Séparations chirales

par CPL, CPS et CPG

par Marcel CAUDE

Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)
Docteur ès Sciences
Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique
et Nathalie BARGMANN-LEYDER
Ingénieur de l’École Supérieure de Physique et Chimie Industrielles de Paris

1. Généralités................................................................................................. P 1 470 - 2
1.1 Chiralité et structure moléculaire ............................................................... — 2
1.2 Nomenclature R,S autour d’un centre de chiralité.................................... — 3
1.3 Règle des trois points.................................................................................. — 3
2. Formation de diastéréoisomères par dérivation précolonne....... — 4
2.1 Chromatographie en phase gazeuse ......................................................... — 4
2.2 Chromatographies en phases liquide et supercritique ............................ — 4
3. Formation de diastéréoisomères labiles dans la phase mobile .. — 11
3.1 Chromatographie d’adsorption .................................................................. — 11
3.2 Chromatographie de partage à polarité de phases inversée................... — 11
3.3 Chromatographie d’échange de ligands.................................................... — 12
3.4 Chromatographie de paires d’ions............................................................. — 12
4. Formation de diastéréoisomères labiles à la surface de phases
stationnaires chirales (PSC) .................................................................. — 12
4.1 Chromatographie en phase gazeuse ......................................................... — 12
4.2 Chromatographies en phases liquide et supercritique ............................ — 13
5. Conclusion ................................................................................................. — 23
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 470

L es séparations chirales ont une grande importance dans des domaines

variés :
— pharmacologique (l’activité d’une molécule thérapeutique peut varier d’une
configuration absolue à une autre ; le cas le plus tragique fut celui de la thalido-
mide utilisée comme sédatif chez la femme enceinte dont l’une des formes s’est
avérée tératogène) ;
— agrochimique (de nombreux herbicides et pesticides possèdent un ou plu-
sieurs centre(s) d’asymétrie et l’une des formes peut être plus active que l’autre ;
son utilisation permettrait de diminuer les quantités épandues et ainsi la
pollution) ;
— arômes et parfums...
Aussi n’est-il pas surprenant que le contrôle de la pureté optique et l’étude des
propriétés des énantiomères deviennent une nécessité, en particulier pour les
molécules médicamenteuses.

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Différentes techniques de détermination de la pureté optique ou énantiomé-

rique existent, elles peuvent être séparées en deux groupes selon que la sépara-
tion effective des énantiomères est réalisée ou non.
Les méthodes sans séparation non développées ici sont la polarimétrie (utili-
sant la propriété pour un composé chiral de faire tourner le plan de polarisation
de la lumière), la RMN (on distingue les méthodes indirectes consistant à dériver
les énantiomères en diastéréoisomères des méthodes directes consistant à utili-
ser un solvant chiral comme le (R) - (I) - 2,2,2-trifluoro-1-phényléthanol ou un
réactif optiquement actif type complexe de lanthanide, la dilution isotopique, la
calorimétrie et enfin les techniques enzymatiques.
Les méthodes avec séparation sont la recristallisation fractionnée et les chro-
matographies. La recristallisation fractionnée a longtemps été la technique de
choix pour préparer des composés optiquement purs. Cette méthode est basée
sur des différences de comportement thermodynamique des deux antipodes
d’un racémique : en présence d’un agent résolvant chiral, ils donnent des com-
plexes ayant des solubilités distinctes. Elle présente certains inconvénients : lon-
gue à mettre en œuvre, elle n’est pas à l’abri d’erreurs résultant de vitesses de
réaction différentes, de la racémisation du réactif chiral ou de racémisation lors
de l’étape finale de libération du réactif chiral.
Les développements des chromatographies en phase gazeuse (CPG) puis en
phase liquide (CPL) et plus récemment en phase supercritique (CPS) ont permis
la mise au point de techniques de plus en plus performantes. Les propriétés phy-
sico-chimiques de deux énantiomères sont identiques sauf lorsqu’ils sont placés
dans un environnement dissymétrique. Ce dernier peut être obtenu avant la
colonne chromatographique (méthode 1) ou dans la colonne chromatogra-
phique par l’intermédiaire de la phase mobile (méthode 2) ou de la phase sta-
tionnaire (méthode 3).
Méthode 1 : les énantiomères sont transformés chimiquement en diastéréoi-
somères et séparés ensuite avec des phases stationnaires et mobiles achirales.
Méthode 2 : un agent chiral est ajouté à la phase mobile dans laquelle vont se
former des complexes diastéréoisomères labiles.
Méthode 3 : la séparation repose sur la formation de complexes diastéréoiso-
mères labiles entre chaque énantiomère et la phase stationnaire chirale : la
sélectivité de la séparation chirale est alors directement liée à la différence de
stabilité des complexes ainsi formés.
Ce sont ces trois méthodes qui seront développées dans cet article après avoir
défini les notions utiles à leur compréhension.

1. Généralités Si des stéréoisomères ne sont pas images dans un miroir, ils sont
dits diastéréoisomères (les formes cis et trans d’une même molé-
cule sont, par définition, des diastéréoisomères). Les diastéréoiso-
mères, contrairement aux énantiomères, présentent des énergies
internes différentes et peuvent être séparés en exploitant leur diffé-
1.1 Chiralité et structure moléculaire rence de propriétés physicochimiques (point de fusion, solubilité,
etc.). Précisons enfin que l’énantiomérie ou la diastéréoisomérie
sont des relations liant deux configurations : pour un même com-
La chiralité est la propriété géométrique qui caractérise le fait posé, la forme A peut être énantiomère de la forme B et diastéréoi-
qu’un objet et son image dans un miroir ne sont pas superposables. somère de la forme C ou D, comme le montre la figure 1 pour une
Des isomères pour lesquels seul l’arrangement spatial des ato- molécule comportant deux centres d’asymétrie. On distingue les
mes diffère sont appelés stéréoisomères. Deux stéréoisomères sont molécules asymétriques (possédant un carbone ou un hétéroatome
dits énantiomères si et seulement si ils sont images l’un de l’autre asymétrique) des molécules symétriques pour lesquelles il peut
dans un miroir. La molécule originelle et son image sont dites s’agir de chiralité axiale (allènes, spirannes...), planaire (dérivés
antipodes ; un mélange équimolaire d’antipodes est appelé racé- « ansa », paracyclophane...) ou d’hélicité (atropoisomérie : hexahéli-
mate. cène, trans-cyclooctène...).

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Figure 2 – Nomenclature des molécules chirales

doublet électronique libre). Si on observe (en se plaçant face au

volant) la séquence GMP distribuée dans le sens des aiguilles d’une
montre, on lui attribue la configuration R (figure 2 a ). Dans le cas
contraire, celle-ci est dite S. Pour les atropo-isomères (isomérie pro-
voquée par un empêchement stérique à la rotation), on utilise la
nomenclature M (minus) et P (plus) associée respectivement à des
hélices droites ou gauches (figure 2 b ).
Figure 1 – Relation existant entre les quatre configurations absolues Rappelons que, pour un composé ayant n centres d’asymétrie, on
d’une molécule comportant deux centres d’asymétrie compte 2n stéréoisomères, soit 2n–1 couples d’énantiomères. Pour
une molécule renfermant 5 centres d’asymétrie, on peut prévoir
32 stéréoisomères se composant de 16 couples d’antipodes.
1.2 Nomenclature R,S autour d’un centre Il est cependant possible que des éléments de symétrie molécu-
de chiralité laire et/ou une interdépendance configurationnelle entre les centres
de chiralité réduisent le nombre des stéréoisomères.

Cahn, Ingold et Prelog ont proposé une nomenclature unifiée R

(Rectus), S (Sinister) pour désigner la configuration absolue des
molécules asymétriques. Considérons un atome A asymétrique 1.3 Règle des trois points
entouré de quatre groupements différents. La nomenclature retenue
nécessite deux opérations. On classe tout d’abord les groupements
par la comparaison des numéros atomiques des atomes liés au cen- La séparation des énantiomères repose sur la formation de com-
tre d’asymétrie. Par exemple : plexes diastéréoisomères entre le racémate et un sélecteur chiral. La
stéréosélectivité dépend de la différence de stabilité des diastéréoi-
I > Br > Cl > F somères ainsi formés. La règle des trois points d’interaction (dite
Pour les chaînes carbonées commençant toutes par un carbone, il règle de Dalgliesh) [1] permet, à partir de considérations purement
y a indétermination ; elle est levée grâce à un certain nombre de géométriques, de montrer que deux énantiomères seront séparés si
règles qui ne seront pas détaillées ici [121]. Nous dirons seulement au moins trois interactions simultanées (AA’, BB’, CC’) dont l’une de
que la comparaison entre deux groupes est poursuivie dans les nature stéréosélective, ont lieu avec l’un des énantiomères
chaînes carbonées jusqu’à la levée de l’indétermination. Par exem- (figure 3). L’obtention d’une stéréosélectivité n’implique pas obliga-
ple, —CH2—CH3 a priorité sur —CH3 car le second carbone du radi- toirement la perte d’une interaction avec l’un des énantiomères
cal éthyle l’emporte sur l’hydrogène correspondant dans le mais des énergies d’interaction différentes tout en restant du même
groupement méthyle. On aboutit alors au classement suivant pour ordre de grandeur. Cette règle, qui a le mérite de la simplicité, ne
les principaux substituants : s’applique bien que pour des processus bimoléculaires ; elle est en
cela très réductrice. La réalité s’avère souvent plus complexe car il
—C6H5 > —C(CH3)3 > —CH(CH3)2 > —CH2—CH3 > —CH3 faut aussi prendre en considération les états conformationnels
—OH > —NH2 > —COOH > —CHO > —CH2OH > —C6H5 adoptés par le soluté et la phase stationnaire chirale. De plus, lors-
que celle-ci est un polymère chiral, aux interactions attractives clas-
On imagine ensuite que les groupements G (gros), M (moyen), siques s’ajoute un phénomène de reconnaissance de forme qui met
P (petit) sont répartis sur un volant dont l’axe serait A-I (I étant le en jeu la géométrie globale du soluté (comparable aux processus de
plus petit des quatre groupements, il peut s’agir quelquefois d’un reconnaissance enzymatique de type clef-serrure).

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De nombreux réactifs de dérivation chiraux possédant différents

groupements fonctionnels sont disponibles, les plus couramment
utilisés sont rassemblés dans le tableau 1.

2.1.2 Exemples

Des progrès considérables ont été faits dans la compréhension

des mécanismes de séparation des diastéréoisomères en CPG
par Karger et al. [7] [8] notamment. Le chlorure de N trifluoroacétyl
de L-proline (N-TFA) L-proline) est le plus utilisé des réactifs de déri-
vation chirale pour les amines primaires et secondaires (amines
cycliques incluses) [9] [10] ainsi que pour les acides aminés sous
forme esters [6] [7]. Cependant, ce réactif n’est pas toujours le plus
Figure 3 – Modèle des trois points d’interaction selon Dalgliesh efficace pour la résolution des amines. Souter et al. [11] ont comparé
la résolution d’amphétamines et d’amines diverses dérivées par dif-
férents chlorures d’acides aminés ou par le classique chlorure de N-
TFA L-proline. Comme le montre la figure 4, la (1-méthyl -3-phényl)
2. Formation propylamine est mieux résolue lorsqu’elle est dérivée par le chlo-
de diastéréoisomères rure de N-TFA L-leucine que par le chlorure de N-TFA L-proline. De
même, les dérivés N-penta-fluoropropionyl ou N-heptafluorobutyryl
par dérivation précolonne donnent, dans la majorité des cas, des résolutions équivalentes aux
dérivés N-TFA analogues mais avec un temps d’analyse beaucoup
plus court.
Cette méthode consiste à faire réagir de façon préalable le
racémate avec un réactif optiquement pur de manière à former
des diastéréoisomères ; ceux-ci ont des propriétés physico-chi-
miques différentes et peuvent donc être séparés avec des pha- 2.2 Chromatographies en phases liquide
ses stationnaires et mobiles classiques. Cette méthode est et supercritique
limitée aux molécules ayant des fonctions réactives (amines,
acides, alcools, etc.). Pour des séparations préparatives, le
retour à l’énantiomère initial peut s’accompagner d’une racémi-
sation partielle, ce qui constitue une autre limitation de cette En chromatographie en phase liquide ou supercritique, les avan-
méthode. tages et les inconvénients de la dérivation précolonne sont les
mêmes qu’en CPG. Cette méthode était, avant le développement
des phases stationnaires chirales, très utilisée. Actuellement elle est
encore appliquée mais, le plus souvent, pour améliorer simultané-
2.1 Chromatographie en phase gazeuse ment la détection des solutés.

Dès 1960, des séparations d’énantiomères après dérivation préa- 2.2.1 Réactifs
lable en diastéréoisomères ont été réalisées. On trouve dans [6] une
mise au point détaillée de cette technique rassemblant les procédu-
res utilisées en fonction des classes de racémates à résoudre, les De nombreux réactifs de dérivation chirale sont disponibles com-
applications ainsi que certaines données mécanistiques. mercialement. Les plus utilisés sont regroupés dans le tableau 2.
Cette méthode est encore très utilisée en CPG malgré les contrain-
tes dues, en particulier, aux réactifs chiraux.
2.2.2 Exemples
2.1.1 Réactifs
Un exemple significatif concerne la séparation de stéréoisomères
de 17 acides aminés préalablement dérivés par le (+) -1- (9-fluorényl)
La formation de diastéréoisomères par dérivation précolonne doit
respecter certaines contraintes : éthylchloroformiate (FLEC). Elle est effectuée par chromatographie
de partage à polarité de phases inversée sur gel de silice greffée
— le réactif chiral doit être optiquement pu ou, dans le cas con- octyle avec élution graduée et détection fluorimétrique et UV [12]
traire, sa pureté optique doit être connue avec précision (si ces con- (figure 5). Le principal intérêt de cette méthode est la très grande
ditions ne sont pas respectées, elles peuvent entraîner des sensibilité de détection.
incertitudes importantes sur le résultat) ;
— la réaction de dérivation doit être rapide et quantitative ; Un autre exemple est fourni par la séparation des énantiomères
— les diastéréoisomères formés doivent être suffisamment vola- d’un bronchodilatateur, l’imoxitérol, possédant deux centres d’asy-
tils (sinon la volatilité doit être introduite par une réaction métrie. Macaudière et al. [13] ont en effet démontré qu’il était possi-
supplémentaire) ; ble de séparer sur une colonne achirale les quatre formes après
— le comportement chromatographique des dérivés diastéréoi- dérivation préalable au moyen du (R ) - (+) -1-phényl éthylisocyanate
somères doit être approprié (séparation aisée, stabilité dans les con- (figure 5) alors que l’utilisation d’une phase stationnaire chirale ne
ditions de la CPG...). permet pas la séparation de l’un des couples de diastéréoisomères.

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Tableau 1 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase gazeuse [3]
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

Chlorure de 2-chloro-isovaléryle Acides aminés

Amines

Chlorure de drimanoyle Acides aminés

Amines

Acides aminés
Chlorure de chrysanthémoyle Amines

Chlorure N-TFA-prolyle Acides aminés

Amines

Chlorure
N-(pentafluorobenzoyl) prolyle Amines

Chlorure N-TFA-alanyl
et homologues Amines
(R1 = CH3, CH(CH3)2,
CH2CH(CH3)2, C6H5)

Chlorure
(S )-2-méthoxy-2-trifluoro-
méthyl acétyl (MTPA-Cl)
Amines

Chloroformiate de menthyle (–) Acides aminés

Amines

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Tableau 1 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase gazeuse [3] (suite)
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

Chlorure de 2-phényl propionyl Hydroxy-acides

Alcools

Chlorure de 2-phényl butyryl Alcools

Chlorure d’acide
O-acétyllactique Alcools

Hydroxy-acides
Chlorure de drimanoyle Alcools

Chlorure de chrysantémoyle Hydroxy-acides

Alcools

MTPA-Cl Amphétamines

Chloroformiate de menthyle (–) Hydroxy-acides

Alcools

(1-phényl) éthyl isocyanate Hydroxy-acides

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Tableau 1 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase gazeuse [3] (suite)
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

Alcanes 2-ol (R1 = n-C2-C6, Acides aminés

(CH3)2CH, (CH3)3C) α-hydroxyacides

Kéto-acides
Menthol (–) Acides aminés
α-hydroxyacides
Autres acides

(+)-2-amino-4-méthylpentane Acides aminés

Esters méthyliques d’acides Acides aminés

aminés

(+)-2,2,2-trifluoro-1-phényl- Cétones
éthylhydrazine

O-(–)-menthyl hydroxylamine Carbohydrates

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Figure 4 – Résolution de la (1 - méthyl - 3 - phényl) propylamine et de l’éthylphénéthylamine après dérivation avec le chlorure de N-TFA L-leucine
ou avec le chlorure de N-TFA L-proline

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Tableau 2 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase liquide [3]
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

Dérivés N-carboxy-anhydrides ou
tert-butoxycarbonyl Acides aminés
d’acides aminés L

Chlorure N-TFA-prolyl Amino-alcools

Chlorure d’acide (S )-O-méthyl-

mandélique

Acide (–) 1-méthoxy-1-méthyl-

1-naphtyl acétique

Acide (–) 1-méthoxy-1-méthyl- Acides aminés

1-(2-naphtyl) acétique Esters

Isothiocyanate tétra-O-2,3,4,6- Acides aminés

acétyl-β-D - glucopyranosyl (GITC) Amino-alcools

Isothiocyanate tri-O-2,3,4-acétyl-β- Éphédrines

D - arabino-furanosyl (AITC) Amphétamines

(1-phényléthyl) isocyanate

Amines

(1-naphtyléthyl) isocyanate

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Tableau 2 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase liquide [3]
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

MTPA-Cl Alcools terpénoïques

(1-phényléthyl) isocyanate

Alcools

(1-naphtyléthyl) isocyanate

(1-phényléthyl) amine

(1-naphtyléthyl) amine

Acides carboxyliques

1-(4-nitrophényl) éthylamine

méthylphénylalaninate

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Figure 5 – Séparation d’un mélange étalon de 17 acides aminés racémates après réaction avec le (+) -1- (9 - fluorényl) éthylchloroformiate

3. Formation de sur l’exactitude de la détermination mais diminue la sélectivité. Les

chromatographies d’adsorption, de partage à polarité de phases
diastéréoisomères labiles inversée, d’échange de ligands et de paires d’ions sont principale-
ment utilisées.
dans la phase mobile
3.1 Chromatographie d’adsorption
L’ajout d’un réactif de dérivation chiral dans la phase mobile
est essentiellement mis en œuvre en chromatographie en phase
liquide. En chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile Les diastéréoisomères labiles sont formés par liaison hydrogène
a un pouvoir solvant trop faible (citons cependant l’étude réali- entre le racémate (acides aminés et dérivés, alcools, acides...) et le
sée par Maestas et al. [14] portant sur la résolution d’alcools et sélecteur chiral (acide (+) - 10-camphosulfonique, N-acétyl-L-valine
de cétones bicycliques racémiques par CPG sur des phases sta- tert-butylamide...) dissous dans la phase mobile peu polaire et sont
tionnaires achirales en ajoutant à l’injection un réactif de dériva- ensuite séparés sur silice vierge [15] [16] [17].
tion chiral volatil (d-limonène, l-menthol...) provoquant une
dérivation in situ). Deux mécanismes de discrimination chirale
sont envisageables. La formation des diastéréoisomères labiles
peut se faire soit au sein de la phase mobile chirale, soit à la sur- 3.2 Chromatographie de partage
face de la phase stationnaire après son imprégnation par le à polarité de phases inversée
réactif chiral. Il est probable que ces deux mécanismes coexis-
tent.
L’additif chiral le plus utilisé en chromatographie de partage à
polarité de phases inversée est la β-cyclodextrine (dissoute dans la
Cette méthode nécessite de grandes quantités de réactif chiral ; phase mobile constituée de mélanges eau-méthanol ou éthanol
elle est limitée par la détection qui doit être compatible avec la tamponnés entre pH 5 et 7) qui forme avec le racémate à séparer des
nature du réactif chiral et, dans le cas d’une séparation préparative, complexes d’inclusion de stœchiométrie 1 : 1. Ces derniers sont
par la récupération des énantiomères qui doivent être séparés du séparés par interactions hydrophobes sur une silice greffée n-alkyle
réactif chiral. En revanche, la pureté optique du réactif n’influe pas [18]. D’autres sélecteurs chiraux hydrophobes peuvent être utilisés

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comme par exemple le tartrate de di- n -butyle pour les amino-

alcools [19].

3.3 Chromatographie d’échange

de ligands

La phase mobile contient le complexe d’un métal de transition

(Zn2+) avec un ligand renfermant un carbone asymétrique et une
chaîne hydrophobe telle que la (–)-2-isopropyl -4-octyle diéthylène-
triamine [20]. La phase stationnaire est une silice greffée alkyle qui
exerce une rétention par interactions hydrophobes des complexes
mixtes formés avec les énantiomères (acides aminés, peptides).
D’autres ligands et cations métalliques peuvent également être utili-
sés [21] [22] [23] [24].

3.4 Chromatographie de paires d’ions

Un contre-ion chiral est dissous dans la phase mobile et forme

des paires d’ions diastéréoisomères avec les énantiomères du racé-
mate. Ces paires d’ions peuvent interagir différemment avec la
phase stationnaire. Cette méthode a été largement utilisée [25] [26] Figure 6 – Séparation des quatre diastéréoisomères de l’imoxitérol
[27] et a même pu être mise en œuvre avec une phase mobile super- après réaction avec le R - (+) 1 - phényléthylisocyanate
critique pour la séparation d’amino-alcools (figure 6) [28], ce qui
permet de diminuer la durée des séparations par rapport à la chro-
matographie en phase liquide. — Les phases diamide dérivées des précédentes et contenant
deux fonctions amide thermiquement stables à proximité d’un uni-
que centre d’asymétrie forment le second groupe. Elles ont l’avan-
tage de donner de meilleures stéréosélectivités [34] [38].
4. Formation de — Le troisième type de phases regroupe les PSC de type N, N-car-
diastéréoisomères labiles bonyl-bis (ester d’acide aminé). Celles-ci ont été initialement déve-
loppées pour augmenter le nombre des interactions autour du
à la surface de phases centre d’asymétrie de la phase de façon à améliorer les stéréosélec-
tivités. Elles sont parfois appelées, de façon impropre, phases
stationnaires chirales (PSC) ureide [3] [39] [40] [41]. Les structures générales des PSC de ces
trois premiers groupes sont représentées figure 8.
— Plus récemment, un quatrième type de PSC a été introduit fai-
sant intervenir la formation d’un complexe de coordination métalli-
4.1 Chromatographie en phase gazeuse que [42]. Ces PSC sont particulièrement utilisées pour la séparation
de composés ne possédant pas de groupements appropriés à la for-
mation de liaisons hydrogène avec les sélecteurs chiraux des PSC
La première séparation d’énantiomères sur PSC par CPG a appartenant aux trois premiers groupes [43].
été réalisée en 1966 par Gil-Av (séparation d’esters d’acides aminés
N-trifluoroacétylés sur phase N-trifluoroacétyl- L-isoleucine lauryl) — Le cinquième groupe enfin, qui connait un développement très
[29]. Des progrès dans la compréhension des mécanismes de recon- important, regroupe les PSC dérivées des cyclodextrines [44] [45].
naissance chirale ainsi que la volonté d’améliorer la résolution, l’effi- Bien qu’il existe un grand nombre de PSC pour la CPG, le nombre
cacité et la stabilité thermique des phases ont conduit au de phases commerciales est encore relativement limité [phases dia-
développement de plusieurs autres PSC classées à l’origine en trois mide et cyclodextrine (tableau 3)].
groupes . Plus récemment enfin, un grand nombre de phases déri-
vées des cyclodextrines ont été synthétisées, le domaine d’applica-
tions de ces phases étant nettement plus étendu [30] [31]. 4.1.2 Mécanismes d’interaction

4.1.1 Classement des phases stationnaires chirales La discrimination chirale des phases dipeptide est fondée sur la
formation par liaisons hydrogène (engageant les dipôles amide) de
commercialisées « diastéréoisomères conformationnels » transitoires entre le soluté
et la phase stationnaire chirale [46].
Les PSC pour la CPG peuvent actuellement être classées en cinq
Les mécanismes de reconnaissance chirale mis en jeu par les PSC
groupes en fonction de la structure de leur sélecteur chiral et de la
dérivées des cyclodextrines sont plus complexes. Les interactions
nature des interactions mises en jeu au cours du processus de dis-
hydrophobes, le phénomène d’inclusion du soluté dans la cavité
crimination chirale.
chirale et des interactions dipolaires semblent jouer un rôle prédo-
— Les phases dipeptide introduites par Gil-Av et Feibush consti- minant pour la discrimination chirale à l’image des mécanismes
tuent le premier groupe. Ces PSC sont utilisées principalement pour proposés en CPL [47] [48]. Berthod et al. [49] proposent l’existence
les séparations de dérivés d’acides aminés très volatils [32] [33]. de deux mécanismes antagonistes, le premier par inclusion, le

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Figure 8 – Structures générales des phases stationnaires chirales

dipeptide, diamide et du type N, N - carbonyl - bis (ester d’acide
aminé) pour la chromatographie en phase gazeuse

4.2.1 Classement des phases stationnaires chirales

commercialisées
La première phase stationnaire chirale conçue par Pirkle et al. [51]
est apparue sur le marché en 1981 et actuellement environ 70 pha-
Figure 7 – Séparation par chromatographie de paires d’ions en phase ses sont commercialisées (tableau 4). On peut classer ces PSC en
supercritique du propanolol (a ) et du DPI 101 - 106 (b ) quatre groupes selon la structure chimique des sélecteurs chiraux et
les mécanismes de reconnaissance chirale mis en jeu [52].

second, moins classique, faisant intervenir diverses interactions 4.2.2 Groupe IA : PSC indépendantes de type
avec l’extérieur des cavités de la cyclodextrine. Pirkle
4.2.2.1 Sélecteurs chiraux
Les PSC du groupe IA sont constituées d’un sélecteur chiral
4.1.3 Applications (généralement un acide aminé dérivé) greffé de manière covalente
(plus rarement ionique) sur une silice chromatographique.
Les phases dipeptide permettent la résolution des acides aminés Chaque sélecteur chiral agit de manière indépendante avec les
(figure 9). molécules du racémate et ces PSC sont ainsi dites
« indépendantes ». Les PSC de type Pirkle [53] contiennent un noyau
Le domaine d’applications des PSC dérivées de la cyclodextrine aromatique à caractère accepteur ou donneur d’électrons π qui
semble très étendu et fait actuellement l’objet de nombreuses étu- intervient dans un complexe de transfert de charge avec le soluté
des. Mentionnons, à titre d’exemple, la séparation des énantiomè- porteur d’un noyau aromatique de caractère complémentaire. Une
res de l’hexobarbital et du méphobarbital (figure 10) [50]. seule phase ne contient pas de noyau aromatique (type Hara) [54]
[55] mais généralement deux fonctions amide.

4.2.2.2 Mécanisme de reconnaissance chirale

Les mécanismes de reconnaissance chirale associés aux PSC
4.2 Chromatographies en phases liquide indépendantes sont relativement bien appréhendés puisque la
et supercritique structure du complexe bimoléculaire soluté-sélecteur chiral a été
étudiée par des méthodes spectroscopiques [56] [57] ou informati-
ques [58] [59]. La plupart des modèles implique la formation de
complexes diastéréoisomères labiles mettant en jeu une interaction
Les chromatographies en phases liquide et plus récemment π-π et des interactions par formation de liaisons hydrogène et/ou par
supercritique sont très utilisées pour les séparations énantioméri- empilement de dipôles (dipôle stacking ). La figure 11 [56] montre
ques. Cela s’explique par le fait que les séparations se pratiquent à les trois points d’interaction nécessaires à la reconnaissance chirale
température ordinaire ou à des températures très peu élevées, ce pour un exemple précis. La reconnaissance chirale n’implique pas
qui, d’une part, augmente l’intensité des interactions avec la phase obligatoirement la perte d’une des interactions avec l’énantiomère
chirale donc la stéréosélectivité et, d’autre part, évite toute racémi- le moins retenu mais seulement une diminution de l’énergie d’une
sation des solutés. Aussi n’est-il pas surprenant que 80 % des sépa- ou plusieurs interactions due à des phénomènes d’encombrement
rations chirales soient effectuées en CPL. stérique [60].

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Tableau 3 – Phases stationnaires chirales commerciales pour la chromatographie en phase gazeuse

Sélecteur chiral Nom commercial Fabricant

Phases indépendantes
(L ) -valine-tert-butylamide Chirasil-L-Val Chrompack, Macherey-Nagel
RSL-007 Alltech
(D ) -valine-tert-butylamide Chirasil-D-Val Chrompack, Macherey-Nagel
N-n-lauroyl-N-(L ) -valine-tert-butylamide SP-300 Supelco
S-valine-α-phényle-éthylamide XE-60-S-Valine-S-
α-phényle-éthylamide Chrompack
Cyclodextrines modifiées
α-cyclodextrine modifiée S-hydroxypropyl Chiraldex A-PH
β-cyclodextrine modifiée S-hydroxypropyl Chiraldex B-PH
γ-cyclodextrine modifiée S-hydroxypropyl Chiraldex G-PH

α-cyclodextrine modifiée dialkyl Chiraldex A-DA

Astec
β-cyclodextrine modifiée dialkyl Chiraldex B-DA Alltech
γ-cyclodextrine modifiée dialkyl Chiraldex G-DA

α-cyclodextrine modifiée trifluoroacétyl Chiraldex A-TA

β-cyclodextrine modifiée trifluoroacétyl Chiraldex B-TA
γ-cyclodextrine modifiée trifluoroacétyl Chiraldex G-TA

α-cyclodextrine modifiée hexakis-(2,3,6-tri-O-pentyl) Lipodex A

α-cyclodextrine modifiée hexakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-acétyl) Lipodex B Macherey-Nagel
β-cyclodextrine modifiée heptakis-(2,3,6-tri-O-pentyl) Lipodex C
Cyclodex-B J W Scientific
β-cyclodextrine modifiée heptakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-acétyl) Lipodex D
γ-cyclodextrine modifiée octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl) Lipodex E Macherey-Nagel
β-cyclodextrine modifiée heptakis-(2,3,6-tri-O-méthyl) diluée dans Hydrodex β−PM
OV-1701 (cyanopropyl-diméthyl-phényl-polysiloxane) CP-Cyclodextrin-β-2,3,6-M19 Chrompack

Figure 9 – Séparation d’une série d’acides aminés (acides aminés N-pentafluoropropyl, ester isopropylique) par CPG sur PSC de type diamide

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Figure 10 – Séparation des énantiomères de l’hexobarbital (1) et du méphobarbital (2) sur phase stationnaire chirale dérivée de la cyclodextrine

Pour la PSC de type Hara, le mécanisme de reconnaissance chi-

rale est basé uniquement sur l’établissement de liaisons hydrogène
et est, du fait de cette spécificité, nettement moins utilisé.

4.2.2.3 Choix de la phase mobile

La grande stabilité de ces PSC permet leur utilisation aussi bien

en CPL qu’en CPS.
Phase liquide
Ces phases sont utilisées essentiellement avec des éluants peu
polaires du type hexane/modificateur polaire, beaucoup plus rare-
ment avec des éluants hydro-organiques [61]. L’influence de la
nature du modificateur polaire ajouté à la phase mobile est impor-
tante aussi bien du point de vue thermodynamique que cinétique.
En règle générale, les alcools ramifiés sont les plus sélectifs [62] [63]
(le sélecteur chiral plus encombré par solvatation devenant plus
sélectif). Les alcools linéaires à courte chaîne ont néanmoins l’avan-
tage d’être plus éluants et surtout d’entraîner une plus grande effi-
cacité que leur homologues supérieurs ou ramifiés. Ces propriétés
induisent un nivellement de l’influence de la nature de l’alcool sur la
résolution par unité de temps. Les solvants chlorés sont globale-
ment plus sélectifs mais l’efficacité de la colonne est alors inférieure
à celle mesurée avec les alcools. Ces résultats sont liés au fait que
les alcools sont à la fois donneur et accepteur de protons et peuvent
ainsi interagir par liaison hydrogène avec le site basique et/ou acide
des dipôles amide de la PSC alors que le chloroforme (donneur de
protons) et le chlorure de méthylène (interactions dipolaires) intera-
gissent seulement avec un site unique. De ce fait, les interactions
PSC -soluté sont optimales si l’on utilise des solvants chlorés (ce qui
se traduit par des sélectivités élevées) alors que, parallèlement, la
cinétique d’adsorption-désorption des solutés sur la PSC est plus
lente (ce qui se traduit par de plus faibles efficacités).
Il est donc souvent judicieux de choisir comme modificateur
polaire un mélange binaire solvant chloré (pour assurer la sélecti-
vité maximale) et alcool (pour conserver une grande efficacité et
Figure 11 – Modèle de reconnaissance chirale montrant une élution rapide) [63] [64] [65].
l’établissement de trois interactions concomitantes entre le
(S ) - N - (2 - naphtyl) alaninate de méthyle D’autres solvants comme le dioxanne sont parfois utilisés pour la
et le (S ) - N - (3,5 - dinitrobenzoyl) leucine N - propylamide séparation de sulfoxydes ou d’amino-alcools [66].

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Tableau 4 – Phases stationnaires chirales commerciales pour la chromatographie en phase liquide

Sélecteur chiral Nom commercial Fabricant

TYPE IA

(R )- ou (S )-(3,5-dinitrobenzoyl) phénylglycine DNBPG Baker, Regis

ChiralDNBPG-C Serva
Sumichiral OA-2000 Sumitomo
Sumichiral OA-2000S Sumitomo
(R )- ou (S )-N-(3,5 dinitrobenzoyl) tyrosine n-butylamide ChyRoSine-A Sedere
(S )-(S )-N-(3,5-dinitrobenzoyl) tyrosine [1-naphtyléthyl]amide ChyRoSine-AD Sedere
(S )-(3,5 dinitrobenzoyl)leucine DNBLeu Baker, Regis
ChiralDNBL-C Serva
(L )-(3,5-dinitrobenzoyl)phénylalanine Chirachrom A1 Interchim
(L )-(3,5 dinitroanilidophénylalanine Chirachrom D1 Interchim
(S ) - Naproxene Chirachrom D2 Interchim
(R )-α-méthylbenzylurée Supelcosil-LC-(R)-urea Supelco
(R )- ou (S )-N-(2-naphtyl)alanine Regis
(S )-α-(1-naphtyl)éthylamine Sumichiral OA-1000
dérivé amide de la (R)-phénylglycine et de l’acide
(S )-(4-chloro-phényl)isovalérique Sumichiral OA-2100
dérivé amide de la (R )-phénylglycine et de l’acide
(1R-3R )-chrysanthémique Sumichiral OA-2200
(R )- ou (S )-(3,5-dinitrobenzoyl) 1-napthtylglycine Sumichiral OA-2500
Sumichiral OA-2500S
(S )-valine tert-butylurée (PSC de type Hara) Sumichiral OA-3000
(S )-(3,5-dinitrobenzylurée)valine Sumichiral OA-3100
(S )-(3,5-dinitrobenzylurée)tert-leucine Sumichiral OA-3200 Sumitomo
(S )-valine-(S)-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4000
(S )-valine-(R )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4100
(R )-phénylglycine-(R )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4200
(R )-phénylglycine-(S )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4300
(S )-proline-(S )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4400
(S )-proline-(R )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4500
(S )-tert-leucine-(S )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4600
(S )-tert-leucine-(R )-[1-(1-naphtyl)éthyl]urée Sumichiral OA-4700

acide tartrique et 3,5-dinitrobenzylphényléthylamine Nucleosil Chiral-2 Macherey-Nagel

Diméthyl N-3,5-dinitrobenzoyl-α-amino-2,2-diméthyl-4-pentyl (R)-α−Burke 1 Baker, Regis

phosphonate
(S, S ) ou (R, R ) 1 - [(3,5-dinitrobenzoyl) amino] 2-allyl-1,2,3,4-tétrahydro- (S,S) ou (R,R) Whelk 01 Baker, Regis
phénanthrène

On peut adjoindre à cette liste déjà longue :

— Kromasil CHI-I (dérivé O,O’-bis (3,5 diméthylbenzoyl)-N,N’ diallyl L-tartardiamide) ;
— et Kromasil CHI-II (dérivé O,O’-bis (4 - ter - butylbezoyl) N-N’-diallyl L-tartardiamide) ;
— les phases stationnaires CHIREX dont la grande majorité des sélecteurs chiraux sont identiques à ceux déjà mentionnés ;
— une phase stationnaire sélective : β-Gem 1 (dérivé N-3,5-dinitrobenzoyl-3-amino-3 phényl-2(1,1-diméthyléthyl propanoate) ; cette phase
est utilisée pour les séparations des acides carboxyliques préalablement dérivés sous forme anilide.

TYPE IB

Divers aminoacides greffés sur silice (proline, valine hydroxyproline, Chiral hydroxyCu Serva
etc.)

Chiral proCu Serva

Chiral valCu Serva
Nucleosil Chiral-1
Chiralgel L-prolinamide
Chiralgel L-valinamide Macherey-Nagel
Chiralgel L-phenylalinamide

Chiralpak WM/WE Daicel

Chiralpak MA(+) Daicel
Accusphere J et W Scientific
2-carboxyméthylamino-1,2-diphényléthanol Chiralpak WE Daicel

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Tableau 4 – Phases stationnaires chirales commerciales pour la chromatographie en phase liquide (suite)

Sélecteur chiral Nom commercial Fabricant

TYPE IIA

α-cyclodextrine Cyclobond III Astec

β-cyclodextrine Cyclobond I (1) Astec
Chiradex Merck
Chiral β-dex Serva

γ-cyclodextrine Cyclobond II
α-cyclodextrine acétylée Cyclobond III Ac
β-cyclodextrine acétylée Cyclobond I Ac
β-cyclodextrine dérivée (S )-2-hydroxy-propyl Cyclobond I SP
β-cyclodextrine dérivée-2-hydroxy-propyl (racémique) Cyclobond I RSP
Astec
β-cyclodextrine dérivée (S )[1-(1-napthyl)éthyl]carbamate Cyclobond I SN
β-cyclodextrine dérivée (R )-[1-(1-napthyl)éthyl]carbamate Cyclobond I RN
β-cyclodextrine dérivée [1-(1-naphtyl)éthyl] carbamate (racémique) Cyclobond I RSN
β-cyclodextrine dérivée 3,5-diméthylphénylcarbamate Cyclobond I DMP
β-cyclodextrine dérivée 4-méthylphénylcarbamate Cyclobond I PT

TYPE IIB

Éther-couronne greffé sur silice Crownpak CR (+) Daicel

TYPE IIIA

Cellulose microcristalline triacétylée (polymère brut) Triacétate de cellulose Merck

Chiral triacel Macherey-Nagel
Chiralcel CA-1

Triacétate de cellulose Chiralcel OA

Tribenzoate de cellulose Chiralcel OB (10 µm) ; OB-H (5µm)

Triphénylcarbamate de cellulose Chiralcel OC

Tri-(3,5-diméthyl-phényl)carbamate de cellulose Chiralcel OD (10 µm) ; OD-H (5 µm)
Chiralcel OD-R (phase inverse)
Tri(4-chloro-phényl)carbamate de cellulose Chiralcel OF Daicel
Tri(4-méthyl-phényl)carbamate de cellulose Chiralcel OG
Tri(4-méthyl)benzoate de cellulose Chiralcel OJ + OJ-R (phase inverse)
Tricinnamate de cellulose Chiralcel OK
Tri(3,5-diméthyl-phényl)carbamate d’amylose Chiralpak AD
Tri[(R )-(1-phényl-éthyl)]carbamate d’amylose Chiralpak AS

TYPE IIIB

Poly (N-1-acroyl-phénylalanine éthylester) Chiraspher Merck

Poly (triphénylméthylméthacrylate) Chiralpak OT (+) Daicel
Poly (2-pyridil-diphénylméthylméthacrylate) Chiralpak OP (+) Daicel

TYPE IV

Albumine de sérum de bœuf Resolvosil-BSA-7 Macherey-Nagel

Acide α1-glycoprotéique Enantiopac LKB
Chiral-AGP Chromtech AB
Albumine de sérum humain Chiral protein 2 Life Sciences Int.
Ovomucoïde Ultron ES-OVM Mac-Mod Analytical
Vancomycin (2) Chirobiotic V Astec
Teicoplanin (antibiotiques macrocycliques) (2) Chirobiotic T Astec
Cellobiohydrolase (enzyme stable) Chiral CBH Astec
Ovoglycoprotein Ultron ES-OGP Shinwa Chemical
Industries Ltd

(1) De nouvelles PSC (Cyclobond I 2000) ont été récemment commercialisées. La reproductibilité du mode de greffage a été améliorée.
(2) Ces deux phases chirales peuvent aussi être classées dans le groupe III A dont elles partagent certaines propriétés.

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Phase supercritique
Le fluide surpercritique le plus utilisé est le dioxyde de carbone
(température critique : 31,3 oC, pression critique : 73,8 bar).
La sélectivité ne varie pas significativement avec sa masse volu-
mique, ce qui montre qu’il n’interagit pas ou peu avec le sélecteur
chiral de la PSC (le CO2 est facilement déplacé de la surface du sélec-
teur chiral par les molécules de soluté plus polaires et par celles du
modificateur polaire souvent contenu dans la phase supercritique).
Du point de vue de la thermodynamique, les plus grandes sélectivi-
tés sont obtenues à basse température (10 < T (oC) < 30), ce qui cor-
respond au domaine subcritique du CO2 (le logarithme de la
sélectivité augmente linéairement en fonction de l’inverse de la tem-
pérature), mais un compromis doit être réalisé avec la cinétique (en
règle générale, à durée d’analyse constante, le nombre de plateaux
contenu dans une colonne diminue quand la température diminue,
c’est-à-dire quand la viscosité de la phase mobile augmente).
Dans le cas des PSC de type IA, les sélectivités observées en CPS
sont, dans la très grande majorité des cas, identiques à celles obser-
vées en CPL. Cela suggère que les mécanismes de reconnaissance
chirale sont du même type pour ces deux fluides, l’hexane et le
dioxyde de carbone apparaissant comme des solvants interchan-
geables du point de vue de la sélectivité [67].
L’influence de la nature des modificateurs polaires (alcools, sol-
vants chlorés) ajoutés à la phase mobile supercritique est le même
que pour la CPL.
Signalons toutefois deux cas particuliers pour lesquels l’hexane
et le dioxyde de carbone ne peuvent être considérés comme inter-
changeables.
Le premier cas concerne la séparation non conventionnelle de
solutés accepteurs d’électrons π (dinitrobenzoyle d’α-amino-esters)
sur PSC également accepteur d’électrons π [68]. Dans ce cas, aucune
interaction de type transfert de charge ne peut s’établir au cours de
la discrimination chirale et l’on observe un changement du méca-
nisme dominant en fonction de la nature de la phase mobile, pou-
vant conduire à une inversion de l’ordre d’élution des deux
énantiomères. On note, dans ce cas, des différences importantes de
sélectivité entre une phase mobile du type hexane/éthanol et une
phase mobile CO2 supercritique/éthanol. Un comportement voisin
de celui du chlorure de méthylène est observé pour la phase super-
critique dans le cas de la séparation des diastéréoisomères de
l’oxyde de phosphine dérivé du L-menthyle (figure 12).
Le second exemple, très important tant au niveau théorique que
pratique, concerne la séparation d’amino-alcools-1, 2 β-bloquants
sur ChyRoSine A [69]. Ces composés sont très bien résolus en CPS
et ne le sont pas ou peu en CPL (figure 13). Cela est dû au compor-
tement tout à fait particulier du dioxyde de carbone qui joue ici
spontanément, et de façon réversible, le rôle d’agent de dérivation
in situ. Les différences de sélectivité observées sont liées au fait que Figure 12 – Séparation des énantiomères de l’oxyde de phosphine
l’espèce chromatographiée et séparée en CPS n’est pas la même dérivé du L-menthyle par CPL et CPS
que celle en CPL (formation d’un complexe labile par interaction
entre la fonction amino-alcool et la molécule de CO2).
Du point de vue cinétique, le gain apporté par la mise en œuvre de identique à des temps d’analyse 5 à 10 fois plus courts en CPS [71]
fluide supercritique est toujours très important. En effet, le nombre [72] (figure 14). Le gain par rapport à la CPL est bien sûr d’autant
de plateaux par unité de temps que peut générer une colonne chro- plus significatif que la valeur de Dm est grande, ce qui signifie que,
matographique est donné par la relation [70] : du strict point de vue cinétique, on a toujours intérêt à privilégier de
faibles masses volumiques de CO2 et à proscrire l’ajout de modifica-
N/t0 = vDm /hd 2
teurs polaires, ce qui est contradictoire avec l’élution de composés
où v est la vitesse réduite de la phase mobile, h, la hauteur de pla- polaires et l’obtention d’une grande sélectivité dans un temps rai-
teau réduite, Dm le coefficient de diffusion du soluté dans la phase sonnable d’où la nécessité, là encore, d’un compromis.
mobile et d le diamètre des particules contenues dans la colonne
chromatographique remplie ou le diamètre intérieur de la colonne
chromatographique capillaire. Pour un même rapport v/h et une 4.2.2.4 Applications
même colonne chromatographique, le nombre de plateaux par
unité de temps est donc proportionnel à Dm . Or les coefficients de Les plus nombreuses concernent les PSC accepteurs d’électrons
diffusion des solutés dans les fluides supercritiques sont, selon [73], qui permettent la résolution des racémates donneurs, ce qui
l’état supercritique, la nature du fluide et des solutés, 5 à 10 fois plus est le cas de nombreuses molécules thérapeutiques. Le choix de ces
grands que dans les liquides ; cela se traduit pour un temps d’ana- PSC est conditionné par la nature du centre de chiralité et des grou-
lyse constant par une amélioration de la résolution et à résolution pements fonctionnels présents dans le racémate.

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Figure 14 – Variation de la résolution Rs en fonction de la durée

d’analyse en CPL et en CPS pour un naphtoyl - amide dérivé
du 2-amino-octane

Figure 13 – Séparation du propanolol sur ChyRoSine - A par CPS

et CPL devant présenter des orbitales vacantes facilement accessibles (Cu
(II), Ni (II), Zn (II)...) est ensuite fixé par percolation.

Des énantiomères comportant des atomes asymétriques tels que 4.2.3.2 Mécanisme de reconnaissance chirale
C*, P*, S*, Se*... sont généralement bien résolus. En revanche, les Les solutés susceptibles d’être séparés doivent être bifonction-
atropoisomères et les hélicènes ne le sont pas. Des groupements nels pour établir deux liaisons datives et/ou ioniques avec le cation
fonctionnels possédant un moment dipolaire (—CO—NH—, métallique. Le principe de séparation repose, en effet, sur la forma-
≡≡ P == O, == S == O, ≡≡ P == S...) ou ayant la possibilité de former des tion des complexes diastéréoisomères ternaires entre le ligand
liaisons hydrogène (—OH, —SH, —NH—CO—NH—, —NH— CO— sélecteur (Lse), le cation métallique (Me ) et le soluté ligand Lso (L ou
C—...) sont nécessaires près du centre d’asymétrie ainsi que la pré- D ) représenté par l’équilibre suivant dans le cas de ligands
sence d’un cycle aromatique (phényle, naphtyle...). En revanche, les bidentates :
fonctions polaires (acide carboxylique, amines...) qui donneraient
des interactions trop fortes doivent être dérivées en amide, bien que → Lse Me (L ) Lso PS
2 (Lse Me NH3)PS + (L, D ) Lso PM ←
quelques exemples d’injection directe en chromatographie de par-
tage à polarité de phases inversée aient été publiés [74]. Ces phases, + Lse Me (D ) Lso PS + 2 NH3 PM
du fait de leur grande efficacité, se prêtent bien à l’analyse des tra- PS : phase stationnaire
ces [75] ; elles trouvent aussi des applications en chromatographie
préparative [18] [76]. PM : phase mobile
Divers facteurs interviennent dans la formation et la stabilité des
complexes : la structure chimique du ligand sélecteur bi- ou trifonc-
4.2.3 Groupes IB : PSC indépendantes tionnel, la nature du cation métallique, la composition de la phase
pour la chromatographie par échange mobile éluante (pH, force ionique), la nature et la structure de la
de ligands matrice (taux de réticulation) et le mode de greffage du sélecteur
chiral.
4.2.3.1 Sélecteurs chiraux 4.2.3.3 Choix de la phase mobile
Ces PSC sont, comme les précédentes, dites « indépendantes ». Les phases mobiles sont constituées soit d’eau pure, soit de tam-
Elles sont utilisées en chromatographie d’échange de ligands et sont pon phosphate ou acétate de concentrations comprises entre 10–2 et
obtenues par greffage chimique d’un ligand chiral, le plus souvent 5 × 10–2 mol · L–1 (4 < pH < 6), soit encore de mélanges binaires tam-
un acide aminé sur une matrice organique de type polyacrylamide pon aqueux-solvants organiques (méthanol, acétonitrile ou tétrahy-
ou polystyrène-divinylbenzène [77] [78] ou sur une silice de fine gra- drofuranne). Des traces d’ions Cu2+ (10–5 à 10–4 mol · L—1) sont
nulométrie [79]. Indépendamment du type de matrice utilisée, les généralement ajoutées à la phase éluante de façon à maintenir
acides aminés cycliques (proline, hydroxyproline) conduisent aux constante la capacité d’échange de ligands de la colonne chromato-
meilleurs énantiosélectivités et efficacités. Le cation métallique graphique (les acides aminés sont élués sous la forme de comple-

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Figure 15 – Représentation schématique des deux étapes de discrimination chirale sur PSC de type cyclodextrine

xes avec le cuivre (II), ce qui facilite, pour la plupart d’entre eux, leur — (a ) inclusion par effet hydrophobe de la molécule de soluté ou
détection dans l’ultraviolet). d’une partie seulement de celle-ci dans la cavité chirale de façon à
restreindre ses orientations possibles dans la cage ;
— (b ) interactions par formation de liaisons hydrogène entre les
4.2.3.4 Applications
groupements se situant au voisinage du centre d’asymétrie et les
La chromatographie d’échange de ligands a été largement déve- hydroxyles secondaires de la cyclodextrine.
loppée pour la séparation des isomères d’acides aminés [80] [81] La reconnaissance chirale fait intervenir principalement l’adéqua-
[82] [83], des di et tripeptides [80] [81] [82] et des hydroxyacides [80] tion de la taille de la cavité avec le motif hydrophobe du soluté (tight
[84], c’est-à-dire de solutés ayant au moins deux des groupements fit ). La β-cyclodextrine permet l’inclusion d’un cycle benzénique ou
fonctionnels suivants : —COOH, —OH, —NH2, ... capables de former naphtyle ou de taille équivalente ; les racémates résolus comportent
avec l’ion Cu2+ un complexe bidenté. Les acides aminés sont géné- souvent deux cycles dont l’un au moins est aromatique, le centre
ralement non dérivés bien que la forme dansyle soit parfois préférée d’asymétrie étant généralement situé entre les deux ou entre un
essentiellement pour des raisons de détection (fluorimétrie). cycle et une fonction carbonyle. Des changements minimes dans la
structure des solutés peuvent entraîner des variations importantes
de la rétention et de la sélectivité [88].
4.2.4 Groupe II : cyclodextrines et éther-couronne Pour les éthers-couronnes, la discrimination chirale repose sur la
différence de stabilité des complexes diastéréoisomères d’inclusion
formés avec l’éther-couronne (molécule hôte).
4.2.4.1 Sélecteurs chiraux

Ce groupe comprend les cyclodextrines et un éther-couronne. Les 4.2.4.3 Choix de la phase mobile
cyclodextrines [85] sont des oligosaccharides cycliques formant une
cavité hydrophobe de forme toroïdale. Les groupements alcool Phase liquide
secondaire bordent l’entrée de la cavité alors que les groupements Cyclodextrines : ces PSC sont mises en œuvre avec des phases
alcool primaire plus rapprochés, et par ailleurs plus flexibles, obs- mobiles du type eau-solvant organique, ce dernier agit de façon
truent partiellement l’accès opposé de la cavité. La densité électro- compétitive avec le soluté sur le motif cyclodextrine. Ces phases chi-
nique élevée due aux atomes d’oxygène glucosidiques rend rales ne sont généralement pas utilisées en mode normal car elles
l’intérieur de la cavité hydrophobe (hydrophobie comparable à celle ont alors un comportement analogue à celui des phases diols (il y a
de l’octanol), ce qui permet la formation de complexes d’inclusion en effet obturation de la cavité chirale par les molécules du solvant
avec des solutés apolaires ou polaires comportant un motif hydro- hydrophobe, qui empêche toute pénétration même partielle des
phobe. Chaque unité glucopyrannose possède cinq atomes de car- molécules de soluté et il ne subsiste plus que les interactions non
bone asymétriques, ce qui confère aux cyclodextrines des stéréosélectives avec les groupements hydroxyle secondaire bor-
propriétés chirales. Le greffage est généralement effectué par réac- dant l’entrée de la cavité chirale) [89]. Les solvants organiques choi-
tion de la cyclodextrine sur une silice greffée époxyde. Récemment, sis sont le méthanol, l’éthanol ou l’acétonitrile. Les facteurs de
de nouvelles PSC greffées cyclodextrine ont été commercialisées capacité, la sélectivité et la résolution augmentent quand la teneur
[86]. Elles sont obtenues en dérivant les groupements hydroxyle en solvant organique dans la phase mobile décroît. Le méthanol est
secondaire des cyclodextrines sous la forme ester ou carbamate. le solvant souvent le plus sélectif.
Les cyclodextrines sont ensuite greffées sur une silice de 5 µm, le Éther-couronne : les phases éluantes sont généralement consti-
bras reliant la cyclodextrine à la silice est dépourvu d’atomes tuées de solutions aqueuses d’acide perchlorique de pH compris
d’azote, ces phases présentant l’avantage d’être très stables en entre 1,5 et 2. Selon le caractère hydrophobe du soluté, une faible
milieu aqueux. quantité de méthanol est quelquefois ajoutée à la phase aqueuse
Les éthers-couronnes sont des polyéthers cycliques connus pour afin de diminuer la rétention.
leurs propriétés complexantes vis-à-vis des cations métalliques Phase supercritique
alcalins et des sels d’ammonium et d’alkylammonium [87]. La chira- Les cyclodextrines ont été mises en œuvre avec succès en CPS
lité est introduite par incorporation de deux motifs binaphtyle qui bien que, comme nous venons de le voir, ces phases ne soient pas,
présentent une stéréoisomérie conformationnelle de torsion (atro- a priori, adaptées à la séparation d’énantiomères en phase normale.
poisomérie). Cette utilisation est cependant rendue possible par le fait que la
molécule de dioxyde de carbone a, d’une part, un moment dipolaire
4.2.4.2 Mécanisme de reconnaissance chirale induit, ce qui lui confère une polarité supérieure à l’hexane et,
d’autre part, un volume molaire plus faible, ce qui l’empêche de blo-
La figure 15 représente, de façon schématique, les deux étapes quer irréversiblement les cavités chirales hydrophobes des cyclo-
essentielles des séparations avec les cyclodextrines non modifiées : dextrines. De façon générale, la sélectivité est très supérieure à celle

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tique. La γ-cyclodextrine convient bien aux molécules possédant des

substituants très volumineux du type phénobarbital. Enfin, l’α-
cyclodextrine est utilisée de préférence pour des molécules plus
petites possédant par exemple un seul noyau aromatique ou une
chaîne aliphatique courte. Leur mise en œuvre avec le CO2 supercri-
tique permet d’obtenir des sélectivités particulières, et partant,
d’étendre leur domaine d’applications : la CPS et la CPL à polarité de
phases inversée sont donc deux techniques chromatographiques
complémentaires [90].
Les cyclodextrines ne sont pas utilisées, du fait de leur faible
capacité, en chromatographie préparative.
Éthers-couronnes : les PSC dérivées d’éthers-couronnes offrent
des sélectivités élevées, mais leur domaine d’applications est prati-
quement limité aux acides aminés [91] et aux amino-alcools. Leur
coût élevé et les faibles résolutions observées ne permettent pas
leur utilisation en chromatographie préparative.

4.2.5 Groupe III : polymères naturels

et synthétiques

4.2.5.1 Sélecteurs chiraux

Le sélecteur chiral est ici un polymère présentant un grand nom-
bre de centres d’asymétrie et/ou de cavités asymétriques. Les poly-
mères sont utilisés soit à l’état brut, soit (le plus souvent) imprégnés
sur des gels de silice. On distingue, là encore, deux sous-groupes :
les polymères naturels (amylose et cellulose) [92] [93] [94] et les
polymères synthétiques (phases polyacrylamides et polymétha-
crylamides, le poly(triphénylméthylméthacrylate) (ou PTrMA) [95]
[96].

4.2.5.2 Mécanisme de reconnaissance chirale

La formation du complexe soluté-PSC est assurée par l’inclusion
du soluté dans les cavités chirales du réseau polymère de la PSC,
mais ici, les motifs chiraux vont le plus souvent interagir avec le
soluté de façon coopérative (interaction du soluté avec plusieurs
chaînes chirales ou cavités chirales formées entre plusieurs chaî-
nes). La grande complexité des mécanismes de reconnaissance chi-
rale rend très difficile l’établissement de règles structure/
Figure 16 – Comparaison des sélectivités obtenues pour la énantiosélectivité et donc le choix de la PSC la mieux adaptée.
séparation d’oxydes de phosphine 2 - naphtyl et O - anisyl racémiques
sur Cyclobond I en CPL et CPS 4.2.5.3 Choix de la phase mobile
Phase liquide
obtenue en phase liquide (figure 16), ce qui montre que les molécu- Polymères naturels : les phases mobiles mises en œuvre sont
les de CO2 sont facilement déplacées de l’intérieur de la cavité chi- généralement des mélanges binaires hexane-alcool. La structure de
rale par celles du soluté [90]. l’alcool peut modifier la sélectivité et souvent l’isopropanol est le
solvant polaire le plus sélectif [97]. Les solvants présentant un pou-
L’emploi de modificateurs polaires entraîne une diminution de la voir solvant notable envers la cellulose ou l’amylose comme le chlo-
rétention (compétition avec le soluté et augmentation de la solubi- roforme, le dichlorométhane, le 1,2-dichloroéthane, le tétrahydro-
lité des solutés). En ce qui concerne la sélectivité, tous les modifica- furanne, le dioxanne ou l’acétone sont à exclure.
teurs polaires utilisés (méthanol, éthanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-
propanol) sont sensiblement équivalents. Mentionnons que l’eau Polymères synthétiques : pour la PSC Chiraspher, le greffage chi-
diminue de façon importante la sélectivité et doit donc être pros- mique du polymère à la surface de la silice permet d’utiliser une
crite. large gamme de polarité. Les phases mobiles les plus utilisées sont
soit des mélanges ternaires hexane-dioxanne-isopropanol, soit des
mélanges binaires éther de méthyltertiobutyle-tétrahydrofuranne.
4.2.4.4 Applications Pour les phases Chiralpak OT(+) et OP(+), le méthanol est souvent le
Cyclodextrines : le domaine d’applications de chaque cyclodex- solvant de choix [98].
trine est déterminé par l’adéquation de la taille de la cavité chirale Phase supercritique
avec la taille du soluté à séparer. En effet, lorsque la taille de la Des différences notables de mécanismes de reconnaissance chi-
cavité est trop grande par rapport au soluté, celui-ci n’a plus d’orien- rale ont été mises en évidence entre la CPL et la CPS pour ce type de
tation privilégiée d’où une perte de sélectivité et, lorsqu’elle est trop PSC [99] [100]. Ces différences s’expliquent à la fois par des solvata-
petite, il n’y a pas d’inclusion. tions différentes des sites chiraux et par une modification de la géo-
Ainsi, la majorité des séparations a été réalisée avec la β-cyclo- métrie et/ou du volume des cavités chirales provoquant des
dextrine dont le diamètre interne de la cavité (0,78 nm) s’adapte variations importantes de la sélectivité. Comme en CPL, les alcools
bien aux noyaux naphtyle, biphényle, benzénique ou cyclohexyle ramifiés entraînent souvent une plus grande stéréosélectivité que
rencontrés dans de nombreuses molécules d’intérêt pharmaceu- leurs homologues linéaires.

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l’oxyde de trans-stilbène [103] et de l’acide abscisique [104] sur Chi-

ralcel OB et OD. Ces PSC sont utilisées également en chromatogra-
phie préparative pour laquelle des colonnes sont commercialisées.

— Phases polymères hélicoïdales : ces phases polymères (Chiral-

pak OT(+) et OP(+)) sont principalement utilisées pour la séparation
des atropoisomères et des racémates possédant un ou plusieurs
cycles ou noyaux aromatiques. On trouvera dans [18] de nombreu-
ses applications.

4.2.6 Groupe IV : protéines ou fragments

de protéines greffés sur gel de silice

4.2.6.1 Sélecteurs chiraux

Les PSC de ce groupe sont constituées par une protéine ou un

fragment de protéine greffé sur des gels de silice. Ces PSC sont
sélectives envers un grand nombre de principes actifs de médica-
ments, cela étant en relation avec les interactions entre médica-
ments et protéines dans les milieux biologiques. Quatre PSC sont
Figure 17 – Séparation des énantiomères actuellement commercialisées : l’albumine de sérum de bœuf (BSA)
de l’oxyde de trans-stilbène [105], l’acide α1-glycoprotéique (AGP) [106], l’ovomucoïde (OVM)
[107] et l’albumine de sérum humaine (HSA) [108].

4.2.6.2 Mécanisme de reconnaissance chirale

Les mécanismes de reconnaissance chirale sont très complexes,

car ces phases mettent en jeu un grand nombre d’interactions et,
surtout, l’inclusion de la molécule de soluté dans la structure de la
protéine qui dépend, entre autres, de la nature du contre-ion éven-
tuel et du solvant additionné à la phase éluante [109] [110].

4.2.6.3 Choix de la phase mobile

Ces phases stationnaires sont utilisées essentiellement en milieu

aqueux ou hydro-organique. La rétention et la sélectivité sont
gouvernées par les mêmes paramètres que ceux de la chromatogra-
phie de paires d’ions (pH, force ionique, concentration du contre-
ion, nature et concentration du solvant organique dans la phase
mobile) mais leur influence est moins prévisible surtout en ce qui
concerne la sélectivité. Les phases mobiles sont souvent consti-
tuées d’un mélange d’une solution aqueuse de tampon phosphate
de pH compris entre 4 et 7,5, de concentration comprise entre 10–3 et
10–2 mol · L–1, et d’un solvant polaire (méthanol, éthanol, propanol,
isopropanol plus rarement acétonitrile).

— Influence du pH : en règle générale, la rétention des solutés

cationiques diminue quand le pH de la phase mobile diminue, tan-
Figure 18 – Séparation des énantiomères de l’acide abscisique dis que celle des solutés anioniques augmente. La sélectivité ne
varie que faiblement en fonction du pH, ce qui montre que la majo-
rité des interactions électrostatiques ne sont pas stéréosélectives.
4.2.5.4 Applications
— Influence de la force ionique : l’influence de la force ionique de
— Phases dérivées de la cellulose : les phases stationnaires de la phase mobile sur la rétention des solutés ionisés est complexe :
type Chiralcel ont un vaste domaine d’applications aussi bien en elle modifie simultanément les interactions électrostatiques soluté-
chromatographie en phase liquide que supercritique. De façon protéine et les interactions hydrophobes. Les prévisions sont donc
générale, ces phases donnent des résolutions satisfaisantes avec les difficiles d’autant que souvent la rétention peut présenter un mini-
petites molécules rigides ou contenant un cycle (ou un noyau aro- mum en fonction de la force ionique de la phase mobile [111].
matique) et un des groupements polaires suivants : carbonyle, nitro,
nitrile, hydroxyle, sulfoxyde, carboxylique... près du centre d’asy- — Influence du contre-ion : des contre-ions anioniques et cationi-
métrie qui peut être varié (carbone, soufre, phosphore...). On trou- ques variés ont été utilisés en particulier avec l’acide α1-glycoprotéi-
vera de nombreux exemples d’applications dans [18] [101] et, en que (tableau 5) [112]. Les effets sur la rétention sont classiques (les
particulier, dans [102] qui propose un guide pour le choix de la contre-ions cationiques augmentent la rétention des solutés anioni-
nature de la PSC en fonction de la structure du racémate. Les ques et diminuent celles des solutés cationiques) mais les variations
figures 17 et 18 montrent respectivement, les séparations de de la sélectivité sont difficilement prévisibles.

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Tableau 5 – Contre-ions utilisés avec les silices greffées

acide α1 - glycoprotéique

N, N diméthyl octylamine
Amines tertiaires
Contre-ions cationiques

N, N diméthyl éthylamine

Bromure de
tétrapropylammonium
Ammonium
quaternaire
Bromure de
tétrabutylammonium

Acide aminé Acide diaminobutyrique

octanoïque
Contre-ions anioniques

Acides carboxyliques butyrique

décanoïque

Acide aminé Acide aspartique

Acide sulfamique Acide cyclohexylsulfamique

— Influence de la nature et de la concentration du solvant

organique : l’addition de solvants organiques à la phase éluante
entraîne généralement une diminution de la rétention et de la sélec-
tivité. Cependant, cette règle souffre de très nombreuses excep-
tions. Pour les amines tertiaires telles que la mépivacaïne, la
bupivacaïne (anesthésiques locaux), une augmentation de la teneur
en isopropanol de la phase mobile, de 1 à 8 % en volume, entraîne
une diminution de la rétention d’un facteur 17 tout en maintenant
rigoureusement constante la sélectivité [113]. Pour d’autres solutés,
l’addition de solvant organique (choisi en fonction de son caractère
accepteur-donneur de protons) permet d’accroître la sélectivité
comme l’illustre la figure 19 [114]. Ces effets peuvent s’expliquer par
le changement de la structure de la protéine, bien que des mesures
de dichroïsme circulaire n’aient montré aucune variation de la con- Figure 19 – Influence de la nature et de la concentration du solvant
formation de l’acide α1-glycoprotéique pour des teneurs en iso- organique contenu dans la phase mobile sur la sélectivité des
propanol aussi grandes que 40 %. Il est néanmoins raisonnable énantiomères du N-méthylphénobarbital (a ) et de la méphénytoïne (b )
d’admettre que des modifications, même très faibles, de la structure
de la protéine peuvent entraîner la création ou la disparition de sites
d’interaction qui affectent sa sélectivité. Dans ces conditions, on
conçoit qu’il soit difficile de prévoir l’influence de l’addition d’un sol- 5. Conclusion
vant organique dans la phase éluante ; malgré cela, l’optimisation
de ce paramètre ne doit pas être négligée car il permet, bien sou-
vent, d’aboutir à la séparation recherchée. La multiplicité des PSC commercialisées est à la fois un handicap
(choix difficile) et une force (possibilité de résoudre tous les problè-
mes). Il n’existe pas de règle simple de choix d’une PSC, d’autant
4.2.6.4 Applications que celui-ci est rarement univoque. On peut cependant proposer
une stratégie de séparation fondée sur la structure du racémate
Les PSC protéiques ont un vaste domaine d’applications, en parti- (nombre et polarité des groupements fonctionnels près de son cen-
culier pour l’étude du métabolisme des médicaments dans les tre d’asymétrie, encombrement stérique et flexibilité conformation-
milieux biologiques (plasma, urine) qui sont parfaitement compati- nelle) [116] (figure 19). Cependant, celle-ci n’est pas le paramètre
bles avec les phases mobiles aqueuses ou hydroorganiques mises unique à considérer. En effet, l’origine du racémate, la possibilité de
en œuvre avec ce type de phases chirales [18] [112] [115]. Ces phases le modifier avec un réactif achiral (pour introduire un site d’interac-
ne sont pas utilisées en chromatographie préparative car leur capa- tion supplémentaire ou améliorer sa détection) ou chiral (formation
cité est trop faible. précolonne de diastéréoisomères), le but de la séparation (analy-

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tique ou semi-préparative) sont également des facteurs importants CHIRBASE permet de rechercher et de trier les structures molécu-
à considérer. D’autres paramètres peuvent également être pris en laires 2D des solutés et des phases stationnaires chirales parmi les
compte, par exemple le prix de la phase peut parfois inciter l’utilisa- 40 000 séparations enregistrées aujourd’hui. Cette base de données
teur à modifier son soluté pour l’adapter à une PSC de type IA par peut être installée sur un PC (Windows 95 ou 3.1, logiciel ISIS/Base)
exemple. Le choix de la PSC la mieux adaptée à un type de racémate ou sur un serveur (VAX/VMS, Silicon Graphics utilisant le logiciel
ou de mélange racémique peut aussi être réalisé en consultant la ISIS/Host). Son extension à la CPG a été développée par B. Koppen-
banque de données CHIRBASE développée par C. Roussel et P. Piras hoefer et U. Trettin à l’Université de Tübingen [120].
[117] [119] pour la CPL et la CPS.
CHIRBASE est une base de données moléculaires pour le déve-
loppement de méthodes d’analyses et de préparations des énantio-
mères par chromatographie en phases liquide et supercritique.

Figure 20 – Guide de sélection des phases stationnaires chirales

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