Pharma&Biotech

Lysat d’amoebocytes de limule (LAL)

Kinetic-QCL™

Licence américaine numéro 1775. Traductions disponibles sur le site [Link]

Table des matières

Section page

1 Utilisation prévue 2
1 Avertissement 2
1 Description du test 3
2 Principe 4
2 Réactifs fournis et conditions
de conservation 5
3 Matériel et équipement non fournis 6
4 Prélèvement et préparation
des échantillons 8
4 Les différents types de tests
Kinetic-QCL™ 9
5 Préparation des réactifs 11
6 Réalisation du test 14
Section Page

7 Caractéristiques de performance 16
7 Calcul des concentrations
en endotoxines 17
8 POWERCURVE™ 20
9 Inhibition du produit 22
9 Limites et indications 25
9 Échantillons colorés 25
10 Courbe d’étalonnage archivée 26
10 Corrélation avec les autres méthodes 27
10 Une note pour nos clients
internationaux 27
11 Références 28
Important : lire la brochure en entier avant d’effectuer le test.

Utilisation prévue
Ce produit a été conçu pour servir de test in vitro de détection des
endotoxines dans le produit final pour les médicaments parentéraux à
usage humain et vétérinaire, les produits biologiques et les dispositifs
médicaux. Ce produit n’est pas destiné à la détection des endotoxines
dans les échantillons cliniques ou au diagnostic de maladie humaine. Ce
test utilise une préparation du lysat d’amoebocytes de limule (Limulus
Amebocyte Lysate ou LAL), en association avec un lecteur-incubateur de
microplaque et le logiciel correspondant, afin de détecter les endotoxines
par photométrie.

La pharmacopée décrit brièvement les procédures qui sont considérées

comme nécessaires pour :
1. Établir les limites des concentrations en endotoxines pour les
médicaments et les dispositifs médicaux
2. Valider l’utilisation du LAL en tant que tests de dosage des endotoxines
dans le produit final
3. Développer un protocole d’analyse en routine8
Les procédures décrites dans ce document se basent sur les
recommandations de la pharmacopée.

Avertissement
Pour diagnostic in vitro uniquement. Le dosage Kinetic-QCL™ n’est pas
prévu pour détecter l’endotoxémie chez l’homme. Le test LAL, utilisé
conformément aux recommandations de la pharmacopée, peut remplacer
le test d’apyrogénicité sur le lapin pour les tests sur le produit final pour
les médicaments parentéraux à usage humain et vétérinaire, les produits
biologiques et les dispositifs médicaux8.
2
Description du test
Le test Kinetic-QCL™ permet le dosage quantitatif et cinétique des 1
endotoxines des bactéries Gram-négatif. Un échantillon est mélangé avec le
réactif LAL/substrat, puis placé dans un lecteur-incubateur de microplaque.
L’apparition de la couleur jaune est ensuite surveillée automatiquement au
cours du temps. Le temps nécessaire pour obtenir l’apparition de la couleur
jaune (temps de réaction) est inversement proportionnel à la quantité
d’endotoxines présente dans l’échantillon ; c’est-à-dire qu’en présence
d’une quantité importante d’endotoxines, la réaction est rapide alors qu’en
présence d’une plus petite quantité d’endotoxines, le temps de réaction est
plus long. La concentration en endotoxines dans les échantillons inconnus
est calculée à partir d’une courbe d’étalonnage.

L’utilisation du LAL pour détecter les endotoxines a commencé avec

l’observation de Bang1 selon laquelle une infection Gram-négatif du
Limulus polyphemus, le crabe en fer à cheval, entraînait une coagulation
intravasculaire fatale. Plus tard, Levin et Bang2,3 ont démontré que cette
coagulation était le résultat d’une réaction entre les endotoxines et une
protéine coagulable présente dans les amoebocytes du sang de limule
(Limulus). Après la mise au point d’un anticoagulant adapté au sang
de limule, Levin et Bang4 ont préparé un lysat à partir d’amoebocytes
lavés qui représentait un indicateur extrêmement sensible de la présence
d’endotoxines. Solum5,6 et Young, Levin et Prendergast7 ont purifié et
caractérisé la protéine coagulable à partir du LAL et ont démontré que
la réaction avec les endotoxines était enzymatique.

La méthode LAL décrite utilise la partie initiale de la réaction LAL-

endotoxines pour activer un enzyme qui libère de la p-nitroaniline (pNA)
à partir d’un substrat synthétique, produisant une couleur jaune.

3
Principe
Proenzyme Endotoxine Enzyme

Substrat + H2O Enzyme Peptide + pNA

Les endotoxines des bactéries Gram-négatif catalysent l’activation d’une

proenzyme dans le LAL7. Le taux initial d’activation est déterminé par la
concentration en endotoxines présentes. L’enzyme activée catalyse la
libération de pNA du substrat incolore Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA. La pNa libre
est mesurée par photométrie, à 405 nm, de façon continue tout au long de la
période d’incubation. La concentration en endotoxines dans un échantillon
est calculée à partir de son temps de réaction, puis en comparant celui-ci
avec une courbe d’étalonnage.

4
Réactifs fournis et conditions de conservation
Réactif Kinetic-QCL™ (K50-643) Flacon à étiquette jaune
Chaque flacon contient un mélange lyophilisé de lysat préparé à partir
d’amoebocytes circulants provenant de crabes en fer à cheval, Limulus
2
polyphemus et d’un substrat chromogène.

Juste avant utilisation, reconstituer le lysat en ajoutant 2,6 ml d’eau pour

réactif LAL dans chaque flacon. Si plus d’un flacon est requis, regrouper
deux flacons ou plus avant utilisation. Agiter par rotation, doucement pour
éviter de faire mousser. Le réactif lyophilisé Kinetic-QCL™ doit être conservé
à une température comprise entre 2 et 8 °C. Le protéger des expositions
prolongées à la lumière.

Le réactif reconstitué Kinetic-QCL™ doit être utilisé rapidement. Le réactif

reconstitué Kinetic-QCL™, conservé entre 2 et 8 °C, est stable pendant
8 heures ; il peut aussi être conservé à une température de -10 °C ou
inférieure pendant deux semaines au maximum. Ne congeler et décongeler
qu’une seule fois.

Endotoxine 055:B5 d’E. coli (E50-643) Flacon à étiquette rouge

Le volume de reconstitution des flacons est indiqué sur le certificat
d’analyse (CoA) et est calculé pour obtenir une solution contenant 50 UE
(ou UI) par ml. Reconstituer avec le volume d’eau pour réactif LAL spécifié.
Agiter vigoureusement pendant au moins 15 minutes, à vitesse élevée
à l’aide d’un agitateur Vortex. Avant son utilisation subséquente, il faut
mettre la solution reconstituée à température ambiante, puis l’agiter
vigoureusement au vortex pendant 15 minutes. Ceci est important car
l’endotoxine à tendance à s’attacher au verre. Le CoA est disponible sur le
site [Link]/coa.

5
Conserver l’endotoxine lyophilisée O55:B5 d’E. coli à une température
comprise entre 2 et 8 °C. Conservée entre 2 et 8 °C, la solution
d’endotoxine reconstituée est stable pendant quatre semaines.
Remarque : les flacons d’endotoxine ne sont pas inclus dans les kits
comprenant seulement des flacons de lysat, mais sont nécessaires.

Cette endotoxine est fournie afin d'aider l’utilisateur. D’autres préparations

d’endotoxines peuvent être utilisées pour préparer les étalons ; cependant,
leur performance dans le dosage chromogène relatif à l’endotoxine étalon
de référence (EER) doit être déterminée.

Eau pour réactif LAL (W50-640) Flacon étiqueté en bleu

Chaque flacon contient 30 ml d’eau pour réactif LAL. Cette eau doit être
utilisée pour remettre en suspension le réactif Kinetic-QCL™ et l’endotoxine
de l’E. coli, et pour préparer les dilutions d’endotoxine et des échantillons.
L’eau pour réactif LAL est équivalente à l’eau pour le test de détection des
endotoxines bactériennes (BET).

Conserver l’eau pour réactif LAL à une température comprise entre 2 et 8 °C.
Remarque : les flacons d’eau pour réactif sont nécessaires, mais ne sont
pas inclus dans les kits.

Matériel et équipement NON fournis

1. Tubes jetables en verre pour dilution, apyrogènes (13 × 100 mm,
no N207 ou équivalent).

2. Pipettes sérologiques emballées individuellement.

3. Pipettes automatiques, avec embouts stériles emballés

individuellement ou disposés sur un support.

6
4. Microplaques stériles jetables.
Remarque : avant une utilisation routinière, les microplaques doivent
être préqualifiées8 (no 25-340 ou équivalent).

5. Réservoirs à réactif (no 00190035 ou équivalent).

6. Pipette à huit canaux.

3
7. Hydroxyde de sodium, 0,1 N ou bien acide chlorhydrique, 0,1 N, dissout
dans l’eau pour réactif LAL, pour l’ajustement du pH de l’échantillon,
au besoin.

8. Lecteur de microplaque (lecteur ELx808™ IU, no 25-315S ou équivalent).

9. Logiciel WinKQCL™.

10. Chronomètre.

11. Agitateur Vortex.

12. Pour les kits sans eau : eau pour réactif LAL (nos. W50-640, W50-100,
W50-500 ou équivalent).

13. Étalon d’endotoxine (endotoxine étalon de contrôle correspondant

au LAL).

7
Prélèvement et préparation des échantillons
Employer une technique sûre afin d’éviter toute contamination microbienne
ou par des endotoxines. Tout le matériel entrant en contact avec les
échantillons ou les réactifs ne doivent contenir aucune endotoxine.
Débarrasser la verrerie et le matériel des endotoxines en les exposant,
pendant 30 minutes, à une température de 250 °C. Prendre les
précautions nécessaires pour protéger le matériel dépyrogénéisé de toute
contamination environnementale.

D’expérience, la plupart des pipettes en plastique stériles et emballées

individuellement, et les embouts de pipettes sont exempts d’endotoxine.
Cependant, ce matériel doit être testé avant d’être utilisé.

Si l’ajustement du pH de l’échantillon est nécessaire pour qu’il se situe entre

6,0 et 8,0, utiliser de l’hydroxyde de sodium ou de l’acide chlorhydrique
exempt d’endotoxine. Toujours mesurer le pH d’une aliquote de l’échantillon
de base afin d'éviter toute contamination par l’électrode du pH-mètre.
Ne pas ajuster les solutions non tamponnées.

Conserver les échantillons à analyser de façon à ce que toute activité

bactériologique soit arrêtée, sinon la concentration des endotoxines
augmentera au cours du temps. Par exemple, conserver les échantillons
entre 2 et 8 °C pendant moins de 24 heures et au-delà, les congeler. Il
incombe à l’utilisateur de veiller à ce que le récipient et les conditions de
conservation de ses échantillons soient corrects.

Si le récipient du diluant utilisé pour remettre en suspension le réactif

Kinetic-QCL™ a été préalablement ouvert ou s'il n’est pas fourni par Lonza,
tester le diluant seul pour confirmer qu’il n’est pas contaminé par des
endotoxines.

8
Les différents types de tests Kinetic-QCL™
Le lecteur-incubateur de microplaque et le logiciel WinKQCL™ font partie
intégrante du test Kinetic-QCL™. Il est important de se familiariser avec
le fonctionnement du lecteur-incubateur de microplaque et avec les
fonctionnalités du logiciel WinKQCL™. Veiller à consulter les manuels du
lecteur-incubateur de microplaque et du logiciel WinKQCL™, ou encore la
section Aide pour plus de détails.

Il existe quatre (4) types de tests Kinetic-QCL™ de base, chacun étant conçu
pour réaliser un aspect différent du test LAL. 4

1. Test de routine
Un test de routine calcule la concentration en endotoxines dans un
échantillon dont la valeur est inconnue par comparaison avec la
performance d’une série d’étalons d’endotoxine.

Dans le test de routine, l’utilisateur a le choix d’inclure un contrôle

produit positif (CPP) pour suivre l’inhibition ou la stimulation par
le produit (section 2 ci-dessous). Un CPP est un échantillon de
produit auquel a été ajoutée une quantité connue d’endotoxine. Le
logiciel WinKQCL™ calcule automatiquement la quantité d’endotoxine
retrouvée dans le CPP, permettant de la comparer à la quantité connue
d’endotoxine ajoutée.

2. Inhibition / stimulation
La réaction LAL est stimulée par un enzyme et possède donc une
plage de pH optimale et des conditions de sels et de cations bivalents
spécifiques. Parfois, les échantillons à analyser peuvent altérer ces
conditions optimales à tel point que le lysat devient insensible à
l’endotoxine. Les résultats négatifs provenant d’échantillons inhibant
le test LAL n’indiquent pas nécessairement l’absence d’endotoxine.

9
 Un test d’inhibition / stimulation est conçu pour déterminer le taux de
dilution du produit qui dépasse l’inhibition ou la stimulation. Chaque
dilution du produit doit être accompagnée d’un contrôle produit positif
(CPP). Le logiciel WinKQCL™ calcule automatiquement la quantité
d’endotoxine retrouvée dans le CPP afin de la comparer à la quantité
connue d’endotoxine ajoutée. De cette manière, il est possible de
déterminer quelles sont les dilutions du produit qui n’interfèrent pas.

3. Endotoxine étalon de référence / endotoxine étalon de contrôle

Un test endotoxine étalon de référence / endotoxine étalon de contrôle
(EER/EEC) est conçu pour déterminer la puissance d’un EEC en termes
d’unités de concentration de l’EER.

Le test requiert une seule série de dilutions EER et une ou plusieurs

séries de dilutions d’EEC. Selon les unités de concentration de l’EEC,
le logiciel WinKQCL™ calcule automatiquement les valeurs moyennes
de la puissance en termes de UE/ng ou de UE/ml. L’utilisateur a aussi
l’option de saisir des unités autres que UE ou ng.

10
4. Test initial de qualification
Un test initial de qualification a été développé selon les recommandations
décrites dans la pharmacopée8. Ce test est nécessaire et fait partie de
la validation du test LAL ; il doit aussi être effectué chaque fois qu’un
nouveau lot de Kinetic-QCL™ est utilisé.

Le test initial de qualifiation effectue une corrélation log/log linéaire

des valeurs individuelles du temps de réaction pour chaque copie de
chaque étalon d’endotoxine. Les autres tests utilisent le temps de
réaction moyen de toutes les réplicats de chaque étalon.

Le test initial de qualifiation ne prévoit l’inclusion d’aucun échantillon.

5

Préparation des réactifs

Laisser les réactifs atteindre la température ambiante avant de les utiliser.

Afin de calculer les concentrations en endotoxines dans les échantillons

dont la concentration est inconnue, chaque test Kinetic-QCL™ doit être
référencé à une courbe d’étalonnage valide.

Puisque la plage de détermination des concentrations en endotoxines

peut être grande, il est possible d’ajuster la plage quantitative d’un test
donné en ajustant la concentration en étalons d’endotoxine utilisés lors
de la préparation de la courbe d’étalonnage. Un minimum de trois étalons
est requis.

11
Le test Kinetic-QCL™ a été optimisé pour être linéaire de 0,005 UE/ml à
50,0 UE/ml. Cependant, l’utilisateur a la possibilité de raccourcir la courbe
d’étalonnage en accord avec les exigences particulières du produit. Les
données indiquent que raccourcir une courbe d’étalonnage d’un test
LAL avec la méthode cinétique chromogène peut améliorer la précision
des valeurs d’endotoxines prévues pour les échantillons à analyser. Il
est conseillé à l’utilisateur de se familiariser avec les recommandations
de la pharmacopée portant sur les méthodes cinétiques de détection
des endotoxines avant d’établir la plage de la courbe d’étalonnage par
chromogénie cinétique à utiliser pour l’analyse standard des échantillons
de produit8.

Le tableau suivant suggère un modèle de dilution pour établir une série

de dilutions d’endotoxine à partir de l’endotoxine fournie dans le kit. Il ne
faut pas utiliser toutes les dilutions pour établir une courbe d’étalonnage.
D’autres modèles de dilutions peuvent être utilisés ainsi que d’autres
endotoxines non fournies. Si l’endotoxine utilisée n’est pas fournie,
le recours à un test EER/EEC est possible pour déterminer la puissance
de l’EEC.

Remarque : il est déconseillé de faire les dilutions de l’endotoxine dans

des tubes en plastique.

Concentration Volume d’eau pour Volume de solution d’endotoxine

d’endotoxine (UE/ml) réactif LAL ajoutée à l’eau pour réactif LAL
5,0 0,9 ml 0,1 ml d’une solution de 50,0 UE/ml
0,5 0,9 ml 0,1 ml d’une solution de 5,0 UE/ml
0,05 0,9 ml 0,1 ml d’une solution 0,5 UE/ml
0,005 0,9 ml 0,1 ml d’une solution de 0,05 UE/ml

12
1. Préparer une solution contenant 5,0 UE/ml d’endotoxine en ajoutant
0,1 ml de la solution d’endotoxine mère à 50,0 UE/ml dans 0,9 ml d’eau
pour réactif LAL dans un récipient approprié et poser une étiquette
indiquant 5,0 UE/ml. Cette solution doit être vigoureusement mélangée
au vortex pendant au moins 1 minute avant de continuer.

2. Transférer 0,1 ml de la solution contenant 5,0 UE/ml d’endotoxine dans

0,9 ml d’eau pour réactif LAL dans un récipient approprié et poser une
étiquette indiquant 0,5 UE/ml. La solution doit être vigoureusement
mélangée au vortex pendant au moins 1 minute avant de continuer.

3. Transférer 0,1 ml de la solution contenant 0,5 UE/ml d’endotoxine dans

0,9 ml d’eau pour réactif LAL dans un récipient approprié et poser une
5
étiquette indiquant 0,05 UE/ml. Cette solution doit être vigoureusement
mélangée au vortex pendant au moins 1 minute avant de continuer.

4. Transférer 0,1 ml de la solution contenant 0,05 UE/ml d’endotoxine

dans 0,9 ml d’eau pour réactif LAL dans un récipient approprié et
poser une étiquette indiquant 0,005 UE/ml. Cette solution doit être
vigoureusement mélangée au vortex pendant au moins 1 minute avant
de continuer.

13
Réalisation du test
Consulter les manuels du lecteur-incubateur de microplaque et du logiciel
WinKQCL™ pour plus de détails sur la procédure du test Kinetic-QCL™.

1. Créer un modèle de plaque pour l’analyse à réaliser. Un modèle contient

le nom de l’analyste, le type de test, les numéros de lot des réactifs,
le nombre et la concentration en étalons d’endotoxine, le nombre des
réplicats et comment les étalons et les échantillons seront organisés
sur la microplaque.

2. Le type de test à choisir est le Kinetic-QCL. Ne pas changer les

paramètres par défaut du modèle sans qualification antérieure :

Delta t (secondes) 150

Filtre de mesure (nm) 405
Delta Dom 200
Nombre de lectures 40

3. Imprimer le modèle de plaque afin de l’utiliser comme référence pour

placer les étalons et les échantillons dans la microplaque.

4. Lancer l’analyse de la plaque en suivant les informations du logiciel

WinKQCL™.

14
5. Distribuer avec précaution 100 μl d’eau pour réactif LAL (sert de
blanc), d’étalons d’endotoxine, d’échantillons de produit, de contrôles
produit positifs (voir les pages 22 à 24 pour les instructions relatives
au contrôle produit positif), etc. dans les puits appropriés de la
microplaque.

6. Placer la plaque remplie dans le lecteur de microplaque et fermer

le couvercle du lecteur.

7. Pré-incuber la plaque pendant au moins 10 minutes à 37 °C ± 1 °C.

8. Lorsque la période de pré-incubation est presque terminée, reconstituer

le nombre nécessaire de flacons de réactif Kinetic-QCL™ à l’aide de
2,6 ml d’eau pour réactif LAL par flacon. Mélanger doucement mais
soigneusement.
Remarque : ne pas mélanger le lysat au vortex. 6

9. Regrouper les réactifs dans un réservoir à réactifs et mélanger en

balançant doucement le réservoir d’un côté vers l’autre.

10. À l’aide d’une pipette à huit canaux, distribuer 100 μl de réactif Kinetic-
QCL™ dans les puits de la microplaque en commençant par la première
colonne (A1-H1), puis continuer dans l’ordre jusqu’à la dernière colonne
utilisée. Ajouter le réactif aussi rapidement que possible.
Remarque : éviter de créer des bulles!

11. Immédiatement cliquer sur le bouton OK du logiciel WinKQCL™

pour lancer le test.
Remarque : le test Kinetic-QCL™ est effectué sans le couvercle de la
microplaque.

15
Caractéristiques de performance
Linéarité
Vérifier la linéarité de la courbe d’étalonnage se trouvant dans la
plage de concentrations utilisées pour déterminer les concentrations
d’endotoxines. Pas moins de trois étalons d’endotoxine, couvrant la plage
des concentrations voulues, et un blanc d’eau pour réactif LAL doivent
être testés, et ce au moins en triplicata, selon les paramètres de test d'un
test initial de qualifiation. Inclure d’autres étalons afin de limiter chaque
intervalle de logarithme sur la plage de la courbe d’étalonnage.

La valeur absolue du coefficient de corrélation (r) de la courbe d’étalonnage

calculée doit être ≥ 0,980.

Reproductibilité
Plusieurs résultats doivent être analysées afin d’établir une méthode de
qualité et un faible coefficient de variation. Le coefficient de variation (CV)
est égal à l’écart type des temps de réaction de « l’échantillon » divisé par
la moyenne, et est généralement exprimé en pourcentage. Le pourcentage
du CV des temps de réaction pour les copies doit être inférieur à 10 %.
Généralement, on atteint entre 3 et 4 %.

16
Calcul des concentrations en endotoxines
Tout au long du test, le lecteur de microplaque et le logiciel WinKQCL™
mesurent en continu l’absorbance à 405 nm de chaque puits de la
microplaque. En utilisant la lecture initiale d’absorbance de chaque puits
comme son propre blanc, le lecteur détermine le temps requis pour que
l’absorbance augmente de 0,200 unités d’absorbance. Ce temps est appelé
le temps de réaction. Le logiciel WinKQCL™ effectue la corrélation log/log
linéaire du temps de réaction de chaque étalon avec sa concentration en
endotoxines correspondante. Les paramètres de la courbe d’étalonnage
seront indiqués sur le rapport imprimé. Si la valeur absolue du coefficient
de corrélation (r) est ≥ 0,980, un modèle polynomial peut être utilisé
pour construire une courbe d’étalonnage qui permettra de prédire les
concentrations en endotoxines des échantillons testés. Ce modèle
polynomial d’ajustement de la courbe (POWERCURVE™) est une fonction
importante du logiciel WinKQCL™ (voir POWERCURVE™, page 20).

Régression linéaire
Les informations ci-dessous servent d’exemple sur la façon dont le logiciel
7
WinKQCL™ effectue la corrélation log/log linéaire et calcule les concentrations
d’endotoxines dans les échantillons dont la concentration est inconnue.
Il n’est pas nécessaire d’effectuer ces calculs de façon indépendante.
Pour chaque échantillon de chaque produit, le logiciel WinKQCL™ calcule la
concentration en endotoxines correspondante à partir du temps de réaction
pour cet échantillon. Le logiciel ajuste automatiquement le résultat final
du test en prenant compte de la dilution du produit.

17
Corrélation linéaire

Exemples de calcul
Temps de réac- Log de la con- Log du temps
Étalons Concentration tion moyen (s) centration de réaction
Contrôle négatif — Non réactif — —
S1 0,005 UE/ml 4351 -2,301 3,639
S2 0,05 UE/ml 2496 -1,301 3,397
S3 0,5 UE/ml 1406 -0,301 3,148
S4 5,0 UE/ml 895 0,699 2,952
S5 50,0 UE/ml 561 1,699 2,749
Échantillons
1 — 1576 — 3,198
2 — 943 — 2,975

( )
Pente = Sy r
Sx
Ordonnée à l’origin = ∑y / N – (∑x / N × pente)

r = N∑xy – (∑x)(∑y)
N(N–1)SxSy

Concentration en endotoxines = antilog [ log temps de réactionpente

moyen – ordon. origin.
]
x = log10 de la concentration en endotoxines (UE/ml).
y = log10 de la moyenne des temps de réaction.
N = nombre d’étalons utilisés.
∑x = somme des log10 des concentrations des étalons utilisés (UE/ml).
∑y = somme des log10 des temps de réaction.
∑xy = somme des log10 des concentrations des étalons fois log10 de la moyenne
des temps de réaction.
18
ETx = cart type de x = √N∑xN(N-1)
- (∑x)
2 2

ETy = cart type de y = √N∑yN(N-1)- (∑y)

2 2

Calculs (les données utilisées ne sont que des exemples) :

N=5
∑x = -1,505 = (-2,301 - 1,301 - 0,301 + 0,699 + 1,699)
∑y = 15,885 = (3,639 + 3,397 + 3,148 + 2,952 + 2,749)
∑xy = -7,006 = (-2,301 × 3,639) + (-1,301 × 3,397) + (-0,301 × 3,148) +
(0,699 × 2,952) + (1,699 × 2,749)
ETx = 1,581
ETy = 0,352

r = 5(-7,006) - (-1,505)(15,885) = -0,999

5(5 - 1)(1,581)(0,352)

Pente = 0,352 × -0,999 = -0,222 7

1,581

[
Ordonnée à l’origine = 15,885 - -1,505 × (-0,222)
5 5 ]
= 3,177 - [(-0,301) × (-0,222)] = 3,110

Exemple 1
[
Conc. endotoxines UE/ml = antilog 3,198 - 3,110
-0,222 ]
= antilog (-0,396)
= 0,402 UE/ml

Exemple 2
[
Conc. endotoxines UE/ml = antilog 2,975 - 3,110
-0,222 ]
= antilog (0,608)
= 4,056 UE/ml
19
POWERCURVE™
Si la valeur absolue du coefficient de corrélation (r) est ≥ 0,980, un modèle
polynomial peut être utilisé pour construire une courbe d’étalonnage qui
permettra de prédire les concentrations en endotoxines des échantillons
testés. Il a été déterminé que le modèle polynomial (POWERCURVE™)
améliore la précision de la prédiction des concentrations en endotoxines
sur l’ensemble de la plage des endotoxines (5-log). L’utilisation du modèle
POWERCURVE™ nécessite l’utilisation du logiciel WinKQCL™.

Lorsque le modèle polynomial POWERCURVE est utilisé, une courbe

d’étalonnage est générée à l’aide des valeurs du log10 des temps de réaction
et leurs valeurs respectives au log10de la concentration en endotoxines
correspondante pour définir une équation polynomiale. L’ordre de l’équation
polynomiale utilisé pour générer la courbe de régression est déterminé
par le nombre d’étalons d’endotoxine dans le test. L’ordre du polynôme
sera toujours un de moins que le nombre d’étalons d’endotoxine, avec un
maximum de un polynôme du quatrième ordre pour les tests comprenant
au moins cinq étalons d’endotoxine, et un minimum de un polynôme de
deuxième ordre pour les tests comprenant trois étalons.

Il est aisé de trouver les solutions à ces équations polynomiales en utilisant

le logiciel WinKQCL™ POWERCURVE™. Les informations ci-dessous sont un
exemple d’une solution à une équation polynomiale utilisant la même série
de données que l’exemple de la corrélation linéaire donné à la page 18.

20
Modèle polynomial (POWERCURVE™)
Y = A + BX + CX2 + DX3 + EX4
A = 3,08374
B = -0,20432
C = 0,02894
D = -0,00596
E = -0,00503

Les paramètres de la courbe d’étalonnage sont indiqués sur le rapport

imprimé. Le logiciel WinKQCL™ POWERCURVE™ utilise ces paramètres pour
calculer la concentration en endotoxines correspondante à partir du temps
de réaction de chaque échantillon. Le logiciel ajuste automatiquement le
résultat final du test en prenant compte de la dilution du produit.

Il est important de noter que le modèle polynomial POWERCURVE™ NE

PEUT PAS être utilisé pour les tests initiaux de qualifiation. Pour ces
derniers, il faut utiliser la régression linéaire. De plus, le modèle polynomial
POWERCURVE™ a été évalué uniquement pour les réactifs Kinetic-QCL™ et
PYROGENT™-5000 fournis par Lonza
8

21
Inhibition par le produit
L’inhibition par le produit survient lorsque des substances présentes
dans l’échantillon à analyser interfèrent avec la réaction LAL. Dans le test
Kinetic-QCL™, cette inhibition entraîne un temps de réaction plus long,
indiquant des niveaux d’endotoxines inférieurs par rapport à ce qu’ils
sont vraiment dans l’échantillon à analyser. L’absence d’inhibition par
le produit doit être déterminée pour chaque échantillon spécifique, dilué
à une dilution appropriée ou non dilué.

Pour vérifier l’absence de l’inhibition par le produit, une quantité connue

en endotoxine est ajoutée à une aliquote de l’échantillon à analyser (ou
une dilution de l’échantillon à analyser).

Il est conseillé que la surcharge en endotoxine dans l’échantillon soit à

une concentration finale de 0,5 UE/ml. Pour les échantillons qui pourraient
contenir un niveau en endotoxines > 1 UE/ml, la surcharge en endotoxine
doit se faire à une concentration finale en endotoxines de 5,0 UE/ml.

Dans un test d’inhibition / stimulation, la solution surchargée (CPP)

est testée en même temps que l’échantillon non surchargé, et leurs
concentrations respectives en endotoxines, ainsi que l’endotoxine
retrouvée dans l’échantillon surchargé sont automatiquement calculées.
L’endotoxine retrouvée doit être égale à la concentration connue de la
surcharge dans une fourchette située entre 50 et 200 %8.

22
Une aliquote surchargée de l’échantillon à analyser (ou de la dilution) peut
être préparée d’une des façons suivantes :

Méthode utilisant un tube

Transférer 50 μl de la solution à 50,0 UE/ml dans 4,95 ml d’échantillon
à analyser (ou dilution). Cette solution contient une concentration
en endotoxines de 0,5 UE/ml dans l’échantillon à analyser (ou dilution).
Avant utilisation, cet échantillon doit être vigoureusement mélangé au
vortex pendant une minute.

Transférer 100 μl de cette solution dans une plaque de 96 puits, comme

indiqué par le modèle du test.

Méthode 1 utilisant une plaque

Transférer 10 μl de la solution à 5,0 UE/ml dans chacun des puits CPP dans
la plaque de 96 puits, comme indiqué par le modèle du test. Ajouter à ces
puits 0,1 ml d’échantillon à analyser (ou dilution). Chaque puits contient
maintenant une solution à 0,5 UE/ml. Mélanger doucement en tapotant
le côté de la plaque.

23
Méthode 2 utilisant une plaque
Placer 0,1 ml d’échantillon à analyser (ou dilution) dans les puits CPP dans
la plaque de 96 puits, comme indiqué par le modèle du test. Ajouter à ces
puits 10 μl de la solution à 5,0 UE/ml. Chaque puits contient maintenant une
solution à 0,5 UE/ml. Mélanger doucement en tapotant le côté de la plaque.

S’il s’avère que l’échantillon à analyser (ou dilution) inhibe la réaction

Kinetic-QCL™, une dilution supplémentaire de l’échantillon peut être
nécessaire jusqu’à ce que l’inhibition soit levée.

Exemple : détermination d’une dilution non inhibitrice

Dilution de l'échantillon Endotoxine retrouvée
1/10 0,125 inhibitrice
1/20 0,212 inhibitrice
1/40 0,550 non inhibitrice

Pour commencer, on peut procéder à un dépistage de l’inhibition par le

produit en testant les échantillons à analyser dilués au dixième. Une fois
la dilution non inhibitrice approximative déterminée, la dilution exacte peut
être déterminée en testant les échantillons à analyser dilués de moitié
autour de cette dilution.

24
Limites et indications
Le degré d’inhibition ou de stimulation dépend de la concentration
du produit. Si plusieurs concentrations du même produit doivent être
testées, il est nécessaire d’établir les caractéristiques de performance
pour chacune de ces concentrations.

On pourra trouver des schémas d’inhibition ou de stimulation différents

de ceux observés avec la méthode traditionnelle LAL de gélification.

Si l’ajustement du pH de l’échantillon est nécessaire pour qu’il se situe entre

6,0 et 8,0, utiliser de l’hydroxyde de sodium ou de l’acide chlorhydrique
exempt d’endotoxine pour lever l’inhibition.

Échantillons colorés
Puisque la lecture initiale de l’absorbance de chaque puits est utilisée
comme son propre blanc, les échantillons qui possèdent une coloration
significative de manière intrinsèque ne présentent pas de problème
particulier. Si la couleur de fond est ≥ 1,5 unités d’absorbance, l’échantillon
doit être dilué et testé de nouveau.

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Courbe d’étalonnage archivée
Le logiciel WinKQCL™ peut être utilisé avec une courbe d’étalonnage
archivée. Si les numéros de lot courants du réactif Kinetic-QCL™, de l’eau
pour réactif LAL et de l’endotoxine, ainsi que les paramètres du lecteur
de microplaque correspondent à ceux utilisés pour générer la courbe
d’étalonnage archivée valide, la courbe d’étalonnage archivée peut être
utilisée au lieu de placer de nouveaux étalons d’endotoxine dans la plaque
à 96 puits.

Si une courbe d’étalonnage archivée est utilisée, tester un seul étalon

d’endotoxine de contrôle contenant une concentration en endotoxine située
au milieu de la courbe, en se basant sur le logarithme, entre la concentration
en endotoxine la plus élevée et la plus faible des étalons d’endotoxine de
la courbe d’étalonnage archivée. La concentration en endotoxine prévue
doit se trouver dans ± 25 % de sa valeur connue.

Par exemple, dans un test ayant une courbe d’étalonnage variant de 50,0
à 0,005 UE/ml, tester un étalon de contrôle égal à 0,5 UE/ml.
log 50,0 = 1,6990
log 0,005 = -2,3010
log moyen = -0,3010
antilog -0,3010 = 0,5

Dans un test ayant une courbe d’étalonnage variant de 1,0 à 0,01 UE/ml,
tester un étalon de contrôle égal à 0,1 UE/ml.
log 1,0 = 0,0000
log 0,01 = -2,0000
log moyen = -1,0000
antilog -1,0000 = 0,1

26
Corrélation avec les autres méthodes
Aux États-Unis, l’utilisation officielle du test LAL est règlementée par la
FDA. La puissance des différentes préparations d’endotoxines varie pour
la méthode de gélification traditionnelle et la méthode chromogénique.
L’étalon d’endotoxine fourni dans ce kit a été comparé à l’endotoxine
étalon de référence (EER) de la pharmacopée américaine en utilisant le
test Kinetic-QCL™ ; la puissance est de 50,0 UE/ml une fois reconstituée
à l’aide du volume précisé sur le certificat d’analyse spécifique du lot.
La courbe d’étalonnage établie par des dilutions de cet étalon produira
une plage de 0,005 à 50,0 unités d’endotoxine/ml, selon le EER. Il faut
cependant se rappeler que le test traditionnel par gélification est étalonné
par une dilution de moitié, et donc les variations paraitront passablement
importantes par rapport à celles du test Kinetic-QCL™ où l’étalonnage est
continu et les variations réduites au minimum.

Une note pour nos clients internationaux

Les organismes responsables de la réglementation dans d’autres pays ont
peut-être d’autres normes d’exécution auxquelles les utilisateurs doivent
satisfaire pour respecter leur propre législation.

10

27
Bibliographie
1. Bang, F.B. A bacterial disease of Limulus polyphemus. Bull. Johns Hopkins Hosp.
98:325 (1956).

2. Levin, J. and F.B. Bang. The role of endotoxin in the extracellular coagulation
of Limulus blood. Bull. Johns Hopkins Hosp. 115:265 (1964).

3. Levin, J. and F.B. Bang. A description of cellular coagulation in the Limulus.

Bull Johns Hopkins Hosp. 115:337 (1964).

4. Levin, J. and F.B. Bang. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics
of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19:186 (1968).

5. Solum, N.O. Some characteristics of the clottable protein of Limulus polyphemus

blood cells. Thromb. Diath. Haemorrh. 23:170 (1970).

6. Solum, N.O. The coagulogen of Limulus polyphemus hemocytes. A comparison of

the clotted and non-clotted forms of the molecule. Thromb. Res. 2:55 (1973).

7. Young, N.S., J. Levin, and R.A. Prendergast. An invertebrate coagulation system

activated by endotoxin: Evidence for enzymatic mechanism. J. Clin. Invest.
51:1790 (1972).

8. United States Pharmacopeial Convention. General Chapter <85>

Bacterial Endotoxins Test. United States Pharmacopeia (USP).

9. European Directorate for the Quality of Medicines. Chapter 2.6.14

Bacterial Endotoxins Test. European Pharmacopoeia (EP).

10. Ministry of Health, Labour, and Welfare, General Chapter 4.0.1

Bacterial Endotoxins Test. Japanese Pharmacopoeia (JP).

11. U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,
Guidance for Industry Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers
(June 2012).

28
Remarques

11

29
[Link]/pharmabiotech
Certificat d’analyse : [Link]/coa

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Amérique du Nord
Service client : +1 800 638 8174 (sans frais)
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