PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET

DE NUMERATION DES BACTERIES DANS LES

ALIMENTS
 Numération à partir d’un milieu solide : UFC

-Fréquemment réalisée dans des boîtes de Pétri.

-Elle repose sur le principe que toute bactérie vivante
introduite dans la masse ou en surface d’un milieu
gélosé favorable donne en principe naissance après
incubation à une colonie macroscopique.
- Le nombre total de colonies correspond alors au
nombre d’UFC présents dans l’inoculum.
  Technique de numération dans la masse de la gélose

-Les milieux gélosés sont liquéfiés,

-1 ml du liquide dans lequel on veut connaître le nombre de

microorganismes (échantillon/dilution) est introduit au centre de la
boîte de Pétri,

-Couler le milieu dans la boîte de Pétri contenant l’inoculum,

-Mélanger rapidement par agitations circulaire et alternative

horizontales ; éviter les mouvements brusques qui risquent de projeter
le milieu inoculé sur les bords ou même à l’extérieur de la boîte.
  Technique de numération en surface de la gélose

100 à 500 microlitres du milieu à analyser sont déposés à la

surface de la gélose et immédiatement répartis de façon uniforme
à la surface du milieu avec un ensemenceur stérile (râteau).
Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile
Milieux préconisés

 PCA (Plate Count Agar),

 Gélose nutritive, Ces milieux ne conviennent pas pour

les bactéries lactiques (Lactobacillus…..).
 RECHERCHE D’UNE CONTAMINATION D’ORIGINE
FECALE

Dénombrement des coliformes totaux/fécaux

La numération des coliformes peut être effectuée par ensemencement

de 1 ml de produit et /ou de ses dilutions dans 15/20 ml de milieu
gélosé, technique de double couche. Après solidification, la boîte est
incubée retournée 24/48 h à 30/37°C pour les coliformes totaux et
44°C/24 h pour les fécaux.
 Milieux utilisés en colimétries (totaux/Fécaux)

Milieux Solides

-Gélose de base + Lactose + indicateur de pH + inhibiteurs type sels

biliaires.

-Gélose VRBL (Cristal Violet, Rouge neutre, Bile, Lactose).

Colonies pourpres entourées d’un

halo pourpre= bactéries lactose+ =
coliformes
Colonies pâles avec des zones
verdâtres= bactéries lactose-
Pour 1 litre de milieu :
- Peptone pepsique de viande ...........................................................7,0 g
- Extrait autolytique de levure ............................................................3,0 g
- Lactose ..........................................................................................10,0 g
- Sels biliaires.....................................................................................1,5 g
- Chlorure de sodium .........................................................................5,0 g
- Rouge neutre..............................................................................30,0 mg
- -Cristal violet ..................................................................................2,0 mg
- - Agar agar bactériologique..............................................................12,0 g

La présence simultanée de cristal violet et de sels biliaires assure

l’inhibition des bactéries à Gram positif.
- La fermentation du lactose se traduit par une acidification, révélée
par le virage au rouge de l’indicateur pH (rouge neutre), et par la
précipitation d’acides biliaires autour des colonies.
-Gélose lactosée au Désoxycholate (0,1%) : ici la colonie devient
rouge, diamètre 0,5 mm.
2 inhibiteurs des bactéries Gram+ :

Colonies
rouges : bactéries
-le désoxycholate de
lactose+ = coliformes
sodium (sels biliaires)
- le citrate de sodium. Colonies
incolores : bactéries
lactose-

-Les germes lactose positif produisent une

acidification qui, en présence de rouge neutre, se
manifeste par l’apparition de colonies rouges.

-Les germes lactose négatif donnent des colonies

incolores (Salmonella et Shigella).
L’inhibition des microorganismes à Gram positif est essentiellement
due à l’action du désoxycholate de sodium, bien que le citrate de
sodium soit également un inhibiteur efficace.

Désoxycholate de sodium
 L’effet inhibiteur de la température sur la
croissance et le métabolisme des coliformes (non
fécaux) à 44°C implique des composants cellulaires
du métabolisme fermentatif et aérobie du lactose ;
la perméabilité membranaire est très diminuée chez
ces coliformes à 44°C.
 Numération en milieu liquide : UFT

Cette méthode repose sur le fait qu’un inoculum contenant au

minimum 1 germe (UFT) donnera, après introduction dans un
milieu liquide donné, une culture positive. Dans cette technique,
la disponibilité des nutriments pour le microorganisme est
excellente.
Résultat avec des essais multiples (3 tubes par dilution):

Se reporter au table de Mac Grady pour 3 tubes de

dilution afin de trouver le NPP correspondant au nombre
321: le NPP est 15.
Dénombrement des coliformes

La numération des coliformes est réalisée par ensemencement de 1 ml

de l’aliment (ou de sa suspension mère) et de ses dilutions dans un
bouillon lactosé bilé au vert brillant (BLBVB). Les essais sont
effectués en double ou en triple et les résultats analysés par la méthode
de Mac Grady

Après ensemencement, les milieux sont incubés à 30°C pendant 24

h puis 48 h. Sont considérés comme positifs les tubes dans lesquels
il y a croissance et une production notable de gaz.
NB: La numération des coliformes fécaux est effectuée
avec le même milieu mais après 48 heures d’incubation à
44°C.

Test de MacKENZIE

Une öse d’un tube positif est inoculée dans un tube de BLBVB
avec cloche , et une autre dans un tube d’eau peptonée ; si après
incubation à 44°C pendant 48 h il y a production de gaz
(BLBVB) et d’indole (mis en évidence par addition de réactif
de Kovacs dans le tube d’eau peptonée) on peut soupçonner la
présence d’ E. coli.
Milieu BCPL : bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol
(colimétrie de l’eau)

Tubes avec 10 ml de bouillon à double

concentration + 10 ml d’eau à analyser.

Tubes de bouillon normal + 1 ml d’eau à

analyser.

Les tubes positifs (trouble et gaz) peuvent

être soumis au test de MacKENZIE .
 Numération par filtration

Cette méthode consiste à faire passer un certain volume

d’échantillon ou de ses dilutions au travers d’une membrane
filtrante (de 0,45 mm à 0,22 μm) sur laquelle sont retenus les
microorganismes recherchés.
Colimétries par filtration

Il est possible de réaliser la colimétrie par la méthode de numération

après filtration. Il est ainsi possible de réaliser la numération des
coliformes ou des coliformes fécaux.

Les milieux les plus souvent utilisés sont : la gélose lactosée au TTC
(Triphenyl Tetrazolium Chloride) et au tergitol.

Lecture :

-Colonies jaunes/orange: non réductrices,

-Colonies violettes : réduisent le TTC,
-Halo jaune: lactose+,
-Halo bleu/vert: lactose -.
Milieu sélectif chromogène

Le milieu chromogénique sélectif pour dénombrement E. coli et les

autres coliformes dans les produits alimentaire.

Principe:

-Le milieu repose sur la mise en évidence simultanée de deux

enzymes : la Bêta-D-Glucuronidase (GLUC) et la Bêta-D-
Galactosidase (GAL).

-Le milieu contient deux substrats chromogéniques:

Un substrat pour la GAL =coloration bleue des colonies.

Un substrat pour la GLUC= coloration rose.
E. Coli = (GAL+/ GLUC+) = coloration violettes à roses.
Recherche des Salmonella

La mise en évidence des Salmonella par la méthode “traditionnelle”

nécessite plusieurs phases:
- un pré-enrichissement qui est facultatif le milieu de pré-
enrichissement est un bouillon qui va permettre à la bactérie de se
régénérer avant la mise en culture ou l'isolement.

- un enrichissement sélectif ( obligatoire ): augmenter la

représentation (proportion) des microorganismes.

- un isolement sélectif

- une identification biochimique

- un sérotypage
Pré-enrichissement (AFNOR 1973)

Milieu eau peptonée tamponnée

-25 g d’aliment sont broyés dans 225 ml de milieu pendant 2

minutes.

-L’incubation est réalisée pendant 16 - 24 h au plus à 37°C.

Enrichissement

Plusieurs milieux d’enrichissement sont utilisables : milieu de

Rappaport/ Bouillon au sélénite/ MULLER KAUFFMANN au
tétrathionate …
Isolement

A partir d’une öse ou d’une goutte d’un des milieux

d’enrichissement on réalise un isolement sur milieu SS/ Kristensen (
gélose au vert brillant et au rouge de phénol)/ Rambach / Gélose
Hektoen/ sur DCL.

Milieu SS (Salmonella Shigella )

-colonies rouges lactose + (Enterobacter, Klebsiella… ).

-colonies incolores lactose- (Salmonella, Shigella, Serratia,
Proteus morganii).
-colonies à centre orangé (Proteus rettgeri, Providencia ).
-colonies à centre noir (Salmonella, Citrobacter, Proteus vulgaris,
Proteus mirabilis ).
Milieu au vert brillant et au rouge de phénol (Kristensen)

Les Salmonella donnent des colonies rouges (ou roses) entourées

d’une zone rouge.

Milieu DCL

Ce milieu diffère de celui utilisé pour la colimétrie surtout par sa

teneur élevée en désoxycholate. Il inhibe la croissance des germes
Gram+. L’incubation est réalisée à 37°C pendant 24 h.

Sur ce milieu les germes lactose+ donnent des colonies rouges.

Salmonella donne des colonies incolores à blanchâtres (Salmonella
H2S-) avec un centre noir (Salmonella H2S+).
Rambach (un milieu de culture chromogène)

-Colonies rouges : entérobactéries métabolisant le propylène glycol et

ne possédant pas de β-galactosidase.

-Colonies bleues ou bleu-violet : entérobactéries métabolisant

le propylène glycol et possédant une β-galactosidase (coliformes).

-Colonies incolores : entérobactéries ne métabolisant pas le propylène

glycol et ne possédant pas de β-galactosidase. Elles sont constituées de
S. paratyphiA, S. typhi et de la plupart des autres entérobactéries.
Gélose Hektoen

-Colonies jaune saumon: E. coli, Klebsiella, Citrobacter,

Enterobacter, Serratia
-Colonies jaune saumon à centre gris: P. vulgaris
-Colonies vertes à centre noir: P. mirabilis, Salmonella
-Colonies vertes ou bleuâtres: Shigella, Providencia
-Colonies bleues ou brunâtres : Pseudomonas (oxydase positive)
 Identification biochimique

glucose + avec acidification

lactose-
saccharose- La présomption de présence de
Salmonella suffit pour satisfaire aux
H2S+
buts de l’analyse, et cette présomption
uréase- est acquise dès la fin de l’isolement sur
SS ou autre milieu équivalent (la
LDC+
pression de sélection est telle tout au
ß-galactosidase- long de l’analyse que la présence de
colonies lac - H2S + sur ces milieux
indole-
suffit à l’analyste pour conclure à la
VP- présence du germe).
RECHERCHE D’UNE CONTAMINATION D’ORIGINE FECALE

Numération des streptocoques fécaux ( groupe D de

Lancefield)

Les streptocoques fécaux font partie de la flore intestinale de

l’homme et des animaux ; leur nombre varie de 105 à 107 par g
de matière fécale. Ces germes sont par ailleurs abondamment
répandus dans la nature (végétaux etc...) et de ce fait leur
présence dans un aliment n’indiquera pas forcément une
contamination d’origine fécale.
-Parmi les streptocoques du groupe D on rencontre les espèces
suivantes : Streptococcus faecalis, S. faecium et S. durans .
Certains auteurs ont proposé d’inclure les espèces S. bovis,
S. equinus et S. mitus dans le groupe des stretpocoques
fécaux.

-De toutes les bactéries non sporogènes, ces germes sont parmi ceux
qui résistent le mieux à des conditions de milieu défavorables. Ces
germes résistent mieux que les coliformes et E. coli à la
réfrigération, à la congélation, au chauffage et à la salaison.
-De ce fait ces bactéries peuvent se multiplier dans un grand
nombre d’aliments (produits acides, salés, réfrigérés etc..)
qu’elles peuvent ainsi altérer.

-Les streptocoques fécaux sont moins souvent associés aux

germes pathogènes que les coliformes fécaux.

-Leur croissance est faible sur les milieux de culture (colonies

de petit diamètre) ; elle est possible entre 0 et 50°C, entre pH 5
et 9,6, en présence de bile (40 %) et de chlorure de sodium (6,5
%). Ces germes sont micro-aérophiles.
-Après prolifération abondante dans l’aliment, ces germes peuvent
être à l’origine de toxi-infections bénignes.

NB. on tolère en général moins de 103 streptocoques

fécaux par g ou ml d’aliment.

 Numération en milieu liquide

Cette numération se fait en deux étapes :

1) test présomptif
2) test confirmatif
1) test présomptif

- Ce test est effectué par ensemencement d’un milieu de ROTHE.

- Ce milieu contient de l’azide de sodium (NaN3) qui inhibe la

plupart des microorganismes.

- Ce milieu est peu favorable à la croissance des streptocoques

fécaux et la plupart des autres bactéries n’y cultivent pas.

- Le milieu de ROTHE est cependant moins sélectif que le milieu

de LITZKY, ce qui le fait utiliser d’abord , les germes “adaptés”
à l’effet inhibiteur de l’azide étant ensuite à même de s’adapter à
la présence d’éthyl violet.

- Ce milieu permet un enrichissement.

1 ml de la suspension mère (et de ses dilutions) est ensemencé dans
10 ml de milieu. Après 24 h (ou 48 h) d’incubation à 37°C, on
considère comme positif tout tube présentant un trouble. Ces tubes
sont soumis au test confirmatif.

2) test confirmatif

-Le milieu de LITZKY utilisé est le milieu de Rothe additionné

de 0,5 mg d’éthyl violet par litre.

-Ce milieu est ensemencé à partir d’une öse prélevée dans les
milieux de Rothe positifs.
-Après 24 h d’incubation (ou 48 h) à 37°C, on considère comme
positif tout tube présentant un louche bactérien avec parfois
formation d’un culot violet = pastille violette au fond de tube
(dans le cas où il se forme un culot violet , le trouble peut être très
léger).

Pour identifier l’espèce, procéder à un isolement à partir d’une

öse prélevée sur milieu de Litzky sur un milieu de BARNES.
Isolement sélectif des Streptococcus fécaux sur
BEA (bile Esculine Azide).
Enterococcus faecalis sur milieu bile-esculine
  Numération en milieu solide

-Milieu de SLANETZ et BARTLEY (méthode par filtration)

-Les streptocoques fécaux donnent sur ce milieu des petites colonies

rouges ou marron avec ou sans auréole blanche.

-L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance de la majorité

des microorganismes utilisant une chaine respiratoire aérobie.
-Le TTC est un indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit
en formazan insoluble à l’intérieur de la cellule (colonies de
couleur rouge à marron).
-Milieu KF streptocoque

-Avant utilisation ajouter au milieu, 10 ml de chlorure de

triphényltétrazolium à 1 %.

-Les streptocoques fécaux donnent des colonies rouge foncé ou des

colonies à centre rouge ou noir après 24 h d’incubation à 37°C.
 Isolement

-Milieu de BARNES INGRAM

-Milieu D - Coccosel
 RECHERCHE ET NUMERATION DE
Staphylococcus aureus

Enrichissement

-La recherche des staphylocoques coagulase + nécessite parfois un

enrichissement préalable sur des milieux liquides tels que le milieu de
ZEBOVITZ, CHAPMAN liquide, Giolitti-Cantoni.

Milieu de ZEBOVITZ

-Ajouter au milieu 20 ml de tellurite de potassium à 1 %

stérilisé par filtration. Le milieu ensemencé est incubé 24 h
à 37°C.
-Les staphylocoques coagulase+ réduisent le tellurite en
tellure métallique ce qui leur permet d’éliminer la toxicité
du tellurite.

-La concentration élevée en glycine inhibe fortement la

flore secondaire Gram+, le chlorure de lithium, la flore
Gram-.

-Pyruvate, mannitol et glycine favorisent le

développement des staphylocoques coagulase+ en
apportant ainsi une éventuelle atténuation aux inhibiteurs.
Le milieu de CHAPMAN liquide peut aussi être utilisé pour
l’enrichissement des staphylocoques.

-10 ml de milieu ajouter 10 ml de suspension à enrichir

(concentration finale en NaCl 7,5 %). Incuber 24 h à 37°C. Ce
milieu permet l’enrichissement en staphylocoques du fait de sa
teneur très élevée en sel.

-L’utilisation de ces milieux d’enrichissement permet de mettre en

évidence des staphylocoques présents dans un aliment donné en très
petit nombre. La réponse est alors du type présence ou absence dans
x ml de produit analysé.
 Milieu Giolitti-Cantoni

-Le mannitol et le pyruvate de sodium sont des facteurs de

croissance pour les staphylocoques.

-Les bacilles Gram- fermentant le lactose sont inhibés par le chlorure

de lithium et les bacilles Gram+ par le tellurite de potassium.

-L’anaérobiose, créée en recouvrant le milieu de paraffine stérile,

inhibe le développement des microcoques.

-Le bouillon de Giolitti-Cantoni est recommandé pour la recherche

de S. aureus dans les laits en poudre pour bébés et autres aliments.
-Ensemencer 1 g de l’échantillon, (1 ml d’une série de dilutions
décimales) dans le bouillon de Giolitti-Cantoni.

-Le milieu est recouvert avec 2 cm de paraffine fondue stérile

(chauffée à 42–44°C) et incubé à 37°C pendant 48 heures, puis
examiné quotidiennement.

-En l’absence de S. aureus, on n’observe pas de noircissement du

milieu.

-Si un noircissement apparaît au fond des tubes ou dans tout le

milieu, ensemencer le bouillon par stries sur un milieu d’isolement
pour staphylocoques.
 Numération sur milieux liquides

Milieu trypticase - soja

-Ensemencer avec 1 ml de suspension mère ou de ses dilutions

(essais en double ou en triple, méthode de Mac Grady). Incuber 48
h/37°C.

-Transférer une öse de chaque tube positif sur milieu de Baird

Parker.

-Incuber les boîtes 24 h/37°C.

-Identifier la présence de colonies de staphylocoques.

 Numération sur milieux solides

Milieu de CHAPMAN

-Le milieu , réparti à raison de 17 ml par boîte de Pétri , est

ensemencé en surface par 0,1 ml du produit ou des dilutions.

-La boîte est incubée 24 h/37°C. Les colonies de S. aureus sont

rondes, régulières, bombées, opaques et pigmentées en jaune-doré;
elles sont entourées d’un halo jaune correspondant à une acidification
à partir du mannitol (mannitol +).

-S. epidermidis donne des colonies blanches mannitol - .

Milieu de Baird Parker

-Ajouter au milieu régénéré et ramené à 50°C, 50 ml d’une

émulsion de jaune d’oeuf à 50 % en eau physiologique, 3 ml d’une
solution de tellurite de potassium à 3,5 % stérilisées par filtration et
pour éviter la croissance des Proteus , 50 mg de sulfaméthazine.

-Le tellurite inhibe la croissance des germes qui ne peuvent le

réduire en tellure noir.

-La sulfaméthazine inhibe les Proteus et la glycine et le pyruvate

sont des nutriments favorisant la croissance.

-Le chlorure de lithium inhibe les germes Gram -.

-Ensemencer en surface à partir de 0,1 ml de suspension mère ou de
ses dilutions et incuber 24 h/37°C.

-S. aureus donne des colonies noires, brillantes, convexes, de 1,5

mm de diamètre, entourées d’un halo clair (protéolyse) de 2 à 5 mm
de diamètre.

-Des zones opaques peuvent apparaître plus tardivement dans le

halo clair ; elles sont dues à l’activité lipolytique et lécithinolytique
du germe.

Micrococcus : très petites colonies marron sans halo

Bacillus : colonies irrégulières marron foncé
Levures : colonies blanches.
Halo clair de protéolyse des
protéines du jaune d’oeuf

Zone blanche opaque

d’hydrolyse des lécithines du
jaune d’oeuf
 Identification

- Coque Gram + , groupé en amas, catalase positive, oxydase -,

glucose +, immobiles, dépourvus de spores et de capsules....

-Son identification repose surtout sur la recherche de l’activité

coagulase et ADNase (thermonucléase).