UNIVERSITE DE LIMOGES

FACULTE DE MEDECINE

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ANNEE 2011 THESE N°

APPLICATION DES EXIGENCES TECHNIQUES DE LA NORME NF EN ISO 15189

AU SECTEUR DE PARASITOLOGIE DIRECTE DU C.H.U. DE LIMOGES

THESE
POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE
obtenu après soutenance du

MEMOIRE
du Diplôme d’Etudes Spécialisées de Biologie Médicale

présentée et soutenue publiquement : le 06 mai 2011

PAR

Jean-Philippe COLLET

né le 06 mai 1980, à Nice.

EXAMINATEURS DE LA THESE
Mme le Professeur ALAIN Sophie ....................................................... Président
Mme le Professeur DARDÉ Marie-Laure ............................................. Juge
M. le Professeur DREYFUSS Gilles .................................................... Juge
M. le Docteur BOUTEILLE Bernard .................................................. Juge
Mme le Docteur ROQUES Christine .................................................... Membre invité
DOYEN DE LA FACULTE: Monsieur le Professeur VALLEIX Denis

ASSESSEURS: Monsieur le Professeur LASKAR Marc

Monsieur le Professeur MOREAU Jean-Jacques
Monsieur le Professeur PREUX Pierre-Marie

PROFESSEURS DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS:

* C.S = Chef de Service

ACHARD Jean-Michel PHYSIOLOGIE

ADENIS Jean-Paul (C.S) OPHTALMOLOGIE
ALAIN Sophie BACTERIOLOGIE, VIROLOGIE
ALDIGIER Jean-Claude (C.S) NEPHROLOGIE
ARCHAMBEAUD-MOUVEROUX Françoise (C.S) MEDECINE INTERNE
ARNAUD Jean-Paul (C.S) CHIRURGIE ORTHOPEDIQUE ET TRAUMATOLOGIQUE
AUBARD Yves (C.S) GYNECOLOGIE-OBSTETRIQUE
BEAULIEU Pierre ANESTHESIOLOGIE et REANIMATION CHIRURGICALE
BEDANE Christophe DERMATOLOGIE-VENEREOLOGIE
BERTIN Philippe (C.S) THERAPEUTIQUE
BESSEDE Jean-Pierre (C.S) OTO-RHINO-LARYNGOLOGIE
BONNAUD François PNEUMOLOGIE
BONNETBLANC Jean-Marie (C.S.) DERMATOLOGIE-VENEREOLOGIE
BORDESSOULE Dominique (C.S) HEMATOLOGIE
CHARISSOUX Jean-Louis CHIRURGIE ORTHOPEDIQUE ET TRAUMATOLOGIQUE
CLAVERE Pierre (C.S) RADIOTHERAPIE
CLEMENT Jean-Pierre (C.S) PSYCHIATRIE ADULTES
COGNE Michel (C.S) IMMUNOLOGIE
COLOMBEAU Pierre UROLOGIE
CORNU Elisabeth CHIRURGIE THORACIQUE ET CARDIO-VASCULAIRE
COURATIER Philippe NEUROLOGIE
DANTOINE Thierry (C.S) GERIATRIE ET BIOLOGIE DU VIEILLISSEMENT
DARDE Marie-Laure (C.S) PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE
DAVIET Jean-Christophe MEDECINE PHYSIQUE ET DE READAPTATION
DE LUMLEY WOODYEAR Lionel PEDIATRIE
DENIS François (Sur 31/08/2011) BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE
DESPORT Jean-Claude NUTRITION
DRUET-CABANAC Michel (C.S) MEDECINE ET SANTE DU TRAVAIL
DUMAS Jean-Philippe (C.S) UROLOGIE
DUMONT Daniel (Sur 31/08/2012) MEDECINE ET SANTE AU TRAVAIL
ESSIG Marie NEPHROLOGIE
FEISS Pierre (Sur 31.08.2013) ANESTHESIOLOGIE ET REANIMATION CHIRURGICALE
FEUILLARD Jean (C.S) HEMATOLOGIE
FOURCADE Laurent CHIRURGIE INFANTILE
GAINANT Alain (C.S) CHIRURGIE DIGESTIVE
GAROUX Roger (C.S) PEDOPSYCHIATRIE
GASTINNE Hervé (C.S) (Retraite au 04.10.10) REANIMATION MEDICALE
GUIGONIS Vincent PEDIATRIE
JACCARD Arnaud HEMATOLOGIE
JAUBERTEAU-MARCHAN Marie-Odile IMMUNOLOGIE
LABROUSSE François (C.S) ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUE
LACROIX Philippe MEDECINE VASCULAIRE
LASKAR Marc (C.S) CHIRURGIE THORACIQUE ET CARDIO-VASCULAIRE
LIENHARDT-ROUSSIE Anne (CS) PEDIATRIE
MABIT Christian ANATOMIE
MAGY Laurent NEUROLOGIE
MARQUET Pierre PHARMACOLOGIE FONDAMENTALE
MATHONNET Muriel CHIRURGIE DIGESTIVE
MAUBON Antoine RADIOLOGIE ET IMAGERIE MEDICALE
MELLONI Boris (C.S) PNEUMOLOGIE
MERLE Louis PHARMACOLOGIE CLINIQUE

2
MONTEIL Jacques (C.S) BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE
MOREAU Jean-Jacques (C.S) NEUROCHIRURGIE
MOULIES Dominique (C.S) (Sur. 31.08.2013) CHIRURGIE INFANTILE
MOUNAYER Charbel RADIOLOGIE ET IMAGERIE MEDICALE
NATHAN-DENIZOT Nathalie (C.S) ANESTHESIOLOGIE ET REANIMATION CHIRURGICALE
PARAF François ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUE
PLOY Marie-Cécile (C.S) BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE
PREUX Pierre-Marie EPIDEMIOLOGIE, ECONOMIE DE LA SANTE ET PREVENTION
ROBERT Pierre-Yves OPHTALMOLOGIE
SALLE Jean-Yves (C.S) MEDECINE PHYSIQUE ET READAPTATION
SAUTEREAU Denis (C.S) GASTRO-ENTEROLOGIE, HEPATOLOGIE
SAUVAGE Jean-Pierre (Sur 31/08/2011) OTO-RHINO-LARYNGOLOGIE
STURTZ Franck (C.S) BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE
TEISSIER-CLEMENT Marie-Pierre ENDOCRINOLOGIE, DIABETE ET MALADIES METABOLIQUES
TREVES Richard RHUMATOLOGIE
TUBIANA-MATHIEU Nicole (C.S) CANCEROLOGIE
VALLAT Jean-Michel (C.S) NEUROLOGIE
VALLEIX Denis (C.S) ANATOMIE – CHIRURGIE GENERALE
VANDROUX Jean-Claude (Sur 31/08/2011) BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE
VERGNENEGRE Alain (C.S) EPIDEMIOLOGIE-ECONOMIE DE LA SANTE et PREVENTION
VIDAL Elisabeth (C.S) MEDECINE INTERNE
VIGNON Philippe REANIMATION MEDICALE
VIROT Patrice (C.S) CARDIOLOGIE
WEINBRECK Pierre (C.S) MALADIES INFECTIEUSES
YARDIN Catherine (C.S) CYTOLOGIE ET HISTOLOGIE

MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES-PRATICIENS HOSPITALIERS

AJZENBERG Daniel PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE

ANTONINI Marie-Thérèse (C.S) PHYSIOLOGIE
BOURTHOUMIEU Sylvie CYTOLOGIE ET HISTOLOGIE
BOUTEILLE Bernard PARASITOLOGIE - MYCOLOGIE
CHABLE Hélène BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE
DURAND-FONTANIER Sylvaine ANATOMIE – CHIRURGIE DIGESTIVE
ESCLAIRE Françoise BIOLOGIE CELLULAIRE
FUNALOT Benoît BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE
HANTZ Sébastien BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE
LAROCHE Marie-Laure PHARMACOLOGIE CLINIQUE
LE GUYADER Alexandre CHIRURGIE THORACIQUE ET CARDIO-VASCULAIRE
MARIN Benoît EPIDEMIOLOGIE, ECONOMIE de la SANTE et PREVENTION
MOUNIER Marcelle BACTERIOLOGIE – VIROLOGIE – HYGIENE HOSPITALIERE
PICARD Nicolas PHARMACOLOGIE FONDAMENTALE
QUELVEN-BERTIN Isabelle BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE
TERRO Faraj BIOLOGIE CELLULAIRE
VERGNE-SALLE Pascale THERAPEUTIQUE
VINCENT François PHYSIOLOGIE

PRATICIEN HOSPITALIER UNIVERSITAIRE

CAIRE François NEUROCHIRURGIE

P.R.A.G.

GAUTIER Sylvie ANGLAIS

PROFESSEURS ASSOCIES A MI-TEMPS

BUCHON Daniel MÉDECINE GÉNÉRALE

BUISSON Jean-Gabriel MEDECINE GENERALE

MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE A MI-TEMPS

DUMOITIER Nathalie MEDECINE GENERALE

MENARD Dominique MEDECINE GENERALE
PREVOST Martine MEDECINE GENERALE

3
 REMERCIEMENTS

Au Professeur Sophie ALAIN,

PROFESSEUR DES UNIVERSITES-PRATICIEN HOSPITALIER

SERVICE DE BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE-HYGIENE DU CHU DE LIMOGES

Vous m’avez fait l’honneur de bien vouloir assurer la présidence de cette

thèse.

Je vous remercie pour toute l’attention que vous savez porter aux internes en
Biologie Médicale.

Veuillez trouver ici l’expression de ma sincère gratitude et de tout mon

respect.

4
Au Professeur Gilles DREYFUSS,

PROFESSEUR DES UNIVERSITES-FACULTE DE PHARMACIE DE LIMOGES

Je suis très sensible à l’honneur que vous me faites en acceptant de juger ce

travail.

Soyez persuadé de mon plus profond respect.

5
Au Professeur Marie-Laure DARDÉ,

PROFESSEUR DES UNIVERSITES-PRATICIEN HOSPITALIER

CHEF DU SERVICE DE PARASITOLOGIE-MYCOLOGIE DU CHU DE LIMOGES

Mes plus sincères remerciements pour la confiance que vous m’avez

accordée en acceptant d’être ma directrice de thèse.

Au cours de ces années, votre grande disponibilité, votre rigueur scientifique

et votre immense culture médicale m’ont permis de travailler dans les
meilleures conditions possibles.

Vos qualités professionnelles et humaines imposent l’admiration.

6
Au Docteur Bernard BOUTEILLE,

MAITRE DE CONFERENCE DES UNIVERSITES-PRATICIEN HOSPITALIER

SERVICE DE PARASITOLOGIE-MYCOLOGIE DU CHU DE LIMOGES

Merci de m’avoir épaulé tout au long de ce travail.

Vos connaissances et votre expérience hors du commun ont su répondre à

mes nombreuses sollicitations.

Trouvez ici le témoignage de ma respectueuse et sincère reconnaissance.

7
Au Docteur Christine ROQUES,

BIOQUALITICIENNE
SERVICE DE PARASITOLOGIE-MYCOLOGIE DU CHU TOULOUSE RANGUEIL

En acceptant de m’initier à l’univers de la qualité et en partageant vos

connaissances si précieuses, vous avez permis la réalisation de ce travail.

Votre bonne humeur et votre disponibilité laissent transparaître d’énormes

qualités humaines.

Merci infiniment.

8
Au Docteur Daniel AJZENBERG,

C’est un immense privilège d’avoir pu travailler à tes cotés, tes compétences

et tes qualités d’orateur ont su rendre mon apprentissage passionnant.

Merci pour ta bonne humeur.

A tous mes collègues internes,

Pour les chaleureux moments partagés ensemble.

A Annabelle, Hélène, Martine, Maryse, Michèle, Murielle et Valérie,

Merci d’avoir contribué à la réalisation de ce travail et de participer à sa

mise en application.

A Christine et Martine,

A tout le personnel hospitalier qui a participé de près ou de loin au bon

déroulement de mes années d’internat.

9
A mes parents,

Pour m’avoir permis d’être ce que je suis et m’avoir donné les armes
nécessaires à mon épanouissement. Vous êtes un exemple quotidien de
tolérance et de bonté. De simples mots ne peuvent suffire à vous témoigner la
profondeur de mon amour.

A mon frère Guillaume,

Rien ne peut remplacer tous ces moments de joie, d’amour, de complicité et

de solidarité.

Tu es pour moi un modèle et une source inépuisable d’inspiration.

Merci d’exister.

A ma sœur Nathalie,

Merci ma sœur pour ta générosité et ton sourire qui ont illuminé mon
enfance.

Tu es une grande sœur fantastique. Quel plaisir de te voir heureuse.

A mes neveux Marion, Clément et Ange,

Pour tous les moments de bonheur que vous nous apportez.

A ma grand-mère Joséphine et à la mémoire de mon grand-père Marc,

Pour ces merveilleux souvenirs d’enfance.

A René,

10
A mes beaux-parents Guy et Marie-Rafaëlla,

Pour votre immense soutien au cours de ces longues années d’études. La

confiance que vous m’avez accordée a une valeur inestimable. Soyez certains
de l’amour et du respect que j’éprouve à votre égard.

A Aldric,

Pour les moments précieux et enrichissants que nous avons partagés. Ta

force d’esprit et ton intelligence forcent l’admiration.

A Alalia,

A Vincent et Chloé,

Pour leur amitié à toute épreuve.

A Christophe, Didier,Marianne, Romain, Pierre-Alain et Youcef

Aux petits Louis et Arthur

11
A Lydia,

Pour ton amour, ta présence et ton soutien permanents depuis le premier jour
de notre rencontre.

Tu sais me comprendre, m’écouter et me rassurer lorsque je doute. La vie à

tes côtés est tous les jours plus intense, tu fais de moi un homme comblé.

Je suis fier que tu sois la mère de mes enfants et d’être uni à une aussi belle
personne que toi.

A mon fils Vincenzo,

Tu m’apprends ce qu’est la vie et me remplis de bonheur. Comment est-il

possible d’être aussi merveilleux ?

A Giovanni,

Nous t’attendons avec impatience.

12
 LISTE DES ABREVIATIONS

AFSSAPS Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé

ANAES Agence Nationale d’Accréditation et d’Evaluation en Santé
ANOFEL Association Française des Enseignants et Praticiens Hospitaliers Titulaires
de Parasitologie et de Mycologie Médicale
CATT Card Agglutination Trypanosomiasis Test
CDC Centers for Disease Control
CHU Centre Hospitalier Universitaire
CNR Centre National de Référence
Cofrac Comité français d’accréditation
EBV Virus d’Epstein-Barr
EDTA Acide éthylène diamine tétracétique
ELISA Enzyme-Linked ImmnoSorbent Assay
FR Facteur Rhumatoïde
GBEA Guide de Bonne Exécution des Analyses de Biologie Médicale
GE Goutte Epaisse
GLIMS General Laboratory Information Management System
GTA Guide Technique d’Accréditation
HRP Histidine Rich Protein
ICT Immunochromatographic Test
IFI Immunofluorescence Indirecte
mAECT Chromatographie par mini colonne échangeuse d’anions
M- Sujets non infectés
M+ Sujets infectés
MIF Merthiolate-Iode-Formol
MGG May-Grünwald-Giemsa
MQ Manuel Qualité
NF EN ISO Norme Française Européenne Internationale
OMS Organisation Mondiale de la Santé
PCR Polymerase Chain Reaction
PSM Poste de Sécurité Microbiologique
QBC Quantitative Buffy Coat
S- Recherches négatives
S+ Recherches positives
Se Sensibilité diagnostique
SIDA Syndrome de l’Immunodéficience Acquise
Sp Spécificité diagnostique
VAT Variant Antigen Type
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
WB Western Blot

13
 SOMMAIRE

REMERCIEMENTS ................................................................................................................... 4

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................. 13

SOMMAIRE ............................................................................................................................. 14

INTRODUCTION .................................................................................................................... 16

GENERALITES ....................................................................................................................... 19
1. LA NORME NF EN ISO 15189 ET LES GUIDES D’ACCREDITATION .............................................. 20

1.1 La Norme NF EN ISO 15189 ........................................................................................ 20

1.2 Les guides d’accréditation du Cofrac ............................................................................. 21
2. LES ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA NORME ........................................................................ 21
2.1 Organisation et management .......................................................................................... 21
2.2 Le personnel .................................................................................................................. 22
2.3 Maîtrise documentaire ................................................................................................... 22
2.4 Traçabilité ..................................................................................................................... 24
2.5 Identification et maîtrise des non-conformités ................................................................ 24
2.6 Validation des méthodes ................................................................................................ 24
2.7 Incertitude de mesure..................................................................................................... 27
2.8 Prestation de conseils..................................................................................................... 28
3. DEROULEMENT DE LA DEMARCHE D’ACCREDITATION ............................................................ 29
3.1 Entrée dans la démarche d’accréditation ........................................................................ 29
3.2 Relation avec les auditeurs............................................................................................. 30
3.3 Obtention de l’accréditation ........................................................................................... 31

APPLICATION DE LA NORME A LA PARASITOLOGIE DIRECTE DU CHU DE

LIMOGES ................................................................................................................................ 32
1. UN TRAVAIL QUI S’INSCRIT DANS UN PROJET HOSPITALIER ..................................................... 33
2. LES SPECIFICITES DE LA PARASITOLOGIE DIRECTE FACE AUX EXIGENCES DE LA NORME........... 33
3. LES OBJECTIFS PRIORITAIRES................................................................................................. 34
3.1 Analyse du risque d’erreur en parasitologie pour cibler les actions prioritaires ............... 34
3.2 L’intérêt du patient : une priorité de notre démarche ...................................................... 36
3.3 La maîtrise de la documentation .................................................................................... 37
4. LES MOYENS UTILISES ........................................................................................................... 38

14
 4.1 Les documents Cofrac ................................................................................................... 38
4.2 Un modèle d’accréditation ............................................................................................. 38
4.3 Les ouvrages de référence .............................................................................................. 38

RESULTATS............................................................................................................................ 40
1. PRESTATIONS DE CONSEILS ................................................................................................... 41
1.1 Les exigences de la Norme ............................................................................................ 41
1.2 Des aides à la prescription pour répondre à cette exigence ............................................. 41
1.3 Avis et interprétations .................................................................................................... 46
2. EXIGENCES LIEES AU PERSONNEL .......................................................................................... 47
2.1 Pré-analytique ............................................................................................................... 47
2.2 Analytique ..................................................................................................................... 56
2.3 Post-analytique .............................................................................................................. 61
3. PROCEDURES TECHNIQUES .................................................................................................... 61
3.1 Le prélèvement est réalisé au laboratoire ....................................................................... 61
3.2 Le prélèvement n’est pas réalisé au laboratoire .............................................................. 75

DISCUSSION......................................................................................................................... 163
1. LES AVANCEES ................................................................................................................... 164
2. LES LIMITES ET LES PERSPECTIVES ....................................................................................... 165
2.1 Les mesures restant à mettre en place .......................................................................... 165
2.2 Le futur bâtiment de Biologie Médicale ....................................................................... 168

CONCLUSION....................................................................................................................... 171

BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................. 173

TABLE DES MATIERES....................................................................................................... 177

TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................ 182

TABLE DES TABLEAUX ..................................................................................................... 184

15
INTRODUCTION

16
 Le 23 septembre 2008, Michel Ballereau, conseiller général des établissements de santé,
propose au ministère de la Santé, de la Jeunesse et des Sports, un rapport pour un projet de
réforme de la Biologie Médicale. La réforme proposée prône la qualité de l’analyse tout en
considérant que le plus important est la réponse apportée à une question clinique, par un
examen approprié réalisé dans les meilleures conditions de qualité et de coût possibles. Il s’agit
de passer d’un système de « normes » réglementaires telles que la taille des locaux ou les
quotas de personnels, à un système qui repose sur l’accréditation vérifiant notamment la qualité
des résultats, la qualification permanente du personnel et la prise en compte des erreurs
constatées.

L’accréditation deviendrait alors obligatoire pour tous les laboratoires de Biologie

Médicale, sur la totalité des examens réalisés. Le 13 janvier 2010, l’Ordonnance d’application
n°2010-49 relative à la Biologie Médicale rend effective cette réforme, et accorde, aux
laboratoires existants, une période transitoire: 3 ans pour la première étape marquant la
volonté d’accréditation sur la totalité de l’activité et 6 ans pour l’accréditation obligatoire
effective. L’aménagement possible de certains points de cette Ordonnance, courant 2011, ne
devrait cependant pas remettre en cause ces directives.

Le comité français d’accréditation (Cofrac) est aujourd’hui l’unique organisme

d’accréditation reconnu et la norme de référence désignée est la Norme européenne NF EN
ISO 15189. L’examen de cette Norme montre une grande proximité avec l’actuel GBEA avec
toutefois un niveau d’exigence plus élevé. La Norme NF EN ISO 15189 sépare les exigences
en deux familles : les exigences relatives au management de la qualité (maîtrise des documents,
revue de contrats, identification et maîtrise des non-conformités, actions correctives et
préventives, audits internes…) et les exigences proprement techniques destinées à améliorer la
prise en charge des échantillons du prélèvement (pré-analytique) jusqu’au compte-rendu du
résultat (post-analytique).

Afin de s’inscrire dans une démarche d’accréditation, le service de Parasitologie-

Mycologie du CHU de Limoges a débuté un ensemble de remaniements et de mesures, en
référence aux exigences de la Norme. Le secteur de parasitologie directe présente de
nombreuses particularités à prendre en considération lors de l’application de certaines
exigences techniques. Pour exemple, la qualité du résultat rendu en parasitologie est largement
dépendante :

17
- De la qualité de l’ensemble de la phase pré-analytique incluant notamment la prescription
médicale, les conditions de prélèvement ainsi que la pertinence des informations cliniques
et épidémiologiques recueillies au lit du patient ; un effort tout particulier doit alors être
fait pour perfectionner cette étape.

- De la qualité de la formation des techniciens assurant la recherche directe des éléments

parasitaires par observation microscopique. Cette formation nécessite une expérience
pratique importante alors que les parasitoses sont des pathologies rarement rencontrées en
France métropolitaine. Il est donc difficile de mettre en place des mesures d’habilitation
sur des périodes courtes (cas des internes ou du personnel remplaçant).

Concernant la majorité des parasitoses tropicales, la rareté des échantillons positifs

disponibles rend peu évidente la validation sur site des techniques et la mise en place de
contrôles internes de qualité. Pour ces techniques qui sont qualitatives pour la majorité d’entre
elles, l’emploi de réactifs de fabrication « maison » est peu adapté à une démarche de qualité.

Ce travail de thèse, détaille l’ensemble des actions menées au sein du secteur de

parasitologie directe, de novembre 2009 à mars 2011 ; elles ont toutes été réalisées dans le but
répondre de la manière la plus cohérente possible aux exigences techniques de la Norme NF
EN ISO 15189.

18
GENERALITES

19
1. LA NORME NF EN ISO 15189 ET LES GUIDES D’ACCREDITATION

1.1 LA NORME NF EN ISO 15189

Cette Norme internationale, fondée sur l’ISO/CEI 17025 et sur l’ISO 9001, fournit les
exigences de compétence et de qualité propres aux laboratoires d’analyses de Biologie
Médicale (1).

Elle est destinée à être utilisée par les laboratoires d’analyses de Biologie Médicale qui
élaborent leur système de management de la qualité et évaluent leur propre compétence ainsi
que par les organismes d’accréditation engagés dans des activités de confirmation ou de
reconnaissance de la compétence des laboratoires d’analyses de Biologie Médicale (1).

Cette Norme est divisée en deux parties majeures :

- Une partie qui intègre les exigences relatives au management et souvent appelée « partie
qualité ».

- Une partie « exigences techniques » correspondant au cœur du métier, c’est entre autre sur
elle que se fonde l’aptitude technique du laboratoire.

Tableau 1 : Exigences de la Norme NF EN ISO 15189

Exigences relatives au management Exigences techniques

1. Organisation et management 1. Personnel
2. Système de mangement de la qualité 2. Locaux et conditions environnementales
3. Maîtrise des documents 3. Matériel de laboratoire
4. Revue de contrats 4. Procédures pré analytiques
5. Analyses transmises à des laboratoires sous-traitants 5. Procédures analytiques
6. Services externes et approvisionnements 6. Assurer la qualité des procédures analytiques
7. Prestations de conseils 7. Procédures post analytiques
8. Traitement des réclamations 8. Compte rendu des résultats
9. Identification et maîtrise des non conformités
10. Actions correctives
11. Actions préventives
12. Amélioration continue
13. Enregistrements qualité et enregistrements techniques
14. Audits internes
15. Revue de direction

20
1.2 LES GUIDES D’ACCREDITATION DU COFRAC

L’application des exigences de cette Norme peut poser des problèmes pratiques surtout
pour un laboratoire qui débute une démarche de qualité et qui doit se familiariser avec un
« nouveau » vocabulaire. Les documents Cofrac LAB LABM Ref 02 : Exigences pour
l’accréditation des laboratoires d’analyses de biologie médicale selon la Norme NF EN ISO
15189 (2) et SH Ref 02 : Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des
laboratoires de biologie médicale (3) sont destinés à faciliter l’application de cette Norme et à
en faire ressortir des exigences prioritaires de manière concrète. La satisfaction des exigences
normatives et des dispositions législatives et réglementaires citées dans le document SH Ref 02
est la condition de l’accréditation ; leur non respect constitue un écart (3).

Le Cofrac met aussi à disposition des laboratoires un guide technique d’accréditation en

Parasitologie-Mycologie: le document LAB GTA 12 (4) qui définit certaines recommandations
spécifiques résultant de l’application de la Norme.

2. LES ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA NORME

2.1 ORGANISATION ET MANAGEMENT

La phase de sensibilisation du personnel au sein du laboratoire doit être initiée dès le

départ, de façon à ce que la démarche qualité soit comprise par l’ensemble des acteurs du
système (biologistes, internes, techniciens, secrétaires…) et que leur adhésion permette de
construire le système et de le faire vivre.

La définition des responsabilités est une priorité avec la nomination d’un responsable
d’assurance qualité qui doit avoir des compétences par une formation aux normes ISO et à
l’assurance qualité (1). Il doit être épaulé par l’ensemble du personnel ; des référents peuvent
être désignés dans chaque secteur et des réunions de concertations doivent être instituées pour
faire le point régulièrement sur les démarches mises en place et évaluer leur efficacité.

La politique et les objectifs du système de management de la qualité doivent être définis

dans une déclaration de politique de la qualité sous l’autorité du directeur du laboratoire et
figurer dans le manuel de qualité qui doit également décrire la structure de la documentation du
système qualité.

21
2.2 LE PERSONNEL

Un système qualité ne peut fonctionner que s’il repose sur du personnel impliqué et
motivé. La nécessité de formalisation de la qualification du personnel doit inciter à définir des
modalités d’habilitation à un poste déterminé et à mettre en place un parcours de formation. Le
laboratoire peut s’appuyer sur les formations externes (formation continue, congrès,
fournisseurs) ou internes (1) (2) (3).

2.3 MAITRISE DOCUMENTAIRE

Un des principes fondamentaux d'une bonne organisation du laboratoire est la mise en

place d’une architecture documentaire structurée. Cette notion de base de la qualité fait partie
intégrante des recommandations de la Norme NF EN ISO 15189 ; exigence 4.3.1. :

« Le laboratoire doit définir, documenter et mettre à jour les procédures de maîtrise de tous
les documents et informations (de sources internes et externes) qui constituent sa
documentation de la qualité [...] »

Le laboratoire doit donc établir et tenir à jour des procédures visant à maîtriser tous les
documents faisant partie de son système de management (produits en interne ou provenant de
sources externes). Un exemplaire de chacun de ces documents est archivé pour toute
consultation ultérieure et le directeur du laboratoire définit sa période de conservation.

Tout document est révisé et approuvé, par les personnes habilitées à le faire, avant sa
diffusion au personnel de laboratoire (Illustration 1) ; seules les versions autorisées des
documents appropriés doivent être disponibles sur les lieux où elles sont utilisées (1) (2).

Illustration 1 : Schéma du circuit classique d’un document produit en interne (d’après C. ROQUES)

22
 Le Manuel Qualité (MQ) décrit le système de management de la qualité dans le laboratoire
et la structure de la documentation de celui-ci. Il inclut ou fait référence aux procédures de
soutien, incluant les procédures techniques. Il met en relief la structure de la documentation du
système de management de la qualité (1). L’ensemble du personnel doit être formé à
l’utilisation et à l’application du Manuel Qualité et de tous les documents référencés (1).

Il constitue le sommet de la pyramide du système de documentation (Illustration 2).

Les procédures (procédures de soutien, procédures techniques) décrivent, selon les

situations rencontrées, l’ensemble des actions menées dans les domaines du pré-analytique, de
l’analytique ou du post-analytique, elles répondent aux questions : comment faire ? quand ?

Toutes ces procédures doivent se référer aux différents modes opératoires utilisés, ceux-ci
répondent aux questions : Où ? Selon quel procédé ?

Le Manuel Qualité, les procédures et les modes opératoires constituent des documents
descriptifs du laboratoire.

A ces éléments descriptifs s’ajoutent un ensemble de documents : les enregistrements

(prescriptions, fiches d’habilitation, diplômes, listes de travail, feuilles de paillasse…) qui
constituent des preuves des actions menées (base de la pyramide de l’Illustration 2) et dont la
durée de conservation d’au minimum 18 mois doit être déterminée par la direction du
laboratoire (2).

Illustration 2 : Schéma de la pyramide de gestion documentaire (d’après C. ROQUES)

23
2.4 TRAÇABILITE

La traçabilité est un élément incontournable de la démarche et contribue à la création

d’indicateurs. Il est essentiel de mettre en place des formulaires d’enregistrement, tant pour le
domaine qualité (fiches d’anomalies) que pour le domaine technique (traçabilité des réactifs,
fiches de stocks, prélèvements non conformes). Ainsi, la fiche d’anomalie permet de recenser
le dysfonctionnement constaté, l’action corrective réalisée et les actions préventives
envisagées. Celle-ci fait partie intégrante des outils à utiliser pour participer à l’amélioration
continue de la qualité. Cet effort de traçabilité nécessite une discipline au quotidien de
l’ensemble du personnel.

2.5 IDENTIFICATION ET MAITRISE DES NON-CONFORMITES

Le laboratoire doit mettre en place une politique et une procédure en cas de non-
conformité quelconque de ses analyses par rapport à ses procédures et aux exigences
convenues dans le cadre de son système de management de la qualité (1).

2.6 VALIDATION DES METHODES

Le respect des règles d’assurance qualité des laboratoires nécessite de procéder à la

validation des techniques en préalable à leur utilisation et à le justifier (1) (5).

Il est essentiel de démontrer que la méthode (généralement un couple analyseur/réactif)

fonctionne correctement dans les conditions opératoires du laboratoire et qu’elle donne des
résultats sûrs pour le patient. Pour cela, une vérification initiale et une vérification continue
sont requises (5).

Le document LAB GTA 04 (5) a pour but d’expliciter ce qui est entendu par les aspects de
« validation de méthodes », il constitue un guide pratique pour les laboratoires d’analyse de
Biologie Médicale.

Il en ressort que la vérification initiale d’une méthode est souvent la plus compliquée, elle
s’effectue en plusieurs étapes :

- Le biologiste doit initialement déterminer les critères de performance (paramètres) à

évaluer au moment de la vérification sur site en fonction du type de l’analyse (qualitative,
semi-quantitative ou quantitative) ainsi que les limites d’acceptabilité de ces critères. Le
choix de ces limites dépendra des recommandations de l’ANAES, de sociétés savantes et
des conférences consensus (5).

24
- Une vérification bibliographique est également indispensable, elle consiste à réaliser
l’étude des données du fournisseur ainsi qu’une synthèse des lectures bibliographiques
concernant la méthode à valider. Une synthèse critique de ces données devra être abordée
(5).

- Une étape de vérification sur site permettra ensuite d’évaluer, dans les conditions du
laboratoire, les critères de performance initialement fixés. La méthodologie et la
profondeur de cette vérification dépendront du type d’analyse et des possibilités
matérielles du laboratoire (5).

Pour les analyses quantitatives, fournissant un résultat chiffré en relation directe avec une
quantité ou une activité de l’analyte à mesurer, la vérification sur site devra couvrir de
nombreux paramètres : fidélité, justesse, corrélation, sensibilité entre autres, en se basant sur le
traitement statistique du suivi de contrôles de qualité internes et externes (5) (6).

Concernant les analyses qualitatives qui apportent une information sur la présence ou
l’absence de l’analyte, le nombre souvent insuffisant d’échantillons positifs disponibles rend
très compliquée l’évaluation de la méthode (5). La vérification sur site est alors plus réduite et
devra explorer principalement la sensibilité diagnostique et la corrélation avec une ou plusieurs
autres méthodes du laboratoire (Tableau 2) (5).

Le récent guide d’accréditation pour la validation des méthodes : SH GTA 04 (7) apporte
quelques précisions supplémentaires en distinguant les méthodes « fournisseurs » (portée
flexible standard A) dites adoptées, avec uniquement la nécessité d’une vérification réduite des
performances sur site et les méthodes adaptées ou développées en internes (portée flexible
étendue B) pour lesquelles la validation sur site de nombreux paramètres sera nécessaire.

Concernant les méthodes qualitatives, la spécificité et la sensibilité diagnostiques sont,

d’après ce guide, les paramètres essentiels à maîtriser. Pour cela, la comparaison des résultats
obtenus avec d’autres méthodes complémentaires ou des techniques de référence est conseillée
(7).

25
 Tableau 2 : Vérification initiale d’une technique qualitative, d’après LAB GTA 04 (5)

Paramètres à
Vérification
vérifier et/ou à Bibliographie
sur site
connaitre

Spécificité Oui Non

Sensibilité
Oui Oui
diagnostique
Contamination
entre
Oui Oui
échantillons (s’il
y a lieu)

Stabilité Oui Si besoin

Robustesse Oui Non

Corrélation avec
méthode de Oui Non
référence
Corrélation avec Oui Oui
méthode utilisée
au laboratoire (Si existe) (si possible)

Les résultats de la vérification doivent faire l’objet d’un document cohérent et clair, avec
une acceptation formelle de la validité opérationnelle des techniques. Ce document doit
comporter la présentation de la technique, la détermination des paramètres à vérifier, la
détermination des objectifs à atteindre, la compilation et le traitement statistique des données
obtenues et la décision quant à la validité opérationnelle de la technique (5) (7). Les
formulaires SH FORM 43 et SH FORM 44 prévus par le Cofrac peuvent servir de modèle de
présentation des résultats.

26
 Pour chaque analyse, une vérification continue doit également être mise en place et
s’appuie notamment sur l’utilisation, la gestion et le suivi de contrôles de qualité internes et
externes (5) (7).

2.7 INCERTITUDE DE MESURE

L’étude de l’incertitude est un indicateur de la qualité d’un résultat d’analyse.

L’incertitude de mesure est inhérente à tout processus de mesure. Son évaluation permet
d’accorder un niveau de confiance que l’on peut avoir dans le résultat rendu. Pour ce faire, quel
que soit le type d’analyse, le laboratoire devra identifier et lister tous les facteurs ayant
potentiellement une influence sur le résultat puis montrer, après analyse du risque, comment
sont maîtrisés les facteurs dont l’influence est jugée significative, de manière à minimiser les
erreurs (1) (2) (8). Pour établir la liste exhaustive de ces facteurs, le laboratoire doit s’appuyer
sur l’analyse de chaque étape de son processus (du pré- au post-analytique), par exemple à
partir de la règle des « 5M » (main d’œuvre, milieu, matériel, matière, méthode) (8) (Tableau
3).

L’étude de la criticité permet d’évaluer l’influence des différents facteurs d’incertitude mis
en évidence. Des mesures prioritaires pourront alors être instaurées pour minimiser le risque
d’erreur. Pour les analyses quantitatives, les données de validation de méthode, en particulier
celles relatives à la fidélité (répétabilité et reproductibilité) et à la justesse (biais), permettent,
grâce et des formules mathématiques, une approche de l’incertitude associée au résultat de
l’analyse (5).

27
 Tableau 3 : Identification des facteurs d’incertitude grâce à la règle des « 5M »

Pré-analytique Criticité
Main
Préleveur Préleveur externe 1/3/9
d’œuvre

Méthode Méthode de prélèvement utilisée 1/3/9

Conditions du
Milieu Type de tube Durée du transport Conservation 1/3/9
transport

Matériel Matériel utilisé 1/3/9

Matière Qualité de l’échantillon 1/3/9

Analytique Criticité
Main
Technicien Interne Biologiste 1/3/9
d’œuvre
Méthode Mode opératoire 1/3/9

Conditions Conditions de stockage des Conditions de stockage des

Milieu 1/3/9
ambiantes prélèvements réactifs

Matériel Pipette Automate Informatique 1/3/9

Matière Réactifs Echantillons 1/3/9

Post-analytique Criticité
Main
Opérateur réalisant les calculs 1/3/9
d’œuvre
Méthode Calculs, algorithmes, arrondis… 1/3/9

Milieu 1/3/9

Matériel Système informatique de laboratoire 1/3/9

Matière 1/3/9

2.8 PRESTATION DE CONSEILS

L’Ordonnance du 13 janvier 2010 a substantiellement modifié le rôle du biologiste

médical dans la prestation de soin au patient. La « prestation de conseils » de la Norme
devient une obligation à la phase pré-analytique comme à la phase post-analytique de
l’examen. Le conseil en matière de choix des examens de Biologie Médicale est alors une
obligation et des rencontres régulières avec le personnel médical sont recommandées (1). Le
biologiste doit modifier, si nécessaire, la prescription sur le fondement des éléments cliniques
28
 du patient et en fonction de la question posée par le prescripteur (3). De plus, le compte-rendu
d’examens doit être validé avec interprétation contextuelle et une communication appropriée
au prescripteur et au patient dans un délai compatible avec l’état de l’art.

3. DEROULEMENT DE LA DEMARCHE D’ACCREDITATION

3.1 ENTREE DANS LA DEMARCHE D’ACCREDITATION

Pour justifier son entrée effective dans une démarche d’accréditation, le laboratoire de
Biologie Médicale peut avoir recours, selon son choix, à deux options (A ou B) définies par
l’arrêté du 14 décembre 2010 (9).

3.1.1 Option A
En choisissant cette option, le laboratoire doit adresser au Cofrac, au plus tard le 31
octobre 2012, une demande d’accréditation partielle sur un ou plusieurs examens, de la phase
pré-analytique à la phase post-analytique. Cette demande est accompagnée d’un dossier
comprenant le formulaire de renseignements et le questionnaire d’autoévaluation (sur la
conformité du laboratoire vis-à-vis de la Norme). Ces documents sont disponibles sur le site
internet du Cofrac (10).

Après réception du dossier complet, le Cofrac adresse au laboratoire un document, à lui

retourner signé, décrivant la portée de demande d’accréditation. Dans les mois qui suivent, le
Cofrac effectue une visite d’évaluation lui permettant ou non de délivrer une accréditation
partielle au laboratoire.

Une fois titulaire de cette accréditation partielle et au plus tard le 31 mai 2013, le
laboratoire fait sa demande d’entrée effective dans la démarche d’accréditation en adressant au
Cofrac un dossier comportant obligatoirement:

- 3 vérifications de méthodes portant sur des méthodes qualitatives et quantitatives.

- La preuve de l’abonnement à des programmes d’évaluation externe de la qualité.

- Une description de l’activité du laboratoire qui n’entre pas dans sa portée d’accréditation
partielle.

- Un calendrier prévisionnel conduisant à une accréditation sur la totalité de son activité

avant le 1er Novembre 2016.

29
 La notification au laboratoire (par le Cofrac) de la décision constatant l’entrée effective dans la
démarche d’accréditation en constitue la preuve.

3.1.2 Option B
Cette option permet au laboratoire d’éviter la demande au Cofrac d’une accréditation
partielle. La demande de vérification d’entrée dans la démarche se fera donc au plus tard le 31
mai 2013, mais le dossier devra comporter en plus une attestation en cours de validité émanant
d’un organisme agréé, reconnu par la Haute Autorité de Santé pour l’évaluation des pratiques
en Biologie Médicale, avant le 1er janvier 2010 (9).

3.2 RELATION AVEC LES AUDITEURS

Après l’acceptation du dossier, le contact téléphonique et le mail sont les moyens de

correspondre avec le responsable Cofrac des dossiers (11). Le nombre d’auditeurs, leur nom, le
mois potentiel et le nombre de jours de la visite sont proposés (11).

3.2.1 Avant l’audit

Tous les auditeurs retenus (un auditeur qualiticien et un ou plusieurs auditeurs techniques)
entrent en relation avec le laboratoire pour obtenir des documents supplémentaires et décider
du planning lors de la visite. Celui-ci sera connu du laboratoire au minimum 15 jours avant la
visite (11).

3.2.2 Déroulement de l’audit

Après une réunion d’ouverture, l’auditeur qualiticien qui est en général le rapporteur de
l’audit s’intéresse essentiellement à la partie « management » de la Norme, il est en relation
avec le référent qualité, le chef de service ou le directeur de laboratoire et le cadre de santé
(11).

L’auditeur technique vérifie quant à lui le respect des exigences de la partie technique de
la Norme en contrôlant les phases pré-analytique, analytique et post-analytique.

Une réunion de clôture permet aux auditeurs de faire le bilan de la visite et de notifier les
écarts critiques ou non critiques. Un écart critique correspond à un dysfonctionnement qui peut
avoir un risque ou une conséquence sur la qualité du système par rapport à la Norme et devra
être corrigé avant la prochaine visite. Trop d’écarts critiques empêchent l’accréditation d’un
laboratoire. A la fin de cette réunion, les fiches d’écart sont signées par les deux parties (11).

30
3.2.3 Après la visite d’audit
Le laboratoire dispose de 15 jours pour proposer un plan d’amélioration aux auditeurs qui
devront à leur tour donner ou non leur accord sur les actions proposées.

Un rapport confidentiel de la visite est envoyé par les auditeurs au Cofrac et au

laboratoire ; il passera en commission d’expert et la réponse sera signifiée au laboratoire 4 à 5
mois après la visite des auditeurs (11).

3.3 OBTENTION DE L’ACCREDITATION

L’accréditation est délivrée par notification écrite du responsable de la section des

laboratoires ; un numéro d’accréditation est lié au logo Cofrac et à la mise en ligne de
l’accréditation du laboratoire sur le site du Cofrac. L’utilisation du logo est soumise à des
règles strictes (11).

Le laboratoire accrédité sera soumis à une surveillance régulière avec une première visite 1
an après puis tous les 15 mois, l’accréditation étant valable 4 ans (11).

31
 APPLICATION DE LA NORME A LA
PARASITOLOGIE DIRECTE DU CHU DE LIMOGES

32
1. UN TRAVAIL QUI S’INSCRIT DANS UN PROJET HOSPITALIER
La Norme NF EN ISO 15189 constitue le référentiel d’accréditation. Nous avons donc
choisi d’identifier, à partir de la lecture de ce document, toutes les exigences techniques pour
lesquelles le secteur de parasitologie directe du CHU de Limoges pouvait présenter des écarts,
en cherchant à cibler les éléments prioritaires.

Ce travail, bien que réalisé au sein d’un unique secteur, ne peut être productif que s’il
s’inscrit dans une dynamique de groupe et que les procédures mises en place sont connues et
appliquées par l’ensemble du personnel du service. A l’échelle du centre hospitalier
universitaire, la notion de travail d’équipe est également essentielle puisque l’ensemble des
laboratoires actuels de Biochimie, Hématologie, Immunologie, Bactériologie-Virologie-
Hygiène, Parasitologie-Mycologie et de Pharmacologie-Toxicologie seront considérés dans
l’avenir comme un unique et même laboratoire devant répondre aux attentes du Cofrac. Une
structure qualité a donc été mise en place pour fédérer les initiatives et donner un sens à
l’ensemble des démarches avec pour objectif d’atteindre un niveau « qualité » homogène sans
négliger les pratiques spécifiques de chaque site. La mise en place d’un système informatique
de gestion de la qualité est prévue pour septembre 2011 et chacun des sites devra disposer de
procédures et modes opératoires actualisés et approuvés pour que ce système de gestion
documentaire soit exploitable. La création d’un dossier d’accréditation du Pôle est fixée à
octobre 2012 ; l’objectif étant que le processus d’accréditation soit initié avant 2013, année du
déménagement des laboratoires dans un nouveau bâtiment du Pôle Biologie-Hygiène.

2. LES SPECIFICITES DE LA PARASITOLOGIE DIRECTE FACE AUX

EXIGENCES DE LA NORME

La particularité de la discipline de parasitologie nous a amené à réfléchir longuement aux

actions à mettre en œuvre pour répondre de la manière la plus cohérente possible aux exigences
de la Norme. En effet, les méthodes de référence font souvent appel à des techniques manuelles
d’enrichissement et/ou de coloration pour lesquelles l’emploi de réactifs « maison » parfois
toxiques est nécessaire. Les analyses réalisées sont de type qualitatif puisqu’elles s’appuient
sur l’identification morphologique de parasites ; on comprend alors l’importance pour le
personnel de bénéficier de procédures adaptées d’habilitation et de formation continue. La
faible incidence de certaines parasitoses en France métropolitaine rend difficile la mise en

33
 place de contrôles de qualité ainsi que la validation des méthodes à partir d’échantillons
positifs.

3. LES OBJECTIFS PRIORITAIRES

3.1 ANALYSE DU RISQUE D’ERREUR EN PARASITOLOGIE POUR CIBLER LES
ACTIONS PRIORITAIRES

Pour établir un plan d’action global des mesures à mettre en place au sein du secteur, nous
avons commencé par faire le bilan général de l’influence que peuvent avoir les différents
facteurs d’incertitude sur le résultat. Cette analyse du risque d’erreur, appliquée à la
parasitologie directe, nous a permis de cibler des actions prioritaires à mettre en place.

En affectant, d’après la règle des 5M, un score de 1, 3 ou 9 à chaque étape de l’analyse (1

= faible niveau d’influence, 3 = niveau intermédiaire et 9 = niveau élevé d’influence), nous
avons estimé l’influence sur le résultat (criticité) que peuvent avoir les différentes phases : pré-
analytique, analytique et post-analytique. L’influence maximale pour chaque phase est donc
de 45 (9 fois 5). Il est bien évident que le résultat de cette évaluation est variable en fonction du
parasite recherché et de la méthode utilisée, elle devra donc être réalisée pour chaque analyse.
Néanmoins, l’étude générale résumée dans le Tableau 4 constitue une première approche utile.
On s’aperçoit que les phases pré-analytique (27/45) et analytique (29/45) sont décisives, la
main d’œuvre et la méthode utilisée devant être maîtrisées. Nous avons donc décidé de cibler
nos actions prioritaires autour de la maîtrise de la formation du personnel préleveur et
technicien (habilitation, formation continue) et de la maîtrise des techniques utilisées au
laboratoire (révision des modes opératoires, validation des méthodes).

34
 Tableau 4 : Influence des facteurs d’incertitude en parasitologie directe

Pré-analytique Criticité
Main Prescripteur
Préleveur externe 3
d’œuvre Préleveur

Méthode Méthode de prélèvement utilisée 3

Conditions Durée
Type de
Milieu du du Conservation 9 27
tube
transport transport
Matériel Matériel utilisé 3

Matière Qualité de l’échantillon 9

Analytique Criticité
Main
Technicien Interne Biologiste 9
d’œuvre
Méthode Mode opératoire 9
Conditions de
Conditions
Milieu
ambiantes
stockage des Conditions de stockage des réactifs 1 29
prélèvements
Matériel Pipette Automate Informatique 1

Matière Réactifs Echantillons 9

Post-analytique Criticité
Main
Opérateur réalisant les calculs 9
d’œuvre
Méthode Calculs, algorithmes, arrondis… 1

Milieu 1 13
Matériel Système informatique de laboratoire 1

Matière 1

35
3.2 L’INTERET DU PATIENT : UNE PRIORITE DE NOTRE DEMARCHE

3.2.1 Le paludisme : l’urgence diagnostique vitale

L’urgence diagnostique et la gravité potentielle d’un accès palustre imposent une prise en
charge optimale de cette parasitose. En s’assurant que le prélèvement sanguin est traité à
n’importe quelle heure de la journée, dans les bonnes conditions et dans le délai le plus bref
possible, que les renseignements cliniques essentiels à l’approche diagnostique sont fournis,
que les méthodes de recherche du paludisme sont performantes (vérification sur site) et
réalisées par un personnel compétent et que le résultat est rendu au médecin prescripteur le
plus rapidement possible, le laboratoire augmente alors les chances de survie du patient en cas
d’accès palustre. Cette réflexion justifie la mise en place en priorité de mesures permettant
d’assurer la qualité du résultat.

3.2.2 La gale : une nuisance constituant un problème de Santé Publique

La gale représente un problème de Santé Publique, puisque cette parasitose très
contagieuse est à l’origine d’épidémies familiales ou de collectivité (maisons de retraites…).
Les 146 recherches de gale effectuées à Limoges en 2010 montrent que cette ectoparasitose est
d’actualité. Le diagnostic est le plus souvent clinique, orienté par un prurit très intense, mais la
mise en évidence de l’acarien constitue le seul diagnostic de certitude. Il existe néanmoins de
fréquents faux négatifs, notamment dans les formes pauci-parasitaires. En assurant un
prélèvement de qualité, le laboratoire permet d’authentifier des épidémies, de traiter et donc de
soulager les patients.

La mise en place de mesures permettant de maîtriser au maximum la phase pré-analytique

constitue un des points fondamentaux de ce travail.

3.2.3 La recherche de parasites dans les selles : principale activité du secteur

Avec environ 1000 recherches annuelles, la recherche de parasites dans les selles est
l’analyse qui représente la principale activité du secteur. Elle constitue un élément clé de la
démarche diagnostique et permet par un prélèvement simple et non invasif de mettre en
évidence de nombreux parasites intestinaux, ce qui implique une parfaite maîtrise de cet
examen.

L’étape pré-analytique est essentielle pour de nombreuses raisons :

- Les résultats ne sont interprétables que si la recherche est prescrite à plusieurs reprises et
en respectant certaines conditions.

36
 - Certains parasites comme les cryptosporidies sont recherchés et identifiés grâce à des
techniques spécifiques à réaliser en fonction des renseignements cliniques et/ou de l’aspect
des selles.

- En cas de suspicion clinique d’amoebose intestinale, l’acheminement des selles doit être
très rapide en raison de la fragilité des formes végétatives du protozoaire.

La qualité de la phase analytique est conditionnée par deux éléments majeurs : la

compétence du personnel et les performances des techniques de concentration et de coloration
utilisées. L’évaluation sur site de nos méthodes de recherche de parasites dans les selles est
donc également abordée au cours de ce travail.

Pour permettre au clinicien d’interpréter correctement le résultat rendu et de comprendre

les limites de celui-ci, nous avons jugé utile de mettre en place un système de commentaires
pré-établis, adaptés à chaque situation.

3.2.4 Les parasites pathogènes rares en France

La faible incidence de certaines parasitoses tropicales comme les schistosomoses ou les
filarioses ne justifie en aucun cas une démarche diagnostique moins solide.

Le rôle du laboratoire est, au contraire, primordial car leur diagnostic souvent difficile
permet au clinicien de débuter un traitement curatif adapté. Le diagnostic de phase dans la
trypanosomose humaine africaine est d’une importance pronostique et thérapeutique capitale.

Pour ces parasitoses, nous nous sommes attachés à améliorer au maximum la prise en
charge pré-analytique et la qualité des procédures appliquées. La vérification sur site des
performances des méthodes étant peu applicable, leur validation s’appuie essentiellement sur
une vérification bibliographique.

3.3 LA MAITRISE DE LA DOCUMENTATION

La maîtrise de la documentation étant une des exigences majeures de la Norme et une des
priorités de la cellule qualité du Pôle Biologie-Hygiène, un effort tout particulier a été fait au
cours de ce travail pour établir une architecture documentaire structurée. L’utilisation de
méthodes de coloration et de concentration des parasites souvent historiques a nécessité une
revue de littérature importante et une mise à jour des modes opératoires.

37
4. LES MOYENS UTILISES

4.1 LES DOCUMENTS COFRAC

Pour parvenir à satisfaire au maximum aux exigences de la Norme ISO EN 15189, nous
avons dans un premier temps cherché à identifier les exigences techniques pour lesquelles le
secteur de parasitologie directe présentait des écarts, en cherchant à cibler les éléments
prioritaires. Les documents LAB LABM Ref 02 et SH Ref 02 destinés à faciliter l’application
de la Norme et son utilisation par les évaluateurs (2) nous ont été d’une aide précieuse.
D’autres documents Cofrac comme le guide technique d’accréditation en parasitologie et
mycologie médicale (4) et le GTA 04 (5) nous ont ensuite permis de mettre en place des
mesures efficaces en tenant compte des spécificités de la discipline.

4.2 UN MODELE D’ACCREDITATION

Le laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Rangueil de Toulouse est accrédité

selon les Normes NF EN ISO 17025 en 2006 puis 15189 en 2010. Il constitue un modèle
d’accréditation prouvant ainsi qu’il est possible, en quelques années, de parvenir à instaurer
une véritable politique de qualité au sein du laboratoire, même lorsque la discipline fait appel à
des techniques manuelles souvent anciennes.

De nombreux échanges avec le Docteur Christine Roques, auditeur Cofrac et responsable

qualité de ce laboratoire, nous ont permis d’avoir un éclairage sur de nombreux points de la
Norme et de progresser dans les différentes étapes de prise en charge des échantillons.

Grâce à des avis éclairés et le contrôle de certains de nos échantillons par une PCR à
Toulouse, nous avons pu procéder à la validation de nos méthodes de recherche du paludisme
par une vérification sur site approfondie.

4.3 LES OUVRAGES DE REFERENCE

Afin d’établir une architecture documentaire structurée et pratique, de nombreuses

concertations avec Annabelle Audevard, technicienne référente qualité et les biologistes du
laboratoire ont été nécessaires.

Le Guide technique d’accréditation en parasitologie (4) recommande plusieurs ouvrages et

sites de référence pour l’élaboration des modes opératoires et des procédures analytiques.

38
Nous avons sélectionné les références suivantes :

- Anofel, Parasitoses et mycoses des régions tempérées et tropicales, Elsevier Masson, 2007.

- Y.J. Golvan et P. Ambroise-Thomas, Les nouvelles techniques en parasitologie et immuno-

parasitologie, Flammarion médecine-sciences, 1988.

- M. Gentilini, Diagnostic en Parasitologie, Masson, 1993.

- Cahiers BIOFORMA de Formation en Biologie Médicale N°11 : Amibes et flagellés

intestinaux.

- Cahiers BIOFORMA de Formation en Biologie Médicale N°23 : Parasites sanguins.

En fonction des parasitoses recherchées et des techniques utilisées, nous avons élargi nos
références bibliographiques à des publications récentes et aux recommandations spécifiques.

La qualité du résultat en parasitologie directe dépend fortement de l’aptitude du personnel

à reconnaître les éléments parasitaires au microscope. Nous avons alors décidé d’accompagner
nos modes opératoires de photographies permettant d’illustrer les principaux éléments
parasitaires recherchés en fonction de la méthode employée. Ces photographies sur lames ont
été réalisées, pour la majorité d’entre elles, à partir d’échantillons positifs du laboratoire.

Dans un but synthétique la partie suivante développera, en référence à la Norme et autres

documents Cofrac, les actions menées et les mesures mises en place au sein du secteur.

39
RESULTATS

40
1. PRESTATIONS DE CONSEILS

1.1 LES EXIGENCES DE LA NORME

Le chapitre 4.7 de la Norme porte sur la manière dont le laboratoire de Biologie Médicale
est amené à conseiller les prescripteurs :

« Les professionnels qualifiés pour cette tâche doivent conseiller en matière de choix des
analyses et d’utilisation des prestations du laboratoire, y compris la fréquence de prescription
et le type d’échantillon requis. Le cas échéant, l’interprétation des résultats des analyses doit
être fournie. »

De plus, l’Ordonnance du 13 janvier 2010 a substantiellement modifié le rôle du biologiste

médical dans la prestation de soins au patient. La « prestation de conseil » de la Norme devient
une obligation à la phase pré-analytique comme à la phase post-analytique de l’examen (3).

Cette exigence de prestation de conseil est reformulée dans le chapitre 5.4.3. de la Norme,
relatif aux informations que le laboratoire doit mettre à disposition du prescripteur dans son
manuel de prélèvement :

« Le manuel de prélèvement des échantillons primaires doit comprendre les éléments

suivants : …des informations données aux utilisateurs des prestations du laboratoire sur les
indications médicales et le choix approprié des méthodes disponibles … »

1.2 DES AIDES A LA PRESCRIPTION POUR REPONDRE A CETTE EXIGENCE

La cellule qualité du CHU de Limoges a mis en place un catalogue des analyses

directement consultable par tous les services reliés au réseau de l’hôpital sur Hermès. Des
mises au point sont régulièrement réalisées afin que ce catalogue soit en mesure de répondre
aux attentes de la Norme, un écart a notamment été mis en évidence concernant cette dernière
exigence.

Pour orienter le choix du prescripteur de la manière la plus pratique possible nous avons
donc décidé d’élaborer des fiches d’aide à la prescription destinées à être mises à disposition
du prescripteur sur Hermès et à servir de base documentaire au personnel du laboratoire
(interne et biologiste) lors d’un conseil formulé aux cliniciens.

D’après le document LAB GTA 12 (4), les procédures analytiques adoptées peuvent être
celles préconisées par le collège des enseignants et des praticiens hospitaliers titulaires de

41
 Parasitologie et Mycologie médicale, c’est donc en référence à la 7° édition du livre ANOFEL
(12) que nous avons crée ces logigrammes décisionnels.

Des aides à la prescription ont été mises au point pour orienter le prescripteur devant une
situation fréquente en parasitologie : l’hyperéosinophilie sanguine.

Pour certaines parasitoses spécifiques, souvent rares et nécessitant une prescription

adaptée, nous avons également mis au point des fiches d’aide à la prescription.

1.2.1 L’hyperéosinophilie sanguine : un motif fréquent de recherche

parasitaire
En pratique clinique, un des principaux éléments devant faire suspecter une parasitose est
sans nul doute l’hyperéosinophilie sanguine, surtout lorsqu’aucune autre étiologie évidente ne
lui est imputée. Ce point d’appel biologique peut être induit par tous les helminthes, avec une
intensité pouvant varier en fonction du parasite en cause, de la charge parasitaire, de la phase
du cycle, et de l’individu. Plus rarement sont en cause d’autres parasitoses comme les myiases
ou la gale (13).

Bien qu’efficace par son action cytolytique antihelmintique, l’hyperéosinophilie a, en

contre partie, un rôle néfaste sur les propres cellules de l’organisme (cœur, peau, intestin, rate)
ce qui incite à ne pas laisser persister longtemps une hyperéosinophilie (13). Faire le diagnostic
étiologique du (ou des) parasite(s) en cause est essentiel pour plusieurs raisons.

La mise en route d’un traitement adapté au(x) parasite(s) permet d’avoir une efficacité
ciblée ; contrairement à certaines idées reçues, les helminthes ne répondent pas tous de la
même façon à un traitement d’épreuve par le flubendazole et certaines molécules sont
spécifiquement recommandées dans certaines parasitoses (triclabendazole dans la distomatose,
praziquantel dans la schistosomose et la taeniase, ivermectine dans la loase et l’anguillulose)
(12).

De plus, débuter un traitement antiparasitaire sans connaitre l’organisme en cause peut

s’avérer dangereux pour le patient, c’est le cas dans la loase au cours de laquelle la lyse
parasitaire importante induite par le traitement peut être à l’origine de choc anaphylactique lors
de microfilarémies élevées (12).

Habituellement, l’éosinophilie est plus élevée pour les parasites effectuant un cycle
complexe dans l’organisme (toxocarose, trichine, douve…) que chez ceux restant dans le tube

42
digestif. Cependant, dans ce dernier cas, il peut y avoir des hyperéosinophilies élevées mais
fugaces (Taenia). Dans certains cas, comme l’anguillulose, où il existe un cycle d’auto-
infestation, l’éosinophilie est fluctuante, une remontée correspondant à un nouveau cycle
interne de migration tissulaire (13). Dans les parasitoses anciennes, l’éosinophilie peut revenir
à un taux subnormal, comme par exemple au cours des schistosomoses où le parasite se
recouvre de protéines de l’hôte et se « camoufle » sur le plan immunologique (13).

On comprend alors que l’importance de l’élévation du taux d’éosinophiles à un moment

donné peut orienter le prescripteur mais ne peut en aucun cas constituer un argument
diagnostique décisif.

L’enquête étiologique commence par un interrogatoire sur les pays visités par le patient,
même remontant à plusieurs années, certains parasites comme les anguillules persistant dans
l’organisme plusieurs dizaines d’années, et sur son mode vie (bain en eau douce,
consommation de crudités, poisson ou viande peu cuite…). En effet si certains parasites sont
cosmopolites, d’autres sont plus fréquents dans certaines régions, qu’il s’agisse de l’Europe
(échinococcose alvéolaire) ou des zones tropicales d’Afrique (schistosomose urinaire, loase…),
d’Amérique (cysticercose) ou d’Asie (distomatoses asiatiques) (13).

Les étiologies à rechercher en cas d’hyperéosinophilie ne sont donc pas les mêmes chez un
patient n’ayant jamais quitté la France métropolitaine que chez un patient ayant séjourné ou
vécu en zone intertropicale. De nombreuses analyses sont disponibles (recherche directe dans
les selles, dans les urines et dans le sang, sérologies), il parait alors indispensable que le
prescripteur puisse adopter au moment de la prescription, une démarche logique, reproductible
et orientée tout en respectant certaines conditions d’application.

C’est dans cette optique que nous avons établi des fiches d’aide à la prescription
intitulées :

- Hyperéosinophilie chez un patient n’ayant jamais quitté la France métropolitaine

(Illustration 3).

- Hyperéosinophilie chez un patient ayant séjourné en zone tropicale (Illustration 4).

43
 Illustration 3 : Aide à la prescription devant une hyperéosinophilie chez un autochtone

AIDE A LA PRESCRIPTION PARA F5 P RES 001 A

DEVANT UNE
HYPEREOSINOPHILIE CHEZ Date d’application:
UN PATIENT N’AYANT 01/02/2011
JAMAIS QUITTE LA FRANCE
METROPOLITAINE

Cette démarche diagnostique ne concerne que les étiologies parasitaires d’hyperéosinophilie

RECHERCHER LES CAUSES FREQUENTES

OXYUROSE TAENIA TOXOCAROSE

DEMANDER :

-Scotch test anal

-Parasitologie des selles X3 à 3 j d’intervalle
-Sérologie toxocarose

+
SELON LE MODE DE VIE ET/OU LE CONTEXTE CLINIQUE

Consommation
Consommation Consommation Consommation Vie en zone de végétaux
régulière de de viande de cresson d’élevage extensif forestiers
poisson d’océan crue/braisée de sauvage (berger), (Corse…) potentiellement
cru sanglier/cheval souillés par des
(chasseur…) déjections de
+/- troubles +/- signes +/- images renards (Est,
digestifs hépatobiliaires kystiques massif central)
+ CPK élevées
hépatiques
+/- tableau de
tumeur
hépatique

HYDATIDOSE ?
DISTOMATOSE
ANISAKIASE ? TRICHINELLOSE ? HEPATIQUE ? ECHINOCOCCOSE
KYSTE ALVEOLAIRE ?

DEMANDER : DEMANDER : HYDATIQUE

DEMANDER : FISSURE ?
-Sérologie -Sérologie -Sérologie DEMANDER :
anisakiase trichinellose distomatose -Sérologie
-Parasitologie des DEMANDER : échinococcose
selles X3 à 3 j -Sérologie alvéolaire
d’intervalle à hydatidose
renouveler 3
semaines après si
Hyperéosinophilie négatives
pouvant être très
élevée

44
 Illustration 4 : Aide à la prescription devant une hyperéosinophilie après séjour à l’étranger

PARA F6 P RES 001 A

AIDE A LA PRESCRIPTION :
HYPEREOSINOPHILIE CHEZ UN Date d’application:
PATIENT APRES SEJOUR EN 01/02/2011
ZONE TROPICALE (hors myiases
et causes exceptionnelles)

AFRIQUE + AMERIQUE EXTREME MOYEN

Madagascar
LATINE ORIENT ORIENT

Anguillulose, Ascaridiose,
Ankylostosomose ou autres
helminthoses intestinales
(oxyure, tenia…)
Distomatoses hépatiques
Cysticercose,Toxocarose, Hydatidose,
Trichinose, Anisakiase

DEMANDER :
Si baignade en -Parasitologie des selles X3 à 3 j d’intervalle
eau douce (acheminer rapidement au laboratoire) à renouveler
3 semaines après si négatives
-Scotch test anal
-Sérologies (en fonction du contexte) : distomatose,
cysticercose, toxocarose, hydatidose, trichinose,
+/- hématurie anisakiase

Brésil+++ Si baignade ou marche (Asie) en

eau douce

Schistomose intestinale
Schistosomose urinaire
DEMANDER:
DEMANDER: -Parasitologie des selles X3 à 3 j d’intervalle,
-Parasitologie des urines après à renouveler 3 semaines après si négative
effort physique renouveler 3
semaines après si négative -Sérologie: schistosomose

-Sérologie : schistosomose -Biopsie de muqueuse rectale si bilan négatif

-Biopsie vésicale si bilan et forte suspicion
négatif et forte suspicion

CHEZ UN RESIDENT OU APRES UN SEJOUR PROLONGE EN ZONE RURALE, EVOQUER EN PLUS

Afrique intertropicale Nord de l’Amérique du

Sud
Golfe de Guinée

Loase Onchocercose Filariose lymphatique

DEMANDER : DEMANDER : DEMANDER :
-Recherche de
-Sérologie : filariose -Recherche de microfilarémie à 23h et/ou 12h
microfilarémie à
12h -biopsie cutanée exsangue -Sérologie : filariose 45
-Sérologie : -Recherche d’antigène circulant filarien (envoi à Toulouse)
filariose
1.2.2 Parasitoses tropicales nécessitant une prestation de conseils
Bien que très fréquente lors d’une parasitose, l’hyperéosinophilie sanguine n’est pas
systématique, en effet la majorité des protozoaires n’occasionne pas ce point d’appel
biologique et d’autres signes, cliniques en particulier, peuvent, en fonction du contexte,
nécessiter une prescription d’examens de parasitologie directe.

La symptomatologie observée en parasitologie est rarement spécifique, une recherche de

parasites ne doit donc pas être demandée devant un symptôme isolé, sans connaissance du
contexte épidémiologique (notion de séjour à l’étranger, lieu, durée et conditions du séjour) et
clinico-biologique (autres signes associés). Le dialogue entre le prescripteur et le biologiste
prend alors toute son importance.

Des fiches d’aide à la prescription spécifiques aux parasitoses tropicales majeures ont donc
été établies et sont présentées dans les chapitres correspondants :

« Aide à la prescription : recherche de paludisme »

« Aide à la prescription : recherche d’une leishmaniose viscérale »

« Aide à la prescription : recherche de trypanosomose humaine africaine »

« Aide à la prescription : recherche de filariose »

« Aide à la prescription : en cas de suspicion de parasitose digestive »

« Aide à la prescription : recherche de schistosomose urinaire »

1.3 AVIS ET INTERPRETATIONS

Les avis et interprétations sont une partie intégrante du rapport d’analyse. Ils ne s’imposent
que s’ils apportent un éclairage particulier au client sur la signification et l’exploitation des
résultats communiqués sur le compte-rendu d’analyse (2).

La Norme précise au paragraphe 5.8.3. j et k : « (…) le compte-rendu doit comprendre, sans y

être limité, les éléments suivants : (…) l’interprétation des résultats, le cas échéant ; tout autre
commentaire (…) »

Nous avons donc programmé, dans le logiciel GLIMS, des commentaires adaptés aux
différentes situations rencontrées en pratique lors d’une recherche de parasites dans les selles et

46
 permettant au clinicien d’exploiter le résultat rendu. Ils sont présentés dans le Tableau 14 du
chapître post-analytique 3.2.6.3.

2. EXIGENCES LIEES AU PERSONNEL

2.1 PRE-ANALYTIQUE

Concernant l’activité de prélèvement, le document LAB LABM REF 02 distingue 2

situations (2) :

- Le prélèvement est réalisé par du personnel appartenant au laboratoire, l’ensemble des

exigences du Paragraphe 5.4 de la Norme est applicable : les personnes en charge du
prélèvement seront donc évaluées.

- Le prélèvement est réalisé par du personnel n’appartenant pas au laboratoire qui ne sera
pas évalué mais qui devra avoir pris connaissance du manuel de prélèvement.

2.1.1 Personnel préleveur du laboratoire : habilitation des internes

Les prélèvements de parasitologie-mycologie réalisés au laboratoire sont la recherche de
sarcoptes, le test à la cellophane adhésive, plus couramment dénommé : « Scotch®-test anal »,
la recherche de Demodex et les prélèvements mycologiques de la peau et des phanères. Cette
activité est réalisée par les internes du service. Il s’agit de prélèvements nécessitant une
compétence technique approfondie et pour lesquels la qualité de l’interrogatoire est très
importante : certains renseignements sont susceptibles d’orienter la recherche et de faciliter
l’interprétation (description clinique des lésions, origine géographique du patient, voyages,
autres personnes atteintes dans l’entourage…).

Il est donc indispensable que les internes (en charge des prélèvements pour une période de
6 mois) reçoivent une formation pratique et théorique adaptée à chaque type de prélèvement et
que cette formation puisse être documentée et prouvée.

Nous nous sommes inspirés de l’exemple du laboratoire de Parasitologie-Mycologie du

CHU de Toulouse-Rangueil pour mettre en place des fiches d’habilitation propres à chaque
interne et permettant de certifier la compétence du préleveur pour chaque type de geste effectué
(Illustration 5).

La formation initiale est assurée à Limoges par un biologiste du service ou un interne déjà
habilité. La durée de cette formation ne peut être définie au préalable puisque le nombre et le

47
type de prélèvements à réaliser au laboratoire sont très variables. L’acquisition des
compétences nécessaires demande une formation théorique basée sur la maîtrise des modes
opératoires (connaissance du matériel, informations à recueillir, gestes techniques…) et une
expérience pratique : 1 prélèvement sera réalisé avec un formateur pour chaque type de
prélèvement. Cette fiche sera remplie (date et signature) par le biologiste ou l’interne habilité
en charge de la formation. La cellule qualité du Pôle a également prévu la mise en place de
documents d’habilitation; notre fiche d’habilitation sera donc amenée à évoluer afin d’être
intégrée dans la procédure générale du Pôle.

48
 Illustration 5 : Fiche d’habilitation des internes aux prélèvements réalisés au laboratoire

HABILITATION DES
INTERNES aux Date d’application:
prélèvements réalisés au
laboratoire

Nom de l’interne à habiliter :

Date de prise de fonction :

Cette fiche décrit les compétences nécessaires pour qu’un interne en biologie soit habilité
à réaliser seul les prélèvements réalisés au laboratoire de parasitologie-mycologie.
Elle sera remplie pour chaque nouvel interne présent dans le service au fur et à mesure de
l’acquisition des compétences. En fin de formation, elle fera office de certificat de
qualification de l’interne.

I.FORMATION

Elle est assurée sous la responsabilité d’un biologiste du service ou d’un interne habilité.
Durée minimum de formation : 1 prélèvement effectué avec le formateur pour chaque type
de prélèvement (gale, demodex, recherche de teigne...) après le début de la prise de
fonction. Cette fiche sera remplie par un biologiste ou un interne habilité.

II.COMPETENCES EXIGEES

- Connaissance des modes opératoires :

PARA MO1 P PREA 004 A (gale)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

PARA MO2 P PREA 004 A (Scotch®-test anal)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

PARA MO3 P PREA 004 A (Demodex)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

PARA MO4 P PREA 004 A (mycose de la peau)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

PARA MO5 P PREA 004 A (prélèvement Malassezia)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

49
 HABILITATION DES
INTERNES aux Date d’application:
prélèvements réalisés au
laboratoire

PARA MO6 P PREA 004 A (onychomycose)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par:

PARA MO7 P PREA 004 A (teignes)

Oui □ Non □ Réalisé □ validé par :

- Manipulations techniques pour prélèvement cutané :

- Interrogation pertinente du patient

Contact avec animal, origine géographique ou voyage à l’étranger, traitement antifongique et
délai, lésions identiques dans l’entourage (ces informations sont systématiquement recueillies
dans la fiche d’information qui sera jointe avec le prélèvement)

Oui □ Non □ validé par :

-Préparation correcte du matériel de prélèvement en fonction des demandes

Oui □ Non □ validé par :

-Port des gants

Oui □ Non □ validé par :

-Prélèvement de gale (respect des règles d’hygiène, questions au patient...)

Oui □ Non □ validé par :

50
 HABILITATION DES
INTERNES aux Date d’application:
prélèvements réalisés au
laboratoire

-Manipulations techniques pour la réalisation du scotch anal :

-Vérification du respect par le patient des conditions de réalisation (pas de toilette anale...)

Oui □ Non □ validé par :

-Port des gants

Oui □ Non □ validé par :

-Réalisation du prélèvement

Oui □ Non □ validé par :

-Règles concernant l’étiquetage des prélèvements :

-Etiquetage des prélèvements en contrôlant l’identité du patient

Oui □ Non □ validé par :

-Archivage :
-Cahier de prélèvement correctement rempli:

Identité du patient renseignée

Oui □ Non □ validé par :

Nom et service du prescripteur renseignés

Oui □ Non □ validé par :

Nom du préleveur renseigné

Oui □ Non □ validé par :

Heure et date de prélèvement renseignées

Oui □ Non □ validé par :

Type de prélèvement effectué

Oui □ Non □ validé par :

-Obtention de la qualification :

Oui □ Non □
validée par : Le :
51
2.1.2 Personnel préleveur n’appartenant pas au laboratoire : manuel de
prélèvements et catalogue des analyses
Lorsque le prélèvement est réalisé par du personnel n’appartenant pas au laboratoire, il
convient que le laboratoire dispose d’une liste de diffusion exhaustive, démontrant que
l’ensemble des personnes concernées par le prélèvement, a pris connaissance du Manuel de
Prélèvement des échantillons primaires (spécimens) (1) (2).

En effet, dans le paragraphe 5.4.2. la Norme recommande un effort tout particulier

concernant le manuel de prélèvement :

« Des instructions spécifiques relatives au prélèvement et à la manipulation des échantillons

primaires doivent être documentées et mises en œuvre par la direction du laboratoire et être
mises à la disposition des responsables du prélèvement des échantillons primaires. Ces
instructions doivent figurer dans un manuel des échantillons primaires ».

Comme nous l’avons évoqué au chapitre « Prestation de conseils », la structure qualité du

CHU de Limoges a mis en place un manuel de prélèvements complété par un catalogue des
analyses directement consultable par tous les services reliés au réseau de l’hôpital sur Hermès
avec l’intranet. Des mises au point sont régulièrement réalisées afin que ce catalogue soit en
mesure de répondre aux attentes de la Norme.

D’après le paragraphe 5.4.3. le manuel de prélèvement des échantillons primaires doit

comprendre les éléments suivants :

a) Des copies ou des références à

1. des listes d’analyses de laboratoire disponibles proposées,
2. des formulaires de consentement, le cas échéant,
3. des informations et des instructions fournies aux patients en rapport avec leur propre
préparation avant le prélèvement des échantillons primaires, et
4. des informations données aux utilisateurs des prestations du laboratoire sur les indications
médicales et le choix approprié des méthodes disponibles
b) Des procédures concernant
1. la préparation du patient (par exemple instructions destinées au personnel soignant et aux
personnes effectuant les prélèvements)

52
 Il semble indispensable, au regard de ces textes, de diffuser des informations concernant la
préparation du patient avant un prélèvement. La cellule qualité a prévu un
«espace laboratoire» sur Hermès afin que toutes ces instructions puissent être diffusées aux
cliniciens. Nous avons mis en place des fiches d’instructions destinées aux préleveurs
(infirmiers, médecins) et destinées aux patients (Illustrations 6 et 7). Concernant le secteur de
parasitologie directe, le seul prélèvement qui nécessite une préparation spécifique du patient est
le Scotch®-test anal réalisé lors d’une recherche d’oxyurose; pour cet examen, la mise en
évidence d’éléments parasitaires dépend directement du respect par le patient de certaines
conditions de prélèvement.

Pour les conditions de prélèvement, le document LAB GTA 12 conseille de se reporter aux
références d’ANOFEL (12) ou au livre d’Ambroise-Thomas et Golvan (14).

53
 Illustration 6 : Instructions destinées aux cliniciens, préparation au Scotch®-test anal

PREPARATION DU
PATIENT AU SCOTCH®-
Date d’application:
TEST ANAL
(Test à la cellophane
adhésive)

INDICATIONS :

-Recherche d’oxyurose (Enterobius vermicularis)

-Recherche de cestodose à Taenia sp.

CONDITIONS DE REALISATION :

Cet examen est la méthode de choix pour mettre en évidence les œufs d’oxyures, cependant
sa sensibilité dépend directement des conditions de réalisation du prélèvement.

Il est donc impératif de respecter les instructions suivantes :

-Le patient devra effectuer sa toilette anale la veille du prélèvement (le soir de préférence).

-Le prélèvement sera pratiqué le matin avant la toilette anale du patient et avant défécation.

IMPOSSIBILITE DE REALISATION :

-Prescription de suppositoires, en particulier chez le jeune enfant.

Il sera préférable de faire réaliser ce prélèvement au laboratoire de Parasitologie-Mycologie

à partir de 9 h après avoir prévenu le service (poste 56160).

54
 Illustration 7 : Instructions destinées aux patients, préparation au Scotch®-test anal

Instructions destinées
au patient concernant Date d’application:
le
®
SCOTCH -TEST ANAL

1. Description du geste
La recherche d’oxyures (petits vers blancs souvent à l’origine de démangeaisons anales
nocturnes) ou de Tænia nécessite un prélèvement : le Scotch®-test anal.

Il sera effectué le matin au moyen de cellophane adhésive (Scotch®) appliquée pendant

quelques secondes sur la marge de l’anus pour récupérer les œufs des vers potentiellement
présents à ce niveau.
Ce prélèvement peut être réalisé au laboratoire de parasitologie-mycologie (à partir de 9h)
ou dans le service d’hospitalisation.

2. Est-il associé à des phénomènes douloureux ?

Non, ce geste est indolore

3. Peut-il y avoir des complications éventuelles ?

Non

4. Précautions à prendre avant le geste

La sensibilité de cette recherche dépend directement des conditions de réalisation du
prélèvement, c’est pourquoi il est indispensable que vous suiviez les instructions
suivantes :

 La veille au soir :
 prendre une douche avec toilette anale
 éviter toute prise de suppositoire

 le matin :
 ne pas aller à la selle
 ne pas faire de toilette anale
 venir au laboratoire le plus tôt possible à partir de 9h (sauf si le prélèvement est
réalisé par l’infirmière)

S’il s’agit d’un enfant n’ayant pas encore atteint l’âge de la propreté, essayez dans la
mesure du possible de respecter les mêmes règles.

5. Ce qu’il faut en attendre et ne pas en attendre :

Ce prélèvement permet de mettre en évidence des œufs d’oxyure ou de Tænia, parasites
pour lesquels un traitement efficace peut être administré. Cependant, une recherche
négative n’exclut pas la présence d’un de ces parasites.
Si les précautions ci-dessus ne sont pas respectées, une recherche négative n’est pas
significative.

55
2.2 ANALYTIQUE

2.2.1 Des contrôles internes de qualité pour une formation continue

La Norme insiste dans les paragraphes 5.1.9. et 5.1.11, sur la nécessité d’une formation
continue. :

« un programme de formation continue doit être disponible pour toute les catégories de
personnel. »

« La compétence de chaque membre du personnel pour remplir les tâches imparties doit être
évaluée à l’issue de la formation, puis périodiquement par la suite (…) »

Le document LAB GTA 12 (4) précise que le personnel peut utiliser, pour maintenir sa
qualification et sa compétence, des spécimens témoins, faire référence à des ouvrages
bibliographiques et démontrer sa formation continue (interne ou externe). Il appartient au
laboratoire de démontrer la manière dont il maintient la compétence de son personnel
technique et qui peut être fondée sur l’autoévaluation.

Le secteur de parasitologie directe présente plusieurs particularités qui nous ont incitées à
mettre en place une procédure de contrôles internes de qualité:

- La majorité des recherches parasitaires a recours à l’examen direct et repose sur

l’identification au microscope optique (morphologie), la qualification des personnes
effectuant ces lectures apparaît comme essentielle.

- De nombreuses parasitoses humaines sont peu fréquentes en France métropolitaine, il est

alors important d’exercer l’œil du microscopiste en abordant celles-ci par le biais de
contrôles internes réguliers.

- La recherche du paludisme est l’urgence diagnostique en parasitologie ; le pronostic vital

du patient dépend alors de l’aptitude du laboratoire à mettre en évidence Plasmodium
falciparum. Ce parasite sanguin sera donc abordé de façon privilégiée au cours de nos
contrôles internes.

Ceux-ci sont effectués à tour de rôle par chacun des techniciens pouvant être amenés à
prendre en charge un prélèvement dans le secteur de parasitologie directe.

Concernant la périodicité de ces contrôles, une fréquence trimestrielle a été prévue. Ils
associent à chaque fois un échantillon de selles négatif ou positif (aux principaux protozoaires
et helminthes) et un frottis sanguin, négatif ou positif (aux principaux parasites sanguins).

56
 Comme pour tout prélèvement, ces contrôles sont enregistrés sur GLIMS et validés.

2.2.2 Autres mesures de formation

La formation continue est également assurée par la participation du personnel aux
contrôles AFSSAPS et à des formations spécifiques (Bioformation…). Des mesures
supplémentaires telles l’étude des cas cliniques mensuels du CDC (Centers for Disease
Control) (15), ou un enseignement via « PARASITimages » seront prochainement envisagées.
La traçabilité de toutes ces procédures de formation est une condition sine qua non.

2.2.3 Habilitation au secteur de parasitologie directe

Un autre élément prépondérant dans la qualité du processus analytique est la maîtrise, par
le personnel, des techniques manuelles de concentration et de coloration préalables à l’examen
microscopique.

Nous avons donc mis en place en priorité une procédure d’habilitation des internes ou des
nouveaux techniciens affectés au secteur de parasitologie directe (Illustration 8).

57
 Illustration 8 : Fiches d’habilitation au poste de parasitologie directe

HABILITATION EN
Date d’application:
PARASITOLOGIE
DIRECTE

Nom de l’interne à habiliter :

Date de prise de fonction:

Cette fiche décrit les compétences nécessaires pour qu’un interne en biologie soit habilité à
prendre de façon autonome des activités spécifiées au sein du secteur de parasitologie directe
dans le laboratoire de parasitologie-mycologie. Elle sera remplie pour chaque nouvel interne
présent dans ce secteur.

I. FORMATION
Elle est assurée sous la responsabilité d’un technicien(ne) référent du secteur et du biologiste
responsable du secteur.
Durée minimum de formation : 15 jours à 1 mois
Cette fiche sera remplie en concertation entre le technicien référent et le biologiste
responsable du secteur.

II.COMPETENCES EXIGEES

-Manipulations techniques pour la recherche et l’identification des différents parasites en

fonction du prélèvement. Tous les examens bénéficient d’une double lecture par l’interne et le
technicien référent.

-Recherche et identification des parasites du sang et organes hématopoïétiques :

-PALUDISME

-Frottis mince MGG Oui □ Non □ validé par :

-BinaxNOW Malaria® Oui □ Non □ validé par :

-Goutte épaisse Oui □ Non □ validé par :

-Calcul de la parasitémie Oui □ Non □ validé par

58
 HABILITATION EN
Date d’application:
PARASITOLOGIE
DIRECTE

-FILARIOSE

-Examen direct Oui □ Non □ validé par :

-Goutte épaisse Oui □ Non □ validé par :

-Lyse à la saponine/centrifugation Oui □ Non □ validé par :

-LEISHMANIOSE VISCERALE

-Frottis sanguin MGG Oui □ Non □ validé par :

-Frottis de moelle MGG Oui □ Non □ validé par :

-Culture (promastigotes) Oui □ Non □ validé par :

-Recherche et identification des parasites dans les selles :

-Examen direct Oui □ Non □ validé par :

-Méthodes diphasiques (Bailenger, MIF) Oui □ Non □ validé par :

-Méthodes de flottaison (Janeckso, Willis …) Oui □ Non □ validé par :

-Recherche de larves d’anguillule (Baermann) Oui □ Non □ validé par :

-Culture d’amibes (mise en culture et identification des formes végétatives)

Oui □ Non □ validé par :

-Recherche de cryptosporidies (Ziehl modifié) Oui □ Non □ validé par :

-Recherche de microsporidies (Trichrome de Weber) Oui □ Non □ validé par :

59
 HABILITATION EN
Date d’application:
PARASITOLOGIE
DIRECTE

-Recherche et identification d’ectoparasites (sarcopte, demodex…) :

-Prélèvement Oui □ Non □ validé par :

-Identification Oui □ Non □ validé par :

-Recherche d’oxyurose :

-Prélèvement Oui □ Non □ validé par :

-Identification Oui □ Non □ validé par :

-Gestion du poste de travail :

-Maîtriser la gestion documentaire du poste Oui □ Non □ validé par :

-Hygiène, Sécurité, Elimination des déchets :

-Respecter les règles d’hygiène Oui □ Non □ validé par :

-Connaître les règles de sécurité
AES Oui □ Non □ validé par :

Sécurité incendie Oui □ Non □ validé par :

Risques infectieux et chimiques (feuilles de sécurité) Oui □ Non □ validé par :

-Elimination des déchets Oui □ Non □ validé par :

-Archivage :

-Conservation des échantillons

Lieu de stockage Oui □ Non □ validé par :

Durée Oui □ Non □ validé par :

Température Oui □ Non □ validé par :

-Notions générales :

-Saisie des résultats Oui □ Non □ validé par :

-Approche d’un Regard critique sur le prélèvement Oui □ Non □ validé par :

-Regard critique sur le résultat Oui □ Non □ validé par :

-Validation biologique Oui □ Non □ validé par :

60
2.3 POST-ANALYTIQUE

Le document LAB GTA 12 (4) insiste sur le rôle fondamental du biologiste dans
l’interprétation du résultat en fonction du contexte épidémiologique et biologique du patient.
Ces renseignements sont recueillis en amont, au moment du prélèvement ou au moment de la
réception du prélèvement, par appel téléphonique (fiche de renseignement paludisme, cahier de
renseignements cliniques) et permettent ainsi une validation biologique éclairée.

3. PROCEDURES TECHNIQUES
Les Paragraphes 5.4, 5.5, 5.6, et 5.7 de la Norme abordent les exigences techniques
respectivement relatives aux procédures pré-analytiques, analytiques, à l’assurance qualité des
procédures analytiques et aux procédures post-analytiques.

Concernant les procédures pré-analytiques (Paragraphe 5.4.), le document SH REF 02 (3)

résume ces exigences en précisant que la qualité de l’examen de Biologie Médicale est mieux
maîtrisée lorsque l’échantillon est prélevé au laboratoire. Ceci s’explique par la maîtrise de
principes de base : vérification de l’identité du patient, validation de la prescription sur la base
d’éléments cliniques pertinents, vérification du respect des conditions de réalisation du
prélèvement, faible délai d’acheminement de l’échantillon et maîtrise de la phase post-
analytique grâce aux renseignements cliniques disponibles.

Dans le cas où le laboratoire réalise le prélèvement, il veillera à disposer de dispositions

appliquées pour la réalisation des prélèvements de spécimens (4). Les conditions de
prélèvement doivent être spécifiées par le laboratoire (par exemple dans un guide ou
catalogue). Le laboratoire pourra se reporter aux références d’ANOFEL ou au livre
d’Ambroise-Thomas et Golvan (4).

3.1 LE PRELEVEMENT EST REALISE AU LABORATOIRE

Au laboratoire de parasitologie de Limoges, les prélèvements réalisés au laboratoire sont

les prélèvements techniques nécessitant des compétences particulières et des connaissances
épidémiologiques et cliniques approfondies. La qualité du résultat rendu est alors directement
dépendante de la qualité de la procédure pré-analytique. La démarche analytique est réduite,
pour ces recherches parasitaires, à la recherche d’éléments parasitaires de grande taille,
facilement identifiables par un technicien averti au moyen d’un examen direct. La maîtrise de

61
 cette analyse passe par l’identification des causes d’incertitude pouvant avoir une influence sur
le résultat et la mise en place d’actions destinées à limiter cette incertitude.

3.1.1 Recherche de sarcoptes

La gale humaine est une ectoparasitose très contagieuse due à un acarien, Sarcoptes
scabiei var hominis. Elle touche préférentiellement les couches les plus défavorisées des
populations (16) et est fréquente dans les collectivités (hôpitaux, maisons de retraite, écoles…)
(12) (16). Le diagnostic biologique se fait par recherche de sarcoptes à l’examen direct ; il n’est
pas toujours réalisé car le diagnostic est souvent établi à partir des arguments cliniques et
épidémiologiques. Il est cependant souhaitable de rechercher les sarcoptes chez un sujet isolé
suspect de gale ou dans un contexte épidémique nécessitant d’affirmer le diagnostic (16). Le
signe clinique classique est un prurit intense et généralisé causé par une réaction
d’hypersensibilité. Il est associé à des lésions cutanées plus ou moins typiques dont les
localisations préférentielles sont les espaces interdigitaux, la face antérieure des poignets, les
zones péri-mamelonaires et péri-ombilicale et respectent en général le visage.

La mise en évidence du parasite est réputée difficile chez l’immunocompétent en raison du

nombre réduit de sarcoptes hébergés. La sensibilité de l’examen direct dépend de plusieurs
facteurs comme la présentation clinique et l’expérience du préleveur (16) (17) (Tableau 5).
Lorsque les signes les plus évocateurs, sillons et vésicules perlées des espaces interdigitaux,
sont présents, l’examen est généralement positif. Le prélèvement se fait par raclage cutané
perpendiculairement au sillon à l’aide d’une curette ou d’un vaccinostyle (12) (16) (17). Les
squames ainsi recueillis sont ensuite déposés dans une goutte de mélange éclaircissant (KOH
30% ou chloral-lactophénol) puis recouverts d’une lamelle. Plusieurs prélèvements sont
nécessaires pour augmenter la sensibilité (17). Les lames sont observées à l’objectif 10, une
deuxième lecture retardée, pouvant laisser apparaitre des éléments parasitaires par
éclaircissement, est recommandée (14). Les femelles adultes et/ou les œufs sont facilement
reconnaissables ; les premières sont ovalaires, présentent 4 paires de pattes et mesurent
environ 300 µm, les œufs ont une coque épaisse et un diamètre longitudinal d’environ 150 µm.
Les larves, œufs vides, débris et déjections (scybales) de sarcopte sont plus difficiles à
identifier mais permettent de sensibiliser la recherche.

3.1.1.1 Mode opératoire

L’Illustration 9 expose la version 2011 de notre mode opératoire.

62
 Illustration 9 : Mode opératoire de la recherche de gale

PARA MO1 P PREA 004 A

Date d’application:
RECHERCHE 01/02/2011
DE GALE

INDICATION :
Suspicion de gale
Recherche de Sarcoptes scabiei

MATERIEL ET REACTIFS :

Salle de prélèvement :
 lame porte objet et lamelles de microscope
 chloral-lactophénol
 vaccinostyle stérilisé dans tube à hémolyse en verre :
ne pas jeter après utilisation,
mettre dans le réactif désinfectant de la salle de prélèvement,
 compresses
 lampe mobile
 gants
 papier de protection

Pièce technique de parasitologie :

 microscope

INFORMATIONS PREALABLES :
 Vérifier l’identité du patient et noter dans le cahier de prélèvement l’identité du patient, la
date de naissance, la date du prélèvement, le service prescripteur, le type de
prélèvement réalisé et l’identité du préleveur.
 Rassurer le patient en lui expliquant le déroulement du prélèvement.
 Rechercher des informations permettant d’argumenter la suspicion de gale :
 Prurit, exacerbation nocturne
 Antécédents ? si oui, y a-t-il eu un traitement et évaluer l’observance
 contexte social : profession (personnel soignant à risque), vie en collectivité
 personnes atteintes de gale dans l’entourage proche (famille) ou au travail, si oui,
depuis quand ?

63
 PARA MO1 P PREA 004 A
Date d’application:
RECHERCHE 01/02/2011
DE GALE

TECHNIQUE DE PRELEVEMENT :
 Mettre des gants.
 Installer un papier de protection sur la table pour que le patient y dépose ses mains.
 Préparer les lames.
 Repérer des lésions caractéristiques (sillons, vésicules perlées) en s’aidant d’une lampe
à fort éclairage. Les lésions peuvent être excoriées, eczématisées.
Attention en cas de squames croûteuses : se méfier d’une gale norvégienne,
hypercontagieuse.
Regarder en priorité :
 Sur la paume des mains, entre les doigts, le poignet, les avant-bras et le tronc.
 Sur la plante des pieds, les jambes et les aisselles chez les nourrissons.
 Soulever le toit de la vésicule ou du sillon à l’aide de la pointe du vaccinostyle, puis
gratter assez fortement le plancher de la lésion avec le côté du vaccinostyle. En cas de
squames croûteuses, gratter simplement de manière à les récupérer à l’aide du
vaccinostyle.
 Le prélèvement est déposé dans une goutte de chloral-lactophénol sur une lame en verre
de microscope. Afin de récupérer la totalité du prélèvement, gratter le vaccinostyle sur le
bord de la lame puis ramener le prélèvement au centre de la lame à l’aide d’une lamelle.
 Renouveler le prélèvement sur plusieurs lésions, après avoir essuyé le vaccinostyle à
l’aide d’une compresse (le chloral-lactophénol étant irritant pour la peau).
 Lire aussitôt la lame au microscope en faisant attendre le patient.

LECTURE :
 Rechercher un élément parasitaire (la forme adulte, la forme larvaire, ses œufs ou ses
déjections, voire un morceau de patte…).
 Lire la totalité de la lame au microscope optique à objectif x 10.
 Si le prélèvement est positif,
 en informer le patient, le personnel de santé qui l’accompagne.
 téléphoner au médecin.
 indiquer sur le résultat les éléments observés de Sarcoptes scabiei (oeufs, larves,
adultes, déjections).
 Si le prélèvement est négatif,
 en refaire un autre sur des lésions différentes
 téléphoner le résultat de la lecture au service demandeur
 faire une 2ème lecture des prélèvements quelques heures plus tard (jusqu’à 24
heures) après éclaircissement d’un prélèvement trop épais, avant de rendre un
résultat négatif.
 Attention : ne pas jeter les lames après une première lecture.

64
 PARA MO1 P PREA 004 A
RECHERCHE Date d’application:
DE GALE 01/02/2011

Sarcopte adulte=300µm (4 paires de pattes) Sarcopte adulte (4 paires de pattes)

(les formes larvaires présentent 3 paires de pattes) avec une bulle d’air

2 œufs (150µm) contenant une larve+ multiples déjections Débris d’œufs + déjections

65
 PARA MO1 P PREA 004 A
RECHERCHE Date d’application:
DE GALE 01/02/2011

Patte de Sarcopte

ELIMINATION DES MATERIAUX UTILISES :

Après la deuxième lecture, les lames négatives pourront être jetées dans l’emballage
(NF) jaune pour déchets à coté des microscopes.

DOCUMENTS DE REFERENCE :
Anofel, Parasitoses et mycoses des régions tempérées et tropicales, Elsevier Masson,
2007

66
3.1.1.2 Incertitude de mesure et maîtrise du risque d’erreur

Les facteurs susceptibles d’influencer le résultat d’une recherche de sarcoptes peuvent être
ciblés grâce à la règle des 5M (Tableau 5) ; le niveau d’influence est ensuite évalué par
l’attribution d’un score (1 pour un faible niveau d’influence, 3 pour un niveau intermédiaire et
9 pour un niveau d’influence élevé). On observe alors que le niveau d’influence de la main
d’œuvre (personnel) est élevé à toutes les étapes de l’analyse, en effet nous avons vu
précédemment que la compétence du préleveur est déterminante dans la qualité du résultat.
Afin de minimiser au maximum le risque d’erreur, le laboratoire de parasitologie de Limoges a
mis en place des mesures d’habilitation de l’interne, celui-ci prend en charge la totalité de la
recherche de sarcopte (du prélèvement au rendu du résultat par appel téléphonique). Le mode
opératoire appliqué à Limoges décrit, en référence aux recommandations ANOFEL, les
modalités de prélèvement en précisant les informations cliniques et épidémiologiques qui
seront utiles à l’interne et au biologiste dans l’approche diagnostique. De plus, un second
prélèvement en cas négativité ainsi qu’une deuxième lecture différée des lames négatives
permettent de limiter les faux négatifs.

Des photographies des différents éléments parasitaires observables, permettant de

conclure à une recherche de gale positive (même s’ils sont vus de manière isolée), illustrent le
mode opératoire dans un but pédagogique.

La validation initiale de cette méthode de recherche est avant tout basée sur le respect des
données bibliographiques. Certains indices statistiques permettent tout de même de procéder à
une évaluation continue de la recherche telle qu’elle est réalisée au laboratoire.

Sur l’ensemble des 332 recherches de sarcoptes effectuées du 01/01/2008 au 28/01/2011,

117 se sont avérées positives, soit 35% de prélèvements positifs. Ce taux ne représente pas une
sensibilité car toutes les recherches négatives n’étaient pas forcément réalisées chez des
patients infectés (suspicion clinique par excès, diagnostic d’exclusion). La sensibilité
diagnostique au CHU de Limoges est donc supérieure à 35%.

Le rendement théorique de l’examen direct est faible, même entre des mains
expérimentées, nous pouvons donc considérer la prise en charge au laboratoire comme
satisfaisante (18).

67
 Tableau 5 : Recherche de sarcopte, facteurs d’incertitude et maîtrise du risque d’erreur

Niveau Mesures mises en place

Pré-analytique
d’influence

Prélèvement au
Compétence du préleveur : reconnaissance des lésions laboratoire, mode
Main d’œuvre 9
typiques, qualité de l’interrogatoire opératoire détaillé
Habilitation des internes

Grattage : nombre et type de lésions prélevées, force du Habilitation / Deuxième

Méthode 9
grattage prélèvement si négatif

Chloral-lactophénol : délai d’éclaircissement des Deuxième lecture différée

Milieu 3
squames systématique des négatifs

Matériel vaccinostyle 1 …

Matière Squames 1 …

Analytique Niveau Mesures mises en place

d’influence
Mode opératoire illustré,
Main d’œuvre Microscopiste : qualification (reconnaissance des
différents éléments), concentration 9 habilitation

Mode opératoire,
Méthode Lecture des lames au 10 3
habilitation

Milieu …

Matériel Microscope 3 Maintenance

Matière …

Niveau
Post-analytique Mesures mises en place
d’influence
Le préleveur
Biologiste ou interne : connaissance des renseignements communique le résultat
Main d’œuvre 9
cliniques et épidémiologiques
interprété par téléphone

Méthode

Milieu

Matériel Système informatique de laboratoire 1 …

Matière

68
3.1.2 Test à la cellophane adhésive ou Scotch®-test anal
Ce prélèvement est réalisé pour la mise en évidence d’Enterobius vermicularis, nématode
intestinal cosmopolite, responsable de l’oxyurose. Il est plus rarement prescrit, pour la
recherche d’œufs de Ténias.

L’oxyurose est très répandue, surtout chez l’enfant, on estime que presque tous les enfants
sont à un moment donné touchés par cette parasitose (12). Les oxyures adultes vivent dans la
région caeco-appendiculaire et les femelles gravides migrent la nuit vers la marge anale pour y
pondre des milliers d’œufs. La contamination se fait ensuite par ingestion des œufs émis dans
le milieu extérieur.

La fixation des femelles au niveau de la marge anale peut provoquer un prurit anal
vespéral qui est le plus fréquent des symptômes et donc des motifs prescription. Cependant
cette parasitose est en général asymptomatique. Une hyperéosinophilie sanguine inexpliquée
associée ou non à des troubles digestifs peut aussi amener le clinicien à prescrire un test à la
cellophane adhésive (Illustration 3). Malheureusement, l’intérêt du Scotch®-test anal est
souvent oublié par le prescripteur qui se contente fréquemment de réaliser une recherche de
parasites dans les selles moins efficace pour mettre en évidence Enterobius vermicularis. Les
14 tests à la cellophane adhésive réalisés en 2009 à Limoges (un seul positif) illustrent la
méconnaissance de l’examen.

Afin de limiter cet oubli, nous avons rappelé au prescripteur l’importance du test par le
biais des aides à la prescription et de certains de nos commentaires pré-établis (Tableau 14).

3.1.2.1 Conditions de réalisation

La recherche des œufs caractéristiques pondus sur la marge anale permet une identification
de cette parasitose. La meilleure technique est le test à la cellophane adhésive de Graham (12)
qui consiste à appliquer contre les plis radiés de l’anus la face collante d’un ruban adhésif
transparent (Illustration 10). Celui-ci, une fois collé sur une lame porte objet est examiné au
microscope. La sensibilité de cette recherche dépend directement des conditions de réalisation
du prélèvement qui doit être effectué le matin avant toute toilette locale et toute défécation
(12).

3.1.2.2 Mode opératoire

L’Illustration 10 expose la version 2011 de notre mode opératoire.

69
 Illustration 10 : Mode opératoire du Scotch®-test anal

PARA MO2 P PREA 004A

SCOTCH®-TEST
Date d’application:
ANAL 01/02/2011
(Test à la cellophane
adhésive de Graham)

INDICATIONS :
Diagnostic d’oxyurose (Enterobius vermicularis)
Diagnostic de cestodose à Taenia sp.

MATERIEL :
 Gants
 Table d’examen
 Papier protecteur
 Lame porte objet de microscope
 Ruban adhésif transparent (Scotch®)
 Ciseaux

INFORMATIONS PREALABLES :
 Vérifier l’identité du patient et noter dans le cahier de prélèvement l’identité du patient,
la date de naissance, la date du prélèvement, le service prescripteur, le type de
prélèvement réalisé et l’identité du préleveur.
 Vérifier que les informations relatives à la préparation de cet examen ont bien été
remises au patient et suivies par celui-ci.
 Si le patient est mineur, ne réaliser le prélèvement qu’en présence d’un parent ou
d’une autre personne soignante.
 Rassurer le patient en lui expliquant le déroulement du prélèvement.

TECHNIQUE DE PRELEVEMENT :
En cas de recherche d’oxyure, le prélèvement s’effectue le matin chez un patient n’ayant pas
eu de toilette anale et n’ayant pas encore émis de selles. Si ces conditions ne sont pas
réunies, faire revenir le patient un autre jour si possible.
 Indiquer le nom du patient sur la lame.
 Mettre le patient en position genu-pectorale sur la table d’examen protégée par un papier.
Pour les jeunes enfants, les installer en position de décubitus latéral, les genoux ramenés
sur le ventre.
 Découper un morceau de Scotch® transparent d’une longueur légèrement inférieure à
celle d’une lame porte-objet et coiffer l’extrémité arrondie d’un tube de 10 cc en plaçant la
partie adhésive vers l’extérieur.
 Mettre des gants.
 Appliquer ce montage à la marge de l’anus après avoir déplissé les plis radiés de l’anus
puis déposer le scotch sur une lame en évitant au maximum les bulles d’air.
 Oter les gants.
 Aider le patient à se relever.
 Le faire patienter le temps de la lecture.

70
 PARA MO2 P PREA 004
SCOTCH®-TEST A
ANAL Date d’application:
(Test à la cellophane 01/02/2011
adhésive de Graham)

LECTURE :
 Lire au microscope objectif x 10 de manière à repérer les oeufs d’oxyures (Enterobius
vermicularis) ou de Taenia sp.

Nombreux œufs d’oxyures sur Scotch® Œuf d’oxyure sur examen direct des selles

Œuf de Taenia sp. (50µm)

ELIMINATION DES MATERIAUX UTILISES :

 Après la deuxième lecture, les lames négatives pourront être jetées dans l’emballage
(NF) jaune pour déchets à coté des microscopes.

DOCUMENTS DE REFERENCE :
Y. J. Golvan, P. Ambroise-Thomas, LES NOUVELLES TECHNIQUES EN
PARASITOLOGIE, 1984, FLAMMARION

71
3.1.3 Recherche de Demodex folliculorum
3.1.3.1 Commensal ou pathogène ?

Le demodex est un ectoparasite cosmopolite qui appartient à l’embranchement

Arthropodes, à la classe des Arachnides, à l’ordre des acariens et à la famille des Démodécidés.
chez l’Homme, deux espèces sont habituellement isolées : Demodex folliculorum qui vit dans
le follicule pileux, et Demodex brevis retrouvé dans les glandes sébacées du visage. L’adulte
mesure 300 à 400 µm de long sur 40 µm de large, il est vermiforme, possède une tête rattachée
à une partie antérieure comprenant quatre paires de pattes très courtes et une partie postérieure
allongée. La larve, de plus petite taille est initialement apode, acquiert 6 pattes en 3-4 jours
(19).

Si les demodex sont bien connus en pathologie vétérinaire, en revanche leur caractère
pathogène dans les dermatoses humaines est sujet à controverse. Des études ont montré que ce
parasite était présent dans 18 à 80% des cas d’acné rosacée, dans 45% des blépharites
inflammatoires et 42% des folliculites (19). Cependant, pour certains auteurs, la présence d’une
lésion cutanée constitue un terrain favorable au développement du parasite, initialement
présent sur la peau saine (20). Certains arguments ont alors été proposés pour établir son rôle
pathogène, comme la présence d’un nombre important de demodex intra-folliculaires, ou une
amélioration clinique rapide lors d’un traitement d’épreuve par un anti-acarien (19).

Pour la recherche en cas de blépharite, il est nécessaire d’arracher 4 ou 5 cils par paupière
au moyen d’une pince à épiler. Les cils et les débris adjacents doivent être observés dans une
goutte de sérum physiologique ou de chloral-lactophénol (permettant de conserver les
préparations) entre lame et lamelle au microscope à l’objectif 10 puis 40.

Le rôle du Demodex dans la blépharite doit être discuté en fonction de leur abondance à la
base des cils. En effet la présence de nombreux Demodex par cil (3 ou plus) suggère fortement
leur implication dans l’étiologie de la blépharite. En revanche, un nombre plus réduit doit faire
envisager une autre étiologie (21).

En cas de rosacée, le diagnostic de Demodex peut être fait par biopsie de la surface de la
peau ou par grattage des squames cutanées.

3.1.3.2 Mode opératoire

L’Illustration 11expose la version 2011 de notre mode opératoire.

72
 Illustration 11 : Mode opératoire de la recherche de Demodex

PARA MO3 P PREA 004 A

RECHERCHE DE
Date d’application:
DEMODEX 01/02/2011
FOLLICULORUM

INDICATION :
Recherche de demodex folliculorum
Démodécie des cils (blépharite chronique)
Eruption papulo-pustuleuse du visage

MATERIEL :
Salle de prélèvements :
Pinces à épiler à extrémités plates
Compresses
Curettes
Lames porte-objets et lamelles de microscope
Chloral-lactophénol
Pièce de parasitologie :
Microscope à contraste de phase

INFORMATIONS PREALABLES :
 Vérifier l’identité du patient et noter dans le cahier de prélèvement l’identité du patient, la
date de naissance, la date du prélèvement, le service prescripteur,le type de prélèvement
réalisé et l’identité du préleveur.
 Rassurer le patient en lui expliquant le déroulement du prélèvement.

TECHNIQUE DE PRELEVEMENT :
En cas de blépharite (démodécie des cils)
 Repérer des cils dont la base paraît engluée dans une substance jaunâtre (aspect
inflammatoire): ce sont ceux-là qui sont à prélever en priorité. Si les cils paraissent
normaux, prélever au hasard 4 cils par paupière (supérieure et inférieure) et par œil.
 Les cils sont arrachés à l’aide de la pince à épiler, en maintenant la paupière à l’aide
de la compresse pour rendre le geste moins douloureux.
 Déposer les cils prélevés dans une goutte de chloral-lactophénol sur une lame porte-
objet, en séparant sur 2 lames différentes les cils de l’œil droit et de l’œil gauche.
 Recouvrir d’une lamelle.
 Indiquer sur les lames : le nom du patient et oeil droit ou oeil gauche.
En cas d’éruption papulo-pustuleuse
 Prélever la lésion à l’aide d’une curette ou d’un vaccinostyle.
 Déposer le matériel prélevé dans une goutte de chloral-lactophénol sur une lame
porte-objet.
 Recouvrir d’une lamelle.

73
 PARA MO3 P PREA 004 A
RECHERCHE DE
Date d’application:
DEMODEX
FOLLICULORUM

LECTURE :
 Lire immédiatement la totalité des lames au microscope objectif x 10 ou au contraste
de phase x 20.
 Compter le nombre de Demodex folliculorum et le rapporter pour chaque oeil au
nombre de cils prélevés (Cette notion quantitative est importante car la présence de
Demodex est fréquente chez des personnes asymptomatiques et son rôle pathogène
n’est pas clairement démontré).

 En cas de recherche négative et/ou de prélèvements épais, relire les lames après
avoir laissé s’éclaircir le prélèvement.

Demodex à coté d’un cil Demodex sur un cil

ELIMINATION DES MATERIAUX UTILISES :

Les lames négatives pourront être jetées dans l’emballage (NF) jaune pour déchets à coté
des microscopes.

DOCUMENTS DE REFERENCE :
Y. J. Golvan, P. Ambroise-Thomas, LES NOUVELLES TECHNIQUES EN PARASITOLOGIE,
1984, FLAMMARION

74
3.1.4 Recherche d’onchocercose
La recherche de cette filariose cutanée concerne principalement des sujets ayant vécu
longtemps en zone rurale d’Afrique intertropicale où elle représente encore une cause
importante de cécité. Elle nécessite le prélèvement de fragments de peau ellipsoïdes (biopsie
cutanée exsangue) déposés dans un verre de montre qui contient du sérum physiologique (12).
L’observation à la loupe binoculaire permet ensuite de mettre en évidence les microfilaires.

Ce prélèvement invasif et technique n’est réalisé que par les biologistes du service. Son
mode opératoire a également été créé et intégré dans notre système de documentation.

3.2 LE PRELEVEMENT N’EST PAS REALISE AU LABORATOIRE

3.2.1 Gestion des non-conformités

Lorsque le prélèvement n’est pas réalisé au laboratoire, il est difficile de maîtriser
l’ensemble des facteurs d’incertitude pouvant avoir une influence sur la qualité du résultat.
Même si le manuel de prélèvements permet de limiter les erreurs au moment du recueil de
l’échantillon, la pratique nous démontre qu’il est difficile de les supprimer et qu’il est fréquent
de recevoir des prélèvements non conformes. Dans ce cas, le biologiste ne doit pas accepter
l’échantillon, sauf cas particulier de prélèvement précieux (urgent ou non renouvelable) (3).

La Norme précise dans le chapitre 4.9 la nécessité de mettre en place une politique
d’identification et de maîtrise des non-conformités :

« La direction du laboratoire doit mettre en place une politique et une procédure à mettre en
œuvre en cas de non-conformité quelconque de ses analyses par rapport à ses propres
procédures (…) cette politique et cette procédure doivent garantir que (…) le personnel chargé
de résoudre le problème est identifié, les mesures à prendre sont définies, (…) les analyses
sont interrompues, (…) les actions correctives sont immédiatement entreprises, (…) la
responsabilité pour autoriser la reprise des analyses est définie et, chaque non-conformité est
documentée et enregistrée (…) »

A Limoges, une procédure détaillant la liste des non-conformités relatives à chaque

parasitose et la conduite à tenir en fonction des situations (non-conformité mineure ou majeure)
est mise à jour régulièrement.

Chaque prélèvement non conforme est enregistré sur le logiciel GLIMS par le personnel,
le compte-rendu précise la non-conformité et le prescripteur est contacté pour correction de
75
 l’erreur. Si l’analyse est malgré tout réalisée (après accord du biologiste), le résultat est rendu
sous réserve avec un commentaire adapté du biologiste.

3.2.2 Recherche de paludisme

En France métropolitaine en 2009, à partir des 2200 cas déclarés au Centre National de
Référence, le nombre de cas de paludisme d’importation a été estimé à 4000 (22). Les pays de
contamination sont majoritairement situés en Afrique subsaharienne (90%) et les cas de
paludisme sont dus dans 82% des cas à Plasmodium falciparum (l’espèce potentiellement
mortelle). Plasmodium vivax et Plasmodium ovale sont chacun incriminés dans 6-7% des cas
et Plasmodium malariae dans 2% des cas (23). Il faut souligner que les accès graves
représentaient 8,6% de l’ensemble des accès palustres en 2009. De manière quasi systématique,
les accès graves, et a fortiori mortels, sont associés à un retard de la prise en charge médicale.
Le diagnostic du paludisme d’importation reste donc en toutes circonstances un diagnostic
d’urgence.

Par ailleurs, une donnée épidémiologique récente doit être prise en compte ; une cinquième
espèce : Plasmodium knowlesi a été reconnue comme responsable d’accès palustres
potentiellement graves chez l’Homme (22) (23). Ce Plasmodium simien, présent en Asie du
Sud-est a été mis en cause, depuis les années 2000, dans de nombreuses infections humaines
aux Philippines, en Thaïlande, au Laos, en Chine et à Singapour. En 2008, trois cas de
paludisme d’importation à P.knowlesi ont été diagnostiqués en Suède, Grande-Bretagne et aux
Etats-Unis (23). En 2010, le CHU de Toulouse a mis en évidence le premier cas d’importation
en France. A ce jour, seule la PCR permet de faire le diagnostic de cette espèce
cytologiquement proche de P. malariae (23).

A l’échelle du praticien, médecin généraliste, urgentiste, les suspicions d’accès palustre

restent rares. Une enquête de l’AFSSAPS montre qu’en 2004, sur 3341 laboratoires, 67% n’ont
diagnostiqué aucun cas de paludisme et seulement 5% plus de 5 cas (24). Dans ces conditions,
seule une attitude systématique, à savoir la recherche de plasmodies devant toute fièvre au
retour depuis moins de 2 mois d’une zone d’endémie combinée à l’utilisation de techniques de
diagnostic simples et performantes assurent une prise en charge optimale (23).

76
3.2.2.1 Pré-analytique

En cas de paludisme à P. falciparum, le pronostic vital du patient dépend directement de

la rapidité d’administration par le soignant d’un traitement adapté et donc de la rapidité du
diagnostic au laboratoire.

C’est pourquoi, devant un accès palustre potentiel, tous les moyens possibles doivent être
mis en œuvre pour que le laboratoire rende au clinicien un résultat optimal dans les plus brefs
délais.

3.2.2.1.1 Aide à la prescription

En pratique, le principal problème pouvant retarder le clinicien dans sa prise de décision

de rechercher un paludisme est de savoir si le lieu où le patient symptomatique a séjourné est
une zone d’endémie palustre et donc à risque.

Pour accompagner le médecin, nous avons établi une fiche d’aide à la prescription
(Illustration 12) où les informations épidémiologiques données ne se veulent pas exhaustives
mais ont pour but de mettre en évidence les principales situations au cours desquelles une
recherche est indispensable.

L’autre intérêt de cette fiche est de préciser au prescripteur les modalités pré-analytiques à
respecter afin que l’échantillon de sang parvienne dans les mains de la personne effectuant la
recherche dans les plus brefs délais tout en respectant les conditions de conformité.

77
 Illustration 12 : Aide à la prescription recherche directe de paludisme

AIDE A LA PARA F1 P RES 001 A

PRESCRIPTION : Date d’application:
Recherche directe 01/02/2011
de PALUDISME

DEVANT TOUTE FIEVRE AU RETOUR D’UN SEJOUR EN ZONE

D’ENDEMIE

LA RECHERCHE DIRECTE DE PALUDISME DOIT ETRE EFFECTUEE EN

URGENCE

-Prévenir le laboratoire de parasitologie de 8h à 17h au 53916 (après 17h prévenir le

poste de garde de bactériologie au 56161).
-Donner au laboratoire les renseignements clinico-épidémiologiques concernant
la durée du séjour,
le lieu de séjour,
la date de retour,
les signes cliniques associés,
la chimioprophylaxie (molécule, observance)
-Noter sur le bon ces renseignements, le nom et le n° de tél. du prescripteur
-Attention, le prélèvement devra être remis en main propre (prévenir le coursier)

Demander :
- « paludisme recherche directe » (frottis, goutte épaisse, antigénémie)
(prélever 2 tubes EDTA)
La sérologie paludisme est inutile (souvent négative lors d’un accès palustre) sauf
suspicion de paludisme viscéral évolutif ou pour le diagnostic rétrospectif d’une
fièvre.

QUELLES SONT LES PRINCIPALES ZONES A RISQUE ?

Toute la ceinture intertropicale :
-AFRIQUE+++ (en ville comme à la campagne) : 90% des cas
-SUD EST ASIATIQUE
-CONTINENT SUD AMERICAIN (Amazonie surtout)
-MOYEN ORIENT (INDE)

Territoires français : Guyane française et Mayotte

Pour tout renseignement, appeler le laboratoire (53916) ou

http://www.invs.sante.fr/beh/2010/21_22/beh_21_22_2010.pdf 78
3.2.2.1.2 Fiche de renseignements

Le dialogue entre le clinicien et le biologiste est essentiel au moment d’une recherche de

paludisme. Certains renseignements cliniques, épidémiologiques et biologiques vont permettre
au biologiste d’évaluer, avant même la phase analytique, le risque d’accès palustre et le cas
échéant d’orienter son diagnostic d’espèce.

Le signe clinique majeur lors d’un accès palustre est la fièvre, elle est isolée dans 20% des
cas (24) ou associée à d’autres symptômes peu spécifiques tels que des troubles digestifs
(nausées, vomissements, diarrhées) ou un syndrome grippal (asthénie, céphalées, myalgie,
toux). L’absence de fièvre est rare mais possible chez certains patients (24). De ce fait, devant
tout symptôme chez un patient de retour d’un séjour en zone d’endémie, une recherche de
paludisme devra être réalisée en urgence (12) (24).

Les renseignements épidémiologiques essentiels pour évaluer le risque de paludisme

d’importation sont les pays où le patient a séjourné et la date de retour en France. En effet, plus
de 90% des cas de paludisme d’importation sont consécutifs à un séjour dans un pays
d’Afrique intertropicale, les cas restants sont pour la majorité d’entre eux contractés dans les
autres zones intertropicales du globe. Le lieu de séjour permettra également d’aider le
biologiste à faire un diagnostic d’espèce puisque P. vivax est présent en Asie, Amérique et
Afrique de l’Est et P. ovale en Afrique de l’Ouest (22). En France, 97% des accès palustres à
P. falciparum se manifestent dans les 2 premiers mois suivant le retour (22), ce qui rend peu
probable (mais toujours envisageable) un accès au-delà de cette période. Pour les autres
espèces, des accès peuvent survenir plus longtemps après le retour (jusqu’à plusieurs années
pour P. malariae).

La notion de chimioprophylaxie est également importante dans l’approche diagnostique.

En effet, lorsque celle-ci est inadaptée ou mal prise, une faible parasitémie pourra rendre
compliquée la mise en évidence du parasite.

La thrombopénie, présente dans 60 à 85% des accès, est un argument diagnostique de taille
à rechercher systématiquement.

Tous ces renseignements sont collectés dans une fiche (Illustration 13) remplie lors de
chaque recherche de paludisme et qui sera conservée 18 mois.

79
 Illustration 13 : Fiche de renseignements lors d’une recherche de paludisme

RENSEIGNEMENTS à PARA E1 P POSTA 010 A

demander lors de la Date d’application:
RECHERCHE du 01/02/2011
PALUDISME

Lors de toute demande de recherche de paludisme, téléphoner pour obtenir les renseignements
indiqués sur la feuille jointe.

IDENTITE DU PATIENT : IDENTITE DE L’INTERNE/BIOLOGISTE :

NOM : ………………… Prénom : …………… NOM : …………………….

Naissance : ……… N° d’analyse : …………. Prénom : …………………..

Pays de résidence (12 derniers mois) : …………………………………

Voyage : Pays : ………………………….

Départ : …./…./….
Retour : …./…./….

Autres pays visités et date : …………………….

…………………….
…………………….

SYMPTOMES MOTIVANT LA DEMANDE : ………………………………………..

SI FIEVRE, DATE : …./…./….

THROMBOPENIE : OUI / NON

CHIMIOPROPHYLAXIE :

Médicament : ……………………………

Posologie : ………………………………

Suivie 4 semaines après le retour : OUI / NON

COMMENTAIRES :

80
3.2.2.2 Analytique

3.2.2.2.1 Procédure et modes opératoires

La stratégie diagnostique doit répondre aux recommandations de la conférence nationale

de consensus révisée en 2007 c’est à dire être réalisable 24 heures sur 24 et fournir une réponse
en moins de 2 heures.

Idéalement, la recherche doit associer une technique microscopique de concentration :

goutte épaisse rapide ou QBC® Malaria Test, dotée d’une très bonne sensibilité et un frottis
mince qui assure une identification correcte des espèces (24). Les tests de diagnostic rapide se
positionnent comme une technique de deuxième ligne (25).

L’avènement des techniques récentes de biologie moléculaire permet d’avoir une nouvelle
approche diagnostique du paludisme grâce à un gain de sensibilité (seuil de 0,005 à 0,5
parasites/µL) et de spécificité (23) (26). Néanmoins, les techniques microscopiques avec
concentration (goutte épaisse ou QBC®) restent les méthodes de choix pour le diagnostic
d’urgence du paludisme de par leur rapidité d’exécution.

Un travail comparant la PCR aux techniques microscopiques dans le diagnostic du

paludisme d’importation a analysé les données provenant de 15 études qui regroupaient 2416
sujets ; 1108 étaient positifs en microscopie et 1204 l’étaient par PCR, ce qui correspond à une
sensibilité globale des méthodes microscopiques de 92% (23) (27).

Au CHU de Limoges, les données épidémiologiques de 2009 sont comparables aux

données nationales avec 78% d’accès palustres à P. falciparum sur les 9 cas déclarés (2 accès à
P. vivax) ; l’absence d’accès graves peut être attribuée à une prise en charge précoce.

La recherche de paludisme au laboratoire fait l’objet d’une procédure particulière

d’urgence de jour comme de nuit pour laquelle nous avons réalisé un logigramme (Illustration
16) nous y associons la réalisation de 3 techniques :

- La lecture au microscope du frottis mince coloré au May-Grünwald-Giemsa avec une durée

de coloration au Giemsa 10% de 5 minutes.

- La lecture au microscope de la goutte épaisse.

- 1 test commercialisé de diagnostic rapide (BinaxNow Malaria®) permettant la recherche

d’antigènes de Plasmodium dans le sang.

Pour chacune de ces méthodes nous avons réactualisé, référencé les modes opératoires
(Illustrations 17, 18, 19) puis procédé à leur évaluation en vue d’une validation.
81
 Illustration 14 : Photographie d’un frottis mince avec 3 trophozoïtes de Plasmodium falciparum

Illustration 15 : Photographie d’une goutte épaisse avec nombreux trophozoïtes de Plasmodium falciparum

82
 Illustration 16 : Procédure de recherche de paludisme (logigramme)

PARA P APAR 004 A

RECHERCHE
Date d’application:
DIRECTE 01/02/2011
DE PALUDISME

APPEL PAR LE CLINICIEN PRESCRIPTEUR

-apprécier l’urgence de la demande
-remplir la fiche de renseignements (classeur bleu)
Si pas d’appel -préciser au clinicien les conditions de conformité :
par le 2 tubes EDTA identifiés, patient et prescripteur identifiés,
prescripteur, heure de prélèvement précisée, prélèvement remis en main
appeler ce propre le plus rapidement possible.
prescripteur RECEPTION DU PRELEVEMENT
(normalement remis en main propre, mais les zones de dépôt des
prélèvements de routine sont à surveiller régulièrement)

EN PARASITOLOGIE (technicien, interne ou AU LABORATOIRE DE GARDE DE

biologiste du service) BACTERIOLOGIE (interne ou technicien)
-Du lundi au vendredi de 8h à 17h -Du lundi au vendredi de 17h à 8h
-Le samedi de 8h à 13h -Le samedi à partir de 13h jusqu’au lundi à 8h

-vérifier la conformité du prélèvement

-Placer un tube EDTA à 4° (réfrigérateur pièce de parasitologie)

-ENREGISTREMENT INFORMATIQUE DE LA
-PAS D’ENREGISTREMENT INFORMATIQUE
DEMANDE PARA P PREA 001.doc
-identifier lames et Binax now® par le nom, prénom, date
-coller une étiquette sur les tubes
de naissance
-identifier lames et Binax now® par le numéro
d’échantillon
PHASE ANALYTIQUE :
-lancer la recherche d’antigènes PARA MO2 P APAR 004 .doc
-pendant la révélation de l’ICT : réaliser les frottis, les GE et lancer leurs colorations PARA MO1 P APAR 004 .doc
/ PARA MO3 P APAR 003 .doc
-commencer la lecture du frottis durant la fin de la coloration des GE
-lire le résultat de la recherche d’antigènes
-Poursuivre la lecture du frottis et lire la GE
-Si présence de Plasmodium, faire le diagnostic d’espèce PARA MO3 P APAR 004 .docx
-En cas de positivité à P. falciparum : estimer la parasitémie PARA MO4 P APAR 004 .doc

VALIDATION DU RESULTAT
APPELER LE BIOLOGISTE D’ASTREINTE POUR
PAR UN BIOLOGISTE OU UN INTERNE HABILITE CONFIRMATION DU RESULTAT
(cf. Procédure de validation biologique PARA P POSTA 010 .doc)

Communiquer le résultat au médecin prescripteur dans l’heure suivant la réception du prélèvement

Pour tout diagnostic d’accès palustre, déclaration VALIDATION DU RESULTAT PAR UN BIOLOGISTE OU
au CNR par un biologiste PARA MO5 P APAR 004 .doc UN INTERNE HABILITE dans les heures ouvrable du labo
(cf. Procédure de validation biologique PARA P POSTA 010 .doc)

83
 Illustration 17 : Mode opératoire frottis sanguin et coloration courte au May-Grünwald-Giemsa

FROTTIS SANGUIN PARA MO1 P APAR 004 A

ET COLORATION Date d’application:
COURTE AU MAY 01/02/2011
GRÜNWALD GIEMSA
(MGG)

INDICATIONS :
Recherche de paludisme
Prélèvement apporté rapidement au laboratoire du fait de l’urgence de l’examen,
remis en main propre à un personnel du laboratoire,
accompagné d’une demande avec renseignements épidémiologiques et cliniques
(voyage, date du retour, chimioprophylaxie, fièvre ...)

MATERIEL :
Pour la réalisation du frottis mince :
 Lames à bords rodés et plage dépolie
 Lamelles 22X32
 Micropipette réglable de 0 à 20 µL et embouts adaptés
 Gants en latex
Pour la réalisation de la coloration de MGG :
 Boîtes de pétri avec chevalets pour support de lames
 Dispositif d’aspiration de 3mL et de 1mL
 Tube plastique 15mL pour réaliser la dilution

REACTIFS :
 May-Grünwald à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 Giemsa à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 PBS conservé dans le réfrigérateur du secteur de parasitologie
 Alcool ménager

TECHNIQUE :

Réalisation du frottis sanguin mince :

 Ecrire sur la plage dépolie (au crayon à papier) le nom du patient, la date et l’heure ou le
numéro d’analyse si le demande a été enregistrée dans le logiciel du laboratoire
 Mettre les gants
 Dégraisser la lame à l’alcool
 Après avoir mélangé le tube EDTA par 5 retournements successifs, déposer 2 µL de
sang à côté du bord dépoli de la lame, en évitant la formation de bulles (A)

 Poser le petit bord de la lamelle au contact de la lame, à gauche de la goutte de sang,

l’angle formé à droite étant de 45° environ pour un frottis mince(B) ; plus l’angle est petit,
plus le frottis est mince. Maintenir cet angle et le contact avec une légère pression jusqu’à
la fin de l’opération (inverser pour les gauchers)

84
 FROTTIS SANGUIN PARA MO1 P APAR 004 A
ET COLORATION Date d’application:
COURTE AU MAY 01/02/2011
GRÜNWALD GIEMSA
(MGG)

Rq : lors d’une recherche de filariose, de leishmaniose ou de trypanosomose, réaliser un

frottis plus épais.

 Faire glisser la lamelle vers la goutte de sang, à son contact il se répartit régulièrement
par capillarité le long du bord de la lamelle (C)

 Faire glisser alors la lamelle vers la gauche, jusqu'au bout, d’un mouvement assez lent et
régulier en maintenant le contact et la pression nécessaire pour que le sang s’étale en
une couche mince, uniforme derrière la lamelle (D). Un bon frottis est contenu
entièrement dans la lame (bords et franges) (E)

 Sécher immédiatement en agitant à l’air par des mouvements d’éventail vifs

ASPECTS POSSIBLES DU FROTTIS

85
 FROTTIS SANGUIN PARA MO1 P APAR 004 A
ET COLORATION Date d’application:
COURTE AU MAY 01/02/2011
GRÜNWALD GIEMSA
(MGG)

Coloration du frottis :

Coloration MGG courte (cf. Validation de la technique de recherche de paludisme PARA

P APAR 014 A.doc), cette méthode est utilisée dans la recherche de paludisme :
La coloration s’effectue sur les lames déposées sur des baguettes dans des boîtes de Pétri.
Recouvrir complètement les lames avec les différents réactifs déposés à l’aide des dispositifs
d’aspiration :
 May Grunwald (MG) : 2 minutes (1,5mL)
 Pendant ce temps d’attente, préparer une dilution de Giemsa à 10% dans un tube
plastique de 15mL (1mL de Giemsa dans 9mL de PBS).
 Ajouter sur le MG 1,5mL de PBS : 1 minute
 Rejeter le colorant MG + PBS, dans la boîte à coloration mais ne pas rincer la lame.
 Déposer le Giemsa à 10% : 5 minutes (2,5mL)
 Rincer longuement à l’eau courante.
 Essuyer l’arrière des lames avec du papier absorbant imbibé d’alcool ménagé dilué
 Sécher en appliquant du papier absorbant sur les frottis (sans frotter)
 Finir de sécher les lames par des mouvements d’éventail.
 Examiner au microscope à immersion avec l’objectif 100.

La coloration MGG longue (cf. PARA MO2 P APAR 003 A) s’effectue de la même façon,
mais le temps de pose du Giemsa dilué est de 20 mn.
Cette méthode est utilisée pour les parasites plus difficilement colorables (recherche de
filariose, recherche de leishmaniose viscérale, recherche de Trypanosomoses…) ou pour des
recherches mycologiques.

LECTURE :
 Vérifier la qualité de la coloration: absence de tâches, couleur rose/orangée des
hématies, coloration en violet des noyaux des polynucléaires et des lymphocytes, petites
granulations violettes des neutrophiles, grosses granulations roses des éosinophiles.
En cas de mauvaise qualité, réaliser un nouveau frottis mince coloré.
 En cas de recherche de paludisme et/ou de babésiose, lire le frottis avec une goutte
d’huile à immersion au grossissement 100 (200 champs minimum). Cette lecture doit se
faire en priorité dans une zone ou les hématies sont bien étalées et séparées afin de
mettre en évidence les trophozoïtes et/ou gamétocytes et/ou schizontes.
 En cas de recherche de microfilaires, lire la totalité du frottis au grossissement 10 (sans
oublier les franges).

REFERENCES :
Cahier de formation biologie médicale BIOFORMA N°23, parasites sanguins, Décembre 2001
Y. J. Golvan, P. Ambroise-Thomas, LES NOUVELLES TECHNIQUES EN PARASITOLOGIE,
1984, FLAMMARION

86
 Illustration 18 : Mode opératoire réalisation et coloration d’une goutte épaisse

PARA MO3 P APAR 003 A

REALISATION ET
Date d’application:
COLORATION DE 01/02/2011
GOUTTE EPAISSE

INDICATIONS :
Recherche de paludisme
Recherche de filariose
Recherche de babésiose
Recherche réalisée sur tube de sang total EDTA

MATERIEL :
 Lames à bords rodés et plage dépolie
 Boîtes de Pétri avec chevalets pour support de lame
 Dispositifs d’aspiration de 3mL et de 1mL
 Micropipette réglable de 0 à 20µL et embouts adaptés
 Tubes Plastique 15mL
 Tubes à hémolyse
 Bécher
 Sèche cheveux
 Platine chauffante (pièce de parasitologie)
 Gants

REACTIFS :
 Giemsa à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 PBS conservé dans le réfrigérateur du secteur de parasitologie
 Saponine à 2% dans de l’eau physiologique. Des aliquotes de 500 µL en tubes à hémolyse
sont stockés à 4°C (conservation 1 an). Une réserve est au congélateur (même
réfrigérateur à -20°C (tiroir n°2) (conservation : 2 ans).

TECHNIQUE :

Réalisation de la goutte épaisse :

 Mettre les gants.
 Ecrire sur la plage dépolie le nom du patient, la date et l’heure ou le numéro d’analyse si
la demande a déjà été enregistrée dans le logiciel du laboratoire.
 Déposer 15 µL de sang au 1/3 de 2 lames à bords rodés et plage dépolie.
 Etaler en tournant avec le coin d’une autre lame ou lamelle 22x32 de façon à obtenir une
tache d’environ 1 cm de diamètre.
 Mettre aussitôt à sécher sur une platine chauffante réglée à 46°C pendant 3-4 minutes.
Retirer la lame dès que l’évaporation est terminée.

87
 PARA MO3 P APAR 003 A
REALISATION ET
Date d’application:
COLORATION DE 01/02/2011
GOUTTE EPAISSE Page 88 sur 187

Coloration de la goutte épaisse :

La coloration s’effectue à plat sur les lames déposées sur des baguettes dans des boîtes de
Pétri.
 Préparer (dans un tube plastique de 15mL) 10mL de colorant de Giemsa dilué au 1/10
ème dans le PBS
 Y ajouter 5 gouttes de saponine (gouttes d’environ 25µL).
 Recouvrir complètement chaque lame avec cette solution et laisser colorer pendant 20
minutes.

 Rincer précautionneusement dans un bécher avec de l’eau déminéralisée : plonger la

lame dans l’eau, l’y laisser le temps que le colorant soit éliminé. Renouveler l’eau 1 fois si
besoin
 Sécher en dirigeant le sèche-cheveux sur l’arrière de la lame.

LECTURE :
 La goutte doit être bien sèche.
 Lire au microscope optique au grossissement x10 (recherche de microfilaires) et x100
avec une goutte d’huile à immersion (recherche de protozoaires sanguicoles).
 Vérifier la qualité de la coloration par la présence de lymphocytes et de polynucléaires
colorés en violet et l’absence de tâches, le fond doit être rose pale.
 Rechercher la présence de trophozoïtes et/ou gamétocytes et/ou schizontes ou de
microfilaires selon la recherche.
 Lire au minimum 200 champs.

REFERENCES :
Brenier-Pinchart MP, Pinel C, Grillot R et Ambroise-Thomas P. Le diagnostic du paludisme
dans les régions non endémiques : valeurs, limites et complémentarité des méthodes
actuelles. Ann Biol Clin 2000 ;58 :310-15
Y. J. Golvan, P. Ambroise-Thomas, « LES NOUVELLES TECHNIQUES EN
PARASITOLOGIE », 1984, FLAMMARION.

88
 Illustration 19 : Mode opératoire recherche d’antigènes de Plasmodium

PARA MO2 P APAR 004 A

RECHERCHE
Date d’application:
D’ANTIGENES 01/02/2011
BinaxNow Malaria®

INDICATIONS :
Diagnostic du paludisme
La recherche s’effectue à partir de sang sur tube EDTA (bouchon violet)

MATERIEL :
 micropipette réglable de 0 à 20 µL et embouts adaptés (secteur de parasitologie)

REACTIFS :
 coffret Binax now® Malariae (conservé à température ambiante au dessus de la paillasse de
parasitologie)

TECHNIQUE :
 Sortir la carte test de sa pochette juste avant de l’utiliser.
 Ouvrir la carte et la poser à plat sur la surface de travail.
 Mélanger le tube de sang par retournements successifs (6 fois).
 A l’aide de la pipette, déposer lentement 15 µL de sang total EDTA au niveau de la zone
violette du buvard (coté droit du dispositif).
 Mettre ensuite 2 gouttes du réactif contenu dans le petit flacon A sous la zone violette
(laisser la première goutte pénétrer avant d’ajouter la deuxième). Ne pas ajouter de réactif A
directement sur le tampon violet.
 Laisser migrer le sang lysé rouge le long de la bandelette de test jusqu’à sa limite
supérieure. Remarque : Si la migration du sang est bloquée à mi-chemin après 1 minute,
ajouter une goutte de réactif A sous la zone violette de dépôt du sang.
 Juste avant que le sang n’atteigne la base du tampon blanc sur le haut de la bandelette,
laisser tomber lentement 4 gouttes du réactif A sur le haut du coté gauche du dispositif.
 Retirer la protection adhésive du bord droit du dispositif quand le sang arrive en haut de la
bandelette test.
 Refermer la carte et bien appuyer le long du bord droit de la fenêtre de résultats.

LECTURE :
La notice recommande la lecture du kit à 15 mn, cependant les bandes peuvent apparaître
plus rapidement voire après 15 mn. Il est donc préférable de surveiller régulièrement la
révélation du test (avant et après la lecture des lames).
Le résultat ne sera valide que si la bande C apparaît (bande contrôle).
L’interprétation se fera en fonction des résultats du frottis, de la goutte épaisse et du
contexte épidémiologique PARA P POSTA 010 .doc

89
 PARA MO2 P APAR 004 A
RECHERCHE
Date d’application:
D’ANTIGENES 01/02/2011
BinaxNow Malaria®

C C C C C
T1 T1 T1 T1 T1
T2 T2 T2 T2 T2

Test non valide Test négatif Positif à Positif à Positif à

(Faux négatif possible) P. falciparum P. ovale P. falciparum
(Faux positif possible) ou P. vivax ou infection mixte
ou P. malariae
voire infection mixte
(2 de ces espèces)

C : bande contrôle
T1 : met en évidence l’antigène HRP-2 spécifique de P. falciparum
T2 : met en évidence un antigène pan-plasmodique (aldolase)

La présence de toute ligne, même très faible, est à prendre en considération.

Attention, la sensibilité du test dépend de l’espèce concernée et de la parasitémie. Des faux
négatifs sont possibles (mutants HRP-2, faible parasitémie…) ainsi que des faux positifs
(Facteur rhumatoïde…) ; se reporter à la notice du coffret.

REFERENCES :
Gabriella A. Farcas et Al., Evaluation of the Binax Now® ICT Test versus PCR and
microscopy for the detection of Malaria in return travellers, Am. J. Trop. Med. Hyg., 69(6),
2003, pp. 589-592

ANNEXE :
Notice du coffret BinaxNow Malariae®

90
3.2.2.2.2 Validation des méthodes

Pour ces techniques qualitatives dont l’utilisation est recommandée par les sociétés
savantes, une validation basée essentiellement sur la vérification bibliographique de leurs
performances était envisageable (5). Les résultats de nos contrôles de qualité externes
(AFSSAPS) pouvant suffire à prouver la compétence du laboratoire.

Cependant, nous avons estimé que ces contrôles externes de qualité (frottis sanguins
colorés) permettaient de rendre compte du niveau d’expertise du microscopiste (élément
déterminant dans la recherche du paludisme), mais ne prenaient pas en compte la sensibilité
propre des techniques utilisées au laboratoire. Cette notion ne pouvant satisfaire notre volonté
d’assurer au patient et au prescripteur la concordance de nos résultats avec les données de la
littérature, nous avons décidé de procéder à une vérification initiale sur site plus approfondie.

Ceci répondant d’ailleurs à l’exigence du paragraphe 5.5.2 de la Norme :

" Les validations doivent être aussi approfondies que nécessaire pour répondre aux besoins de
l'application ou du domaine d'application concerné(e).

La vérification continue sera basée sur la mise en place de contrôles internes de qualité
(chapitre 3.2.2.2.3) et sur le suivi des contrôles externes AFSSAPS.

3.2.2.2.2.1 Vérification initiale sur site

- Echantillons inclus dans la vérification :

Notre vérification sur site a été réalisée à partir des 47 échantillons adressés au laboratoire
pour recherche de paludisme du 01/01/2010 au 27/09/2010 et sur lesquelles ont été effectuées
simultanément les 3 techniques (frottis mince, goutte épaisse, BinaxNow Malaria®).

Nous avions conclu, durant cette période, à 12 échantillons positifs : 10 à P. falciparum, 1

à P. ovale et 1 à P. malariae (pour celui-ci, la recherche d’antigènes avec le BinaxNow
Malaria® était négative).

D’autre part, 34 échantillons avaient été rendus négatifs et 1 échantillon avait présenté
des résultats discordants avec des recherches microscopiques sur frottis et goutte épaisse

91
négatives mais une recherche d’antigènes positive. La sensibilité de la recherche d’antigènes
étant inférieure à celle de la goutte épaisse, cette situation correspond à 2 hypothèses :

- Faux positif BinaxNow Malaria® possible en cas de présence de facteur rhumatoïde (23)
(28).

- Patient traité pour accès palustre avec persistance d’antigènes dans le sang (jusqu’à 15
jours après) (23).

Il est évident que les renseignements cliniques et épidémiologiques sont alors

indispensables. Pour ce cas précis, le patient, vivant en France et d’origine africaine, avait
consulté aux urgences pour frissons (sans fièvre observée au moment de la consultation) 4
jours après son retour de Guinée ; le médecin urgentiste nous précise l’absence d’accès
palustre et de traitement antérieurs. Dans ce contexte, le biologiste conseille au clinicien une
surveillance par un contrôle biologique rapproché.

- Confirmation des résultats (méthode):

Le paludisme d’importation n’est pas une maladie à déclaration obligatoire, cependant le

laboratoire procède à la déclaration systématique de chaque accès palustre au CNR de La Pitié-
Salpêtrière à Paris ainsi qu’à l’envoi des échantillons positifs (frottis mince coloré, goutte
épaisse et tube de sang total conservé à 4°C). Nos 12 échantillons positifs (ainsi que le
diagnostic d’espèce) ont donc pu être confirmés par cette procédure.

Pour confirmer nos recherches négatives, nous avons eu recours à 2 méthodes :

- Une méthode prospective basée sur le suivi des résultats d’autres examens biologiques
réalisés en parallèle (hémoculture, ponction lombaire…) et prouvant l’implication d’un
autre agent infectieux ou d’une autre étiologie dans la fièvre ; l’évolution clinique
favorable du patient permettant ensuite d’éliminer l’hypothèse d’un accès palustre occulte
associé et donc de considérer ces échantillons comme de vrais négatifs.

- Pour les échantillons n’ayant pu bénéficier de cette confirmation (absence d’autre examen
biologique demandé par le clinicien, absence d’étiologie retrouvée), la congélation à -80°C
des échantillons négatifs et de l’échantillon discordant a permis de procéder à leur envoi
différé au laboratoire de parasitologie du CHU de Rangueil à Toulouse pour un contrôle
par biologie moléculaire. Ce laboratoire est accrédité selon la Norme NF EN ISO 15189 et
92
 la technique utilisée est la PCR LightCycler Roche® dont les performances sont optimales
(23) (26).

Sur les 34 échantillons négatifs et l’échantillon discordant, un seul n’a pu être vérifié par
aucune de ces 2 méthodes : le patient concerné, perdu de vue, n’ayant pas eu d’autre examen
microbiologique et l’échantillon sanguin n’ayant pas été congelé. Il a donc été exclu de l’étude.

L’évaluation de la sensibilité, de la spécificité et de la corrélation entre les 3 techniques a

ensuite été réalisée à partir des 46 échantillons retenus.

Recherches positives (Tableau 6) :

Tous nos envois au CNR du paludisme de La Pitié-Salpêtrière à Paris ont été confirmés
avec un diagnostic d’espèce correct.

Sur ces 12 échantillons, les frottis et les gouttes épaisses ont été rendus tous positifs (d=12
vrais positifs) alors que la recherche d’antigènes était faussement négative (b=1) lors d’un
accès à P. malariae.

93
 Tableau 6 : Recherches de paludisme positives du 1erjanvier au 27 septembre 2010

Recherches de paludisme positives du 1er janvier au 27 septembre 2010

GOUTTE trophozoïtes/ plaquettes
Dossier FROTTIS BinaxNow® conclusion
EPAISSE µL G/L
100001010 positif positif négatif P. malariae 109

100152128 positif positif positif P. falciparum 12000 130

100187412 positif positif positif P. ovale ND

100194413 positif positif positif P. falciparum 53000 48

100196356 positif positif positif P. falciparum 40000 249

100218067 positif positif positif P. falciparum 8000 169

100238390 positif positif positif P. falciparum 80000 50

100242976 positif positif positif P. falciparum 288 367

100257365 positif positif positif P. falciparum 102000 48

100270971 positif positif positif P. falciparum 27000 115

100279161 positif positif positif P. falciparum 6000 121

100279844 positif positif positif P. falciparum 48 240

1 Faux
Négatif

94
Recherches négatives et recherche discordante (Tableaux 7 et 8):

L’enquête prospective a permis de retrouver chez 16 patients une autre étiologie

imputable à la symptomatologie (pneumopathie, péritonite, salmonellose, réactivation EBV,
cryptosporidiose, méningite à entérovirus, poussée lupique…).

Pour 7 autres patients, seule l’évolution clinique et biologique favorable en l’absence de

traitement ont permis de confirmer les recherches négatives.

Les 11 échantillons restants, pour lesquels le contexte épidémio-clinique était très

évocateur d’un accès palustre, ont été vérifiés par PCR au CHU de Rangueil à Toulouse :

- 10 ont été confirmés comme négatifs

- 1 était discordant (positif à Plasmodium sp. mais négatif avec les amorces spécifiques), il a
été retenu comme positif ; il s’agissait de l’échantillon initialement discordant
(frottis/goutte épaisse négatives/recherche d’antigènes positive). Un nouvel interrogatoire
de ce patient a permis de révéler que les symptômes (fièvre…) avaient débuté avant son
retour de Guinée et donné lieu à un traitement par un médicament local à base
d’Artemisine expliquant ainsi la négativité de nos examens microscopiques.

95
 Tableau 7 : Recherches de paludisme négatives du 1er janvier au 27 septembre 2010

Recherches de paludisme négatives au CHU LIMOGES du 01 janvier au 27 septembre 2010

Dossier épidémiologie motif plaquettes G/L étiologie finale/PCR évolution clinique
100004720 fièvre 522 favorable
100010359 fièvre 526 pneumopathie favorable
100041105 fièvre 316 favorable
100043294 342 favorable
100045950 fièvre 230 Plaie S. aureus+Pyo. favorable
100061824 fièvre 40 S. myéloprolifératif
100084478 retour<2 mois cytolyse hépatique 157 favorable
100091710 fièvre 311 favorable
100102126 retour 1 an convulsions idiopathique favorable
100106562 retour<2 mois cytolyse hépatique 290 Hépatite B évolutive favorable
100109613 225 favorable
100115601 fièvre 315 Poussée lupique favorable
100125665 fièvre 529 Réactivation EBV favorable
100128766 Algérie il y a 4 ans anémie 363 Drépanocytose
100129798 Algérie il y a 4 ans anémie 363 Drépanocytose
100132814 Mayotte il y a 7 mois thrombopénie favorable
100154912 Afrique du Nord fièvre/douleurs abdo 186 pyélonéphrite
100160679 fièvre/diarrhée 301 Lupus favorable
100173214 Congo il y a 1 mois fièvre 399 ? PERDU DE VUE
100180405 Madagascar il y a 8 mois fièvre/abcés foie 287 Péritonite favorable
100193381 Cameroun il y a 5j fièvre/céphalées 165 Méningite entérovirus favorable
100199947 fièvre/diarrhée 122 salmonellose favorable
100205032 Mayotte il y a 4 ans fièvre 515 péritonite favorable
100212545 Guadeloupe fièvre/thrombopénie ? PCR-
100213695 thaïlande fièvre/myalgies 264 PCR-
100220147 Brésil,balades+piqûres fièvre 391 PCR-
100223507 Congo il y a 1 semaine céphalées 171 PCR-
100225756 Cameroun il y a 3ans fièvre/anémie 228 PCR-
100234403 Niger fièvre/diarrhée 407 PCR-
100236669 Gabon durant 2 ans convulsions (connu) 405 PCR-
100238835 Inde Fièvre 369 PCR-
100240451 Burkina Faso il y a 3j diarrhée+fièvre 400 Cryptosporidiose favorable
100243442 vit Congo fièvre intermittente 223 PCR-
100269601 Guinée il y a 8 jours fièvre/douleurs abdo 235 PCR-

Tableau 8 : Résultat de paludisme discordant

Résultat discordant: Test rapide positif/frottis et Goutte épaisse négatifs

100253994 Guinée il y a 6 jours nausées 233 PCR + fièvre

96
 Au total, on disposait réellement de 33 échantillons non infectés (M- =33) et 13
échantillons infectés (M+ =13).

Concernant le frottis mince et la goutte épaisse, nous avons rendu 33 vrais négatifs (a=33)
et 1 faux négatif (b=1 faux négatif dû au traitement). Pour le BinaxNow Malaria®, nous avons
rendu 33 vrais négatifs (a=33) et 1 faux négatif (b=1 faux négatif à P. malariae).

- Evaluation du seuil de détection (Tableau 9):

Le seuil de détection ne fait pas partie des éléments à évaluer pour la validation d’une
méthode qualitative (5). Nous avons cependant choisi de l’aborder pour la recherche du
paludisme où cette notion peut s’avérer importante au moment de la validation biologique d’un
résultat.

Au cours de faibles parasitémies, il est possible que le frottis et/ou le test de diagnostic
rapide soit négatifs. La goutte épaisse permet alors de rendre une parasitémie (souvent très
faible) à partir du décompte du nombre de trophozoïtes pour 500 leucocytes et, par
extrapolation, un nombre de trophozoïtes / µL de sang.

En travaillant à partir d’échantillons faiblement parasités, il est donc possible d’obtenir des
valeurs seuils de positivité (en trophozoïtes /µL) pour chaque technique qui pourront ensuite
être comparées aux données bibliographiques.

97
 Sur nos 12 échantillons positifs à Plasmodium, 2 étaient faiblement parasités (48/µL et
288/µL). La surveillance biologique à J3 des patients traités pour accès à P. falciparum nous a
permis d’obtenir d’autres échantillons faiblement parasités (48/µL, 77/µL, 13/µL et 160/µL).

Tableau 9 : Approche du seuil de détection grâce au suivi post-thérapeutique

Patients traités bénéficiant d'un suivi post thérapeutique à J3 du 1er janvier au 27

septembre 2010
Dossier FROTTIS GOUTTE EPAISSE BinaxNow® conclusion Trophozoïtes / µL

100197565 négatif positif positif P. falciparum 48

100219537 négatif positif Non fait P. falciparum 77

100242014 négatif positif Non fait P. falciparum 13

100259367 positif positif Non fait P. falciparum 160

3.2.2.2.2.2 Interprétation des résultats

Frottis mince coloré au MGG et goutte épaisse :

Les sensibilités diagnostiques du frottis mince et de la goutte épaisse (probabilité que la

recherche donne un résultat positif en présence de Plasmodium) sont dans cette vérification de
92% ce qui est satisfaisant au regard des données de la littérature puisque la sensibilité d’un
frottis mince coloré au MGG est de 70 à 80% (toutes parasitémies confondues) (25). Elle sont
d’ailleurs sous-estimées si on tient compte du fait que le seul faux négatif, pour ces deux
techniques, présentait une parasitémie à la limite de détection en PCR causée par un traitement
(cas rare en pratique).

L’analyse supplémentaire des résultats des échantillons faiblement parasités (suivi après 3
jours de traitement) met en évidence 3 frottis négatifs mais qui correspondent à des taux
inférieurs au seuil de détection décrit dans la littérature (48, 77 et 13 parasites/µL pour un seuil
de 100-300/µL) (23) ; on s’aperçoit de plus que 2 frottis ont permis de détecter des
trophozoïtes pour des valeurs inférieures ou à la limite du seuil (48 et 160 parasites/µL). On
remarque également que les gouttes épaisses sont positives alors que la densité parasitaire est
proche du seuil de détection décrit dans la littérature (48, 77 et 13 parasites/µL pour un seuil de

98
10 à 20/µL) (23) (29) (30) (31) et que le frottis mince se négative. Nos techniques du frottis
mince et de goutte épaisse présentent donc un seuil de détection satisfaisant.

Les spécificités diagnostiques du frottis et de la goutte épaisse (probabilité que la

recherche donne un résultat négatif en l’absence du parasite) sont de 100% ce qui est excellent.

Si on étudie la présence ou l’absence de parasite (hors suivi post-thérapeutique), la

concordance entre le frottis mince et la technique de la goutte épaisse est de 100%. La
concordance entre le frottis mince et le BinaxNow Malaria® est de 96%, tout comme celle
entre la goutte épaisse et le BinaxNow Malaria®. Les causes de discordance sont acceptables
puisqu’elles correspondent à un accès palustre à P. malariae non détecté par le BinaxNow
Malaria® et à la présence d’un traitement instauré avant le diagnostic, à l’origine du frottis et
de la goutte épaisse négatifs.

Au regard de ces résultats, nous pouvons conclure à la validité analytique du frottis

mince et de la goutte épaisse.

BinaxNow Malaria® :

La sensibilité diagnostique du test BinaxNow Malaria® est de 92% ce qui est satisfaisant
au regard des données de la littérature car le seul faux négatif observé correspond à un accès à
P. malariae, espèce pour laquelle le test est connu pour être peu performant (30). La spécificité
diagnostique s’élève à 100% ce qui est excellent.

Si on étudie la présence ou l’absence de parasite (hors suivi post-thérapeutique), la

concordance entre le BinaxNow Malaria® et les techniques microscopiques est de 96% ; les
discordances correspondent, pour un échantillon, à la mise en évidence de l’accès à P.
malariae par le frottis et la goutte épaisse et, pour un autre échantillon, à la positivité du
BinaxNow Malaria®, en raison de la persistance d’antigènes dans le sang après traitement,
alors que les parasites n’étaient plus détectables en microscopie. Ces discordances mettent
surtout en évidence la complémentarité de nos techniques.

Au regard de ces résultats, nous pouvons conclure à la validité analytique du

BinaxNow malaria®.

99
 D’après le guide GTA 04 (5), les résultats de la vérification doivent faire l’objet d’un
document cohérent et clair, avec une acceptation formelle de la validité opérationnelle des
techniques. Ce document doit comporter la présentation de la technique, la détermination des
paramètres à vérifier, la détermination des objectifs à atteindre, la compilation et le traitement
statistique des données obtenues et la décision quant à la validité opérationnelle de la
technique.

Le document SH FORM 44, disponible sur le site du Cofrac, est destiné à servir de
formulaire de présentation des résultats de validation de méthode qualitative (7).

Les illustrations suivantes (Illustrations 20, 21 et 22) ont donc été élaborées à partir des
résultats obtenus, sur le modèle de ce formulaire.

100
 Illustration 20 : Validation du frottis mince coloré au MGG dans la recherche de paludisme

FICHE DE VALIDATION Référence : SH FORM 44

du frottis sanguin mince coloré au May-
LOGO Grünwald-Giemsa pour la recherche de Indice de révision : 00
Cofrac
paludisme
Date d’application :
(portée B étendue) 15/04/11

Note : le laboratoire se réfèrera au tableau du § 9.2.1 du Document Cofrac SH GTA 04 pour connaître les
paramètres à déterminer dans le cadre d'une vérification sur site (portée A) ou d’une validation (portée B)
et complétera une fiche par examen de biologie médicale.

EXAMEN DE BIOLOGIE MEDICALE :

Frottis sanguin mince coloré au May-Grünwald-Giemsa dans la recherche de
paludisme

DESCRIPTION DE LA METHODE

Analyte/Mesurande : Trophozoïtes/gamétocytes/schizontes de Plasmodium

Recherche directe du parasite dans les hématies par un microscopiste.

L’étalement des hématies sur lame et la coloration de celle-ci au May-
Principe de la Mesure :
Grünwald-Giemsa permettent de visualiser et d’identifier les différentes
espèces de Plasmodium.
Qualitative par recherche au microscope (objectif 100) au minimum 30
Méthode de mesure :
minutes par du personnel habilité
Marquage CE (Oui/Non)
Non (oui pour les réactifs)
Codage C.N.Q. (s’il existe) :

101
 FICHE DE VALIDATION Référence : SH FORM 44
du frottis sanguin mince coloré au May-
LOGO Grünwald-Giemsa pour la recherche de Indice de révision : 00
Cofrac paludisme
Date d’application :
(portée B étendue) 15/04/11

MISE EN OEUVRE

Collet Jean-Philippe (interne niveau 2 habilité)

Opérateurs (Habilitation) : Martin Michèle (technicienne)
Internes habilités
Biologistes
Le laboratoire procède à la déclaration systématique de chaque accès
palustre au CNR de La Pitié-Salpêtrière à Paris ainsi qu’à l’envoi des
échantillons positifs (frottis mince coloré, goutte épaisse et tube de sang
total). Nos 12 échantillons positifs (ainsi que le diagnostic d’espèce) ont
donc pu être confirmés par cette procédure.

Pour confirmer nos recherches négatives, nous avons eu recours à 2

méthodes :

- Une méthode prospective basée sur le suivi des résultats

d’autres examens biologiques réalisés en parallèle (hémoculture,
ponction lombaire…) et prouvant l’implication d’un autre agent
Procédure de validation : infectieux ou d’une autre étiologie dans la fièvre ; l’évolution
clinique favorable du patient permettant ensuite d’éliminer
l’hypothèse d’un accès palustre occulte associé et donc de
considérer ces échantillons comme de vrais négatifs.

- Pour les échantillons n’ayant pu bénéficier de cette confirmation

(absence d’autre examen biologique demandé par le clinicien,
absence d’étiologie retrouvée…), la congélation à -80°C des
échantillons négatifs et de l’échantillon discordant a permis de
procéder à leur envoi différé au laboratoire de parasitologie du
CHU de Rangueil à Toulouse pour un contrôle par biologie
moléculaire (PCR LightCycler Roche®).

Procédure de gestion de la portée

flexible :
Période d'évaluation : Du 01/01/2010 au 27/09/2010
Date de mise en service :
Autorisation par :

102
 FICHE DE VALIDATION Référence : SH FORM 44
LOGO du frottis sanguin mince coloré au May-
Cofrac Grünwald-Giemsa pour la recherche de Indice de révision : 00
paludisme
Date d’application :
(portée B étendue) 15/04/11

MAITRISE DES RISQUES

Données d'entrée Points critiques à maîtriser Modalités de maîtrise

Type d'échantillon primaire Manuel de prélèvement, catalogue

(urine, sang, Type de Sang sur tube EDTA des analyses, aide à la prescription,
récipient (tubes, …), Additifs : gestion des non conformités

Prétraitement de l'échantillon
Confection d’un frottis sanguin mince Mode opératoire, habilitation
(centrifugation, dilution, …) :
Main d'œuvre (habilitation du
personnel) : Préciser les
Techniciens, internes, biologistes Procédures d’habilitation
références des procédures et
enregistrements.
-Respect des temps de
Conditions ambiantes
fixation/coloration -Fixation/coloration chronométrées
requises (ex : température,
-Conditions de coloration : pH 7,2 à -Utilisation de tampon PBS
organisation des locaux,
7,4 -Aménagement des locaux
éclairage,…) :
-Zone de lecture au calme
Référence du réactif Marqués CE
-May-Grünwald Biolyon® FR09766
(référence fournisseur, ® Contrôle interne (témoin positif)
-Giemsa Biolyon FR09265
version) : PARA MO1 P QUA 011 A
Matériau de références Coloration des hématies et leucocytes
Qualité de la coloration
(témoins) : Contrôles internes positifs
Equipements :
Exigences métrologiques*
(définir les paramètres Micropipette réglable (0 à 20µL)
Maintenance
critiques) Microscopes
Exigences informatiques*
spécifiques
* item à renseigner si nécessaire

103
 FICHE DE VALIDATION Référence : SH FORM 44
LOGO du frottis sanguin mince coloré au May-
Cofrac Grünwald-Giemsa pour la recherche de Indice de révision : 00
paludisme
Date d’application :
(portée B étendue) 15/04/11

EVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE

SPECIFICITE & SENSIBILITE DIAGNOSTIQUES

(indispensable en portée B)
On considère M+: sujets infectés a : Vrais négatifs
M- : sujets non infectés b : Faux négatifs
S- : Recherches négatives c : Faux positifs
S+ : Recherches positives d : Vrais positifs

33M- 13M+
S- a=33 b=1
S+ c=0 d=12

Se= 12/ (12+1)

Sp= 33/ (33+0)

La sensibilité diagnostique (Se) du frottis (probabilité que la

Résultats de l'étude
recherche donne un résultat positif en présence de Plasmodium) est
de 92% ce qui est satisfaisant au regard des données de la littérature
puisque la sensibilité d’un frottis mince coloré au MGG est de 70 à
80% (toutes parasitémies confondues) avec un temps de lecture
minimal recommandé de 20 minutes (25). Elle est d’ailleurs sous
estimée si on tient compte du fait que le seul faux négatif présentait
une parasitémie à la limite de détection en PCR due à un traitement
(cas rare en pratique).

La spécificité diagnostique du frottis mince (probabilité que la

recherche donne un résultat négatif en l’absence du parasite) est de
100% ce qui est excellent.

CONTAMINATION

Inter échantillon pour les

Non applicable
paramètres sensibles :
Inter réactif si nécessaire : Non applicable
Vérification bibliographique : Non applicable
Vérification sur site : Non applicable

104
 FICHE DE VALIDATION Référence : SH FORM 44
LOGO du frottis sanguin mince coloré au May-
Cofrac Grünwald-Giemsa pour la recherche de Indice de révision : 00
paludisme
Date d’application :
(portée B étendue) 15/04/11

COMPARAISON DE METHODES

Méthode précédente, autre méthode ®

Goutte épaisse et BinaxNow Malaria
utilisée dans le laboratoire :
Nombre de mesures : 46
Descriptif de l'échantillon étudié : 13 échantillons infectés et 33 non infectés
Méthode d'exploitation des résultats
Pourcentage de résultats identiques (présence ou absence)
(études des concordances) :
Résultats et interprétations des La concordance entre le frottis et la technique de la goutte épaisse
discordances : est de 100%.
®
La concordance entre le frottis et le BinaxNow Malaria est de 96%.

Les causes de discordance sont acceptables puisqu’elles

correspondent à un accès palustre à P. malariae non détecté par le
BinaxNow Malaria® et à la présence d’un traitement instauré avant le
diagnostic et à l’origine de la persistance d’antigènes dans le sang et
d’un frottis négatif.
Conclusions et dispositions : Ces discordances sont en accord avec les données bibliographiques
(études indépendantes et fournisseur BinaxNow Malaria®).

Elles mettent surtout en évidence la complémentarité de nos 3

techniques qui sont toujours réalisées conjointement.

ROBUSTESSE

Données bibliographiques : Non applicable

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

STABILITE

Données bibliographiques : Non applicable

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

Commentaires éventuels :
A partir du suivi post-thérapeutique à J3 de certains patients nous avons également tenté d’évaluer le seuil de
détection (parasites/µL) en comparaison avec la goutte épaisse (voir résultats).

105
 Illustration 21 : Validation de la goutte épaisse dans la recherche de paludisme

Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO de la goutte épaisse pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée B étendue) Date d’application :
15/04/11

Note : le laboratoire se réfèrera au tableau du § 9.2.1 du Document Cofrac SH GTA 04 pour connaître les
paramètres à déterminer dans le cadre d'une vérification sur site (portée A) ou d’une validation (portée B)
et complétera une fiche par examen de biologie médicale.

EXAMEN DE BIOLOGIE MEDICALE :

Goutte épaisse colorée au Giemsa dans la recherche de paludisme

DESCRIPTION DE LA METHODE

Analyte/Mesurande : Trophozoïtes/gamétocytes de Plasmodium

Recherche directe du parasite par un microscopiste. La confection d’une

goutte épaisse sur lame puis la lyse des hématies avec de la saponine
permettent de concentrer les parasites ; la coloration au Giemsa permet
Principe de la Mesure :
la visualisation de trophozoïtes libres voire de gamétocytes. La
différentiation des espèces de Plasmodium est possible mais demande
une grande expérience.

Qualitative par recherche au microscope (objectif 100) au minimum 30

minutes (ou 200 champs) par du personnel habilité
Le microscopiste recherche des trophozoïtes à partir de leur noyau violet
Méthode de mesure :
et de leur cytoplasme bleu, ils peuvent prendre plusieurs formes
(« parachute », « point d’exclamation » ou « annulaire ») ; des
gamétocytes peuvent aussi être observés.

Marquage CE (Oui/Non)
Non (oui pour les réactifs)
Codage C.N.Q. (s’il existe) :

106
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO de la goutte épaisse pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée B étendue) Date d’application :
15/04/11

MISE EN OEUVRE

Collet Jean-Philippe (interne niveau 2 habilité)

Opérateurs (Habilitation) : Martin Michèle (technicienne)
Internes habilités
Biologistes
Le laboratoire procède à la déclaration systématique de chaque accès
palustre au CNR de La Pitié-Salpêtrière à Paris ainsi qu’à l’envoi des
échantillons positifs (frottis coloré, goutte épaisse et tube de sang total).
Nos 12 échantillons positifs (ainsi que le diagnostic d’espèce) ont donc
pu être confirmés par cette procédure.

Pour confirmer nos recherches négatives, nous avons eu recours à 2

méthodes :

- Une méthode prospective basée sur le suivi des résultats

d’autres examens biologiques réalisés en parallèle (hémoculture,
ponction lombaire…) et prouvant l’implication d’un autre agent
Procédure de validation :
infectieux ou d’une autre étiologie dans la fièvre ; l’évolution
clinique favorable du patient permettant ensuite d’éliminer
l’hypothèse d’un accès palustre occulte associé et donc de
considérer ces échantillons comme de vrais négatifs.

- Pour les échantillons n’ayant pu bénéficier de cette confirmation

(absence d’autre examen biologique demandé par le clinicien,
absence d’étiologie retrouvée…), la congélation à -80°C des
échantillons négatifs et de l’échantillon discordant a permis de
procéder à leur envoi différé au laboratoire de parasitologie du
CHU de Rangueil à Toulouse pour un contrôle par biologie
®
moléculaire (PCR LightCycler Roche ).
Procédure de gestion de la portée
flexible :
Période d'évaluation : Du 01/01/2010 au 27/09/2010
Date de mise en service :
Autorisation par :

107
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO de la goutte épaisse pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée B étendue) Date d’application :
15/04/11

MAITRISE DES RISQUES

Données d'entrée Points critiques à maîtriser Modalités de maîtrise

Type d'échantillon primaire Manuel de prélèvement, catalogue

(urine, sang, Type de Sang sur tube EDTA des analyses, aide à la prescription,
récipient (tubes, …), Additifs : gestion des non conformités

Prétraitement de l'échantillon
Confection de la goutte Mode opératoire, habilitation
(centrifugation, dilution, …) :
Main d'œuvre (habilitation du
personnel) : Préciser les
Techniciens ou internes Procédures d’habilitation
références des procédures et
enregistrements.
Conditions ambiantes
-Respect du temps de coloration -Coloration chronométrées
requises (ex : température,
-Rinçage -Rinçage dans un bécher adapté
organisation des locaux,
-Zone de lecture au calme -Aménagement des locaux
éclairage,…) :
Référence du réactif Marqués CE
-Giemsa Biolyon® FR09265
(référence fournisseur, Contrôle interne (témoin positif)
-Saponine S 2149
version) : PARA MO1 P QUA 011 A
Matériau de références Contrôle de l’absence de tâches
Qualité de la coloration
(témoins) : Contrôle des leucocytes
Equipements :
Exigences métrologiques*
(définir les paramètres Micropipette réglable (0 à 20µL)
Maintenance
critiques) Microscopes
Exigences informatiques*
spécifiques
* item à renseigner si nécessaire

108
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO de la goutte épaisse pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée B étendue) Date d’application :
15/04/11

EVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE

SPECIFICITE & SENSIBILITE DIAGNOSTIQUES

(indispensable en portée B)
On considère M+: sujets infectés a : Vrais négatifs
M- : sujets non infectés b : Faux négatifs
S- : Recherches négatives c : Faux positifs
S+ : Recherches positives d : Vrais positifs

33M- 13M+
S- a=33 b=1
S+ c=0 d=12

Se= 12/ (12+1)

Sp= 33/ (33+0)

La sensibilité diagnostique (Se) de la goutte épaisse (probabilité

Résultats de l'étude
que la recherche donne un résultat positif en présence de
Plasmodium) est de 92% ce qui est satisfaisant au regard des
données de la littérature. Comme pour le frottis sanguin, elle est sous
estimée si on tient compte du fait que le seul faux négatif présentait
une parasitémie à la limite de détection en PCR due à un traitement
(cas rare en pratique).

La spécificité diagnostique de la goutte épaisse (probabilité que la

recherche donne un résultat négatif en l’absence du parasite) est de
100% ce qui est excellent.

CONTAMINATION

Inter échantillon pour les

Non applicable
paramètres sensibles :
Inter réactif si nécessaire : Non applicable
Vérification bibliographique : Non applicable
Vérification sur site : Non applicable

109
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO de la goutte épaisse pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée B étendue) Date d’application :
15/04/11

COMPARAISON DE METHODES

Méthode précédente, autre méthode ®

Frottis sanguin mince coloré au MGG et BinaxNow Malaria
utilisée dans le laboratoire :
Nombre de mesures : 46
Descriptif de l'échantillon étudié : 13 échantillons infectés et 33 non infectés
Méthode d'exploitation des résultats
Pourcentage de résultats identiques (présence ou absence)
(études des concordances) :
Résultats et interprétations des La concordance entre la technique de la goutte épaisse et celle du
discordances : frottis est de 100%.
®
La concordance entre la goutte épaisse et le Binax Now Malaria est
de 96%.

Les causes de discordance sont acceptables puisqu’elles

correspondent à un accès palustre à P. malariae non détecté par le
Binax et à la présence d’un traitement instauré avant le diagnostic et à
l’origine de la persistance d’antigènes dans le sang et d’une goutte
épaisse négative.
Conclusions et dispositions :

Ces discordances sont en accord avec les données bibliographiques

(études indépendantes et fournisseur BinaxNow Malaria®).

Elles mettent surtout en évidence la complémentarité de nos 3

techniques qui sont toujours réalisées conjointement.

ROBUSTESSE

Données bibliographiques : Non applicable

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

STABILITE

Données bibliographiques : Non applicable

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

Commentaires éventuels :
A partir du suivi post-thérapeutique à J3 de certains patients nous avons également tenté d’évaluer le seuil de
détection (nombre de parasites/µL) (voir résultats) ces résultats confirment la sensibilité supérieure de la goutte
épaisse.

110
 Illustration 22 : Validation du BinaxNow Malaria® dans la recherche de paludisme

Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO du BinaxNow Malaria® pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée A standard) Date d’application :
15/04/11

Note : le laboratoire se réfèrera au tableau du § 9.2.1 du Document Cofrac SH GTA 04 pour connaître les
paramètres à déterminer dans le cadre d'une vérification sur site (portée A) ou d’une validation (portée B)
et complétera une fiche par examen de biologie médicale.

EXAMEN DE BIOLOGIE MEDICALE :

BinaxNow Malaria®

DESCRIPTION DE LA METHODE

Analyte/Mesurande : Antigène spécifique de Plasmodium falciparum (HRP-II) et un antigène

pan-spécifique: aldolase (commun à toutes les espèces de Plasmodium).

Test immuno-chromatographique utilisant des anticorps monoclonaux

immobilisés sur une membrane permettant de détecter, dans des
Principe de la Mesure :
échantillons de sang total, un antigène spécifique de Plasmodium
falciparum (HRP-II) et/ou un antigène pan-spécifique : l’aldolase
(commun à toutes les espèces de Plasmodium).

Qualitative par lecture visuelle

La lecture doit se faire 15 minutes après fermeture du kit. Tout résultat
Méthode de mesure : devra être validé par l’apparition de la ligne de contrôle (C).
La présence de toute ligne de test même très faible indique un résultat
positif.
Marquage CE (Oui/Non)
oui
Codage C.N.Q. (s’il existe) :

111
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO du BinaxNow Malaria® pour la recherche Indice de révision : 00
Cofrac de paludisme
(portée A standard) Date d’application :
15/04/11

MISE EN OEUVRE

Collet Jean-Philippe (interne niveau 2 habilité)

Opérateurs (Habilitation) : Martin Michèle (technicienne)
Internes habilités
Biologistes
Le laboratoire procède à la déclaration systématique de chaque accès
palustre au CNR de La Pitié-Salpêtrière à Paris ainsi qu’à l’envoi des
échantillons positifs (frottis mince coloré, goutte épaisse et tube de sang
total). Nos 12 échantillons positifs (ainsi que le diagnostic d’espèce) ont
donc pu être confirmés par cette procédure.

Pour confirmer nos recherches négatives, nous avons eu recours à 2

méthodes :

- Une méthode prospective basée sur le suivi des résultats

d’autres examens biologiques réalisés en parallèle (hémoculture,
ponction lombaire…) et prouvant l’implication d’un autre agent
Procédure de validation :
infectieux ou d’une autre étiologie dans la fièvre ; l’évolution
clinique favorable du patient permettant ensuite d’éliminer
l’hypothèse d’un accès palustre occulte associé et donc de
considérer ces échantillons comme de vrais négatifs.

- Pour les échantillons n’ayant pu bénéficier de cette confirmation

(absence d’autre examen biologique demandé par le clinicien,
absence d’étiologie retrouvée…), la congélation à -80°C des
échantillons négatifs et de l’échantillon discordant a permis de
procéder à leur envoi différé au laboratoire de parasitologie du
CHU de Rangueil à Toulouse pour un contrôle par biologie
®
moléculaire (PCR LightCycler Roche ).
Procédure de gestion de la portée
flexible :
Période d'évaluation : Du 01/01/2010 au 27/09/2010
Date de mise en service :
Autorisation par :

112
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO du BinaxNow Malaria® pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée A standard) Date d’application :
15/04/11

MAITRISE DES RISQUES

Données d'entrée Points critiques à maîtriser Modalités de maîtrise

Type d'échantillon primaire Manuel de prélèvement, catalogue

(urine, sang, Type de Sang sur tube EDTA des analyses, aide à la prescription,
récipient (tubes, …), Additifs : gestion des non conformités

Prétraitement de l'échantillon
Mode opératoire, habilitation
(centrifugation, dilution, …) :
Main d'œuvre (habilitation du
personnel) : Préciser les
Techniciens ou internes Procédures d’habilitation
références des procédures et
enregistrements.
Conditions ambiantes -Conservation à température
-Conservation à température ambiante
requises (ex : température, ambiante
-Révélation chronométrées
organisation des locaux, -Respect du délai de 15 mn
éclairage,…) : -Bon éclairage lors de la lecture
Référence du réactif
REF 660-000
(référence fournisseur, Marqué CE
version) :
Matériau de références
Ligne de contrôle Si absente, test non valide
(témoins) :
Equipements :
Exigences métrologiques*
(définir les paramètres Micropipette réglable (0 à 20µL)
Maintenance
critiques) Microscopes
Exigences informatiques*
spécifiques
* item à renseigner si nécessaire

113
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO du BinaxNow Malaria® pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée A standard) Date d’application :
15/04/11

EVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE

SPECIFICITE & SENSIBILITE DIAGNOSTIQUES

(indispensable en portée B)
On considère M+: sujets infectés a : Vrais négatifs
M- : sujets non infectés b : Faux négatifs
S- : Recherches négatives c : Faux positifs
S+ : Recherches positives d : Vrais positifs

33M- 13M+
S- a=33 b=1
S+ c=0 d=12

Se= 12/ (12+1)

Sp= 33/ (33+0)

La sensibilité diagnostique (Se) du test (probabilité que la recherche

Résultats de l'étude
donne un résultat positif en présence de Plasmodium) est de 92% ce
qui est satisfaisant au regard des données de la littérature : une étude
indépendante parrainée par l’OMS en 2008 a évalué les performances
de 68 tests de diagnostic rapide commercialisés, en testant chaque kit
avec 2 panels d’échantillons positifs à P. falciparum : un constitué de
spécimens faiblement parasités (200 trophozoïtes /µL) et un autre
constitué d échantillons parasités à 2000 trophozoïtes/µl ; Le
®
BinaxNow Malaria a montré des sensibilités respectives à 91.1% et
100% et se situe parmi les plus performants, de plus aucun faux
positif n’a été rapporté(32).
Le résultat faussement négatif correspond à un accès à P. malariae.
La spécificité diagnostique du test est de 100% ce qui est excellent.

CONTAMINATION

Inter échantillon pour les

Non applicable
paramètres sensibles :
Inter réactif si nécessaire : Non applicable
Vérification bibliographique : Non applicable
Vérification sur site : Non applicable

114
 Référence : SH FORM 44
FICHE DE VALIDATION
LOGO du BinaxNow Malaria® pour la recherche
Cofrac Indice de révision : 00
de paludisme
(portée A standard) Date d’application :
15/04/11

COMPARAISON DE METHODES

Méthode précédente, autre méthode

Frottis sanguin mince coloré au MGG et goutte épaisse
utilisée dans le laboratoire :
Nombre de mesures : 46
Descriptif de l'échantillon étudié : 13 échantillons infectés et 33 non infectés
Méthode d'exploitation des résultats
Pourcentage de résultats identiques (présence ou absence)
(études des concordances) :
®
Résultats et interprétations des La concordance du BinaxNow Malaria avec le frottis est de 96%.
discordances : La concordance du BinaxNow Malaria® avec la goutte épaisse est
de 96%.

Les causes de discordance sont acceptables puisqu’elles

correspondent à un accès palustre à P. malariae non détecté par le
Binax (espèce pour laquelle le test est peu performant) et à la
présence d’un traitement instauré avant le diagnostic et à l’origine de
de recherches microscopiques négatives avec persistance
d’antigènes dans le sang.
Conclusions et dispositions : Ces discordances sont en accord avec les données bibliographiques
(études indépendantes et fournisseur BinaxNow Malaria®).

Elles mettent surtout en évidence la complémentarité de nos 3

techniques qui sont toujours réalisées conjointement.

ROBUSTESSE

Données bibliographiques : Non applicable

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

STABILITE

Données bibliographiques : oui

Résultats : Non applicable
Conclusions et dispositions : Non applicable

115
3.2.2.2.3 Contrôles internes de qualité

Le contrôle qualité constitue la validation continue du processus analytique et fait suite à la

validation initiale de la méthode (5) (6). Il doit s’envisager en fonction des différents contextes
auxquels est confronté le biologiste ainsi que des différentes spécialités de la Biologie
Médicale. Sa mise en œuvre doit être simple, assurer une sécurité nécessaire et suffisante, à un
coût raisonnable, être rapide dans la détection des anomalies, sans alerte inutile (6).

La difficulté concernant ces méthodes qualitatives qui recherchent des pathologies

relativement rares est de disposer d’échantillons parasitologiques « vrais ». Ceci ne permet
donc pas d’envisager un contrôle qualité avec des fréquences comparables à celles des analyses
à résultats quantitatifs. En France, en l’absence de recommandations, le choix de la périodicité
du contrôle est du ressort du biologiste (6). Pour la parasitologie, des frottis chargés en
parasites peuvent être utilisés.

Les contrôles externes AFSSAPS permettent d’évaluer la compétence du microscopiste

sans toutefois rendre compte de la capacité de nos réactifs à mettre en évidence le parasite
puisqu’ils sont basés sur la lecture d’un frottis sanguin déjà coloré au MGG. Nous nous
sommes donc efforcés de mettre en place des contrôles internes capables de valider notre
coloration MGG.

Deux problèmes majeurs étaient à prendre en compte ; tout d’abord la faible incidence des
accès palustres à Limoges et la durée de vie limitée des trophozoïtes dans les échantillons de
sang total.

Le seul moyen de conserver des contrôles positifs non colorés est de fixer au méthanol des
frottis de sang impaludé puis de les stocker à -80°C. Cette méthode est directement accessible
sur le site du CDC Dpdx (15) à partir duquel nous avons mis en place un mode opératoire de
préparation des contrôles internes (Illustration 23). Il parait logique de réaliser un contrôle
interne lors de chaque changement de flacon de MGG ou pour tout problème remettant en
cause la qualité de la coloration. Le suivi de ces contrôles est notifié dans la fiche du réactif.

116
 Illustration 23 : Préparation des contrôles internes pour coloration M.G.G.

PREPARATION DES PARA MO1 P QUA 011 A

CONTROLES QUALITE Date d’application:
INTERNES PALUDISME 01/02/2011
POUR COLORATION MGG Page 117 sur 187

INDICATIONS :
Contrôle qualité de chaque nouveau flacon de colorant dans le cadre de la vérification
continue des méthodes de recherche directe de paludisme.
Vérification technique décidée par le biologiste.
Ce mode opératoire décrit la réalisation et la conservation de frottis sanguins positifs aux
différentes espèces de Plasmodium.

MATERIEL :
 sang EDTA d’un patient positif à Plasmodium
 lames à bord dépoli
 lamelles

REACTIFS :
 méthanol pur

TECHNIQUE :
 Sélectionner le sang EDTA (prélèvement < 1h) d’un patient positif à une espèce
de Plasmodium ; la recherche de paludisme devra avoir permis de mettre en évidence au
moins 1 trophozoïte tous les 2 à 3 champs.
 Noter l’espèce plasmodiale et la parasitémie sur chaque lame.
 Faire autant de frottis sanguins que nécessaires cf PARA MO1 P APAR 004 A.doc
 Faire sécher les frottis à température ambiante en les aérant (comme un éventail).
 Fixer les frottis par trempage dans du méthanol à 100% et laisser sécher.
 Conserver les lames à -80°Cdans la boite réservée à cet effet (située dans le congélateur
1BHFR 08 :3 porte en partant du haut, tiroir du milieu à droite).
 Avant utilisation, sortir une lame et laisser évaporer la condensation.

LECTURE :
 Vérifier, après coloration cf PARA MO1 P APAR 004 A.doc, la positivité de la lame pour
valider les colorants et remplir la fiche réactif MGG.

REFERENCES :
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/PDF_Files/malaria_staining_benchaid.pdf

117
3.2.2.2.4 Evaluation externe de la qualité

3.2.2.2.4.1 Contrôles AFSSAPS

L’évaluation externe de la qualité de notre recherche directe de paludisme s’appuie sur la

réalisation et le suivi des contrôles AFSSAPS.

Par le biais de frottis minces colorés, le paludisme est la parasitose sanguine la plus
souvent abordée au cours de ces contrôles. C’est alors la capacité du personnel à mettre en
évidence le parasite au microscope, à faire un diagnostic d’espèce et à estimer une parasitémie
qui est évaluée. L’exploitation des résultats depuis 2000 n’a révélé aucune erreur concernant la
mise en évidence de Plasmodium et le diagnostic d’espèce.

Tableau 10 : Résultats des contrôles externes AFSSAPS (frottis minces)

ANNEE REPONSES DU LABORATOIRE REPONSES ATTENDUES

2000 PAR2 P. falciparum (trophozoïtes) P. falciparum (trophozoïtes)

2001 PAR1 Absence de parasite Absence de parasite

2002 PAR1 P. ovale (trophozoïtes, gamétocytes) P. ovale (trophozoïtes, gamétocytes)

2003 PAR1 Loa Loa (microfilaires) Loa Loa (microfilaires)

2003 PAR2 Trypanosoma brucei Trypanosoma brucei

P. falciparum (trophozoïte, schizontes,
2004 PAR1 P. falciparum (trophozoïte, schizontes)
gamétocytes)
2004 PAR2 P. falciparum (trophozoïtes) P. falciparum (trophozoïtes)

2005 PAR1 P. ovale (trophozoïtes, gamétocytes) P. ovale (trophozoïtes, gamétocytes)

2005 PAR2 Leishmania donovani (promastigotes) Leishmania donovani (promastigotes)

P. falciparum (trophozoïtes,
2006 PAR1 P. falciparum (trophozoïtes)
gamétocytes)
P. malariae (trophozoïtes, schizontes, P. malariae (trophozoïtes, schizontes,
2007 PAR1 gamétocytes) gamétocytes)
2008 PAR1 P. falciparum (trophozoïtes) P. falciparum (trophozoïtes)

2009 PAR1 P. falciparum (trophozoïtes) P. falciparum (trophozoïtes)

2010 PAR1 P. falciparum (trophozoïtes) P. falciparum (trophozoïtes)

3.2.2.2.4.2 Confirmation par le Centre National de Référence

La déclaration de nos accès palustres au CNR de la Pitié-Salpêtrière ainsi que l’envoi de

lames colorées et d’un tube EDTA permet une confirmation continue de nos diagnostics
d’espèce.

118
3.2.2.3 Post-analytique

Les résultats discordants observés pour un échantillon au cours de la vérification sur site
illustrent l’importance du contexte épidémiologique, de la clinique et des informations
recueillies lors de la phase pré-analytique.

Ces renseignements permettent au biologiste d’évaluer un risque d’accès palustre, et en

fonction de celui-ci, d’interpréter les résultats de manière adaptée. L’avis rendu au clinicien
pourra s’avérer déterminant dans la suite de la prise en charge. Certains renseignements
permettent également d’évaluer la gravité de l’accès palustre.

Devant l’importance de la phase post-analytique, nous avons rédigé une procédure de

validation biologique des résultats permettant de rendre une interprétation et un avis au
prescripteur. Les 2 logigrammes suivants (Illustrations 24 et 25) sont issus de cette procédure.

Illustration 24 : Logigramme décisionnel devant un frottis mince positif

LE FROTTIS EST POSITIF : FAIRE UN DIAGNOSTIC D’ESPECE

cf. PARA MO2 P APAR 004 A .doc

P. falciparum P. malariae* P. ovale P. vivax

Confronter le diagnostic d’espèce au résultat du BinaxNow Malaria®

Bande HRP-2+bande pan-plasmodium Bande pan-plasmodium

L’absence de bande est possible (mutant HRP-2…) ou absence de bande

P. falciparum P. falciparum
ou
P.P.malariae
malariae P. ovale P. vivax
infection mixte

Les arguments épidémiologiques

peuvent aider à différencier ces 2
RENDRE LA PARASITEMIE espèces morphologiquement très
cf. PARA MO4 P APAR 004 A.doc proches

LECTURE DE LA GOUTTE EPAISSE

à la recherche de trophozoïtes/schizontes/gamétocytes pouvant confirmer le diagnostic d’espèce
ou argumenter une co-infection

Communiquer immédiatement le résultat

au médecin prescripteur 119
*Si parasitémie ≥2% et/ou signes de gravité, évoquer P. knowlesi
 Illustration 25 : Logigramme décisionnel devant un frottis mince négatif

LE FROTTIS EST NEGATIF

Ag POSITIF Ag NEGATIF

GE - GE + GE -

-confirmer par une 2°

Faible parasitémie :
lecture de la GE (2° lecteur)
-chimioprophylaxie
-discussion clinico- mal adaptée ou mal
biologique* prise Paludisme
-prémunition chez un réfuté *
patient vivant en zone
d’endémie
Possible accès palustre
traité avant confirmation
biologique :
Binax now® positif 15 jours
après
Conclusion :
Possible faux positif : FR
(exceptionnel avec Binax Diagnostic d’espèce si possible selon [Absence de
now malaria®) Binax now® et/ou la GE (gamétocytes) Plasmodium]

Communiquer immédiatement le résultat au médecin prescripteur

*En cas de recherche négative avec forte suspicion épidémio-clinique, une surveillance clinique rapprochée et un
deuxième prélèvement seront proposés au prescripteur

120
3.2.3 Recherche de leishmaniose viscérale
Les leishmanioses sont des affections dues à des protozoaires flagellés du genre
Leishmania, elles sont transmises à l’Homme par des petits moucherons : les phlébotomes.

Seule la forme viscérale touche les organes hématopoïétiques, le parasite se multipliant

dans le sang et la moelle (33). Celle-ci connait comme agents pathogènes : Leishmania
infantum, Leishmania donovani et Leishmania archibaldi. Le diagnostic est évoqué à partir
d’arguments épidémiologiques, cliniques et biologiques (33). Les principaux foyers de
leishmaniose viscérale sont localisés dans le pourtour méditerranéen, au Moyen-Orient, en
Afrique de l’Est, en Inde et sur le continent sud-américain ; une triade classique associe fièvre
folle, splénomégalie et pâleur. La pancytopénie est typique mais s’installe progressivement.
L’incidence mondiale des formes viscérales est de 500 000 cas par an dont 90% sont recensés
dans seulement 5 pays (Inde, Népal, Bangladesh, Soudan, Brésil) (12) (34).

En France, le Centre National de Référence des Leishmania situé à Montpellier, recense

depuis 1999 les cas de leishmanioses viscérales autochtones. Entre 1999 et 2003, 118 cas de
leishmaniose viscérale ont été recensés avec des variations de 18 à 30 cas par an (34). Parmi
ces cas, 40% concernent des sujets co-infectés par le VIH et 22% des enfants de moins de 6 ans
(34). Les principales régions françaises de contamination sont celles bordant la méditerranée
où la maladie est zoonotique, due à Leishmania infantum et a pour réservoir le chien.

3.2.3.1 Pré-analytique

3.2.3.1.1 Aide à la prescription

Comme pour de nombreuses parasitoses rares, l’étape pré-analytique est essentielle, le

retard au diagnostic étant le plus souvent la conséquence d’une méconnaissance ou d’un oubli
de cette pathologie. Le diagnostic de leishmaniose viscérale se base sur des éléments
d’orientation cliniques et biologiques que nous avons synthétisés dans une aide à la
prescription (Illustration 26), celle-ci répond également à l’exigence de la Norme quant aux
conseils à donner au prescripteur à propos du choix des analyses disponibles.

C’est la ponction de moelle osseuse qui est la plus souvent contributive (12). Néanmoins la
recherche peut aussi être réalisée à partir du sang veineux, des ganglions, du foie, des
muqueuses digestives ou de liquide bronchiolo-alvéolaire (12).

121
 Illustration 26 : Aide à la prescription recherche de leishmaniose viscérale

AIDE A LA PARA F4 P RES 001 A

PRESCRIPTION : Date d’application:
Recherche d’une 01/02/2011
leishmaniose Page 122 sur 187
viscérale

-NOTION DE SPLENOMEGALIE NON ETIQUETEE + FIEVRE

- ET/OU PANCYTOPENIE (Anémie, leucopénie++)
+/- ADENOPATHIE
+/-HEPATOMEGALIE

Rq : Les jeunes enfants et les immunodéprimés sont plus fréquemment

concernés

+
SEJOUR EN ZONE D’ENDEMIE
-BASSIN MEDITERRANEEN (France : Corse, PACA, Cévennes l’été)
-ASIE (Chine, Inde, Bangladesh…)
-EST AFRICAIN
-AMERIQUE DU SUD (Brésil …)
Pour plus de renseignements, appeler le laboratoire au 53916

Demander :

- « Leishmaniose recherche directe » sur sang EDTA pour recherche

directe et PCR ou sur mœlle osseuse pour recherche directe (sur frottis),
PCR+culture (sur 1 tube EDTA et citraté)

- « Leishmaniose sérologie » (une sérologie négative n’exclut pas le

diagnostic)

122
3.2.3.2 Analytique

3.2.3.2.1 Procédure diagnostique du laboratoire

Classiquement, le diagnostic de certitude repose sur la visualisation du parasite sur un

prélèvement de moelle osseuse coloré au May-Grünwald-Giemsa avec une sensibilité
diagnostique qui dépasse 90% (35).

Le prélèvement de sang périphérique coloré au May-Grünwald-Giemsa après

leucocytocentrifugation permet d’avoir une sensibilité intéressante chez le malade
immunodéprimé (12) (34).

Au microscope, les parasites se présentent sous forme amastigote en position typiquement

intra-macrophagique mais souvent extracellulaire ; leur petite taille (2 à 5µm) et l’appariement
d’un noyau rond pourpre et d’un kinétoplaste punctiforme sont typiques.

Illustration 27 : Photographie de formes amastigotes intra-macrophagiques de Leishmania

La réalisation de cultures en association avec l’examen direct est recommandée (36). En

effet, elles permettent de redresser certains diagnostics mais aussi d’identifier l’espèce par
caractérisation biochimique des isolats.

Le diagnostic moléculaire, basé sur la détection et l’analyse des acides nucléiques du

parasite dans le sang ou la moelle, complète les approches parasitologiques et sérologiques
123
dans le diagnostic initial et a une place essentielle dans le suivi post-thérapeutique (34). La
sensibilité de cette technique approche les 100% sur la moelle comme sur le sang (35).

La positivité de la sérologie constitue une très forte présomption diagnostique. La

technique de référence est l’immunofluorescence indirecte sur promastigotes de culture. Cette
technique est de plus en plus supplantée par les tests ELISA. L’immuno-empreinte ou
Western-Blot est très sensible et spécifique, il s’agit d’un test de confirmation réservé à des
laboratoires spécialisés (34).

La sensibilité approche 100% chez l’immunocompétent par les techniques les plus
performantes, elle est moindre en cas de SIDA mais reste supérieure à 80% (35).

Notre procédure de recherche de leishmaniose viscérale fait partie de la procédure de

recherche de parasites sanguicoles. En référence à l’état actuel des données scientifiques, nous
utilisons au laboratoire une recherche directe du parasite sur frottis de moelle osseuse coloré au
May-Grünwald-Giemsa et/ou sur sang après leucocytocentrifugation. Nous y associons des
cultures répétées sur milieu de Schneider, une technique sérologique par immunofluorescence
indirecte ainsi qu’une technique de biologie moléculaire.

Le logigramme de l’Illustration 28 résume la démarche diagnostique appliquée au

laboratoire au cours des phases pré-analytique et analytique.

Le mode opératoire de la leucocytocentrifugation (Illustration 29) a été mis à jour en

référence à la méthode décrite dans le cahier de formation de Biologie Médicale BIOFORMA
N°23 : parasites sanguins (37). Concernant notre méthode de culture sur milieu de Schneider,
notre mode opératoire s’inspire du livre de Jean-Pierre Dedet : Les leishmanioses (38).

124
 Illustration 28 : Procédure de recherche de leishmanioses (logigramme)

PARA F1 P APAR 003 A

RECHERCHE DE Date d’application:
LEISHMANIOSES 01/02/2011
Page 125 sur 187

RECEPTION DES ECHANTILLONS

RECHERCHE DE RECHERCHE DE
LEISHMANIOSE CUTANEE LEISHMANIOSE
OU CUTANEO-MUQUEUSE VISCERALE

-BIOPSIE CUTANEE MOELLE OSSEUSE* ECHANTILLONS SANGUINS

-GRATTAGE Echantillons transmis au laboratoire Transmis au laboratoire par un

par un interne du laboratoire coursier
-SEROSITE CUTANEO-DERMIQUE d’hématologie (lieu de prélèvement)
Tube Tube Tube
EDTA Frottis Tube
citraté EDTA SST
citraté

Secteur de Secteur
Secteur de parasitologie directe de
parasitologie directe sérologie

-APPELER LE PRESCRIPTEUR POUR DISCUSSION CLINICO-BIOLOGIQUE

-ENREGISTREMENT DE LA DEMANDE SUR LE LOGICIEL INFORMATIQUE

Apposition Culture Culture sur LEUCO- IFI

+ sur milieu Coloration milieu CYTO- +/-
Coloration Schneider PCR MGG Schneider CENTRIFUG WB
MGG ATION

*En cas de prélèvement de MO non réalisable ou de forte

suspicion, le biologiste proposera au prescripteur une PCR
sur sang EDTA après LEUCOCYTOCENTRIFUGATION pour
éviter la ponction de MO

IFI= immunofluorescence UNE RECHERCHE DE LEISHMANIOSE VISCERALE est

indirecte également réalisable sur ponction ganglionnaire voire
WB= western blot d’autres prélèvements (LBA, biopsie digestives…)
PCR= Polymerase chaine
reaction
MGG= May-Grünwald-Giemsa

125
 Illustration 29 : Mode opératoire leucocytocentrifugation

PARA MO7 P APAR 003 B

LEUCOCYTO Date d’application:
CENTRIFUGATION 01/02/2011
Page 126 sur 187

INDICATIONS :
Cette technique est notamment utilisée pour la recherche de leishmanies.
Elle s’effectue sur :
 Sang prélevé sur EDTA (5mL) (ou citrate)
 Moelle osseuse en cas de prélèvement dilué : sur anticoagulant (EDTA ou citrate)

MATERIEL :
 Boîtes de Pétri avec chevalets pour support de lame (pièce parasitologie)
 Filtre Sartorius® (0,2µm) et seringue stérile de 2mL
 Cytocentrifugeuse cytospin 3 SHANDON (pièce mycologie)
 Matériel cytospin (cytoclips, carte filtrante, chambres jetables) dans le placard D de la
pièce mycologie
 Tube à hémolyse
 Dispositif d’aspiration 1mL
 Micropipette réglable 200 à 1000µL (pièce de sérologie)
 Lames à bords rodés et plage dépolie (pièce parasitologie)
 Microscope optique

REACTIFS :
 Solution hémolysante pour leucocytocentrifugation filtrée (cf. fiche réactif)
 May Grunwald à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 Giemsa à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 PBS conservé dans le réfrigérateur du secteur de parasitologie (95 00 106)
 Solution stérile NaCl à 0,9% flacon de 250mL

TECHNIQUE :
 Dans un tube à hémolyse, récupérer 1mL de la solution hémolysante filtrée (0,2µm).
 Ajouter 500µL de sang (100µL si recherche effectuée sur moelle).
 Mélanger doucement par retournements jusqu’à hémolyse complète (1mn).
 Prélever, avec la micropipette réglable, un volume de ce mélange qui sera fonction du
nombre de leucocytes (à récupérer sur cyberlab) :

126
 PARA MO7 P APAR 003 B
LEUCOCYTO Date d’application:
CENTRIFUGATION 01/02/2011
Page 127 sur 187

Quantité de sang hémolysé à centrifuger en

Leucocytes/µL
µL
1000-3000 500
3000-4000 350
5000-6000 300
9000-12000 200
> 12000 150

 Déposer ce volume dans deux chambres jetables de la cytospin, puis fermer avec le
bouchon
 Monter 2 dispositifs pour centrifugation : inclure une lame de microscope et la carte
filtrante entre le cytoclip et la chambre jetable.
 Placer les dispositifs dans la cuve de la cytospin.
 Refermer la cuve.
 Centrifuger 12 minutes à 2000tours/minute.
 Retirer précautionneusement les lames.
 Sécher les lames à température ambiante et colorer au May-Grünwald-Giemsa (cf MO
MGG).
 Observer longuement (30 minutes) au microscope, avec l’objectif x100 à immersion en
recherchant les formes amastigotes intra ou extra cellulaires.

Si la recherche est positive, remplir la fiche de déclaration en suivant la procédure

directement accessible sur le site internet du CNR Leishmaniose-Montpellier
http://www.parasitologie.univ-montp1.fr/ et surveiller la culture pour envoi la souche au CNR
ou de l’ADN parasitaire (typage).

REFERENCES :
Cahier de formation biologie médicale BIOFORMA N°23, parasites sanguins, Décembre 2001

127
3.2.3.2.2 Validation des méthodes

La leishmaniose viscérale est exceptionnelle en France métropolitaine et la validation des

méthodes repose avant tout sur une vérification bibliographique des performances.

Cependant, l’analyse rétrospective des résultats obtenus au laboratoire au cours des années
2008, 2009 et 2010 nous permet d’étudier la corrélation de nos méthodes. De plus, en
considérant l’association : examen direct de la moelle osseuse et cultures comme la méthode de
référence (36), nous pouvons calculer la sensibilité des autres techniques.

Pendant ces trois années, sur les 28 recherches réalisées, seulement 15 ont respecté
l’association de l’examen direct de la moelle osseuse et de la culture. Sur ces 15 recherches, un
cas de leishmaniose viscérale infantile autochtone a été authentifié en 2009. La positivité de la
PCR et de l’immunofluorescence indirecte permettent de conclure à une sensibilité de 100%
pour ces deux techniques. La corrélation de nos 4 méthodes est de 100%.

Devant le faible nombre de recherches et l’unique cas de leishmaniose viscérale, il est

évident que cette évaluation est à poursuivre et que les résultats doivent être interprétés avec
une certaine mesure.

Dans le suivi post-thérapeutique, la PCR sur sang périphérique a été la seule réalisée en
raison de sa plus grande sensibilité reconnue dans la littérature.

3.2.3.3 Post-analytique

Le résultat est validé par un biologiste qui, en fonction des éléments pré-analytiques et
analytiques, interprétera le résultat sur le compte-rendu.

128
3.2.4 Recherche de trypanosomose humaine africaine
La trypanosomose humaine africaine, aussi appelée « maladie du sommeil », est due à un
protozoaire flagellé sanguicole Trypanosoma brucei dont il existe 2 sous-espèces de répartition
géographique différente (T. b. gambiense en Afrique de l’Ouest et T. b. rhodesiense en Afrique
de l’Est) (12). Les vecteurs sont des diptères du genre Glossina plus connus sous le nom de
mouches tsé-tsé. Cette parasitose est strictement africaine et ne peut être contractée qu’en
Africaine subsaharienne principalement dans les zones rurales reculées.

En France, son diagnostic est exceptionnel, une étude rétrospective portant sur 50
laboratoires de parasitologie durant les années 1980-2004 révèle que seuls 24 cas ont été
recensés (39).

La rareté de la maladie en France ne justifie en aucun cas une prise en charge diagnostique
de seconde ligne. En effet, cette pathologie qui a une présentation clinique peu spécifique
(fièvre, asthénie, prurit, adénopathies…) évolue constamment, en l’absence de traitement, vers
une phase méningo-encéphalitique aboutissant à un état grabataire et un coma d’évolution
fatale. De plus, au début du XXI siècle, de nombreux pays d’Afrique centrale et de l’Ouest
connaissent des flambées épidémiques d’infections à T. b. gambiense (40).

On comprend alors la nécessité de mettre en place, au sein du laboratoire de parasitologie,

des mesures destinées à optimiser, en cas de besoin, la recherche de cette parasitose.

3.2.4.1 Pré-analytique

3.2.4.1.1 Motifs de la recherche

Il est très difficile pour un médecin de France métropolitaine d’évoquer une parasitose
aussi exceptionnelle. C’est l’association de plusieurs arguments cliniques, épidémiologiques et
biologiques qui doit mener le clinicien à la suspecter.

Les diverses études conduites sur les signes cliniques de la trypanosomose humaine
africaine, leur fréquence et leur proportion sont encore aujourd’hui peu fiables (41).

L’incubation est de durée variable : de quelques jours à plusieurs années et la notion de

piqûre infectante, à l’origine d’une réaction inflammatoire locale « trypanome » est souvent
oubliée au moment de l’interrogatoire. La réaction du système réticulo-histiocytaire peut être à
l’origine d’adénopathies, d’hépatomégalie et de splénomégalie et la maladie évolue
schématiquement en 2 périodes qui se chevauchent : la phase lymphatico-sanguine et la phase
méningo-encéphalitique de polarisation cérébrale.

129
 Pendant la phase lymphatico-sanguine, la fièvre est le symptôme le plus constant (12),
l’apparition de ganglions cervicaux mobiles, indolores et élastiques est un signe évocateur,
l’hépatosplénomégalie est modérée. Des manifestations cutanées sont observables, parmi elles,
le prurit est la plus fréquente (12) ; des œdèmes de la face et des trypanides (éruptions
polycycliques) sont inconstants mais évocateurs. Au cours de cette phase, il est possible
d’isoler le parasite dans le sang et/ou les ganglions.

Lors de la phase méningo-encéphalitique, le parasite a traversé la barrière hémato-

méningée et envahit le système nerveux central, le malade peut présenter en plus des
symptômes précédents, des troubles de la conscience, de la motricité, de la sensibilité, des
troubles neuro-endocriniens ainsi qu’une altération du cycle veille/sommeil donnant son nom à
la maladie. Les parasites peuvent être retrouvés grâce à leur mobilité dans le culot de
centrifugation du liquide céphalo-rachidien (LCR).

3.2.4.1.2 Rôle fondamental du biologiste

Le biologiste a un rôle déterminant dans la prise en charge de cette maladie puisque la

seule façon de la diagnostiquer est de démontrer la présence du parasite chez l’hôte humain
(41) (42). En cas de positivité du sang ou d’un ganglion, l’étude du LCR est indispensable pour
établir le stade de la maladie et en fonction de celui-ci le traitement à administrer. Cette étude
devra systématiquement associer la recherche directe du parasite, la recherche d’une cytorachie
( ≥ 5 cellules par µL), la recherche d’une protéinorachie ( ≥ 0.4 g/L), en cas de positivité d’une
seule ou plusieurs d’entre elles, le diagnostic de phase méningo-encéphalitique pourra être
établi (42).

Lors de la phase pré-analytique, la région d’Afrique où le patient a vécu est une

information essentielle car elle permettra de suspecter plus ou moins une des 2 sous-espèces et
donc d’envisager différemment l’interprétation des tests sérologiques qui mettent mieux en
évidence T. b. gambiense.

Les signes cliniques étant peu spécifiques et inconstants au cours de la trypanosomose

humaine africaine (42), il est indispensable d’orienter le clinicien par des conseils et une aide à
la prescription (Illustration 30) indiquant les principaux éléments épidémiologiques, cliniques
et biologiques à prendre en compte ainsi que les analyses à prescrire en fonction du contexte.

130
 Illustration 30 : Aide à la prescription recherche de trypanosomose humaine africaine

AIDE A LA PARA F3 P RES 001 A

PRESCRIPTION : Date d’application:
Recherche de 01/02/2011
trypanosomose Page 131 sur 187
humaine africaine

NOTION DE SEJOUR PROLONGE EN ZONE

D’ENDEMIE (OU RESIDENT):

ZONES RURALES D’AFRIQUE SUBSAHARIENNE :

-Afrique de l’Ouest et centrale pour T. b. gambiense (90%

+
des cas)
-Afrique de l’Est pour T. b. rhodesiense
+
Signes de phase 1
Signes de phase 2
lymphatico-sanguine :
méningo-
Mali
encéphalitique:
-FIEVRE -TROUBLES
Tchad
« anarchique » Soudan NEURO-
Guinée
(éliminer avant tout un Nigeria ENDOCRINIENS
Togo
Ghana

CIV R.Centre-Afrique
paludisme) Cameroun Ethiopie
-TROUBLES DU
Congo Ouganda
Gabon Kenya SOMMEIL
et/ou manifestations RD Congo T. b.
cutanées : T. b. gambiense CCONGO Tanzanie
rhodesiense -TROUBLES
-PRURIT SENSITIVO-
Zambie

Angola
Mozambique

-œdèmes MOTEURS
-érythèmes fugaces Namibie Zimbabwe
-TROUBLES DU
(tronc, racine des Très forte endémie
COMPORTEMENT
membres) Forte endémie

A risque -SYNDROME
Des adénopathies sont CONFUSIONNEL
également possibles
-CONVULSIONS

Ces signes sont

d’intensité variable et Un syndrome inflammatoire biologique associé est à rechercher
peuvent manquer systématiquement

Demander :
- une « trypanosomose africaine recherche directe » sur sang pour T. b. gambiense et
rhodesiense (voire ponction ganglionnaire)
- une « trypanosomose africaine sérologie » (CATT et IFI), uniquement en cas de suspicion de T.
b. gambiense (cf carte)
En cas de positivité ou de forte suspicion clinique de phase 2, il est impératif de réaliser une
recherche dans le LCR :
- du parasite à l’examen direct
- d’anticorps spécifiques (IFI) « trypanosomose africaine sérologie »
- d’une cytorachie (LCR en Hématologie pour recherche de plasmocytes) et d’une protéinorachie 131 et
dosage des IgM (LCR en immunologie)
3.2.4.2 Analytique

3.2.4.2.1 Procédure du laboratoire

Le diagnostic ne peut être affirmé que si les signes de suspicion sont confirmés par la mise
en évidence de trypanosomes dans le sang ou dans la lymphe. La recherche directe de parasites
dans le sang au cours de dépistages de masse est souvent décevante, en raison de faux négatifs
dus aux vagues de parasitémie (41). Il est alors nécessaire d’employer des méthodes de
concentration des trypanosomes. Les méthodes indirectes telles que la détection d’anticorps
sont utiles pour établir une suspicion et, dans les dépistages de masse, pour la présélection de
sujets susceptibles d’être infectés.

Une fois la réalité de l’infection par le trypanosome établie, il convient de pratiquer le

diagnostic de phase ou de stade. Celui-ci est indispensable, car les médicaments administrés au
cours du stade méningo-encéphalitique sont très toxiques et/ou difficiles à administrer (41). La
présence de trypanosomes dans le LCR et les réactions induites par cette présence sont alors
recherchées.

Nous avons choisi d’associer à notre procédure de recherche de parasites sanguicoles, un

arbre décisionnel (Illustration 31) déterminant la succession des choix des tests réalisés au
laboratoire lors d’une recherche de trypanosomose humaine africaine. Il a été vérifié par le
Docteur Bernard Bouteille et intègre la réalisation de méthodes sérologiques (CATT et IFI)
souvent réalisées de manière isolée pour d’autres laboratoires de parasitologie.

132
 Illustration 31 : Procédure de recherche de trypanosomose humaine africaine (logigramme)

PARA F2 P APAR 003 A

RECHERCHE DE
Date d’application:
TRYPANOSOMOSE 01/02/2011
HUMAINE AFRICAINE
Page 133 sur 187

ECHANTILLONS PROVENANT DU ECHANTILLONS SUR

C.H.U. DEMANDES
(services cliniques) EXTERNES AU C.H.U.

APPELER LE PRESCRIPTEUR pour

renseignements cliniques et
épidémiologiques.
Prise en charge de l’échantillon<15mn

Recherche directe
sur sang total EDTA Recherche indirecte
+/-ponction ganglionnaire (réalisée par l’interne du secteur
+/- Moelle osseuse de sérologie)

NEGATIVE POSITIVE Sur LCR

Sur sérum
si demandée
APPELER LE
PRESCRIPTEUR

Pas de signe Signes -CATT

neuro. neuro. LCR -IFI -IFI

T+ T-
LCR et/ou cellules et cellules
≥5/µL <5/µL
et/ou et protéines
T- T+ protéines <0.4g/L
≥0.4g/L

T.H.A. stade 1
Surveillance T.H.A. stade 2 lymphatico-
voire contrôle neurologique sanguine

LCR = Liquide Céphalo-Rachidien

T- = Recherche de trypanosome négative
T+ = Recherche de trypanosome positive
CATT= Card Agglutination Trypanosomiasis Test
IFI= ImmunoFluorescence Indirecte
T.H.A= Trypanosomose Humaine Africaine

133
3.2.4.2.2 Techniques réalisées au laboratoire et leur vérification bibliographique

3.2.4.2.2.1 Recherche du parasite au microscope

Depuis la découverte de Trypanosoma brucei gambiense par Dutton (1902), la

confirmation directe de la présence de parasites par l’examen microscopique du sang et/ou
d’autres liquides biologiques représente aujourd’hui le « gold standard » des techniques de
diagnostic biologique (41). La recherche au microscope, toute imparfaite qu’elle soit, doit
toujours être faite, pour deux raisons essentielles : les tests sérologiques ont une marge
d’erreur, et surtout la thérapeutique est fondée sur des produits toxiques, notamment au stade 2.
La capacité du trypanosome à envahir tous les liquides corporels a conduit à examiner le sang,
le suc ganglionnaire, le LCR mais aussi, de façon plus anecdotique, la moelle osseuse ou
encore les hydrocèles (41). Le nombre de parasites détectés ne joue pas un rôle déterminant
dans le diagnostic car il fluctue au cours de l’infection.

Illustration 32 : Photographie de Trypanosoma brucei sur frottis mince coloré au May-Grünwald-Giemsa

Les données de la littérature concernant l’évaluation des performances des différentes

méthodes diagnostiques sont peu nombreuses et ont été menées sur le terrain. Elles montrent
des résultats parfois disparates. Un document de référence, rédigé à la suite des
recommandations de la réunion d’experts organisée par Tropical Diseases
Research/Organisation mondiale de la santé à Londres en février 2006 (41), synthétise
l’ensemble des résultats de ces études. Il en ressort que les techniques de concentration du
134
 parasite comme la cytocentrifugation en tube capillaire, la technique du QBC ® et la
chromatographie par minicolonne échangeuse d’anions (mAECT) sont bien plus sensibles que
l’examen direct du sang à l’état frais (6 000 à 10 000 parasites par mL) ou le frottis sanguin
coloré (10 000 parasites par mL). Le seuil de détection pourrait aller jusqu’à 16 trypanosomes
par mL pour les deux premières et 3-4 trypanosomes par mL pour la mAECT, technique la plus
sensible mais dont le coût élevé est un frein à son utilisation.

Au laboratoire, la recherche dans le sang est réalisée en priorité par la technique de la

centrifugation en tube capillaire associée à l’examen direct à l’état frais, au frottis sanguin
coloré et à la goutte épaisse. Son utilisation étant motivée par la maîtrise de la technique par le
Docteur Bernard Bouteille et un coût moindre.

Sur le LCR la technique de la double centrifugation est utilisée considérée par l’OMS
comme la technique la plus sensible (41). Les modes opératoires de ces techniques de
concentration ont été rédigés en référence au cahier BIOFORMA N°23 (37), vérifiés puis
approuvés.

3.2.4.2.2.2 Les techniques de recherche indirecte

- L’agglutination directe ou Card Agglutination Trypanosiomasis Test (CATT)

Ce test, effectué sur sang total ou sérum, repose sur la détection sérologique d’anticorps
dirigés contre un type dominant d’antigène variant (variant antigen type, VAT) de la
glycoprotéine variante de surface (VSG). L’antigène du CATT est constitué de T. b. gambiense
LiTat 1.3 purifiés (il n’est pas efficace dans la maladie à T. b. rhodesiense).

Initialement validé chez 155 patients infectés par T. b. gambiense, comparés à 247 sujets
sains et 54 patients porteurs d’une autre parasitose, ce test est fourni par l’Institut de médecine
tropicale Prince Léopold d’Anvers. La sensibilité du CATT (de 92 à 100%), sa spécificité (de
90 à 95%) et la stabilité des réactifs sont constamment améliorés. Cependant, des faux positifs
peuvent être dus à une infection par des trypanosomes animaux ou des Leishmanies et des faux
négatifs sont possibles lors d’infections trop récentes. Il doit donc être complété par des tests
parasitologiques de confirmation avant d’entreprendre un traitement (41).

- Le test d’immunofluorescence indirecte (IFI)

En laboratoire, c’est la technique de choix en raison de sa sensibilité élevée malgré une

procédure complexe et une lecture délicate (41).

135
 La méthode peut être utilisée sur du sérum ou du LCR. Elle a été améliorée par Magnus et
al. (1978) en utilisant l’antigène lyophilisé LiTat 1.3 préparé à l’Institut de médecine tropicale
Prince Léopold d’Anvers ainsi que le conjugué d’anticorps anti-IgG humain gamma spécifique
marqué à la fluorescéine et produit par Pasteur Diagnostics.

L’évaluation sur site des méthodes directes n’est pas envisageable du fait de l’impossibilité
de disposer au laboratoire d’échantillons contenant des trypanosomes vivants. Concernant les
méthodes indirectes, une évaluation sur site ne pourrait se faire qu’avec des échantillons
prélevés sur des patients séropositifs.

La validation de nos méthodes repose donc avant tout sur la vérification bibliographique.

3.2.4.3 Post-analytique

L’Illustration 31 détaille, en plus du processus analytique, une partie de la démarche post-

analytique. Le résultat est validé par un biologiste qui, en fonction des éléments pré-
analytiques et analytiques, interprétera le résultat sur le compte-rendu.

3.2.5 Recherche de filarioses

Les filarioses sont observées en France chez des voyageurs qui sont essentiellement des
migrants (17).

La loase est transmise par piqûre du chrysops en Afrique centrale forestière. Elle se
manifeste par du prurit, un sillon cutané érythémateux, des œdèmes fugaces et migrateurs et le
passage de la filaire adulte sous la conjonctive ou la peau (12) (17).

L’onchocercose est transmise par piqûre d’une simulie en Afrique subsahélienne

principalement. Pour les touristes, elle peut être révélée par un prurit intense, des nodules
cutanés ou par des formes aiguës à type de lymphœdème de membres (17).

La filariose lymphatique est transmise par piqûre d’un moustique en Afrique

subsaharienne, dans le continent indien, dans le sud de l’Asie du Sud et quelques îles de
l’Océanie. Elle provoque des lymphangites dites rétrogrades (de la racine du membre vers son
extrémité), une chylurie puis plusieurs années plus tard des œdèmes des membres inférieurs,
supérieurs et des organes génitaux réalisant un éléphantiasis. Cette pathologie est rencontrée
principalement chez les autochtones ayant passé de nombreuses années en brousse (12) (17).

136
3.2.5.1 Pré-analytique

Les principaux éléments devant motiver une recherche de filariose sont

l’hyperéosinophilie chez une personne ayant vécu longtemps en zone à risque (rurale), des
manifestations cutanées pouvant être associées ou non. L’hyperéosinophilie est très fréquente
et souvent élevée (12) (17).

Les signes cliniques sont peu spécifiques, ils peuvent être absents ou au contraire
spectaculaires ; les renseignements épidémiologiques ont donc une importance majeure dans
l’approche diagnostique et donc lors de la phase pré-analytique.

Concernant les filarioses sanguicoles, les microfilaires apparaissent dans le sang selon une
périodicité qu’il faut respecter au moment du prélèvement pour optimiser le rendement
diagnostique de l’examen parasitologique :

- en cas de suspicion de loase (Loa loa), le prélèvement sanguin devra être réalisé vers 12h
(37).

- en cas de suspicion de filariose lymphatique (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi,

Brugia timori), la périodicité étant variable en fonction des espèces et des variétés, il est
préconisé de réaliser un prélèvement vers 12h et un prélèvement vers 23h (37).

Concernant l’onchocercose, le diagnostic direct repose sur la biopsie cutanée exsangue

réalisée au laboratoire.

3.2.5.1.1 Aide à la prescription

Nous avons élaboré une aide à la prescription (Illustration 33) destinée à orienter le
prescripteur dans le choix des analyses disponibles, en fonction du contexte clinico-
épidémiologique.

137
 Illustration 33 : Aide à la prescription recherche de filariose

AIDE A LA PARA F2 P RES 001 A

PRESCRIPTION : Date d’application:
Recherche de 01/02/2011
FILARIOSE Page 138 sur 187

NOTION DE SEJOUR PROLONGE

AFRIQUE INTERTROPICALE, -AFRIQUE INTERTROPICALE

(CAMEROUN, BENIN, GABON, CONGO, -MADAGASCAR
NIGERIA…)
- INDE, ASIE DU SUD-EST
- Amérique du Sud (Guyane)
+ - Pacifique, Océan
PRURIT indien :Polynésie, Mayotte …

+/- OEDEMES +/- NODULES sous LYMPHOEDEME(S) (surtout au niveau des

migrateurs (« de cutanés membres inférieurs)
Calabar ») +/- ADENOPATHIE(S) de la racine des
+/- MIGRATION DU +/- TROUBLES membres
VER ADULTE sous la +/- épisode(s) de lymphangite aiguë
OCULAIRES
peau / sous la +/- asthénie
conjonctive -chylurie

Loase ? Onchocercose ? Filariose lymphatique ?

Des formes asymptomatiques peuvent exister pour toutes ces filarioses

Une hyperéosinophilie, généralement associée, est à rechercher

Demander :
- Une « filariose sérologie » (une sérologie négative n’exclut pas le diagnostic)
- Une recherche directe de microfilaires

Recherche directe sur Recherche directe Recherche directe sur :

du sang prélevé à sur biopsie cutanée -sang prélevé à 12h sur tube EDTA
12h sur tube EDTA exsangue faite au -sang prélevé à 23h sur tube EDTA
(prévenir le laboratoire laboratoire (prévenir le laboratoire 53916)
(53916)
53916)
Prévoir également un tube EDTA pour
recherche d’antigènes circulants filariens
pour W. bancrofti (envoi au CHU de Toulouse)

138
3.2.5.2 Analytique

3.2.5.2.1 Procédure du laboratoire

Le diagnostic de certitude des filarioses à microfilaires sanguicoles se fait en deux

temps (37) :

- Recherche de microfilaires dans le sang

- Identification de l’espèce en cause par l’étude morphologique après coloration

Dans certains cas, il sera utile de pratiquer une numération des microfilaires. Quant au
diagnostic sérologique, il ne peut être qu’un élément d’appoint, utile dans les formes pauci-
parasitaires.

La recherche de microfilaires à Limoges associe l’examen du sang à l’état frais, entre lame
et lamelle à la technique de leucoconcentration (lyse par la saponine) permettant de sensibiliser
la recherche (12). La réalisation d’un frottis mince et d’une goutte épaisse colorés permettent le
diagnostic d’espèce.

Dans le cadre de notre politique de maîtrise documentaire, nous avons révisé le mode
opératoire de notre technique de leucoconcentration (Illustration 34) en vérifiant sa conformité
au cahier BIOFORMA (37).

Nous avons également établi un document illustré permettant d’adopter une démarche
pratique pour le diagnostic d’espèce des trois principales filaires sanguicoles pathogènes chez
l’Homme : Loa loa, Wuchereria bancrofti et Brugia malayi.

139
 Illustration 34 : Mode opératoire concentration des microfilaires par hémolyse à la saponine

CONCENTRATION PARA MO5 P APAR 003 A

DES FILAIRES Date d’application:
PAR HEMOLYSE 01/02/2011
A LA SAPONINE Page 140 sur 187

INDICATIONS :
Ce mode opératoire est utilisé pour la recherche de microfilaires sanguicoles et conserve les
microfilaires vivantes :
 Loa loa (Afrique)
 Wuchereria bancrofti (Afrique, Inde…)
 Wuchereria bancrofti (var Pacifica)
 Brugia malayi
 Mansonella perstans

Recherche réalisée sur tube de sang total EDTA

MATERIEL :
 Tube plastique de 50mL
 Pipettes graduées de 15mL
 Poires d’aspiration 3mL
 Centrifugeuse (secteur de parasitologie)
 Lames porte-objets de 76x26 mm, bords non rodés et rodés
 lamelles 22 x 22 mm

REACTIFS :
 Eau physiologique
 PBS conservé dans le réfrigérateur du secteur de parasitologie (95 00 106)
 Saponine à 2% dans de l’eau physiologique. Des aliquotes de 500 µL en tubes à
hémolyse sont stockés à 4°C (conservation 1 an). Une réserve est au congélateur
(même réfrigérateur à -20°C (tiroir n°2) (conservation : 2 ans).
 May-Grünwald à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie
 Giemsa à température ambiante au dessus de la paillasse de parasitologie

TECHNIQUE :
Dans un tube plastique de 50mL, mettre :

 5mL de sang total

 En fonction de la quantité de sang dont on dispose, on peut augmenter ou réduire le
volume traité.
 10mL d’eau physiologique (ou 2 volumes)
 Retourner pour bien mélanger
 Rajouter progressivement, tout en agitant, 5 gouttes de la solution de saponine à 2%
et retourner le tube plusieurs fois jusqu’à obtenir un sang d’aspect laqué (rajouter des
gouttes si nécessaire)
 Centrifuger 10 minutes à 1500 t/min.
 Rejeter le surnageant, sans retourner complètement le tube et essuyer les parois avec
un papier absorbant.
 Ajouter une goutte d’eau physiologique
 Examiner le culot sur des lames à bords non rodés jusqu’à épuisement au
microscope au grossissement x 10.

140
 CONCENTRATION PARA MO5 P APAR 003 A
DES FILAIRES Date d’application:
PAR HEMOLYSE 01/02/2011
A LA SAPONINE Page 141 sur 187

LECTURE :
Le culot ne comporte que des leucocytes et des microfilaires.
Les microfilaires restent vivantes et bien mobiles.
En cas de résultat positif :
 Faire à partir du culot une goutte épaisse calibrée colorée au Giemsa pour
différenciation d’espèce.
 Compter le nombre de microfilaires par mL de sang (compter la totalité du culot)
 Le résultat devra être rendu en nombre de microfilaires par mL et par µL.

DOCUMENTS DE REFERENCE :
cahier de formation biologie médicale (BIOFORMA) N°23 :PARASITES SANGUINS 2001

141
3.2.6 Recherche de parasites dans les selles
3.2.6.1 Pré-analytique

La recherche de parasites dans les selles représente la principale activité du secteur de

parasitologie directe. Les motifs de recherche de parasites dans les selles sont très divers et
peuvent inclure tous les troubles digestifs chroniques, toute hyperéosinophilie non expliquée
voire même les bilans d’adoption ou de retour de voyage en zone à risque. Les
recommandations de l’ANAES de 2003 fixent les indications et les modalités de prescription
d’un examen parasitologique standard des selles (43). Nous avons essayé de les synthétiser
dans une aide à la prescription (Illustration 35).

Certaines recherches spécifiques de parasites nécessitent une prise en charge pré-

analytique adaptée et très rapide, c’est le cas notamment de la recherche de formes végétatives,
très fragiles, d’Entamoeba histolytica, pratiquée devant toute suspicion de dysenterie
amibienne. Les renseignements épidémiologiques (séjour en zone à risque), cliniques (fièvre
associée, immunodépression) ou encore l’aspect des selles peuvent orienter vers certaines
parasitoses et impliquer des recherches spécifiques supplémentaires comme la recherche de
cryptosporidies ou de microsporidies. Ces éléments essentiels sont précisés dans l’aide à la
prescription mais aussi dans le catalogue des analyses du CHU.

142
 Illustration 35 : Aide à la prescription devant une suspicion de parasitose digestive

AIDE A LA PARA F7 P RES 001 A

PRESCRIPTION EN CAS DE Date d’application:
SUSPICION DE 01/02/2011
PARASITOSE DIGESTIVE Page 143 sur 187

A évoquer devant un des signes suivants :

-Diarrhée aiguë > 3 jours avec traitement symptomatique
-Diarrhée 2 semaines
-Autres troubles digestifs chroniques
Chez des patients asymptomatiques :
- bilan d’une hyperéosinophilie
- voire bilan de retour de voyage (à faire au moins 3-4 semaines après le retour)
ou d’arrivée en France à partir d’une zone d’endémie

Demander :

- « Scotch®-test anal » : oxyures ou Taenia saginata (les causes les plus fréquentes en France)

- « Parasitologie des selles » à 3 reprises (à 2/3 jours d’intervalle)

si voyage ou séjour en zone tropicale : préciser « recherche d’anguillule »*et acheminer

rapidement les selles au laboratoire
si suspicion d’amœbose (glaires, sang) : selles émises ou laboratoire ou acheminées en moins
de 30 min ; prévenir le biologiste (tel : 53916)
si diarrhée liquide et/ou associée à de la fièvre et/ou immunodépression : préciser
« recherche de cryptosporidies » et « recherche de microsporidies »

EN CAS DE NEGATIVITE

CHEZ UN PATIENT N’AYANT JAMAIS QUITTE CHEZ UN PATIENT AYANT VECU OU

LA FRANCE METROPOLITAINE SEJOURNE EN ZONE INTERTROPICALE

Si hyperéosinophilie : Si hyperéosinophilie :

- En fonction du contexte, des sérologies - renouveler la « Parasitologie des selles » à

peuvent se discuter (Toxocarose, 3 reprises (à 2/3 jours d’intervalle), 1 mois après
Distomatose, Trichinellose…) tel : 53916 la première série, pour tenir compte de la phase
d’invasion ou de la maturation des helminthes.
- renouveler les « Parasitologie des selles »
à 3 reprises (à 2/3 jours d’intervalle), 1 mois après - préciser « recherche d’anguillules »
la première série, pour tenir compte de la phase
d’invasion ou de la maturation des helminthes. - En fonction du contexte, des sérologies
peuvent se discuter (Bilharziose,
Filariose…) tel : 53916

EN POST THERAPEUTIQUE (1 à 3 mois selon le parasite) :

- une « Parasitologie des selles » à 3 reprises (à 2/3 jours d’intervalle)

* Recherche systématique avant tout traitement immunosuppresseur chez un patient à risque d’anguillulose
143
3.2.6.2 Analytique

3.2.6.2.1 Procédure du laboratoire

L’association de plusieurs techniques basées sur l’identification au microscope permet, au

regard de la bibliographie, un diagnostic convenable de la majorité des éléments parasitaires
rencontrés dans les selles.

Comme conseillé par l’ensemble des données de la littérature (14) (44) (45) (46) (47) un
examen parasitologique des selles standard doit combiner :

- Un examen direct à l’état frais

- Une technique de concentration diphasique

- Une technique de concentration par flottation

- Une technique d’enrichissement sélective (Baermann), le cas échéant

Les techniques de concentration diphasiques dérivent toutes de celle de Telemann (1908)

consistant à triturer la selle avec un mélange composé à parties égales d’éther et d’acide
chlorhydrique puis à tamiser l’émulsion fécale et à centrifuger. Les parasites se concentrent
dans le sédiment.

La concentration parasitaire par ces méthodes physico-chimiques découle de la mise en

présence de 2 phases non miscibles, l’une aqueuse, l’autre lipophile. Elles permettent la
réalisation d’un coefficient de partage dont la valeur est conditionnée, pour chaque particule
fécale (parasite et déchet), par sa balance hydrophile-lipophile.

En 1962, J.Bailenger met au point une méthode susceptible de donner satisfaction dans la
majorité des analyses à effectuer. Suite à de nombreuses expériences, il s’aperçoit que
plusieurs facteurs ont une influence sur la concentration des œufs, des larves et des kystes, le
principal étant le pH.

En testant plusieurs solutions différentes, il détermine une formule permettant d’obtenir

une solution d’acéto-acétate de pH = 5 qu’il associe dans sa méthode à l’éther.

Cette méthode fait partie, avec celle du MIF des méthodes diphasiques utilisées en routine
au laboratoire depuis plusieurs années, sa rapidité et sa simplicité de réalisation étant très
avantageuses.

Nous avons donc évalué nos techniques du Bailenger et du MIF au cours de notre
évaluation sur site.
144
 Illustration 36 : Concentration parasitaire : méthode diphasique, aspect du tube après centrifugation

Phase organique non miscible à l’eau (éther…)

Interface (débris = bactéries, résidus alimentaires…)

Phase aqueuse

Culot d’enrichissement (contenant les parasites)

Les techniques de concentration par flottation ont recours à une solution de densité élevée
pour parvenir à récupérer les œufs d’helminthes ou certaines formes de protozoaires (kystes de
Giardia, oocystes de coccidies) sur une lamelle déposée à la surface du mélange selle/solution
de densité élevée.

Les méthodes de flottation réalisées au laboratoire utilisent soit le liquide de Janeckso-

Urbanyi, très efficace mais très toxique et néfaste pour l’environnement, soit une solution de
chlorure de sodium (technique de Willis), soit une solution de sulfate de Zinc (technique
d’Otto-Hewitt). Nous avons également évalué ces trois méthodes de flottation.

145
 Illustration 37 : Concentration parasitaire : méthode de flottation

Lamelle déposée sur le tube récupérant les œufs

Mélange selle/solution de densité élevée

Pour la recherche spécifique d’anguillulose, nous réalisons la technique de Baermann

décrite par Ambroise Thomas (14).

Notre procédure de recherche de parasites dans les selles a été adaptée aux résultats de
notre évaluation sur site et les modes opératoires des différentes techniques ont été révisés.

146
3.2.6.2.2 Evaluation sur site

3.2.6.2.2.1 Méthode

Il s’agit de techniques qualitatives mettant en évidence la présence ou l’absence

d’éléments parasitaires.

Il est donc étudié pour la validation de nos méthodes :

- Les sensibilités de l’examen direct, du MIF concentration, et du Bailenger concernant les

principaux protozoaires intestinaux et une espèce du genre Cyclospora.

- Les sensibilités de l’examen direct, du MIF concentration, du Bailenger, du Willis, du

Janeckso et de l’Otto Hewitt concernant les principaux œufs d’helminthes et une espèce du
genre Cyclospora.

Bien qu’il s’agisse d’une méthode qualitative, nous avons également intégré des données
quantitatives en décomptant le nombre de kystes ou oocystes présents pour 50 champs à
l’objectif 40 et en décomptant le nombre d’œufs ou oocystes présents pour 50 champs à
l’objectif 10 (une différence d’au moins 30% étant retenue comme significative).

Les techniques ont été réalisées à partir de 45 échantillons positifs du CHU de Limoges et
du CHU de Nice conservés à 4°C. La majorité des protozoaires et helminthes potentiellement
rencontrés dans les selles en parasitologie était représentée (voir les Tableaux 11 et 12).

Les échantillons ont été techniqués en suivant les instructions de nos modes opératoires,
dans les conditions du laboratoire.

La lecture des lames a été réalisée à l’aveugle en respectant également les modes
opératoires du laboratoire.

147
 Tableau 11 : Protozoaires et coccidie inclus dans la vérification

Protozoaires+coccidie Nombre d’échantillons positifs

Entamoeba coli 12
Endolimax nana 5
Iodamoeba butschlii 1
Entamoeba histolytica/dispar 2
Giardia intestinalis 3
Chilomastix mesnilii 2
Cyclospora 1
Total 26

Tableau 12 : Helminthes et coccidie inclus dans la vérification

Helminthes+coccidie Nombre d’échantillons positifs

Trichuris trichura 4
Ankylostoma 2
Ascaris 6
Dicrocoelium 2
Hymenolepis nana 3
Schistosoma mansoni 1
Taenia sp. 1
Cyclospora 1
Total 20

148
3.2.6.2.2.2 Résultats

Concernant les protozoaires/Cyclospora, les sensibilités de l’examen direct, de la

méthode de MIF et du Bailenger sont respectivement de 69%, de 92% (2 faux négatifs à
Entamoeba coli pour le Bailenger correspondant à des échantillons de très faible parasitisme)
et de 100%.

Les données de l’évaluation quantitative montrent que les méthodes du MIF et du

Bailenger ont en général des résultats comparables et largement supérieurs à ceux de l’examen
direct.

Cependant des différences significatives en faveur du Bailenger par rapport au MIF sont à
remarquer concernant certaines espèces : Endolimax nana (n°1 à 5 sur le graphique) et
Entamoeba coli (n°6 à 17), un échantillon de Iodamoeba butschlii (n°18), un de Chilomastix
mesnilii (n°24) et un de Cyclospora (n°26).

Illustration 38 : Nombre de kystes/oocystes pour 50 champs à l’objectif 40

500
Bailenger MIF ED
450

400

350

300

250

200

150

100

50

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

149
 Concernant les helminthes/Cyclospora, les sensibilités de l’examen direct, de la méthode
du MIF, et du Bailenger sont respectivement de 45%, de 50% et de 70% (les faux négatifs
pour le Bailenger correspondent à 2 Ascaris, 2 H. nana, 1 Trichuris et 1 Schistosoma).

Les sensibilités des méthodes de flottation sont de 60% pour l’Otto-Hewitt, 75% pour le
Willis (2 faux négatifs à Dicrocoelium, 1 à Trichuris, 1 à H. nana, 1 à Schistosoma) et 90%
pour la méthode de Janeckso-Urbanyi (faux négatifs: 1 H. nana et 1 Dicrocoelium)

La méthode d’Otto-Hewitt est en retrait avec une sensibilité de 60%.

L’association de la méthode du Bailenger et du Janeckso permet d’atteindre une sensibilité de

100% contre 90% pour l’association Bailenger/Willis.

L’évaluation quantitative montre qu’il existe des différences significatives entre le

Janeckso et les autres méthodes de flottation concernant les œufs de trichocéphale (n°1 à 4 sur
le graphique), d’ankylostome (n°8, 9), d’Hymenolepis nana (n°10, 11) d’ascaris (n°15, 16), de
Schistosoma mansoni (n°7) et les oocystes de Cyclospora (n°20)

La méthode de Willis est nettement supérieure à celle d’Otto-Hewitt pour les œufs de
trichocéphale (n°1 ,2 ,4), d’ankylostome (n°8, 9) et les oocystes de Cyclospora.

Illustration 39 : Nombre d’œufs/oocystes pour 50 champs à l’objectif 10

160

140

120

100

Janeckso
80
Willis
60 Otto

40

20

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

150
 Ces résultats sont en phase avec les données de la littérature (14) (44) (46), en effet la
technique de Janeckso-Urbanyi est la plus sensible pour mettre en évidence les helminthes et
les différentes techniques de flottation ont une sensibilité qui dépend des espèces
d’helminthes : le Janeckso met particulièrement bien en évidence les gros œufs (notamment
Schistosoma mansoni) et les œufs de trichocéphale. Le Willis est efficace pour les œufs
d’Hymenolepis nana (un faux négatif mais très faiblement parasité). L’association
Bailenger/Willis permet d’avoir une sensibilité identique à celle du Janeckso isolé.

L’ensemble des résultats justifie l’utilisation de la technique diphasique de Bailenger lors

d’une recherche standard de parasites dans les selles. On choisira de lui associer la méthode de
flottation de Willis lors de recherches de routine (médecine du travail), celle-ci ne présentant
pas de risque de toxicité. Cependant, malgré sa toxicité, la méthode de Janeckso-Urbanyi sera
préférée au Willis, en cas de suspicion d’helminthose (surtout distomatose et schistosomose) et
d’hyperéosinophilie.

3.2.6.2.3 Contrôles internes

Pour assurer une évaluation continue de nos méthodes, nous effectuons un contrôle interne
après chaque régénération de réactif (Bailenger, Janeckso-Urbanyi, Willis, MIF). Cette mesure
nécessite la conservation d’échantillons de selles positives à 4°C dans de l’azide de sodium. La
toxicité de nombreux de ces réactifs nous a incité, au regard des exigences du chapitre 5.2. de
la Norme concernant la sécurité du personnel, à mettre à jour les fiches réactifs ainsi que les
fiches de sécurité des substances chimiques utilisées.

Ce problème de toxicité nous mènera prochainement à évaluer une technique

commercialisée (Gamme Parasep® SF) ayant recours à une double filtration (sans formol, ni
éther, ni acétate d’éthyle) dans l’idée de remplacer nos méthodes actuelles.

151
3.2.6.2.4 Evaluation externe

L’évaluation externe de la qualité de notre recherche de parasites dans les selles s’appuie
sur la réalisation et le suivi des contrôles AFSSAPS.

Au cours de ces contrôles, les échantillons parviennent au laboratoire sous forme de

suspensions directement observables au microscope. C’est donc la capacité du personnel à
mettre en évidence le parasite au microscope, à faire un diagnostic d’espèce qui est appréciée.

L’exploitation des résultats depuis 2000 n’a révélé aucune erreur majeure concernant la
mise en évidence de parasites dans les selles et le diagnostic d’espèce lorsqu’il était possible.

On note un seul oubli qui concernait la selle de 2003 PAR1 et la mise en évidence de
Blastocystis hominis secondaire dans cet échantillon parasité par Entamoeba histolytica/dispar.

Tableau 13 : Résultats des contrôles externes AFSSAPS (selles parasitées)

ANNEE REPONSES DU LABORATOIRE REPONSES ATTENDUES

2000 PAR2 microsporidies microsporidies

2001 PAR1 Entamoeba coli Entamoeba coli

2002 PAR1 Isospora belli Isospora belli

Entamoeba histolytica/dispar Entamoeba histolytica/dispar
2003 PAR1 Blastocystis hominis
2003 PAR2 Ascaris lumbricoïdes/Trichuris trichura Ascaris lumbricoïdes/Trichuris trichura

2004 PAR1 Endolimax nanus Endolimax nanus

2004 PAR2 Giardia intestinalis Giardia intestinalis

2005 PAR1 Paragonimus westermani Paragonimus westermani

2005 PAR2 Œufs d’Ankylostomidés Œufs d’ankylostomidés

2006 PAR1 Entamoeba histolytica/dispar Entamoeba histolytica/dispar

2007 PAR1 Taenia sp. Taenia sp.

2008 PAR1 Endolimax nana Endolimax nana

2009 PAR1 Giardia intestinalis Giardia intestinalis

2010 PAR1 Absence de parasite Absence de parasite

152
3.2.6.3 Post-analytique

Lors d’une recherche de parasites dans les selles, l’étape post-analytique est décisive dans
la qualité de la prise en charge ultérieure du patient. En effet, il est important que le clinicien
connaisse les limites du résultat rendu par le laboratoire et qu’il soit en mesure de l’interpréter
correctement.

Pour bien interpréter un résultat, il est essentiel de maîtriser plusieurs notions :

- L’émission intermittente des éléments parasitaires dans les selles (kystes, œufs, formes
végétatives…) ne permet pas d’exclure formellement une parasitose digestive à partir d’un
unique examen négatif. De même, la mise en évidence d’un ou plusieurs parasites sur un
seul échantillon de selles n’élimine d’autres parasitoses associées. Il est donc recommandé
d’effectuer au moins 3 examens parasitologiques des selles espacés de quelques jours (43)
(45).

- De plus, lorsqu’ils sont réalisés pendant la phase d’invasion larvaire (schistosomose,

distomatose…), les 3 examens seront négatifs et il sera important de les renouveler à
distance en cas de forte suspicion (43).

- Le laboratoire peut être amené à mettre en évidence des protozoaires, des flagellés ou
autres parasites peu connus du médecin prescripteur et pour lesquels le rôle pathogène
n’est pas démontré.

Nous avons donc mis en place une procédure de validation biologique destinée à assurer la
présence sur le compte-rendu de commentaires adaptés aux différentes situations possibles et
permettant au clinicien d’adapter la conduite à tenir. Chaque commentaire est associé à un code
dans le logiciel GLIMS permettant une saisie rapide.

153
 Tableau 14 : Commentaires codifiés des résultats d’examens parasitologiques des selles

SITUATIONS CODES SIGNIFICATIONS

Absence de
parasite
SEL1- Un examen parasitologique des selles négatif n’exclut pas
sur selles de
2_NEGMT une parasitose.
médecine du
travail
Absence de Un examen parasitologique des selles négatif n’exclut pas
parasite une parasitose, 3 examens parasitologiques des selles à 2-3
(Hors MT) SEL1-2_NEG jours d’intervalle sont nécessaires.
sur selles n°1 ou En cas de suspicion d’oxyurose ou de taeniasis, prescrire
n°2 préférentiellement un Scotch®-test anal.
Absence de L’absence d’élément parasitaire après 3 examens des selles
parasite n’exclut pas une parasitose (phase d’invasion des
helminthoses, émission intermittente). En cas de forte
après 3 examens SEL3_NEG suspicion, renouveler une série de 3 examens
successifs des parasitologiques des selles dans 3 semaines.
selles En fonction du contexte clinique et épidémiologique, des
(hors médecine examens complémentaires peuvent être envisagés après
du travail) concertation clinico-biologique.
Présence d’un Un examen parasitologique des selles positif n’exclut pas
parasite un ou plusieurs autres parasites associés, 3 examens
pathogène parasitologiques des selles à 2-3 jours d’intervalle sont
SEL1-2_POS
sur selles n°1 ou nécessaires.
n°2 En cas de suspicion d’oxyurose ou de taeniasis, prescrire
un Scotch®-test anal.
En cas Rôle pathogène non démontré ou à discuter, présence
d’organisme témoin d’une contamination d’origine fécale.
non pathogène Un examen parasitologique des selles positif n’exclut pas
(Blastocystis un ou plusieurs autres parasites associés, 3 examens
hominis, amibes SEL1-2_RPND parasitologiques des selles à 2/3 jours d’intervalle sont
autres nécessaires.
qu’Entamoeba En cas de suspicion d’oxyurose ou de taeniasis, prescrire
histolytica, un Scotch®-test anal.
flagellés autre
que Giardia Rôle pathogène non démontré ou à discuter, présence
intestinalis) SEL3_ RPND témoin d’une contamination d’origine fécale.

154
3.2.7 Recherche de schistosomose urinaire
La schistosomose ou bilharziose est une parasitose très répandue en zone tropicale. Elle est
relativement fréquente parmi les voyageurs qui se rendent en Afrique.

La découverte d’une hématurie chez un patient ayant séjourné en zone d’endémie doit
faire suspecter une bilharziose urinaire à Schistosoma haematobium. Après un bain en eau
douce infestée, le parasite pénètre à travers la peau en une dizaine de minutes. Les
schistosomules gagnent le foie et deviennent des vers adultes. Après copulation, les vers
migrent vers leur lieu d’élection, en particulier les veines péri-vésicales pour Schistosoma
haematobium. Les femelles pondent des œufs qui tombent dans la vessie et sont éliminés dans
les urines. Dans l’eau douce, les œufs éclosent et libèrent les embryons ciliés ou miracidium.
Ceux-ci nagent dans l’eau et pénètrent dans un mollusque, le bulin, où ils se multiplient. Ils en
ressortent sous forme de larves aquatiques ou furcocercaires qui doivent pénétrer dans un
organisme vivant, Homme ou animal pour poursuivre le cycle. Il s’écoule deux mois entre
l’infestation et l’élimination des œufs dans les urines (12).

Le diagnostic est en général suspecté devant le contexte épidémiologique (séjour en

Afrique intertropicale), une hématurie (20% des cas) et/ou une hyperéosinophilie sanguine
(82% des cas) (48) (49).

Cependant, les symptomes cliniques et l’intensité de l’hyperéosinophilie varient selon le

stade de la maladie. La pénétration transcutanée des larves peut être accompagnée d’un prurit
passager. Pendant la migration des shistosomules à travers l’organisme, l’hyperéosinophilie est
souvent élevée. Les patients sont généralement asymptomatiques mais peuvent présenter une
asthénie fébrile ou d’autres signes peu spécifiques (troubles digestifs…) plus ou moins
intenses. Au bout de 10 à 12 semaines, apparait le signe principal de l’infection à Schistosoma
haematobium : l’hématurie terminale (car vésicale) pouvant être associée à d’autres signes
urinaires. A ce stade, l’hyperéosinophilie est également un élément diagnostique important
même si elle est souvent moins élevée que lors de la phase d’invasion (48) (49).

155
3.2.7.1 Pré-analytique

3.2.7.1.1 Aide à la prescription

Pour qu’une recherche de schistosomose urinaire soit rentable et que le résultat rendu soit
interprétable, il est indispensable que la prescription associe la recherche directe du parasite
(dans les urines voire dans les selles) à une recherche indirecte moins spécifique mais positive
à un stade plus précoce.

Lorsque l’on analyse l’ensemble des recherches de schistosomose urinaire réalisées au

laboratoire en 2009 et en 2010, on s’aperçoit que seulement 20 recherches sur 54 ont bénéficié
de l’association de la technique directe et une sérologie.

Une action préventive doit absolument être mise en place pour réduire ces erreurs au
moment de la prescription.

Si la recherche directe est négative malgré une sérologie positive ou une forte suspicion, il
sera indispensable que le prescripteur demande une nouvelle série d’examens directs à distance
(1 mois). La première ayant potentiellement été réalisée pendant la phase d’invasion au cours
de laquelle il n’y a pas encore de ver adulte et, par conséquent, pas d’œuf émis. Ces modalités
de prescription ne sont pas toujours respectées en pratique.

Afin d’améliorer la qualité de la prescription, nous avons donc établi une aide à la
prescription (Illustration 40). Le rôle du laboratoire étant également indispensable dans le suivi
du traitement, nous y avons intégré des informations concernant la périodicité et les modalités
de cette surveillance post-thérapeutique.

3.2.7.1.2 Importance des conditions de prélèvement

La recherche directe du parasite dans les urines devra être réalisée sur les urines des 24
heures ou en cas d’impossibilité sur miction complète matinale après effort physique pré-
mictionnel (montée d’escalier, sautillements…). Celui-ci permet de détacher les œufs
enchassés dans la muqueuse vésicale (12). Ces conditions de prélèvement sont précisées dans
le catalogue des analyses du CHU.

156
 Illustration 40 : Aide à la prescription recherche de schistosomose urinaire

AIDE A LA PARA F9 P RES 001 A

PRESCRIPTION : Date d’application:
Recherche de 01/02/2011
Schistosomose urinaire Page 157 sur 187

DANS UN BUT DIAGNOSTIQUE

NOTION DE SEJOUR EN ZONE D’ENDEMIE :

- Afrique
- Madagascar
- Proche Orient

+
BAINS EN EAU DOUCE

+ +

HYPEREOSINOPHILIE HEMATURIE
avec séjour récent <2 mois Avec séjour il y a plus de
± fièvre, urticaire 2 mois
+/- hyperéosinophilie

Demander :
- une « schistosomose sérologie »
- une parasitologie directe des urines X3
- une parasitologie des selles X3

Redemander à distance (1 mois) : En cas de recherche négative et

de forte suspicion, une biopsie
- une parasitologie directe des urines x 3 de muqueuse vésicale et/ou rectale
- une parasitologie des selles x 3 est à discuter avant d’éliminer le
(En cas de première recherche négative) diagnostic

DANS UN BUT THERAPEUTIQUE

Demander 2, 6 et 12 mois après le début du traitement :

-une « schistosomose sérologie »
-une parasitologie directe des urines (viabilité des œufs)
-une parasitologie des selles (viabilité des œufs)
-une recherche de Schistosome dans biopsie muqueuse rectale et/ou vésicale (viabilité des œufs)
157
3.2.7.2 Analytique

3.2.7.2.1 Procédure du laboratoire

Notre procédure de recherche de schistosomose urinaire est rattachée à la procédure

générale de recherche de parasites dans les urines.

Le diagnostic de certitude est porté par la mise en évidence des oeufs dans les urines, dans
les selles ou sur biopsie de muqueuse rectale, d’œufs ovoïdes de 150 sur 60 micromètres
pourvus d’un éperon terminal caractéristique (12) (48).

Les techniques de filtration et de centrifugation des urines permettent d’augmenter la

sensibilité de la recherche (12).

Illustration 41 : Photographie d’un œuf de S. haematobium (140µm) avec son éperon terminal

A Limoges, nous effectuons préférentiellement la recherche directe de Schistosoma

haematobium dans les urines après filtration (membrane de polycarbonate), méthode sensible
et fidèle. Nous avons révisé notre mode opératoire.

Le personnel doit être sensibilisé à la difficulté de reconnaître les œufs lorsqu’ils sont
recouverts de débris cellulaires (Illustration 42).

Nous associons à cette recherche la réalisation d’un test sérologique par hémagglutination
indirecte (BILHARZIOSE FUMOUZE®) permettant d’optimiser notre sensibilité diagnostique.

158
 Illustration 42 : Mode opératoire recherche de Schistosoma haematobium dans les urines

RECHERCHE DE PARA MO1 P APAR 002 A

SCHISTOSOMA Date d’application:
HAEMATOBIUM 01/02/2011
DANS LES URINES Page 159 sur 187

INDICATIONS :
Cf. Aide à la prescription PARA F9 P PREA 001 .doc
La recherche s’effectue à partir des urines de fin de miction émises après effort (monter les
escaliers) ou bien la totalité des urines de 24 heures.

MATERIEL :
 Seringue stérile de 20mL
 Porte filtre
 Filtre polycarbonate Wathmann ® 12µm (réf :7060-2516)
 Pince
 Centrifugeuse
 Microscope
 Lame et lamelles
 Pipette Pasteur ou dispositif d’aspiration
 Tube plastique de 30mL

REACTIFS :
 Acide acétique 3%

TECHNIQUE :
 Si les urines sont claires : réaliser la technique du filtre
 Dévisser le porte filtre
 Sur la partie inférieure du porte filtre, installer le filtre en polycarbonate face
brillante vers le haut
 Revisser soigneusement le porte filtre
 Remplir la seringue avec l’urine à analyser
 Insérer la seringue sur le porte filtre
 Filtrer la totalité des urines
 Dévisser et mettre la membrane à l’aide d’une pince sur une lame porte objet
 Ajouter une goutte d’eau physiologique
 Recouvrir d’une lamelle
 Lors d’urines chargées en cristaux ou hématies :
 Prendre un tube plastique, le remplir d’urines avec quelques gouttes d’acide
acétique à 3% et centrifuger à 2000 t/min pendant 10 minutes
 Jeter le surnageant et lire au microscope jusqu’à épuisement, la totalité du culot.
 Urines de 24 heures :
 Laisser décanter pendant une nuit
 Aspirer la partie supérieure en ne laissant qu’environ 20mL dans le fond
 Centrifuger la totalité du reste d’urines
 Lire le culot en entier au microscope grossissement x10 et x20
 Ou le filtrer à l’aide du filtre de la même manière que précédemment

159
 RECHERCHE DE PARA MO1 P APAR 002 A
SCHISTOSOMA Date d’application:
HAEMATOBIUM 01/02/2011
DANS LES URINES Page 160 sur 187

LECTURE :
 Lire au microscope x10 et x20
 Rechercher des œufs de S. haematobium (150µm de long avec éperon terminal)
 Apprécier leur viabilité par la recherche de miracidium (dans l’œuf ou après éclosion)
et la mobilité de leurs nombreux cils périphériques

Œuf de S. haematobium avec son éperon terminal A une échelle inférieure, miracidium hors de son
(et son miracidium) retenu par les pores du filtre. œuf avec ses nombreux cils vibratiles.

Parfois les œufs sont plus difficilement identifiables

(œuf accompagné de nombreux débris cellulaires)

DOCUMENTS DE REFERENCE :
Y. J. Golvan, P. Ambroise-Thomas, LES NOUVELLES TECHNIQUES EN
PARASITOLOGIE, 1984, FLAMMARION

160
3.2.7.2.2 Evaluation des méthodes : corrélation entre recherche directe et sérologie

La mise en évidence des œufs de Schistosoma haematobium dans les urines est considérée
comme la méthode de référence puisqu’elle permet le diagnostic de certitude de schistosomose
urinaire (12).

Cependant, la réalisation conjointe d’une technique sérologique est indispensable car si la

recherche directe est réalisée lors de la phase d’invasion parasitaire, l’excrétion inconstante des
œufs peut être à l’origine de faux négatifs (48).

Les résultats des évaluations du test d’hémagglutination indirecte (BILHARZIOSE

FUMOUZE®) annoncés par le fournisseur montrent une sensibilité de 84.4% et une spécificité
de 96.9%.

Au laboratoire, au cours des années 2009 et 2010, 15 recherches de schistosomose urinaire

ont été réalisées en associant la technique directe et de la technique indirecte (Tableau 15).
L’étude des résultats nous permet d’évaluer la corrélation entre ces deux méthodes ainsi que la
sensibilité et la spécificité de l’hémagglutination indirecte (par rapport à la méthode de
référence qu’est l’examen direct).

Sur les 15 recherches directes dans les urines, 2 ont permis de mettre en évidence
Schistosoma haematobium, la sérologie était à chaque fois positive avec une réaction
significative d’une infection évolutive (titre ≥ 160). La sensibilité diagnostique du test
sérologique est alors de 100%.

Par contre, 2 recherches sérologiques supplémentaires étaient positives (titres à 320 et 80)
malgré la négativité de la recherche dans les urines. Si on les considére comme des faux
positifs, la spécificité est alors de 84%. En réalité, la sérologie titrée à 320 correspondait à une
infection à S. haematobium en phase d’invasion confirmée ultérieurement par un autre examen
des urines et la sérologie titrée à 80 correspondait à une schistosomose urinaire récemment
traitée. La spécificité diagnostique réelle de l’hémagglutination indirecte est donc de 100%
dans cette évaluation.

Sur l’ensemble des 15 recherches, la corrélation de nos deux méthodes est de 87%. Les
deux discordances correspondent à 2 recherches directes négatives (une pendant la phase
d’invasion et une après traitement) illustrant en fait la complémentarité des deux techniques.

161
 Tableau 15 : Recherches de schistosomose urinaire à Limoges retenues pour l’évaluation

RECHERCHES DE SCHISTOSOMOSE URINAIRE EN 2009

Patient RECHERCHE DIRECTE SEROLOGIE DATE
1 négative négative 06-févr
2 négative négative 13-févr
positive 320 13-mai
3 positive* Non demandée* mai
positive* Non demandée* juin
négative négative 05-juin
4 négative négative 03-juil
négative négative 18-sept
négative* Non demandée*
négative* Non demandée*
négative 320 01-oct
positive* Non demandée* 01-nov
5
positive* Non demandée* 01-nov
positive* Non demandée* 01-nov
RECHERCHES DE SCHISTOSOMOSE URINAIRE EN 2010
positive 320 05-janv
6 négative 80 02-mars
négative négative 03-juin
7 négative négative 06-mai
8 négative négative septembre
négative négative 06-juin
9
négative négative 04-août
10 négative négative 22-juil
*Résultats non pris en compte (étude de corrélation impossible)

3.2.7.3 Post-analytique

Le résultat est validé par un biologiste qui, en fonction des éléments pré-analytiques et
analytiques, interprétera le résultat sur le compte-rendu.

162
DISCUSSION

163
1. LES AVANCEES
L’objectif de la Biologie Médicale est de contribuer à la prévention, au dépistage, au
diagnostic, à la décision thérapeutique et au suivi de l’état de santé des patients. Elle est
construite pour les patients et non pour les professionnels, tout en sachant qu’il est de l’intérêt
des patients d’avoir des professionnels compétents, aux connaissances régulièrement
actualisées. Au-delà de l’analyse biologique, le plus important est la réponse apportée à une
question clinique par un examen approprié, réalisé dans les meilleures conditions de coût et de
qualité possible. C’est en essayant d’adhérer à cette politique prônée par le Rapport Ballereau
que nous avons élaboré ce travail.

Il en ressort de nombreuses satisfactions personnelles, professionnelles et déontologiques

car nous avons fait en sorte de répondre au maximum aux exigences de la Norme NF EN ISO
15189 tout en privilégiant l’intérêt du patient.

Nous avons progressé dans la gestion de toute notre documentation par la mise en place
d’une architecture documentaire structurée, la création de nouveaux documents indispensables
et la révision/approbation des documents relatifs à la parasitologie directe. La mise au point de
fiches d’habilitation permet une meilleure traçabilité de la formation initiale du personnel.

Nous avons greffé à ces mesures propres au management de la qualité un ensemble

d’actions destinées à répondre aux exigences techniques de la Norme.

En effet, à partir de procédures techniques et de modes opératoires révisés et actualisés,

nous avons pu envisager la validation de nos méthodes. S’agissant de techniques qualitatives
souvent anciennes, un important travail de vérification bibliographique a été mené. La
vérification sur site de leurs performances, bien que parfois non applicable, a été la plus
approfondie possible, notamment pour la recherche de paludisme. Nous avons constitué pour
cette parasitose un dossier de vérification des méthodes qui pourra faire partie de ceux qui
seront proposés au Cofrac lors de la demande d’entrée du CHU dans la démarche
d’accréditation.

La qualité du résultat en parasitologie directe étant largement dépendante de la compétence

du personnel, la mise en place de contrôles internes de qualité permettra de contribuer à la
formation continue indispensable du personnel.

Les exigences techniques ne concernent pas que la phase analytique de l’examen et nous
avons essayé d’améliorer la coopération du laboratoire avec le personnel médical en proposant

164
 des conseils quant à la pertinence des analyses demandées que ce soit lors de la phase pré-
analytique par l’amélioration du manuel de prélèvement et la mise en place d’aides à la
prescription ou lors de la phase post-analytique par des commentaires adaptés.

Ce travail a le mérite de constituer un élément d’initiation et de sensibilisation du

personnel à la démarche qualité. Il a également permis de soulever des problèmes jusque-là
ignorés. Il laisse envisager l’adhésion de l’ensemble du service à une politique d’amélioration
continue de la qualité.

2. LES LIMITES ET LES PERSPECTIVES

2.1 LES MESURES RESTANT A METTRE EN PLACE

2.1.1 Recherche d’amibes libres

Parmi ces protozoaires, Naegleria, et Acanthamoeba sont les principaux genres pathogènes
pour l’Homme. Ils peuvent être responsables, selon les espèces, de méningo-encéphalites
(Naegleria fowleri), d’encéphalites (Acanthamoeba spp) ou de pathologies oculaires
(Acanthamoeba spp). Le diagnostic ne peut être fait que par la mise en évidence directe du
parasite dans le prélèvement à partir de l’examen direct et/ou après culture sur milieu enrichi
en bactéries. Il est essentiel de maîtriser les différentes phases de cette recherche peu fréquente
en s’assurant de la qualité du prélèvement et des méthodes analytiques. Une technique PCR
existant au laboratoire aidera à la validation des méthodes classiques.

2.1.2 Recherche de cryptosporidies et de microsporidies

Nous avons évalué, au cours de ce travail, nos méthodes de recherche standard de parasites
dans les selles. Cependant, faute d’échantillons positifs disponibles, les recherches spécifiques
de cryptosporidies et de microsporidies n’ont pas été abordées. Les validations des méthodes
utilisées au laboratoire (coloration de Ziehl-Neelsen modifiée pour les cryptosporidies et
trichrome de Weber pour les microsporidies) devront donc être envisagées prochainement par
la mise en place de contrôles externes de qualité.

165
2.1.3 L’environnement : Hygiène et Sécurité
2.1.3.1 Séparation des produits chimiques

Dans le chapitre 5.2, la Norme met l’accent sur la sécurité du personnel, la sécurité des
locaux et également sur le traitement et l’élimination des déchets.

L’utilisation de produits chimiques parfois toxiques et incompatibles entre eux a nécessité

une mise à jour des fiches réactifs et des fiches de sécurité. Les principes de séparation des
produits chimiques devront être respectés lors du déménagement du secteur (50).

2.1.3.2 Sorbonne

Pour le respect de l’environnement, il est indispensable de disposer d’une sorbonne

équipée d’un système adapté de collecte et d’évacuation des produits chimiques utilisés :

- La sorbonne à registre est destinée à la manipulation de solvants, aérosols et vapeur d’eau.

- La sorbonne à caisson est prévue pour les manipulations d’acides, bases et vapeurs
lourdes, à froid. Un caisson étanche permet la récupération des condensas.

- La sorbonne d’attaque est destinée aux manipulations d’acides chauffés ou autres

applications intensives de corrosifs. De l’eau, sous forme de spray, est pulvérisée par une
rampe, en partie haute du caisson. Les condensas sont collectés et éliminés en partie basse.
Un caisson assécheur d’air permet la condensation des vapeurs afin d’éviter leur
dissémination vers l’extérieur.

2.1.3.3 Remplacement des réactifs utilisés pour la recherche dans les selles

Les exigences concernant la sécurité du personnel nous poussent à remettre en cause

l’utilisation de certains de nos réactifs comme le liquide de Janeckso (contenant du mercure) et
l’éther, utilisés depuis de nombreuses années pour la recherche de parasites dans les selles.
Bien que les techniques utilisant ces réactifs soient reconnues historiquement comme des
techniques de référence et que nous ayons vérifié leurs performances sur site, il paraît
inéluctable de les remplacer dans un avenir proche par des techniques commercialisées.

Nous exposerons ici, à titre d’exemple, le principe de la méthode Parasep® SF ayant

recours à une double filtration. La dispersion des graisses par le filtre secondaire permet de
s’affranchir de l’utilisation d’éther ou d’acétate d’éthyle. L’association d’une chambre de
mélange cloisonnée et d’un système de filtration jetables après centrifugation du système
permet de limiter les risques d’exposition du personnel aux réactifs et agents infectieux. Le
principe de la technique est résumé dans la page suivante.
166
 Pour le choix du kit, une évaluation des performances sur site est à envisager, notamment
par l’étude de la corrélation avec nos techniques actuelles. Le principal facteur limitant de cette
vérification est la faible quantité d’échantillons parasités disponibles. Une étude du coût de ces
méthodes commercialisées est également nécessaire.

Illustration 43 : Principe de la méthode Parasep® SF

Chambre de mélange

Mailles
Tridimensio-
nnelles

Pelle de prélèvement

Filtre primaire breveté

Scellement air/eau et blocage de sécurité

Trappe à débris

Filtre secondaire breveté : dispersion des graisses

Cône de sédimentation

167
2.1.4 Les contrôles externes de qualité
La mise en place et le suivi de contrôles externes de qualité font partie des éléments
essentiels de la Norme. Ils permettent de participer à la formation continue du personnel et à
l’évaluation continue des méthodes utilisées.

Le suivi des contrôles AFSSAPS en parasitologie ne peut constituer, à lui seul, une mesure
suffisante d’évaluation externe de la qualité. La participation à des contrôles inter-laboratoires
devra donc être envisagée.

2.1.5 La maintenance
Des procédures concernant la maintenance du matériel du laboratoire sont indispensables.
Une traçabilité de cette maintenance (microscopes, centrifugeuse, balances…) est requise.

2.1.6 Gestion des non-conformités

Notre procédure de gestion des non-conformités doit être associée à la mise en place
d’actions préventives et correctives. Leur évaluation doit permettre de prouver l’amélioration
du système.

2.1.7 Un travail à inclure dans une démarche collective

Pour que ce travail ait un intérêt, il est essentiel que les procédures mises place soient
appliquées, mais aussi réévaluées et remises en question. La qualité ne se résume pas à un
ensemble de documents destinés à être mis en vitrine, c’est l’ensemble du personnel qui doit
faire vivre le système par une implication constante avec pour objectif l’amélioration continue
du laboratoire de Biologie Médicale.

Il est donc important que chacun participe à cette démarche qualité. Ceci passera à l’avenir
par des réunions plus régulières au sein du service et la mise en place de groupes de travail.

Des audits internes réguliers doivent également être appliqués afin de faire progresser
continuellement le système.

2.2 LE FUTUR BATIMENT DE BIOLOGIE MEDICALE

La perspective proche (en 2013) du regroupement des laboratoires de Biologie Médicale

du CHU dans un nouveau bâtiment laisse de nombreuses interrogations concernant les futures
conditions environnementales de travail. De nombreuses réunions interdisciplinaires fédérées
par la cellule qualité permettent d’organiser le futur laboratoire hospitalier de Limoges et de

168
justifier les aménagements à prévoir en fonction des exigences de la Norme et des différentes
spécialités.

Dans ce contexte, nous avons difficilement pu aborder les exigences relatives aux locaux
et conditions environnementales actuelles, telles que l’absence de sorbonne pour la réalisation
des examens parasitologiques des selles.

Pour le futur bâtiment, des questions restent en suspend concernant l’organisation liée à
l’activité de prélèvement. Une procédure générale, commune aux différents services, devrait
être mise en place. Cependant, nous l’avons vu précédemment, les prélèvements de
parasitologie et de mycologie sont très spécifiques et nécessitent une prise en charge adaptée,
parfois longue (second prélèvement de gale en cas de premier examen direct négatif) qui devra
donc être prise en compte. Les recommandations de l’Institut National de Recherche et de
Sécurité précisent que le laboratoire doit disposer d’au moins une salle de prélèvement située à
proximité de la salle d’attente et de la salle de tri des échantillons (50). La salle de prélèvement
doit également répondre à des exigences spécifiques de conception (superficie, conditions de
luminosité et de température, respect de l’intimité du patient…).

Au sein de la pièce technique de microbiologie, 4 zones doivent être délimitées :

- Une zone contenant un poste de sécurité microbiologique (PSM) à l’abri des courants d’air
ambiant. Ce PSM est destiné à effectuer les manipulations pouvant générer des bio-
aérosols potentiellement contaminants.

- Une zone de paillasses

- Une zone calme dédiée à l’observation des lames au microscope

- Une zone « propre » (saisie informatique)

169
Illustration 44 : Schéma fonctionnel d’une salle de microbiologie selon l’INRS (50)

170
CONCLUSION

171
 L’intérêt du patient doit être au cœur des préoccupations du système de santé. C’est un des
principes de base du Rapport Ballereau à l’origine de la réforme de la Biologie Médicale. Pour
permettre à chacun d’avoir accès à une biologie de qualité prouvée, l’ensemble des laboratoires
français doit repenser et adapter son mode de fonctionnement. Les laboratoires du secteur privé
sont, en général, bien avancés dans leur démarche d’accréditation alors que ceux du secteur
hospitalier ne sont, pour la plupart, que dans une phase d’initiation à la qualité.

L’hôpital dispose d’un important réseau de professionnels de santé au sein duquel

médecins, infirmiers, biologistes, techniciens doivent travailler en connexion étroite pour
contribuer à une prise en charge optimale du patient. Les laboratoires hospitaliers doivent
chercher à raisonner en fonction du dossier clinique du patient.

C’est dans cette direction que nous avons mené ce travail au sein du secteur de
parasitologie directe de Limoges. L’évaluation de nos méthodes qualitatives a notamment été
basée sur l’évolution clinique et biologique du malade. L’importance du contexte
épidémiologique et des renseignements cliniques dans cette discipline a nécessité la mise en
place de procédures orientées vers le dialogue clinico-biologique et la prestation de conseils.

Les niveaux de compétence du personnel au moment du prélèvement et de la recherche de

parasites sont également des éléments décisifs dans la qualité du résultat rendu. Nous pouvons
donc considérer les mesures d’habilitation et de formation continue mises en place comme des
actions participant à la progression du service.

Le travail de management initié par la cellule qualité au sein de l’hôpital doit être relayé
par les différents services du futur laboratoire afin de pouvoir envisager une entrée effective
dans la démarche d’accréditation avant 2013. Nous avons donc proposé à l’ensemble de la
cellule, notre dossier de validation des méthodes qualitatives de recherche de paludisme pour
qu’il fasse partie des méthodes présentées en 2012 au comité français d’accréditation.

Nous espérons également que l’amélioration de notre maîtrise documentaire facilitera

l’exploitation du système de gestion des documents prochainement adopté au sein de l’hôpital.

172
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176
 TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ................................................................................................................... 4

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................. 13

SOMMAIRE ............................................................................................................................. 14

INTRODUCTION .................................................................................................................... 14

GENERALITES ....................................................................................................................... 19
1. LA NORME NF EN ISO 15189 ET LES GUIDES D’ACCREDITATION .............................................. 20

1.1 La Norme NF EN ISO 15189 ........................................................................................ 20

1.2 Les guides d’accréditation du Cofrac ............................................................................. 21
2. LES ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA NORME ........................................................................ 21
2.1 Organisation et management .......................................................................................... 21
2.2 Le personnel .................................................................................................................. 22
2.3 Maîtrise documentaire ................................................................................................... 22
2.4 Traçabilité ..................................................................................................................... 24
2.5 Identification et maîtrise des non-conformités ................................................................ 24
2.6 Validation des méthodes ................................................................................................ 24
2.7 Incertitude de mesure..................................................................................................... 27
2.8 Prestation de conseils..................................................................................................... 28
3. DEROULEMENT DE LA DEMARCHE D’ACCREDITATION ............................................................ 29
3.1 Entrée dans la démarche d’accréditation ........................................................................ 29
3.1.1 Option A ................................................................................................................. 29
3.1.2 Option B ................................................................................................................. 30
3.2 Relation avec les auditeurs............................................................................................. 30
3.2.1 Avant l’audit ........................................................................................................... 30
3.2.2 Déroulement de l’audit ............................................................................................ 30
3.2.3 Après la visite d’audit ............................................................................................. 31
3.3 Obtention de l’accréditation ........................................................................................... 31

APPLICATION DE LA NORME A LA PARASITOLOGIE DIRECTE DU CHU DE

LIMOGES ................................................................................................................................ 32
1. UN TRAVAIL QUI S’INSCRIT DANS UN PROJET HOSPITALIER ..................................................... 33
177
2. LES SPECIFICITES DE LA PARASITOLOGIE DIRECTE FACE AUX EXIGENCES DE LA NORME........... 33
3. LES OBJECTIFS PRIORITAIRES................................................................................................. 34
3.1 Analyse du risque d’erreur en parasitologie pour cibler les actions prioritaires ............... 34
3.2 L’intérêt du patient : une priorité de notre démarche ...................................................... 36
3.2.1 Le paludisme : l’urgence diagnostique vitale ........................................................... 36
3.2.2 La gale : une nuisance constituant un problème de Santé Publique .......................... 36
3.2.3 La recherche de parasites dans les selles : principale activité du secteur .................. 36
3.2.4 Les parasites pathogènes rares en France ................................................................. 37
3.3 La maîtrise de la documentation .................................................................................... 37
4. LES MOYENS UTILISES ........................................................................................................... 38
4.1 Les documents Cofrac ................................................................................................... 38
4.2 Un modèle d’accréditation ............................................................................................. 38
4.3 Les ouvrages de référence .............................................................................................. 38

RESULTATS............................................................................................................................ 40
1. PRESTATIONS DE CONSEILS ................................................................................................... 41
1.1 Les exigences de la Norme ............................................................................................ 41
1.2 Des aides à la prescription pour répondre à cette exigence ............................................. 41
1.2.1 L’hyperéosinophilie sanguine : un motif fréquent de recherche parasitaire .............. 42
1.2.2 Parasitoses tropicales nécessitant une prestation de conseils .................................... 46
1.3 Avis et interprétations .................................................................................................... 46
2. EXIGENCES LIEES AU PERSONNEL .......................................................................................... 47
2.1 Pré-analytique ............................................................................................................... 47
2.1.1 Personnel préleveur du laboratoire : habilitation des internes ................................... 47
2.1.2 Personnel préleveur n’appartenant pas au laboratoire : manuel de prélèvements et
catalogue des analyses ......................................................................................................... 52
2.2 Analytique ..................................................................................................................... 56
2.2.1 Des contrôles internes de qualité pour une formation continue ................................ 56
2.2.2 Autres mesures de formation ................................................................................... 57
2.2.3 Habilitation au secteur de parasitologie directe ........................................................ 57
2.3 Post-analytique .............................................................................................................. 61
3. PROCEDURES TECHNIQUES .................................................................................................... 61
3.1 Le prélèvement est réalisé au laboratoire ....................................................................... 61
3.1.1 Recherche de sarcoptes ........................................................................................... 62
3.1.1.1 Mode opératoire ..................................................................................................... 62
3.1.1.2 Incertitude de mesure et maîtrise du risque d’erreur ................................................ 67
3.1.2 Test à la cellophane adhésive ou Scotch®-test anal .................................................. 69

178
 3.1.2.1 Conditions de réalisation ........................................................................................ 69
3.1.2.2 Mode opératoire ..................................................................................................... 69
3.1.3 Recherche de Demodex folliculorum ....................................................................... 72
3.1.3.1 Commensal ou pathogène ? .................................................................................... 72
3.1.3.2 Mode opératoire ..................................................................................................... 72
3.1.4 Recherche d’onchocercose ...................................................................................... 75
3.2 Le prélèvement n’est pas réalisé au laboratoire .............................................................. 75
3.2.1 Gestion des non-conformités ................................................................................... 75
3.2.2 Recherche de paludisme .......................................................................................... 76
3.2.2.1 Pré-analytique ........................................................................................................ 77
3.2.2.1.1 Aide à la prescription ................................................................................ 77
3.2.2.1.2 Fiche de renseignements............................................................................ 79
3.2.2.2 Analytique.............................................................................................................. 81
3.2.2.2.1 Procédure et modes opératoires ................................................................. 81
3.2.2.2.2 Validation des méthodes............................................................................ 91
3.2.2.2.3 Contrôles internes de qualité ................................................................... 116
3.2.2.2.4 Evaluation externe de la qualité ............................................................... 118
3.2.2.3 Post-analytique..................................................................................................... 119
3.2.3 Recherche de leishmaniose viscérale ..................................................................... 121
3.2.3.1 Pré-analytique ...................................................................................................... 121
3.2.3.1.1 Aide à la prescription .............................................................................. 121
3.2.3.2 Analytique............................................................................................................ 123
3.2.3.2.1 Procédure diagnostique du laboratoire ..................................................... 123
3.2.3.2.2 Validation des méthodes.......................................................................... 128
3.2.3.3 Post-analytique ..................................................................................................... 128
3.2.4 Recherche de trypanosomose humaine africaine .................................................... 129
3.2.4.1 Pré-analytique ...................................................................................................... 129
3.2.4.1.1 Motifs de la recherche ............................................................................. 129
3.2.4.1.2 Rôle fondamental du biologiste ............................................................... 130
3.2.4.2 Analytique............................................................................................................ 132
3.2.4.2.1 Procédure du laboratoire.......................................................................... 132
3.2.4.2.2 Techniques réalisées au laboratoire et leur vérification bibliographique ... 134
3.2.4.3 Post-analytique ..................................................................................................... 136
3.2.5 Recherche de filarioses.......................................................................................... 136
3.2.5.1 Pré-analytique ...................................................................................................... 137
3.2.5.1.1 Aide à la prescription .............................................................................. 137

179
 3.2.5.2 Analytique............................................................................................................ 139
3.2.5.2.1 Procédure du laboratoire.......................................................................... 139
3.2.6 Recherche de parasites dans les selles ................................................................... 142
3.2.6.1 Pré-analytique ...................................................................................................... 142
3.2.6.2 Analytique ........................................................................................................... 144
3.2.6.2.1 Procédure du laboratoire.......................................................................... 144
3.2.6.2.2 Evaluation sur site ................................................................................... 147
3.2.6.2.3 Contrôles internes ................................................................................... 151
3.2.6.2.4 Evaluation externe ................................................................................... 152
3.2.6.3 Post-analytique..................................................................................................... 153
3.2.7 Recherche de schistosomose urinaire .................................................................... 155
3.2.7.1 Pré-analytique ...................................................................................................... 156
3.2.7.1.1 Aide à la prescription .............................................................................. 156
3.2.7.1.2 Importance des conditions de prélèvement .............................................. 156
3.2.7.2 Analytique............................................................................................................ 158
3.2.7.2.1 Procédure du laboratoire.......................................................................... 158
3.2.7.2.2 Evaluation des méthodes : corrélation entre recherche directe et sérologie161
3.2.7.3 Post-analytique..................................................................................................... 162

DISCUSSION......................................................................................................................... 163
1. LES AVANCEES ................................................................................................................... 164
2. LES LIMITES ET LES PERSPECTIVES ....................................................................................... 165
2.1 Les mesures restant à mettre en place .......................................................................... 165
2.1.1 Recherche d’amibes libres ..................................................................................... 165
2.1.2 Recherche de cryptosporidies et de microsporidies ................................................ 165
2.1.3 L’environnement : Hygiène et Sécurité ................................................................. 166
2.1.3.1 Séparation des produits chimiques ........................................................................ 166
2.1.3.2 Sorbonne .............................................................................................................. 166
2.1.3.3 Remplacement des réactifs utilisés pour la recherche dans les selles ..................... 166
2.1.4 Les contrôles externes de qualité ........................................................................... 168
2.1.5 La maintenance ..................................................................................................... 168
2.1.6 Gestion des non-conformités ................................................................................. 168
2.1.7 Un travail à inclure dans une démarche collective ................................................. 168
2.2 Le futur bâtiment de Biologie Médicale ....................................................................... 168

CONCLUSION....................................................................................................................... 171

BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................. 173

180
TABLE DES MATIERES....................................................................................................... 177

TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................ 182

TABLE DES TABLEAUX ..................................................................................................... 184

181
 TABLE DES ILLUSTRATIONS

Illustration 1 : Schéma du circuit classique d’un document produit en interne (d’après C.

ROQUES) ............................................................................................................................... 22
Illustration 2 : Schéma de la pyramide de gestion documentaire (d’après C. ROQUES) ................. 23
Illustration 3 : Aide à la prescription devant une hyperéosinophilie chez un autochtone ................. 44
Illustration 4 : Aide à la prescription devant une hyperéosinophilie après séjour à l’étranger ........ 45
Illustration 5 : Fiche d’habilitation des internes aux prélèvements réalisés au laboratoire ............. 49
Illustration 6 : Instructions destinées aux cliniciens, préparation au Scotch®-test anal ................... 54
Illustration 7 : Instructions destinées aux patients, préparation au Scotch®-test anal...................... 55
Illustration 8 : Fiches d’habilitation au poste de parasitologie directe ........................................... 58
Illustration 9 : Mode opératoire de la recherche de gale ................................................................ 63
Illustration 10 : Mode opératoire du Scotch®-test anal ................................................................... 70
Illustration 11 : Mode opératoire de la recherche de Demodex ....................................................... 73
Illustration 12 : Aide à la prescription recherche directe de paludisme ........................................... 78
Illustration 13 : Fiche de renseignements lors d’une recherche de paludisme ................................. 80
Illustration 14 : Photographie d’un frottis mince avec 3 trophozoïtes de Plasmodium falciparum... 82
Illustration 15 : Photographie d’une goutte épaisse avec nombreux trophozoïtes de Plasmodium
falciparum .............................................................................................................................. 82
Illustration 16 : Procédure de recherche de paludisme (logigramme) ............................................. 83
Illustration 17 : Mode opératoire frottis sanguin et coloration courte au May-Grünwald-Giemsa .. 84
Illustration 18 : Mode opératoire réalisation et coloration d’une goutte épaisse ............................. 87
Illustration 19 : Mode opératoire recherche d’antigènes de Plasmodium........................................ 89
Illustration 20 : Validation du frottis mince coloré au MGG dans la recherche de paludisme ......... 101
Illustration 21 : Validation de la goutte épaisse dans la recherche de paludisme ............................ 106
Illustration 22 : Validation du BinaxNow Malaria ® dans la recherche de paludisme ...................... 111
Illustration 23 : Préparation des contrôles internes pour coloration M.G.G. .................................. 117
Illustration 24 : Logigramme décisionnel devant un frottis mince positif......................................... 119
Illustration 25 : Logigramme décisionnel devant un frottis mince négatif ....................................... 120
Illustration 26 : Aide à la prescription recherche de leishmaniose viscérale ................................... 122
Illustration 27 : Photographie de formes amastigotes intra-macrophagiques de Leishmania .......... 123
Illustration 28 : Procédure de recherche de leishmanioses (logigramme) ....................................... 125

182
Illustration 29 : Mode opératoire leucocytocentrifugation .............................................................. 126
Illustration 30 : Aide à la prescription recherche de trypanosomose humaine africaine .................. 131
Illustration 31 : Procédure de recherche de trypanosomose humaine africaine (logigramme) ........ 133
Illustration 32 : Photographie de Trypanosoma brucei sur frottis mince coloré au May-Grünwald-
Giemsa ................................................................................................................................... 134
Illustration 33 : Aide à la prescription recherche de filariose ......................................................... 138
Illustration 34 : Mode opératoire concentration des microfilaires par hémolyse à la saponine ....... 140
Illustration 35 : Aide à la prescription devant une suspicion de parasitose digestive ...................... 143
Illustration 36 : Concentration parasitaire : méthode diphasique, aspect du tube après
centrifugation ......................................................................................................................... 145
Illustration 37 : Concentration parasitaire : méthode de flottation ................................................. 146
Illustration 38 : Nombre de kystes/oocystes pour 50 champs à l’objectif 40 .................................... 149
Illustration 39 : Nombre d’œufs/oocystes pour 50 champs à l’objectif 10........................................ 150
Illustration 40 : Aide à la prescription recherche de schistosomose urinaire .................................. 157
Illustration 41 : Photographie d’un œuf de S. haematobium (140µm) avec son éperon terminal ..... 158
Illustration 42 : Mode opératoire recherche de Schistosoma haematobium dans les urines............. 159
Illustration 43 : Principe de la méthode Parasep® SF ..................................................................... 167
Illustration 44 : Schéma fonctionnel d’une salle de microbiologie selon l’INRS (50) ...................... 170

183
 TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Exigences de la Norme NF EN ISO 15189 ................................................................... 20

Tableau 2 : Vérification initiale d’une technique qualitative, d’après LAB GTA 04 (5) ................... 26
Tableau 3 : Identification des facteurs d’incertitude grâce à la règle des « 5M » ............................ 28
Tableau 4 : Influence des facteurs d’incertitude en parasitologie directe ........................................ 35
Tableau 5 : Recherche de sarcopte, facteurs d’incertitude et maîtrise du risque d’erreur ............... 68
Tableau 6 : Recherches de paludisme positives du 1erjanvier au 27 septembre 2010 ....................... 94
Tableau 7 : Recherches de paludisme négatives du 1er janvier au 27 septembre 2010 ..................... 96
Tableau 8 : Résultat de paludisme discordant ................................................................................. 96
Tableau 9 : Approche du seuil de détection grâce au suivi post-thérapeutique ................................ 98
Tableau 10 : Résultats des contrôles externes AFSSAPS (frottis minces) ........................................ 118
Tableau 11 : Protozoaires et coccidie inclus dans la vérification .................................................... 148
Tableau 12 : Helminthes et coccidie inclus dans la vérification ...................................................... 148
Tableau 13 : Résultats des contrôles externes AFSSAPS (selles parasitées) .................................... 152
Tableau 14 : Commentaires codifiés des résultats d’examens parasitologiques des selles ............... 154
Tableau 15 : Recherches de schistosomose urinaire à Limoges retenues pour l’évaluation ............. 162

184
 SERMENT D’HIPPOCRATE

En présence des maîtres de cette école, de mes condisciples, je

promets et je jure d’être fidèle aux lois de l’honneur et de la probité dans
l’exercice de la médecine.

Je dispenserai mes soins sans distinction de race, de religion,

d’idéologie ou de situation sociale.

Admis à l’intérieur des maisons, mes yeux ne verront pas ce qui s’y
passe, ma langue taira les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira pas
à corrompre les mœurs ni à favoriser les crimes.

Je serai reconnaissant envers mais maîtres, et solidaire moralement de

mes confrères. Conscient de mes responsabilités envers les patients, je
continuerai à perfectionner mon savoir.

Si je remplis ce serment sans l’enfreindre, qu’il me soit donné de jouir

de l’estime des hommes et de mes condisciples, si je le viole et que je me parjure,
puissé-je avoir un sort contraire.

185
186
 L’Ordonnance du 13 janvier 2010, propre à la réforme de la Biologie Médicale, impose
aux laboratoires français l’accréditation selon la Norme NF EN ISO 15189. L’objectif est
d’améliorer et d’uniformiser le niveau de qualité de la Biologie Médicale française. Chaque
laboratoire doit alors prouver au comité français d’accréditation (Cofrac) qu’il maîtrise toutes les
phases de l’analyse, du prélèvement jusqu’au rendu du résultat. Une cellule qualité a donc été
mise en place au sein du Pôle Biologie-Hygiène du CHU de Limoges dans le but de fédérer les
initiatives et les démarches Qualité de chacun des sites du futur laboratoire hospitalier.
Dans ce contexte, le service de Parasitologie-Mycologie a initié un ensemble d’actions
destinées à répondre aux exigences de la Norme. Les spécificités propres à la parasitologie directe
rendent parfois difficile l’application des exigences techniques. En effet, les méthodes
analytiques, basées sur la mise en évidence d’éléments parasitaires au microscope, sont
qualitatives et la faible incidence des parasitoses en France métropolitaine rend difficilement
applicable la vérification de leurs performances sur site. Un important travail de réflexion et une
collaboration inter-laboratoires sont alors nécessaires.
Le service de Parasitologie-Mycologie du CHU de Rangueil à Toulouse est accrédité selon
la Norme NF EN ISO 15189. Nous nous sommes appuyés sur leur savoir-faire afin de constituer
le dossier de validation des méthodes de recherche de paludisme et d’évaluer les performances sur
site d’autres techniques.
Afin de favoriser le dialogue clinico-biologique, nous nous sommes efforcés d’établir des
prestations de conseils (aide à la prescription, proposition d’une démarche diagnostique,
interprétation des résultats…). Nous avons également mis en place des mesures destinées à
prouver et à optimiser la qualité de la formation du personnel du secteur de parasitologie directe.
La réactualisation de nos procédures techniques et leur approbation nous ont aussi permis de
progresser dans la maîtrise de notre documentation.
Les actions, ainsi mises en place, participent à l’amélioration de la qualité du résultat rendu
mais ne peuvent être jugées comme suffisantes. Elles doivent s’inscrire dans un processus
d’amélioration continue compris et adopté par tous les acteurs de santé.

Mots clés : Accréditation, norme NF EN ISO 15189, parasitologie directe, validation des
méthodes, habilitation, prescription.

Pôle Biologie-Hygiène.
Service de Parasitologie-Mycologie, CHU de Limoges.

187