Ronéoficheur 

: Alix Dejeger
Ronéolecteur : Sam Dewerpe

PIR : Clonage et ARN interférence : applications en santé

CLONAGE
Définition insérer un ou des fragment(s) d’intérêt dans l’ADN génomique purifié d’un élément
génétique autoréplicatif (virus ou plasmide).
But grand nombre de copies absolument pures d’une séquence donnée d’ADN.

Sélection d’un clone bactérien recombinant (vecteur + ADN) parmi un ensemble de clones
bactériens (banque ou «Library»).

PRINCIPE DU CLONAGE

INSERT

- Fragment d’ADN à insérer dans le vecteur

• ADN génomique (séquençage complet d’un génome)
• Séquence d’intérêt dans l’ADN génomique
• Produit PCR
• ADNc après transcription inverse des ARNm

- Obtention à partir d’une digestion enzymatique:

- enzymes de restriction

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- sauf pour insertion « ADNc entier »

- Extrêmités de l’insert générées par l’enzyme de restriction compatibles avec celles du vecteur
VECTEUR: propriétés

- réplication active dans la cellule hôte indépendamment de l’ADN de la cellule hôte (de manière
épisomale): origine de réplication
- taille compatible avec insertion de grands fragments et manipulation aisée des recombinants
- sélection des cellules qui l’ont incorporé: marqueur de sélection
- stable dans l’hôte
- sites uniques de coupure par les enzymes de restriction
- sites multiples de clonage: « polylinker »

CHOIX DU VECTEUR

Taille maximum
approximative du
fragment d’ADN qui
peut être cloné dans
chaque vecteur

On peut également utiliser des virus: ex. lentivirus (thérapie génique)

PLASMIDES

ADN circulaires extrachromosomiques (< 3Kb), réplication indépendante dans les bactéries; insert
de 0.2 à 4kb (10 max)

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Vecteurs de clonage : les plasmides

2 marqueurs de sélection :
• Gène de résistance à l’Ampicilline : donne des cellules résistantes, permet des
sélectionner les cellules qui ont bien intégré le plasmide
• Gène LacZ (qui contient le site Polylinker)

CHOIX DE LA CELLULE HÔTE

Le choix de l’hôte dépend principalement du vecteur utilisé.
Il existe deux grandes catégories:
1. Les hôtes bactériens
- Avantages: multiplication rapide, faciles à manier, peu coûteux
- E Coli = la plus utilisée (bactéries non pathogènes)
intérêt des souches res(-): restriction négative
et recA(-): pour éviter phénomène de recombinaison
2. Les hôtes eucaryotes
- Cellules de Mammifères, levures, plantes…
- Intérêt pour la production de protéines devant subir des modifications post-traductionnelles (ex.
glycosylations) non réalisées par les
bactéries.
- Possibilité d’utiliser des « vecteurs
navettes »: passage entre système
procaryote et eucaryote

Principales étapes pour la réalisation d’un

clonage

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Étapes de la réalisation d’un clonage : (issu de la fiche ms pour explication +++)

a
• Préparation du fragment d’ADN à cloner :
- Pour un fragment d’ADN génomique : digestion enzymatique totale ou ménagée
- Pour un ADNc : transcription inverse à partir d’ADN + clivage de l’extrémité pour obtenir un ADN
linéaire double brin qui va être ligué à des amorces qui contiennent des sites de restriction (pour
obtenir des extrémités cohésives)

b
• Préparation du vecteur :
- Coupure du vecteur par la même enzyme que l’ADN → obtention d’extrémités compatibles
- Pour un plasmide, pour éviter qu’il se referme, on va déphosphoryler ses extrémités ouvertes
(alors que les extrémités de l’insert ne sont pas déphosphorylées)

c
• Réalisation de l’ADN recombinant : insert + vecteur
- Liaison des séquences de l’insert à celles du vecteurs avec une ligase qui va reconstituer la
liaison phosphodiester (sur un des deux brins)
- On obtient alors un vecteur recombinant avec la séquence d’ADN intégrée.

Transformation des bactéries : transfert du vecteur recombinant dans une bactérie ou une cellule
eucaryote, souvent par choc thermique ou choc électrique ou lipofection (complexe lipidique
cationique
qui va faire entrer le vecteur dans la bactérie)

e
• Sélection des bactéries :
- On a obtenu trois types de bactéries : des bactéries vides, des bactéries avec un plasmide vide
et des bactéries avec un vecteur recombinant. On va éliminer les bactéries vides par un traitement
antibiotique (ATB).

• Pour différencier les deux autres types de bactéries obtenus, on va utiliser le gène LacZ : ce
gène va coder des β galactosidases capables de cliver des sucres pour permettre à la bactérie de
survivre et de se multiplier. Ce système ne va fonctionner que dans un système pauvre en
glucose. On a alors deux cas :
- Dans les bactéries à plasmide vide : il n’y a pas d’insert donc le gène LacZ est intact est va
fonctionner.
Sa réaction va donner un coloration bleue aux cellules.
- Dans les bactéries à plasmide recombinant : ici la séquence du gène est interrompue par l’insert
donc il

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ne va pas fonctionner et la cellule va rester blanche.

f
• Criblage de la banque : identification des clones positifs
- À partir d’une boite de culture, on va réaliser un transfert sur une membrane en miroir par rapport
à la boite. On va alors lyser les cellules et dénaturer leur ADN. Avec une sonde radioactive, on va
hybrider une séquence complémentaire d’intérêt.
- On peut également réaliser un criblage grâce à un anticorps en utilisant un vecteur d’expression
(permet l’expression de la séquence protéique à partir de l’ADNc exprimée dans le vecteur). On y
a donc inséré la séquence d’ADNc, des séquences de restrictions différentes de part et d’autre et
un promoteur. En théorie, un clone sur 3 traduira la protéine (lorsque la bonne phase de lecture
sera détectée). On peut alors utiliser des anticorps à hybrider aux clones qui produiront la protéine.

Transformation des bactéries

1. Obtention des bactéries recombinantes : L’ADN recombinant est introduit dans les bactéries
traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique (électroporation)
ou par lipofection (complexe lipidique cationique = liposomes )

2. Sélection des bactéries :

Bactéries + plasmide (gène de résistance aux ATB)
Bactéries + plasmide recombinant
Bactéries vides =>
élimination par ATB

Sélection des bactéries :

système « opéron lactose
»

Vecteurs d’expression :
• Permettent l’obtention de protéines à partir d’ADNc cloné dans un vecteur.
• De nombreuses applications sont possible en biologie et en médecine :

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- Gène rapporteur : mesure de l’activité fonctionnelle d’un promoteur (cf cours régulation de
l’expression des gènes)
- Analyse structurale et fonctionnelle d’une protéine
- Production de protéine recombinante (comme l’insuline, plus efficace que l’insuline extraite de
pancréas animaux)
- Production d’anticorps et de vaccins

Identification des clones positifs par un anticorps

- pour les banques ADNc
- requiert l’utilisation de vecteurs d’expression

- utilisation préférentielle d’ADNc «orientés» qui s’insèreront dans le «bon sens» en aval du
promoteur situé dans le vecteur
- en théorie : seul un clone sur 3 traduira la protéine dans la bonne phase de lecture et sera
détecté (codon d’initiation apporté par l’insert)

Vecteurs d’expression: systèmes de contrôles

• Différents types de promoteurs :
- niveau d’expression: promoteurs forts viraux (ex. HSV-TK)
- sélectivité tissulaire (ou cellulaire): thérapie génique ++
(ex. MCK muscle creatinine kinase dans les myoblastes, PEPCK
phosphoénolpyruvate kinase dans les hépatocytes, SPA surfactant protein A dans les
cellules épithéliales pulmonaires)

• Système d’expression inductible :

contrôle temporel de l’expression du gène : modulation de la production de la protéine
ex. arrêt ou activation d’une protéine thérapeutique
Système « Tet-off » et « Tet-on » : répresseur bactérien contrôlé par la tétracycline => expression
conditionnelle

Le système bactérien Opéron tétracycline (tet)

Interaction entre une protéine répresseur codée par l’opéron, tetR, et une séquence d’ADN,
l’opérateur tetO qui agit en bloquant l’activité du promoteur du gène situé en aval

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1- en l’absence d’activateur: inhibition de la transcription du gène

2- en présence d’un inducteur (tet=tétracycline): activation de la transcription

On peut remplacer le gène de résistance aux tet par un gène d’intérêt!

Limites d’utilisation:
- nécessité d’ajouter en permanence la tétracycline dans le milieu pour maintenir l’activation du
gène
- nécessité d’avoir tetR en concentrations élevées pour exercer son effet répresseur (compétition
avec les facteurs de transcription endogènes)

Tranfection transitoire/stable des cellules eucaryotes

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Applications médicales du clonage

o Production de médicaments: ex. insuline
o Production de vaccins : ex. vaccin de l’hépatite B

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Transfert de gènes et thérapie génique

o Production de siRNA

Transfert de gènes et thérapie génique

Première étude démontrant l’efficacité d’un lentivirus recombinant permettant de rétablir la
production d’hémoglobine chez des patients atteints d’une forme sévère de ß-thalassémies
nécessitant des transfusions sanguines fréquentes

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Si ARN

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Premier traitement efficace par

RNAi (Givosiran) dans les
crises de porphyries aiguës chez
des patients atteints de
porphyrie aigüe intermittente (PAI)

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Rappels physio-pathologiques
• Porphyrie: déficit
enzymatique d’origine
génétiqu e dans la biosynthèse de
l’hème

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QCM :

1-Cochez la ou les bonnes réponses :

A) Un vecteur peut se retrouver couper à différent niveaux par les enzymes de restrictions
B) Un vecteur peut se retrouver cloné sur un unique site de clonage appelé « linker »
C) Les 2 marqueurs de sélection utilisées sont les gènes de résistance à l’ampicilline et les gènes Lac Z
D) Le fragment d’ADN le plus grand qui peut être retrouvé mesure 10000 kb et est un YAC (yeast
artificial chromosome)
E) En aucun cas les virus ne peuvent être utilisées comme vecteurs, leur taille ne le permet pas

2- Cochez la ou les bonnes réponses :

A) La déphosphorylation d’un plasmide l’abîme et empêche sa fermeture

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B) Le gène Lac Z code des Beta Galactosidases capable de cliver des sucres pour permettre à la bactérie
de survivre et de se multiplier dans des systèmes pauvres en glucose uniquement.
C) L’ADN recombinant est le résultat de la liaison de l’insert et du vecteur
D) Dans le système bactérien Opéron tétracycline ou « tet », le gène de résistance peut être remplace par
un gène d’intérêt
E) La porphyrie correspond à un déficit enzymatique d’origine génétique en plasma

3-Cochez la bonne réponse

A) Lors de la régulation négative de l’expression des gènes, l’ARN double brin endogène entre dans la
cellule via un vecteur comme un virus ou plasmide
B) Le Givosiran est le premier traitement efficace dans les crises de polypes aigües chez de patients PAI
C) Le Givosiran permet une diminution des crises aigues ainsi qu’une amélioration de la qualité de vie

Correction :

1-
A) F : C’est un site unique de coupure par les enzymes de restriction
B) F : Il peut se retrouver cloné sur de multiples sites de clonages que l’on appelle « polylinker »
C) V
D) F : C’est bien le YAC mais il mesure 1000 kb et pas 10000
E) F : Les virus peuvent également être utilisés, comme par exemple les letivirus dans le cadre de
thérapie génique

2-
A) F : On déphosphoryle un plasmide pour éviter qu’il se referme ! Ça ne l’abimera pas
B) V
C) V
D) V
E) F : La porphyrie est un déficit enzymatique d’origine génétique dans la biosynthèse de l’hème.

3-
A) F : exogène
B) F : Piège : on parle de porphyrie et pas de polype
C) V

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