Université 08 mai 1945
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers. .
Département : Ecologie et Génie de l’environnement.
Master 2 : Microbiologie Appliquée
Module : Interactions plantes-microorganismes.
TP 01 : Les Endomycorhizes
Introduction :
Les champignons mycorhiziens forment des symbioses avec les racines d’environ 95 % des
plantes terrestres. Les différents types de mycorhizes qui existent se distinguent à la fois par
les groupes taxonomiques des partenaires symbiotiques impliqués et par les structures
typiques formées par la symbiose.
Parmi les mycorhizes, celles à arbuscules constituent la symbiose végétale la plus répandue
dans la nature, du fait de leur ubiquité et du nombre élevé d’espèces végétales concernées
(environ 80 % des plantes supérieures peuvent former ce type de symbioses). A ce jour on
dénombre environ 120 espèces de champignons capables de former ce type de mycorhizes; ils
appartiennent tous aux Gloméromycètes et ne peuvent être cultivés seuls (en l’absence de la
plante hôte). Leur cycle biologique dans le sol repose entièrement sur la présence de racines
vivantes de la plante hôte.
Principe :
Afin de pouvoir observer des structures mycorhiziennes, on procède d’abord à la décoloration
des parois cellulaires des deux partenaires symbiotiques, puis à la coloration des parois des
cellules du champignon grâce à un colorant de la callose qui est un glucane majeur de celles-
ci. Plusieurs types de colorants peuvent être utilisés : fuschine acide, CBE, trypan blue et le
bleu de méthylène.
Matériel et produits :
- Racines d’une fraichement récoltées.
- Solution de décoloration : KOH à 10%.
- Solution de coloration : 5% Bleu de méthylène, 5% acide acétique.
- Ethanol 70%.
- Eau distillée acidifiée avec 1% d’acide acétique.
- Scalpels.
- Pinces.
- Tubes à essai.
- Béchers avec entonnoir.
- Plaques en verre.
- Papier absorbant.
- Lames et lamelles.
- Microscopes.
- Bain-marie à 95°.
Mode opératoire :
- Laver précautionneusement les racines et prendre les plus jeunes, les couper à une longueur
de 4 - 5 mm.
- Mettre les morceaux de racine dans un tube à essai contenant de la potasse 10 % et porter au
bain-marie à 95° C pendant 30 min.
- Jeter la potasse et rincer avec l’eau acidifiée pour neutraliser.
- Verser environ 2 ml de la solution de coloration dans chaque tube et porter au bain marie à
95° pendant 15 min.
- Elever l’excès de colorant avec de l’éthanol à 70% (un bref lavage).
- Jeter l’éthanol et laver à l’eau acidifiée.
N.B : Ces deux dernières étapes peuvent être répétées plusieurs fois si les échantillons sont
fortement colorés.
- Monter dans une goutte d’eau entre lame et lamelle et observer au microscope.
Résultat attendu :
Le bleu de méthylène marque le champignon mycorhizien, présent dans tout le parenchyme
cortical, sans jamais entrer dans le cylindre central (a). On distingue des arbuscules à
l’intérieur de certaines cellules racinaires (structure d’échange entre partenaires) et des
vésicules entre les cellules (souvent, une goutte lipidique dedans : c’est une structure de
réserve pour le champignon). On voit parfois aussi des hyphes externes, qui ne sont jamais
cloisonnés (b). Il s’agit donc d’une endomycorhize à arbuscules.
Ci-contre: Résultat standard de
la coloration d’endomycorhizes
a) vue d’ensemble ; b) détail avec
arbuscules et vésicule ; c) très
bonne vue de détail d’un arbuscule
dans une cellule végétale.
