RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN FACULTÉ DES SCIENCES

REPUBLIC OF CAMEROON FACULTY OF SCIENCE

Peace – Work - Fatherland

UNIVERSITÉ DE DSCHANG Département de Biochimie

UNIVERSITY OF DSCHANG
Scholae Thesaurus DschangensisIbiCordum Department
BP 96, Dschang (Cameroun) – Tél./Fax (237) 233 45 13 81 of Biochemistry
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Expose de BCH 327

THEME : DOSAGE EN CHROMATOGRAPHIE  : EXPLORATION DES

DIFFERENTES METHODES UTILISEES EN ANALYSE
QUANTITATIVE HPLC ET CPG

- OPTION CLINIQUE MASTER 1

- GROUPE 4

LISTES DES MEMBRES DU GROUPE

N°- NOMS ET PRENOMS MATRICULES

1 ALOMO KENDJOUA MARTIN LEA CM-UDS-17SCI1750

2 GUIDDAM DIGUIM -
3 YOUDA TEVOU AURIANE CM-UDS-17SCI0601
4 PAULIN HLAM-NGOLO -
5 NOPELBA OUAINBE -
6 GWET DEBORAH NADEGE CM-UDS-17SCI0933
7 DJOURGONBE LABA

Supervisé par Pr KUATE Dieudonné

Expose BCH327

Année 2020-2021

TABLE DES MATIÈ RES

INTRODUCTION..........................................................................................................2
I. Principe de la chromatographie en phase gazeuse et de la
chromatographie haute performance................................................................3
I.1 Principe de la CPG........................................................................................................................................... 3
I.2 principe de la HPLC........................................................................................................................................ 3

II. Dosage en chromatographie : Exploration des différentes

méthodes quantitatifs (méthode comparative).............................................4
II.1 Méthode par étalonnage externe........................................................................................................... 5
II.2 Etalonnage interne......................................................................................................................................... 7
II.3 Méthodes des ajouts dosés....................................................................................................................... 9

III. Etude de cas n°1 (dosage HPLC Et CPG après traitement

préliminaire)............................................................................................................11
III.1 Dosage d'adrénaline plasmatique..................................................................................................... 11
III .2 Présentation d'un dosage éthanol par CPG................................................................................ 14

CONCLUSION..............................................................................................................18

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Expose BCH327

INTRODUCTION

Le terme chromatographie désigne un ensemble de technique basées sur la

distribution différentielles des constituants d’un mélange entre une phase stationnaire
et une phase mobile ces deux forces exerçant respectivement une force de rétention et
une force d’entrainement sur chaque constituants. Un des aspects fondamentaux de la
chromatographie est le dosage des molécules biologiques à partie des techniques
chromatographique comme la HPLC et la CPG. En fonction des paramétrés maitrises par
l’operateur, cette technique se décline en trois sous-ensembles : l’étalonnage externe,
l’étalonnage interne et la méthode des ajouts doses. Afin de rendre cette présentation
plus pratique nous allons présenter dans un premier temps les différents méthodes de
quantification utilisées en chromatographie HPLC et CPG, dans un deuxième temps des
exemples d’études de cas utilisant ces différentes méthodes de quantification
précisément le dosage de l’éthanol dans le vin en CPG et celui de l’adrénaline dans le
sang en HPLC.

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Expose BCH327

I. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE ET DE

LA CHROMATOGRAPHIE HAUTE PERFORMANCE

I.1 PRINCIPE DE LA CPG

La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation, d'analyse et
de dosage des substances volatile. Le principe est le suivant : l'échantillon à étudier
circule dans une colonne, entraîné par un gaz vecteur inerte (gaz vecteur utilisé pour
cette manipulation est l'hélium). Le mélange à analyser est en contact permanent avec
une phase stationnaire qui se trouve sur la paroi interne de la colonne (colonne
capillaire) ou remplit (colonne remplit). Par suite de phénomènes d'adsorption ou de
dissolution sélective, les diverses constitutions du mélange sont plus ou moins retenu
par la phase stationnaire, si bien que chaque constituant évolue dans la colonne avec
une vitesse différente. A la sortie de la colonne, on observe donc l'apparition du mélange
non pas simultanément, mais avec un décalage caractéristique chacun de ces
constituants.

Première étape: L'injection du mélange (1 microlitre) à l'aide d'une seringue

Deuxième étape: Le mélange est entraîné dans la colonne par le gaz vecteur
Troisième étape: Les molécules ont une certaine affinité pour la phase stationnaire de
la colonne. Le déplacement de chaque molécule est donc une succession de phases
d'adsorption (la molécule est liée à la surface) et de séparation (la molécule est à
nouveau entraînée par le gaz vecteur) se déplacent globalement plus vite
Quatrième étape: Les molécules arrivent donc par paquet en bout de colonne au d'un
temps t'appelé temps de rétention. Le temps de rétention dépend de conditions
chromatographie (température, pression, débit de gaz vecteur qui peut donner une
réponse qualitative (identification du composé) ou quantitative (dosage).

I.2 PRINCIPE DE LA HPLC

L’échantillon à analyser est poussée par un liquide (phase mobile) dans une colonne
remplie d’une phase stationnaire de fine granulométrie(les grains sont de très petite
taille). Le débit d’écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraine une
augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire
pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la
phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet, pour un

3
Expose BCH327

même volume de la phase stationnaire la surface d’échange augmente si les grains qui la
composent sont de diamètre plus petit. Les pics obtenus sont plus étroits donc la
résolution est améliorée, le seuil de détection est également plus bas. La combinaison de
ces attributs – rapidité et résolution élevée – conduit à l’appellation « haute performance
».

II. DOSAGE EN CHROMATOGRAPHIE  : EXPLORATION DES

DIFFÉRENTES MÉTHODES QUANTITATIFS (MÉTHODE
COMPARATIVE )

Parallèlement à ces méthodes de quantification que l’on peut qualifier de

relativement absolues, il existe un autre concept de quantification qui consiste à
comparer une valeur induite (bien souvent un signal électrique à une échelle externe. En
fonction des paramètres maîtrisés par l’opérateur, cette technique se décline en trois
sous-ensembles :

- L’étalonnage externe
- L’étalonnage interne
- La méthode des ajouts dosés

Le premier avantage de ces techniques comparatives est de s’affranchir d’un certain

nombre de paramètres de réglage des appareillages. En effet, dans tous les cas, on va
mesurer un signal électrique ou un signal optique d’amplitude faible (des µ volts, des µ
intensités de faisceau lumineux…) : Il sera donc nécessaire, dans un premier temps
d’amplifier ce signal et, qui dit amplification, dit gain, dit réglage d’un gain optimum. En
fonction de paramètres physiques (vétusté des sources lumineuses, encrassement des
sources de détection…) le gain optimum peut conduire à des réglages différents. Par les
techniques comparatives, on s’affranchit de ces paramètres que l‘on peut qualifier
d’internes à la machine. On fera toutefois attention de ne pas les modifier en cours
d’analyse.

Hormis ces paramètres liés aux réglages de la machine’, un certain nombre de

paramètres peuvent être liés à la loi de réponse de la technique. Ainsi, en transmission
optique (absorption moléculaire, absorption atomique, émission…), il existe une relation
simple entre l’intensité du rayonnement incident et celle du rayonnement transmis, du
type

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Expose BCH327

d= log10 I0 / It = k l C

Expression dans laquelle Io et It représentent les intensités des rayonnements

incidents et transmis, la longueur du trajet optique, C la concentration en espèce
analysée et k un facteur de proportionnalité lié à la technique utilisée et propre au soluté
analysé.

Dans certains cas, l’opérateur maîtrise la valeur et la constance de l (cas de l’absorption

moléculaire en cuves, de l’absorption atomique…Dans ce cas, le produit k*l reste
constant, et il existe une relation linéaire simple entre le signal et la concentration.
L’opérateur pourra alors utiliser une technique d’étalonnage externe.

Dans d’autres domaines, la chromatographie, l’absorption moléculaire en film…,

l’opérateur ne maîtrise pas obligatoirement la quantité d’échantillon injectée dans
l’appareil (l’épaisseur du film dans le cas de l’absorption), la réponse n’est donc pas
simplement proportionnelle à la concentration. Il s’affranchît de ce problème en utilisant
une technique d’étalonnage interne.

Enfin, il peut, par souci d’économie de temps, être amené à utiliser la méthode des
ajouts.

II.1 MÉTHODE PAR ÉTALONNAGE EXTERNE

C’est une technique qui consiste à comparer les surface des pics du mélange avec un
étalon prise comme référence alors dans certaine technique ils n’est pas possible de
maintenir constant un paramètre analyse. Ce qui est notamment en chromatographie en
phase gazeuse ou on ne connait pas précisément le volume échantillon injecte dans la
chromatographie. Donc on s’affranchit de cette méconnaissance en introduisant dans
échantillon a analysé une substance en quantité connue.

Dans tous les cas, la technique comporte trois phases :

- La réalisation d’une courbe d’étalonnage à partir de solutions de concentrations

connues
- La mesure du paramètre sur l’échantillon inconnu
- La comparaison de la mesure à la courbe d’étalonnage.

Elle est applicable en méthode directe, si le soluté est lui-même coloré ou absorbe
dans le domaine considéré et en méthode indirecte (introduction d’un chromophore) si
le soluté est transparent dans le domaine considéré.

L’exemple de la détermination du phosphore soluble dans les sols (norme NF X 31-

161)10 illustre cette technique (après dérivatisation).

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Expose BCH327

En présence de réactif sulfomolybdique, le phosphore forme un complexe coloré qui

absorbe fortement dans le rouge ( à 825 nm). Cette absorption moléculaire obéit à la loi
de
Beer-Lambert (d = log10 I0/It =  l C), expression dans laquelle  représente une
constante appelée le coefficient d’extinction molaire, l le trajet optique (épaisseur de la
cuve = 1 cm dans le cas présent) et C la concentration.

Courbe d’étalonnage

A partir d’une solution mère d’ortho phosphate d potassium à 450 mg par litre, on
prépare une gamme de quatre solutions étalons respectivement à 0 ; 2,25, 4 et 9 mg /l
par prélèvement de volumes de solution mère adéquate et dilution à 1000 avec de l’eau
qsp.
On soumet un aliquote de chacune de ces solutions étalons à la réaction de
complexassions avec le réactif sulfomolybdique et on mesure l’absorbance de la
solution après complexassions.
On peut alors tracer la courbe d = f(C) :

d = f(C)

1.6

f(x) = 0.17 x − 0
1.4 R² = 1

1.2

0.8
d

0.6

0.4

0.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

C en mg / l

Ce qui se traduit par une droite d’étalonnage d’équation :

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Expose BCH327

d = 0,1656 m – 0,0006 R² = 99,07%

Mesure de l’échantillon

Un aliquote d’échantillon de masse m0 est soumis à la procédure d’extraction et à

celle de dérivatisation de manière analogue à celle utilisée pour les solutions étalons.
La lecture de la densité optique à 825 nm conduit à une valeur d = 1,247

Comparaison à la courbe d’étalonnage

Soit on reporte la valeur de la densité optique sur l’axe des ordonnées, on intercepte
la droite d’étalonnage et on abaisse la verticale qui coupe l’axe des abscisses en m, soit
on utilise directement l’équation de la droite, (plus précis et on s’affranchit des valeurs
erronées) ce qui conduit à m = 7,54 mg /l. Connaissant la procédure de réalisation de la
solution finale (après dédramatisation), il est aisé de revenir à la teneur en phosphore
soluble dans l’échantillon initial de masse m0.
En terme de précision, la lecture de l’absorbance n’apporte que très peu d’erreur, les
appareils fournissant des mesures de densité optique avec des précisions de l’ordre de
0,1 % (à condition d’avoir un signal de forte amplitude). L’erreur principale sera
apportée par l’ensemble des actions réalisées dans la procédure d’extraction et de
dératisations.

Avantages et inconvénients

L’avantage essentiel de la méthode réside souvent dans sa facilité de mise en œuvre

qui en fait une technique très répandue. Elle est applicable et appliquée dans toutes les
méthodes d’absorption atomique (NF T 90-112)11, les méthodes d’absorption
moléculaire (NF T 90-012)12, la chromatographie en phase liquide (HPLC)

L’inconvénient peut être, comme c’est le cas ici, sa lourdeur (nécessité d’appliquer la
réaction de dérivatisation à l’ensemble des étalons.

II.2 E TALONNAGE INTERNE

Dans un certain nombre de techniques, il n’est pas possible de maintenir constant un
paramètre de l’analyse. C’est le cas que l’on rencontre notamment en chromatographe en
phase gazeuse (CPG) ou l’on ne connaît pas précisément le volume d’échantillon injecté dans
le chromatographe. Ceci est également vrai pour les méthodes optiques pour lesquelles on
travaille sur des films, pour lesquels on ne connaît pas l’épaisseur. On s’affranchit de cette
méconnaissance en introduisant, dans l’échantillon à analyser une substance en quantité
connue. Le choix de cette substance sera explicité ultérieurement.

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Expose BCH327

Une application de cette technique concerne l’analyse des acides gras, sous forme d’esters
méthylique FAME, par chromatographie en phase gazeuse (norme NF T 60 – 234)13

En chromatographie, la théorie des plateaux, que l’on abordera ultérieurement, conduit à des
pics chromatographiques (réponse en fonction du temps) Gaussiens. Une des propriétés des
courbes gaussiennes est que l’aire sous-tendue par le gaussien est proportionnel à la
population présente.
Traduit en terme chromatographique, cela signifie que l’aire sous-tendue par le pic
chromatographique est proportionnelle à la masse de soluté i injecté dans le chromatographe,
ce que l’on peut écrire :

mi = ki Ai

Expression dans laquelle mi représente la masse de soluté i injectée dans le chromatographe,

Ai l’aire du pic chromatographique correspondant au soluté i et ki le facteur de
proportionnalité propre au soluté i et dépendant des conditions chromatographiques.

La détermination du facteur de proportionnalité pourrait se faire par injections de différentes

masses mi et mesures des aires Ai correspondantes. Mais, en chromatographie en phase
gazeuse, on injecte des volumes d’échantillon de l’ordre du microlitre à l’aide de
Micro seringues. Dans ces conditions, il ‘est pas possible de connaître précisément le volume
injecté dans le chromatographe, même si celui-ci est relativement constant pour un opérateur
donné. On s’affranchit de cette contrainte en introduisant, dans l’échantillon à analyser un
soluté de référence que l’on appelle ‘l’étalon interne. Son choix sera abordé en fin de
paragraphe

On peut alors écrire :

Pour le soluté i mi = ki Ai
Et pour l’étalon interne me = ke Ae

Ce qui conduit au rapport mi / me = (ki / ke) (Ai / Ae) = Kie (Ai / Ae)

Kie étant le facteur de réponse du soluté i par rapport à l’étalon interne. Ce terme est constant
dans les conditions chromatographiques données.

Par ce rapport, on s’aperçoit que l’on s’affranchit du volume injecté dans le chromatographe.
En effet si l’on injecte un volume supérieur, d’une analyse à l’autre, l’aire du pic du soluté i
va augmenter, mais en même temps l’aire du pic du soluté e va également augmenter, et ceci
dans le même rapport, si bien que le rapport de ces deux aires restera constant.
Pour un système homogène (monophasique), l’échantillon présent dans la seringue
d’injection est le parfait reflet de l’échantillon présent dans notre tube à essai
Ce qui peut se traduire par l’expression :

m°i / m°e = mi / me = Kie (Ai / Ae)

Soit :
m°i = m°e = Kie (Ai / Ae)

La réalisation et l’analyse de solutions références de m°i connues et la connaissance de m°e

permettra la détermination du facteur de réponse Kie.

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Expose BCH327

Connaissant ce facteur de réponse et m°e, on pourra alors déterminer m°i dans n’importe quel
échantillon.

Comme précédemment, la procédure comporte trois étapes

- La réalisation de la courbe d’étalonnage

- La mesure des aires chromatographiques des échantillons
- L’interprétation de ces mesures

Avantages et inconvénients

L’avantage de cette technique est qu’elle permet de s’affranchir complètement des volumes
injectés dans le chromatographe.

Le premier inconvénient est qu’elle est relativement longue à mettre en œuvre, préparation
des solutions étalons, de la solution d’étalon interne, analyse de ces différentes solutions…

Le second point très important concerne le choix de l’étalon interne. Celui-ci doit avoir une
structure chimique proche de celle des solutés analysés. Il ne doit pas être présent dans a
matrice initiale. Il doit s’intégrer dans le chromatogramme sans interférence avec les autres
solutés. Il ne doit pas réagir chimiquement avec d’autres constituants présents et doit être
compatible avec le système de détection utilisé. Enfin il doit être parfaitement soluble dans le
solvant de mise en solution de l’échantillon.
Toutes ces contraintes fon qu’il n’est pas toujours aisé de trouver un étalon interne qu réponde
à toutes ces contraintes.

II.3 MÉTHODES DES AJOUTS DOSÉS

Moins utilisée dans les méthodes officielles, cette technique présente l’avantage de sa
simplicité et de sa mise en œuvre. Elle est cependant très utilisée pour des analyses de traces
d’éléments métalliques et / ou de polluants. Elle est basée sur une double détermination d’un
soluté inconnu :

- Une première détermination sur l’échantillon brut

- Une seconde détermination sur l’échantillon dopé

On peut l’appliquer à toutes sortes de techniques analytiques, on va en voir deux exemples

simples l’un concernant l’absorption atomique, l’autre la chromatographie

 Application à l’absorption atomique en flamme

Soit une solution inconnue de concentration C°1 en élément métallique M1. L’absorption
atomique de cette solution répond à une loi du type :

d = log10 I0 / It = K l C expression dans laquelle I0 et It représentent les intensités

des rayonnements incidents et transmis, l la longueur de la flamme, C la concentration en
élément métallique dosé et K le facteur de réponse de cet élément (dans les conditions
d’analyse)

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Expose BCH327

En procédant à l’analyse directe de l’échantillon, on peut écrire :

d1 = K l C°1
Avec C°1 = m°1 /V

On va alors doper cet échantillon avec une masse m° 2 de l’élément métallique M1 (on pourra
raisonnablement négliger la variation de volume), ce qui va conduire à une nouvelle densité
optique :

d2 = K l C°2
avec C°2 = (m°1 + m°2) /V

soit le rapport : d1 / d2 = C°1 / C°2 = (m°1 / V) / (m°1 + m°2) / V

d1 / d2 = m°1 / (m°1 + m°2)

et
m°2 (d1 / d2)
m°1= 
|1 – (d1 /d2)]

 Application à a chromatographie

On peut également utiliser cette technique en chromatographie. Elle ne permet cependant pas
de s’affranchir du volume injecté et on devra avoir recours à un standard interne pour lever
cette ambiguïté.

Soit un échantillon contenant une masse m° 1 de soluté à analyser. On lui ajoute une masse
m°e de standard interne, comme dans le cas de l’étalonnage interne et on procède à l’injection
chromatographique.

On obtient deux aires A1 et Ae pour ce premier échantillon, avec une relation simple :

m°1/ m°e = K1e A1 / Ae

A l’issue de cette première injection, on ajoute une masse m°1’ connue de soluté à analyser à
‘échantillon précédent et on procède à son injection chromatographique.

On obtient alors deux nouvelles aires A’1 et A’e pour le soluté et le standard interne avec le
rapport (en négligeant les variations de volume et de masse):

(m°1 + m°1’) / m°e = K1e A’1 / A’e

ce qui conduit, en faisant le rapport de ces deux expressions et en simplifiant par K1e et m°e

m°1 / (m°1 + m°’1) = (A1 / Ae) / (A’1 / A’e)

10
Expose BCH327

soit :

m°’1 ( A1 / Ae)
m°1 = 
[ (A’1 / A’e) – (A1 / Ae)]

Par rapport à la technique de l’étalonnage interne, la technique des ajouts dosés est plus
simple à mettre en œuvre dans la mesure où elle ne nécessite que deux points d’analyse.
Cependant, par souci de fidélité, on sera bien souvent obligé de procéder à trois analyses de
manière à obtenir une valeur moyenne.

III. ETUDE DE CAS N°1 (DOSAGE HPLC ET CPG APRÈS

TRAITEMENT PRÉLIMINAIRE)

III.1 D OSAGE D'ADRÉNALINE PLASMATIQUE

 Présentation du dosage de l'adrénaline plasmatique par HPLC

Il s'agit du dosage de l'hormone adrénaline dans le plasma sanguin. L'adrénaline est

mesurée grâ ce à une chromatographie liquide haute performance mettant en œuvre
une phase stationnaire apolaire. Le détecteur en ligne est un détecteur électrochimique
ampérométrique. Le plasma ne peut être analysé directement, une extraction-
purification préalable partiellement sélective est nécessaire. La sélectivité du dosage
pour l'adrénaline est la résultante du trinô me "sélectivité partielle du prétraitement
/temps de rétention caractéristique/détection électrochimique caractéristique".

 Le traitement préalable des plasmas à mesurer

on utilise le fait que les hormones catécholamines sont fortement adsorbées par
l'alumine A un volume essai E de 1,00 mL de plasma on ajoute 50 µL d'une solution de
DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA. La DHBA est la 3,4-dihydroxybenzylamine.
Elle est naturellement absente des plasmas sanguins, elle est utilisée comme 'traceur' de
l'étape de traitement préalable de l'échantillon. A l'analyse HPLC, elle est détectée et
donne un pic bien différencié de celui de l'adrénaline. La DHBA est l’étalon interne de
cette analyse, la quantité ajoutée à l'essai est exactement connue.

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Expose BCH327

 On met le mélange en contact avec une charge de quelques

dizaines de µL de poudre d'alumine qui adsorbe (entre
autres) l'adrénaline et la DHBA. On agite, on élimine
l'éluâ t.

 On lave à l'aide d'un tampon de lavage (2 fois 1 ml).

L'adrénaline et la DHBA (entre autres) demeurent
adsorbées.

 On désorbe à l'aide d'un tampon de désorption (120 µL) :

On ajoute le tampon; on ferme; on agite; on récupère
l'éluâ t qui contient l'adrénaline et la DHBA (partiellement
purifiées).

 L'analyse chromatographique HPLC

• Les volumes injectés sont de 20 µL. Avec la colonne et la phase mobile utilisées, au
débit de 1 mL/min, l'adrénaline élue à 6 min et la DHBA à 8,5 min.

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Expose BCH327

• Un étalonnage préalable dit "interne" est réalisé avec un mélange contenant 3 pg

d'adrénaline par µL et 5 pg de DHBA par µL. 20 µL de ce mélange sont directement
injectés pour analyse HPLC sans subir la phase d'adsorption-élution sur colonne
d'alumine.
Ainsi on étalonne avec respectivement qet,adr = 60 pg et qet,dhba = 100 pg d'adrénaline
et de DHBA injectés.
On obtient un pic étalon adrénaline de surface Set,adr = 230673 unités.
Et un pic étalon DHBA de surface Set,dhba = 557219 unités.
• On peut alors doser les essais issus de plasmas "prétraités" de différents patients. Voici
2 exemples de résultats :
 Pour M. Dupont
L'éluâ t de désorption de la phase de traitement préalable est analysé. On obtient :
Un pic adrénaline de surface Sa = 96620 unités.
Et un pic DHBA de surface Si = 429766 unités.
 Pour Mne Durand
L'éluâ t de désorption de la phase de traitement préalable est analysé. On obtient :
Un pic adrénaline de surface Sa = 174532 unités.
Et un pic DHBA de surface Si = 397562 unités.

 Calcul de la concentration en adrénaline des plasmas dosés (méthode

pas à pas)
On peut calculer facilement la quantité d'étalon interne DHBA (qi) et d'adrénaline (qa)
qui ont été analysées lors de la mesure de chaque essai. Dans les 20 µL injectés !!

On a qa / qet,adr = Sa / Set,adr
Et on a qi / qet,dhba = Si / Set,dhba
En effet, la surface d'un pic est proportionnelle à la quantité de matière qui l' a
déclenché.
Pour M. Dupont
Le calcul donne qa = (96620 / 230672) * 60 = 25,13 pg.
Le calcul donne qi = (429766 / 557219) * 100 = 77,13 pg.
Cela signifie que sur 500 pg de DHBA qu'on avait introduit dans l'échantillon à doser, on
en retrouve 77,13 pg dans les 20 µL d'éluâ t de désorption analysés. Ceci conduit à un
facteur f de récupération de l'étalon interne dans 20 µL. f est égal à 77,13 / 500 pour
l'analyse de ce plasma.

Pour Mne Durand

Le calcul donne qa = (174532 / 230672) * 60 = 45,40 pg.
Le calcul donne qi = (397562 / 557219) * 100 = 71,35 pg.
Cela signifie que sur 500 pg de DHBA qu'on avait introduit dans l'échantillon à doser, on
en retrouve 71,35 pg dans les 20 µL d'éluâ t de désorption analysés. Ceci conduit à un

13
Expose BCH327

facteur f de récupération de l'étalon interne dans 20 µL. f est égal à 71,35 / 500 pour
l'analyse de ce plasma.

Evidemment f varie pour chaque analyse. Si on peut connaître f, c'est grâ ce à l’espion «
étalon interne ».
Si on prétend que le DHBA se comporte comme l'adrénaline lors du traitement
préalable, on peut appliquer le facteur f à l'adrénaline.

Pour M. Dupont
(f=77,13 / 500 = 0,15426)Il y avait donc 25,13 / f = 162,9 pg d'adrénaline dans
l'échantillon de départ qui avait été constitué avec 1 mL de plasma.
Donc, pour le plasma analysé :
[Adrénaline]Dupont = 163 pg /mL

Pour Mme Durand (f=71,35 / 500 = 0,14270)

Il y avait donc 45,40 / f = 318,1 pg d'adrénaline dans l'échantillon de départ qui avait été
constitué avec 1 mL de plasma.
Donc, pour le plasma analysé :
[Adrénaline]Durand = 318 pg /mL.

 Conclusion partielle
On voit l'intérêt de l'étalon interne dans ce dosage : On ne connait pas le rendement
exact de récupération de l'adrénaline du plasma dans le volume injecté pour l'analyse
HPLC. C'est l'étalon interne qui nous renseigne à chaque analyse. La condition de validité
est évidemment que l'étalon interne se comporte comme la substance à doser lors du
traitement préalable.

III .2 PRÉSENTATION D'UN DOSAGE ÉTHANOL PAR CPG

On dose l'éthanol d'alcools forts dits de "bouche" commercialisés de type eau de vie,
bourbon, vodka . Le dosage est réalisé par CPG à l'aide d'une colonne "capillaire wide
bore 0,53 nm" à phase greffée polaire. Le gaz vecteur est de l'hydrogène. Le détecteur est
un détecteur à ionisation de flamme (FID). La colonne supporte les injections directes du
produit à doser après dilution convenable dans l'eau. Le détecteur FID autorise l'eau
comme diluant. On met en œuvre une injection en mode division (mode "split") : le
volume exact réellement injecté est peu reproductible.

 Etablissement d'une fonction d'étalonnage

On va étalonner l'analyse avec une série d'étalons de concentrations variables en

éthanol mais contenant aussi un autre étalon -l'étalon interne- en l'occurrence du métyl-
4-pentanol-2 pur.

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Expose BCH327

Dans les conditions de l'analyse, on a montré que l'éthanol est parfaitement séparé de
tous les autres constituants des alcools de bouche et élue vers 4 min. Il en va de même
pour le métyl-4-pentanol-2 qui est absent des alcools de bouche à mesurer : il est
parfaitement séparé de tous les autres constituants de l'alcool de bouche et élue vers 12
minutes.

On réalise 4 mélanges étalons qui sont mesurés selon les indications du tableau suivant :

Mélange 1 Mélange 2 Mélange 3 Mélange 4

É thanol absolu 0,125ml 0,250ml 0,5ml 1ml

Métyl-4-pentanol-2 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml

pur

Eau 100ml 100ml 100ml 100ml

Surface du pic éthanol 123767 254535 u 522948 u arb 940367 u arb

arb
(4 min)

Surface du pic métyl- 900123 u arb 925578 u 968547 u arb 863025 u arb
4-pentanol-2 pur (12 arb
min)

Pour chaque pic éthanol mesuré, la surface (Set) est proportionnelle à la quantité
injectée (net) selon un coefficient de réponse caractéristique (ket) :

net = ket * Set (relation (a)) (En effet, la surface d'un pic est proportionnelle à la
quantité de matière qui l’a déclenché.)

Pour chaque pic métyl-4-pentanol-2 mesuré, la surface (Si) est proportionnelle à la

quantité injectée (ni) selon un coefficient de réponse caractéristique (ki) :

ni = ki * Si (relation (b))

On remarque que les surfaces obtenues pour le métyl-4-pentanol-2 sont sensiblement

différentes alors que la concentration en métyl-4-pentanol-2 de tous les étalons est la
même. Ceci est essentiellement lié au fait que le volume injecté (Vinj) dans la colonne est
peu reproductible d'une manipulation à l'autre. Et c'est bien ce qui nous ennuie a priori
pour pouvoir tracer une fonction d'étalonnage classique avec de simples solutions
étalons d'éthanol!

Cependant pour une injection donnée (on injecte une même solution qui contient
l'éthanol étalon et le métyl-4-pentanol-2 étalon), les relations (a) et (b) donnent :

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Expose BCH327

cet * Vinj = ket * Set (où cet désigne la concentration en éthanol de la solution injectée)

ci * Vinj = ki * Si (où ci désigne la concentration en métyl-4-pentanol-2 de la solution

injectée)

Etablissons le rapport de ces 2 égalités, on obtient :

cet / ci = (ket / ki) * (Set / Si)

Et hop, Vinj qu'on ne connaissait pas a disparu ! On obtient une relation donnant cet qui
ne dépend pas du volume injecté !!

Voilà donc la relation d'étalonnage intéressante et c'est :

(Set / Si) est proportionnel à (cet / ci)

On se livre aux calculs, on trace (Set / Si) = f( (cet / ci) ; et on obtient :

Pour construire le graphe présenté on a

exprimé les concentrations en éthanol et
en métyl-4-pentanol-2 en % (v/v) selon
les données du tableau de résultats
précédent.

L'équation de la droite de régression

figure sur le graphe accompagnée de son
coefficient de corrélation.

Elle est désormais considérée comme la

fonction d'étalonnage

 Mesures d'essais

On dispose donc d'une fonction d'étalonnage pour les essais. Considérons un essai
"rhum X" mesuré : 1 mL de "rhum X" a été additionné de 0,5 mL d'étalon interne métyl-
4-pentanol-2 et le volume a été ajusté à 100 mL en fiole jaugée. L'analyse CPG dans les
conditions de l'étalonnage donne un pic éthanol de surface Sx = 500 172 unités et un pic
étalon interne de surface Si = 943 624 unités. Le rapport des surfaces est de 0,5301. La
fonction d'étalonnage associe cette valeur à un rapport de concentration de l'éthanol au
métyl-4-pentanol-2 de 0,9782.

La concentration en métyl-4-pentanol-2 dans l'essai chromatographié était de 0,500 %.

On en déduit donc une concentration en éthanol dans l'essai chromatographié de 0,49%
(v/v).Compte tenu de la dilution réalisée dans la fiole jaugée, on déduit : [éthanol]"rhum
X" = 49 % (v/v).
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Expose BCH327

 Conclusion partielle

On voit l'intérêt de l'étalon interne dans ce dosage : On ne connait pas le volume injecté
lors de chaque "run de chromatographie". C'est l'étalon interne qui nous renseigne à
chaque analyse

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Expose BCH327

CONCLUSION

Arrivé au terme de notre exposé on peut retenir que toutes les techniques analytiques
mettant en œuvre des propriétés spectrales font appel à des méthodes de quantification basées
sur un étalonnage externe, si les paramètres autres que la concentration sont maitrisés. Si ces
paramètres ne sont pas maitrisés, il nous viendra d’appliquer des méthodes d’étalonnage
interne.

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