Vecteurs de clonage
I) Définition:
Petites molécules d’ADN possédant leur propre système de réplication (origine de
replication). Ils servent de véhicule pour le clonage génique.
Vecteur natif = vecteur sans insert. Vecteur recombiné = vecteur + insert
II) Caractéristiques des vecteurs:
1. réplication épisomale (facteur sexuel F): réplication indépendante de l’ADN de la cellule
hôte.
2. petite taille: pour permettre l’insertion de grand fragment d’ADN étranger
(vecteur recombinant qui doit être stable)
3. présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.
4. présence de sites de restriction uniques localisés dans les gènes de sélection: permet de
sélectionner les cellules hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant.
5. stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel que soit le nombre de
division
III) Les 2 catégories de vecteurs
Vecteur de clonage
Destiné à isoler physiquement un fragment d’ADN et à amplifier le nombre de copies.
Possède un polylinker (appelé aussi multiple cloning site CMS)
Vecteur d’expression
maintient et expression d’un insert
promoteur constitutif ou inductible (IPTG, Arabinose) compatible avec l’hôte
terminateur de la transcription
La séquence SD=Shine Dalgarno (RBS chez les bactéries)
IV) Différents vecteurs de clonage:
1. Les plasmides:
C’est une petite molécule d’ADN circulaire possédant son propre système de réplication. Il
est d’origine bactérienne. On peut obtenir un plasmide navette qui peut être utilisé chez la
levure Saccharomyces cerevisiae, en ajoutant une origine de replication 2μ pour la levure, et
un facteur de sélection comme l’auxotrophie pour His.
Caractéristiques des plasmides:
Taille max de l’insert = 20 Kb
Peuvent être présent en plusieurs centaines de copies au sein d’une même cellule
bactérienne (cela dépend de la souche bactérienne).
Présence de la séquence ORI (qui permet la réplication autonome)
Petite taille: 2 à 5 kb (le chromosome d’E. coli fait 4700kb)
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Gènes portés: gènes de résistance aux antibiotiques (gènes de sélection), gènes codant
pour des toxines et des antibiotiques et des gènes codant pour la dégradation de
certains composés aromatiques.
contient des sites de restriction uniques à l’extérieur et à l’intérieur des gènes de
sélection.
Schéma d'un plasmide codant la
résistance à un antibiotique donné.
1 et 2. Gène(s) codant la (les)
résistance(s).
3. Origine de réplication.
2. Les vecteurs phagiques:
Taille max de l’insert = 25 Kb (correspond au remplacement de la région b2 non
essentielle)
Entrée par transduction ou infection, spontanées des cellules bactériennes.
Extrémités Cos permettant sa recircularisation à l’intérieur de l’hôte.
permet de construire une banque d’ADN génomique.
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Carte génétique du bactériophage
Bactériophage utilisé comme vecteur d'insertion.
3. Cosmides
C’est un hybride entre les plasmides et le bactériophage .
Taille max de l’insert = 50Kb
Origine de réplication
Un polylinker
Un gène conférant une résistance à un antibiotique
les extrémités cos du phage , et donc l’aptitude à être
recircularisé après l’entrée dans l’hôte.
permet la création de banque génomique
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4. BAC (Bacterial Artificiel Chromosome)
Taille max de l’insert = 300 Kb
ADN circulaire
Origine de réplication issue de l’épisome sexuel F de E. coli.
Faible nombre de copies
Marqueur de sélection
Entrée par electroporation
peu d’évènement de recombinaison avec l’ADNg de l’hôte.
5. YAK (Yeast Artificial Chromosome)
Taille max de l’insert = 1500 Kb
un ou plusieurs marqueurs de sélection
ADN linéaire
Centromère (CEN) et télomères.
Origine de replication pour la levure: Autonomous Replication Site (ARS)
Polylinker (=MCS)
Entrée par transformation
très instable car forte fréquence de recombinaison homologue avec l’ADNg
