Mardi, le 05 Octobre 2021

UNIVERSITE DE LOME
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE PHYSIOLOGIE
ANIMALE
ANNEE ACADEMIQUE : 2020-2021
UE BCH 211 : TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE STRUCTURALE

NOM PRENOMS N° CARTE

AKUE-GOEH N’BOUEKE JEANNE CHRISTEL 162603

ADOLE

TCHAGODOMOU SADATE 457991

INTRODUCTION
Les acides aminés sont à la base de la constitution des protéines possédant à la fois une
fonction amine (-NH2), une fonction carboxyle (-COOH) et une partie variable appelé radical
qui change d’un acide aminé à un autre. Après hydrolyse d’une protéine, le fractionnement ou
la séparation des acides aminés dans un mélange peut se réaliser par chromatographie ou par
électrophorèse. La chromatographie, est méthode d’analyse physico-chimique qui sépare les
composants d’un mélange (solutés) par entrainement au moyen d’une phase mobile (liquide
ou gaz) le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré) partition
sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de
rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).
Notre manipulation (TP) du jour, est porté sur la chromatographie sur papier des acides
aminés et de la détermination du pHi de la Caséine.
I- CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
1- But
Le but de cette manipulation consiste à la séparation des acides aminés par
chromatographie sur papier, la détermination du pHi des rapports frontaux et la
détermination des différents acides aminés composant le mélange homogène.
2- Principe
La chromatographie sur papier permet de séparer et d’identifié des espèces chimiques
d’un mélange. Elle est basée sur leur différence d’affinité pour deux phases : la phase
stationnaire ou phase fixe et la phase mobile ou phase éluant constituée d’un solvant ou
d’un mélange de solvant. Les papiers de chromatographie sont constitués de fibre de
cellulose disposées parallèlement. Ces fibres de cellulose sont imbibées d’eau qui
constitue la phase fixe ; le solvant mobile (mélange développant) se déplace le long de
ces « colonnes aqueuses » en y cédant et en y reprenant, par équilibres successifs, la ou
les substances à chromatographier. Si une substance S1est très soluble dans l’eau et très
peu soluble dans le solvant utilisé comme phase mobile, elle se déplacera très peu par
rapport à son point de départ. Si par contre, une substance S2 est très peu soluble dans
l’eau et très soluble dans le solvant, elle aura tendance à migrer avec le front du solvant.
Les molécules de S2 restent en quelque sorte pus longtemps dans l’eau que celle de S1
d’où le retard quelles prennent au fur et à mesure de la progression du solvant. Il en
résulte une séparation des deux substances, ce qui est le but de la chromatographie. Il est
possible de séparer ainsi plusieurs dizaines de substances placées dans un même
mélange.
3- Protocol expérimental
Sur une feuille de papier WHATMAN N°1, la séparation des acides aminés par
chromatographie de partage est réalisée. On évalue le nombre de gouttes nécessaires
pour obtenir une bonne séparation chromatographique en réalisant un essai sur un papier
à essai sur lequel est représenté les intersections de 1 à 5. A la première intersection on
dépose une goutte d’un des acides aminés à notre disposition et à la deuxième
intersection on dépose deux gouttes et ainsi de suite jusqu’à cinq gouttes à la dernière
intersection. Après dépôt, on détermine l’intersection à laquelle le dépôt a un diamètre
inférieur ou égale à 4mm. Et dans ce cas précis c’est le dépôt de 1goutte de la première
intersection. Donc dans la suite de l’expérience chaque dépôt correspondra à une goutte.
 Préparation du solvant
Le volume total du solvant est de 100ml et est réparti comme suit : 40ml de
butanol ; 10ml d’acide acétique concentré et 50ml d’eau distillée.
 Préparation du chromatogramme
A 2.5cm du bord inférieur du papier, nous avons tracé finiment une ligne droite à
l’aide d’un crayon et avons marqué sur la ligne, 6 croix équidistantes (repère de
dépôts) et avons indiqué lys pour la lysine, leu pour leucine et Mel pour le
mélange d’acide aminé (voir chromatogramme).
A l’aide d’un tube capillaire, on dépose au niveau d’un repère une goutte de la
solution correspondante à ce qui est inscrit en dessus du repère. Pour chaque
dépôt, on a utilisé une pipette paster appropriée et par suite on a séché les dépôts
par un séchoir à air chaud après chaque dépôt.
A l’aide d’un scotch soutenant le papier par le bord supérieur, on a introduit le
papier dans la cuve de chromatographie et on a fermé la cuve en laissant le papier
dans le solvant pendant 1h30min. puis on a retiré le papier en marquant le front
de migration à l’aide d’un crayon. Ensuite on a séché complètement le papier à
l’aide du séchoir. Et on recouvre le tout avec la solution de ninhydrine dans le
sens de la migration et on a séché de nouveau à air chaud pendant environ 5min,
ou jusqu’à ce que les tâches apparaissent.
A la fin on a entouré chaque spot avec un crayon à papier

4. Résultats
a. Observation
Sur le chromatogramme on a constaté une migration de lysine, leucine
et le Mélange.
 Par rapport à la ligne droite on trace 2.5cm du bord inférieur, on
observe que la leucine en coloration violette est plus distante que la
lysine en coloration violette. Au niveau du mélange, on observe 3
spots dont les deux des extrémités sont couleurs violettes et
l’intermédiaire de couleur jaune. Le spot le plus bas du mélange(M1)
coïncide avec la lysine, le spot le plus haut du mélange M3 coïncide
avec la Leucine et spot M2 de couleur jaune est intermédiaire aux
deux autres.
b. Détermination rapport frontal de chaque acide aminé.

l
Rf ¿
L

Rf = rapport frontal
l =est la distance parcourue par le composé par rapport la ligne tracé à 2.5 cm du bord
inférieur
L = est la distance parcourue par le solvant par rapport à la ligne droite tracée à 2.5cm du bord
inférieur
Moyenne de distance parcourue par les composés

l ( dépôt 1 )+l ( dépôt 2 )

L¿
2

0.8+0.8 5+5. 1
l Lysine = =0.8 cm l Leucine = =5.05 cm
2 2
0.8+ 0.9 2.7+ 2.7 5.3+5.6
l M 1= =0.85Cm lM 2 = =2.7 cm lM 3 = =5.45
2 2 2

Tableau donnant le rapport frontal de chaque acide aminé

Acides aminés L (cm) l (cm) l
Rf =
L
Lysine 8.6 0.8 0.09
Leucine 8.6 5.05 0.59
Mélange M1 8.6 0.85 0.1
M2 8.6 2.7 0.31
M3 8.6 5.45 0.63

c - Interprétation des résultats

La ninhydrine colore tous les acides aminés en violet par formation de la pourpre de
Ruhemann sauf la proline et l’hydroxyproline qui sont colorés en jaune. Le rapport frontal est
caractéristique d’un composé donné dans un mélange donné. La lysine et leucine ayant
respectivement comme rapport frontal 0.09 et 0.59. Le rapport frontal de la lysine est inférieur
à celui de leucine ce qui s’explique par le fait que la leucine migre plus vite que la lysine. Au
niveau du mélange le spot 1 à une coloration violette et surcroit sensiblement le même rapport
frontal que celui de lysine d’où, dans le mélange d’acide aminé M1 est la lysine.
Parallèlement on peut déduire que le spot 3 du mélange de même couleur est sensiblement de
même rapport frontal que la leucine, le spot M3 est la leucine. Le spot 2 ou acide aminé M2
ne correspond ni par la couleur « jaune » ni par le rapport frontal « Rf » à aucun des deux
acides aminés connues sur le chromatogramme (lysine et leucine). Sachant que la ninhydrine
ne réagit qu’avec les acides possédant une fonction amine libre et carboxyle libre d’où il ne
peut être que la proline ou l’hydroxyproline qui effectivement ne possèdent pas de fonction et
carboxyle libre puis se colore aussi en jaune en présence de la ninhydrine à 440 nm. La
proline par sa structure (en présence de la ninhydrine donnera autre chose que la pourpre de
Ruheman d’où sa couleur jaune.
5- Réponse aux questions
 En prenant pour exemple la leucine et lysine, quels sont les facteurs différenciants
leurs migrations
 La masse molaire : plus la masse molaire de l’acide est faible, plus il migre vite.
Dans ce cas la leucine à pour masse molaire 131g/mol et la lysine 146g/mol d’où
la leucine migre plus vite que la lysine.
 La solubilité : tout dépend du coefficient de partage des composés dans deux
solvants, c’est-à-dire de leur affinité pour le solvant dont l’un constitue la phase
stationnaire car elle reste immobile et l’autre, phase mobile car elle remonte le
long du papier de chromatographie.
 Le rapport frontal : un acide aminé ayant un rapport plus grand (leucine) à
tendance à migrer plus vite que celui ayant un rapport frotta plus petit (lysine)
 La nature de l’acide aminé : un acide aminé aliphatique migre plus vite que celui
non aliphatique ou basique.
 La polarité d’un acide aminé : dépend de la structure de ses chaînes latérales. La
molécule sera plus polaire si la déférence d’électronégativité entre les atomes est
plus grande.

 Quel est le devenir du rapport frontal de chaque acide aminé étudiés dans un mélange
Le rapport frontal de la lysine et de la leucine dans le mélange est légèrement supérieur à ceux
n’étant pas dans le mélange. Ceci serait due aux interactions régnantes entres les acides
aminés présent dans le mélange où suite à une erreur de dépôt.
II- Détermination du pHi de la Caséine
La caséine est une substance albuminoïde blanche contenue dans le lait.
Le pHi ou pH isoélectrique, est le pH pour lequel la charge nette de la molécule est nulle et ne
migre plus.
1- Principe
Il est basé sur la recherche du minimum de solubilité d’une solution de caséine soumise à
différents pH dans le but de déterminer son pHi.
 2- Technique et résultat
a- Préparation de la caséine dans l’acétate de sodium N/10
On introduit 0,5 g de caséine dans un ballon jaugé de 100 ml. En suite on
ajoute environs 40 ml d’eau distillée et 10ml de soude 1,0N. Après la solubilité
complète, on ajoute 10 ml d’acide éthanoïque (CH3-COOH 1,0N) puis on complète à
100 ml avec de l’eau distillée et faire le mélange. On a obtenu enfin une solution de
caséine dans l’acétate de sodium N/10.
b- Préparation de 9 tubes à essai – résultat – observation
On ajoute dans chaque tube 1 ml de la solution de caséine et on agite.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Eau 8.4 7.75 8.75 8.50 8.0 7 5.0 1.0 7.4
Distillé
e
(mal)
Acide 0.6 1.25
N/100
(ml)
Acide 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
N/10
(ml)
Acide 1.6
N (ml)
pH 5.9 5.6 5.3 5.0 4.7 4.4 4.1 3.8 3.5
Aspect
des
tubes Trouble Peu Clair Trouble Trouble Trouble Trouble Trouble Trouble
après le Trouble
mélang
e
Aspect Sembla
des nt de
tubes Flocula floculat Pas de Flocula Semblant de Floculation Floculation Pas de floculation
après tion ion flocul tion floculation maximum maximum
20 ation
minutes

c- Interprétation
Après 20 minutes les tubes N°1&4 ; N°6 et N°7 présentent une floculation nette. Le
maximum de floculation est observé dans les tubes N°6&7. Ces tubes ont pour bilan un pH =
4,25 on peut dire que la caséine a un pHi d’environ 4,25. Grâce aux charges positives de
l’acide libérant des ions H+ et les charges négatives des micelles (agrégats de plusieurs
caséines), la caséine est neutralisée.
L’acide va déshydrater la micelle, ces micelles vont donc se rapprocher (On parle de
Coagulation acide). Elles se soudent entre elles avec des liaisons fortes et irréversibles. Ces
liaisons sont le résultat d’interactions hydrophobes contenant dans ce réseau de globules
gras, des vitamines, du calcium, etc... On note également que le sel diminue les répulsions
électrostatiques (présence des ions sodium). Les particules peuvent donc entrer en contact, ce
qui donne lieu à la floculation et au mieux à la coagulation. La floculation est un
rassemblement sous forme de petits flocons des particules d’une suspension colloïdale. Ce
sont donc dans notre cas le rassemblement des micelles de caséine.
 CONCLUSION

La chromatographie permet la séparation des constituants d’un mélange. Pour un éluant et

un support donné, une espèce chimique migre de la même façon qu’elle soit pure ou dans
mélange. En effet, une espèce chimique très soluble dans l’éluant migre beaucoup plus vite
(leucine) qu’une substance peu soluble (lysine). De ce fait, les espèces chimiques étant
entraînées à des vitesses différentes peuvent être séparées. C’est aussi une technique
d’analyse qui permet d’identifier les espèces chimiques présentes dans un mélange.
En définitive, notre manipulation est atteinte puis que d’une part, nous avons pu séparer et
identifier les acides aminés contenues dans un mélange grâce à l’action de la Ninhydrine puis
par comparaison des rapports frontaux. Certains facteurs interviennent dans la migration de
ces acides aminés ; et d’autre part, l’observation du maximum de floculation a permis de
déterminer le pHi (pH isoélectrique) de la caséine.