huile dans eau instable à la formation de crème : (I) système initial (couche unique) ; (II)
temps intermédiaires (trois couches) ; (III) système final (deux couches) (McClements, 2005).

73
Figure 16: Représentation schématique du crémage dans une huile dans l'eau polydispersée.

1.7. Capacité émulsifiante d’un tensio-actif

La capacité émulsifiante (CE) d'un émulsifiant hydrosoluble est définie comme la quantité
maximale d'huile pouvant être dispersée dans une solution aqueuse contenant une quantité
spécifique de l'émulsifiant sans que l'émulsion ne se décompose ou ne soit inversée en une
émulsion eau dans huile [189]. Expérimentalement, la CE est habituellement déterminée en plaçant
une solution émulsifiante aqueuse dans un récipient et à l’agiter de manière continue à l'aide d'un
mélangeur à grande vitesse, et en titrant de petits volumes d'huile. Le point final du titrage se
produit lorsque l'émulsion se décompose ou est inversée, ce qui peut être déterminé par des
mesures de conductivité optiques, rhéologiques ou électriques. Plus le volume est grand, plus la
capacité d'émulsion de l'émulsifiant est grande. Bien que ce test soit largement utilisé pour
caractériser les émulsifiants, il peut contenir un certain nombre de limites [189].

L'indice de stabilité des émulsions [190] est un paramètre largement utilisé par les chercheurs de
l'industrie alimentaire depuis de nombreuses années. A l'origine, l'indice de stabilité de l'émulsion
(ESI) était déterminé à partir de mesures de la turbidité d'une émulsion diluée réalisées à l'aide
d'un spectrophotomètre UV-visible à une longueur d'onde particulière :

𝜏𝜏 (0)𝑡𝑡
Equation 5: ESI = 𝜏𝜏(𝑡𝑡)−𝜏𝜏(0)

74
Où, τ (0) est la turbidité initiale de l'émulsion et τ (t) est la turbidité mesurée à l'instant t. Cette
approche relativement simple doit être traitée avec prudence car il n’existe pas de relation
mathématique simple entre la turbidité de l’émulsion et la taille des particules, en particulier dans
la région où le rayon des particules est approximativement égal à la longueur d’onde de la lumière
utilisée [187]. En effet, la turbidité de l'émulsion peut soit augmenter, soit diminuer en augmentant
la taille des particules, en fonction de la taille initiale des particules. Il est donc recommandé de ne
pas utiliser cette approche car il existe des méthodes beaucoup plus précises et fiables pour
déterminer la stabilité de l'émulsion (par exemple, les particules).

1.8. Rôle des émulsions

La formulation des molécules actives sous forme d’une émulsion a pour but d’améliorer
l'application et les propriétés des différents extraits actifs. Le développement des émulsions pour
la protection des plantes ou le traitement des fruits a donné lieu à quelques travaux. Clausse et
coll. (2018) [191] ont préparé une émulsion inverse en utilisant le lécithine et le polyricinoleate de
polyglycérol comme surfactants pour encapsuler les polysaccharides afin d'améliorer l'efficacité
de la pulvérisation sur les feuilles des végétaux notamment les pommes de terre. YA Batta (2004)
[192] a formulé des conidies de Trichoderma harzianum dans des émulsions d'eau dans l'huile
avec Tween 20 pour inhiber la moisissure de la pomme bleue.

Lorsqu'une huile essentielle est la composition active, en raison de sa faible solubilité dans l’eau,
elle peut être encapsulée dans une phase huileuse qui est dispersée dans l'eau avec un émulsifiant
comme Tween-20 ou le triton-X100 [193-194]. Ribes et al. (2017) [195] ont encapsulé les huiles
essentielles dans des nanoémulsions formulées avec Tween-20 et l'huile de tournesol pour
améliorer l’activité inhibitrice vis-à-vis de la croissance mycéliale de A. niger et de la germination
de spores.

2. Synthèse des tensioactifs

2.1. Choix d’une molécule plateforme

Certains acides organiques d’origine naturelle sont utiles pour la synthèse de molécules
fonctionnelles, tels que des agents émulsifiants.

75
2.1.1. Acide citrique :

L’acide citrique ou l’acide 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylique est un triacide de formule

C6H8O7 (Figure 17). L’acide citrique se présente sous forme de cristaux incolores, translucides,
assez friables, légèrement efflorescents ou sous forme de poudre cristalline. La production de
l’acide citrique est d’environ 1,7 millions de tonne par an, avec 90% obtenues par fermentation et
10% d’origine synthétique à partir de l’acétone.

L’acide citrique peut être utilisé dans les domaines alimentaires, pharmaceutiques ou cosmétiques.
Dans l’industrie agroalimentaire (70%) en tant qu’acidulant dans les boissons, que conservateur
dans les sucreries (E330) ou encore en tant qu’agent chélatant dans l’industrie de conserves. Il
permet de préserver la couleur et prévient la décoloration des aliments en conserve [196]. Dans
l’industrie pharmaceutique, l’acide citrique est utilisé comme anticoagulant, comme agent
effervescent dans les dentifrices, ou encore comme complément de calcium sous la forme de citrate
de calcium [197-198]. Le citrate de triéthyle (E1505) est listé au Codex alimentarius, comme
émulsifiant et stabilisant. Il est également inséré dans la composition de produits cosmétiques et
pharmaceutiques [199].

Figure 17: Acide citrique.

2.1.2. Acide aconitique

L’acide aconitique ou l’acide 1-propène-1,2,3-tricarboxylique (C6H6O6) est un triacide

aliphatique, insaturé. Il est l’acide majoritaire des mélasses et se retrouve également dans les
vinasses. Peischier en 1820, a donné le nom d’acide aconitique lorsqu’il a été isolé de l’Aconitum
nappelus et paniculatum. En 1877, il a été identifié dans les mélasses de canne à sucre par Behr
[200]. Il est également présent dans les mélasses de betterave et dans de nombreuses céréales [201].

76
A l’état naturel, l’acide aconitique est un solide cristallisé blanc qui existe sous deux formes
isomères ; la forme cis et la forme trans (Figure 18).

Figure 18: Forme cis et trans de l'acide aconitique.

L’acide aconitique, préparé industriellement par déshydratation de l’acide citrique par de l’acide
sulfurique, a généralement la configuration trans. L’essentiel des données physiques se rapporte à
cette forme. La forme cis est la plus rencontrée à l’état naturel car elle intervient dans le cycle de
Krebs. Cependant, dans la canne à sucre, c’est la forme trans qui est prédominante due à l’action
de l’aconitate isomérase [202].

L’acide trans-aconitique est la forme la plus stable donc moins réactive que l’acide cis-aconitique.
Selon les travaux de Ambler et Roberts [203] , l’équilibre cis-trans est influencé par le pH. Pour
des solutions faiblement alcalines, c’est la forme cis qui prédomine alors que pour des solutions
fortement acides ou fortement basiques, c’est la forme trans. En solution aqueuse, 85% d’acide
sont convertis en forme trans à l’équilibre.

L’acide aconitique est employé comme acidulant ou exhausteur de la saveur de goût dans
l’industrie alimentaire [204-205], comme herbicide en agriculture [206], contre les œdèmes en
médecine [207]. En le combinant à des principes actifs, les dérivés d’acide aconitique trouvent des
applications dans la cosmétique pour le traitement de l’herpès [208], ou en pharmacie pour ses
propriétés antibactériennes et anti-tumorales ou encore anti-VIH. Piang-Siong et al. (2017) [209]
ont évalué les propriétés de l'acide aconitique en tant que molécule antioxydante seule ou en tant
qu'agent promoteur d'une formulation antioxydante contenant d'autres molécules antioxydantes
connues.

L’acide aconitique peut être employé pour la synthèse de dérivés d’hydrazine qui sont utilisés dans
des émulsions photographiques afin d’accroitre la sensibilité et le contraste de ces émulsions. A

77
partir de l’acide aconitique, on peut également envisager la synthèse d’esters identifiés comme
plastifiants d’une formulation de PVC [210].

2.2. Transformations en Chimie Verte

Jusqu'au début des années 90, les performances d'une réaction n'étaient jugées que sur son
rendement sans se soucier des conditions de mises en œuvre.

Le concept de chimie verte a été développé dans les années 1990 aux Etats-Unis dans le cadre de
la prévention de la pollution liée aux industries chimiques. En 1991, l’EPA (Environmental
Protection Agency) est la première à donner une définition à la chimie verte :

La chimie verte a pour but de concevoir des produits et des procédés chimiques permettant de
réduire ou d’éliminer l’utilisation et la synthèse de substances dangereuses.

Sheldon [211] a par la suite précisé cette définition, pour qu’elle soit applicable à une réaction de
synthèse organique : La Chimie verte utilise efficacement des matières premières (de préférence
renouvelables), produit peu ou pas de déchets, et évite l’utilisation de réactifs et solvants dangereux
ou toxiques pour la fabrication et l’application de produits chimiques.

Les douze principes de la chimie verte, proposés par Anastas et Warner [212] en 1998 constituent
un guide pour l’élaboration de synthèses plus vertes (Figure 19).

78
Figure 19: Les douze principes de la chimie verte.

En fait, la chimie verte contribue au développement durable, car elle repose sur trois piliers dits
"EES" : l’environnement, l’économie et le sociétal. En effet, il s'agit de répondre aux
préoccupations des chercheurs et de l'industrie chimique pour concevoir de nouveaux procédés
propres et innovants, qui permettent, de plus, d'améliorer l'image de la chimie auprès du grand
public.

2.2.1. Indicateurs verts

Les chercheurs ont longtemps développé des procédés de synthèse efficaces sans se soucier du
coût, de la toxicité des réactifs utilisés ou des sous-produits formés. Avec l’émergence du concept
de la chimie verte, d’autres paramètres doivent donc être établis afin de mesurer l’impact
environnemental des réactions chimiques.

Parmi les critères les plus utilisés, figurent le facteur environnemental (Environmental impact
factor : E) développé par Sheldon [213], l’économie d’atomes (Atom economy : AE) proposé par
Trost [215] et l’efficacité massique de réaction (Reaction mass efficiency : RME) [214].

Facteur environnemental (E-Facteur)

Le facteur environnemental (E-facteur) développé par Sheldon évalue l’impact environnemental

:

(𝑚𝑚 𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤)𝑖𝑖
𝐸𝐸 − 𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹 = �
𝑖𝑖 (𝑚𝑚 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝)𝑖𝑖

Le calcul est basé sur la quantité de déchets produite par unité de masse.

Economie d’atomes

Depuis toujours, les chimistes ont caractérisé l’efficacité d’une réaction par son rendement et sa
sélectivité. Trost, est le premier à développer le concept d’économie d’atomes afin d’inciter les
chimistes à s’orienter vers des réactions. L’économie d’atomes quantifie la quantité de réactifs
dans le produit final. La méthode de calcul ne tient pas compte du rendement. L’économie
d’atomes est calculée à partir des masses molaires des réactifs et du produit mis en jeu. Pour une

79
réaction du type : A + B → C, l’économie d’atomes se calcule de la façon suivante (cas de
coefficients stœchiométriques égaux à 1) :

𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 𝐶𝐶
𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑑𝑑′ 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 = ×100
𝑀𝑀𝐴𝐴 +𝑀𝑀𝐵𝐵

Efficacité massique de la réaction

L’Efficacité Massique de Réaction (EMR) exprime le pourcentage de la masse des réactifs qui se
retrouvent dans le produit. Donc pour une réaction du type : A + B → C

𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 𝐶𝐶

𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 = ×100
𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝐴𝐴 +𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝐵𝐵

L’EMR évalue de façon globale les différents aspects d’une réaction verte.

2.2.2. Réaction d’estérification

La réaction d'estérification est une réaction usuelle en chimie. C'est pourquoi, elle a largement été
étudiée et est toujours couramment utilisée dans l'industrie. Cependant, elle présente une cinétique
assez lente. Il s’agit, de plus, d’une réaction limitée car réversible. Il existe plusieurs solutions pour
améliorer les performances d’une réaction d’estérification. Notamment, l’utilisation d’un
catalyseur homogène ou hétérogène associé à un apport thermique permet d’améliorer la cinétique.

Pour déplacer favorablement l’équilibre, il est nécessaire d'utiliser un réactif en excès et de soutirer
l’ester ou l’eau produite, au fur et à mesure de sa formation. L’eau est le plus souvent distillée,
piégée ou soutirée par un dispositif tel que la perévaporation [215]. On peut également introduire
un composé déshydratant (tamis moléculaire, silice, zéolites…) au mélange réactionnel.

La production d'esters d'aconitate a été étudiée dans les années 50, puis plus récemment, leur
synthèse en catalyse homogène a fait l'objet de plusieurs travaux [216-217].

2.3. Synthèse et applications d’esters biosourcés

Les acides organiques d’origine naturelle sont de potentiels candidats pour la synthèse d’esters
biosourcés, biodégradables et non toxiques. Quelques auteurs ont étudié la conversion de l'acide

80
aconitique en esters. En 1949, un premier brevet américain mentionnait la préparation de
l'aconitate de trialkyle en utilisant l’acide para-toluène sulfonique comme catalyseur et une
distillation azéotropique de l'eau [218]. Ce brevet revendique d’excellentes propriétés notamment
pour les aconitates de trilauryle et tributyle comme substances actives pour protéger les plantes
contre les insectes, les champignons et les bactéries. D’autres applications ont été mentionnées
pour les aconitates. Par exemple, De Oliveira et al. (2018) ont utilisé l'estérification de Fisher pour
préparer des aconitates de dialkyle aux activités anti-inflammatoires [219]. D’autre brevets
rapportent également la synthèse de citrates issus d’une estérification entre l'acide citrique et un
alcool polyoxyalkylé, rentrant dans la composition de formulations de shampooing, en tant que
surfactants [208]. Grigoryan et al. (2017) ont synthétisé des esters à partir de l'acide citrique avec
des alcools aliphatiques après 20 h réaction à 150 °C. Ces esters de haute pureté ont été utilisés
comme substituts alimentaires pour les huiles et les graisses comestibles [220].

Plusieurs esters d'acides naturels sont cités pour leurs activités antifongiques. Par exemple, l’acide
quinique de 5-O-caffeoyle et certains de ses esters d'alkyle ont empêché la croissance des
Aspergillus qui peuvent contaminer des récoltes de nourriture [221]. Suarez-Quiroz et coll. (2013)
ont également observé une croissance inhibée de certaines levures pathogènes humaines par le
trans-homoaconitate de triméthyle esters [222].

B) Formulations par microencapsulation

1. Microencapsulation

1.1. Définition

La microencapsulation regroupe un ensemble de technologies grâce auxquelles une substance

active et/ou sensible, et sous forme solide, liquide ou gazeuse, est protégée par un matériau
enrobant, via la formation de particules solides. Ce procédé, outre la protection des matières
actives, permet également de protéger les utilisateurs dans le cas d’actifs irritants ou toxiques, ou
encore de mieux contrôler la libération des molécules actives.

81
La microencapsulation a plusieurs finalités : La protection de la stabilité d’actifs sensibles (à
l’oxydation, à la température, à l’humidité…) ; la conservation des molécules actives en formes
solides, en poudres fluides ; le masquage d’odeur et/ou de goût des molécules encapsulées ; - la
réduction de l’évaporation de matières actives volatiles.

La microencapulation est très utilisée dans l’industrie alimentaire pour la préservation des
propriétés fonctionnelles, l’amélioration de la manipulation et de l’utilisation des bioactifs [223-
224].

2.2. Matière enrobant

Le système enrobant joue un rôle principal sur l’efficacité, de la stabilité des microparticules et sur
le degré de protection de la matière active.

Le choix des matériaux enrobants est basé sur leurs propriétés physico-chimiques (stabilité,
humidité, PH, oxydation), thermiques et mécaniques.

Il existe différente matrice des microparticules :

Les polymères synthétiques : Comme l’acide polylactique, polystyrène, polyacrylate d’alkyle,

polyuréthane... Ils sont généralement utilisés dans la médecine [224] et la pharmacie [225].

Les polysaccharides : Les hydrocolloïdes de type polysaccharide ont largement fait leur preuve
dans le domaine de la microencapuslation et sont d’usage courant dans des nombreux secteurs
d’activités (cosmétique, textile, pharmacie, agroalimentaire).

Les polysaccharides utilisés dans l’encapsulation sont l’amidon [226] , la maltodextrine [227] , la
gomme arabic [228], le chitosan [229], la cellulose/éthyle cellulose [230], la pectine [231]. Les
polysaccharides présentent un bon compromis entre le coût et l’efficacité, des propriétés
organoleptiques et une variété de masses moléculaire.

Les protéines : Les protéines d’origine végétale (protéines des soja, protéines de blé...) et animale
(protéines de lait, protéines d’œuf, caséine, gélatine) peuvent être employés comme matériaux
enrobant en microencapsulation. Quelques exemples d’utilisation des protéines en
microencapsulation : gélatine [232] , protéines de soja [233], protéine de lait [234], caséine [235].
Les protéines comme matériau enrobant en microencapsulationsont des matériaux biocompatibles

82
et biodégradables ; le caractère amphiphile des chaines protéiques permet d’encapsuler des
matières actives hydrophobes ou hydrophiles. La masse moléculaire élevée et la flexibilité de leurs
chaines permettent de bien enrober et de protéger la matière active. Les protéines ont de plus une
bonne solubilité dans l’eau et des propriétés gélifiantes.

2.3. Les procédés de microencapsulation

Les techniques de microencapsulation sont variées. Elles sont classifiées selon leur coût
énergétique, l’utilisation ou non de solvants organiques ou selon les domaines d’application.
Cependant, la classification la plus courante est celle distinguant trois types de procédés : les
procédés chimiques, les procédés physico-chimiques et les procédés mécaniques, comme présenté
dans le Tableau 15 [236].

Tableau 14: Procédés de microencapsulation (Ré, 2006).

Les procédés chimiques consistent en la polymérisation d’un ou plusieurs monomère(s) autour

de la matière active (pure ou en solution) conduisant à la formation in situ d’une membrane de
protection.

Les procédés physico-chimiques sont eux basés sur les différences de solubilité et les conditions
de précipitation des matériaux enrobants. Il s’agit dans le cas de la coacervation, de la précipitation
contrôlée d’un polymère en solution par ajout d’un non solvant ou d’un polymère incompatible.

83
Les procédés mécaniques sont basés sur des technologies comme l’atomisation ou le lit fluidisé,
qui sont des procédés de séchage, ou l’utilisation des fluides supercritiques et l’extrusion qui sont
déjà utilisés en tant que procédés d’extraction, et qui sont détournés pour une application en
microencapsulation.

2.3.1. Atomisation (ou spray-drying)

L'atomisation (ou spray-drying) est un procédé mécanique continu de séchage, qui permet la
transformation d'une phase liquide en une poudre sèche. Cette technique est peu coûteuse, simple,
rapide et largement utilisée industriellement dans des applications de séchage mais également de
microencapsulation [237-238].

La préparation de la phase liquide en amont de l’atomisation est essentielle. Dans le cas de la

microencapsulation, elle consiste à formuler principe actif (PA) et matériau enrobant dans un
solvant (le plus souvent aqueux). Dans le cas où PA et matériau enrobant sont tous deux solubles
dans le solvant, une solution sera obtenue [239]. Une étape d’homogénéisation est très souvent
envisagée afin de stabiliser ces préparations liquides.

L’atomisation en elle-même consiste en la pulvérisation de cette phase liquide et à son séchage

grâce à la circulation d’un courant d’air chaud au sein d’un appareil appelé atomiseur (Figure 20)
[240]. La phase liquide est pulvérisée dans une haute tour appelée chambre d’atomisation via une
buse d’atomisation. Le flux d’air chaud circulant à travers la chambre d’atomisation sèche les
gouttelettes de solution et le solvant s’évapore. Le séchage est considéré comme effectif lorsque
la température de la particule formée est égale à celle de l’air en sortie de la chambre d’atomisation.
Le flux d’air chaud entraîne l’air chargé en molécules de solvant et les microparticules en direction
du cyclone, pièce dont la géométrie permet la séparation et la récupération des microparticules
dans un récipient appelé collecteur. L’air est évacué vers la sortie après passage à travers un filtre.

84
Figure 20: Présentation schématique du procédé d’atomisation (Murugesan and Orsat, 2012).

2.3.2. Efficacité de la matière enrobant et l’atomisation

Différents types d'agents d'encapsulation ont démontré leur efficacité pour protéger les molécules
actives des extraits naturels par atomisation. On trouve les protéines [241-242] et divers glucides
tels que la maltodextrine, l'amidon ou le chitosan [243-244].
Certains extraits de fruits tels que des grenades, des grignons de myrtille, des sous-produits de
citron, ou tomates [245-248] ou d'autres extraits de feuilles [249-250] ont ont été encapsulés dans
des polymères naturels pour préserver leur qualité et faciliter leur utilisation.
La biomasse des microalgues et l'huile d'algues ont également été encapsulées par atomisation
[251-252] mais l'encapsulation d'extraits aqueux actifs des macroalgues l’algue verte Ulva lactuca
n’a jamais été rapportée.

85
III. Conclusion

Cette étude bibliographique a permis de faire l’inventaire des informations disponibles sur la
possibilité d’utiliser une algue verte pour lutter contre les maladies post-récolte des agrumes
causées par le pathogène [Link]. La première partie a présenté des généralités sur la
production des agrumes au Liban, ainsi que sur l’utilisation massive des pesticides chimiques dont
les effets secondaires sont maintenant mieux connus. Il en découle la nécessité de développer de
nouvelles méthodes de traitement par des biopesticides utilisant des molécules naturelles.
L’utilisation d’une algue verte ressource disponible localement représente une opportunité de
ressources agissant pour la protection des agrumes. Dans ce contexte, les caractéristiques connues
de l’algue verte Ulva lactuca ont été présentées, ainsi que les activités biologiques déjà étudiées.

La deuxième partie évoque les procédés de formulation envisageables pour les extraits. La
microencapsulation des extraits apparait adaptée pour conserver et stocker les extraits d’algues en
préservant leurs propriétés biologiques. Cette méthode utilisée pour les extraits naturels destinés à
l’agro-alimentaire ou à la cosmétique a été peu étudiée pour des extraits d’algues. Par ailleurs, la
formulation de l’extrait d’algue en émulsion offre la possibilité d’améliorer l’application et
l’efficacité des fractions actives. Pour cela, des agents émulsifiants dérivés de l’acide aconitique
ont été identifiés. Ces aconitates sont également cités comme molécules actives pour la protection
des plantes (brevet allemand de 1949). Une voie de synthèse de ces molécules répondant aux
principes de la chimie verte sera privilégiée.

Ce travail bibliographique a permis de cerner les enjeux du projet dans un contexte de

développement durable et de dégager les principales questions scientifiques qui ont jalonné
l’avancement des travaux.

• Quelles conditions d’extraction choisir pour l’obtention d’une fraction d’intérêt ?

• Quelle est la fraction, hydrophile ou lipophile, à cibler ?
• Quels sont les composés principalement à l’origine de l’activité fongique recherchée ?
• Comment stabiliser une émulsion contenant un extrait d’algue ?
• Quelle peut être l’influence de l’agent émulsifiant sur l’activité de l’extrait ?
• Quel est le mécanisme de résistance des cellules végétale à activer ?
• Comment agit le principe actif au sein de l’émulsion ?

86
Afin de pouvoir répondre à ces questions, plusieurs champs disciplinaires ont été mobilisés
notamment la biochimie, l’analyse chimique, la physico-chimie et la microbiologie. Ainsi, ce
travail s’est articulé en quatre parties :

• Etude de l’extraction et de la caractérisation des extraits en termes de compositions

• Evaluation du potentiel anti-fongique des extraits aqueux et organiques
• Microencapsulation des extraits aqueux – influence sur l’activité anti-fongique (tests in
vitro)
• Formulation des extraits aqueux en émulsions – influence sur l’activité anti-fongique (tests
in vitro et in vivo)

87
Chapitre 2 : Extraction de molécules d’intérêt et évaluation de leurs
propriétés biologiques.

Article I. Utilisation des extraits de l'algue verte Ulva lactuca comme source de
substances actives dans la lutte des moisissures vertes des agrumes après récolte.

Cette partie a été consacrée à évaluer le potentiel des molécules actives d’Ulva lactuca à être
utilisée comme alternative pour protéger les agrumes contre les champignons après récolte. Ces
algues sources de pigments, de polysaccharides, d’anti-oxydants et de protéines peuvent conduire
à des extraits de compositions variables. L’objectif est d’identifier les extraits les plus riches en
molécules actives.

L’étude débute par la sélection d’algues vertes « Ulva lactuca » de la côte Libanaise dont les
propriétés seront comparées avec celles des algues de la même famille importées de Chine de
qualité alimentaire ou agricole (Feed and Food grades). Les fiches techniques de ces échantillons
d’Ulva lactuca séchées sont en annexe I. Certaines informations y sont mentionnées concernant
les teneurs en lipides, en fibres, en protéines, en mannitol et en carotènes.

Les données bibliographiques ont mentionné que les principaux composants chez Ulva lactuca
sont les sucres (sulfatés ou non) et les protéines, évalués respectivement à 24 % et 26,3 % de la
biomasse sèche [253]. La teneur en lipides extraite par un mélange méthanol/dichlorométhane
s’élève à quelques pourcents.

Une méthode d’extraction par macération a été choisie en privilégiant des solvants verts (eau,
éthanol et acétate d’éthyle) et conduit à des extraits de compositions différentes (Figure 21). Des
méthodes chromatographiques et spectrophotométriques ont été utilisées pour l’analyse des
extraits.

88
Figure 21: Extraits réalisés par macération dans l’eau, l’éthanol, l’acétone et l’acétate d’éthyle.

Nous avons également testée une extraction par SC-CO2, méthode encore peu étudiée pour les
algues. Parjikolaei et al., (2016) ont mis en œuvre ces conditions supercritiques pour extraire les
caroténoides d’Ulva lactuca, avec un rendement d’extraction amélioré lorsque 5% d’éthanol est
utilisé en co-solvent [254].

La cellule d’extraction a été remplie de 15 g d’algue sèche broyée (Ulva lactuca du Liban). La
température de l’extracteur a été maintenue à 50°C, celle du séparateur fixée à 60°C. Une pression
de 240 bars a été appliquée avec un débit de CO2 de 80 mg/min.

2.5
Rendement d'extraction (%)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0 50 100 150 200
Temps (min)

Figure 22: Rendements d’extraction de l’Ulva lactuca séchée (P= 240°C, 80 mg/min).

89
Sur une plage de temps de 3 heures dédiée à cette extraction, un rendement de 2,5 % a été atteint
(Figure 22). L’allure de la courbe montre que le rendement d’extraction maximum n’a pas été
atteint, car il est probable que d’autres composés que les lipides aient été extraits. L’extrait obtenu
est de couleur jaune pâle, ce qui indique que la chlorophylle n’a pas été extraite dans ces
conditions. La cinétique d’extraction observée pour Ulva lactuca est plutôt lente. En effet,
l’extraction de lipides de graines de fruit réalisée dans des conditions similaires a été achevée au
bout de 2 heures.

Les fractions lipidiques extraites à l’acétate d’éthyle et par CO2 supercritique ont été analysées par
chromatographie en phase gazeuse. Le protocole et un exemple de chromatogramme se trouve en
annexes 2 et 3.

Pour les différents échantillons extraits à l’acétate d’éthyle (Tableau 15), les acides gras saturés
(AGS) sont les plus abondants, avec une teneur entre 86 et 90 %. L’acide palmitique (C16: 0) est
l’acide principal des échantillons Food et Feed avec de teneurs entre 57–73%, tandis que l’acide
arachidique (C20:0) attaint 56% pour l’Ulva lactuca du Liban.

Ulva lactuca de qualité Feed présente la teneur la plus élevée en acides gras polyinsaturés (AGPI)
and monoinsaturés (AGMI), ce qui confère à cet échantillon une qualité nutritionnelle intéressante.

Tableau 15:Composition en acides gras de l’extrait d’Ulva lactuca réalisé à l’acétate d’éthyle (en %
relatifs).

Macroalgue
Chinese Ulva lactuca Lebanese Ulva
Acides gras
Food powder Feed powder lactuca
C10:0 acide caprique 8.0 ± 0 0.4 ± 0 0.8 ± 0
C14:0 acide myristique 1.2 ± 0 5.3 ± 0 0.6 ± 0
C16:0 acide palmitique 73.8 ± 0 57.4 ± 1.1 28.5 ± 0.1
C18:0 acide stéarique 4.1 ± 0 1.5 ± 0 0.4 ± 0
C20:0 acide
3.6 ± 1.0 13.1 ± 0 56.3 ± 1.1
arachidonique
C16:1n-7 acide
2.7 ± 0 2±0 2.2 ± 0
palmitoleique
C18:2n-6c acide
6.7 ± 0 9.1 ± 0 11.1 ± 0
linoleique
C18:1n-9c acide oléique n.d. 11.29 ± 0 n.d.

90
 Acides gras saturés 90.6 ± 0 77.6 ± 0 86.6 ± 0
Acides gras
2.7 ± 1.0 13.3 ±0 2.2 ± 0
monoinsaturés
Acides gras
7 ±0 20.4 ±1 11.1 ± 0
polyinsaturés

Les extraits réalisés dans les conditions supercritiques présentent majoritairement de l’acide
palmitique et stéarique. Plusieurs auteurs tel que Bhagavathy et al., (2011) ont remarqué que les
fractions lipophiles des algues vertes riches en acide palmitique ont une activité anti-fongique
[255].

Par ailleurs, la fraction polaire des algues vertes contient souvent des composés phénoliques qui
apportent des propriétés anti-oxydantes [256]. C’est pourquoi, les teneurs en polyphénols des
fractions aqueuse et éthanolique ont également été évaluées (Figure 23).
Total polyphenol content (g GAE/100 g d.b.).

0.6
Aqueous extracts
Ethanolic extracts
0.4

0.2

0.0
a

e
PF
uc

PF
ct

l.
l.
la

U
U
a

se
se
lv

ne
ne
U

hi
hi
se

C
C
ne
ba
Le

Figure 23:Teneurs en polyphénols totaux des fractions aqueuses et éthanoliques d’Ulva lactuca.

Les résultats montrent que les extraits éthanoliques des algues chinoises sont riches en composés
phénoliques. Les composés phénoliques des algues chinoises sont de natures différentes de ceux
de l’algue libanaise, car les affinités avec les deux phases ne sont pas les mêmes.

91
Enfin, a été évaluée la capacité des extraits aqueux d'algues (SAE) et des extraits organiques (SOE)
à lutter contre les moisissures vertes des agrumes après récolte. Pour cela, quatre approches ont
été utilisées : l’inhibition de la germination des spores de Penicillium digitatumsur le milieu de
dextrose de pomme de terre (PDB), la viabilité des champignons sur la gélose à l'extrait de malt
(MEA), l’adhésion des spores sur les cellules épidermiques des oranges et la méthode de diffusion
sur disque gélosé.

Les résultats ont montré une inhibition de la germination des spores pour tous les extraits variants
entre 70 et 87%, comparé à l’eau (contrôle négatif) et à la Nystatine (fongicide de référence). Une
inhibition totale (CFU=0) de la viabilité de P. digitatum avec SAE et SOE a été montrée. Les
extraits liquides d'algues (SLE) ont montré une faible adhésion des spores sur l’épiderme des
oranges (Indice d’adhésion (IA) <10). La méthode de diffusion sur disque gélosé a montré que
tous les extraits SLE sont actifs dans des proportions variables en fonction du solvent de référence.
Les fraction ulvanes d’U. lactuca ont montré une inhibition maximale de croissance de P.
digitatum.

92
Article

Control of postharvest citrus green mold using Ulva

lactuca extracts as a source of active substances
Douaa Salim 1,2, Pascale de Caro 2, Othmane Merah2,3, Asma Chbani 1,4.

1 Laboratory of applied biotechnology, Azm Center for Research in Biotechnology and its Applications, Lebanese
University, Tripoli, Lebanon.; [Link]@[Link]
2 Laboratoire de Chimie Agro-industrielle (LCA), Université de Toulouse, INRA, Toulouse INP, France ;

[Link]@[Link], [Link]@[Link], [Link]@[Link]

3 Université Paul Sabatier, IUT A, Département Génie Biologique, 24 rue d’Embaquès 32000 Auch, France.

4 Faculty of Public Health III, Lebanese University, Tripoli, Lebanon; achbani@[Link]

* Correspondence: [Link]@[Link], [Link]@[Link], Tel: +33534323505

Received: date; Accepted: date; Published: date

Abstract: Penicillium digitatum, the causal agent of citrus green mold, is responsible for 90% of postharvest
losses. Chemical fungicides are responsible for damage to human health and the environment. For instance,
the exploitation of green algae as a source of pigments and carbohydrate polymers has been the target of
special attention. In this study, we evaluated the ability of Ulva lactuca extracts and their active molecules
collected from Lebanon and imported from China for the biocontrol of postharvest citrus green mold.
Seaweed aqueous extracts (SAE), organic extracts (acetone, ethanol and ethyl acetate) (SOE) and their
chlorophylls and ulvans fractions of Ulva lactuca were studied. Four approaches were used to evaluate their
antifungal properties: inhibition of the conidia germination of P. digitatum on potato dextrose broth (PDB),
fungus viability on malt extract agar (MEA), adhesion of spores to epidermal orange cells, and the disk
diffusion method. The results showed an inhibition of spore germination for all extracts ranged between
70 and 87%, compared to the control. A total inhibition (CFU=0) of P. digitatum viability with SAE and SOE
was shown. Seaweed liquid extracts (SLEs) showed low adhesions according to the index adhesion (IA<10).
The agar diffusion method showed that all SLEs had high inhibition zones ranged from 11 mm to 16 mm
at the concentration of 50 g.L-1. The separated chlorophylls (Chlorophyll a) and ulvan fractions showed a
maximum growth spore inhibition. These findings are promising to develop safe and effective bioactive
formulations for citrus fruit postharvesting protection.

Keywords: Ulva lactuca; green solvent extraction; chlorophylls, ulvan, anti-fungal activity.

1. Introduction

During storage, citrus fruit is frequently exposed to numerous postharvest diseases, generally caused
by pathogenic molds, which usually infect the host after harvest, and during handling and/or processing
[1]. Green mold caused by Penicillium digitatum is the most significant postharvest disease that affects citrus

93
fruit produced in Mediterranean climate countries, and it can lead to important financial losses during
refrigeration, transport, and marketing [2]. To control this postharvest disease, several chemical fungicides
have traditionally been used, including imazalil (IMZ), thiabendazole (TBZ) and sodium o-phenylphenate
(SOPP) [3]. However, even though these products were successfully used over more than 25 years and
were proven to be highly effective, the global tendency seems to be shifting towards a minimal use of
chemical fungicides on produce, and hence, there is a need to pursue safer and more eco-friendly
alternatives for reducing the decay loss in the harvested commodities [4-5]. In fact, the intensive use of
chemical fungicides promote the development of resistant isolates of Penicillium spp. [6]. Moreover,
increasing concerns regarding the residues of fungicides in the fruit, as well as the risks associated with
their continued use, have prompted a search for safe and effective alternative strategies [7]. The use of
fungicides has been efficient in decreasing loss due to the deterioration of food, but it also generates health
and environmental concerns mainly due to the carcinogenic and/or teratogenic properties of the
compounds, and their cumulative toxic effects.
Thus, it is of the utmost importance to developing new strategies for postharvest disease control,
especially due to the increasing restrictions on the use of pesticides by regulatory agencies and consumer
affairs institutions. Among these strategies, the action of natural substances from green macroalgae has
received increasing attention in the area of postharvest pathogen management. The natural substances,
which are present in green macroalgae, are pigments, polysaccharides, proteins, polyphenols and lipids.
They could be used to treat plants with less environmental impacts [8-9].
Seaweeds have a wide diversity in their biochemical composition, which is related to their
physiological and biochemical characteristics [10]. There are more than 15,000 primary and secondary
metabolites that have been produced during different metabolic pathways of seaweeds with various
applications [11]). The principal cell wall polysaccharides in green seaweeds are ulvan, they are the major
constituents of green seaweeds cell walls representing 8 to 29% of the algal dry weight [12]. They are
ramified acidic and sulphated polysaccharides constituted by a central backbone of disaccharide units
formed by an L-rhamnose 3-sulphate linked to: (i) a D-guluronic acid residue (ulvabiouronic acid unit A);
(ii) a L-iduronic acid residue (ulvabiuronic acid unit B); (iii) a D-xylose 4-sulphate residue (ulvabiose unit
A); or (iv) a D-xylose residue (ulvabiose unit B) (Figure 1).

Figure 1: Disaccharide units of ulvabiuronic acid and ulvabiose in ulvans of green seaweeds.
Ulvan has already proven to be a remarkable polysaccharide with different attractive properties that
make it suitable for a wide range of applications. In fact, this polysaccharide displays physico-chemical and
biological properties of potential interest for diverse applications (food, pharmaceutical, agricultural, and
chemical applications). Ulvans has demonstrated significant biological activities such as anti-cancer [13],
[14], [10], anticoagulant [15], antioxidant [16], antiviral [17].
Few results concerning to the anti-fungal activities of green macroalgae Ulva lactuca have been
reported. Methanolic and ethyl acetate extracts of Ulva lactuca collected from the Egyptian Mediterranean
coast have shown a high antifungal activity [18]. Acetonic extracts of Ulva lactuca have shown inhibition

94
activity on Penicillium purpurescens [19], while ethyl acetate extracts of green algae have acted on the growth
inhibition of virulent strains of bacteria and fungi pathogenic to humans [20]. The green seaweed Ulva linza
showed a greater protection activity than the browns seaweeds Padina pavonica and Sargassum vulgare for
protecting citrus fruits against the postharvest green mold Penicillium digitatum [21]. However, the
antifungal activity of ulvan against P. digitatum on citrus fruit was not studied.
Therefore, the present study intended to estimate the variation in the biochemical constituents of
extracts from the Chlorophyta Ulva lactuca collected from Lebanese coastal zones or imported from China.
Green solvents have been selected to perform an eco-friendly extraction. In vitro tests have been
implemented to assess the antifungal activities of Ulva lactuca liquid extracts (SLEs) and their fractions of
chlorophylls and ulvan against Penicillium digitatum. A new methodology has been implemented to test the
adhesion properties of spores, as their adhesion to orange cells is one of the first stages of the colonization
and can be considered as the starting point of the infectious process. The objective is to evaluate the ability
of these extracts to be as an alternative to chemical fungicides in the process of controlling postharvest
phytopathogens in fruit.

2. Materials and Methods

2.1. Materials

Three different samples of Ulva lactuca were studied. Lebanese Ulva lactuca (Leb Ul.) was freshly and
manually collected from a coastal zone of the Mediterranean, El Mina (34 ° 26 'N–35 ° 50' E) in Tripoli,
Lebanon, on 1 May 2017. The algae were cleaned with seawater to remove unwanted impurities, then
cleaned three times with distilled water and dried at room temperature until the mass remained constant.
The samples were then stored hermetically at room temperature. Two other amounts of dried Ulva lactuca
Food and Feed quality (Ch Ul. PFo , Ch [Link] ) were purchased from Fujian, Mainland China (Fuzhou
Wonderful Biological Technology Co., Ltd.).

2.2. Preparation of seaweed liquid extracts (SLEs)

According to a previous study [22], the seaweed liquid extracts (SLEs) were prepared from 5 g of dried
algae in 100 mL of solvent.

Figure 2: Strategy of Ulva lactuca up-grading in the present study.

95
2.2.1. Seaweed Aqueous extracts (SAE)

SAE was prepared according to Jiménez et al. (2011) [23]. Five grams of dried algae was put in a 100 mL
flask. A volume of 100 mL of boiling Milli-Q water was added. The medium was stirred magnetically for
one hour at room temperature. The extract was then filtered twice through a double layer of sterile
muslin filter (20 cm x 20 cm). After filtration, water was evaporated to provide a dry material. The
extracts were stored at 4 ºC until analysis.

2.2.2. Seaweed Organic extracts (SOE)

Five grams of algal material were macerated in 100 mL of organic solvent at room temperature for a
period of three days, with regular shaking (orbital shaker) [24]. After filtration, organic solvents (acetone,
ethyl acetate, and ethanol) were evaporated under vacuum at 45 °C to produce a dry material. The extracts
were stored at 4 ºC until analysis.

2.3. Extraction of active molecules

2.3.1. Ulvan extraction

Twenty grams of dried seaweed were treated at room temperature with a [Link] MeOH-CHCl3–H2O
mixture to remove colored matter, filtered and vacuum dried to obtain defatted algal biomass [25]. This
material was used to extract Ulva following the method of Mao et al. (2006) [26].The resulting alga was
placed into 400 mL of water. This solution was continuously stirred and kept at 80–90 °C in a hot-water
bath for 2 h. The aqueous extract was centrifuged, and the liquid supernatant was filtered. The water extract
was concentrated by a rotary evaporator to reduce the volume. The water extract was centrifuged, filtered
and precipitated with 3 vol. of absolute ethanol. The alcohol precipitate was separated, washed several
times with ethanol, and dried in a vacuum oven at 40 °C, then re-dissolved in distilled water, dialyzed
against distilled water and freeze-dried to obtain highly purified ulvan.

2.3.2. Pigments extraction

Five grams of Ulva lactuca were homogenized in acetone (100 mL, 80%) and allowed to stand
overnight in dark at 4 ºC for complete extraction followed by centrifugation at 10 000 g for 5 min.

[Link]. Fractionation of pigments by TLC

The pigments present in the acetone extracts were separated by the thin layer chromatography. on 10
× 20 cm silica gel plates (Sigma Aldrich). 5 µL of Ulva lactuca extracts were applied to 1 cm of the base of
plate and developed with hexane/ acetone (75:25 v/v) [20]. The separated compounds were located and
identified by visualizing plates stained with a UV lamp at 254 nm and 365 nm and observed pigments
colors bands. The Rf values of pigments were measured and compared with the reports available for
standard pigments.

[Link]. Separation of Chlorophyll a and b

The separation of Chlorophyll a and b Ulva lactuca, was carried out by the method of differential
solubility of pigments in organic solvents [27].

2.4. Characterization of SLEs, ulvans and pigments fractions

96
2.4.1. Pigments analysis with High Pressure Liquid Chromatography coupled with UV detector (HPLC-
UV)
The acetonic extracts of Ulva lactuca were analyzed by an external calibration method using a Dionex-
DAD-Ref Dionex-Refractometer diode (UltiMate 3000). The samples were diluted with methanol and
filtered using a micro-filtration cartridge Polyray 0.45 micron to eliminate cell residues. The column (SunFir
Watess) C18 used was an apolar column (5 μm, 4.6 × 150 mm) with a pre-column. The temperature of the
furnace was 50 °C, the injection volume was 20 μL and λ = 430 nm. The mobile phase was a mixture of
solvent A (H2SO4 5mM), B (acetone), C (H2O) and D (pure methanol), according to a step gradient, lasting
30 min, which started from 55% B, changing at 62% in 1 min, rising up to 100% B at 15 min and 25% D.
Then, the mobile phase composition was kept constant until the end of the analysis. Total acquisition time
was 30 min. The analyzed compounds were identified by comparing their elution times with those of the
standards.

2.4.2. Spectrophotometric scanning for chlorophylls fractions.

The chlorophyll fractions were scanned using a Thermo Scientific spectrophotometer. Triplicate
scanning was performed in a 3-mL quartz cell in the range 400-700 nm. The degree of purity was defined
as the relative percent of chlorophyll area peak to the total area of peaks determined either by a
spectrophotometric scanning from 300 to700 nm or by HPLC using absorbance measurements (430 nm).

2.4.3. Polysaccharide analysis by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Five concentrations (5 mg. L-1, 15 mg. L-1, 30 mg. L-1, 60 mg. L-1, and 100 mg. L-1) of standards (glucose,
galactose, xylose, arabinose, rhamnose, fucose, mannose, mannitol, and sucrose) were dissolved in 1000
mL of Milli-Q water, and then 125 μL of fucose standard was added. One milliliter of aqueous extract was
dissolved in 25 mL of Milli-Q water, and then 3mL of the solution with 125 μL of fucose standard was
added to the vial, after filtration with the micro-filtration cartridge Polyray 0.45 micron.
Polysaccharides were analyzed by ion exchange chromatography with a CarboPac PA1 column
(Dionex). The eluent was potassium hydroxide, at a flow rate of 1 mL/min. The following concentration
gradient was used: 2 mM for 39 minutes, increasing to 10 mM for 2 minutes, 100 mM for 8 minutes and 100
mM for 3 minutes. The temperature was set to 25°C. The injection volume was 25 µL. External standards
were used for polysaccharide identification. Fucose was used as an internal standard for polysaccharide
quantification.

2.4.4. Anion and organic acid analysis by High Pressure Ion Chromatography (HPIC)

Chromatographic analysis was performed using a Dionexm incorporating an AS 11-HC (4mm) anion-
exchange column and an AG11- HC precolumn. An amount of 25µL of each sample was injected into the
loop of the chromatograph. The flow rate was 0.5 mL. min-1 with a gradient of two mobile phases: Phase A
was ultra-pure water and phase B was a solution at 2mM KOH.

2.4.5. Fourier transform infrared spectroscopy for Ulvan fractions

Spectra of ulvan were acquired using a spectrophotometer coupled with an ATR accessory
(Spectrum100, Perkin-Elmer, USA). Each spectrum is the averaged values of 16 scans in transmittance
mode from 4000 cm−1 to 600 cm−1 at are solution of 4 cm−1.
The bands at 1633 and 1410 cm−1 are assigned to asymmetric and symmetric stretching vibrations of
carboxyl groups (-COO) of iduronic and glucuronic acids, the bands at 1233 and 849 cm−1 correspond to

97
sulfate groups of ulvan (S=O). The high vibration bands at 1066 and 787 cm−1 are typical of the elongation
of the C-O-C moieties of residues rhamnose, glucuronic, and iduronic acid forming the ulvans.
2.5. In vitro antifungal activity

2.5.1. Preparation of pathogen inoculum

Protocol was adapted from Nicosia et al. (2016) [28]. Fungal isolates of Penicillium digitatum were
obtained from infected oranges and then cultivated on Malt Extract Agar (MEA, Sigma–Aldrich) in order
to obtain single conidia colonies. For inoculum growth, cultures were kept at 22 °C for 7–10 days. Obtained
spores were then collected using a sterile spatula, diluted in sterile distilled water, and then vortexed for 1
min to ensure uniform mixing. Spore concentration was fixed to 108 [Link]-1 using a densitometer (Biosan
DEN-1B, McFarland densitometer). The obtained stock solution (108 C mL-1) was then diluted to two
solutions; S1= 106 C mL-1 was used for the study of extract effects on spore germination in liquid medium
and on germ tube elongation, and S2= 2x103 C mL-1 was used to study the extract effects on fungus viability
in solid medium.

2.5.2 Effects of of SLEs on spore germination and germ tube elongation

The solution S1 (12.5 μL at 106 C mL-1) were transferred to Eppendorf tubes to which 25 μL of SLEs.
Then 12.5 μL of potato dextrose broth (PDB, Sigma–Aldrich) were added. Sterile ultrapure water (Water),
organic solvent (Acetone, ethanol, ethyl acetate) and Nystatin were used as negative and positive
controls. The tubes were then mixed and incubated for 20 hours at 22 °C followed by a vortex in order
their homogenization. Afterward, 2 μL of spore suspension were transferred to microscope slides, mixed
with 2 μL of Lactophenol blue than observed at a magnification of 40 for spore germination and tube
elongation. For each slide, three observations were randomly done.

2.5.3. Effects of of SLEs on fungus viability

In order to evaluate the SLEs’ effects on pathogen viability, 0.5 mL of solution S2 (2x103 C mL-1) was
transferred to Eppendorf tubes containing 0.5 mL of SLEs. Sterile ultrapure water, organic solvent (acetone,
ethanol, ethyl acetate) and Nystatin were respectively used as negative and positive controls. Tubes were
gently mixed and then incubated for 20 hours at 22°C. Afterwards, the tubes were mixed and 100 μL of
each mixture was spread on MEA culture medium containing ampicillin and streptomycin. Finally,
cultures were incubated at 25 °C and the number of colony-forming units (CFU) was counted after 3–4
days.
The CFU percentage of each tested extract was then calculated by comparing it with water, used as
negative control.

2.5.4. Effects of SLEs on the adhesion of spores to the epidermal orange cells.

Protocol was adapted from Kimura and Pearsall (1978) [29]. The orange cells were directly taken from
a vigorous orange (the middle ripening stage) by scratching its outer peel. These cells were then washed in
PBS (1 mL/tube), centrifuged at 2500 g for 10 min, and finally re-suspended in 1 mL PBS for counting.
Penicillium digitatum spores were taken from an infected orange and cultivated on Malt medium for 4 days
at room temperature. Spores were then suspended in PBS. Spores and oranges cells’ concentrations were
evaluated using a densitometer (Biosan DEN-1B, McFarland densitometer). Spores and oranges cells’
solutions were diluted to obtain concentrations of 107 cells/mL and 105 cells/mL respectively; 1 mL of orange
cells’ suspension was brought into contact for 1 h with 1 mL of crude extracts solutions (50 mg. mL-1). After
1 h of incubation, 1 mL of Penicillium spores were added to the various mixtures and the whole mixture
was stirred for 2 h at room temperature. After 2 h of incubation, the preparation was washed 3 times in

98
PBS; for a clean wash, 0.5 mL of PBS solution was added each time and the mixture was centrifuged at 2500
g for 10 minutes. The aim of these centrifugations is to eliminate the remaining free spores. The cells being
in suspension, the test reading was carried out by the examination of fresh pellet reconstituted in 0.1 mL
PBS. The adhesion index is defined as the number of Penicillium digitatum spores fixed per orange cell. An
index greater than 25 is the indicator of a strong adhesion, whereas, for an index of less than 10, the
adhesion is low (Linas 1986). The epidermal cells of ten orange were examined in triplicate for each extract
and the averages of adherent cells were calculated.

2.5.5. Disk diffusion test for SLEs, ulvans and chlorophylls.

The determination of the antifungal properties of the extracts of Penicillium digitatum was carried out
by a Disk diffusion test on Malt Extract agar, previously inoculated by flooding with P. digitatum. The
microorganisms were grown on Malt Extract agar (Sigma Aldrich) plates at 24 °C for 48 hours prior to
seeding into Malt Extract [Link] or several colonies of a similar morphology of each P. digitatum were
transferred into the sterile distilled water and adjusted to the 0.5 McFarland turbidity standards (107 C mL-
1 suspension). Inoculates of the P. digitatum were seeded on Malt Extract agar. Each sterile disc was

impregnated with 25 μL SLEs obtained according to protocol 4.2 or 25 μL ulvan fractions (500 mg in 10 mL
distilled water) or 25 μL chlorophyll fractions (500 mg in 10 mL acetone). The sterile filter discs, 6.4 mm in
diameter, were placed on inoculated agar medium and incubated at 24 °C for 48 hours. Nystatin (100
U/disc) was used as a positive antifungal control. The results were determined from the presence or absence
of growth and the size of the inhibition zone. The diameter (mm) of the growth inhibition halos caused by
the different extracts was measured. All the assays were carried out in triplicate.

2.6. Microscopic observation

Observations at high magnifications (×1000) were performed. A small quantity of cell suspension was
placed on a specific plate (Nikon SMZ 1500). The images were captured under a constant exposure and
illumination by a Nikon eclipse E600 camera.

2.7. Statistical analysis

All the data were subjected to variance analysis using the GLM procedure of SAS (SAS Institute, 1987,
Cary, NC, USA). The mean pairwise comparisons were based on a Duncan test at 0.5% probability level.

3. Results

3.1. Extraction Yield

3.1.1. Extraction yield of SLEs

Four solvents were selected to test the effect of solvents with variable polarities, on the extract
compositions and properties.
Extraction yields for Ulva lactuca from different geographic origins are presented in Table 1 and were
calculated according to the formula below.

𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹 𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊ℎ𝑡𝑡 𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒

% 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 = 100 ×
𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼 𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤𝑤ℎ𝑡𝑡 𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
Extraction yields are expressed in % w/w dry weight (d.w).

99
 As expected, extraction yields depend on the solvent (hydrophilic and protic degree), as the solvent
has various affinities with the chemical substances to be extracted (Table 1).
The hydrophilic fraction was similar in Ulva lactuca Food and Feed grades (30.7%) and lesser than for
Lebanese Ulva Lactuca (44%).
Ulva lactuca powder for Food was about as rich in hydrophilic molecules as it was in lipophilic
molecules (30% extraction yields). For Ulva lactuca powder (Feed), the hydrophilic fractions (30 %) was
more abundant than the acetonic fractions (21–25%). The lipophilic fraction extracted with ethyl acetate
was the most important for Ulva lactuca Food grade, sample which is probably richer in lipids.

Table 1: Yield of aqueous and organic extractions of Ulva lactuca

Type of extraction Solvent Macroalgae

Lebanese Chinese Ulva lactuca

Ulva lactuca Food powder Feed powder

Aqueous Extraction Water 20.6 ± 0.1a 30.7 ± 0.0a 30.7 ± 0.0a

Organic Extraction Ethanol 5.7 ± 0.1c 10.6 ± 0.3b 25.6 ± 0.2b

Acetone 25.0 ± 0.1b 33.1 ± 0.9a 21.2 ± 1.2b

Ethyl 6.5 ± 0.2c 13.2 ± 1.2b 5.8 ± 0.1c

acetate

Least significant difference (LSD) 12 % 7% 4.90 %

Values with the same superscript letters have non-significant difference

3.1.2. Extraction yield of ulvans

The amount of ulvan obtained from 20 g of Lebanese Ulva lactuca was 3.7 g corresponding to 18.5%
yield. The two Chinese algae showed lower yield in ulvan (6-9%), indicating that other abundant
hydrophilic molecules are present in their SAE (Table 2).

Table 2: Yield of Ulvan extracted from Ulva lactuca (% dried seaweed).

Lebanese Ulva lactuca 18.5 % ± 1.2a

Chinese Ulva lactuca 6.3% ± 0.1b

(Food Powder)

Chinese Ulva lactuca

(Feed Powder) 9.8% ± 0.4c

100
3.2. Characterization of SAE and SOE

3.2.1. Pigment composition.

The results of pigments separated by TLC and column chromatography showed that Ulva lactuca
extracts contain two important pigments, which were confirmed to their absorption maxima. The
spectrum also showed absorption of two different compounds, one at 425 nm and 660 nm and the other
at 428 nm and 645 nm which was correlated with pigments of chlorophyll a and b. Pigments in acetonic
extracts of Ulva lactucta was determined by HPLC-UV. Ulva lactuca powder for Food was richer in total
contents in chlorophyll and in pigments (Figure 3). Ulva lactuca (Food) showed the highest amounts of
chlorophyll a (1.1 mg.g-1) and chlorophyll b (0.7 mg.g-1), which is in agreement with the extraction yield in
acetone. Ulva lactuca powder for Feed and Lebanese Ulva lactuca have similar contents in chlorophyll a
and b, with about 0.51 mg.g-1 of each.

1 .5
C h in e s e U . l a c t u c a P F o

C h in e s e U .l a c t u c a P F e
a

L e b a n e s e U .l a c t u c a
1 .0
-1

a
m g .g

d
b b C

0 .5

d
a C b
C
b
0 .0
la
lb

ne

e
en
hl
hl

ei

ot
ut
C
C

ar
L

L S D = 1 .1 2
C

L S D = 2 .4 7 L S D = 1 .1 0 L S D = 0 .5 6
ß-

Figure 3: Pigment contents of the studied seaweeds Ulva lactuca (PFo: food powder, PFe: feed powder).
Means in each compound with different letters (a-b-c-d) are significantly different (Duncan test at 0.5%
probability level).
3.2.3. Polysaccharide analysis

The results shown in Table 3 indicate the polysaccharide compositions of SAE analyzed by HPLC. The
compositions in sugar differ from one sample to another. The highest total contents of sugar are shown in
Lebanese Ulva lactuca and in Chinese Ulva lactuca powder for Feed, respectively, with sucrose and fructose
as the most abundant sugars (Table 3). Ulva lactuca powder for Food have the same total content of sugar
at around 58 mg.L-1, mainly composed of sucrose. Glucose was only found in Ulva lactuca powder for Feed.
Rhamnose and xylose which are the main constituents of ulvan were not detected, so were few extracted
by the protocol of aqueous extract.

101
 Table 3: Polysaccharide composition of Ulva lactuca aqueous extracts (HPLC analysis).

Amount (mg. L-1)

Algae
Galactos Glucos Sucros Xylos Fructos Mannito
Source Rhamnose Total
e e e e e l

1.05 1.35 52.32 3.95 58.68

Ch Ul. PFo n.d. n.d. n.d.
±0.06 ±0.04 ±0.04 ±0.04 ±0.04

2.31 25.23 37.32 64.87

Ch Ul. PFe n.d. n.d. n.d. n.d.
±0.03 ±0.01 ±0.03 ±0.03

5.98 66.61 76.95

Leb Ul. 4.362 ±0.01 n.a. n.d. n.d. n.a.
±0.02 ±0.04 ±0.04

Values are expressed as the mean of three measurements ± SD.

3.2.4. Anions and organic acids composition of SAE

Organic acids and anions were detected in SAE (Figure 4). The results showed that the most abundant
species are sulfates, which are partially connected to the presence of ulvan (sulfated polysaccharides) in
the cell wall of green algae. On one hand, succinic acid contents of Ulva lactuca extracts are higher in Chinese
U. lactuca PFe and PFo than Lebanese U. lactuca (Figure 4). On the other hand, a low content of maleic acid
and phosphate compounds found in Ulva lactuca extracts.
100
C h in e s e U . l a c t u c a P F o
o rg a n ic a c id s a n d a n io n s c o n te n ts (% )

a C h in e s e U .l a c t u c a P F e
80
a
L e b a n e s e U .l a c t u c a

60 a

40
c c

20
b
c b
a b c c c b
0
e

id
id

te

te
id

fa
ac
ac

ha
or

ul
c
c

sp
hl

ei
ni

ho
C

al
ci

P
uc

M
S

Figure 4: Organic acids and anions contents (%) of the aqueous extracts of Ulva lactuca. Means in each
compound with different letters (a-b-c-d) are significantly different (Duncan test at 0.5% probability
level).

102
3.2.5. Sulfate content in Ulvan

The sulfate groups in ulvan are supposed to play a positive role in the anti-fungal activity. The sulfate
content in ulvan sample is the highest one for the Lebanese U. lactuca sample.

Table 4: Sulfate content (g/100g) in ulvan fractions obtained from Lebanese and Chinese Ulva lactuca.

Sulfate content (g/100g) in ulvan fractions

Leb Ul. Ch. Ul. PFo Ch Ul. PFe
17.8 ±0,2 8.8 ±0.1 8.0 ±0.1
Values are expressed as the mean of three measurements ± SD.

3.3. In vitro antifungal activity of SLEs

3.3.1. Effects of SLEs on spore germination and on fungus viability

The results showed that the spores germinated in the negative control (water) after 20 h incubation,
while there was no germination in the SLEs and the positive control (Nystatin). An inhibition of spore
germination for all tested extracts ranged between 70 and 87%, compared with water (0%), acetone (20%),
ethanol (25%), ethyl acetate (10%) as a negative control and Nystatin (100%) as a fungicidal standard
(Figure 5 A).
After being incubated at 25 °C for 3–4 days, the number of colony-forming units (CFU) was recorded
for all tested extracts.
The results in Figure 5 B show a strong antifungal activity against fungal multiplication ranged
between 70% and 90%. While, the negative control showed a low percentage of inhibition of spore
multiplication (water 0%, acetone 23%, ethanol 31% and ethyl acetate 17%). The use of these extracts on
MEA seems to inhibit the development of the fungal pathogens. However, even if the tested aqueous
extracts (SAE) showed some CFU, none of them showed a germination of fungal conidia and mycelium
formation. In fact, all SLEs tested showed an ability to inhibit the germination of fungal spores after 4 days
of incubation; development was then limited to multiplication.
C (+) C (-) Aq. exts. Ac. exts. Eth. exts Ethyl ac. exts
Inhibition percentage of colony-forming units (CFU)

a C (+) C (-) Aq. exts. Ac. exts Eth. exts Ethyl ac. exts
Inhibition of germination of Penicillium digitatum (%)

100 a
b c a c c a
b 100
d d b b Leb Ul.
e c c c c c
e f
e
b c
b
d Ch [Link]
Ch [Link]
50
50
a
b
b b
c

d
g
f
0 0
e r

Ch . P .

Ch . P .
ce l

Ch Ul.P l.

Ch Ul.P l.
W tin

hy ha e

Ch Leb Fe

Ch e b e

Ch e b e

Fe
Ul Fo

Ul Fo

Ul Fo

Ul Fo
Ch Leb te
Ul Ul

Ul Ul
l a no
Ac ate
Et Et ton

ce r
L PF

L PF

C l. P .

C l. P .
ce l

U l.

U l.
W tin

hy tha e

C Leb Fe

C eb e

C eb e

Fe
U o

U o

U o

U o
C Leb te
U

U Ul

U Ul
l a no
ta

A ate
Et E ton

L PF

L PF
h F

h F

h F

h F
h U

h U
.P

.P
s ta

ta

l .P

l .P
C l .P

C l.P
ta
.

l.

l.
ys
Ny

(A) (B)

Figure 5: Inhibition efficacy of spore germination by Lebanese (Leb) and Chinese (Ch) Ulva lactuca (Ul.)
Food powder (PFo), Feed powder (PFe), aqueous extratcs ([Link].), Acetonic extracts (Ac. exts.),
Ethanolic extracts (Eth. Exts.) and ethyl acetate extracts (Ethyl ac. exts.) (A); Inhibition percentage of

103
 colony-forming units (CFU) of fungal pathogens on MEA medium incubated for four days with SLEs
(B). Means in each compound with different letters (a-b-c-d-e-f) are significantly different (Duncan test
at 0.5% probability level).

3.3.2. Effects of SLEs on the adhesion of spores to the epidermal orange cells.

Figures 6 show the adhesion of P. digitatum spores to the epidermal cells of oranges in the presence of
the various SLEs.
These results clearly show that all tested Ulva lactuca liquid extracts (SLEs) show an inhibitory activity
in relation to the adhesion of the spores of P. digitatum on the epidermal cells of oranges. In fact, the index
of adhesion for all tested extracts was lower than 10, which, according to Linas 1986, indicates a low spore
adhesion.
However, a high adhesion was observed with water (AI=26), a moderate adhesion was showed with
acetone (AI=7.2), ethanol (8.3) and ethyl acetate (9.5) used as a negative control and lower adhesion was
observed with the antifungal Nystatin (AI=0) used a positive control.
Ch [Link] b
Ethyl ac. exts. Ch [Link] b Leb Ul.
Leb Ul. c
Ch [Link] de Ch [Link]
Eth. exts. Ch [Link] bc
Leb Ul. c Ch [Link]
Ch [Link] ef
Ac. exts. Ch Ul. PFo e
Leb Ul. e
Ch [Link] cd
Aq. exts. Ch Ul. PFo b
Leb Ul. c
Ethyl acetate c
Ethanol c
C (-) Acetone b
Water g
C (+) Nystatin a
10

20

30
0

Adhesion index (AI)

Figure 6: The adhesion index of P. digitatum to the orange’s epidermal cells in the presence of the different tested
SLEs. Photos of adhesion of P. digitatum to the orange’s epidermal cells in the presence of the different tested SLEs.
Means in each compound with different letters are significantly different (Least significant difference LSD= 1.8,
Duncan test at 0.5% probability level.

3.4. Disk diffusion test

The antifungal activity of Ulva lactuca in different extracts was assayed against one fungal strain
Penicillium digitatum by evaluating the inhibition zone diameter (mm). SLE were obtained with protocols
for SAE and SOE. In these conditions, acetonic extracts were about 4 less time concentrated than
chlorophyll fractions.
According to Table 5, extracts had inhibition zones ranged from 11 mm to 16 mm, above the limit
value defined by Drouhet and Dupont (1976) for the positive control (Nystatin). The different SOE
exhibited higher antifungal activities than their standard solvent, the highest gain being for SAE since

104
inhibition zone Diameter for water was nul. The ulvan fractions showed the highest inhibition zone
diameter for three samples of U. latuca. Despite their lower concentrations in chlorophyll, the acetonic
extracts showed higher inhibition zones than for the separated chlorophyll fractions. It means that the
detected activity is due to other molecules present in acetonic extracts.

Table 5: Antifungal activities around the wells of different extracts of Ulva lactuca and the chlorophylls
and ulvan fractions in relation to inhibition zone diameter (mm).

Inhibition zone diameter (mm)

Extracts Fractions
Aqueous Acetonic Ethanolic Ethyl acetate Chll Chll Ulvan
a b
Seaweeds Ch Ul. PFo 12.5 14.1 13.1 12.5 11 10 19
Ch Ul. PFe 11.1 13.8 14.2 12 15 10 17
Leb Ul. 13 13.8 12.3 14 14 10 16
Control Nystatin 13.5
Water 0
Acetone 10.2
Ethanol 9.3
Ethyl acetate 7.3

4. Discussion

The acetonic and aqueous extracts of Ulva lactuca from Lebanon and China showed significant
extraction yields ranged between 20 and 30 %. Cold extractions with a green organic solvent (ethyl acetate
or ethanol) were carried out. The lipophilic fractions were obtained with yields between 6 and 13%.
The chemical compositions in functional molecules (pigments, organic acids, and polysaccharides)
from Lebanese and Chinese Ulva lactuca extracts were determined. The samples of macroalgae showed
extracts with different contents in polar and non-polar molecules. These differences in compositions are
due to different environmental conditions, the season of harvesting, habitat, area of production, and
geographical origin [33].

The acetonic extracts showed chlorophyll contents between 1.2 and 1.8 mg.g-1 DM, chlorophyll. Ulva
lactuca for Food powder was found to be the richest extract in chlorophyll. The chlorophyll a content of
Lebanese and Chinese Ulva lactuca (ranged from 0.5 to 1.05 mg.g-1) was higher than Chlorophyll b. In U.
Lactuca from the Indian coast, 2.1 mg/g of chlorophyll were found [36].
The aqueous extracts of Lebanese Ulva lactuca showed the highest total contents of sugar (77 mg.L-1)
due partially to rhamnose content (Ulvan). The amount of ulvan recovered from Lebanese Ulva lactuca was
particularely high. Ulva lactuca collected from Vietnam had 15% of ulvan [14], but the amount of ulvan
extracted depends on the extraction conditions (pH, Temperature, enzymatic hydrolysis) [37]. The amount
in sulfates (17.8%) in ulvan extracted from Lebanese Ulva lactuca indicates the high concentration in
sulphated polysaccharides in this fraction.
Extraction yields by ethyl acetate led to values above the usual yields (1.3 – 2,6 %) obtained with
petroleum ether or dichloromethane/methanol (AOAC method) applied for lipids extraction of Ulva lactuca
[38].

105
 The results of fungicidal effects of U. lactuca showed that the germination of conidia in PDB containing
SLEs was significantly inhibited (70%–90%) after 20 hours of incubation compared to the control. The
indexes of adhesion for the different extracts were lower than 10 which, according to Linas (1986), indicates
a low spore adhesion. The inhibition of the adhesion of Penicillium digitatum spores to the epidermal cells
of oranges by the various tested Ulva lactuca extracts can be considered as the first main step in the
inhibition of the infectious cycle of this pathogen. In fact, the interactions of fungal spores with an external
hard surface of the host are mandatory for spore germination and aspersorium formation, to lead to the
infection of aerial parts of the hosts by the pathogens [39]. Moreover, the adherence of fungus on the host
cells is known to be a prerequisite for the attachment, colonization, and infection of the cells by the
pathogen [40]. Hence, when the SLEs inhibited the multiplication and the germination of P. digitatum, it
means that the infectious life cycle will be arrested.
SLEs had higher inhibition zones compared to the positive control (Nystatin ≥ 10 mm), highlighting
thus an activity for each extract. The separated chlorophyll did not bring further activity compared to other
acetonic extracts. The ulvan fractions showed the highest inhibition zones, confirming their expected
activity. A few studies reported the potential effect of green algae extracts in the fungi inhibition process.
For instance, antifungal activities were already observed for Ulva rigida extracts against A. niger and C.
albicans at 12 mm [41]. Ethyl acetate extracts of Ulva lactuca obtained in Egypt exhibited a high antifungal
activity against Aspergillus flavipes and Candida albicans [18]. The organic extracts (ethyl acetate, acetone) of
green algae C. humicola showed an excellent effect of nearly 80% microbial growth inhibition of virulent
strains of bacteria and fungi pathogenic to humans [20].
As antifungal activities for the different extracts were identified, we can assume that active
compounds were present in all of them. Liposoluble pigments of marine algae have shown different
beneficial biological activities, such as antioxidant, anticancer, anti-inflammatory, antiobesity,
antiangiogenic as well as neuroprotective activities [42]. Furthermore, the sulfated polysaccharides “ulvan”
are reported to exhibit a wide range of physiological and biological activities, such as cytotoxicity [43]. It
has been used as an alternative treatment for chemical fungicides [44]. In this study, the ulvan extracted
from Ulva lactuca with 18.5% yield, and with high sulfate content (17%) showed for the first time an
antifungal activity against [Link]. Another study has reported that the combination of ulvan and
Stenotrophomonas rhizophila resulted in an efficient antifungal activity against Fusarium proliferaum in
controlling fruit rot in muskmelon [45]. In fact, there are many natural pesticides used in agriculture based
on sulfate and copper, used to fight against plant diseases, whether they are of cryptogamic origin
(microscopic fungi or bacterial).
According to the Ulva lactuca origin, it is possible to select SAE rich in hydrophilic molecules present
in Food or Feed powder U. lactuca. In SAE, organic acids, phenolic acids and polysaccharides, are the major
bioactive compounds involved in anti-fungal properties. SOE fractions are mainly composed of fatty acids,
glycolipids, liposoluble pigments, polyphenols and terpenoids, which can contribute to antimicrobial
properties. Liposoluble pigments (chlorophyll and carotenoids) have confirmed their contribution. Palmitic
acid, one of the main fatty acid from Ulva lactuca was also mentioned for its anti-fungal activity [19]. SOE
could be then selected from Food powder. Anyway, lipids and polysaccharides may act as a protective
matrix for bioactive compounds, thus preserving their efficiency over time.
Based on the potential inhibitory effect of the different fractions towards the fungi species Penicillium
digitatum, this level of inhibition gives a promising indication for the development of an alternative to
chemical fungicides, involving marine natural sources.

5. Conclusions

The conditions used to prepare extracts were mild and involved low-impact solvents, including
biobased solvents. Despite their differences in composition, all the extracts (SAE or SOE) exhibited

106
antifungal activities linked to their contents in polar or low-polar molecules, among them, pigments,
polysaccharides and organic acids. Sulfated Polysaccharides such as ulvan may have synergetic effects with
other molecules. They can also act by protecting or as a vehicle of the activities of the different bioactive
molecules. Thus, different types of formulations for a postharvest treatment could be prepared under the
form of an aqueous dispersion of SAE, or an oil-in-water emulsion including SOE or SAE.
The results of the antifungal activity test are consistent. SOE or SAE act as inhibitors of the fungus
germination, which limits the multiplication stage. Extracts can then inhibit the initiation of the infection
process. These extracts need further in vivo tests in order to facilitate their industrial development.
Moreover, additional studies aiming to elucidate the mechanisms for the inhibition of the germination of
P. digitatum are in progress. This study showed that different extracts of Ulva lactuca could be promising to
prepare natural alternative formulations for the postharvesting control of the green citrus fruit mold
Penicillium digitatum.

Author Contributions: Conceptualization [A.C., P.D.C.]; Methodology [D.S., P.D.C., A.C.]; Formal Analyses and
investigation [D.S., P.D.C]; Statistical analyses [O.M.]; Writing - original draft preparation [D.S.; P.D.C, O.M.]; review
and editing [P.D.C., O.M., A.C].

Acknowledgments: This work was funded by the laboratory of applied biotechnology, Azm Center for Research in
Biotechnology and its Applications, Doctoral School of Science and Technology, Lebanese University and the
laboratory of Agro-industrial Chemistry (LCA) in Toulouse, France.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

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© 2019 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms
and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license
([Link]

109
Article II. Identification du mécanisme de défense contre Penicillium digitatum à
l’origine de la moisissure verte sur les agrumes.

Cette partie a pour objectif d’étudier la capacité des extraits d’algues vertes Ulva lactuca à induire
la production des enzymes de défense dans les cellules des agrumes pour lutter contre [Link].

Lors de l’étude précédente, nous avons mis en évidence l’activité antifongique des extraits d’Ulva
lactuca par des test in vitro. Pour cela, nous avons réalisé des tests in vivo ainsi des méthodes
simples pour mesurer la quantité des protéines ainsi que l’activité enzymatique (β-1,3 glucanase
et peroxidase) des cellules d’oranges. Le traitement de oranges est réalisé par des extraits aqueux,
des extraits éthanoliques d’Ulva lactuca et par une fraction acétonique riche en chlorophylles. Le
suivi est effectué à intervalles réguliers (0h, 12h, 24 h, 48h et 72h). Des enzymes tels que les
glucanases contribuent au mécanisme d’action basé sur la dégradation de la paroi cellulaire
fongique composée principalement de glucane, ce qui retarde la germination des spores et
l’élongation du tube germinatif.

Les peroxydases qui jouent un rôle clé, lors de la synthèse de la lignine, agissent comme un renfort
de paroi cellulaire des agrumes en améliorant la résistance contre de multiples pathogènes. De
plus, les péroxydases augmentent la capacité des agrumes à faire face à l’infection des Pénicillium
par l’activité antioxydante.

Les essais in vivo montrent que les extraits aqueux Ulva lactuca réduisent l’incidence de la
moisissure verte des oranges de 75 à 80% par rapport au témoin négatif traité à l’eau après 45 jours
de stockage à la température ambiante. De même, les résultats de l’essai industriel réalisé au centre
Safadi pour l’emballage et l’exportation des fruits à Halba, Akkar (Liban) a montré un pourcentage
de 90,5% d’inhibition de [Link] après 4 semaines de stockage pour les oranges traitées par
les extraits aqueux Ulva lactuca. Les oranges traitées par la cire de Decco (contrôle positif)
généralement utilisée lors de la procédure d’exportation a donné un pourcentage de 77,7 %
d’inhibition à la fin de ce test.
Les extraits d’Ulva lactuca sont en mesure de contrôler les infections causés par [Link]
lorsqu’ils sont appliqués sur des zones proches de l’inoculation du pathogène, ce qui favorise
l’induction de la résistance de l’hôte comme mode d’action possible.

110
La modification de la concentration en protéines au niveau des tissus d’oranges traités par les
extraits a été corrélée avec l’induction de la production des enzymes de défense β-1,3 glucanase et
de peroxydase dans les oranges traitées.
Tous les extraits et en particulier, l’extrait éthanolique et la chlorophylle a d’U. lactuca ont
provoqué une augmentation transitoire des activités enzymatiques de β-1,3 glucanase et de
peroxydase dans les tissus d’oranges à partir de 24 h et a atteint les niveaux maximaux à 48 et 72
h après traitement.
En conclusion, les résultats obtenus ont montré que l’inhibition directe de [Link] et
l’induction de la résistance des oranges sont les deux processus impliqués dans les modes d’action
d’Ulva lactuca pour la lutte biologique contre la pourriture des agrumes.

Les différentes étapes de cette étude sont présentées sous la forme d’un article soumis au Journal
Postharvest Biology and Technology.

111
Ulva lactuca induces defense responses against Penicillium digitatum, the
postharvest green mold on citrus fruit.

Douaa Salim1,2, Rayane Chahal1, Josephine Al Alam1, Maya Rima1, Othmane Merah2,3, Pascale de
Caro3, Asma Chbani 1,2.

1
Laboratory of applied biotechnology, Azm Center for Research in Biotechnology and its Applications, Lebanese

University, Tripoli, Lebanon.

2
Laboratoire de Chimie Agro-industrielle (LCA), Université de Toulouse, INRA, Toulouse INP, France. e-mails :

[Link]@[Link], [Link]@[Link], [Link]@[Link]

3
Université Paul Sabatier, IUT A, Département Génie Biologique, 24 rue d’Embaquès 32000 Auch, France.
4
Faculty of Public Health III, Lebanese University, Tripoli, Lebanon. e-mails: achbani@[Link]

* Correspondence: [Link]@[Link], Tel: +33534323505

Abstract

Penicillium digitatumcaused annually severe damages in postharvest and stored fruits. Limitting
chemical forces to seek acceptable solutions environmentally and sanitarily. The aim of this study
was to investigate the ability of the green macroalgae Ulva lactuca aqueous, ethanolic extracts and
their chlorophyll a and b to activate defense mechanisms in citrus fruit against postharvest green
mould caused by P. digitatum. However, little is known about its mode of action. The in vivo test
by pulverizing the oranges with Ulva lactuca aqueous extracts was performed and lasted for 45
days. In particular, once the antifungal activity of the seaweed liquid extracts (SLEs) in the absence
of direct contact with the pathogen was confirmed, changes in the protein concentration, enzyme
activity of β-1, 3-glucanase, and peroxidase in treated oranges were analyzed. The results of the in
vivo test indicated that the aqueous extracts (SAE) reduced the incidence of the green mold of
oranges by 75-80 %, compared to the water-treated control after 45 days of the storage period. The
SLEs were able to control P. digitatum infections when applied in wounds nearby those inoculated
with the pathogen, supporting the induction of host resistance as a possible mode of action. Overall,
the SLEs and especially the chlorophyll a of Ulva lactuca caused a transient increase in β-1,3-
glucanase and peroxidase activities in orange tissues starting 24 h and reaching maximum levels
48 and 72 h after treatment. The obtained results showed that both the direct inhibition of P.
digitatum and the induction of fruit resistance should be considered as important aspects of the

112
multiple modes of action of Ulva lactuca in controlling postharvest citrus rots and may be
considered as the basis of its biocontrol activity.

Keywords: Ulva lactuca, β-1, 3-glucanase, peroxidase activity, Penicillium digitatum, Citrus fruit,
biocontrol.

1. Introduction

Citrus is one of the most important crops in many countries, widely cultivated in the Mediterranean
area. These fruit are the world’s major fruit crop grown commercially in more than 100 countries
across six continents (Terol et al. 2007). They contain several phytochemicals and nutraceuticals
including vitamin C with disease-preventing and life-sustaining functions (Dillard and German
2000).

However, citrus fruit are subjects to many diseases altering their beneficial properties. In fact, these
diseases are majorly exerting their attack during the post-harvest phase of fruit. Among these latest
figures the green mold, caused by Penicillium digitatumand which is considered as of the most
devastating pathogen, causing up to 90% of product losses (Macarisin et al. 2007) . P. digitatum
requires wounds to enter the fruit through the flavedo. It infects the fruit in the orchard, the
packinghouse, and during storage, distribution, and marketing, by disseminating its spores in the
air (Palou et al. 2008).

Traditionally, controlling this mold is performed using synthetic fungicides such as Imazalil,
thiabendazole, pyrimethanil and fludioxonil used to minimize postharvest decay (Kanetis et al.
2007). However, the intensive use of these chemicals led to several disorders in the posthavesrt
control such as the reduced number of authorized active compounds, and the increased resistance
of some postharvest fungal pathogens against the few authorized fungicides. Moreover, the
growing consumer demand for safer fruit and higher quality of these commodities, have aroused
important issues relating to environmental protection and human health, prompting to search for
safer and eco-friendly control means (Casals et al. 2010; Mari et al. 2012). Moreover, several
concerns associated with their use, such as pathogen resistance, costs of registration and re-
registration of active ingredients, have encouraged the search for new and safer alternatives
(Kharchoufi et al. 2018; Madanipour et al. 2019; Li et al. 2019; Carmona-Hernandez et al.
2019).Therefore, increasing the fruit's natural defense capabilities through induction of resistance

113
is one of the alternative strategies being investigated as a mean to reduce the use of chemical
fungicides during postharvest handling and storage of fruit and vegetables. In fully mature citrus
fruit, increased resistance against P. digitatum infection can be achieved by application of physical
(Singh and Sharma 2018), a chemical (Zhang et al. 2018) or antagonistic microorganism
treatments (Carmona-Hernandez et al. 2019).

In this context, an increased attention of the seaweed use for avoiding postharvest losses of fruit
has been given from the 2000s. Marine algae are a source of numerous natural bioactive molecules
which can be attributed in the protection process against agricultural pathogens (Xu and Leskovar
2015; Acurio et al. 2018; Martins et al. 2018; Sujatha et al. 2019). The activity of several
macroalgae has been comprehensively evaluated (Mayer et al. 2009; Aruna et al. 2010; Dussault
et al. 2016; Jesus et al. 2019; Sujatha et al. 2019). Seaweeds have shown antifungal properties
against plant pathogenic fungi (Khanzada et al. 2007; Jayaraj et al. 2008; Aruna et al. 2010;
Ambika and Sujatha 2015; Soliman et al. 2018).

Green seaweed has received a great deal of attention as a promising alternative method to
fungicides for controlling post-harvest diseases in citrus. Among the various types of macroalgae,
green algae should be useful in terms of antifungal protection, as different antifungal molecules
have been isolated from several types of green algae (Liu et al. 2013; Abouraïcha et al. 2015).
Among the functional compounds identified, there are natural pigments; particularly chlorophyll,
occupy an important place by presenting important biological activities on the medical level: anti-
oxidant, anti-cancer, anti-in flammatory, and antimicrobial (Chandra et al. 2017). In fact,
chlorophyll present in the organic extract of the green alga Ulva linza has been shown to prevent
the rot of oranges by the fungus Penicillium digitatum (Chandra et al. 2017). Also, Ulva lactuca
Linnaeus evaluated for antimicrobial activity, Ulva lactuca extracts showed a great antifungal
activity against Aspergillus Niger and Candida albicans (Alang et al. 2009; Kosanić et al. 2015).
The understanding the mechanisms underlying induced resistance would help to improve the
development of this alternative strategy, the first step is the knowledge of the biochemical bases
of induced resistance is very poor.

The overall objective of the present study was to determine the mode of action of green seaweed
Ulva lactuca extracts and their purified chlorophyll in controlling green mold caused by
[Link] on citrus fruit. More specifically, we investigated it effect on (i) in vivo fungal growth,

114
(ii) green mold on citrus fruit (iii) activity of the defense-related enzymes β-1,3-glucanase and
peroxidase, and (iv) industrial essay with Ulva lactuca extracts treatment compared to the wax
treatment.

2. Materials and methods

2.1. Materials

Ulva lactuca was freshly and manually collected from a coastal zone of the Mediterranean, El
Mina (34 ° 26 'N - 35 ° 50' E) in Tripoli, Lebanon, on April 1st, 2017. The algae were cleaned with
seawater to remove unwanted impurities, then cleaned three times with distilled water and dried
at room temperature until the mass remained constant. The samples were then stored hermetically
at room temperature. Oranges (Citrus sinensis (L.) Osbeck) cv. Valencia late were harvested from
a local orchard in Tripoli (Lebanon), selected for uniformity of size and absence of symptoms of
any disorders, and immediately processed. Fruit were surface-sterilized with a 2% commercial
bleach solution for 2 min, washed with tap water and air-dried at room temperature.

Milli-Q water (PURELAB classic) was used during all work. Acetone (60%), Ethanol (100%)
were of analytical grade were purchased from VWR. Phosphate buffered saline (PBS), Potato
dextrose agar (PDA), Nystatin Suspension, chlorophyll a standard, sodium acetate buffer solution,
sodium potassium tartrate, Bovine Serum Albumin (BSA), Bradford Reagent, 3,5-Dinitrosalicylic
acid (DNS), Laminarin, Guaiacol, Malt Extract agar were purchased from Sigma Aldrich and
Decco wax purshaded from Citrashine.

2.2. Extraction of seaweed liquid extracts (SLEs)

2.2.1. Seaweed Aqueous extracts (SAE)

SAE were prepared according to Jiménez et al. (2011). Five grams of dried algae was put in a 100
mL flask. 100 mL of boiling Milli-Q water was added. The medium was stirred magnetically for
one hour at room temperature. The extract was then filtered twice through a double layer of sterile
muslin cloth and then cooled to room temperature. After filtration, the extracts were stored at 4 º
C until analysis.

115
2.2.2. Seaweed Organic extracts (SOE)

Five grams of algal material were macerated in 100 mL of organic solvent at room temperature
for a period of three days with a regular shaking (orbital shaker) (Chandini et al. 2008). After
filtration, ethanol was evaporated under vacuum at 45° C to furnish a dry material. The extract
was stored at 4 º C until analysis.

2.2.3. Pigments extraction

Five grams of Ulva lactuca was homogenized in acetone (100 mL, 80%) and allowed to stand
overnight in dark at 4 ºC for complete extraction followed by centrifugation at 10 000 Xg for 5
min. The separation of Chlorophyll a and b Ulva lactuca, was released by the method of
differential solubility of pigments in organic solvents (Prat.R., 2007).

2.3. In vivo laboratory protective test of SAE against P. digitatum infection

To examine whether the SAE have inhibitory effects against P. digitatum, oranges were treated
with these extracts and then infected with P. digitatum. First, the oranges were dried and then
deposited on plastic plates containing absorbent paper, which was soaked with sterile distilled
water in order to provide a moisture content of 95-100%. Each orange was then pulverized with 4
mL of SAE extracts. Three oranges were used for each extract. The chemical fungicide; Nystatin
was used as a positive control and distilled water as a negative control (Chbani et al. 2013). Two
hours after the pulverization, oranges were infected with P. digitatum by spreading 10 µL of spore
suspension (105 spores/mL suspension) on their surface. The spore suspension was prepared by
scraping the surface of PDA in older cultures incubated for 6 days at room temperature using a
sterile spatula. This suspension was put into a blender with a few drops of Tween 20 (used as a
solubilizing agent for membrane proteins). Then, it was transferred to a spray device producing
very fine droplets. Treated oranges were covered with a transparent film and stored at room
temperature. 5 to 6 days after inoculation, the macroscopic aspects of the oranges were studied
(Jiménez et al. 2011).

The in vivo test was applied by pulverizing the oranges with SAE and then after two hours they
were infected by the P. digitatum. This test lasted for 45 days starting from April 12, 2017 to May

116
26, 2017. During this period, five sets of treated oranges were daily monitored and the number of
rotten oranges has been recorded.

2.4. In vivo industrial essay

The in vivo test was conducted at the Safadi center for fruit packing and exporting in Halba, Akkar-
Lebanon and lasted for 5 weeks starting from March 28, 2018 to May 2, 2018. Three sets of freshly
harvested oranges of type “Valencia” were used in the test as follows: 180 oranges treated with
aqueous extracted of Ulva lactuca, 180 oranges treated with Decco wax, is a fungicide with
effective action on Penicillium in harvested citrus fruit, 180 oranges not treated at all. Ulva lactuca
aqueous extracts are sprayed on oranges during their rotation on the conveyer belt allowing a full
cover of the oranges. Then the oranges pass through an area of hot air to get dry and then reach
their final destination in the spraying system, where they manually picked up and put into large
boxes. Finally, oranges were packaged in the same way for their exportation, and they were stored
in five small plastics boxes, same procedure were used for treatment with Decco wax and untreated
oranges.

2.5. Testing of algal extracts as resistance inducers

Oranges were wounded once (5 mm depth × 3 mm wide) with a sterile nail-head along the
equatorial axis. For each treatment, 100 µL of each of the algal extracts or their purified
chlorophyll (Chlorophyll a and b) were applied into each wound. Oranges treated with sterile
distilled water, ethanol, chlorophyll a standard and Nystatin (fungicide), were used as a control.
Treated oranges were placed in a tray, which was then wrapped into a plastic bag. After 48 h of
incubation at 20 ◦C in a high relative humidity (RH, 90–95%), another wound was made
approximately 5 mm away from the previous one. This wound was air-dried and inoculated with
10 µL of a 104 conidia mL−1 suspension of P. digitatum. Each treatment was done in 3 replicates
made of 4 oranges each. Replicates were again wrapped in a plastic bag (90–95% RH) and
maintained at 20 ◦C for two weeks. The incidence of decay (percentage of infected wounds, %)
and disease severity (lesion diameter, mm) were recorded. The whole experiment was repeated
twice.

2.6. Tissue sampling for extractions

117
Fruit were individually wounded with a sterile nail (3 mm wide × 5 mm deep) at eight points on
the equatorial surface. Samples were designated as follows in table 1:

Table 4: Sampling Design.

Wounded/Treated fruit Water

Ethanol
Nystatin
Chlorophyll a standard
Ulva lactuca aqueous extracts
Ulva lactuca ethanolic extracts
Chlorophyll a and b purified from algal extracts
Unwounded fruit Untreated

In each wound, 30 µL of the above-mentioned treatments were applied. For each treatment fruit
were randomized and arranged into 5 lots for tissue excision at different time intervals (0, 12, 24,
48, 72 h). Each lot was made up of 3 replicates of 4 fruit. The whole experiment was repeated
twice. Fruit were arranged in plastic boxes, which were then individually wrapped into plastic bags
(90–95% RH) and stored at 20 °C for 72 h. At the established time intervals, tissue cylinders (5
mm) from each lot were excised from the inoculation site. The excised tissues were mixed and
ground to a fine powder using a commercial blender and stored at −80 °C until use for enzyme
assays (Youssef et al. 2014).

2.7. Enzyme assays

From each sample and sampling time, 10 g of fine tissue powder were homogenized with 50 mmol
sodium acetate buffer pH 5.6 (1:1, w/v), centrifuged (15 min at 10,000 × g and 4 °C) and the
supernatant was then filtered through filter paper by a Buchner funnel. Proteins were precipitated
in 60% acetone (v v−1) at −20 °C and the resulting pellet, following centrifugation (30 min at 10,000
× g and 4 °C), was washed 3 times with 60% cold acetone. The pellets were dried, re-suspended in
2 mL of 50 mmol sodium acetate buffer (pH 5.6) and kept at −20 °C until use. The protein
concentration was determined according to Bradford (1976) with the Bio-Rad protein assay kit
(Bio-Rad Laboratories Ltd., USA).

118
2.8.1.β-1, 3-Glucanase activity

β-1,3-Glucanase activity was determined following the method of Abeles and Forrence (1970), by
incubating 65 µL of protein extracts for 2 h at 37 ◦C in 65 µL of 4% (w/v) laminarin. The reaction
was stopped by adding of 300 µL of 3, 5-dinitrosalicyclic acid (DNS) (prepared by dissolving
2.18g DNSA (MW=[Link]-1) in 80 mL of 0.5 M NaOH followed by heating and stirring at
70 ºC. Then the addition of 30 g of sodium potassium tartrate (MW= 282.2 [Link]-1) was following
by cooling it to room temperature where it was brought to 100 mL with purified water. The sample
was heating in boiling water for 10 min and then rapidly cooling it in ice. The absorbance of each
sample was measured at 492 nm and activity values were reported as µmol glucose equivalents to
µg-1 of total protein min-1.

2.8.2. Peroxidase activity

Peroxidase activity was determined using guaiacol as substrate (Hammerschmidt et al. 1982). The
reaction mixture, consisting of 100 µL of crude extract and 100 µL of 50 mmol sodium acetate
buffer pH 5.6 (10 mmol of guaiacol and 10 mmol H2O2), was incubated for 60 s at room
temperature. The increase in absorbance at 470 nm was assayed by spectrophotometry (Beckman
DU 640 Spectrophotometer, Corona, CA, USA) and the enzyme activity was expressed in U g−1
protein s−1.

Statistical analysis

Data were subjected to ANOVA (one-way analysis of variance and two-way analysis) using the
statistical software package Statistics for Windows (GraphPad prism). Data from repeated
experiments were combined since statistical analysis determined homogeneity of variances. The
data were submitted to the analysis of variance (ANOVA) and means were compared using the
one way or two ways ANOVA using a Dunnett’s multiple comparisons test to determine the
significance of the treatments. In vivo experiments were made using three repetitions. In trials with
artificially inoculated fruits, each repetition consisted of 9 oranges fruit kept in separate plastic
boxes. The enzyme activity was made using three measurements.

119
 3. Results
3.1. In vivo protective test of SAE against P. digitatum infection

The percentages of non-infected oranges on every recording day for all orange sets are analyzed
by Two-way ANOVA ordinary. The results are shown in figures 1, 2 and table 2. For oranges
treated with Ulva lactuca aqueous extracts 100% of the treated correspondent oranges remained
not infected for the first 2 weeks. This number decreased slightly during the period of study to
reach 75% at the end of the test.

For untreated oranges sprayed only with water (negative control), on the 9th day after treatment, 1
out of 12 oranges was contaminated by P. digitatum (infection percentage 8%). The contaminated
oranges raised continually and more markedly than those treated with seaweed to attain 33% of
contaminated oranges at the end of the assay. However, as Nystatin was the reference fungicide
used, none of the treated correspondent oranges was infected by P. digitatum. Thus, 100% of
oranges remained healthy with normal external appearance during the 45 days of the test.

100
Water
Percentage of non-infected oranges

Nystatin
90
Ulva lactuca aqueous
extracts
80

70

60
1

8
k

k
ee

ee

ee

ee

ee

ee

ee

ee
W

Time post-treatement application

Figure 1: Percentage of non-infected oranges treated with water (control-), Nystatin (control+), Lebanese Ulva
lactuca aqueous extracts. Values represent in the figure are mean ±SD of three replicates. p<0,0001****.

120
 Week 2 2 Week 8 Week 8

Oranges treated with water Oranges treated with Nystatin

Week 2 Week 8

Oranges treated with Ulva lactuca aqueous extracts

Figure 2: Oranges treated with water (control-), Nystatin (control+), Lebanese Ulva lactuca aqueous extracts after
the 2nd, 4th and 8th week of treatment.

3.2. in vivo industrial essay

The results of the industrial essay at Safadi center for fruit packing and exporting in Halba, Akkar,
Lebanon represented in figure 3 and 4. For untreated oranges (negative control), on the second
week of the assessment day, one out of 180 oranges was contaminated by P. digitatum (infection
percentage is 0.5 %). Then, on the end of the 4th monitoring week, ten more oranges were found
rotten and were thus removed (total infection percentage became 6.2 %). From the end of the 4th
week and until the end of the test, 10 more oranges out of the 169 oranges left in the boxes were
contaminated by P. digitatum. Hence, 21 of 180 oranges were infected throughout the test leading
to a final P. digitatum inhibition percentage of 88.3%. For oranges treated with Decco wax, none
of the 180 monitored oranges were infected by P. digitatum for the first three monitoring weeks.
However, at the end of the 4th monitoring week, 22 out of 180 oranges were contaminated by the
fungi and were then removed from the boxes (infection percentage was about 12.3%). From the
end of the 4th week and until the end of the test, 18 more oranges out of the 158 oranges left were

121
contaminated by P. digitatum. Hence, 40 of 180 oranges were infected throughout the test leading
to a final P. digitatum inhibition percentage of 77.7 %.
For oranges treated with Ulva lactuca aqueous extracts, none of the 180 monitored oranges were
infected by P. digitatum for the first three monitoring weeks. However, at the end of the 4th
monitoring week, 5 out of 180 oranges were contaminated by the fungi and were then removed
from the boxes (infection percentage was about 2.8%). From the end of the 4th week and till the
end of the test, 12 more oranges out of the 175 oranges left were contaminated by P. digitatum.
Hence, only 17 of 180 oranges were infected throughout the test leading to a final P. digitatum
inhibition percentage of 90.5 % after 5 weeks, which is the best among the three sets of oranges.

100
Untreated oranges
Percentage of non-infected oranges

Oranges treated with

Decco wax
90
Oranges treated withUl aq.
extracts

80

70
week 1 week 2 week 3 week 4 week 5
Time post-treatement application

Figure 3: Percentage of non-infected oranges of untreated oranges and oranges treated with Decco wax (control+),
Lebanese Ulva lactuca aqueous extracts. Values represent in the figure are mean ±SD of three replicates.
p<0,0001****

122
Figure 4: Infected oranges from: (A) Untreated oranges set, (B) oranges treated with wax set and (C) Ulva lactuca
aqueous extracts.

3.3. Testing of extracts as resistance inducers

Green mold incidence and severity on oranges wound-treated with water, chlorophyll a standard
and Nystatin as control. Also, on oranges wound-treated with aqueous, ethanolic extracts of Ulva
lactuca and their purified chlorophyll a, b, after 48 h challenge inoculated with P. digitatum in a
wound 5 mm apart from the previous one, are reported in figure 5. The results showed that the
ethanolic extracts and the chlorophyll a of Ulva lactuca treatments had the lowest percentage of
infected wounds (25-35%); showing that they were able to reduce significantly the disease
incidence. However, the untreated orange, the aqueous extracts and the chlorophyll b of Ulva
lactuca had 40-55% of infected wounds compared to the negative control water. Similarly, with
regard to disease severity, a significant reduction of lesion diameters was recorded by the ethanolic
extracts treatments (22-35mm), where the chlorophyll a from Ulva lactuca behaved the most
efficiently (10-20 mm).

123
 In fe c te d w o u n d s (% ) L e s io n s d ia m e t e r m m
80
150

60
**** **** **** **** **** **** **** ****

D ia m e t e r ( m m )
100

**** **** **** **** **** **** **** ****

40

50

20

0 l. 0
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or

A
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E
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or
re
G

en
re
G

Figure 5: Disease incidence (percentage-infected wounds) and severity (lesion diameter, mm) caused by
Penicillium digitatumon oranges treated by the different control and aqueous and ethanolic extracts of Ulva lactuca
and their purified chlorophyll. Values represent in the figure are studied by ordinary one-way ANOVA,
p<0,0001****.

3.4. Proteins quantification

The protein concentration was determined according to Bradford (1976). The results showed that
all studied tissues treated with all extracts had approximately the same concentration of protein at
0 h, 12 h and 24 h of incubation (Figure 6). This concentration was increased at 72 h particularly
for the orange treated with the Ulva lactuca aqueous extracts (337 µ[Link]-1). However, the protein
concentration of oranges tissues treated with chlorophyll a of Ulva lactuca was reaching a high
concentration at 48 h. The untreated orange, as well as the orange treated with Nystatin, showed a
decreasing of protein concentration at 48 h incubation.

124
 -1
C o n c e n tr a tio n s o f p r o te in µ g .m L

400
**** 0 H

12 H

300
24 H

**** 48 H
**** **** **** **** **** **** ****
200 72 H

100

0
ge

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p

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A
h

E
C

Figure 6: Protein concentration (µ[Link]-1) of “Valencia late” oranges treated with the aqueous, ethanolic extracts
of Ulva lactuca (Ul.), their purified chlorophyll a, b, and the protein concentration (µ[Link]-1) of oranges treated
with the different control (Water, ethanol, Nystatin, chlorophyll a standard and unwounded orange). The
concentrations were measured at 0 h, 12 h, 24h, 48h and 72h. Values represent in the figure are studied by two-way
ANOVA, p<0,0001****.

3.5. Enzymatic activity assays

3.5.1. β-1, 3-Glucanase activity

The analysis of the induction kinetics of β-1, 3-Glucanase activity in orange tissues is shown in
figure 7. The enzyme activity in all studied extracts sampled at 0 h was stable. These extracts
induced a transient increase in β-1, 3-Glucanase activity, starting at 12 h then increasing at 24 h
However, at 48h, a decrease of β-1, 3-Glucanase activity was observed in the almost of tissues
treated. This activity increased and reached maximum levels at 72, especially for the Ulva lactuca
aqueous extracts compared with the untreated tissue and the negative control water.

125
 β - 1 , 3 - G lu c a n a s e a c t iv it y

0 .3 ****
0 H
µ m o l g lu c o s e / µ g p r o t e i n / m i n

12 H
**** **** ***
**** * *** **** **** 24 H
0 .2
48 H

72 H

0 .1

0 .0
ge

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th
lo

A
h

E
C

Figure 7: Enzymatic activity of β-1, 3-Glucanase activity in oranges tissues untreated, control or treated with
ethanolic, aqueous extracts of Ulva lactuca and their purified chlorophyll a, b. Tissues were sampled at 0 h ,12 h,
24 h.48h and 72 h after application.). The activity was measured at 0 h, 12 h, 24h, 48h and 72h. Values represent in
the figure are studied by two-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparisons test, p<0,0001****.

3.5.2. Peroxidase activity

The analysis of the induction kinetics of the peroxidase activity in orange tissues is shown in figure
8. The enzyme activity in all studied extracts sampled at 0 h and 12 was stable. All tissues of
orange treated with different extracts induced a transient increase in peroxidase activity, starting
at 24 h especially. The treatment with ethanolic, aqueous extracts and chlorophyll a of U. lactuca
showed an increasing of enzyme activity at 72 h. However, this activity decreased in the
unwounded oranges and in the negative control water.

126
 P e r o x id a s e a c tiv ity

0 .0 0 5
0 H
**** **** 12 H
0 .0 0 4 ****
**** ****
** 24 H
U / µ g p r o t e i n /s e c

** **** ****
0 .0 0 3 48 H

72 H
0 .0 0 2

0 .0 0 1

0 .0 0 0
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E
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U

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lo

E
h
C

Figure 8: Enzymatic activity of peroxidase activity in oranges tissues untreated or treated with ethanolic, aqueous
extracts and chlorophyll a, b of [Link]. Tissues were sampled at 0 h ,12 h, 24 h.48h and 72 h after application.
Values represent in the figure are studied by two-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparisons test, p<0,0001****.

4. Discussion:

The present study showed the efficacity of the green algae Ulva lactuca aqueous extracts to limit
the contamination of oranges by [Link] around 75% during 8 weeks of storage at room
temperature (Figure 1, Table 2). The in vivo trials were conducted to investigate the Ulva lactuca
extracts mode of action in controlling green mold. A double mode of action was hypothesized on
pathogen viability and on the host defense system.

First, whole oranges without wounding were pulverized with only aqueous extracts U. lactuca.
The percentage for oranges treated with Ulva lactuca aqueous extracts and not infected until the
end of the test was 75%. However, for the oranges treated only with water (negative control), 33%
of them were infected throughout the test. This result has never been observed before. However,

127
the effect of seaweed extracts has already been studied on other plant species against others fungi
(Kulik, 1995; Kosanić and al., 2015; De Corato et al., 2017; Kharchoufi et al., 2018).

The in vivo test also was done on an industrial scale, same inhibition efficacy obtained with Ulva
lactuca aqueous extracts with 90,5%. Even when Decco wax was used in coating citrus especially
in case of exporting ad relatively long shipments, numerous citrus wholesales and exporters have
indicated that there are still losses (up to 10%) due to fungus.

Second, higher control level was achieved by the extracts (25-35% of infected wounds) especially
for the ethanolic extracts and the chlorophyll a from U. lactuca when applied in wounds nearby
those inoculated with the pathogen. Similarly, with regard to disease severity, a significant
reduction of lesion diameters was recorded by the ethanolic extracts treatments (22-35mm), where
the chlorophyll a from Ulva lactuca behaved the most efficiently (20 mm) (Figure 5). Furthermore,
this study showed that both crude extracts and chlorophyll form Ulva lactuca induce changes in
the defense mechanism on the fruit surface. In fact, the obtained results showed that when applied
in different wound close to the one inoculated with the pathogen, the extracts inhibited the
multiplication and development of Penicillium digitatum. In order to confirm this hypothesis,
changes in β-1.3-glucanase and peroxidase of ‘Valencia late’ oranges were studied.

The protein concentration for tissue of orange treated with the crude aqueous extracts of Ulva
lactuca was increasing at 72 h (337 µ[Link]-1) and the chlorophyll a (146.47 µ[Link]-1) and b (162.49
µ[Link]-1 ) were reaching a high protein concentration at 48 h (Figure 6). This result in correlation
with the enzyme activity, which showed an increase in the β-1.3-glucanase activity in the treated
tissues at 24 and 72 h. Moreover, overall the highest activity was recorded in the extracts at 72 h
while this activity was decreased in the untreated orange (Figure 7 and 8). The mechanism of Ulva
lactuca extracts responsible for this process on citrus fruit was not reported before. However,
another studies have showed the effects of algae on defense-related responses and decay
development in apple fruit (Abouraïcha et al., 2015). Also, other findings demonstrate an increased
β-1.3-glucanase activity in citrus fruit by the yeast Candida oleophila (Droby et al. 2002), by
Sodium carbonate and bicarbonate (Youssef et al., 2014), by the electrolyzed sodium bicarbonate
(eNaHCO3) (Fallanaj et al., 2016) and by Chitosan combined with salicylic acid which activated
the defense enzyme activities in grapefruit (Shi et al., 2018).

128
The β-1.3-glucanase is capable of hydrolyzing fungal cell components (glucans), and it has been
shown to inhibit the growth of several pathogenic fungi (Schlumbaum et al., 1986; Sela-Buurlage
et al., 1993). It can potentially degrade the fungal cell wall, mainly composed by β-1,3-glucan
(van Loon et al. 2006), playing a role in delaying growth, spore germination, and germ tube
elongation, and, therefore, decreasing the incidence of Penicillium digitatuminfection (Ballester et
al., 2010).

Concerning the peroxidase, a peak of activity was detected in the tissues of oranges treated with
chlorophyll a of the green algae Ulva lactuca at 72 h, thus suggesting a role of peroxidase in the
beneficial effect of the postharvest macroalgae treatment. The efficacity of peroxidase enzyme was
also showed by Droby et al., (1993) which demonstrate an increased peroxidase activity in citrus
fruit elicited by UV irradiation. Several studies have demonstrated the involvement peroxidase
activity in protecting plants against pathogen infection by including a chain of defense reactions
(Castoria et al., 2001; Ippolito et al., 2000; Ippolito et al., 2005; Lawrence et al., 2000).
Peroxidases play a key role at a later stage in the pathway during the synthesis of lignin, which
acts as a cell wall reinforcement enhancing resistance against multiple pathogens and may alter
the antioxidant ability of citrus fruit to cope with Penicillium infection (Ballester et al. 2006).
Peroxidase isoforms have shown to produce H2O2 in vitro at an alkaline pH, which is
characteristically found in the apoplast following pathogen recognition (Bolwell & Wojtaszek,
1997) Moreover, the directed secretion of peroxidases to sites of infection has also been
demonstrated (McCluskey et al., 1999).

The β-1.3-glucanase and peroxidase activity were strongly activated by Ulva lactuca extracts and
by their Chlorophyll at 72 h as compared to other treatments. Both of these enzymes are considered
important in host resistance mechanisms since peroxidase is involved in lignin formation (Kuć,
1990). The increase of enzyme concentrations in treated tissues showed that the Ulva lactuca
extracts and more specifically chlorophyll a induced an increase in the enzyme activity, which can
play an interesting role in the degradation of the wall cell of pathogens.

The data showed that Ulva lactuca extracts and even more Chlorophyll treatments could be
promising method to reduce dependency on synthetic fungicides.

129
 3. Conclusion:

In conclusion, Ulva lactuca had a significant impact on green mold control in citrus fruit when
fruit was exposed to the treatment. The control effect was associated with the inhibition of
[Link] germination and growth, and the induction of host defense-related enzymes.

We found that the aquoeus extract and the chlorophyll (a) fraction induce higher enzymatic
activities than those of ethanolic extracts and chlorophyll (b) fraction, according to measured
concentrations in proteins.

We can confirm that the selection of these extracts rich in polar molecules, such as chlorophyll
and polysaccharides, could be promising to prepare alternative eco-friendly formulations to
conventional chemical pesticides. Moreover, this work could be used to develop a tool to identity
the potential anti-fungal activity of a fraction through the quantification of the protein.

These extracts need further tests, including molecular and biochemical studies for the enzymes in
order to isolate the genes encoding for β-1, 3-glucanase from citrus fruit and to gain more insight
into the molecular mechanisms involved in citrus fruit responses to various stresses, elicitors, and
pathogen attacks.

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136
Chapitre 3 : Formulation des extraits aqueux d’Ulva
lactuca.
Dans le chapitre précédent, nous avons montré que les extraits aqueux d’Ulva lactuca (UL)
ont une activité anti-fongique en se basant sur des tests in vitro et in vivo. Cette activité peut être
attribuée à l’association de différentes molécules actives hydrophiles et polaires telles que les
ulvanes, les polyphénols et les pigments hydrosolubles.

Dans ce contexte, la formulation de ces extraits a été proposée dans un objectif de faciliter le
transport et le stockage des agrumes. Deux formulations différentes ont été étudiées : d’une part,
la microencapsulation des extraits avant leur solubilisation, et d’autre part, leur mise en émulsion
après une éventuelle encapsulation. L’activité antifongique in vitro a été ensuite réévaluée.

Article III. Activité antifongique des extraits aqueux d’Ulva lactuca

microencapsulés

Pour le traitement post-récolte des agrumes, il est donc envisageable d’utiliser une solution
aqueuse d’extrait d’U. lactuca à appliquer sur les agrumes. Cette solution devra être préparée peu
de temps avant le traitement, sur le site même du traitement, pour éviter un stockage néfaste à la
qualité et à l’efficacité du produit. De ce fait, il est nécessaire de pouvoir conserver l’extrait aqueux
en préservant les propriétés des fractions actives et en facilitant leur solubilisation.

Les résultats de cette étude sont présentés sous forme d’un article soumis dans le journal “Journal
of Food Processing and Preservation”. Dans ce travail, nous avons examiné l’intérêt de protéger
des fractions bioactives par un procédé de microencapsulation.

La microencapsulation par atomisation est un procédé utile pour la stabilisation des composés
actifs provenant de diverses sources naturelles. L’objectif était donc de trouver des conditions
adaptées pour la microencapsulation, conditions permettant de préserver l’activité biologique des
extraits aqueux d’Ulva lactuca pendant plusieurs semaines voire plusieurs mois.

Deux matériaux d'encapsulation ont été testés : les protéines de soja (SPI) et un mélange 50/50 de
protéines de soja et de maltodextrine (SPI + MD). Leur concentration en solution (2% w/w) a

137
permis de garantir leur dissolution complète et une viscosité appropriée pour la pulvérisation. Les
paramètres de séchage, la température d'entrée et le débit d'alimentation (120 °C et 0,33 L /h
respectivement) ont été ajustés d’une part pour évaporer le solvant sans altérer les extraits UL et
d’autre part pour optimiser le rendement de production. La concentration choisie en extraits UL
séchés permet d’obtenir un rapport matériau d'encapsulation / extrait sec de 1 :1 pour les différentes
expériences.
Les résultats ont montré des rendements d’atomisation variant de 48 à 62%. Des essais
d’atomisation réalisés à partir des extraits éthanoliques ont conduit à un rendement de 45 %. Les
microparticules ont des morphologies similaires, les particules à base d’isolats de protéine ayant
les diamètres les plus élevés (7,8 – 9 µm).

La capacité des matériaux à préserver les propriétés anti-fongiques a été évaluée après 12 mois de
stockage. Les tests in vitro ont montré que la microencapsulation avec les deux matériaux n'a pas
atténué l'activité anti-fongique initiale des extraits. Cela signifie que les molécules actives n'ont
pas été altérées pendant le processus d'encapsulation. Cette étude a montré que les microparticules
à base de SPI ont des caractéristiques appropriées pour préserver l’activité antifongique d’un
extrait d’algue verte pendant leur stockage. De plus, l’activité anti-fongique détectée pour le SPI
semble contribuer au renforcement des propriétés biologiques des extraits. L'autre matériau à base
de SPI + MD génère des microparticules présentant une perte d'activité antifongique, pouvant
s’expliquer par la perméabilité du revêtement et par le fait que la maltodextrine peut être utilisée
par les champignons comme source d’énergie. La solubilisation de ces microparticules dans l'eau
peut aisément conduire à la préparation de la solution aqueuse à pulvériser sur les agrumes.

138
Anti-fungal activity of microencapsulated aqueous extracts from Ulva lactuca

Douaa Salim 1,3, Pascale de Caro 3, Vanessa Durrieu 3 and Asma Chbani 1,2
1
Laboratoire de biotechnologie appliquée, Centre Azm pour la recherche en Biotechnologie et ses applications,
Lebanese University, Tripoli, Lebanon.
2
Faculté de santé publique III, Université Libanaise, Tripoli, Lebanon.
3
Laboratoire de Chimie Agro-industrielle, LCA, Université de Toulouse, INRA, Toulouse, France.

* Corresponding author: [Link]@[Link],

Running title: Microencapsulation of Ulva lactuca extracts

Abstract

Microencapsulation by spray-drying is a process useful for the stabilization of active compounds

from various natural sources. The aim of this work was to study the biological activities of aqueous
extracts of Ulva lactuca and to find adapted conditions to encapsulate them while preserving their
properties. The choice of wall materials and spray drying parameters was thus investigated. Drying
yields and microparticles characteristics were compared according to the wall materials. The
ability of tested material walls (soy protein isolate and maltodextrin) to preserve the active
molecules was also evaluated through three different in vivo anti-fungal tests. The two materials
generated two different behaviors of microparticles in term of antifungal activity towards
Penicillium digitatum. The results showed that SPI microparticles are able to prevent the loss of
the anti-fungal activity of extracts after one year of storage. The anti-fungal activity detected for
SPI contributes to strengthening the biological properties of extracts.

Keywords: microencapsulation; spray drying; maltodextrin; soy protein; Ulva lactuca; antifungal
activity.

Practical applications:

Citrus fruit are frequently contaminated by Penicillium digitatum after their harvest. To avoid high
citrus losses, developing a safer natural treatment to replace the use of hazardous chemical
products, would help to limit sanitary impacts. This study proposes a mean to preserve the

139
antifungal activity of green seaweed extracts to consider their convenient application on citrus
peels.

1. Introduction

Penicillium digitatum is the major source of postharvest decay in citrus fruits worldwide
(Poppe and al., 2003). It is one of the most severe postharvest pathogens, causing green mold
disease (Ghanei Ghooshkhaneh and al., 2018). This fungus spreads on a number of skin oil glands
through pores and wounds in which nutrients are available to stimulate spore germination. The
initiation of the infection area appears as a soft watery spot (sometimes referred to as clear rot) on
the fruit peel, and if suitable temperature and conditions are available, it becomes a white
mycelium that later turns an olive color with spore production (Ismail & Zhang, 2004; Vu et al.,
2018). Currently, a number of synthetic fungicides carries out the postharvest control.
Nevertheless, the repeated use of certain fungicides has led to the appearance of fungicide-resistant
populations of Penicillium digitatum (Kanetis and al., 2010) and serious risks for human health
and the environmental (Mari and al., 2012). These reasons have encouraged the search for new
and safer alternatives to protect fruit from fungi either by using a biocontrol approach (Carmona-
Hernandez et al., 2019, Li et al., 2019) or by using natural extracts (Carmona-Hernandez et al.,
2019; Li et al., 2019; Madanipour et al., 2019).

In this context, marine algae have been selected as the source of active compounds alternative to
replace the chemical fungicides (Sujatha et al. 2019). Antifungal properties of compounds from
seaweeds have already been detected to struggle against plant pathogenic fungi (Aruna et al. 2010;
Ambika and Sujatha 2015; Soliman et al. 2018, Sujatha et al. 2019). Indeed, biological activities
of several natural compounds in aqueous green algae extracts have been identified, such as
pigments, polyphenols and ulvan (Chandra et al., 2017; Liu et al., 2013).

In this work, we propose to use the anti-fungal properties of aqueous extracts of Ulva lactuca, a
green alga available over numerous Mediterranean coats. Aqueous extracts applied on citrus fruit
can prevent the development of Penicilium digitatum. To prepare ready-to-use solutions, isolated
active fractions must be stored during transportation and before their use. However, some of these
molecules lose their activities due to their sensitivity to light and to oxidation reactions. In the
present work, we have considered the protection of bioactive fractions by microencapsulation
process.

140
Microencapsulation has been described as a good strategy in food industry for various purposes,
such as preservation of functional properties, improved handling and utilization of bioactives
(Pires & Pena, 2017; Chang & Nickerson, 2018). Among encapsulation techniques, spray drying
is the most common technology applied due to its low cost, flexibility, production of good quality
powder particles (Singh and al., 2018). Spray-drying have proved to be an effective technology
for encapsulating and protecting bioactive molecules, such as vitamins, antioxydants or
polyphenols. (Drosou et al, 2017; Ray et al., 2016). Different types of encapsulating agents have
shown their efficiency to protect antioxidants against light and thermal oxidation through the
physical barrier (Yuan et al. 2017). The most used with spray-drying technology include proteins
(Nesterenko, 2014; Rocha-Guzman, 2010) and various carbohydrates such as maltodextrin, starch
or chitosan. (Ray, 2016, Kumar, 2017). Some extracts from fruit such as lemon by-products and
tomato or blueberry pomaces (Papoutsis et al., 2018, Robert et al., 2010; Flores et al, 2014) or
other extracts from leaves (Gonzalez et al., 2019) have been encapsulated by natural polymers to
preserve their quality and to facilitate their use. Algal biomass and algal oil have also been
encapsulated by spray-drying (Bonilla-Ahumada et al. 2018, Shao et al., 2018), but encapsulation
of active aqueous extracts from seaweeds is not reported.

The objective of this study is to find appropriate conditions to encapsulate the green seaweed Ulva
latuca extracts with natural coating materials able to extend their shelf life. The protection
efficiency will be assessed by the level of anti-fungal properties, before and after encapsulation.

2. Material and Methods

2.1. Materials

Three different samples of Ulva lactuca were studied. Lebanese Ulva lactuca (Leb Ul) was freshly
and manually collected from a coastal zone of the Mediterranean, El Mina (34 ° 26 'N - 35 ° 50'
E) in Tripoli, Lebanon. The algae were cleaned with seawater to remove unwanted impurities.
Then cleaned 3 times with distilled water and dried at room temperature until the mass remained
constant. The samples were then stored hermetically at room temperature. Two other lots of Ulva
lactuca (Feed and Food quality: Feed Ul and Food Ul) were purchased from Fujian, China-
Mainland (Fuzhou Wonderful Biological Technology Co., Ltd.).

141
Milli-Q water was used for the different tasks. Maltodextrin (MD) Glucidex IT 12 was purchased
from Roquette, Soy protein isolate (SPI) (90% pure) was purchased from Solae Belgium NV
(Ieper, Belgium). Phosphate buffered saline (PBS), Nystatin suspension, Ampicillin sodium salt,
Streptomycin sulfate salt, Potato dextrose broth, Malt extract agar were purchased from Sigma
Aldrich.

2.2. Algae aqueous extract preparation

Algae aqueous extracts were prepared according to Jimenez et al. (2011). 5 g of dried algae was
put in a 100 mL flask. A volume of 100 mL of boiling Milli-Q water was added. The medium was
stirred magnetically for one hour at room temperature. The extract was then filtered twice through
a double layer of sterile muslin filter (20 cm x 20 cm). The filtrate was dried in a Memmert
incubator (Schwabach, Germany) at 103 ± 2 °C for 12 hours, to obtain a dried extract. The yield
of extraction was calculated using the final weight of dried extract according to the following
formula:

Extraction yields are expressed in % w/w dry weight (d.w). The extracts were stored at 4 ºC until
analysis. The dry matter rate (% dry weight) of liquid extracts (filtrates) was calculated with the
following equation:

Where, m0: crucible tare (g), m1: mass of crucible and sample before drying (g), m2: mass of
crucible and sample after drying (g)

2.3. Chemical composition of Ulva lactuca extracts.

2.3.1. Total Polysaccharide content

Polysaccharides were analyzed by ion exchange chromatography with a CarboPac PA1 column
(Dionex). The eluent was potassium hydroxide, at a flow rate of 1ml min_1. The following
concentration gradient was used: 2mMfor 39 min, increasing to 10 mM for 2 min, 100mM for 8
min and 100mM for 3 min. The temperature was set to 25 °C. The injection volume was 25 μl.

142
External standards were used for polysaccharide identification. Fucose was used as an internal
standard for polysaccharide quantification

2.3.2. Ulvan amount determination

20 g of dried seaweed were treated at room temperature with a [Link] MeOH-CHCl3–H2O
mixture to remove colored matter, filtered and vacuum dried to obtain defatted algal biomass
(Bilan et al. 2006). This material was used to extract ulva following the method of (Mao et al.
2006).The resulting alga was placed into 400 mL of water. This solution was continuously stirred
and kept at 80–90 °C in a hot-water bath for 2 h. The aqueous extract was centrifuged, and the
liquid supernatant was filtered. The water extract was concentrated by a rotary evaporator to reduce
the volume. The water extract was centrifuged, filtered and precipitated with 3 vol. of absolute
ethanol. The alcohol precipitate was separated, washed several times with ethanol, and dried in a
vacuum oven at 40 °C, then re-dissolved in distilled water, and dried to obtain highly purified
ulvan.

2.3.3. Total Phenolic content

The total phenolic content of the plant aqueous extracts was determined by the Folin Ciocalteu
method. 20 μL of extract, 10 μL of Folin Ciocalteu reagent and 170 μL of sodium carbonate were
added to each well of a 96-well microplate. The plate was incubated for 45 min at 45 °C and
absorbance was measured at 760 nm with a spectrophotometer (Spectrostar, BMG Labtech). A
calibration curve was plotted with a standard solution of gallic acid. Each sample was analyzed in
four wells. Results are expressed as grams of gallic acid equivalent per 100 g of sample on a dry
basis (GAE/100 g d.b.)

2.3.4. Soluble Protein content

Proteins were quantified by Lowry method (Lowry et al., 1951) using a standard curve of
bovine serum albumine (BSA) and a lowry kit (Lowry reagent, bovine albumin standard and 2-N
Folin-Ciocalteu reagents) purshased from Thermo Fisher Scientific. A calibration curve was
prepared using a concentration range of BSA from 0 500 μ[Link]−1. An amount of 0.2 mL of each
standard and sample containing the crude protein extract was withdrawn. 1 mL of modified Lowry
reagent was added to each sample. They were then vortexed and incubated for exactly 10 min.

143
After incubation, 100 μL of Folin-Ciocalteu reagent (1 N) was added and again vortexed and
incubated for 30 min. The blue-colored solution was then measured at 750 nm with a UV-1800
Shimadzu spectrophotometer.

2.4. Microencapsulation of algae extracts

2.4.1. Preparation of solutions

Two raw materials were tested: soy protein isolates (SPI) and a mixture of soy protein isolates
with maltodextrin (SPI+MD) with the ratio 50/50. A dried algal extract was dissolved in an
aqueous solution of raw material, using Milli-Q water with gentle magnetic stirring at room
temperature. The final concentrations in algal extract and in raw material were 2% (w/w). The
solution was kept under constant stirring at room temperature for 30 min before spray-drying step.

2.4.2. Spray-drying

The solutions (125 mL) were spray-dried in a Mini Spray dryer B-290 (Büchi, Flawil, Switzerland)
under the following process conditions: inlet air temperature at 120 ± 4 °C and outlet temperature
at 74 ± 4 °C, drying air flow rate of 470 L.h-1, liquid feed flow rate of 0.33 L.h-1, and 100%
aspiration. Microparticles were collected from the cyclone collector, shut hermetically in opaque
packaging and stored at 4 °C.

The spray drying yield was evaluated by considering the recovery of product. It is given as a
percentage by the ratio between the total recovered product mass (Mp) and the mass of the material
initially fed into the system (Msp). The yield is expressed by the following equation:

Where Mp is the dried mass of the powder (microparticles) collected and MSP is the initial mass of
solid content in the solution, including soy protein, maltodextrin and algae extracts.

2.5. Characterization of microparticles

2.5.1. Microparticles moisture content

144
Moisture content of all the obtained powders was determined with infrared moisture balance
(Sartorius, Goettingen, Germany) by drying at 105 °C to constant weight.

2.5.2. Microparticle Size Distribution

The size distribution of the microparticles was determined by laser diffractometry with a Sirocco
2000 machine (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). A refractive index of 1.52 was used,
with an air dispersion pressure of 4 bars. The volume-based particle diameters (D4,3) were
calculated as the mean of three measurements per sample.

2.5.3. Morphology
Microparticles were observed by scanning electron microscopy (SEM) with a LEO435VP
scanning electron microscope (LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK) operating at 10
kV. They were deposited on a conductive double-faced adhesive tape and sputter-coated with
silver.

2.6. In vitro antifungal properties

2.6.1. Preparation of pathogen inoculum

Protocol was adapted from Nicosia et al. (2016). Fungal isolates of Penicillium digitatum were
obtained from infected oranges and then cultivated on Malt Extract Agar (MEA, Sigma–Aldrich)
in order to obtain single conidia colonies. For inoculum growth, cultures were kept at 22 °C for 7–
10 days. Obtained spores were then collected using a sterile spatula, diluted in sterile distilled
water, and then vortexed for 1 min to ensure uniform mixing. Spore concentration was fixed to 108
[Link]-1 using a densitometer (Biosan DEN-1B, McFarland densitometer). The obtained stock
solution (108 [Link]-1) was then diluted to two solutions; S1= 106 [Link]-1 was used for the study
of microcapsules effects on spore germination in liquid medium and on germ tube elongation, and
S2= 2x103 [Link]-1 was used to study of the microparticle effects on fungus viability on solid
medium.

2.6.2. Adhesion test on the epidermal orange cells

145
Protocol was adapted from Kimura and Pearsall (1978). The orange cells were directly taken from
a vigorous orange by scratching its outer peel. These cells were then washed in PBS (1 mL/tube),
centrifuged at 2500 g for 10 min, and finally re-suspended in 1 mL PBS for counting. Penicillium
digitatum spores were taken from an infected orange and cultivated on Malt medium for 4 days at
room temperature. Spores were then suspended in PBS. Spores and oranges cells’ concentrations
were evaluated using a densitometer (Biosan DEN-1B, McFarland densitometer). Spores and
oranges cells solutions were diluted to obtain concentrations of 107 cells/mL and 105 cells/mL
respectively; 1 mL of orange cells suspension was brought into contact for 1 h with 1 mL of crude
extracts solutions (50 [Link]-1) or microparticles solutions at the same concentration (which
correspond to 1 g of the microparticles dissolved in 10 mL autoclaved Milli-Q water). After 1 h of
incubation, 1 mL of Penicillium spores were added to the various mixtures and the whole mixture
was stirred for 2 h at room temperature. After 2 h of incubation, the preparation was washed 3
times in PBS; for a clean wash, 0.5 mL of PBS solution was added each time and the mixture was
centrifuged at 2500 g for 10 minutes. The aim of these centrifugations is to eliminate the remaining
free spores. The cells being in suspension, the test reading was carried out by the examination of
fresh pellet reconstituted in 0.1 mL PBS. The adhesion index is defined as the number of
Penicillium digitatum spores fixed per orange cell. An index greater than 25 is the indicator of a
strong adhesion, whereas, for an index of less than 10, the adhesion is low (Linas 1986). Ten
orange cells were examined in triplicate for each extract and the averages of adherent cells were
calculated.

2.6.3. Inhibition of germination and germ tube elongation test

12.5 μL of the solution S1 (106 C mL-1) were transferred to Eppendorf tubes to which 25 μL of
aqueous extract (obtained according to protocol 2.2) or 25 μL of an autoclaved Milli-Q water
solution where microparticles were dissolved (1 g in 10 mL). Then 12.5 μL of potato dextrose
broth (PDB, Sigma–Aldrich) were added. Sterile ultrapure water (Water), Nystatin, soy protein
(SPI) and mixture SPI+MD 50:50 were used as negative and positive controls. The tubes were
then mixed and incubated for 20 hours at 22 °C followed by a vortex in order their homogenization.
Afterward, 2 μL of spore suspension were transferred to microscope slides, mixed with 2 μL of
lactophenol blue, then observed at a magnification of 40 for spore germination and tube elongation.
For each slide, three observations were randomly done.

146
2.6.4. in vitro antifungal activity
The determination of the antifungal properties of the extracts on Penicillium digitatum was carried
out by Disk diffusion test on Malt Extract agar (Sigma Aldrich) previously inoculated by flooding
with P. digitatum. The microorganisms were grown on Malt Extract agar (Sigma Aldrich) plates
at 24 °C for 48 hours prior to seeding into Malt Extract agar (Sigma Aldrich). One or several
colonies of a similar morphology of each Penicillium were transferred into the sterile distilled
water and adjusted to the 0.5 McFarland turbidity standards (107 spores/mL suspension).
Inoculates of the respective fungi were seeded on Malt Extract agar. The sterile discs were
impregnated with 25 μL of the aqueous extract (obtained according to protocol 2.2) or 25 µL of
microparticles solutions (1 g of microparticles dissolved in 10 mL of autoclaved Milli-Q water)
and then dried at room temperature. The sterile filter discs 6.4 mm in diameter were placed on
inoculated agar medium and incubated at 24 °C for 48 hours. Nystatin (100 U/disc) was used as a
positive antifungal control. The results were determined from the presence or absence of growth
and size of the inhibition zone. The diameter (mm) of the growth inhibition halos caused by the
different extracts was measured. All the assays were carried out in triplicate.

2.7. Statistical analysis

Results for the microbiological test were based on three replicates for three experiments (n=9). All
extraction and characterization data were presented as mean values ± standard deviations of three
experiments. A two-way ANOVA was performed to identify significant differences among the
treatments-control groups. Sidak’s and Dunnett’s significance test was applied to compare the
means of every treatment towards the control. Statistically significant differences are indicated
with stars (* p < 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p < 0.0001).

3. Results and discussion

3.1. Extraction yield

Extraction yields obtained for Ulva lactuca from Lebanon and China are presented in Table 1. The
results show that the aqueous extract from Chinese Ulva lactuca for Feed has the highest yield in
dry matter content (31.6 % ± 0.17). Chinese Ulva lactuca for Food and Lebanese Ulva lactuca

147
have similar extraction yields (21.7 % ± 0.19 and 20.6 % ± 0.11 respectively). In these conditions,
it was possible to get good yields in a short time of extraction (1h).

Table 5: Yields of aqueous extraction of Ulva lactuca.

% dry matter content Extraction Yield (%)

Chinese Ulva lactuca Food Ul 1.7 % ± 0.4 21.7 % ± 0.2

Feed Ul 2.1 % ± 0.2 31.6 % ± 0.2

Lebanese Ulva lactuca Leb Ul 1.6 % ± 0.4 20.6 % ± 0.1

The chemical composition of the aqueous extract was characterized in term of polysaccharides,
proteins and polyphenols contents. In the case of ulvan, contents were determined from algae
biomass et not from the extracts. The higher the ulvan content in seaweed, the richer the aqueous
extract is in ulvan.

Table 6: Chemical characterization of Ulva lactuca samples

Total Ulvan Soluble proteins Total

polysaccharides (g / 100 DM) (g/100 g DM) polyphenols
(g/ 100g DM) (g/100 g)
Ch Food Ul 11.7 ± 0.04 6.3 ± 0.1 3.2 ± 0.4 9.0 ± 0.6
Ch Feed Ul 13.0 ± 0.03 9.8 ± 0.4 1,7 ± 0.3 6.0 ± 0.7
Lebanon Ul 15.5 ± 0.04 18.5 ± 1.2 5.4 ± 0.1 6.0 ± 0.1

Other water-soluble compounds present in the commercial Food and Feed grade samples can
explain the higher extractions yield obtained, compared to Lebanese Ulva lactuca;

3.2. Microparticles preparation and characterization

Spray-drying was used to produce SPI and SPI+MD microparticles loaded with UL aqueous
extracts. Several parameters have an influence on microencapsulated products final characteristics:
the properties of the encapsulating materials, the formulation parameters and operating conditions
(Paulo & Santos, 2017). For the experiments, two encapsulating materials were tested: soy proteins
(SPI) and a mixture 50/50 of soy proteins and maltodextrin (SPI + MD). Their concentration in
the solution was kept constant (2% w/w), to ensure their complete dissolution and a suitable

148
viscosity for spraying. Concerning the spray-drying parameters, inlet temperature and feed flow
(120 °C and 0.33 L/h respectively) were adjusted to evaporate correctly the solvent without altering
the UL extracts and to optimize the production yield. The concentration of dried UL extracts was
set at 2% w/w, to obtain a 1:1 encapsulating material/dry extract ratio for the different experiments.
The spray-drying yields (Table 2) varying from 48 to 62 %, were in accordance with previous
works dealing with the same encapsulating materials. Indeed, the production yields reported for
microencapsulation with plant proteins range from 50 to 70% (Nesterenko et al., 2012; Wang et
al., 2015) whereas those obtained for maltodextrin based microencapsulation are rather around
50% (Santiago-Adame et al., 2015; Tolun and al., 2016). Moreover, the results demonstrate that
combining two encapsulating materials allowed to increase spray-drying yield, as previously
observed by (Rodriguez et al., 2015). Spray drying yields also depends on Ulva lactuca origin thus
confirming that the compositions of aqueous extracts are different.
Microparticles moisture contents (Table 2) varied from 2.4 % to 3.1%, which is in the range
ensuring microbiological stability of the extracts (Mendanha et al., 2009). We can notice that the
moisture values were slightly lower for microparticles produced with SPI than for the one with
SPI + MDX.
Table 7: Properties of Loaded Spray-Dried Microparticles.

Spray-drying Moisture content of Microparticles mean

yield (%) microparticles (%) diameter
(D4,3)µm
SPI 54 2,7 4.22 ± 0.04
SPI + MD 54 2,7 3.90 ± 0.01
Food Ul /SPI 53 2.7 9.01 ± 0.12
Feed Ul / SPI 48 2.4 7.80 ± 0.41
Leb Ul / SPI 58 2.9 9.01 ± 0.12
Food Ul /SPI+MD 62 3.1 6.08 ± 0.01
Feed Ul / SPI+MD 58 2.9 4.58 ± 0.08
Leb Ul / SPI + MD 60 3.0 5.34 ± 0.04

Mean microparticle diameters ranged from 3.9 to 9.0 µm (Table 3), which is consistent with
published values for SPI and MD based microparticles (Nesterenko and al., 2014). Particles
produced with SPI+MDX are slightly smaller than those made with SPI whatever the UL extract.
Similar findings were made by (Pang et al., 2014) who suggested that this result could be correlated
to the higher viscosity of protein solution compared to the protein/maltodextrin solution at a similar

149
solid concentration. Whatever the encapsulating material, microcapsules with Feed UL extract
have smaller diameter than the two other extract microparticles.
The obtained values were confirmed by SEM observations (Figure 1). Produced microparticles
were spherical and of regular shape, but with a slightly cracked surface. No significant difference
was observed between encapsulating materials of UL extracts, other than the mean diameter of the
microparticles.

Empty SPI+MD microparticles Empty SPI microparticles

Feed Ul extract encapsulated in SPI+MD Feed Ul extract encapsulated in SPI

Figure 1: Scanning electron micrographs of microparticles

150
3.3. In vitro antifungal properties
In vitro antifungal properties were studied for aqueous extracts of Ulva lactuca ([Link] Ul, [Link]
Ul and Leb Ul) and for aqueous extracts encapsulated with the two coating materials. The
measurement of antifungal activity was performed both on fresh samples and on samples stored
for one year at 20°C in closed flasks away from light. Microcapsules were dissolved in water (2
%w/w) before assessing anti-fungal properties.

3.3.1. Adhesion test on the epidermal orange cells.

Figure 2 shows the adhesion levels of P. digitatum spores to the epidermal cells of oranges in the
presence of microparticles and aqueous extracts. The three aqueous extracts demonstrated
interesting anti-adhesion properties, even after one year of storage.

We observed the AI of aqueous extracts were very similar to the adhesion index of microparticles
obtained with SPI. The other material (SPI+MD) seems to increase the index adhesion due to the
presence of maltodextrin. Indeed, maltodextrin may contribute to the growth cycle of fungi. This
result is an agreement with the adhesion index of pure materials AISPI+MD = 45 higher than AISPI=
16.

The values obtained show that the microparticles performed with SPI preserved the anti-adhesion
properties after one year of storage. It means that SPI seems to be an efficient coating to protect
the activity of the extracts. However, the microparticles performed with SPI+MD showed
increasing adhesion index above 25, compared to non-encapsulated extracts. Two hypotheses can
be done to explain this result: the permeability of the coating may lead to reduced activities of the
extracts after one year, or the maltodextrin may be used by the fungi as a source of energy.

151
 [Link] Ul./SPI+MD **** Fresh extract
****
[Link] Ul./SPI+MD
**** Stored extract
Leb Ul./SPI+MD
[Link] Ul./SPI ***
[Link] Ul./SPI ***
Leb Ul./SPI ***
[Link] Ul. *
[Link] Ul. *
Leb Ul. *
SPI+MD ****
SPI *
Nystatin *
Water
20

40

60
0

Adhesion Index (AI)

Figure 2: Adhesion index of P. digitatum to the orange’s epidermal cells in the presence of Ulva lactuca extracts
(encapsulated or non-encapsulated). Values in the figure are studied by a two-way ANOVA, (* p < 0.05, *** p <0.001,
**** p < 0.0001).

3.3.2. Inhibition of germination and germ tube elongation test.

On figure 3, we can observe that fresh aqueous extracts generate high inhibitions of germination
(around 75%), values which decrease after one year of storage. Surprisingly, we found that SPI
material has an anti-fungal activity, as suggested in the previous test. Therefore, the encapsulation
of Ulva lactuca aqueous extracts by SPI improved the initial inhibition of germination of fresh
extracts, due to SPI barrier effect (Liu et al. 2017) and to its own activity. If SPI material allows
to limit the inhibition of germination of extracts after one year, microparticles based on SPI+MD
showed a significant decrease of the inhibition of germination of P. digitatum after one year.

152
 150
Fresh extract
Inhibition of germination of Penicillium digitatum (%)

Stored extract

**** **** * **** **** **** **** ** ** ** **** **** ****

100

50

0
er

l.
tin

PI
l.
l.

I
I

D
SP

SP
SP
U
U

U
M

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at

./ S
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Fo

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l ./
I+

I+

I+
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ys

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h.
h.
SP

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SP

SP
N

Fo

Fe
C
C

l ./

l ./

l ./
Le

h.
h.

U
C
C

Fo
b

Fe
Le

h.
h.

C
C

Figure 3: Inhibition of germination of [Link] by Ulva lactuca extracts (encapsulated or non-encapsulated).

Values in the figure are studied by a two-way ANOVA (* p < 0.05, ** p <0.01, **** p < 0.0001).

3.4. In vitro antifungal activity

The antifungal activities of extracts and microparticles were assessed according to the agar
diffusion method on discs.
According to table 4, the aqueous extracts encapsulated with SPI showed high inhibition zone
diameters for the three extracts (16-21 mm) corresponding to a better activity compared to the non-
encapsulated aqueous extracts (fresh or stored). Thus, the SPI encapsulated feed extracts almost
reached the nystatin zone diameter (23.3 mm). This result indicates that SPI coating contributes
itself to the global anti-fungal activity of microparticles, while efficiently protecting the initial
antifungal activity of the extracts. Besides, several works (Gonzalez-Estrada et al., 2017; Wu et
al. 2019) suggested that SPI based films have interesting properties to preserve food from different
microbiological contaminations.

Conversely, the microparticles made with the mixture SPI+MD (50:50) exhibited a decrease of the
inhibition zone diameter compared to the non-encapsulated aqueous extracts, in particular for
Lebanese and feed Ulva lactuca. This result confirms that the maltodextrin used for coating
enhances the fungi development.

153
Table 4: Inhibition zones measured around the wells for extracts and microparticles after one-year storage

(a value corresponds to a mean ± SD of triplicates)

Penicilium digitatum Inhibition zone diameter (mm)

Control Nystatin 23.3 ± 1.5

water 0±0
Soy protein isolates 13.5 ± 2.1
SPI/MD 2.8 ± 0.2
Lebanese Ul Fresh aq. extract 15.1 ± 0.2
Stored aq; extract 13.0 ± 0.3
Stored microp. SPI 16.1 ± 0.1
Stored microp. SPI/MD 8.3 ± 0.0
Feed Grade Ul Fresh aq. extract 14.2 ± 0.1
Stored aq; extract 11.1 ± 0.2
Stored microp. SPI 21.5. ± 0.0
Stored microp. SPI/MD 5 ± 0.0
Food Grade Ul Fresh aq. extract 13.5 ± 1.1
Stored aq. extract 12.5 ± 0.1
Stored microp. SPI 16.3 ± 0.0
Stored microp. SPI/MD 13.2 ± 0.2

To conclude the assessment of extracts properties, the three tests are in agreement to show that
aqueous extracts of Ulva lactuca have anti-fungal activities linked to the presence of active
molecules. The ulvan content of Lebanese sample may explain its slightly better activity than the
two other fresh samples, observed for the three tests.
When Ulva lactuca extracts were coated with SPI, they presented the highest anti-fungal activity
after the storage period, results attributed both to the chemical structure of soy protein forming an
efficient barrier and to the size of SPI particles which minimizes the exchange surface compared
to SPI + MD particles. The three tests also highlighted a noticeable SPI anti-fungal activity,
interesting for the target application.

4. Conclusion

Ulva lactuca aqueous extracts were successfully encapsulated using soy protein and a mixture of
soy protein- maltodextrin (50:50) as coating agents. We observed that drying yields and particles
sizes depend on Ulva lactuca origin and on wall material. Microparticles have a similar
morphology. Microencapsulation with both materials did not reduce the anti-fungal activity,

154
according to the three in vitro tests. It means that the active molecules were not altered during the
encapsulation process. This study showed that microparticles based on SPI have suitable
characteristics to preserve the antifungal activity of a green seaweed extract during their storage.
The other material made of SPI+MD generates microparticles showing a loss of antifungal activity
probably due to the interactions between maltodextrin and fungi, meaning once more that the
choice of a coating material must be carefully done. The solubilization of these microparticles in
water easily led to the preparation of the aqueous solution to spray on the citrus fruit.

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161
Article IV. Extraits d’algues vertes formulés avec des ingrédients biosourcés pour
la conservation des agrumes après récolte.

La seconde approche étudiée pour préparer une formulation, vaporisable et adaptée au

traitement des agrumes, est la réalisation d’une émulsion à partir de l’extrait aqueux d’Ulva
lactuca.

La pulvérisation de l’extrait aqueux nécessite quelques précautions car elle génère un rebond des
gouttelettes sur la surface à traiter, une lixiviation et finalement des pertes d'une partie du produit.
De ce fait, un autre type de formulation à base d'une émulsion huile dans eau comprenant l'extrait
aqueux d’Ulva lactuca a été considéré Ce type de formulation présente également l’avantage de
limiter la consommation en molécules actives. De plus, la viscosité de l’émulsion végétale doit
faciliter l’adhérence des fractions actives à la surface des agrumes, en évitant les coulures du
produit. Le séchage de la formulation s’accompagne de la formation d’un film d’huile végétale
protecteur à la surface de la peau.

Pour stabiliser l’émulsion, des agents émulsifiants biosourcés dérivés de l’acide trans-aconitique
ont été synthétisés en respectant les principes de la chimie verte. Ces composés ont pour rôle de
disperser l’huile végétale dans l’extrait aqueux d’Ulva lactuca. C’est pourquoi, l’acide trans-
aconitique provenant des vinasses de canne à sucre, a été estérifié par un alcool gras pour
synthétiser des aconitates d’alkyle (Figure 25) selon un procédé qui minimise les impacts
environnementaux. Les conditions réactionnelles, sans ajout de catalyseur et sans tiers solvant,
peuvent être ajustées (ratio des réactifs et température) pour orienter la réaction vers la catégorie
d'esters (aconitates de monoalkyle, de dialkyle ou de trialkyle) la plus adaptée à l’émulsion visée.

162
 H COOH H COOH

HOOC ROOC
COOR COOR
H COOH H COOH H COOR H COOR
ROH ROH ROH
HOOC ROOC ROOC ROOC
COOH COOH COOH COOR
Acide trans-aconitique Aconitate de tri-alkyle
H COOR H COOR

HOOC HOOC
COOH COOR
Aconitate de mono-alkyle Aconitate de di-alkyle

Figure 24: Schéma de l'estérification de l'acide aconitique.

Les esters d’aconitates ont été caractérisés par leur balance lipophile-hydrophile (HLB) et leur
tension-superficielle. La stabilité des émulsions a été évaluée par le suivi de l’indice de crémage.
La taille des gouttes d’huile et la viscosité des émulsions ont été également mesurées.

Les résultats ont montré que les teneurs en monoesters et diesters sont plus élevées pour la réaction
avec le dodécanol (camparé à l’alcool oléique), et en limitant le temps de réaction à deux heures.
A l’inverse, un temps de réaction rallongé à 3 heures et un ratio alcool : AcoA égal à 3 (au lieu de
2) favorisent la conversion du dodécanol et augmente la proportion de triester.

Les indicateurs de la chimie verte ont été calculés à partir des équations bilan des réactions mises
en oeuvre. L’acide aconitique, le dodécanol, les monoesters, les diesters ainsi que les triesters sont
désignés par AcoA, DD, ME, DE et TE respectivement.
Les conditions de synthèse conduisant à un mélange riche en aconitates de monododécyle et de
didodécyle (70%) génèrent l’équation suivante :

1 AcoA + 2 DD  0,35 ME + 0,2 DE + 0,18 TE + 1,3 H2O + (0,7 DD + 0,27 AcoA)

Le taux de conversion de l’acide aconitique atteint alors 73%.

163
En augmentant le ratio dodecanol/AcoA, le mélange obtenu contient 66% d’aconitate de
tridodecyle, avec l’équation suivante :

1 AcoA + 3 DD  0,27 ME + 0,11 DE + 0,43 TE + 1,8 H2O + (1,2 DD + 0,19 AcoA)

Dans ce cas, le taux de conversion de l’acide aconitique est égal à 81 %.

En augmentant le temps de réaction d’une heure, la teneur en aconitate de tridodécyle passe à

73,5% , selon l’équation suivante :

1 AcoA + 3 DD  0,01 ME + 0,23 DE + 0,65 TE + 1,98 H2O + (0,58 DD + 0,11 AcoA)

Le taux de conversion de l’acide aconitique est égal à 89%.

L’économie d’atome ou Atom economy (AE) reflète l’incorporation des réactifs dans le produit
final. Les coefficients stoechiométriques sont ceux des équations déterminées ci-dessus.

Si le produit visé est le mélange d’aconitates, la formule est la suivante appliquée dans le tableau
16 :

ν ME M ME + ν DE M DE +ν TEM TE
AE = x100
ν AcoA M AcoA + ν DD M DD

Tableau 16: Economie d’atome (AE) calculées pour la synthèse des esters d’aconitate.

Experiment Target compound AE (%)

content

Aconitate de 86,8
70 %
mono/di dodecyle

Aconitate de 89,9
66 %
tridodecyle

Aconitate de 91,4
73.50 %
tridodecyle

164
Les trois conditions d’estérification conduisent à des économies d’atome élevées. Lorsque la
teneur en triester augmente, nous pouvons vérifier que l’économie d’atome est plus élevée.

Le facteur environnemental ou Environnemental factor (E-Factor) permet de comparer les

quantités de déchets générées par la réaction rapportée à la quantité de produits formés :
m waste m AcoA
E − factor = =
m product m ME + m DE + m TE

Pour le calcul, l’acide aconitique est considéré comme le seul déchet généré par la réaction, ce qui
donne les valeurs de E-factors du tableau 17.

Tableau 17: E-factors calculés pour la synthèse des aconitates d’esters.

Target compound
Experiment E-factor
content
1 70% 0.14
4 66% 0.075
5 73.50% 0.034

Les conditions conduisant au triester présentent des E-facteurs réduits, car la synthèse du triester
implique un taux de conversion d’acide aconitique plus élevé que pour les monoesters et diesters.
Si le dodécanol qui n’a pas réagi était inclus dans les déchets, le E-factor augmenterait.

L’efficacité massique de la réaction (ou Mass efficiency Reaction) de la réaction est calculée
avec la formule suivante :

m ME + m DE + m TE
MER = x100
m AcoA + m DD

Tableau 18: Calcul de l’efficacité massique de la synthèse des aconitates d’esters.

Experiment Target compounds content Mass efficiency of the reaction (%).

1 70 % 64
4 66 % 60
5 73.50 % 76,4

165
Le tableau 18 montre que l’enrichissement du milieu en triester augmente l’efficacité massique de
la réaction. En conservant le dodécanol dans la composition finale, l’efficacité massique s’en
trouve encore améliorée.
Au total, les valeurs des indicateurs sont en accord avec les principes de la chimie verte. La
comparaison des indicateurs verts montre clairement que l’enrichissement du milieu en composés
cibles, le taux de conversion de l’acide aconitique et la conservation du dodécanol dans le milieu
agissent favorablement sur les aspects chimie verte. La présence de dodécanol au sein des
aconitates augmente le HLB résultant, ce qui est favorable pour la préparation des émulsions huile-
dans-eau. Le dodécanol ainsi conservé dans le milieu peut jouer le rôle comme un co-émulsifiant.

Les caractéristiques physico-chimiques des émulsions ont montré que les aconitates de
monododecyle et de didodécyle conduisent à des émulsions plus stables (indice de crémage
inférieur) que celles stabilisées par les tridodécyles aconitates.

Les résultats indiquent que l’émulsification de l’extrait aqueux est favorable à son activité anti-
fongique vis-à-vis du Penicillium digitatum, en limitant l’ampleur de la contamination. Les tests
in vitro avec les nouveaux ingrédients montrent également que les esters d’aconitate purs ont une
activité anti-fongique au moins égale à celle de l’extrait aqueux.

Les tests in vivo avec les émulsions avec des extraits d’algues ont montré un pourcentage
d’inhibition de l’infection de 88,9% après 6 semaines de traitement au lieu de 83% pour les oranges
traitées uniquement avec l'extrait d'Ulva lactuca et de 22 % pour les oranges non traitées.

La formation d’un film lipidique à la surface du fruit contribue à limiter l’infection, car il agit
comme une barrière protectrice vis-à-vis de la germination des champignons. Les émulsions ne
contiennent que 8,3% (v/v) d’extrait aqueux, et une teneur de 8 % en volume d’agent émulsifiant.

La biocompatibilité de la formulation finale peut s’appuyer sur plusieurs éléments :

- L’ingrédient naturel (extrait aqueux d’Ulva lactuca) est déjà répertorié dans la base INCI
en tant qu’ingrédient non réglementé, car sans risque pour la santé humaine et d’impact
environnemental réduit.
- Les ulvanes sont déclarées cytocompatible par une étude de cytotoxicité in vitro, pour être
utilisées pour des applications liée à la santé [257].

166
 - L’ingrédient biosourcé (agent émulsifiant) est dérivé de l’acide trans-aconitique qui est
répertorié dans la base GRAS (generally recognized as safe). Ainsi, l’acide trans-
aconitique est déjà répertorié comme additif alimentaire (exhausteur de goût et co-additif
anti-oxydant). Lors de la synthèse de l’agent émulsifiant, des traces d’acide aconitique
n’ayant pas réagi sont en effet détectables par HPLC.
- Les aconitates d’alkyle peuvent être considérés comme des composés biocompatibles.
D’une part, des monoesters, diesters and triesters préparés à partir d’éthanol, n-butanol et
n-octanol ont été identifiés comme des composés prometteurs pour la préparation de
nouveaux médicaments pour limiter les processus inflammatoires (de Oliveira, 2018).
D’autre part, une étude viabilité cellulaire réalisée par l’INSERM a montré que l’acide
trans-aconitique n’est pas toxique à une concentration de 10 mM et que l’aconitate de
tridodécyle à 0,1 mM présente une viabilité cellulaire de 50 %. Ce pourcentage augmente
avec des aconitates à chaîne plus courte [258].
De plus, les aconitates sont facilement hydrolysables en acide aconitique et en alcool
correspondant.

Ces différentes informations excluent les phrases de risques interdites pour les produits de
biocontrôle selon le décret de la DGAL paru en 2019, ce qui tend vers l'autorisation les
formulations décrites pour un contact avec les agrumes, sans danger pour l’homme.

En conclusion, ces formulations écocompatibles représentent une approche intéressante pour

améliorer l’efficacité de la conservation des agrumes. Les résultats de cette étude démontrent la
faisabilité de la conception d'émulsions aux propriétés antifongiques à base d'ingrédients naturels
et biosourcés.

La totalité des résultats est présentée sous la forme d’un article soumis à Crop Protection.

167
Green seaweed extract formulated with biobased ingredients for postharvest
citrus fruit preservation

Douaa Salim a,b, Pascale de Caro a, Asma Chbani b, Xavier Chasseray c and Alain Shum Cheong Sing c

a
Laboratoire de Chimie Agro-industrielle, LCA, Université de Toulouse, INRA, Toulouse, France

b
Laboratoire de Technologie appliquée, centre AZM pour la recherche en Biotechnologie et ses applications,
Université Libanaise, Tripoli, Liban.
c
Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et des Sciences des Aliments, LCSNSA, Université de La Réunion,
Saint Denis, La Réunion, France
*Correspondence: [Link]@[Link]; Tel: +33534323505

Abstract
Penicillium digitatumis the causal agent for citrus green mold which generates 90 % of post-harvest losses.
The use of a green seaweed extract to struggle against this fungal pathogen could represent an alternative
to chemical fungicides. We propose to formulate this aqueous extract in an emulsion dedicated to prevent
the development of fungi on the citrus fruit. Biobased emulsifiers were selected to prepare emulsions
combining hydrophilic natural active molecules and a vegetable oil used to disperse this aqueous phase,
while forming a coating film after the water evaporation. Alkyl aconitates were synthesized from aconitic
acid, a platform molecule coming from sugar cane, according to a green process. Alkyl aconitates were
efficient to stabilize oil-in-water emulsions including the Ulva lactuca aqueous extract. In vitro and in vivo
microbiological tests based on the fungus viability were carried out to evaluate the new ingredients towards
the spore adhesion and the Penicillium digitatum germination. The results showed that anti-fungal activity
of the Ulva lactuca aqueous extract formulated with alkyl aconitates was enhanced. Alkyl aconitates were
able to confer a stability and a viscosity adapted to an easy application. These ecocompatible formulations
represent an interesting approach to improve the efficiency of citrus fruit preservation.

Keywords: Ulva lactuca extract, biobased emulsifier, anti-fungal activity, green formulation, citrus fruit
preservation

1. Introduction

Citrus fruit are heavily affected by Penicillium digitatum, which causes green mold diseases
during the packaging, storage rooms, transit containers and market places. Plant diseases can be
controlled by applying synthetic fungicides, but it may have several side effects, including the
resistivity of strains, environmental contamination and human health issues. Therefore, an

168
alternative postharvest control, based on the use of natural ingredients could be safer for food
industry and their consumers. In a previous work, Salim et al. (2019) obtained an Ulva lactuca
aqueous extract rich in ulvan, proteins, polysaccharides and antioxidant molecules, and exhibiting
an antifungal activity against Penicillium digitatum. The use of an aqueous plant extract to be
applied on the peels requires a few precautions. For instance, moisture on fruit peels must be dried
before transportation. Moreover, the spray of an aqueous extract generates rebound of
the droplets on the surface, leaching and finally losses of part of the product, Therefore, we
investigated another type of formulation based on an oil-in-water emulsion including the aqueous
extract. An emulsion has a higher viscosity which can limit the running of product on the peel
surface, and promotes its adherence. The dispersion of vegetable oil in the aqueous extract is
expected to vehicle antifungal molecules of green seaweed towards the fruit peels.

The current paper deals with the feasibility to formulate an aqueous extract from Ulva lactuca
under the form of an emulsion to improve the product application and the anti-fungal properties.

Extracts of green seaweed formulated with a biobased emulsifier have never been reported. A few
examples of emulsions dedicated to the plant or fruit protection are reported. When an essential
oil is the active composition, due to the low water solubility, it can be encapsulated in an oily phase
which is dispersed in water with an emulsifier such as tween-20 or triton-X100 (Ali et al. 2017;
Wu et al. 2019). When essential oils were encapsulated in nanoemulsions formulated with tween
80 and sunflower oil as a ripening inhibitor, the inhibiting effect against A. niger mycelial growth
and spore germination was enhanced (Ribes et al. 2017).

Clausse et al. (2018) prepared an invert emulsion encapsulating polysaccharides to improve the
efficiency of spraying on leaves. Lecithin and polyglycerol polyricinoleate were used as
surfactants. Batta (2004) formulated conidia of Trichoderma harzianum in water-in-oil emulsions
with Tween 20 to inhibit apple bleu mold.

To stabilize an emulsion including an aqueous seaweeds extract, biobased molecules has been
selected. Their easy preparation from a platform molecule and their potential properties towards
plants protection guided our choice. The platform molecule is aconitic acid, a tricarboxylic acid,
which has a similar structure as itaconic acid, one of the twelve biobased building blocks molecules
mentioned in a report of US Department of Energy (2004). Produced by plants during the Krebs
cycle, aconitic acid is accumulated by some of them. It was first isolated by Peschier in 1820 in

169
Aconitum paniculatum and later was identified in sugar cane molasses in 1877 (Behr, 1877). It is
the dominant acid in sugar cane juice (Yoder, 1911). If the isomer cis–aconitic acid is an
intermediate of the citric acid cycle, the trans-aconitic acid is a defense metabolite in plant; it
corresponds to the isomer form available when extracted.

Trans-aconitic acid (tAcoA) was also produced by dehydration of citric acid (Cranston, 1955).
Properties which was identified for trans-aconitic acid are mainly the inhibition of enzymatic
activity to treat some diseases (Chen et al., 2017) or its scavenging ability (Piang-Siong et al.,
2017).

A few authors investigated the conversion of aconitic acid into esters. In 1949, an American patent
mentioned the preparation of trialkyl aconitate using para-tolune sulfonic as catalyst and an
azeotropic distillation of water (Meincke 1949). This patent claims outstanding properties of
several trialkyl aconitates such as trilauryl or tributyl aconitate as active substances to protect
materials from insect, fungi and bacteria.

More recently, several conditions have been studied to prepare isoamyl aconitate esters (Piang-
Siong et al., 2011). The authors observed that the production of aconitates and their resulting
compositions in monoesters, diesters and triester, strongly depend on the type of catalyst
(homogeneous or heterogeneous). Fischer esterification with a mineral acid was also carried out
to prepare ethyl, butyl and octyl aconitates by de Oliveira et al. (2018). This study has identified
an anti-inflammatory activity in particular for dialkyl aconitates.

We can mention that biodegradable and non-toxic surfactants were prepared from citric acid,
another tricarboxylic acid, through an esterification by polyoxyalkylated alcohols between 150 and
190°C (Turchiniet al., 1986). The resulting esters were used as a major component in shampoo
formulations. Triesters of citric acid were also obtained with high aliphatic alcohols after 20 h
reaction at 150°C (Grigoryan et al., 2017). These high purity esters were used as dietary substitutes
for edible oils and fats. We can add that several esters of natural acids are cited for their anti-fungal
activities. For instance, 5-O-caffeoyl quinic acid and some of its alkyl esters inhibited growth of
Aspergillii which may contaminate food crops (Suárez-Quiroz et al., 2013). Milewska et al. (2012)
also observed an inhibited growth of some human pathogenic yeasts by trimethyl trans-
homoaconitate.

170
The present work aims to prepare an alternative formulation including natural and biobased
ingredients, to replace the conventional synthetic pesticides, which are used to struggle against the
fungal pathogen which grows on oranges peels.

The synthesis of aconitates from trans aconitic acid was performed by abiding with green
chemistry principles. The reaction was shifted towards the ester category which is the most adapted
to form an oil-in-water emulsion. In vitro and in vivo antifungal properties against Penicillium
digitatum were investigated for the new ingredients and their resulting emulsions.

2. Materials and methods

2.1 Materials

Lebanese Ulva lactuca (Leb UL) was freshly and manually collected from a coastal zone of the
Mediterranean, El Mina (34 ° 26 'N–35 ° 50' E) in Tripoli, Lebanon, on 1 May 2017. The algae
were cleaned with seawater to remove unwanted impurities, then cleaned three times with distilled
water and dried at room temperature until the mass remained constant. The samples were then
stored hermetically at room temperature.

Milli-Q water (PURELAB classic) was used in all work. Trans-aconitic acid (AcoA) (98%), oleyl

alcohol (98%), dodecyl alcohol (DDA), Ethanol, sulfuric acid (95-98%), Nystatin Suspension,

ampicillin sodium salt, streptomycin sulfate salt, Potato Dextrose Broth, Malt Extract agar were

purchased from Sigma–Aldrich and molecular sieves 3A (4 to 8 mesh) was purchased from

ACROS organics.

2.2. Synthesis of aconitate esters.

2.2.1. Synthesis of monododecyl and didodecyl aconitates under catalyst free conditions

Dodecanol (16.06 g, 86.2 mmoles) and aconitic acid (7.51 g, 43.1 mmol) corresponding to a ratio
2:1 were mixed in a 100 mL flask and heated under stirring until the solubilization of the solid
aconitic acid. Five grams of molecular sieve were placed at the bottom of the cooler in a sintered
glass fitting. The reaction medium was stirred at 170 °C during 2 h to get 28 g of a composition
rich in monododecyl and didodecyl aconitates (70%).

171
1
H of monododecyl and didodecyl aconitates (CDCl3): 1H NMR: δ 7.03-6.93 ppm (s, 1H, C=CH),
4.24–4.09 ppm (t, 2H, O–CH2), 3.95 ppm (s, 2H, CH2–CO– O), 1.67-1.61 ppm (m, 2H, O–CH2–
CH2–CH2–), 1.24 ppm (m, 2H, CH2–CH2–), and 0.88 ppm (t, 3H, CH3).

2.2.2. Synthesis of tridodecyl aconitate under catalyst free conditions

Dodecanol (24.09 g, 129.3 mmol) and aconitic acid (7.51 g, 43.1 mmol) corresponding to a ratio
3:1 were mixed in a 100 mL flask and heated under stirring until the solubilization of the solid
aconitic acid. 5 g of molecular sieve were placed at the bottom of the cooler on a sintered glass
fitting. The reaction medium was stirred at 170 °C during 3h, to get 28 g of mainly tridodecyl
aconitate (73%).
1
H NMR of tri-dodecyl aconitate (CDCl3): 1H NMR: δ 7.03-6.93 ppm (s, 1H, C=CH), 4.22–4.09
ppm (t, 2H, O–CH2), 3.95 ppm (s, 2H, CH2–CO– O), 1.26 ppm (m, 2H, CH2–CH2–) and 0.88 ppm
(t, 3H, CH3).

2.2.3. Synthesis of tridodecyl aconitate under homogeneous catalysis

Dodecanol (16.06 g, 86.2 mmoles) and aconitic acid (7.51 g, 43.1 mmoles) were mixed and heated
under stirring until the solubilization of the solid aconitic acid and before adding 2.7 wt.% of
sulfuric acid (relative to alcohol weight). The reaction was then stirred at 100 ◦C during 5h. At the
end of the reaction, 20 mL of ethyl acetate was added to the reaction medium and the organic phase
was washed three times with 10 mL of water. The organic phase was dried with sodium sulfate
before ethyl acetate evaporation.

2.3. Purification of products

2.3.1. Thin layer chromatography (TLC):

The thin layer chromatography was carried out with silica gel 60 F254 plates on aluminum foil
(Merck). The mixture of aconitate esters was dissolved in the eluent composed of cyclohexane /
ethyl acetate (70/30), to which 1% acetic acid is added. The plates were observed under UV lamp
at 254 nm or revealed with a solution of potassium permanganate.
Rf = 0.82 was found for tridodecyl aconitate, higher than other spots corresponding to
monodiesters and diesters.

172
2.3.2. Column chromatography:
Tridodecyl aconitate was separated from monododecyl and didodecyl aconitates on silica gel 60
opened columns (70-200 μm). The aconitates mixture was solubilized in a small amount of ethyl
acetate to be deposited at the top of silica gel. On the basis of TLC analyses, the same eluent was
used. Tridodecyl aconitate was first recovered, followed by the fraction of didodecyl and
monododecyl aconitates.

2.4. Characterization of esters aconitates

2.4.1. NMR analysis

1
H NMR spectra were collected on a Bruker Avance 300 spectrometer with a 5 mm BBFO ATMA
probe. Chemical shifts are reported as parts per million from tetramethylsilane with an absolute
frequency 300.13 MHz.
The compositions of the final reactional media were calculated by 1H NMR integrations.
Integrations of the methyne proton (-CH=C) were used to calculate the molar percentage of esters:
Positions of the methyne proton obtained for spectra in CDCl3:
- monododecyl aconitate: 7.00 ppm, 7.02 ppm (or 7.03 ppm), 7.06 ppm
- didodecyl aconitates: 6.95 ppm (or 6.96 ppm), 7.01 ppm
- tridodecyl aconitates: 6.93 ppm
For instance, the calculation of molar percentage of mono-alkyl aconitate is carried out with the
following formula (I: integration of signals for the methyne proton).

% monododecyl aconitate =
∑ I monoester
∑I monoester + I diester + I triester

Moreover, integrations of the methylene group, CH2 in α- OH position for lauryl (3.583 ppm) and
oleyl alcohol (3.586 ppm) were used to calculate the unreacted percentage of alcohol according to
the formula:

173
 I CH2-OH
% unreacted dodecanol = x 100
I CH2-OH + I CH2COOR

I CH2-COOR: Integration of methylene group in α- COOR position ( esterified alcohol)

I CH2-OH: Integration of methylene group in α- OH position (unreacted alcohol)

2.4.2. Fourier transform infra-red (FTIR) spectra

FTIR spectra of aconitate esters were acquired by using a spectrophotometer coupled with an ATR
accessory (Spectrum100, Perkin-Elmer, USA). Each spectrum is the averaged values of 16 scans
in transmittance mode from 4000 cm−1 to 600 cm−1 at are solution of 4 cm−1. Each spectrum was
baseline corrected and the absorbance was normalized between 0 and 1.
The bands at 1740 cm-1 and 1720 are assigned to C= O stretching of esters, the bands at 1167 cm-
1
corresponds to C−O stretching and the one at 1654 cm-1 is due to C=C stretching.

2.4.3. Determination of surface tensions

Surface tension measurements were performed using a GBX 3S (Surface Science Studies)
tensiometer. A platinum blade (Wilhelmy's blade) whose length is 1.955 cm and a thickness of
0.01 cm (a perimeter of 3.93 cm) was used. Solutions corresponding to critical micellar
concentrations of aconitates were prepared. A mobile sample holder brings the liquid to be
analyzed in contact with the blade which is suspended on a precision scale.

2.5. Aqueous extraction of Ulva lactuca

The aqueous extracts of Ulva lactuca was prepared according to Jiménez et al. (2011). Five grams
of dried algae was placed in a 100 mL flask. A quantity of 100 mL of boiling Milli-Q water was
added. The medium was stirred magnetically for one hour at room temperature. The extract was
then filtered twice through a double layer of sterile muslin cloth and then cooled to room
temperature. After filtration, water was evaporated under vacuum to provide a dry material. The
extracts were stored at 4 º C until analysis.

174
2.6. Emulsification process
To prepare 24 mL of emulsion, 2 mL of aqueous extract of Ulva lactuca obtained with the previous
protocol, were dissolved in 12 mL of water. Then, 2 mL of aconitates were blended with 8 mL of
rapeseed vegetable oil. This lipophilic phase was added to the aqueous phase, before emulsifying
with an Ultra Turax (T25 digital, IKA) for 2 minutes at 18000 rpm. The total content of aconitates
in the emulsion corresponds to 8.3 % (v:v).
The emulsion samples were prepared with the compositions rich in targeted aconitates:
TA/O/W/UL: emulsion including tridodecyl aconitate (TA) and Ulva lactuca aqueous extracts
MDA/O/W/UL: emulsion including mono/didodecyl aconitates (MDA) and Ulva lactuca aqueous
extracts
Emulsions without Ulva lactuca extract were also prepared (in this case 14 mL of water have been
added instead of 12 mL).
TA/O/W: emulsion stabilized by tridodecyl aconitate (TA)
MDA/O/W: emulsion stabilized by monododecyl and didodecyl aconitates (MDA)

2.7. Stability of oil/water emulsion by creaming index

The emulsions stability was assessed by the determination of the creaming index (CI). Freshly prepared

emulsions (20 g) were transferred into transparent glass tubes (27 mm internal diameter, 45 mm height)

sealed by plastic caps. The tubes were kept at room temperature (25°C) for 7 days. The total heights of the

emulsions in the tubes (HT) were noted. The emulsions stability was followed by measuring the height of

the transparent serum layer (HS) formed below the opaque “cream” layer, at regular intervals. The creaming

index (CI) was then calculated with the following formula:

𝐻𝐻
CI (%) = 𝐻𝐻𝑠𝑠 × 100
𝑡𝑡

2.8. Viscosity measurements

A rheometer MCR 302 (Anton Paar) with a cone-plate geometry of 50 mm diameter and 2 ° angle
was used to perform rheological analysis of the emulsions. Experiments were carried out at a

175
temperature of 25 °C regulated with a bath thermostat (Huber). The viscosity and shear stress were
studied by increasing exponentially the shear strain from 0 to 50 s-1 .

2.9. Assessment of in vitro anti-fungal activity of the formulation

2.9.1. Preparation of pathogen inoculum

Protocol was adapted from Nicosia et al. (2016). Fungal isolates of Penicillium digitatum were
obtained from infected oranges and then cultivated on Malt Extract Agar (MEA, Sigma–Aldrich)
in order to obtain single conidia colonies. The variation in colony morphology from one species
to another on a particular medium provides useful characteristics for the identification of isolates.
For inoculum growth, cultures were kept at 22 °C for 7–10 days. Then, individual mold species
with green color were isolated macroscopically. The colony morphology and their appearance
were confirmed under the optical microscope. To prepare the spore solution, spores were collected
using a sterile spatula, diluted in sterile distilled water, and then vortexed for 1 min to ensure
uniform mixing. Spore concentration was fixed to 108 C mL-1 using a densitometer (Biosan DEN-
1B, McFarland densitometer). The obtained stock solution (108 C mL-1) was then diluted to two
solutions; S1= 106 C mL-1 was used for the study of extract effects on spore germination in liquid
medium and on germ tube elongation, and S2= 2x103 C mL-1 was used to study the extract effects
on fungus viability in solid medium.

2.9.2. Fungus viability

In order to evaluate the effects of the new ingredients on pathogen viability, 0.5 mL of solution S2
(2x103 C mL-1) was transferred to Eppendorf tubes containing 0.5 mL of aqueous extracts of Ulva
lactuca and/or 0.5 mL of esters aconitates. Sterile ultrapure water and Nystatin were respectively
used as negative and positive controls. Tubes were gently mixed and then incubated for 20 hours
at 22 °C. Afterwards, the tubes were mixed and 100 μL of each mixture was spread on MEA
culture medium containing ampicillin and streptomycin. Finally, cultures were incubated at 25 °C
and the number of colony-forming units (CFU) was counted after 3–4 days.

The CFU percentage of each tested extract was then calculated by comparing it with water, used
as a negative control.

2.9.3. Spore adhesion test

176
The orange cells were directly taken from a healthy orange by scratching its outer peel. These cells
were then washed in Phosphate Buffer Saline (PBS) (1 mL/tube), centrifuged at 2500 g for 10
minutes, and finally re-suspended in 1 mL PBS for counting. Penicillium digitatumspores were
taken from an infected orange and cultivated on Malt medium for 4 days at room temperature.
Spores were then suspended in PBS. Spores and oranges cells’ concentrations were evaluated
using a densitometer (Biosan DEN-1B, McFarland densitometer). The solutions’ concentration
was estimated at 105 C mL-1 for the orange solution and 107 C mL-1 for Penicillium digitatum.
Then, 1 mL of orange cell suspension was brought into contact with 1 mL of Ulva lactuca aqueous
extracts and/or 1 mL of aconitate esters for 1 h, while stirring at room temperature on a rotary
shaker. After 1 h of incubation, 1 mL of Penicillium digitatum spores was added to the various
mixtures, and the whole mixture was stirred for 2 h at room temperature. After 2 h of incubation,
the preparation was washed 3 times in PBS; for a clean wash, 0.5 mL of PBS solution was added
each time and the mixture was centrifuged at 2500 g for 10 minutes. The aim of these
centrifugations was to eliminate the remaining free spores. With the cells being in suspension, the
test reading was carried out by the examination of fresh pellets reconstituted in 0.1 mL PBS. The
adhesion index is defined as the number of Penicillium digitatum spores fixed per orange cell. An
index greater than 25 is an indicator of a strong adhesion, whereas, for an index of less than 10,
the adhesion is low (Linas, 1986). Ten orange cells were examined in triplicate for each extract
and the averages of adherent cells were calculated.

2.9.4. Spore germination and germ tube elongation

An amount of 12.5 μL of the solution S1 (106 C mL-1) was transferred to Eppendorf tubes, to which
are added 25 μL of Ulva lactuca aqueous extracts and/or 25 μL of aconitates, as well as 12.5 μL
of potato dextrose broth (PDB, Sigma–Aldrich). Sterile ultrapure water and Nystatin were
respectively used as negative and positive controls. The tubes were then mixed and incubated for
20 hours at 22 °C, followed by a vortex in order to affect their homogenization. Afterwards, 2 μL
of spore suspension was transferred to microscope slides, mixed with 2 μL of Lactophenol blue,
and then observed at a magnification of 40 for spore germination and tube elongation. For each
slide, three observations were performed, haphazardly.

177
2.10. in vitro antifungal activity of formulated ingredients

The determination of the antifungal properties of the new ingredients against Penicillium digitatum
was carried out by a Disk diffusion test on Malt Extract agar (Sigma Aldrich), previously
inoculated by flooding with P. digitatum. The microorganisms were grown on malt extract agar
(Sigma Aldrich) plates at 24 °C for 48 hours prior to seeding into malt extract agar (Sigma
Aldrich). One or several colonies of a similar morphology of each P. digitatum were transferred
into the sterile distilled water and adjusted to the 0.5 McFarland turbidity standards (107 C mL-1
suspension). Inoculates of the P. digitatum were seeded on Malt Extract agar. The sterile discs
were impregnated with 25 μL/disc of the formulated ingredients and then dried. The sterile filter
discs, 6.4 mm in diameter, were placed on inoculated agar medium and incubated at 24 °C for 48
hours. Nystatin (100 U/disc) was used as a positive antifungal control. The results were determined
from the presence or absence of growth and the size of the inhibition zone. The diameter (mm) of
the growth inhibition halos caused by the different extracts was measured. All the assays were
carried out in triplicate.

2.11. in vivo protective test using formulated ingredients against P. digitatum infection

To examine whether the emulsions have inhibitory effects against P. digitatum, oranges were
treated with these extracts and then infected with P. digitatum. First, the oranges were dried and
then deposited on plastic plates containing absorbent paper, which was soaked with sterile distilled
water in order to provide a moisture content of 95-100%. Each orange was then pulverized with 4
mL of emulsion or aqueous extract. Three oranges were used for each emulsion. The chemical
fungicide Nystatin was used as a positive control and distilled water as a negative control (Chbani
et al. 2013). Two hours after the pulverization, oranges were infected with P. digitatum by
spreading 10 µL of spore suspension (105 spores/mL suspension) on their surface. The spore
suspension was prepared by scraping the surface of PDA in older cultures incubated for 6 days at
room temperature using a sterile spatula. This suspension was put into a blender with a few drops
of Tween 20 (used as a solubilizing agent for membrane proteins) and then transferred to a spray
device producing very fine droplets. Treated oranges were covered with a transparent film and
stored at room temperature. 5 to 6 days after inoculation, the macroscopic aspects of the oranges
were studied (Jiménez et al. 2011).

178
Statistical analysis

Analyses were done in triplicate using three microscope slides as well as three MEA plates. Data
were statistically analyzed using ordinary one-way ANOVA with multiple comparison analysis;
means were compared to negative control and the criterion of the significance of the treatment was
*
P < 0.05, **P <0.01, ****P < 0.001.

3. Results and discussion

The selectivity of the reaction was discussed according to several experimental parameters. Indeed,
the emulsifiying properties depends on the compositions in aconitates in the final medium.

3.1. Synthesis of mono- and di- alkyl aconitates

To produce preferentially mono- and di-alkyl aconitates, aconitic acid (AcoA) reacted with
dodecanol and oleyl alcohols according to a 2:1 ratio, allowing the solubilization of AcoA when
heating. Moreover, this ratio is a good compromise between AcoA conversion and the content in
mono- and di- alkyl aconitates in the final medium. In table 1, the compositions in esters produced
by the catalyst free reaction are given in relative molar percentages. In table 2, are indicated the
percentages including the unreacted alcohol in the final medium.

3.1.1. Effect of hydrocarbon chain length of alcohol.

The comparison of experiments 1 and 2 (Table 1) showed that the content of mono- and di-esters
was higher for the reaction with dodecanol, compared to oleyl alcohol; It is in agreement with the
higher proportion of unreacted dodecanol compared to oleyl alcohol.

Thus, oleyl alcohol had a slightly better reactivity than dodecanol towards aconitic acid (Table 2).
In fact, for a solvent free reaction, the viscosity of reactional medium has an influence on the
reaction course. The fluidity of oleyl alcohol probably improved the diffusion of aconitic acid in
the medium. The lower reactivity of dodecanol logically limited the conversion of monododecyl
and didocecyl aconitates into tridodecyl aconitate, that was favorable to enrich the medium in these
species.

3.1.2. Effect of time

179
Experiments 1 and 3 (Table 1) showed that an extended reaction time to 3 h tended to improve the
conversion of dodecanol and to increase the proportion of tridodecyl aconitate. Thus, by limiting
the reaction time at 2 h, the highest content of monoester and diester (70.6%) is reached (Table 2).

Table 1: Composition in aconitates after esterification at 170°C with an alcohol: AcoA ratio = 2:1
%
%
Experiments Time alcohol monoester % diester % triester
monoester
and diesters

1 Dodecyl 70,6% 37,9% 32,7% 29,4%

2h
2 Oleyl 63,8 % 34,4 % 29,4 % 36,2 %

3 3h Dodecyl 62,5 % 29,5 % 33,0% 37,5%

After reaction, the contents in unreacted alcohol were evaluated in the media (Table 2).

Table 2: Compositions of the reactional medium after esterification reaction (from NMR data).

Experiments % unreacted alcohol % monoester and diester % triester

1 21,9 % 55,1 % 23,0 %
2 26,7 % 46,7 % 26.5 %
3 26,8 % 45,8 % 27.3 %

The experiment 1 which led to the highest contents of mono- and di-alkyl aconitates (70.6%) was
kept to prepare emulsions.

3.2. Synthesis of tri-alkyl aconitates

The ratio dodecanol: AcoA was increased to enhance trialkyl aconitate formation. The results are
presented in table 3 including relative compositions in esters. In table 4 are also presented the
contents in unreacted alcohol.

3.2.1. Effect of Time

For catalyst free conditions (experiments 4 and 5), the effect of time from 2 to 3 h acted positively
on the production of tridodecyl ester, its proportion in the medium shifting from 66% to 73 %.

3.2.2. Effect of catalyst

180
Homogeneous catalysis requires a lower temperature (100°C) but a longer reaction time (5 h),
compared to catalyst free reaction conditions, to obtain at least 60 % of triester in the final medium.
Experiment 6 shows that after 5 h, it was not possible to reach the percentage of triester obtained
without catalyst (73%).

Table 3: Production of tridodecyl aconitate with dodecanol: AcoA ratio = 3:1 (from NMR data)
Time % % %
Experiments Catalysis Temperature
(h) monoester diester triester
4 - 170°C 2 20.6 % 13.2 % 66,1 %
5 - 170°C 3 0,9 % 25,6 % 73,5%
6 Homogeneous 100°C 5 28% 12% 60 %

The conversion of dodecanol calculated for homogeneous catalyst (exp.6) was lower than for
experiment 4.

Table 4: composition of the final medium after esterification (from NMR data)
% of unreacted %monoester and
Experiments % triester
dodecanol diester
4 34,2 % 22,3 % 43,5 %
5 30,2 % 18,4% 51,3 %
6 45.2 % 21.9 % 32.8 %

The experiment 5 which had the highest content in tridodecyl aconitate (73.5%) was selected to
prepare emulsions.
Finally, dodecyl and oleyl aconitates were easily synthesized through a solvent free reaction,
without adding a catalyst, avoiding thus a purification step. The conditions allow to reach a
selectivity above 70% for the target aconitates, after 2 or 3 hours of reaction.

3.3. Characterization of emulsifying properties

Calculations of lipophilic-hydrophilic balance (HLB) of the different aconitates were performed

with Griffin method using the following formula:

HLB = 20*[(MH/(MH+ML)]

181
with MH et ML being the weights of hydrophilic and lipophilic parts in the molecule

For a mixture of several molecules, we can use: HLB=∑xi * HLBi with xi the molar fraction of the
molecule i in the mixture (Table 8).

Ethoxylated sorbitan monooleate is a marketed surfactant chosen as a standard. It is used as a

hydrophilic emulsifier or as a stabilizing agent for emulsions in the pharmaceutical, cosmetic,
textile or lubricant industries.

Table 8: HLB values according to Griffin method

Monoisoamyl aconitate 14

Monododecyl aconitate 8.5

Didodecyl aconitate 6,1

Tridodecyl aconitate 4.9
Experiment 1 (70.6% mono/didodecyl 6,65
aconitate)
Experiment 4 (66% tridodecyl 5,8
aconitate)
Experiment 5 (73.6% tridodecyl 5.2
aconitate)
Experiment 4 including unreacted 8.6
dodecanol
Experiment 5 including unreacted 7,8
dodecanol
Dodecanol 14

Ethoxylated monooleate sorbitan 16,5

Due to the polar head of carboxylic acid, HLB of monododecyl or didodecyl aconitates are
logically higher than the one of tridodecyl aconitate. HLB of monoalkyl aconitates are the most
adapted to stabilize an oil-in-water emulsion (HLB >8). So, the medium rich in mono/didodecyl
aconitates may be suitable to prepare the targeted emulsion. The possible presence of dodecanol
in the medium tended to increase the HLB which was interesting for the preparation of oil-in-water
emulsions.

The surface tensions of monoesters and diesters of aconitates isolated by silica gel column were
measured at their critical micellar concentration (CMC). The measurements were not performed
with tridodecyl aconitate due to its poor solubility in water.

182
 Table 9: Characterization of emulsifying agents

CMC
Surface tension (mN.m-1) at 25°C ( g. L-1)
Mono/diisoamyl aconitate * 36 31.10-2
Mono/didodecyl aconitates (exp. 5) 22 12.10-2
Ethoxylated monooleate sorbitan 40
5.10-2
(Reference)
* synthesis according to W. Piang-Siong et al.

Table 9 shows that mono/didodedcyl aconitate added to water can lower its surface tension (72
mN.m-1 at 20 °C), as does the standard surfactant. Mono/didodecyl aconitates have the ability to
form micellar, in particular those with a twelve-carbon chain. The structures of mono/didodecyl
aconitates present polar moieties (free aconitic acid groups), which confer amphiphilic structures
to the molecules. This result confirmed that the mixture rich in monododecyl and didodecyl
aconitates had good emulsifying properties

The creaming indexes of emulsions based on new ingredients were measured during 6 days. Oil-
in-water blends stabilized with aconitates were compared with oil-in-water blends including both
aconitates and Ulva lactuca aqueous extracts.

183
 Creaming index (%)
80
15 min
30 min
60
45 min

40 1h
1b
Day 4

20 Day 6

0
/W

l
/W

/U

/U
/O

/W

/W
/O
A

TA

/O
/O
D

A
TA
M

D
M

1c
1a

Figure 1a: Creaming index profiles CI (%) of emulsions stored at room temperature for 6 days. (MDA: mono/dodecyl
aconitates, TA: tridodecyl aconitate, Ul: Ulva lactuca aqueous extract), 1b: Micrograph (x 40) of fresh emulsion with
MDA, 1c; Micrograph (x 40) of fresh emulsion with TA

In agreement with their physico-chemical characteristics, monododecyl and didodecyl aconitates

led to more stable emulsions (lower creaming index) than those stabilized with tridodecyl
aconitate. The fresh emulsion prepared with MDA had a milky aspect due to a thinner dispersion
of oil in the aqueous phase, which is in agreement with the size of oil droplets observed on the
micrographes (Figure 1b and 1c). In any case, creaming index was almost stable during the 6 days
period, which lets enough time to use the emulsion after its on-site preparation. Moreover, the
stability of emulsions was preserved when the Ulva lactuca aqueous extract was used.

3.4. Viscosity of emulsions

The viscosities of emulsions prepared with new ingredients were measured (Table 5). Emulsions
including aconitates had similar viscosity values around 7,6 mPa.s. When emulsions included both
aconitates and Ul. aqueous extracts, their viscosity increased above 15 mPa.s which is interesting
for the product adhesion to fruit peels.

184
 Table 5: Apparent viscosities of emulsions at a shear = 20 s-1

Ingredients in the Mono/didodecyl aconitates Tridodecyl aconitate Exp.1 + Ul Exp.5 + Ul

emulsion from exp. 1 from exp.5 aqueous extract aqueous extract

Viscosity (mPa.s) 7.5 7.7 15;9 19.7

3.5. Effect of formulated ingredients on fungus viability, spore adhesion and germination.

Anti-fungal activities of the new ingredients and their emulsions were tested according to three
approaches: effect on fungus viability, effects on spore adhesion and on spore germination
Penicilium digitatum.

3.5.1. Effects of new ingredients on fungus viability.

After being incubated at 25 °C for 3–4 days, the number of colonies forming units (CFU) was
recorded for the different samples.

Figure 2 showed the results of the antifungal inhibition cultivated on dishes after 4 days incubation.
We observe that Ulva lactuca extract has a CFU = 4, corresponding to anti-fungal properties. The
emulsifier agent (mixture of monododecyl and didodecyl aconitates) inhibited the appearance of
colonies with CFU=1 more than tridodecyl aconitate (CFU=9). In fact, anti-fungal activity for the
synthetized aconitates are in agreement with the application described by Meincke (1949).

The association of the two combined ingredients (Ulva lactuca extract and aconitates) leads to a
strong antifungal activity against Penicillium digitatum as the resulting emulsions exhibits a CFU
value equal to 0. So, the combination of extract and emulsifier allows an effective decrease of
CFU.

185
 Colony Forming Unit (CFU)
50

40

30

20 ****

10
****
**** **** **** ****
0

.
s

.
t
te
in
r

aq
aq
ac
te
e

ita
at
at

ita

tr

l.
l.
st
W

on

ex

s/U
U
on
y
N

e/
s
c
la

te
ou
la

t
ita

ta
y

ue
y
ec

ni
on
ec

aq
od

co
od

ac

la
d

a
d
i

yl
uc
Tr

di

cy
ec
ct
o/

de
od
la
on

do
id
a
M

lv

di
Tr
U

o/
on
M

Figure 2: CFU of fungal pathogen on MEA medium incubated for four days with the new ingredients. each value is
a mean ±SD of triplicate; Values were compared to negative control (water) and the criterion of the significance of
the treatment was *P < 0.05, ****P < 0.001. A) tridodecyl aconitate; B) mono/didodecyl aconitates; C) mixture of tridodecyl
aconitate and Ulva lactuca ; D) mixture of mono/didodecyl aconitates and Ulva lactuca; E) Nystatin; F) Water.

3.5.2. Effects of new ingredients on the adhesion of spores on the epidermal orange cells.

The adhesion of P. digitatum spores to the epidermal cells of oranges has been assessed in the
presence of the new ingredients (Figure 3). PBS was used a negative control (AI=32) and Nystatin
(AI=0,7) was used a positive control. The index of adhesion for the different samples were lower
than 10, which indicates a low spore adhesion according to Linas 1986. In fact, a decrease of spore
adhesion was detected when Ulva lactuca aqueous extract and aconitates were tested separately.
The mixtures of both materials (extract and aconitate) are also efficient to preserve the index
adhesion below 10.

186
 Adhesion Index (AI)

Mono/didodecyl aconitates/Ul. aq. ****

Tridodecyl aconitate/ Ul. aq. ****
Ulva lactuca aqueous extract ****
Mono/didodecyl aconitates ****
Tridodecyl aconitate ****
Nystatin
PBS
10

20

30

40
0

Figure 3: The adhesion index of P. digitatum to the orange’s epidermal cells in the presence of Ulva lactuca extract
and aconitates. each value is a mean ±SD of triplicate; Values were compared to negative control (water) and the
criterion of the significance of the treatment was *P < 0.05, **P <0.01, ****P < 0.001. A) tridodecyl aconitate; B)
mono/didodecyl aconitates; C) mixture of tridodecyl aconitate and Ulva lactuca; D) mixture of mono/didodecyl
aconitates and Ulva lactuca.

3.5.3. Effect of new ingredients on spore germination and germ tube elongation

For the samples including at least one of the new ingredients, inhibition of spore germination
ranged between 78% and 87% compared with water as a negative control (0%) and nystatin as a
fungicidal standard (100%) (Figure 4).

When tested separately, Ulva lactuca aqueous extract and aconitates have shown an activity for
the inhibition of germination of [Link]. A similar activity was observed when the extract was
associated to one of the aconitates,

187
 Inhibition percentange (%) of germination
150

100
**** **** ****
**** ****

50

0
.
s

.
ct
te
ti n
r

aq
aq
te
e

ra
ta
at

ita
ta

l.
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W

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ct
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de
od
la
on

do
id
a
M

lv

di
Tr
U

o/
on
M

Figure 4: Inhibition percentage of the germination of P. digitatum incubated for 20 h at 22 °C in PDB containing the
new ingredients, water as negative control and Nystatin as positive control, each value is a mean ±SD of triplicate;
Values were compared to negative control (water) and the criterion of the significance of the treatment was *P < 0.05,
****P < 0.001. A) tridodecyl aconitate; B) mono/didodecyl aconitates; C) mixture of tridodecyl aconitate and Ulva lactuca aq.
extract; D) mixture of mono/didodecyl aconitates and Ulva lactuca aq. extract; E) Water; F) Nystatin.

3.6. in vitro antifungal activity of new ingredients

Antifungal activities of the new formulations were assayed against one fungal strain Penicillium

digitatumby evaluating the inhibition zone diameter (table 6 and figure 5). A zone diameter above

10 mm corresponds to the limit value defined by Drouhet and Dupont (1976) for the positive

control (Nystatin). First, we can check that the aqueous extract of Ulva lactuca presented a higher

anti-fungal activity than aconitates. The association of both of them led to high inhibition zone

diameters (26-27 mm) similar to the one of Ulva lactuca aqueous extract. When Ul aq. extract was

emulsioned by mono/didodecyl aconitates, the resulting inhibition zone diameter was the highest

(31 mm), meaning that this emulsion helps to increase the antifungal activity of UL aq. extract.

188
Table 6: Antifungal activities around the wells of Ulva lactuca extracts and aconitates (from exp. 1 and 5)
- each value is a mean ±SD of triplicate

Penicilium digitatum Inhibition zone diameter (mm)

Nystatine 25 ± 0.5
Control
Water 0 ± 0.0
Oil / water 8 ± 0.5
Aconitates Tridodecyl aconitate 17 ± 0.2

Mono/didodecyl aconitates 13 ± 0.2

Seaweed Aqueous extracts U. lactuca 26 ± 0.2
Mixture Tridodecyl aconitate / U. lactuca 27.3 ± 0.4
Mono/didodecyl aconitate / U. lactuca 26.5 ± 0.4
Emulsions Tridodecyl aconitate /O/W 11 ± 0.2
Mono/didodecyl aconitates /O/W 28 ± 0.2
Tridodecyl aconitate / O/W/U. lactuca 10 ± 0.3
Mono/didodecyl aconitates /O/W/U. lactuca 31.4 ± 0.3

189
Figure 5: Antifungal activities of new ingredients assessed by the disc diffusion method; A) Oil-in-water; B) Ul.
Aqueous extracts; C) Mono/didodecyl aconitates/O/W; D) Tridodecyl aconitate (exp.5)/O/W; E) Mono/didodecyl
aconitates (exp.1)/O/W/ Ul; F) Tridodecyl aconitate (exp.5)/O/W/Ul.

3.8. in vivo protective test with formulated ingredients against P. digitatum infection

Oranges were infected by the P. digitatum two hours after the pulverization. During 45 days (from
May 20 to July 1, 2019), the treated oranges were daily monitored and the percentages of non-
infected oranges were recorded (figure 6).

Untreated oranges were not infected during four weeks, but reached a rate of infection of 88 %
at the end of the 5th week. A few percent of oranges treated with the only aqueous extract
solution started to be infected during the third week. Oranges treated with an emulsion showed
lower infection rates: at the end of sixth week, 88.9 % of oranges treated with an aconitate based
emulsion remained healthy with a normal external appearance, instead of 83% for the oranges
treated only with the Ulva lactuca extract. Unlike the in-vitro tests, emulsions prepared from
tridocedyl aconitate or from mono/didodecyl aconitates exhibited the same resistance towards
Penicillium digitatum.

100
MDA/O/W/Ul
Percentage of non-infected oranges

TA/O/W/Ul
O/W/Ul
Untreated oranges
50
Nystatin
Ulva lactuca aqueous extract

0
2

6
1

k
k

ee

ee

ee

ee

ee
ee

w
W

Time post-treatement application

Figure 6: Percentage of non-infected oranges treated with the formulated ingredients MDA, Mono/didodecyl
aconitates from experiment 1, TA: tridodecyl aconitate from experiment 5

190
 The action of Ulva lactuca aqueous extract was observed from 4 weeks and a half (intersection
between the black curve and the red curve). The aqueous extract took between two and three
weeks before stabilizing the non-infected rate of oranges. From the fourth week, emulsions with
TA et MDA reduced the infection rate more significantly than aqueous extracts, in particular
with the tridodecyl aconitate based emulsion..

Conclusion:

Overall, this study showed the possibility to formulate an aqueous extract of Ulva lactuca with a
biobased emulsifier, as a new formulation able to substitute to chemical fungicides. The
combination of two ingredients (a natural extract and a biobased emulsifier) within an emulsion
has several advantages; an easier application, a better adherence to orange peels, and a more rapid
drying of the formulation are expected. The emulsions also contain only 8.3% (v:v) of aqueous
extract, thus sparing a large amount of active molecules. Long chain aconitates obtained through
a green route showed interesting emulsifying properties due to their amphiphilic structures. It was
possible to modify the composition in aconitates by tuning the synthesis conditions. In vitro tests
detected anti-fungal activities for both aconitates and Ulva lactuca aqueous extract. Moreover, the
different tests highlighted that the emulsification of Ul. aqueous extract with 8 % (v:v) of aconitates
improved its anti-fungal activity. The resulting emulsions based on natural and biobased
ingredients were thus able to inhibit mycelia growth, and eliminate both spore germination and
spore adhesion of [Link] on citrus fruit. In vivo tests confirmed that aconitates contributed to
an anti-fungal action. Even if the two compositions of aconitates have not exactly the same
emulsifying properties and anti-fungal activities, both of them generated functional and stable
emulsions including the Ulva lactuca extract.

The results of this study provided guidelines for the design of antifungal emulsions based on
natural and biobased ingredients. This finding represents a contribution towards the utilization of
an ecofriendly formulation for controlling postharvest citrus fruit against Penicillium digitatum.

Acknowledgment
This work was funded by the Laboratories mentioned in the partnership. We thank AZM Center
for Biotechnology in Tripoli (Lebanon) for the PhD grant.

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193
 Conclusion générale et perspectives

La prise de conscience des impacts négatifs des traitements chimiques appliqués aux agrumes
ont conduit à la recherche d’une solution alternative pour lutter contre les champignons
responsables de la moisissure des agrumes. La nouvelle approche étudiée porte sur le
développement d’un biopesticide à base d’extraits issus d’une macroalgue verte, l’Ulva lactuca
(laitue de mer) que l’on trouve sur de nombreux territoires côtiers.

Tout d’abord, différents extraits ont été réalisés à partir de l’algue sèche. Trois lots ont été
sélectionnés, un échantillon d’Ulva lactuca collectée sur la côte Libanaise et deux échantillons
d’Ulva lactuca importés de Chine, correspondants à une qualité alimentaire et à une qualité
agricole. La composition des extraits a été étudiée, soit dans leur globalité soit en isolant des
fractions riches en chlorophylles ou en polysaccharides soufrés. Plusieurs solvants verts ont été
privilégiés pour réaliser des macérations et obtenir des fractions de compositions différentes.
L’évaluation de leur activité antifongique in vitro et in vivo a été réalisée en mettant en œuvre
plusieurs méthodologies.

Les extraits aqueux d’algues privilégiés ont été formulés selon deux méthodes :

D’une part la micro-encapsulation permet de préserver l’activité anti-fongique des extraits pendant
le stockage et le transport, avant de les resolubiliser au moment de leur utilisation. D’autre part,
l’incorporation des extraits dans une émulsion huile-dans-eau avait pour objectif de limiter la
consommation en molécules actives et de faciliter l’adhérence de la formulation à la surface des
agrumes.

L’étude des propriétés des extraits d’algues vertes Ulva lactuca ainsi que les formulations obtenues
conduisent aux résultats suivants :

• Tous les extraits inhibent la germination des spores entre 70 et 87%, génèrent une
inhibition totale (CFU=0) de la viabilité de P. digitatum et induisent une faible adhésion
des spores sur les cellules épidermiques (indice d’adhésion (IA) <10). Les extraits et les
fractions isolées (chlorophylles et ulvane) inhibent la croissance de [Link] avec des
efficacités variables par rapport au contrôle (solvant de l’extrait). En effet, les extraits

194
 hydrophiles comme les extraits lipophiles ont des propriétés anti-fongiques qui peuvent
être exploitées pour le développement d’un biopesticide.
• L’activité antifongique in vivo des extraits aqueux d’Ulva lactuca a été évaluée par des
tests à l’échelle laboratoire et l’échelle pilote. Nous avons démontré que la pulvérisation
des extraits aqueux Ulva lactuca réduit de 75 à 80% le nombre d’oranges contaminées par
l’apparition de la moisissure verte des oranges, et ce par rapport au témoin négatif traité à
l’eau, après 45 jours de stockage à température ambiante. L’essai réalisé à plus grande
échelle au centre Safadi pour l’emballage et l’exportation des fruits (Halba, Akkar, Liban)
a montré que 90,5% du nombre d’oranges traitées par les extraits aqueux étaient non
infectées par [Link] après 4 semaines de stockage.
• Les extraits testés (aqueux, éthanolique, et fractions chlorophylles) d’U. lactuca ont induit
une augmentation transitoire des activités enzymatiques de β-1,3 glucanase et de
peroxydase dans les tissus d’oranges, processus qui pourrait être à la base du mécanisme
de défense contre le Penicillium digitatum. La quantification de la protéine pourrait
constituer un outil utile pour la détection de l’activité anti-fongique potentielle d’une
molécule ou d’une fraction extraite.
• L’isolat de protéine de soja s’est avéré le matériau d'enrobage le plus adapté pour préserver
l’activité anti-fongique de l’extrait d’algue verte. De plus, cette matière première, après
dissolution des capsules, semble renforcer l’activité anti-fongique initiale des extraits. La
solubilisation des microparticules d’Ulva lactuca dans l'eau permettra d’obtenir une
solution aqueuse prête à l’emploi ou bien pouvant être utilisée comme base pour la
préparation d’une émulsion.
• Un agent émulsifiant biosourcé a été synthétisé selon un nouveau procédé vert. Des esters
dérivés de l’acide aconitique ont montré leur capacité à stabiliser une émulsion huile-dans-
eau en lien avec les HLB des esters. Des émulsions incorporant 8,3 % d’extrait aqueux et
8 % d’agent émulsifiant ont montré des propriétés anti-fongiques accrues comparées aux
extraits aqueux seuls. Les tests in vitro ont révélé la capacité de ces émulsions pour inhiber
l’apparition des moisissures. Ces résultats peuvent être attribués aux propriétés anti-
fongiques détectées pour les aconitates synthétisés, propriétés jusqu’alors peu connues,
qui renforcent les propriétés de l’extrait aqueux. La présence d’huile végétale agissant en

195
 tant qu’agent filmogène peut également expliquer l’action favorable des émulsions pour
lutter contre l’apparition du P. digitatum.
• La mise au point d’une émulsion associant des ingrédients biosourcés et d’origine
naturelle, est une façon innovante de répondre aux cahiers des charges des biopesticides
pour le traitement post-récolte des agrumes.

Les solutions alternatives que suggèrent les travaux réalisés ont pris en compte différents
paramètres ;
- Les contraintes techniques en termes de propriétés physico-chimiques et
microbiologiques ont conduit à optimiser l’efficacité des molécules fonctionnelles,
- Les impacts environnementaux sont minimisés par des procédés écocompatibles qui
répondent clairement aux principes de la chimie verte,
- Les aspects sanitaires ont été intégrés puisque l’absence de toxicité des ingrédients
utilisés s’appuient sur différentes données disponibles, et des formulations sans
émission de COV ont été privilégiées,
- Les aspects économiques ont été pris en compte tout au long du travail : accent mis
sur les extraits aqueux, coût de l’agent émulsifiant minimisé par une synthèse verte
(sans ajout de tiers solvant, sans catalyseur et sans post-traitement) et une teneur
réduite en molécules actives.
- Le contexte réglementaire auquel nous nous sommes référés permet à ce travail de
répondre aux exigences d’une agriculture durable et d’une industrie agro-alimentaire
générant des produits sains.

En perspective d’une future commercialisation, la compatibilité des formulations avec les

exigences d’un contact alimentaire par une composition de biocontrôle devra être validée.

De plus, il serait intéressant de mettre au point une émulsion incorporant des extraits lipophiles
riches en chlorophylle, de façon à comparer le niveau d’activité anti-fongique atteint par rapport à
l’émulsion basée sur l’extrait aqueux.

Enfin, il est prévu de réaliser une étude de faisabilité pour produire et commercialiser une
formulation aqueuse à base d’algue sur le marché libanais. Ce projet comporterait les étapes
suivantes : sélection de fournisseurs d'algue, préparation des installations de production,

196
production d’échantillons, commercialisation du produit, amélioration continue du produit en se
basant sur des analyses et sur les appréciations des clients.

L’obtention d’une homologation en tant que produit phytopharmaceutique sera nécessaire, avant
d’envisager l’exportation du produit vers d’autres pays.

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213
 Annexe

ANNEXE 1 : Fiche technique des algues sèches Ulva lactuca

importées de Chine

Wholesale Food/Feed Grade Ulva Powder Dried Seaweed Powder/Flakes in Fujian China
Food Ulva Powder

Feed Ulva Powder

214
ANNEXE 2: Protocoles d’analyse
Fatty acid analysis by Gas Chromatography (GC)
The ethyl acetate extracts of Ulva lactuca and Spinacia oleracea were analyzed by an external
calibration method, using a Varian 3900 gas chromatograph equipped with an automatic sample
changer. The capillary column was: Agilent, Select FAME, 50 m × 0.25 mm ×0.25 μm. The
method of chemical derivation is based on transesterification of fatty acids to fatty acid methyl
esters (FAMEs): 20 mg of the sample was diluted with 1 mL of TBME (tert-butyl methyl ether),
and then 100 μL of this solution was added to the vial with 50 μL TMSH (0.5 M methylene chloride
in trimethylsulphonium hydroxide). The helium gas flow rate was 1.2 [Link]-1. The injection of
1 μL of the sample was carried out in Split mode (1/100). The temperature program used was 185
°C for 40 minutes, followed by a gradient of 15 °[Link]-1 up to 250 °C. The temperature of 250 °C
was maintained for 10.68 min. Both the injector and the FID detector were heated to 250 °C.

Total Phenolic Content

Total phenolic contents of the filtrates was determined using Folin Ciocalteu method as follows:
20 µL of filtrates, 10 µL of Folin Ciocalteu reagent and 170 µL of sodium carbonate solution (2.36
%) were added in a 96-well microplate. After 45 min of incubation at 45 °C, the absorbance was
measured at 760 nm with a spectrophotometer (Spectrostar, BMG Labtech). Standard solutions of
gallic acid were used to build the calibration curve. Each sample was analyzed in 4 wells. Results
were expressed as gram of gallic acid equivalent per 100 g of sample dry basis (GAE/100g d.b.)

Soluble Protein analysis

Proteins were quantified by Lowry method (Lowry et al., 1951) using a standard curve of bovine
serum ambumine (BSA) and a lowry kit (Lowry reagent, bovine albumin standard and 2-N Folin-
Ciocalteu reagents) purshased from Thermo Fisher Scientific. A calibration curve was prepared
using a concentration range of bovine standard albumin from 0 to1, 500 μgmL−1. An amount of
0.2 mL of each standard and sample containing the crude protein extract was withdrawn. One
militer of modified Lowry reagent was added to each sample. They were then vortexed and
incubated for exactly 10 min. After incubation, 100μL of Folin -Ciocalteu reagent (1 N) was added
and again vortexed and incubated for 30 min. The blue-colored solution was then measured at 750
nm with a UV-1800 Shimadzu spectrophotometer.

215
ANNEXE 3 : Exemples de chromatogrammes de fractions lipidiques
de l’Ulva lactuca.

Chromatogramme de l'extrait à l'acétate d'éthyle de Chinese Feed powder Ulva lactuca

Chromatogramme de l'extrait à l'acétate d'éthyle Lebanese Ulva lactuca

216
Chromatogramme de l'extrait à l'acétate d'éthyle Chinese Feed powder Ulva lactuca

217
ANNEXE 4: Profil de CCM des extraits acétoniques de l’algue Ulva
lactuca.

Rf = 0.95
β- Carotène

Ulva lactuca
Rf = 0.58 1.2
α-Carotène
1
Rf = 0.42
0.8
Absorbance

Chlorophylle b
Rf = 0.32 0.6
Chlorophylle a 0.4
Rf = 0.25
0.2
Violaxanthin
Rf= 0.14 0
Myxoxanthin 400 450 500 550 600 650 700
wavelength (nm)

Chll a Chll b β-carotene Xanthophyll

218
ANNEXE 5: Composition des sucres dans les ulvanes d’Ulva lactuca

Amount (mg.L-1)

Glucuronic Iduronic
Rhamnose Galactose Glucose Xylose
acid acid

Lebanese Ulva lactuca 19.2 ± 1.1 1.1 ± 0.1 0.5 ± 0.1 2.5 ± 0,3 16.2 ± 0.5 5.1 ± 0.1

Food
Chinese 0.3 ± 0.0 4.1 ± 0.3 1.1± 0.0 1.2 ± 0,1 8.2 ± 0.3 0.4 ± 0.0
powder
Ulva
latuca Feed
0.4 ± 0.0 5.1 ± 0.5 1.5 ± 0.0 0.7 ± 0,1 8.1 ± 0.2 0.2 ± 0.0
powder

Values are expressed as the mean of three measurements ± SD.

219