Université de BLIDA—1

Faculté de MEDECINE

Département de PHARMACIE

Laboratoire d’hydrologie-bromatologie

5eme année

Analyse microbiologique des eaux de consommation

Dr MERZOUGUI. maitre assistante en Hydrologie-Bromatologie

Année 2020-2021
• Chaque année des milliers de personnes dans le monde perdent leur vie à cause des
maladies liées à l’eau. Selon le rapport de l’organisation mondiale de la santé pas
moins de deux millions de morts et les enfants en constituent le grand nombre.

• L’Algérie traverse depuis quelques années une phase de transition épidémiologique

marquée par la persistance des maladies transmissibles hydriques caractéristiques des
pays en développement et dues à la mauvaise qualité des eaux liée à la pollution
anthropique ou naturelle
1-Maladies infectieuses à transmission hydrique MTH

Définition / Généralités :

L'eau peut être à l'origine de la transmission de maladies infectieuses lorsqu'elle est

contaminée par des agents pathogènes : bactéries, virus, protozoaires et parasites.

La consommation d'une eau contaminée par des porteurs de germes ou des malades ou son
utilisation pour la préparation des aliments ou la toilette, voire son inhalation sous la forme de
vapeur ou d'aérosols peut provoquer une infection.

Ces infections sont communément appelées : maladies à transmission hydrique ( MTH )

• Maladies à déclaration obligatoire

• Sont dites du péril fécal

• Sont à allure épidémique

• Symptomatologie :le plus souvent digestive ( nausées , vomissement )

• De mortalité très élevée dans les pays pauvres notamment pour les enfants en bas âge

2- Facteurs favorisant l’apparition des MTH

• Augmentation de la production de déchets solides et liquides du fait de l’urbanisation

rapide

• Expansion démographique

• Contexte géographique favorable

• Conditions de précarité et de pauvreté

• Absence de conformité du réseau d’assainissement de l’eau potable ( AEP ) favorisée

par une insuffisance des contrôles techniques à toutes les étapes

• Cross connexion entre le réseau d’AEP et le réseau des eaux usées

• Procédés de désinfection de l’eau destinée à la consommation inefficaces (révolus ou

non adaptés )
3- Mesures préventives / correctives :

• Promotion de l’hygiène et de la salubrité publique

• Amélioration des conditions de vie des citoyens : habitat , alimentation en eau potable
, assainissement du milieu )

• Collaboration intersectorielle : secteurs de l’habitat ,de l’hydraulique et de la santé

(rôle du pharmacien hydro-bromatologue )

• Unification et standardisation des méthodes de contrôles

4- Classification des maladies infectieuses à transmission hydrique : MTH

Peuvent être classées en 3 catégories :

I. Maladies d’origine bactérienne

II. Maladies d’origine virale

III. Maladies d’origine parasitaire

Origine bactérienne Origine virale Origine parasitaire

Campylobacteriose Hépatite A et E Ascaridiase

Choléra Dengue et Infestation par le ver de

Dengue Guinée (Dracunculose)
Fièvres typhoïde et
Hémorragique
paratyphoïde Onchocercose (cécité des
Encéphalite rivières)
Leptospirose
japonaise
Paludisme
Trachome
Schistosomiase/bilharziose
Toxines
cyanobactériennes

Légionellose
5-Prélèvement

L’étape de prélèvement et d’échantillonnage : IMPORTANTE !!!

Car : Echantillon correctement prélevé = Fiabilité des résultats

Pour garantir la fiabilité des résultats et interprétations , on doit s’assurer que :

• Echantillon correctement prélevé

• Récipient stérile

• Mode opératoire précis évitant toute contamination

• NB : La surveillance microbiologique des eaux repose sur l’identification et le

dénombrement de micro-organismes cibles, pour la plupart des bactéries

• De nombreuses méthodes microbiologiques de recherche ou de dénombrement des

bactéries ont été développées et sont largement utilisées en routine.

• Pour chaque méthode, le choix du milieu de culture et des conditions d’incubation,

ainsi que la nature de l’échantillon et la qualité du prélèvement ont une influence sur
l’isolement des

bactéries et leur dénombrement

II- méthodes générales de recherche et de dénombrement de bactéries

 Dénombrement après concentration: méthode par filtration sur

membrane.

 Dénombrement direct par numération des colonies après

ensemencement sur une gélose nutritive:

par incorporation en gélose

par étalement en surface

 Méthodes de culture en milieu liquide:

(méthode de détermination du nombre le plus probable).( methode abondonnée) NPP

- 1- Dénombrement après concentration: méthode par filtration sur membrane:
Principe:
- la filtration d’un volume défini d’un échantillon d’eau sur la membrane filtrante, ce
qui permet la concentration des germes avant leur culture sur un milieu spécifié

• Plusieurs modèles d’appareil de filtration sont commercialisés, ils

comprennent les éléments de base suivants :
Technique de filtration :

• Flamber la face supérieure (plaque poreuse) de l’appareil.

• Fermer le robinet du support et mettre en marche la pompe à vide.

• Prélever une membrane stérile en la saisissant par son bord extérieur, avec une pince
flambée et refroidie ; la déposer sur la plaque poreuse.

• placer l’entonnoir -réservoir flambé et refroidi au-dessus de la membrane.

• Agiter soigneusement le flacon d’eau à analyser et verser l’eau, stérilement dans le

réservoir jusqu’à repère (50 ou 100ml).

• Si le contenu de réservoir correspond à la prise d’essai nécessaire, rincer avec de l’eau

stérile (40 à 50 ml) dès la filtration terminée.

Sinon, fermer le robinet à ce moment-là, remplir à nouveau le réservoir avec de l’eau à

analyser, et rincer lorsque tout l’échantillon a été filtré.

• Dès que la membrane parait sèche, fermer le robinet, enlever le réservoir, Prélever la
membrane avec une pince flambée en la saisissant par son extrême bord, et
l’introduire sur le milieu de culture choisi ou lui faire subir le traitement selon la
méthode utilisée.

• Si le volume de l’échantillon est important et sa teneur en matière en suspension est

élevée, la membrane peut être colmatée. Plusieurs membranes devront donc être
successivement utilisées.

Dénombrement sur membrane :

• La membrane après filtration peut être déposée sur

 la surface d’une gélose pour isolement ‘’le plus souvent sélective en vue de la mise
en évidence de germes ou de groupes de germes’’

 un tampon absorbant imprégné de solution nutritive.

Avantages de la méthode :

• Absence de choc thermique

• Différenciation plus aisée des colonies,

• Possibilité de repiquage.

• La filtration permet de séparer les bactéries du milieu

analysé, donc des éventuels inhibiteurs contenus dans ce milieu.

Inconvénients :

• La nécessité d’effectuer des dilutions si le nombre de colonies sur la membrane

dépasse 80 a 100

• La présence abondante de matières insolubles dans l’échantillon filtré peut colmater

les pores faire obstacle au passage des nutriments donner des résultats erronés par
défaut.

Dénombrement direct par numération des colonies après

ensemencement sur une gélose nutritive

• Principe général:

les bactéries maintenues dispersées dans un milieu solide ou à sa surface, donnent naissance,
dans des conditions favorables, à des colonies isolées les unes des autres peuvent être
directement comptées

2-Dénombrement par incorporation en gélose :

Principe

• L’échantillon d’eau à analyser est mélangé au milieu de culture solide préalablement

fondu et refroidi à une T prochende la T de solidification. Après incubation, les
colonies qui se

développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées.

• Fréquemment utilisée pour les bactéries aérobies revivifiables

inconvénient :
 • Le choc thermique: mélange de l’échantillon avec la gélose fondue (45 °C), bactéries
habituées à vivre dans des eaux de température basse.

• la culture par incorporation en gélose n’est pas favorable aux bactéries aérobies
strictes.

3-Dénombrement par étalement en surface

Principe :

• L’échantillon d’eau à analyser est étalé avec ensemenceur stérile du

type pipette râteau à la surface d’un milieu gélosé sans trace d’humidité,

après incubation, les colonies qui se développent à la surface sont

dénombrées.

• ce volume ne peut excéder 0.2 ml une boite de 90 mm de diamètre,

Avantage :

• Ne donne pas lieu à des chocs thermiques.

• Elle est particulièrement favorable pour les germes aérobies stricts.

• Permet une différenciation des colonies orientant le diagnostic et leur repiquage.

4-Dénombrement des germes totaux par épi-fluorescence :

Donne directement le nombre total de germes.

• Rapide (20 à 30 minutes par échantillon)

• Sensible.

• Ne permet pas la différenciation des bactéries selon des critères taxonomiques ou

d’activité métabolique.

• Sa pratique nécessite un technicien expérimenté qui se basera sur la morphologie pour

distinguer les germes des débris.
Principe

La méthode comprend une fixation permettant la conservation, une coloration avec un

composant fluorescent, une filtration sous vide sur une membrane en polycarbonate non
fluorescente, une numération avec un microscope à épi-fluorescence

III- Objectif de l’analyse microbiologique de l’eau

• L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas d’effectuer un inventaire de

toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celles qui sont susceptibles d’être
pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fécale.

• Cette analyse est importante car la qualité bactériologique d’une eau n’est pas un
paramètre stable, mais au contraire sujet à la fluctuation, par pollution accidentelle,
nécessitant des contrôles permanents et représentant la cause la plus fréquente de non
potabilité de l’eau.

Bactéries indicatrices de contamination et d’efficacité de traitement

• Les analyses bactériologiques concernent des germes jouant un rôle

d’indicateurs sans que leur présence constitue nécessairement un risque pour la santé

• le risque d’une contamination par les matières fécales pouvant véhiculer des
microorganismes pathogènes est apprécié par les indicateurs de contamination fécale

• la qualité d’un traitement de désinfection de l’eau vis-à-vis de microorganismes

pathogènes est évaluée par les indicateurs d’efficacité de traitement

A- Coliformes totaux

Le terme de « coliformes » ne correspond pas à une définition microbiologique stricte. Sous

ce terme est regroupé un certain nombre d’espèces bactériennes appartenant à la famille des
Enterobacteriaceae et qui partagent certaines caractéristiques biochimiques.

 Selon l’Organisation internationale de standardisation (ISO).

• Le terme « coliforme » correspond à des organismes en bâtonnets, non sporogènes,

Gram négatifs, oxydase négatifs, facultativement anaérobies, capables de croître
 en présence de sels biliaires ou d’autres agents de surface possédant des activités
inhibitrices de croissance similaires,

• Capables de fermenter le lactose (et le mannitol) avec production d’acide et

d’aldéhyde en 48 heures, à des températures de 35 à 37 °C.

• Le dénombrement de ces organismes à 35-37 °C est souvent désigné sous l’expression

de « dénombrement des coliformes totaux ».

• Les coliformes fécaux se distinguent des coliformes totaux par leur température de
prolifération qui est de 44°

• E. coli présumé: des coliformes thermotolérants qui produisent de l’indole à partir de

tryptophane, à 44 °C. ont les caractères biochimiques propres à cette espèce.

Groupe caractéristiques Genre et / ou espèce

Coliformes totaux - bacilles Gram négatif non sporulés, Escherichia ;Citrobacter

oxydase-aéro-anaérobie facultatifs ;Enterobacter

- se développent en présence de sels Klebsiella ;Yersinia ;Serratia

biliaires ou d’autres agents de
surface équivalents

- fermentent le lactose (et le mannitol)

avec production d’acide et
d’aldéhyde en 48h, à une
température de 35 à 37°C
Coliformes fécaux - Ils ont les mêmes propriétés que les Citrobacer freundii
ou thermo précédentes ;Citrobacer diversus
tolérants
- Ils sont capables de se développer à Citrobacer amalonaticus
44°C ;Enterobacter aerogenes

Enterobacter cloacae
;Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae
;Klebsiella oxytoca

Moellerella wisconsensis

Salmonella (sous genre III

Arizona), Yersinia
enterocolitica

Streptocoques Possèdent la substance (acide teichoique) Enterococcus faecalis

fécaux et antigène caractéristique du groupe D de ;Enterococcus faecium
enterococcus Lance Field
Enterococcus durans
Cocci Gram positif aérobies oxydase - ;Enterococcus hirae

chimiotropismes, mésophiles Streptococcus bovis

;Streptococcus suis

Streptococcus aquinus
Groupe Caractéristiques Genre Et / Ou Espèce

Bactéries Sulfito- Anaérobies Sulfitoréductrices, Genre : Clostridium Telle Que :

réductrices
Bacille Ou Cocci Gram + Sporulés Clostridium Perfringens
;Clostridium Bifermentans

Clostridium Sporogenes
;Clostridium Fallax

Bactéries Aérobies Aérobies Mésophiles

Revivifiables Ou
Peuvent Se Développer Dans Les
Germes Totaux Ou
Conditions Aérobies Habituelles De
Flore Totale
Culture
-
A Une Température Comprise
Entre 25 Et 40°C

Intérêt hygiénique de la recherche des coliformes dans une eau :

 Les coliformes totaux sont principalement utiles comme indicateurs de l’efficacité du

traitement, de l’intégrité du réseau de distribution ainsi comme indicateurs de la
recroissance bactérienne après traitement.

 Par ailleurs, leur résistance aux agents antiseptiques, et notamment au chlore et ses
dérivés, est voisine de la résistance des bactéries

pathogènes vis-à-vis desquelles ce type de traitement est instauré .

1- La recherche et le dénombrement de l’ensemble des coliformes, sans préjuger de leur
appartenance taxonomique et de leur origine. Cet examen, capital pour la vérification de
l’efficacité d’un traitement désinfectant, est d’un intérêt plus nuancé pour déceler une
contamination d’origine fécale.

2- La recherche et le dénombrement des coliformes fécaux, examen sans base taxonomique,

mais proposé en raison d’une concordance statistique entre leur présence et l’existence d’une
contamination fécale quasi certaine.

3- La recherche et le dénombrement des seuls Escherichia coli.

Ces deux derniers examens sont, au contraire, essentiels dans le diagnostic d’une
contamination fécale.

A- Dénombrement des coliformes

Méthode de dénombrement par filtration sur membrane

Principe

 Après filtration de l’eau à analyser, la membrane est déposée sur un milieu gélosé
approprié.

 Ceci permet aux colonies de coliformes de se développer préférentiellement au cours

d’une incubation de 18 à 24 heures sous un aspect suffisamment caractéristique pour
permettre un diagnostic présomptif. Celui-ci peut être d’ailleurs confirmé par des
repiquages .

Choix des prises d’essai :

La plupart des réglementations concernant les eaux destinées

à l’alimentation humaine exigent l’absence de coliformes dans

100 ml

donc PE= 100 ml.

 • V=100 ml pour l’eau potable, eau de puits et de piscine.

• V=250 ml pour les eaux minérales et eau de sources.

• V=25 ml pour les eaux de mer (eaux trop chargées)

Pour des eaux polluées il faut procéder à des dilutions

• Filtrer dans deux membranes différentes, 2 prises d’essai de l’eau à analyser.

• Placer chacune des deux membranes sur une boite de gélose lactosée au TTC et
Tergitol.

• Mettre ces boites à incuber durant 24 heures l’une à 37 °C, l’autre à 44°C.

• La lecture des boites permet de reconnaître la présence de coliformes par les

caractéristiques suivantes :

• - Coloration jaune, orange ou rouge brique (mais non violette) des colonies, résultant
de l’absence de réduction du TTC par les coliformes, en général,

• les E. coli provoquent une coloration nettement orangée ; les Klebsiella une coloration
jaunes

En certaines circonstances, il est

100 ml d’eau 100 ml d’eau possible de se contenter de
compter les colonies
correspondantes, d’après leurs
Filtration
aspects, aux coliformes ; il est
toutefois recommandé de pratiquer
Membrane 1 Membrane 2 des tests simples confirmatifs.

2 Géloses lactosées au TTC et tergitol

Incubation Incubation

24 h, à 37 °C 24 h, à 44 °C

Lecture : coloration jaune, orange ou rouge brique

Méthode simplifiée pour le dénombrement des Escherichia coli

L’échantillon d’eau à analyser est ensemencé dans un milieu gélosé contenant un substrat
chromogène ou fluorogène. Après incubation en milieu anaérobie, les colonies
caractéristiques

révélées par la présence de la Β glucuronidase sont dénombrées et permettent de calculer le

nombre d’E.Coli par ml d’eau.

2- Dénombrement des streptocoques fécaux et Enterococcus

Définition : On entend par entérocoques intestinaux des bactéries:
1. Cocci à Gram (+) formant des chaînettes
2. Catalase (-)
3. (X) en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant
des colonies caractéristiques réduisant le TTC
4. Hydrolysent l’esculine en 2 heures à 44°C après repiquage sur BEA

- Méthode par filtration sur membrane

Principe : Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des
entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » de la classification de Lance Field,
ou encore Streptocoques fécaux dans les eaux, par filtration sur membrane.
Mode opératoire : La recherche d’entérocoques intestinaux par filtration se déroule selon les
mêmes étapes décrites précédemment
• Milieu utilisé: Gélose SLANETZ et BARTLEY.
• Incubation: à 36 ± 2°C pendant 44 ± 4 heures.
Lecture des boites :
Les colonies caractéristiques sont lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées
en rouge, marron ou rose.
• Transférer la membrane du milieu de Slanetz et Bartley sur (BEA) préalablement
préchauffée à 44°C puis incuber à 44°C pendant 2 heures.
• Les colonies prennent alors une coloration noire traduisant ainsi l’hydrolyse de
l’esculine.
• Compter le nombre de colonies et le rapporter au volume d’eau filtré (100ml-250ml).
Expression des résultats
Les résultats du dénombrement de streptocoques fécaux sont exprimés en nombre de germes
par 100 ml.
3- Recherche et dénombrement des bactéries sulfito-réductrices et de leurs spores :
Définition : Les ASR sont :
 Des BGP
 (x) à 36 ± 2°C en 24 à 48 heures en gélose profonde de type TSC ou TSN ou
encore VF et donnent des colonies caractéristiques blanche entourées d’une
auréole noire.
 La présence d’ASR dans les eaux, constitue un véritable indice de contamination
ancienne.

Interet :
• Ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale : Clostridium
perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe
assez ubiquiste.
• L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans leur propriété de sporuler,
ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection.
 • Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des
traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.

Méthode par incorporation en gélose

Principe
• Transférer environ 20 ml dans un tube stérile ;

• chauffage à 75°C pendant 15 minutes, pour détruire toutes les formes végétatives.

refroidir immédiatement le flacon destiné à l’analyse, sous l’eau de robinet.

• Répartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes différents et stériles, à raison de 5

ml par tube.

• Ajouter environ 18 à 20 ml gélose Viande Foie, fondue puis refroidie à 47  1°C,

• Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en évitant d’introduire des bulles d’air.

• Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber à :

 36  2°C, pendant 44  4 heures, dans le cas de la gélose Viande Foie.

 La première lecture doit absolument être faite à 16 heures car très souvent les spores
des bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont envahissantes.

**** des dilutions décimales de 10 -1 voire 10-2, sont nécessaire dans ce cas.

 la deuxième lecture se fera à 24 heures et la troisième et dernière à 44  4 heures.

 Dénombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamètre, ayant poussée en masse et

rapporter le nombre total des colonies dans les quatre tubes à 20 ml d’eau à analyser.
III- BACTERIES PATHOGENES
1- Recherche des Salmonella
Principe
La recherche dans l’eau doit inclure une phase de pré enrichissement, de sélection puis
confirmation.
 D’une part leur présence en nombre relativement faible dans les eaux ainsi que leur
difficulté à y survivre
 D’autre part l’existence habituelle d’un nombre important de germes
d’accompagnement d’origine fécale (coliformes) ou non (Pseudomonas)
Ces constatations obligent l’utilisation des milieux d’enrichissement sélectifs, dans le but
d’inhiber le développement des autres bactéries.

Dans les eaux usées la prise d’essai est inférieure à 1 litre. Pour une eau de surface, le volume
nécessaire devrait être1 à 5 litres et pour une eau destinée à l’alimentation il est de 5 litres. Si
le volume d’échantillon à analyser au laboratoire est grand, procéder à une concentration de
germes (filtration sur membrane pour les eaux claires et la centrifugation pour les eaux usées)
La recherche des Salmonella comporte plusieurs étapes :
- Pré enrichissement : ensemencement d’un milieu liquide non sélectif avec l’échantillon à
analyser, puis incubation à 37 °C
- Enrichissement : ensemencement des deux milieux sélectifs solides à partir des bouillons
d’enrichissement par incubation à 37 °C
- Identification des colonies présumées à l’aide de tests biochimiques ou sérologiques.

Recherche des salmonelles par la méthode de filtration en milieu liquide :

Principe : Cette méthode consiste en la recherche et l’identification des Salmonella présentes
dans les eaux par filtration.
Définition : les Salmonelles sont:
 Des BGN
 (x) à la température de 36 en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies,
lisses à contours réguliers, pigmentés en vert ou en bleu vert à centre noir.
• Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoïdiques (Hautement
pathogènes) et les non typhoïdiques.
Mode opératoire :
Filtration : 250 ml, 500 ml
Enrichissement primaire : placer la membrane dans un flacon contenant du SFM DC additionné
de 10 disques d’oxydase. Incuber ce dernier à 36 °C pdt 48h. Enrichissement secondaire en
transférant 1 ml de l’enrichissement primaire sur le milieu SFM 2 simple concentration Incuber
ce dernier à 37°C pdt 24h.
1er Isolement sur milieu Hektoen 1 et incuber à 37°C pdt 24h.
Repérer les colonies caractéristiques.
Identification biochimique sur ONPG, TSI, Urée/Indole
Identification antigénique par agglutination sur sérums de groupe OMA et OMB
Enrichissement tertiaire : en transférant 1 ml de l’enrichissement secondaire sur le milieu SFM
3 SC Incuber ce dernier à 37°C pdt 24h.
2éme isolement sur milieu Hektoen 2 à incuber à 37pdt 24h.
Repérer les colonies caractéristiques.
Interprétation des résultats obtenus :
Formuler la réponse : présence ou absence de Salmonella dans PE (ml)
JOUR1
Eau à analyser
500ml
3 SFM D/C 3SFM D/C 3 SFM S/C
50ml 10ml 1ml
Incubation à 37°C pdt 24h
Si ces milieux virent au rose : culture des bactéries.
JOUR2 :
Flacon positif
Hecktoen 1 SFM (tube) S/C 2
Incubation à 37°C pdt 24h
Repérer les colonies caractéristiques.
Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée –Indole et
Identification antigénique basée sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB
JOUR3 : SFM S/C
Hecktoen 2 SFM (tube) S/C 2
Incubation à 37°C pdt 24h
2- Recherche des staphylocoques pathogènes
Principe : La recherche et le dénombrement des Staphylocoques à coagulase + (S.aureus) dans
les eaux par filtration sur membrane : méthode de référence, surtout dans les eaux de baignade
(les eaux de piscine)
Définition : Staphylocoques à coagulase (+):
• Cocci à Gram (+)
• Isolées ou en grappes de raisin
• Catalase (+) et coagulase (+)
• (x) en 24 à 48 h à 37 °C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol.
• L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus (pathogène)
Principe
Après concentration des échantillons après filtration sur membrane de cellulose à 0.45 µm,
celle-ci est déposée sur un milieu sélectif pour bactéries tolérant des hautes concentrations en
NaCl (milieu Chapman au mannitol). Les colonies présentant l’aspect de Staphylococcus
aureus sont soumises aux essais de pathogénicité : coagulase, désoxyribonucléase et
phosphatase.
Mode opératoire
o Filtration
o Milieu utilisé: Chapman (au mannitol).
o Incubation à 37° C pendant 48 heures
Lecture et interprétation :
Les Staphylocoques à coagulase + (S. aureus), apparaissent sous forme de petites colonies lisses
légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées en jaune ou en blanc.
Prendre 3 à 5 colonies au hasard, une servira au test à la catalase, l’autre sera triturer dans un
tube contenant du bouillon BHIB, et incuber à 37°C pendant 24H
Test à la catalase :
Placer deux gouttes d’une solution de peroxyde d’hydrogène sur une lame de microscope.
Prélever une colonie avec une pipette Pasteur et l’émulsionner dans une des deux gouttes.
Observer immédiatement et après 5 mn s’il y a apparition (catalase +) ou absence (catalase -)
de bulles d’O2. Les observations peuvent se faire macroscopiquement ou à l’aide d’un
microscope à faible grossissement.
Test à la coagulase :
Après incubation du bouillon BHIB, ajouter 0,1 ml de cette culture à 0,3 ml de plasma de lapin
contenu dans un tube à hémolyse, et incuber de nouveau à 37°C pendant 2 à 6 heures.
Examiner la coagulation du plasma de lapin. Coagulase + quand le coagulum occupe + 3/4 du
volume initialement occupé par le liquide.
Staphylocoque aureus
Catalase +
Coagulase +
Mannitol en anaérobie +

Résistance à la Novobiocine S

Conclusion : présence ou absence de Staphylococcus aureus. En cas de nécessité une

identification sur galerie API permettra la détermination de l’espèce.
3- Recherche du vibrion cholérique
Principe
Cette méthode consiste en la recherche et l’identification des Vibrionacae présents dans les
eaux, en milieu liquide.
Définition : Les Vibrionacae sont :
 BGN droits ou incurvés
 Très mobiles
 Ox (+)
 Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S
• Hautement pathogènes
Mode opératoire
L’enrichissement primaire s’effectue dans un flacon contenant 50ml d’EPA 10 fois concentrée,
auquel on ajoute aseptiquement 450 ml d’eau à analyser.
Incubé à 37°C pendant 24 heures.
Après incubation, le flacon constituant l’enrichissement primaire fera l’objet :
• d’un enrichissement secondaire sur milieu EPA en tube (1ml)
• d’un isolement sur gélose GNAB 1
Dans les deux cas, l’incubation se fera à 37°C pendant 24 heures.
Le tube d’EPA fera l’objet d’un isolement sur GNAB 2 (37°C pdt 24 h)
La boite de GNAB1 subira une lecture: les Vibrions se présentent sous forme de grosses
colonies lisses, plates, transparentes et très caractéristiques.
Cinq colonies caractéristiques subiront une identification morphologique et biochimique:
• État frais (bacilles, mobilité)
• Coloration de Gram (BGN)
• Oxydase (+)
• Ensemencement d’un tube de KIA (37°C pdt 24H)
• Ensemencement d’un tube de GN inclinée (37°C pdt 24H) et qui servira à
l’agglutination sur lame.
Agglutination sur lame :
 Si l'agglutination avec l'eau physiologique et le sérum polyvalent O1 est -, faire une
mini-galerie biochimique basée sur l'étude des aa en vue de différencier les Vibrions,
 des Pleisiomonas et des Aéromonas. S'il s'agit du genre Vibrio, répondre : V.cholerae
gpe nonO1 anciennement NAG
LDC ODC ADH
Vibrions + + -
Aéromonas - - +
Pleisiomonas + + +
 Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au sérum polyvalent O1 est +, il s'agit d'un
vibrion rough (auto agglutinable) et très pathogènes.
 Si l'agglutination avec l'eau physiologique est négative et positive au sérum polyvalent
O1, répondre : Vibrion cholérique.

- Recherche et dénombrement de Pseudomonas aéroginosa :

Cette méthode de référence, consiste en la recherche Pseudomonas aeruginosa dans les eaux
destinées à la consommation humaine, par filtration sur membrane.
Définition : Pseudomonas aeruginosa est:
• Un BGN
• Oxydase (+)
• Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide.
• C’est une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques
Diagnostic présomptif : Après filtration de l’échantillon (eau de piscine 100ml, eau thermale
250 ml). Déposer la membrane à la surface d’une gélose à la cétrimide et à l’acide nalidixique.
Incuber à 37 °C pdt 48H
Les colonies de Pseudomonas aeruginosa ont un diamètre de 2 mm, un contour circulaire, une
surface lisse et brillante, une couleur blanc crème, un aspect muqueux et sont accompagnées
d’une production de pigment bleu-vert: fluorescence sous UV.

IV-INTERPRETATION DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU

Micro-organisme Unité Valeur Remarques

indicative
A/avec adduction : -Turbidité<1UNT
1/Eau traitée prélevée à -Pour la désinfection au chlore le
l’entrée du réseau : pH doit être <8
-Coliformes fécaux 0 -Le chlore libre résiduel 0.2 à
-Coliformes totaux 0 0.5mg/l après 30 mn de contact

2/Eau non traitée à Dans 98% des échantillons/an

l’entrée de réseau Pour les gros débits
coliformes fécaux Nombre/100ml 0 Pour échantillons prélevés en
coliformes Nombre/100ml 3 nombre suffisant.
3/Eau prélevée dans le 0 Occasionnellement, mais jamais
réseau 0 pour des prélèvements consécutifs
coliformes fécaux Nombre/100ml
coliformes Nombre/100ml
B/sans adduction 0 Dans 95% des échantillons
coliformes fécaux Nombre/100ml 10 examinés/an
coliformes Nombre/100ml Pour les gros débits
 Pour les échantillons prélevés en
nombre suffisant.
C/eau de boisson en -Occasionnellement
bouteille : -Jamais pour des prélèvements
coliformes fécaux Nombre/100ml 0 consécutifs
coliformes Nombre/100ml 0 -Ne doit pas se reproduire
entérovirus - Non fixée fréquemment :sicette valeur
s’observe fréquemment et que
l’assainissement s’avère
impossible, changer de source. La
source doit être exempte de
contamination fécale
Selon journal officiel algerien 2009- et 2014