Univ Blida I.

FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray

Introduction :

Le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer la succession
linéaire des bases A, C, G et T prenant part à la structure de l’ADN. La lecture de cette
séquence permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci. Étant donné
l’unicité et la spécificité de la structure de l’ADN chez chaque individu, la séquence de
l’ADN permet de nombreuses applications dans le domaine de la médecine, comme, par
exemple, le diagnostic, les études génétiques, l’étude de paternité, la criminologie, la
compréhension de mécanismes physiopathologiques, la synthèse de médicaments, les
enquêtes épidémiologiques, la systématique, la phylogénie.
Les génomes de nombreux agents infectieux, de mammifères et de plantes ont également été
séquencés dans leur totalité (nombre d’entre eux sont accessibles sur le site
[Link]/Genomes). Leur connaissance a modifié considérablement les
recherches biomédicales et biologiques en ouvrant de vastes panoramas dans le domaine de la
médecine (diagnostic, thérapeutique, prédiction, pronostic, prévention. . .) et dans de
nombreuses autres disciplines biologiques (anthropologie, agronomie, environnement. . .). Le
séquençage est un remarquable instrument nécessaire à la compréhension des cycles de la vie
dans leur globalité. Les techniques de séquençage évoluent et leurs applications s’élargissent.
Le séquençage a pu être diffusé dans de nombreux laboratoires, en partie depuis la description
de la polymerase chain reaction (PCR) en 1985. Depuis 2000, outre la PCR, de nouvelles
techniques de séquençage se sont développées.
Les deux premières techniques de séquençage de l’ADN, celle de Maxam-Gilbert et celle de
Sanger ont été décrites en 1977.

- La technique de Maxam-Gilbert :

Cette technique est pratiquement abandonnée de nos jours. Cette méthode, publiée
parallèlement à celle de Sanger en 1977, par son caractère révolutionnaire a grandement
contribué à l’histoire de la biologie moléculaire. Il s’agit d’une méthode chimique de
séquençage. Les réactifs clivent spécifiquement après chacune des bases A, C, G, [A + G], [C
+ T]. Cette technique est basée sur la propriété de certains agents chimiques, l’hydrazine, le
diméthyl sulfate (DMS) et l’acide formique, de modifier les bases de l’ADN. Dans un second
temps, la pipéridine est ajoutée et « casse » les brins d’ADN au niveau des bases modifiées.
Les agents chimiques sont utilisés dans des conditions telles qu’ils n’agissent qu’avec un
faible pourcentage des bases de l’ADN étudié. Le DMS agit au niveau des bases «G». L’acide
formique agit au niveau des bases «A+G». L’hydrazine agit au niveau des bases «C+T» (en
milieu alcalin, l’hydrazine agit uniquement au niveau des « C »). L’ADN à séquencer est
marqué à une extrémité. Le plus souvent, il s’agit d’un marqueur radioactif. Le produit de
séquence est déposé sur un gel d’acrylamide, puis la séquence lue après autoradiographie
(Fig. 1 et 2). L’ADN étudié peut être simple ou double

1
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray

Figure 1 : Technique de Maxam-Gilbert.

Cette technique est une méthode chimique de traitement de l’ADN. Un fragment amplifié par PCR
et marqué radioactivement par le phosphore radioactif (P32) est modifié par un agent chimique,
par exemple l’hydralazine. Celle-ci modifie les bases C et T et en milieu alcalin, uniquement les
bases C (comme dans ce schéma). Dans un second temps, l’addition de pipéridine casse de
manière aléatoire et au moins une fois au niveau de chaque base C modifié.
On obtient donc des fragments de taille différente.

Figure 2 : Technique de Maxam-Gilbert.

Dans quatre tubes différents, l’ADN cible est traité par chacun des produits de modification
spécifique de base (hydralazine C+T; hydralazine C en milieu alcalin ; diméthyl sulfate G; acide
formique A + G), suivi d’un traitement par la pipéridine. Les fragments coupés aléatoirement et au
moins une fois après chaque base spécifique2sur l’ADN cible sont de taille différente. La migration
de ces derniers dans un gel d’acrylamide spécifique suivie d’une autoradiographie permet de déduire
la séquence de l’ADN au cours de la lecture du gel dans le sens 5’→3’ de bas en haut du gel.
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray
- La technique de Sanger :

La diffusion de la méthode de Sanger, la commercialisation d’automates utilisant des

fluorophores quatre couleurs ainsi que le déploiement de la PCR dans les laboratoires ont
considérablement amélioré les procédures de séquençage. La méthode de Sanger a en effet
rapidement dépassé la méthode de Maxam-Gilbert pour la remplacer et reste à ce jour la
principale méthode de séquençage utilisée dans les laboratoires. Son principe est le suivant.
Dans un premier temps, il est nécessaire d’amplifier l’ADN cible par PCR, puis de le
dénaturer afin d’obtenir un ADN simple brin. À l’aide d’une amorce spécifique et
complémentaire du brin étudié (sens ou antisens), identique ou différente de celle utilisée pour
la PCR, une ADN polymérase effectue alors la synthèse de l’ADN complémentaire à partir de
cette amorce. De l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’, cette enzyme ajoute les
désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP) complémentaires et de manière aléatoire et
inconstante des didéoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP), par exemple un ddGTP sera
parfois ajouté à la place d’un dGTP. La réaction se faisant dans un seul tube, les ddNTP
ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP) sont marqués à l’aide de fluorophores différents pour
chaque ddNTP (fluorophores « quatre couleurs »). Lorsqu’un ddNTP est incorporé à la place
d’un dNTP, l’ADN polymérase ne peut plus continuer sa polymérisation. La réaction
d’extension s’arrête (en effet, le didéoxynucléotide ne possède pas de groupe 3’-hydroxyle
indispensable à la réaction de polymérisation de l’enzyme). Statistiquement, au cours de la
réaction, pour chaque « base » de l’ADN cible, au moins une fois, un ddNTP complémentaire
sera incorporé à la place d’un dNTP. Par conséquent, à la fin de la réaction, nous obtiendrons
des fragments de taille différente. L’analyse de la réaction est ensuite effectuée. Différentes
méthodes d’analyse sont possibles. Aujourd’hui, l’électrophorèse capillaire réalisée sur un
automate de séquençage est la méthode de choix. Lors de la migration, chaque fragment
(contenant un ddNTP marqué par un fluorophore) sera excité par un laser et le signal obtenu
analysé par un logiciel spécifique. L’analyse informatique des signaux permet d’obtenir la
séquence étudiée, par exemple, sous forme d’un électrophorégramme, de lecture manuelle
aisée mais souvent fastidieuse (Fig. 3). Des logiciels d’analyse des séquences peuvent être
utilisés. Dans tous les cas, l’analyse d’un fragment d’ADN après PCR se fait toujours à l’aide
d’une amorce sens et antisens afin de confirmer la séquence (et une éventuelle anomalie de
séquence). En général, cette technique permet d’obtenir des séquences de longueur comprise
entre 400 et 850 pb. D’autres technologies ont donc été développées pour améliorer le
rendement, la rapidité et le coût du séquençage.

3
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray

Figure 3: Principes du séquençage selon la méthode de Sanger

Figure 4 : Lecture et traitement des séquences par le

logiciel avec obtention de l’électrophorégramme

4
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray
Puces à ADN : (Microarray)

Initialement développées comme outil de criblage de banque, les puces à ADN se sont
imposées comme l’outil de la mesure d’expression des gènes. Contrairement à d’autres
techniques, elles permettent de mesurer l’expression des gènes de l’ensemble d’un génome
même complexe, en une seule hybridation. L’existence de puces commerciales de plus en plus
fiables et de moins en moins chères et de protocoles d’hybridation et d’analyses standardisées
rendent cet outil indispensable à tous les domaines de la biologie. Enfin, le champ
d’application des puces à ADN n’a cessé d’augmenter. À l’heure actuelle, les puces à ADN
permettent de mesurer les variations du génome, du transcriptome, de reséquencer un gène ou
bien de caractériser les sites de fixation d’un facteur de transcription sur la chromatine.
Aspects technologiques :
Les puces à ADN sont un réseau de sondes très dense déposé sur une surface solide. Ces
sondes sont hybridées avec l’ADN (ou l’ADN complémentaire) que l’on cherche à mesurer.
Cet ADN à doser est marqué par de la radioactivité, une enzyme, de la fluorescence ou de la
biotine. . . Le signal obtenu sur chaque sonde de la puce reflète l’abondance de la séquence
complémentaire dans l’ADN à doser (Fig. 5).
Les sondes utilisées pour fabriquer ces puces à ADN peuvent être des clones d’ADNc, des
plasmides, des produits de PCR ou des oligonucléotides de synthèse. Ces sondes sont
déposées sur le support de nylon, de verre, de silicium. . . au moyen de robots de dépôts
utilisant des pointes pleines, des plumes avec réservoir, des imprimantes à jet d’encre ou bien
sont synthétisées in situ.

Figure 5 : Principe des puces à ADN.

Une puce à ADN est un réseau régulier et très dense de sondes d’ADN déposé sur un
support solide. Chaque sonde est spécifique d’un gène donné. Elle est hybridée avec de
l’ARN provenant d’un échantillon biologique, réverse-transcrits et marqués. Le signal
observé sur chaque sonde reflète l’abondance dans l’échantillon biologique étudié, de
l’ARN correspondant à cette sonde. 5
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray
L’application la plus habituelle des puces à ADN est la mesure du transcriptome, c’est-à-dire
la mesure du niveau d’expression de l’ensemble des gènes d’un génome. Cela en fait un outil
majeur de la génomique qui vise à étudier les génomes en terme de séquence (et de variation
de séquence) et de fonctionnement (d’expression). L’étude du transcriptome d’un échantillon
biologique permet de caractériser des signatures caractéristiques de cet échantillon.

Applications des puces à ADN :

Il existe de très nombreuses applications des puces à ADN. Les puces à ADN permettent de
cribler des banques génomiques ou d’ADNc ou bien de caractériser leurs clones par
empreintes d’oligonucléotides. Elles permettent de mesurer l’expression des gènes, mais aussi
de caractériser la taille des ARN messagers en hybridant sur différentes puces les différentes
fractions d’un gel d’électrophorèse. Elles permettent aussi de détecter et de valider les gènes
dans un génome ou une région génomique. Pour cela, une puce à ADN comportant des sondes
régulièrement réparties sur la séquence à tester est hybridée avec des ARN provenant de
différents tissus.
Ces hybridations mettent en évidence les régions transcrites et la cohérence des signaux
obtenus avec les différents tissus permet de déterminer si plusieurs régions voisines transcrites
proviennent d’un seul ou de plusieurs gènes. Au niveau de l’ADN, les puces à ADN
permettent de déterminer des délétions ou des amplifications de régions chromosomiques
par hybridation génomique comparative (CGH) sur des puces couvrant la région à tester au
moyen de sondes régulièrement réparties.
Plus de 60 000 échantillons d’ADN différentes peuvent être déposés sur une puce d’ADN, ce
qui représente des milliers de gènes.
Les puces à ADN sont préparées sur de petites plaques de verre divisées en très petites
surfaces appelées puits (petits carrés). Dans chaque puits, des copies d’une sonde synthétique
d’ADN spécifique, d’environ 20 nucléotides de longueur, sont attachées au verre. Les puits à
puce peuvent ainsi contenir différentes combinaisons de nucléotides, aussi bien des allèles
normaux que divers allèles mutés de gènes donnés. Sur une rangée de puits, la séquence de la
sonde synthétisée diffère d’un nucléotide d’un puit à l’autre. Ainsi, un ensemble de 4 puits (un
pour chaque nucléotide) est nécessaire pour tester le contenu nucléotidique en une position
donnée de la molécule d’ADN. Les générations actuelles de puces contiennent entre 280 000
et 560 000 puits, mais des puces avec plusieurs millions de puits sont testées.
Pour utiliser une puce à ADN en diagnostic génétique, de l’ADN du patient est extrait et des
gènes sélectionnés sont amplifiés par PCR. Les produits de PCR sont marqués avec un ou
plusieurs fluorochromes, dénaturés en simple-brin et appliqués sur la puce. Les produits de
PCR dont la séquence nucléotidique est exactement complémentaire à celle de la sonde
déposée sur la puce, s’hybrideront et ceux qui ne trouveront pas de séquences
complémentaires seront éliminés. La puce est ensuite balayée par u rayon laser qui induit une
fluorescence sur les puits où une hybridation a eu lieu. L’ensemble de ces zones de
fluorescence forme le motif de fluorescence de la puce. Un logiciel associé analyse le motif
d’hybridation et les données peuvent être présentées sous plusieurs formes (voir Figure ci-
dessous).

6
Univ Blida I. FSNV M1 Microbiologie
Techniques de base de BM Séquençage de l’ADN et Microarray