Université Amar Télidji de Laghouat
Faculté de Médecine
Module de Cytologie et Physiologie cellulaire
2020-2021
Dr. Dr.
LAOUADI BECHEUR
MOURAD MOURAD
Dr. LAOUADI MOURAD Dr. BECHEUR MOURAD
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Chapitre II
Méthodes d’études de la cellule
Sommaire
II-1 Les microscopes optiques ou photoniques
A- Le microscope optique à fond clair
B- Le microscope optique à fluorescence
II-2 Les microscopes électroniques
A- Le microscope électronique à transmission (MET)
B- Le microscope électronique à balayage (MEB)
Sommaire
II-3 Techniques de détection et de localisation des
composés cellulaires
II-4 Les procédés d’isolement des composants cellulaires
Résolution et grossissement Résolution et grossissement
limités plus importants
Observation de la structure Observation des organites
générale des cellules cellulaires et leurs détails
Microscope optique Microscope électronique
II-2 Les microscopes électroniques
Microscope Microscope
électronique à électronique à
transmission (MET) balayage (MEB)
Observer l’intérieur de la Observer l’extérieur de la cellule
cellule (3D)
A-Microscope électronique à transmission
(MET)
Objectifs du cours
1) Donner le principe de fonctionnement du microscope
électronique à transmission (MET)
2) Déterminer les domaines de son utilisation
3) Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue de sa
caractérisation ultrastructurale (technique des coupes minces
et contraste positif)
4) Lister les différents procédés de contraste électronique
(coloration positive, négative, ombrage)
5) Indiquer l’apport de chaque procédé de contraste électronique
dans l’analyse morphologique d’un échantillon.
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
Limite de résolution = 0,2 nm à 2 nm
Le MET fonctionne également selon le principe de
transmission
Le MET fait passer sous vide le faisceau
d'électrons à travers une coupe ultrafine d'un
échantillon biologique. Ce faisceau est ensuite
agrandi par des lentilles électromagnétiques et
vient former une image sur un écran ou sur un
film photographique
Image en noir et blanc
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
MET
MO
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
Schémas de principe des microscopes
Photonique Électroniques à transmission (MET)
Source d’électrons :
Source de photons : filament chauffé soumis
lampe à une forte ddp
>100 kVolts
Condenseur
Condenseur
Grille de cuivre
Lame support support objet
objet transparent transparent
Objectif(s)
Objectif
réglables
Vide
Oculaire
Projectif
Écran fluorescent
Oeil
Plaque photographique
cours E. Grelier
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
MO MET
Echantillon Echantillon
sur lame en sur grille
verre en cuivre
Objectif 2: Domaines de son utilisation
Résolution = 0,2 à 2 nm
Grossissement = 100 000 X
Ultrastructure cellulaire (organites)
après coloration positive
Aspect morphologique des bactéries et
des virus après coloration négative
Structures cellulaires isolées ou
macromolécules par ombrage métallique
Objectif 3: Etapes préparatoires d’un
échantillon en vue de sa caractérisation ultra-
structurale
La Microscopie Électronique en Transmission (MET) permet une
analyse morphologique, structurale et chimique d’échantillons solides à l’échelle
atomique. Cette technique repose sur l’interaction des électrons avec la matière
et la détection des électrons ayant traversé l’échantillon. Les échantillons étudiés
doivent donc être préalablement amincis afin d’être transparents aux électrons
Principe : réaliser des coupes ultrafines permissives aux
faisceaux d’électrons et aux sels de métaux lourds
Objectif 3: Etapes de préparation
1-Prélèvement
Objectif 3: Etapes de préparation
2-Fixation
But : maintenir l’état la plus proche du vivant
• Glutaraldéhyde
Chimique • tétraoxyde d’osmium
• Azote liquide
Physique • Utilisation d’un cryo-
Cryofixation microscopie électronique
Objectif 3: Etapes de préparation
2-Fixation
1er bain (2h30) dans le Glutaraldehyde: fixe les
protéines , les sucres , acides nucléiques
Lavage dans une solution tamponnée
2ème bain (1h) dans le Tétroxyde d’osmium: fixe les
lipides
À la sortie de l’acide osmique, le prélèvement est
entièrement noir
Objectif 3: Etapes de préparation
3-Déshydratation
But: enlever l’eau des tissus prélevés et le remplacer
par un milieu miscible avec le milieu d’inclusion
Déshydratation dans des bains successifs d’alcool de
plus en plus concentrés jusqu’à l’alcool absolu
Imprégnation dans un solvant de la résine, comme l’oxyde
de propylène (la résine sera utilisée dans l’étape de
l’inclusion)
Objectif 3: Etapes de préparation
4-Inclusion
But: imprégnation du tissu par un milieu capable de durcir
fortement pour permettre la coupe par la suite
Milieu utilisé: Résine (Epon)
Propriété de polymériser donc durcir à la
chaleur
Mélangeur pendant 3h
Enrobage dans des moules spéciaux
Polymérisation à l’étuve (37C /45C/ 60C)
Objectif 3: Etapes de préparation
5-Coupe
But: Coupes ultrafines de 300 – 600 Å (30-60 nm)
Utilisation d’un ultra-microtome
Objectif 3: Etapes de préparation
5-Coupe
Petit bac rempli d’eau pour récupérer les coupes ultrafines très fragiles
Objectif 3: Etapes de préparation
5-Coupe
Objectif 3: Etapes de préparation
Coupes étalées sur une grille métallique(en cuivre)
Objectif 3: Etapes de préparation
6-"Coloration"
Coloration aux sels de métaux lourds
But: augmenter le contraste des structures cellulaires en
augmentant leurs densité aux électrons
Acétate d’uranyl : ADN, protéines, sucres
Citrate de plomb: ARN et lipides (membranes)
Remarque importante
Le terme « coloration » a été mis entre guillemets car ce n’est
pas une coloration à proprement parler, mais un procédé qui
vise à augmenter le contraste en utilisant les métaux lourds et
non les colorants classiques
Objectif 3: Etapes de préparation
7-Observation
Image en noir et blanc
Régions opaques et sombres : régions plus
denses aux électrons (arrêt des
électrons)
Régions claires : transmission des
électrons
Objectifs 4 et 5: Différents procédés de
contraste électronique
• Coloration • Coloration • Ombrage
positive négative métallique
Objectifs 4 et 5: Différents procédés de
contraste électronique
Contraste positif (=coloration positive)
Les atomes majeurs de la matière biologique sont
transparents aux électrons d’où la nécessité d’utiliser
des sels de métaux lourds: Acétate d’Urany, Citrate
de Plomb
But: Décrire finement l’ultrastructure intracellulaire
Zone claire
(électrons
transmis)
Zone sombre
opaque
(Électrons
arrêtés)
Contraste positif d’une cellule animale
Contraste positif d’une cellule bactérienne
Contraste positif du VIH
Contraste positif de la membrane plasmique
Contraste positif d’une mitochondrie
Contraste positif d’un appareil de Golgi
Objectifs 4 et 5: Différents procédés de
contraste électronique
Contraste négatif (=coloration négative): le principe
(principe)
Le principe consiste à déposer tout autour de
l’échantillon une couche de métaux lourds
Il permet d’assombrir le fond sans colorer l’objet lui-
même. Les structures apparaissent en « négatif » : en
clair sur fond sombre
Objectifs 4 et 5: Différents procédés de
contraste électronique
Contraste négatif (=coloration négative): le but
Observer les structures de très petites dimensions après
isolement
Description morphologique (morphologie externe) de
macromolécules, d’organites, de ribosomes, de virus ,
bactérie,,,
Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette
(microtubules, microfilament d’actine..), de la chromatine,
des pores nucléaires,,,
Contraste négatif d’un bactériophage
Contraste négatif de l’influenza virus
Contraste négatif: virus de la mosaïque du tabac
Objectifs 4 et 5: Différents procédés de
contraste électronique
Ombrage métallique
Consiste à vaporiser sous vide et sous un angle donné une
très fine couche métallique (platine) se déposant sur la
surface de petites particules isolées, créant un effet
d’ombre
But : obtenir un effet d’ombre (morphologie ) de la
surface des petites particules isolées ; bactéries, virus,
ADN, protéines. Elle a l’avantage d’obtenir une image 3D
en MET (car la 3D on l’obtient surtout par le MEB).
