Module : Méthodologie scientifiques et techniques d’étude du vivant
Niveau : 2 année licence écologie et BTV.
Chapitre 2 :
II- METHODES D'ETUDE DE LA COMPOSITION BIOCHIMIQUE DES
CELLULES
Ces méthodes visent à étudier la nature et la localisation des composants biochimiques de
la cellule.
1. Les matériels cellulaires
1.1 Cellules entière ou des coupes de cellules
Pour les coupes cellulaires ou bien l’étude de la cellule entière, il faut voir le chapitre 1
partie 2 (préparation des échantillons pour observation microscopique).
1.2 Broyats cellulaires= Homogénats cellulaires
* broyat cellulaire = homogénat cellulaire c’est de faire une préparation homogène d'un
corps à étudier, il peut être une suspension de cellules, ou bien des fragments de tissu.
*Homogénat cellulaire = organites en suspension + débris cellulaires (fragments
d'ultrastructures) + constituants biochimiques en solution.
*Afin de préparer un homogénat cellulaire, différentes techniques sont utilisables :
Ces techniques peuvent être combinées pour une meilleure efficacité.
1- Mortier + abrasif (( عملية سحق النسيج:
Cette méthode s'adresse à des fragments de tissus.
Les morceaux de tissu sont très souvent congelés immédiatement par immersion dans de
l'azote liquide (- 196°C) ou de la carboglace (CO2 liquide, - 80 °C) afin de les durcir.
L'abrasif utilisé est généralement le sable de Fontainebleau de granulométrie régulière et très
fine.
2- Mixeur (photo ci-dessous) : (Figure 1)
Exemple : Le disperseur ultra-Turrax
C'est un appareil homogénéisateur.
Figure 1 : Le disperseur ultra-Turrax
3- Broyeur Potter-Elvehjem (Figure 2) Il est constitué d'un tube de verre et d'un piston en
plastique tels que l'espace annulaire entre le piston et la paroi du tube ne soit que de quelques
dixièmes de mm. Le piston tourne à 1000 ou 2000 tours/min et en même temps que le piston
tourne, on fait aller et venir le tube verticalement.
Les cellules qui passent entre le piston et la paroi du tube sont alors soumises à des forces de
cisaillement qui amènent leur éclatement.
Figure 2 : Broyeur Potter-Elvehjem
4- Le choc osmotique :
On met les cellules dans un milieu hypotonique. Le milieu intracellulaire étant plus
concentré qu'à l'extérieur, de cette manière l'eau entre à l'intérieur des cellules sous l'effet de
l'osmose. Le volume cellulaire augmentant, la membrane plasmique n'y résiste pas et la
cellule éclate.
Si les cellules sont délimitées par une paroi, celle-ci peut protéger les cellules de la lyse.
Pour éliminer la paroi, on doit placer les cellules dans une solution isotonique tamponnée
contenant des enzymes capables d'hydrolyser les constituants de la paroi.
ex : cellulases et pectinases pour les cellules végétales.
ex : lysozyme pour les cellules bactériennes.
ex : chitinase pour levures et moisissures.
5- Vibrateur ultrasonique :
Cet appareil émet des ultrasons dont on peut régler la fréquence et l'intensité selon le type des
cellules étudiés.
On travaille entre 0-4°C, afin d’arrêter tout les activistes enzymatique. En effet la
composition cellulaire n'est pas entièrement conservée. La préparation d'homogénats
cellulaires est donc réalisée en chambre froide ou dans un bain de glace pilée.
1.3. Fractions cellulaires
Si l'on veut étudier la composition biochimique des organites cellulaires, il faut les isoler
séparément. La séparation des organites passe par l'obtention de fractions cellulaires. On parle
de techniques de fractionnement cellulaire = isolement d'organites cellulaires.
1.3.1 Etapes
2.1. Prélèvement d’une suspension cellulaire ou tissu.
2.2. Homogénéisation : c’est de faire libéré le contenue cellulaire, par la destruction de la
membrane plasmique. Quatre procédés sont fréquemment utilisés :
a. fractionnement par des ultrasons à haute fréquence
b. utilisation d’un détergent doux pour faire des trous dans la membrane plasmique
c. forcer les cellules à passer à travers un petit trou en utilisant une forte pression
d. saisir les cellules, entre un broyeur tournant étroitement adapté et les parois épaisses d’un
récipient en verre.
2.3. Récupération de l’homogénat cellulaire : qui contient les organites cellulaires, les
grosses et les petites molécules (enzymes, ribosomes et métabolites).
* Principe de la séparation des organites cellulaires :
Le fractionnement cellulaire est basé sur la différence de densité des organites. À partir d'un
homogénat cellulaire on peut constater que la vitesse de sédimentation des organites, et est
différente car leur densité diffère :
- les plus denses sédimentent les premiers
- les moins denses sédimentent par la suite.
1.4. L'ultracentrifugation différentielle :
C’est la séparation des composants de l’homogénat cellulaire en fonction de la taille et de
la densité de ses composants. Cette technique est basée sur la centrifugation répétée à des
vitesses progressivement croissantes qui peuvent fractionner les homogénats cellulaires en
leurs composants initiales (organites, particules et molécules) (figure 3).
Les centrifugations doivent être réalisés en milieu refroidi et on doit donc disposer d'une ;
ultracentrifugeuse réfrigérée.
Pratiquement la technique consiste à soumettre un homogénat de tissu à des centrifugations
successives de plus en plus rapides. La vitesse et les temps de centrifugation sont à adapter en
fonction de la nature du matériel biologique étudié.
Figure 3 : Les étapes de l’ultracentrifugation différentielle.
1.5 L'ultracentrifugation sur gradient de densité :
La centrifugation en gradient de densité permet une séparation complète des organites. Pour
cela, on doit mettre dans le tube des solutions de saccharose dont la concentration molaire
augmente du haut vers le bas (gradient), puis on étale en une fine couche la fraction à purifier
sur la dernière solution de saccharose puis on centrifuge. Selon leur densité, les organites
migrent vers les zones de saccharose de densité identique (les zones d’où la densité de
saccharose et très proche de celle d’organite). Finalement les organites isolés sont
récupérés. (Figure 4)
Figure 4 : L'ultracentrifugation sur gradient de densité.
2. Les méthodes d'analyse et de dosage biochimiques
2.1 Chromatographie
La chromatographie (du grec ancien χρῶμα / khrôma, « couleur » et γράφειν / graphein, «
écrire ») est une méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances
présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse).. Cette
technique est basée sur le taux de solubilité différentielle des composés dans des solvants ou
des mélanges de solvants variés. Chaque molécule chimique se déplace à une vitesse propre
qui dépendant de ses caractéristiques. Il existe différents types de chromatographies suivant
la méthode de séparation utilisée: d’adsorption, de partage, d’échange d’ions, d'exclusion.
Abréviations des 3 grandes familles de chromatographie
CPG : chromatographie en phase gazeuse
HPLC : chromatographie liquide haute performance
CCM : chromatographie sur couche mince
Cette méthode d'analyse permet l'identification et le dosage de composés dans un mélange.
Elle peut-être couplée à un spectromètre de masse pour l'identification de composés inconnus.
Pour l'exploiter pleinement il est important de connaitre les différentes grandeurs de rétention
et d'utiliser des colonnes avec une bonne efficacité.
La chromatographie permet également d'effectuer des dosages avec une grande précision. Les
principales méthodes de dosage sont la normalisation interne, la méthode des ajouts dosés et
l'étalonnage interne. L'étalonnage externe peut également être effectué sous certaines
conditions.
La chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple, est une technique physique de
séparation d’un mélange chimique. Pour cela on utilise un éluant: solvant qui monte par
capillarité le long du support entraînant ainsi les différentes espèces chimiques.
Dans certains cas, le partage se fait plus facilement par chromatographie de partage
bidimensionnelle : une première chromatographie dans un premier système de solvants est
suivie par une deuxième migration dans un système de solvants différent effectuée sur la
plaque préalablement séchée et tournée de 90°. Les constituants du mélange sont répartis sur
toute la surface de la plaque et donc mieux séparés qu'après une migration
monodimensionnelle.
*L’électrophorèse : elle est basée sur les différences de charge électrique. Elles permettent
aisément de séparer les sucres simples, les acides aminés, les acides organiques et les acides
gras, les nucléotides. C’est aussi une méthode intéressante pour séparer, en présence d'un
champ électrique, les centaines ou les milliers d'espèces moléculaires de protéines et d'acides
nucléiques constituant les mélanges naturellement rencontrés dans les cellules.
*Electrophorèse sur papier
Dans l'électrophorèse sur papier, l'échantillon est déposé en un point au milieu d'une bande
de papier filtre ou d'acétate de cellulose imbibée de solution tampon. Les extrémités de la
bande plongent dans deux réservoirs de tampon séparés dans lesquels sont placées les
électrodes. Quand on fait passer un courant continu, les ions de l'échantillon migrent vers les
électrodes de signes opposés, à des vitesses différentes pour former, éventuellement, des
bandes discrètes. La vitesse de migration d'un ion est influencée, dans une certaine mesure,
par ses interactions avec la matrice support, mais elle est essentiellement fonction de sa
charge. Lorsque l'électrphorégramme est achevé (en général après quelques), la bande est
séchée et les constituants de l'échantillon sont localisés grâce aux mêmes techniques que
celles utilisées dans la chromatographie sur papier.
En conclusion
Les macromolécules cellulaires sont solubilisées en désorganisant les cellules par différents
traitements chimiques ou mécaniques tels que les broyeurs. Après lyse des cellules, une
purification partielle par centrifugation différentielles permet d'éliminer les débris
cellulaires ou d'isoler un composant cellulaire intéressant. Une fois sorties du contexte
protecteur de la cellule, les protéines et les autres molécules de la cellule doivent être traitées
pour ne pas être endommagées sous l'influence de pH ou de températures extrêmes, ou par
dégradation enzymatique ou chimique, ou par manipulation grossière. L'état de pureté d'une
substance en cours de purification doit être contrôle tout au long de la purification par un
dosage spécifique
La chromatographie par échange d'ions utilise des supports tels que la cellulose ou des gels
de polyacrylamide réticulés. Les séparations sont dues aux interactions électrostatiques
différentes entre les groupes chargés du support échangeur d'ions et ceux des substances en
coins de séparation. Dans la chromatographie sur papier, les composés sont séparés par
partage entre une phase mobile d'un solvant non-polaire et une phase stationnaire aqueuse qui
imprègne les tissus du papier.
Elles sont appliquées soit à des homogénats, soit à des fractions cellulaires à partir desquels
on obtiendra des extraits bruts = constituants biochimiques en solution. Elles consistent à
rechercher la nature et la concentration des constituants biochimiques : glucides, lipides,
protéines et acides nucléiques. Elles concernent les techniques d'extraction, de purification, de
caractérisation et de dosage.
Avec l'électrophorèse, les molécules chargées sont séparées en fonction de leurs vitesses de
déplacement dans un champ électrique sur un support solide comme le papier, l'acétate de
cellulose, des gels de polyacrylamides réticulés ou l'agarose.
2.2 Les méthodes cytochimiques
Ces méthodes permettent de localiser les composants biochimiques à l'intérieur des cellules.
Ces méthodes nécessitent des coups. On peut citer quelques exemples
* ex : localisation de polysaccharides : réaction à l'APS
APS = Acide Périodique - réactif de Schiff C'est la méthode la plus employée pour localiser
les polysaccharides dans la cellule. Elle s’applique sur des coupes tissulaires en deux temps :
1) oxydation des polysaccharides par l'acide périodique IO4H. Il y a alors formation de
fonctions aldéhydes à partir de certaines fonctions alcool (= groupement hydroxyle) des oses
qui constituent les polyholosides. La coupe est trempée dans un bain d'AP.
2) mise en évidence des fonctions aldéhydes apparues par le réactif de Schiff. La coupe est
immergée dans un bain de réactif de Schiff. On obtient une coloration rouge dans les régions
cellulaires riches en polysaccharides. La coupe est ensuite observée au microscope
photonique par transmission.
3) Pour déterminer la nature des polysaccharides détectés dans les différentes régions de la
coupe , on effectue au préalable une digestion enzymatique. La coupe est trempée dans une
solution tamponnée d'une enzyme donnée (ex. la glycogénase). Puis on réalise la réaction
APS. On compare la première lame et de la seconde, et on recherche les zones dans lesquelles
la coloration rouge a disparu. On en déduit alors la localisation du polysaccharide recherché
(ex glycogène).
* ex : localisation d'acides nucléiques : test de Brachet et réaction de Feulgen Cette
technique est destinée afin de localiser les acides nucléiques dans la cellule. Elle est toujours
réalisée à partir de coupes.
Ce test combine : l une méthode de coloration au mélange [vert de méthyle + pyronine]
* vert de méthyle ----> ADN vert
* pyronine ----> ARN rouge
* l'emploi d'enzymes capables d'hydrolyser de façon spécifique soit l'ADN soit l'ARN, cas
ADNase et RNase. Le traitement par les nucléases est nécessaire pour vérifier la spécificité de
la coloration, car la coloration au vert de méthyle-pyronine n'est pas très spécifique.
Coupe A sert de témoin et n'est pas traitée par les nucléases
Coupe B est traitée par la DNase
Coupe C est traitée par la RNase.
Puis ces trois coupes sont colorées par le mélange vert de méthyle-pyronine et sont observées
au microscope photonique par transmission.
* noyau contient ADN (chromatine) et ARN (nucléole bien visible, mais transcription partout
aussi)
*cytoplasme contient ARN pas d'ADN (l'ADN mitochondrial et chloroplastique n'est pas
visible à l'intérieur de ces organites car sont rarement observables en microscopie
photonique).
2.3 Immuno cytologie
* Localisation d'antigènes (Ag) à partir d'anticorps (Ac) :
Utilisation des anticorps ce sont des méthodes très générales car à partir du moment où on a
l'Ac on peut localiser n'importe quel Ag c'est à dire n'importe quelle molécule. Ces méthodes
reposent donc sur la propriété de reconnaissance spécifique des anticorps. On travaille
toujours à partir de coupes tissulaires. La méthode se déroule en deux temps :
- 1) formation du complexe Ag-Ac = complexe immun : la coupe est trempée dans un bain
contenant l'anticorps en solution
- 2) révélation de la présence des complexes immuns : utilisation d'outils immunologiques
marqués, par exemple anti-anticorps = anti-immunoglobuline = anti-Ig = antiglobuline
marquée. Il existe différentes façons de marquer les "anticorps révélateurs" :
* par des enzymes capables d'utiliser un substrat chromogène c’est t’a dire. Capable de
donner un produit coloré détectable ----> observation en microscopie photonique par
transmission
* par des fluorochromes ----> observation au microscope à fluorescence
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1- CHELLI A (2013). Cours de Biologie Cellulaire .UNIV- ALGER .16PP .
2- TRIQUI Z A (2016). Cours de biologie cellulaire .UNIV EL REBAT.105PP.
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4- AG BELARBI A(2020). Cour de Cytologie de la première année de
Médecine .FACULTE DE MEDCINE.UNIV ORAN 1.7PP.
5- MARC M(2002). Biologie Cellulaire. Abrégés. 9ème édition, Masson.
6- CALLEN. J. DUNOD(2005) . Biologie cellulaire, Des molécules aux organismes,
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