Chapitre 4
Le milieu de culture et les
conditions de culture
1/ Principe de la culture cellulaire
1.1. Définition
- C’est une technique de laboratoire pour faire
vivre des cellules in vitro
- C’est le prélèvement de cellules, d'un animal ou
d'une plante et leur placement ultérieur dans un
environnement artificiel conduisant à leur croissance
- Le but est de multiplier des cellules ou de les
maintenir vivantes pour les utiliser
1.2. Intérêts
- Matériel en grande quantité
- Conservation des caractéristiques du tissu initial
- Homogénéité des cellules
- Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués
- Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire
- Pour la production de:
• Vaccins
• Protéines thérapeutiques (anticorps, agents
immunologiques, Hormones)
• Tissus
• Vecteurs viraux
• Cellules souches
2/ Composition des milieux de culture
2.1. Le sérum
• Essentiellement sérum de veau fœtal (SVF)
• L’addition de sérum est nécessaire et suffisante à la
croissance des cellules in vitro
2.2. Les milieux de culture synthétiques
Composants conservés et pesés en atmosphère contrôlée
Qualité primordiale
- Filtration
- Désionisation
- Distillation
- Stockage A -80°C dans des récipients en inox
Refroidissement à 20°C au moment de l’utilisation
Mélange des constituants
Dissous séparément et mélangés dans l’ordre spécifié
Conformité aux normes du pH et de l’osmolarité
Taille des lots
Varie de 3 à 2000 L
Filtration stérilisante et mise en bouteille
Filtres de 0,15 μm, sous hottes à flux laminaire
Les milieux en poudre
Secteur de production où humidité et température
sont contrôlés
Analyses physico-chimiques
Osmolarité et pH
Tests microbiologiques
En milieux liquides pendant 2 semaines
Tests de cytotoxicité et de croissance
Cellules adhérentes et en suspension
2.3. Les solutions salines équilibrées
Exemples : PBS, HEPES, solutions d’enzymes…
Constituants :
-Enzymes
Trypsine: décollement des cellules adhérentes
-Aminoacides et vitamines
Essentiels et non-essentiels
- Tampons
Fluctuations du pH dues au métabolisme
HEPES le plus utilisé
2.4. Les solutions antibiotiques et antimycosiques
Rattrapage délicat des cultures contaminées
2.5. Facteurs de croissance et d’attachement
Peuvent être nécessaires pour certaines lignées
Exemples
Hormones, éléments-traces, vitamines
Insuline, transferrine, sélénium: réduction de la
concentration en SVF
Cytokines, lymphokines
Fibronectine, vitronectine
3/ Conditions de culture
3.1. Matériel
Il existe 2 sortes de flacons de culture :
- Boite de Pétri : Ce sont des boites avec des couvercles qui
s'ouvrent et permettent des manipulations rapides mais ce
n'est pas ce qu'il y a de plus propre et stérile. On s'en sert
quand de faire des manipulations rapides sur beaucoup
d'échantillons.
- Flacons : L'intérêt est qu'il y a un bouchon avec au bout un
filtre qui permet de laisser entrer l'O2 et CO2 dans les
cellules mais ne laisse pas passer les bactéries et du coup on
peut laisser pousser les cellules tranquillement sans être
contaminées par les fluides qui vont être sous la hotte.
3.2. Manipulations en milieu stérile
On travaille toujours sous des hottes à flux laminaire, l'intérêt est
que c'est de l'air stérile qui circule donc déjà ça permet de
nettoyer les bactéries, virus en suspension... pour ne pas
contaminer les cellules mais aussi de protéger l'utilisateur.
3.3. Etuve
Enceinte de culture a 37°C
Milieu humide pour pas que le milieu qui est dans la
boite s'évapore et que les cellule se déshydrate (5cm
d'eau dans le fond de l‘étuve et pour éviter une source
de contamination la paroi est en cuivre = antiseptique
L’air est enrichi de 5% de CO2 qui permet le maintien
du pH des cellules à 7,2 sinon en moins de 24h les
cellules meurt
En résumé, les conditions de culture :
