N° d'ordre : 2340

THESE

Présentée pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

École Doctorale: Science des Procédés

Specialité : Sciences des Agroressources

Par

Abraham ENDRIAS

Bio-raffinage de plantes aromatiques et médicinales appliqué à

l'Hibiscus sabdarifJa L. et à l'Artemisia annua

Soutenue le 22 mai 2006 devant le jury composé de

M. BASSENE Emmanuel Rapporteurs

Professeur: Faculté des Sciences Pharmaceutiques de Dakar

M. KARMOUS Tijani
Maître de Conférence: Faculté des Sciences de Bizerte
,

Mme FOURASTE Isabelle

Professeur émérite: Faculté des Sciences Pharmaceutiques Président
de Toulouse

'
M. TREILHOU Michel
Professeur: Université Jean-François Champollion Albi Membre

M. MOULOUGUI Zéphirin
Directeur de Recherche: INRA à l'INP-LCA-ENSIACET-Toulouse

M. TALOU Thierry
Ingénieur de Recherche: INP-LCA-ENSIACET- Toulouse

M. BESSIERE Jean-Marie Invité

Professeur Honoraire: ENSC de Montpellier

Mme LAQUIEZE Brigitte

Directrice de l'ENFA Toulouse

M. PROVENDIER Damien
Conseiller Scientifique NOMAD RSI Toulouse

'
Directeur de thèse
A mes Parents
Remerciements

Mes remerciements vont spécialement à Mr. Kraemer pour son aide lors du commencement
et pendant cette thèse. Sans son appui, ce projet n aurait pas eu lieu.

Je remercie chaleureusement à Michel Treilhou pour avoir accepté de diriger cette thèse et la
confiance qu'il m'a témoignées au cours de dernières années de thèse.

Je remercie à ML T. Talou, d'avoir encadré le projet AUF et Particulièrement de m'avoir

donné l'occasion de voyage au cambodge.

Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Mr. Z. Mouloungui pour avoir encadré mon travail
sur les huiles végétales, et pour m'avoir fait partager son expérience de la lipochime, et pour
le financement une partie de ce travail, et aussi de son soutien et encouragement. J'ai tout
particulièrement apprécié sa rigueur et son dynamisme.

J'adresse mes sincères remerciements à Mr. E. Bassene et Mr T. Karmous pour l'honneur

qu'il m'a fait d'accepter d'être rapporteur de cette thèse.

J'exprime mon profond respect et ma reconnaissance à Mme I. Fourasté, qui a accepté de

juger ce travail.

Je remercie Mme B. Laquieze de m'avoir fait l'honneur d'assister à ma soutenance.

Un grand merci à tout l'équipe du Nomad RSI Toulouse, et Nomad Cambodge pour
son accueil chaleureux durant ces années, qui a su créer une ambiance très sympathique d'entraide.

Je tiens également à exprimer ma plus vive reconnaissance à D. Provendier, je le remercie

pour son suivi permanent, ses conseils judicieux, ses grandes qualités humaines et le soutien
qu'il m'a constamment apporté en me faisant profiter de ses compétences et de son
enthousiasme.

La qualité des données présentées dans cette thèse sont le fruit d'un travail d'équipe sur le
terrain (au Cambodge) avec la collaboration de nombreux acteurs . . . .Nicola, . Damien,
Sarang, Calum, Net, Antoine et Sophal merci à vous tous.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à M. Cerny pour son amitié et son soutien
inconditionnel, Je te remercie pour ton aide précieuse.

Je souhaite exprimer toute ma gratitude à J. Roche pour ses conseils avisés notamment
concernant les analyses statistiques et la rédaction scientifique.

Merci aussi à tous mes collègues thésards et amis du laboratoire. Pour sa convivialité et pour
le bon accueil qu'ils m'ont réservé. J'en garde un très agréable souvenir :
Florina, Yaocihuatl, Céline, Lucita, Aurélie, Delphine, Philippe Micone., Julien, Mathieu
M., Phillipe E., Fabien, Laurent, Matthieu B., Oilivier, Azeddine, Virginie, Laure,
Géraldine, Christine, Brigitte, Marjorie, Anne, Catherine, Michel L, Didier N., Jérôme,
Antoine, Eric, Philippe M., Didier D., Sam, Samedy, Almu, Léon, Jesns, Colin, et Olaf.
A tous les amis qui de prés ou de loin ont rendu plus facile la réalisation de ce travail, :
Dorin, Brocher, Laurence Berdot, Eric Roskam, Kathleen Knabb, Ninfa Redman, Cati
Blanche, Own Goods, and (The Gross family), Fredman, Maya, Sarah and Claribel.
A la famille Bourges (Rabastens) Alain, Christine, Helen, Damien et Slyvan.

Je remercie profondément de tout cœur à Kira Sosnina pour ton grande patience et soutien au
moment les plus difficiles.

Une pensée sympathique à ma soeur Jerry Thurston, de m'avoir supporté et aidé.

INTRODUCTION GENERALE

CHAPITRE 1 Etude Bibliographique

Les plautes aromatiques et médicinales, généralités

CHAPITRE II Hibiscus sabdariffa L.

CHAPITRE liA Rappel bibliographique
CHAPITRE liB Matériel et méthodes
CHAPITRE IIC Résultats et discussiou
Cl. Les calices d'Hibiscus sabdarifJa: extraction et caractérisation
C2. Les graines d' Hibiscus sabdarifJa: extraction et caractérisation des
huiles

CHAPITRE III Artemisia annua L.

CHAPITRE IlIA Rappel bibliographique
CHAPITRE IIIB Contexte du projet de coopération scientifique inter-universtaire
CHAPITRE IIIC Matériels et méthodes
Cl. Essai de mise en culture au Cambodge
C2. Essai de mise en culture au Sénégal
C3. Méthodes d'analyses
CHAPITRE IIID Résultats et discussion
Dl. Cambodge
D2. Sénégal

CONCLUSION GENERALE ET PERESPECTIVES

ANNEXES

1
 SOMMAIRE

SOMMAIRE

Introduction Générale ... .. .... . ..... . . . . . . ...... . . . ...... ... . . . . . ..... .. . . . . .

. .. . ... ........ . .
.... ........... .1 0
Chapitre 1 - Etude bibliographique

1.1 Les plantes aromatiques et médicinales, généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.1.1 Identité botanique ............... ......... . . . . . ...... . ... . . ..... . ... .... . ...... .. ....... ... 1 4
.

1 . 1 .2 Culture .... . . . . . . . ...... . .

. ........ . .. . ....... . . . . . . ............... . .
. . .... . ......... ........... 14
1.1 .3 Choix du site de culture ..... . . . . . . . . .... ....... . . .... . .... .... ... ...... . ...... . .
. . . ..... . 14
U.4 Environnement naturel et impact social . . . . . . . ...... .. . . .. ..... . ......... . .. . .......... . 15
.

1 . 1.5 Climat . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . .... . . .. . . . . . . . . . 1 5

1 . 1 .6 Sol. .. ............ .................. . ...... . . . . . ...... . . . . .. ... . ....... . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . 15

LI. 7 Période de récolte et techniques de cueillette .. . . . . . . . . ... . . . .. . . ... . ... . ... . .......... 16
1. 1 .8 Séchage . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 1 6

U.9 Conservation . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . .....1 7

1.2 Les huiles essentielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...............................17

1.2.1 Localisation des huiles essentielles... . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . ..... . .. . . ... . . . 1 8

1.2.2 Composition chimique . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . ... . . 1 8

1 .2.3 Propriétés physiques . . . . ........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . '" . . . .. . . . . . . . . . ... . . . . ... . . . . . . . .....2 1

1.2.4 Activités biologiques des huiles essentielles ........ .. . .. ....... . ... .. ....... . .
. ... . . 21
..

1.2.5 Procédé classique d'extraction des huile essentielles . . . . . . . . . . . . ...........................22

1.2.6 Principe de l'entraînement à la vapeur d'eau des huile essentielles . . . . ... . ....... . 22

1.3 Extraction par un solvant organique volatil.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ... . . . . . .. ....................23

1.3.1 Pouvoir de solubilisation .. .. ..
.. ..... . . . ... . ..
. .... .. . . . ....... . . . . ... . ... . ....... . . . . . . . . 24
1.3.2 Le pouvoir extractif. . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 25

1.3.3 L a capacité d e pénétration...... . ... . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . ....... . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . ....25

1.4 Composition des huiles végétales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......................... 26

1.4. 1 Les acides gras . . . . . .. . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.4.2 Les différents acides gras naturels.... . . ... . . . .... . . . . . . . . . . .... . .. . . . .. . ... . . . . . . .......27

1.4.2. 1 . Acide gras saturés . . . . . . . . . . ..... . . . . . .. . . .... . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . .........................28

[Link] Acide gras insaturés . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . ..... 28
[Link] Acide gras poly-insaturés . . . . ... .. . . .... . . .. . . . . . . . ... . . '. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . .. 30

2
 SOMMAIRE

1.4.3 Les glycérides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 30

1.4.4 Les phospholipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3 1

1.4.5 Les cérides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . .... . ...... 32

1.4.6 Les stérols . . .......... . . . . ............. . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .......... .32
1.4.7 Les Tocophérols ............ . . . ............ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .34
Références bibliographiques .......... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... . ......... .37

Chapitre II-Hibiscus sabdariffa L

Etude comparative et caractérisation chimique de l'espèce Hibiscus sabdarijJa

perspectives de valorisation.

Chapitre lIA Rappel bibliographique-Hibiscus sabdarifJa . . . . .. . . . . . . . . .. . . ... 42.

IIA . I Autres dénominations . . . . . . . ........... . . . . ........... .. . . .............. . .......... . . . . . ... .42

IIA .2 Description botanique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . .. .43
IIA. 3 Présentation de la plante ..... . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... . . . . .43
IIA. 4 Culture de l'Hibiscus sabdariffa . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . . . .44
IIA. 5 Les Calices ... ........ . ............ .......... . . . . . . . . . . . .............. . ............ . . . . . . . ... 44
IIA. 6 Les Graines ...... ....................................... . ............ . . . . . . . . . . ..... . ........ .45
IIA. 7 Les Feuilles ........... . .............. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . ..... .46
IIA. 8 Utilisations médicinales du Hibiscus sabdariffa ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........ .47
IIA. 9 Les marchés des tisanes à partir des calices d'Hibiscus sabdariffa L. . . . .. . . . . . . . .48
IIA. 10 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . .............. .......... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .... 50
Chapitre lIB. Matériel et méthodes

lIB.! Détermination de la teneur en matière sèche des calices et des graines d'
Hibiscus sabdarijJa . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 52
lIB. 2 Méthode d'extraction et analyses à partir des calices d'Hibiscus sabdarijJa . 52 .

IIB. 2.1 Procédé classique d'extraction: Hydrodistillation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... ...... 52

IIB. 2.2 Conditions opératoires d'hydrodistillation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . 53

IIB. 2.3 Distillation -Extraction Simultanées (D.E.S), (Likens-Nickerson) . . . . . . ..... . . . . . 53

IIB. 2.4 Extraction par Soxhlet. ..... . ............... . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 55

IIB. 2.5 Macération ... . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 56

IIB. 2.6 E.M.A.U.S (Extraction, Macération Assistée par UltraSons) .......... . . . . . . ....... 56
IIB. 2.7 Conditions d'analyse de CPG/SM des calices d'Hibiscus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 56

3
 SOMMAIRE

IIB.3 Détermination de la composition des huiles d'hibiscus sabdariffa

IIB.3.1 Méthode d'extraction à partir des graines de l' Hibiscus [Link] a . . . ............ . . . . 57

IIB.3 . 1 . 1 Extraction à chaud au Soxhlet.. . . . . . . . . .... . . . . . . . ....... . . .... . . .... . . . . .. . ... . . . . . .... 57

IIB.3.l.2 Extraction à froid (par centrifugation) . . . . . . . ... . . . .. ..... . . . . . . ... . . . . . . . . .. . . ... . . . . . . 57

IIB.3.l.3 Accelerated solvent extractor (ASE 200 Dionex) . . . ... . . . .. . . . . ... .... . . . . . . . . . . .....58

IIB.3.2 Caractérisation des propriétés physico-chimiques de la qualité des huiles

d'Hibiscus sabdarifa f ............... . . . . ................ . . .................... . . ............. ..... 59
IIB.3.2.1 Indice de saponification . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 59
IIB.3.2.2 Indice d'acide . . . . . . . . . .... ....... . ... . .. . . . . ..... . .... . . . ...... . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . ... . . . . 60
IIB.3.2.3 Indice d'iode . . . . . . . . . . . . ........... . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . ... 60
IIB.3.2.4 Mesure de la densité . . . . . . . . . . . . . ...... ... . . . ..... '" .. . . . . . . . . . . .... . . ... . . . ..... . . .. . . . 6 1
IIB.3.3 Détermination de l a composition chimique des huiles d'Hibiscus sabdariffa.61
IIB.3.3.1 Analyse des acides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . ... . . . . . ...6 1
IIB.3.3.2 Dosage des esters méthyliques d'acides gras par CPG . . . . . . . . . .. . . . ..... . . . . . . . ..... 62
IIB.3.3.3 Conditions d'analyse du profil d'acides gras... . . . . . . . . . ... . . . ..... . . . . . . . ... . . . . . .... 62
IIB.3.3.4 Détermination de la teneur en phytostérols . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . ... . . . . . . . 63
IIB.3.3.5 Analyses des stérols par CPG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .... . . . 63
IIB.3.3.6 Extraction de tocophérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .... . . . . . . .... . . .....64
IIB.3.3.7 Dosage par étalonnage externe . . . . . . . . . . . . ... .... ..... . . . .... . . . . . . . .. . . . ... . . . . . . . . ....64
IIB.3.3.8 Conditions chromatographiques des tocophérols (CLHP) . ... . . . . . . . . . ... . . . . . . .. . . 64
IIB.3.4 Détermination des cendres .............................................................. 65
IIB.3.5 Détermination de la teneur en protéines .............................................. 65

Chapitre IIC Résultats et discussion

IIC1 Analyse de huile essentielle extraite par l'hydrodistillation à partir du

calice ......................................................................................... 68
IIC l . 1 . 1 Etudes préliminaires sur l'hydrodistillation . . . . .. . . . . ... . . . . ..... . . . . .. . . . . . ... . . . . .... 68
IIC l . l .2 Résultats et discussion sur l'hydrodistillation .................................................... 69
IIC l . 2 Comparaison de l'efficacité extractive des différentes techniques et solvants . . . . 73
IICl. 2. 1 Résultats d'analyses par CPG/SM ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 76

IICl. 2.2 Conclusion . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . ..... . .... . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . .. . . .... . . . . . . . . . . ....... 84

IIC2. Extraction et caractérisation des huiles des graines de l'hibiscus ....... ............. 86
IIC2. 1 . 1 . Propriétés physico-chimiques des huiles . . . . . . .. . . . . ... . . . . . . .. .. . . . . . . . . ...... . . . .... 86

4
 SOMMAIRE

IIC2 .. 1.2 Composition en acide gras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............... 87

IIC2. 1 .3 Composition en stérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 90
IIC2 . 1 .4 Détermination des teneurs en tocophérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .... . . . . . . . 9 1
IIC2. 1 . 5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
Références bibliographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .... 94

Cha pitre III Artemisia annua

Etude agronomique et phytochimique pour le développement d'un traitement viable

accessible et efficace du paludisme au Cambodge et au Sénégal

IIIA.l Rappel bibliographique............................................. ................ ....................................100

. .

IIIA 1 . 1 Le paludisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 00
IIIA.1.2 Le cycle parasitaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1 0 1
IIIA. 1 .3 Morbidité et mortalité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1 02
IIIA.I.4 Répartition géographique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 03
IIIA.2 Artemisia annua, plante anti-paludique.........................................................................l04
IIIA.2. 1 Historique ........................... .......................................................... ...................... 105
IIIA.2.2 Description botanique .................................. . ................................................... . . 1 05
IIIA.2.3 Noms vernaculaires . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . 1 06
IIIA.2.4 Origine phytogéographique . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 1 06
IIIA.2.5 Utilisation des armoises . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 07

IIIA.3 L'Artémisinine. .... . . ... . .................. ........ ...... ..... ... . . . . . . . . . ................ . . . . . 107
.. . .

IIIA. 3 . 1 Structure, chimie et synthèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 07

IIIA.3.2 Artémisinine mode d'action et les dérivés d'artémisinine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
IIIA.3.3 Toxicité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II0
IIIA.3.4 Résistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... .III
IIIA.4 Méthodes de production .. ...... ... . .............. .......... . . . . . . . . . . ........... . . . ..... ......111
. .

IIIIA.4.1 Approche synthétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 12

IIIA.4.2 Approche biotechnologique. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... 1 1 2
IIIA.5. Les différents stades de croissance et le cycle biologique ........ ...... . . . ...... . . .......112 .

IIIA.5 . 1 La phénologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

IIIA.5.2 L'initiation de la floraison . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3

5
 SOMMAIRE

IIIA.5.3 La densité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 1 13

IIIA.5A Nutrition, fertilité et sol . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1 1 3
IIIA.5.5 Irrigation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 1 14
IIIA.5.6 La récolte et séchage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 1 14

llIA.6 Variations de la concentration en artémisinine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... .... 115

IIIA. 6.1 Selon les parties de la plante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 1 1 5
IIIA. 6.2 Les différentes lignées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 1 15
Références bibliographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . ... 1 1 6
Chapitre IIlB.1. Contexte du projet de coopération scientifique inter-universitaire

IIIB . 1 . Partenaires et thématiques de recherche . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1

IIIB.2 Essai de mise en culture d'artemisia annua par Nomad au Cambodge et
au Sénégal en 2002 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . ....... . . . . 122
IIIB.3 Le programme Nomad au Mondolkiri- Cambodge . . . . . . . . . . . . . . . . .. ..... . . . . . . ... 123
IIIB.3.1 La situation du paludisme au Mondolkiri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 23

IIIB.3.2 Caractéristiques géographiques et climatiques du Cambodge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

IIIB . 3.3 La zone d'étude : la province de Mondolkiri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 25

Chapitre IlIC Matériels et méthodes
IIICI. Essais de mise en culture au Cambodge
IIIC l . 1 . 1 Les graines d'A rtemisia annua ............ . .. . . . ... .............. . .... . ... . ....... . . 1 28
IIIC 1 . 1 .2 Sites de mise en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 28
IIIC 1 . 1 .2 . 1 Localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . 1 28
IIIC 1 . 1 .2.2 Le climat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 1 29
IIICl . 1 .2.3. Dispositif expérimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 130
IIIC 1 . 1 .2A L'analyse de sol (Cambodge) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 130
IIIC 1 . 1 .2.5 Résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1

IIIC.2. Essai de mise en culture au Sénégal

IIIC2. 2.1 Historique du projet. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

IIIC2. 2.2 L'obj ectifgénéral du projet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

IIIC2.2.3 La résistance aux antipaludiques au Sénégal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

IIIC2.2A Localisation de la mise en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 138

6
 SOMMAIRE

IllC2.2.5 Semis et élevage des plantules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . ...... 138

IIIC3. Méthodes d'analyses

IllC.3.1 Echantillonage du matériel végétal. . .... . . . ....... . .... . ... . . . . . . ......... .. . . . . . . . ... 141
IllC.3.2 Choix de la méthode d'analyse de l'Artemisia annua . .. . . . ... . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . 142

IIIC.3.3 Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)-Densitomètre .... 143
IllC.3.3 1 Extraction de Artemisia annua ...... . .
. . . ... . . . . . . ..
. .... .. ........ ... . . . . . . . .... .. ... 143
IIC.3.3.2 Solution standard . . . .. . . ... . . .... . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . ...... . ... . . . . . . ......143
IllC.3.3.4 Dosage de l'artémisinine par CCM et densitomètrie ...... . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . 145
IIIC.4 Analyses statistiques . . . .. . . . . . . . .. .... . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... .. 146

IIIC.5 Analyses des sols (Cambodge) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . ....... ..... ......146

IllC.5.1 Prélèvement et analyses de sols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 146

IllC.5.2 Granulométrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... .... 146

IllC.5.3 pH et conductivité électrique ....... . . . . . .. . . . .... . .. . . .... . .. ........ . ..... . . ... . ......146

IllC.5.4 La matière organique.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . ...... .. . ..... . . . . . .... 147

IllC.5.5 L'azote total par la méthode Kjeldahl. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . ...... ...... 147

IllC.5.6 La capacité d'échange cationique .... . . . . . . . .... ... .... . . .... . . . . . .......... . . ...... . . . 147

IllC.5.7 Dosage des micro-éléments : Fer, Cuivre, Zinc et Manganèse . . . . . . . . .......... ... 148

IIIC.6 Méthodes de distillation-extraction . . . . . . . . . . . . . .... . . . .. . . . . . . . . . ..... . . . . . . ..... ..... 148

IllC.6. 1 L'hydrodistillation . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . .... . . ........ . ..... . . . . . . . . .. . . . 148

IIIC.6.2 Conditions d'analyse de CPG/SM.. . . . . . . . ... . . . . . .. . . .... . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . ... 148

IllC.6.3 Méthode des indices de rétention - Identification des alcanes ... ... ........ . .... . . 149

Chapitre IIID. Résultats et discussion sur artemisia

IIID1.1 Cultivée au Cambodge . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .... . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

IIID 1.1 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . 151

IIID.1 . 1 . 1 Effets des modalités de culture sur la production d'artémisinine

extraite des fleurs.... . . . . . . . . .......... . .. . . . . . .. . . . . .. . .. . . ... . . .. . ... . ...................1 5 1
IIID. 1 . 1 .2 Effets des modalités de culture sur l a production d'artémisinine extraite
des feuilles . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . .... . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . 1 52
IIID 1 . 1 .3 Discussion . . . . . . ..... . . . . ... . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . 1 60

7
 SOMMA IRE

. Composés volatiles d'Artemesia annua extraits par hydrodistillation

IIID1 2 .. . . . . '" ... 1
. 61

. Conclusions
IIID1 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . ...... 163

IllD2. Cultivée au Sénégal .. .......... . .........

. ........... ...... . . ..... ....... . .. ............ 164

. . Date de récolte et nombre dejoùrs entre la transplantation et la récolte

IIID2 .1 1 . . . . ..165

. 1. Conclusion
IIID2 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . .167
Références bibliographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . 1. 68

Conclusions générales et perspectives ................................. . . . ............. 171

8
 Liste des abréviations

Liste des abréviations

ASE: Accelerated Solvent Extractor
A.U.F: Agence Universitaire de la Francophonie
C.N.M: Centre national de Malariologie
CPG: Chromatographie en Phase Gazeuse
H.N.I: Health Net International
FAO : Food and AgricuItural Organization of the United Nations.
FAME: Fatty Acid Methyl Ester
M.D.M.: Médecins du Monde
mUr: champ cultivé en langage Phnong (Cambodge)
O.M.S: Organisation Mondiale de la Santé
O.N.G : Organisation Non Gouvernementale
P.H.D: Provincial Health Department
RITAM: Research Initiative on Traditional Antimalarial Methods
RSI: Recherche et Soutien International
TBME: Terbutylméthylether
TMSH: Triméthylsulfonium hydroxyde

9
 Introduction générale

Produites dans de nombreux pays du monde sous des formes très variées, les plantes
aromatiques et médicinales sont une source intarissable de molécules intéressant le monde
industriel. Les molécules issues de ces plantes sont souvent assimilées à des principes actifs
possédant des propriétés spécifiques qui leur confèrent un caractère unique. Issues de la
biodiversité, ces plantes particulièrement recherchées sont adaptées à des pays dont
l'environnement et le climat facilitent leur culture. L'exploitation des molécules d'intérêt
n'est par conséquent possible que dans les pays où la population entretient et cultive ces
plantes depuis des décennies.
Hibiscus sabdariffa 1 ., une espèce végétale appartenant à la famille des Malvaceae,
pousse à l'état sauvage au Vietnam et donne lieu à des applications très variées dans le
domaine industriel, notamment celui des arômes, des colorants alimentaires et de la
génération des nouvelles boissons. Il est un candidat, par ses graines, à être une nouvelle
source d'huile végétale. Hibiscus sabdariffa 1 . n'est pas une plante spécifique du Vietnam.
On le trouve également en Afrique et en Amérique. On sait que la composition chimique des
huiles essentielles est parfois différente selon l'origine et la biodiversité de la plante (nature
du sol, climat et pratiques culturelles) et selon les méthodes d'extraction. Comme les fleurs
rouges d'hibiscus sont communément utilisées en Asie, en Afrique ou sur le continent
américain comme nourriture, colorant ou boisson, il nous a semblé intéressant de faire une
étude comparative des fractions aromatiques contenues dans les calices et des huiles végétales
contenues dans les graines d'hibiscus du Vietnam (Asie), du Sénégal (Afrique) et du Mexique
(Amérique).
L'objectif de cette étude est de déterminer les caractéristiques et la composition
chimique des fractions volatils et des « concrètes » extraites des calices, ainsi que des huiles
végétales extraites des graines d' Hibiscus sabdariffa en vue de leur valorisation à des fins
industrielles.

Une seconde plante a fait également l'objet de mon travail de thèse : c'est Artemisia
annua L. utilisée comme antipaludique dans bon nombre de pays en voie de développement.

JO
Selon l'organisation mondiale de la santé (OMS) (2000 ), le paludisme est la plus importante
infection parasitaire au monde, entraînant la mort de plus d'un million de persounes et en
infectant 500 millions par an. Malgré les efforts pour contrôler l'infection, la morbidité et la
mortalité n'ont pratiquement pas changé durant les 50 dernières années. La quinine et ses
dérivés ont été la principale source de traitement de la maladie pendant des siècles.
Cependant, aujourd'hui, face à l'augmentation de la résistance du parasite à ces médicaments
à base de quinine dans toutes les zones impaludées, une nouvelle molécule est utilisée,
l'artémisinine. L'artémisinine est extraite de la plante A rtemisia annua 1. pour la fabrication
du médicament : la synthèse par voie chimique n'est pas encore possible. C'est donc la
culture d 'Artemisia annua qui semble être la seule voie de production d'artémisinine.
Une autre approche consiste en une utilisation directe de la plante sous forme
d'infusion de feuilles. C'est la méthode traditiounelle qui est utilisée dans la pharmacopée
chinoise depuis plus de 2000 ans. Depuis 1997, l'organisation non gouvernementale (ONO)
Toulousaine, «Nomad» recherche et soutien international (RSI), a mis en place des projets de
recherche opérationnelle orientés sur cette maladie dans une zone fortement impaludée du
Cambodge, le Mondolkiri, où coexiste médecine traditionnelle et moderne et dont l'accès à

des soins efficaces est souvent difficile. Dans son objectif de recherche de solution permettant
d'améliorer la santé globale, tout en tenant compte le contexte local, «Nomad» a intégré la
culture d'Artemisia annua dans ses programmes. Ce projet s'inscrit dans le cadre d'une
coopération internationale entre «Nomad» et trois universités: le laboratoire de Chimie Agro­
industrielle de Toulouse, (INPT, France), la faculté de pharmacie de Dakar, (Sénégal) et
l'université d'agriculture de Phnom Penh, (Cambodge). Il a été financé par l'Agence
Universitaire de la Francophonie (AUF) qui permettra à des étudiants et chercheurs des 3
universités partenaires de se rencontrer et d'enrichir leurs connaissances.

L'objectif global du projet est de contribuer à la lutte contre le paludisme au travers de

recherches coordonnées sur les potentialités de production et d'utilisation de la plante
Artemisia annua. Ce type de recherche s'inscrit dans un objectif de développement
international car sa finalité est de permettre l'accès à des modalités de soins
géographiquement et financièrement accessibles pour les populations rurales du Cambodge et
du Sénégal.
Le projet consiste, d'une part, à établir les conditions de production les plus favorables
dans deux régions du Cambodge et du Sénégal dans lesquelles le paludisme est largement

11
prévalent et cOlmaît une résistance aux traitements classiques et, d'autre part, à initier des
recherches concernant l'extraction des composés actifs de la plante.

Le premier chapitre de ce mémoire propose une mise au point bibliographique des

différents aspects abordés dans cette étude, des généralités sur les cultures des plantes
aromatiques et médicinales, des propriétés physico-chimiques des huiles essentielles et de la
composition des huiles végétales.
Le deuxième chapitre est consacré à une étude comparative de trois variétés
d'Hibiscus sabdariffa d'origines géographiques différentes. Après un bref rappel
bibliographique et une présentation des matériels et méthodes nous avons, dans une premier
temps, comparé les rendements et les performances des méthodes conventionnelles
d'extraction telles que l'hydrodistillation, la D.E.S (Distillation Extraction Simultanées)
Likens-Nickerson, l'E.M.A.U.S (Extraction, Macération Assistée par Ultrasons), et
l'extraction par Soxhlet, ainsi que l'influence de la nature du solvant (eau, hexane,
cyclohexane et dichlorométhane). Dans une deuxième partie, une étude comparative des
extraits des graines des trois variétés de 1 'hibiscus incluant une caractérisation physico­
chimique et la détermination de la composition en acide gras des huiles a été également
menée. Puis, des dosages qualitatifs et quantitatifs des principaux composés de la fraction
insaponifiable de ces huiles ont été réalisés. Enfin, à l'aide des résultats obtenus, nous
tenterons de proposer des voies de valorisation potentielles des extraits des calices et des
grames.

Le troisième chapitre propose une première partie bibliographique mettant en lumière

les dernières découvertes autour du paludisme. Concernant, les traitements ainsi que
résistances et les espoirs apportés par Artemisia annua. Une deuxième partie est consacrée à

une présentation des matériels et méthodes et à une description du projet agronomique de

mise en culture d'artemisia. Enfin, une troisième partie présente les principaux résultats de
l'effet des différentes conduites agronomiques (techniques de plantation, site de culture,
variation des dates de récolte, et le stade phénologique . . . ) sur la production du principe actif
artémisinine en termes de pourcentage et rendements dans le cadre d'expérimentation au
Cambodge et au Sénégal. Ces résultats sont discutés en rapport avec le lieu et les
caractéristiques du lieu de culture.

12
 CHAPITRE 1

Etude bibliographique

13
 Chapitre l Etude bibliographique

1.1 Les Plantes Aromatiques et Médicinales. Généralités

1.1.1 Identité botanique.

L'identité botanique, c'est-à-dire le nom scientifique (geme, espèce, sous­

espèce/variété, auteur et famille) de chaque plante médicinale cultivée, doit être détenninée

ou définie et emegistrée. Le nom local et le nom commun français, s'ils existent, seront

également emegistrés. Toute autre infonnation pertinente, comme le mode de culture,

l'écotype, le chimiotype ou le phénotype, peut également être notée selon le cas.

En ce qui concerne les cultivars disponibles dans le commerce, le nom du cultivar et

celui du fournisseur doivent être indiqués. Dans le cas d'espèces primitives récoltées,

multipliées, disséminées et cultivées dans une région déterminée, on notera la lignée avec son

nom local, la source des graines, plantes d'origine ou autres matériels de multiplication[ll.

I.1.2 Culture
La culture des plantes médicinales requiert des soins attentifs et une gestion adéquate.

Les conditions et la durée de culture dépendent de la qualité des matières végétales

recherchées. S'il n'existe pas de données scientifiques publiées ou documentées sur la culture

des plantes médicinales, on suivra, là où c'est possible, les méthodes de culture

traditionnelles. Les principes de bonne gestion agricole, y compris par la rotation appropriée

des cultures en fonction de leurs exigences environnementales, devront être appliqués, et les
2
labours seront adaptés au développement des plantes et aux autres besoins de la culture [ l .

1.1.3 Choix du site de culture

La matière végétale dérivée de la même espèce peut présenter des différences

importantes de qualité d'un site de culture à un autre, du fait de l'influence du sol, du climat et

d'autres paramètres. Ces différences peuvent porter sur l'aspect physique des plantes ou sur

leurs constituants dont la biosynthèse peut être affectée par des conditions environnementales

extrinsèques, notamment par des variables écologiques et géographiques, et doivent être

prises en compte. Les risques de contamination du fait de la pollution des sols, de l'air ou de

l'eau, ou par des produits chimiques dangereux, doivent être évités. L'impact de l'utilisation

passée des sols sur le lieu de culture choisi, notamment les plantations précédentes et les
2
applications éventuelles de produits phytosanitaires, doit être évaluë .3l

14
 C hapitre l Etude bibliographique

1.1.4 Environnement naturel et impact social.

La culture des plantes médicinales peut affecter l'équilibre écologique et, en

particulier, la diversité génétique de la flore et de la faune des habitats environnants. La

qualité et le développement des plantes médicinales peuvent, à leur tour, être affectés par les

autres plantes, les autres êtres vivants et les activités humaines. L'introduction d'espèces non

indigènes de plantes médicinales, sous forme de cultures, peut avoir un impact défavorable

sur l'équilibre biologique et écologique de la région. Là où cela est réalisable, l'impact

1
écologique des activités de culture devra être surveillé dans le temps [ -3J.

1.1.5 Climat

Les conditions climatiques, par exemple la période de la journée, les précipitations et

la température extérieure, ont une influence sensible sur les qualités physiques, chimiques et

biologiques des plantes médicinales. La durée d'ensoleillement, la hauteur moyenne des

précipitations, la température moyenne et l'amplitude thermique entre le jour et la nuit

influencent également l'activité physiologique et biochimique des plantes. Il est important de

déterminer au préalable tous ces facteurs [4J.

1.1.6 Sol

Le sol doit contenir des quantités appropriées d'éléments nutritifs, de matières

organiques et d'autres éléments de façon à assurer à la plante un développement et une qualité

optimale. Les conditions pédologiques optimales - type de sol, de drainage, rétention de

l 'humidité, fertilité, pH - seront dictées par l'espèce de plantes médicinales ou aromatiques

choisies et lou par la partie de la plante que l'on souhaite récolter. Il est souvent indispensable

d'utiliser des engrais pour obtenir des rendements élevés. Il est toutefois nécessaire de

s'assurer, grâce à la recherche agronomique, que les types adéquats d'engrais sont

correctement utilisés ainsi que les quantités. Dans la pratique, on utilise des engrais

organiques et naturels. Mais, quels que soient les engrais utilisés, ils doivent être appliqués

avec parcimonie et en fonction des besoins de la plante médicinale cultivée et de la capacité

du sol. L'application devra être réalisée de façon à éviter au maximum le lessivage [6 -8J•

15
 Chapitre 1 Etude bibliographique

1.1.7 La période de récolte et les techniques de cueillette

Les propriétés des plantes dépendent essentiellement de la région de production, de la

période de récolte et des techniques de cueillette. La connaissance du calendrier des récoltes
et des techniques de cueillette et de conservation doit toujours être considérée afin de garantir
la qualité des produits. Les différentes parties d'une plante (racines, tiges, feuilles, fleurs,
fruits et graines) ont des modalités de croissance bien détenninées et chacune d'entre elles
renfennent, à des moments précis et en proportions variables, les différents éléments qui
conditionnent leur qualité et leur efficacité.

La cueillette doit toujours tenir compte des variations climatiques et saisonnières.

Ainsi, elle ne doit j amais se faire par temps de pluie afin d'éviter les risques de moisissure.
Pour déterminer les propriétés d'une plante, il est donc nécessaire de prendre en
considération, non seulement la partie utilisée mais aussi sa morphologie, sa couleur, sa
nature, sa saveur et ne pas s'arrêter sur un seul critère [7-9].

1.1.8 Le séchage
De la qualité du séchage va dépendre la conservation de la plante. La cueillette
tenninée, la plante est débarrassée de tout détritus indésirable, puis ses différentes parties sont
traitées de manière spécifique. Selon les catégories de plantes, les techniques de séchage
peuvent variées: séchage au soleil, séchage à l'ombre, séchage artificiel. Le séchage au soleil
est la méthode la plus simple et la plus économique. Il concerne surtout les racines, les tiges
ou les graines. Les feuilles vertes séchées au soleil j aunissent, les pétales de fleurs perdent
leurs couleurs vives, ce qui peut altérer les propriétés médicinales de ces produits. Les plantes
aromatiques, pour ne pas perdre leur parfum, ne doivent pas rester trop longtemps au soleil.
Les séchages artificiels doivent s'effectuer dans un endroit sec, à l'abri du soleil. Ils
conviennent particulièrement aux plantes aromatiques. Les séchages artificiels s'obtiennent à
l'étuve ou dans une chambre de séchage chauffée. Les fruits, qui contiennent beaucoup de jus,
ou les racines, riches en sucs, doivent être séchés rapidement à une température moyenne de
25-30° C [7-9].

16
 Chapitre l Etude bibliographique

1.1.9 La conservation

Au cours d'un stockage prolongé, les méthodes et les conditions de conservation

doivent permettre d'éviter toute modification de la nature des plantes (vermine, moisissures,

micro-organismes) afin de préserver l'intégrité de leurs propriétés actives. La qualité des

plantes aromatiques ou médicinales en dépend. C'est une étape importante dans la garantie

des propriétés des plantes étudiées ou utilisées.

Le développement des moisissures et des micro-organismes est favorisé par 1'humidité

pouvant provenir de la plante elle-même, d'une mauvaise aération du lieu de conservation ou

de l'humidité du sol. Ces facteurs qui peuvent accélérer les processus de fermentation ou

d'oxydation de certains constituants végétaux. La conservation dans un endroit frais évite, par

exemple, la dissémination des spores et la multiplication des parasites. Aussi, est-il souvent

nécessaire, dans un premier temps, de soumettre les produits récoltés au séchage par le soleil,

tout en sachant qu'un séchage trop prolongé au soleil modifie non seulement la couleur mais
lO
aussi la nature de ceux-ci [ l .

La conservation à l'abri de la lumière, dans des récipients en porcelaine, en faïence ou

en verre teinté, peut être nécessaire pour les plantes qui subissent des transformations

chimiques sous l'influence des ultraviolets. La conservation en milieu étanche peut être utile
[IO ll
pour les plantes qui s'oxydent rapidement ou qui contiennent des produits volatils , l.

I.2 Les huiles essentielles

Les parfums qu'exhalent certaines plantes sont dus à des molécules volatiles que l'on

désigne globalement par le terme "essence". L'huile essentielle correspond à l'extrait obtenu

par entraînement à la vapeur d'eau de l'organe végétal où a lieu le stockage de l'essence. Ces

composés volatils ont la propriété d'être solubles dans l'huile et les graisses et ont, de ce fait,

reçu le nom d'huile essentielle. Le terme "huile" souligne le caractère visqueux et hydrophobe

de ces substances.

1.2.1 Localisation des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont largement répandues dans le règne végétal avec des

familles à haute teneur en matières odorantes comme les co nifè res, les rutacées, les

my rtacées, les o mbellifè res, les lamiacées, les géraniacées etc.

17
 Chapitre l Etude bibliographique

Les essences peuvent être localisées dans des cellules sécrétrices isolées (cas des
lauracées et magnoliacées), mais on les trouve le plus souvent dans des organes sécréteurs
spécialement différenciés et variables suivant les familles botaniques. On peut citer, par
exemple, les poils sécréteurs des lamiacées, les poches sécrétrices des rutacées et les canaux
sécréteurs des conifères. L'appareil sécréteur peut être externe, comme dans bon nombre de
1
lamiacées, ou bien interne, comme c'est le cas pour les différents eucalyptus (myrtacées) [ 3,
14].

1.2.2 Composition chimique

L'huile essentielle est un mélange complexe de molécules odorantes. C'est un liquide

homogène, bien que constitué d'un assemblage hétérogène sur le plan chimique par la
diversité des structures présentes. Nous présenterons, au cours de ce paragraphe, les
principales familles de molécules odorantes.

Les composés terpéniques, quelle que soit leur provenance, sont issus de métabolites
secondaires de l'acide mévalonique. Leur structure est généralement formée par un nombre
entier d'unités (n), de méthyl-2-butadiène. Selon le nombre d'unités, nous pouvons réaliser la
classification suivante : Un grand nombre de composés naturels de la famille des terpènes
viennent des polymérisations et des remaniements d'un même précurseur l'isoprène, carbure
diénique à5 atomes de carbone :

représentaI!on simplifiée
2-mélhyl-I,3 butadiène
)0
1
�4
- 3
ou
isoprène

Figure1 : Molécule d'isoprène

• Pour n=2 : Les monoterpènes, ce sont des hydrocarbures aromatiques, en (CIO). Ils
peuvent être acycliques, monocycliques ou bicycliques. A ces terpènes se rattachent un
certain nombre de produits naturels à fonctions chimiques spéciales, surtout alcool et
aldéhyde, comme: l'ocimène (basilic), le myrcène (laurier) et le géraniol. Ces derniers
sont des monoterpènes acycliques, alors que le limonène et le pinène sont des
monoterpènes cycliques.

18
 Chapitre l Etude bibliographique

Limonène Ocimène u-pinène

Figure2: Exemple des composants monoterpéniques

• Pour n=3 : Les sesquiterpéniques. Ce sont des hydrocarbures aromatiques en (C1S),

comme les pinène, phellandrène, camphène, caryophyllène, humulène etc . . . .

CH3
H
,
,

H3C
H
CH(CHvl

�-Cadinan Eudesane

Figure.3 : Exemple des composants sesquiterpéniques

• Pour n=4: Les diterpènes. Ce sont des dérivés d'hydrocarbures aromatiques en

(C20). Ces composées, à point d'ébullition élevé, se rencontrent surtout dans les
résines.

�OH
Acide abiétique Vitamine A

Figure 4: Exemple des composants terpéniques

19
 Chapitre l Etude bibliographique

• Pour n=5: les sesterpènes. Ce sont des dérivés d'hydrocarbures, (C2S)

• Pour n=6: Les Triterpènes. Ce sont des dérivés d'hydrocarbures aromatiques en

'. '. ..
'>
..

Squalène

Figure 5 : Exemple des composants triterpéniques

·Pour n=8: Les polyterpènes. Le caoutchouc naturel dont les précurseurs sont des

stéroïdes, très répandus, notamment dans les résines, à l'état libre, estérifié, ou sous

forme hétérosidique.

'.

Caoutchouc naturel

Figure6 : Exemple du caoutchouc naturel

La formule brute des hydrocarbures terpéniques est donc (CsHs )n, famille de

composés se retrouvant beaucoup dans les huiles essentielles. Aussi, comme nous le verrons

par la suite, un grand nombre de composés oxygénés (alcools, cétones, acides, aldéhydes,

éthers, esters) [ 13, 14] entrent dans la composition des huiles essentielles.

1.2.3 Propriétés physiques

Malgré leurs différences de constitution, les huiles essentielles possèdent un certain

nombre de propriétés physiques communes. Elles sont généralement sous forme liquides à
température ambiante et leur grande volatilité les oppose aux "huiles fixes" (lipides).

Lorsqu'elles viennent d'être préparées, leurs teintes est généralement comprise dans une

gamme allant de l'incolore, à jaune pâle. Il existe toutefois quelques exceptions, comme

20
 Chapitre l Etude bibliographique

l 'huile essentielle de camomille romaine (Anthemis nobilis) qui possède une coloration bleu

clair due à la présence du chamazulène.

Leur densité est le plus souvent inférieure à l'unité. Seules 3 huiles essentielles

officinales ont une densité supérieure à celle de l'eau: il s'agit des huiles essentielles de

cannelle, de girofle et de sassafras. Elles possèdent un indice de réfraction souvent élevé et

sont douées de pouvoir rotatoire puisque constituées, pour l'essentiel, de molécules

asymétriques. Peu solubles dans l'eau, elles lui communiquent cependant leurs odeurs (eaux

distillées aromatiques). Elles sont solubles dans les alcools et dans la plupart des solvants

organiques. Elles sont très facilement altérables et sensibles à l'oxydation, mais ne rancissent

pas. Le caractère odorant des huiles essentielles est lié à la volatilité des molécules qui les
[1 4J
composent ce qui permet de les obtenir par entraînement à la vapeur d'eau

I.2.4 Activités biologiques des huiles essentielles

Les huiles essentielles possèdent de nombreuses propriétés thérapeutiques. En

phytothérapie, elles sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques contre les maladies
[151
infectieuses d'origine fongiques, contre les dermatophytes , celles d'origine bactériennes,
1 5 161 17
par exemple contre les bactéries endocanalaires[ , et au niveau de la microflore vaginale [ 1 .

Elles possèdent également, des propriétés cytotoxiques en tant qu'agents antimicrobiens à

large spectre. Dans des préparations pharmaceutiques, les terpènes phénoliques, comme le

thymol et le carvacrol, sont souvent utilisés comme antiseptiques, antibactériens et

antifongiques. Le thymol est très irritant, astringent et caustique.

La dose de thymol applicable sur la peau et les muqueuses est de 0 ,5 % . Ingéré à des
1 91
dose de 2 g ou plus, il est responsable de gastralgies et de nausées[ . Dans les domaines

phytosanitaire et agro-alimentaire, les huiles essentielles ou leurs composés actifs peuvent

également être employés comme agents de protection contre les champignons

201 211
phytopathologies [ , et les microorganismes envahissant des denrées alimentaires[ .

Les huiles essentielles les plus étudiées dans la littérature pour leurs propriétés

antibactériennes et antifongiques appartiennent à la famille des Labiatae: thym, origan,

lavande, menthe, romarin, sauge, etc. L'essence d'origan d'espagne est souvent citée comme
221
étant parmi les huiles les plus actives [ . Son composé majoritaire, le carvacrol, possède
[2 1
également une forte activité antimicrobienne 3 .

21
 Chapitre l Etude bibliographique

1.2.5 Procédé classique d'extraction des huiles essentielles.

En général les composants extraits à partir de matière végétale sont initialement

dissous ou en émulsion, dans la sève de cellules, bien que quelques huiles essentielles
puissent exister renfermés dans des poches à huile, sur des poils secreteurs, etc. Il est
nécessaire d'extraire ou d'isoler de la masse de la matière cellulaire inerte le complexe
d' odeur/saveur avec le minimum de transformations chimiques. Ceci peut être réalisé par
. plusieurs techniques selon la matière végétale initiale.

D'une façon générale, la distillation est un procédé de séparation basé sur la différence
de composition entre un liquide et la vapeur engendrée. La technique implique la
condensation de la vapeur et la récupération des fractions liquides résultantes. On parle de
distillation simple ou fractionnée lorsqu'il s'agit de liquides miscibles. On peut également
procéder à la distillation de liquides non miscibles. C'est le cas de l'hydrodistillation des
huiles essentielles [24].

1.2.6 Principe de l'entraînement à la vapeur d'eau des huile essentielles.

Le procédé, correspondant à nne distillation hétérogène, met en jeu l'application de
deux lois physiques .

• La loi de Dalton: La pression du mélange des vapeurs est égale à la somme des
tensions de vapeur des constituants.

H et E désignent respectivement l'huile essentielle et l'eau

Pr Pression totale
T= Tension de vapeur

. La loi de Raoult: Le rapport des quantités des entités distillées simultanément est
fonction de la tension et des densités des vapeurs (donc des masses moléculaires) à la
température de distillation choisie.

22
 Chapitre 1 Etude bibliographique

Mo/e H = TH
Mo/eE TE

T= Tension de vapeur

La relation de ces deux lois donne respectivement la pression totale et la composition

des vapeurs en fonction des pressions partielles, d'où le calcul du taux de corps entraîné ou
rapport d'entraînement :

M = masse molaire
P = poids
R = rapport d'entraînement

La température d'ébullition d'un mélange est atteinte lorsque la somme des tensions
de vapeur de chacune des constituants est égale à la pression d'évaporation. Elle est donc
inférieure à chacune des températures d'ébullition des substances pures. Ainsi, le mélange
eau/huile essentielle distillée possède une température inférieure à 100 oC à pression
atmosphérique (généralement proche de100 oC, en raison de la faible tension des constituants
odorants) alors que les températures d'ébullition des composés aromatiques sont pour la
plupart très élevées [2 4J ••

1.3 Extraction par un solvant organique volatil

Cette technique est la plus pratiquée avec 1'hydrodistillation. Elle consiste à épuiser la
matière première de ses constituants odorants au moyen d'un solvant, puis à chasser celui-ci
de l'extrait par évaporation sous vide. Il est existe deux cas particuliers, les hydrolats
(extraction par solvant en présence d'eau) et les alcoolats (extraction avec de l'éthanol dilué)
pour lesquels on récupère les composés odorants conjointement avec le solvant lors de la
distillation pratiquée pour éliminer l'eau présente dans les isolats. Le choix du solvant dépend
de nombreux paramètres techniques et économiques, notamment :

•
la sélectivité (pouvoir solvant),
•
la température d'ébullition (stabilité thermique des constituants),
•
la miscibilité dans l'eau,

23
 Chapitre l Etude bibliographique

•
la facilité de recyclage,
• la sécurité de manipulation : les solvants choisis seront, dans la mesure du
possible, non toxiques tant pour le manipulateur que pour le consommateur.

Les solvants les plus utilisés à l'heure actuelle sont surtout des hydrocarbures
aliphatiques (hexane, éther de pétrole), des hydrocarbures aromatiques (toluène), des alcools
ou des solvants carbonylés, et moins fréquemment des hydrocarbures halogénés
(dichlorométhane). La méthode d'extraction mise en œuvre dépend aussi de la nature de la
matière première végétale. On peut extraire soit à chaud, c'est-à-dire à température proche de
la température d'ébullition du solvant, soit à température ambiante. On travaille, en général,
dans un extracteur statique afin d'éviter la dégradation de la matrice végétale et la
solubilisation concomitante de composés indésirables [27l .

Les solutions aromatiques obtenues, appelées miscella, sont évaporées sous vide, à
température la plus basse possible afin d'éviter la dégradation des molécules odorantes. Le
solvant organique extrait également des composés indésirables, en particulier des matières
grasses (huile, cires, etc . . . .). Celles-ci sont d'ailleurs responsables de la dénomination
«concrète» qui traduit la tendance des produits à se solidifier à température ambiante. Un
traitement secondaire est donc nécessaire pour séparer les fractions aromatique et grasse. Il
consiste à entraîner, à l'éthanol, les composés aromatiques. Cette opération est pratiquée à
basse température (environ -20°C). On obtient, après évaporation de l'éthanol, un produit
I2
appelé «absolue» qui comporte la majorité des composés volatils [ l .

1.3.1 Pouvoir de solubilisation

Le pouvoir de solubilisation d'un solvant est relié à ses caractéristiques moléculaires,

définissant notamment sa polarité et son hydrophilie, utilisées en tant qu'indicateurs de
l'affinité chimique. Les caractéristiques de polarité et d'hydrophilie sont notamment révélées
par :
la présence de groupes fonctionnels dissociatifs,
•
le potentiel de liaison hydrogène et la faculté de mise en commun d'électrons,
•
l'affinité eau/solvant, soit la solubilité du solvant dans l'eau, soit la solubilité de
l'eau dans le solvant.

24
 Chapitre l Etude bibliographique

Cette approche sur l'efficacité extractive des solvants se justifie d'autant plus qu'elle
concerne des substrats végétaux dont la teneur en eau peut atteindre 80 % pour les matières
fraîches. L'affinité eau/solvant conditionne la diffusion dans les tissus riches en eau
interstitielle et dans les cellules où l'eau libre est abondante. En entraînant l'eau libre, le
solvant modifie l'assemblage cellulaire et entraîne les métabolites solubles dans l'eau [27].
De plus, la solubilisation peut atteindre l'eau structurelle qui participe à l'intégralité des
tissus. Cette action prime sur les facteurs intervenant sur le pouvoir extractif, notamment lié à
la diffusion, en relation avec les propriétés physiques du solvant. Par sa qualité déstructurante,
elle a comme incidence d'assurer la diffusion du solvant dans les tissus végétaux. Un exemple
de cette interaction pour l'éthanol, qui a une grande affinité pour l'eau. Il déstabilise
l'interaction hydrophobe responsable de la structure tertiaire des molécules protéiques ou
lipoprotéines présentes dans les membranes cellulaires.

En ce qui concerne l'affinité vis-à-vis de l'eau, deux facteurs sont à prendre en

compte : la solubilité du solvant dans l'eau et la solubilité de l'eau dans le solvant. Ces
facteurs interviennent vraisemblablement sur la diffusion des produits à l'intérieur du contenu
cellulaire, notamment la solubilité dans l'eau pour la circulation du solvant dans les milieux
hydratés. La solubilité de l'eau et sa polarité sont plus particulièrement déterminants pour
prévoir le pouvoir du solvant vis-à-vis des composés hydrophiles dans un milieu hydrophile.

1.3.2 Le pouvoir extractif

L'estimation de l'efficacité d'un solvant ne peut être réduit aux seules propriétés
chimiques de polarité et d'affinité vis-à-vis de l'eau. Nous devons également tenir compte des
propriétés physiques déterminant la capacité du solvant à pénétrer dans une matrice poreuse.
Le pouvoir extractif est défini par la capacité du solvant à pénétrer et à diffuser dans la
structure végétale de façon à rencontrer et entraîner les molécules cibles. Evidemment, ce
dernier processus suggère la solubilisation des molécules. Il est clair que les notions de
pouvoir solvant et extractif, ainsi que de sélectivité chimique, sont liées les unes aux autres
par les caractéristiques chimiques et physiques des solvants [27]. Nous tenterons d'évaluer le
pouvoir extractif selon deux composantes, eux-mêmes liées, aux deux paramètres indiqués
ci-dessous:
•
tension superficielle et viscosité
• capacité de pénétration

25
 Chapitre l Etude bibliographique

1.3.3 La capacité de pénétration

La faible tension superficielle d'un liquide, dans lequel on immerge une matrice solide

poreuse tel un substrat végétal, permet un bon mouillage des pores, surtout si ces pores sont

de petites dimensions. La pénétration du liquide est plus efficace, notamment s'il s'agit d'une

matière à organisation cellulaire. Si la viscosité du liquide est peu élevée, il bénéficiera d'un
27]
bon écoulement dans les spores et circulera naturellement dans les espaces intercellulaires [ .

En ce qui concerne la tension superficielle des solvants utilisés généralement dans

l'extraction, nous remarquons qu'elle est faible pour l'hexane le dichlorométhane et le

Toluène (Tableau . l ). Nous pouvons constater, dans le Tableau l , que la valeur de la viscosité

de l'hexane est la plus basse par rapport aux autres solvants qui sont très utilisés lors de
[2 2
l'extraction de composants issus de la matière végétale 8, 9] .

Nous pouvons aussi considérer l'effet du volume moléculaire des solvants sur leur

absorption si nous estimons que le diamètre des pores des matrices végétales est faible. Dans

l'hypothèse où cette caractéristique intervient effectivement en tant que facteur limitant à la

pénétration des solvants, nous constatons que la molécule ayant les plus faibles viscosité et

tension superficielle a un volume moléculaire plus élevé et inversement.

Solvant n-Hexane Cyc\ohexane Toluène Dichlorométhane

Masse moléculaire 86, 1 8 84, 1 6 92, 14 84,93

Densité 0,663 0,789 0,866 1,33

Solubilité
(g/I OOml) à 0,07 0.09 0,053 1 ,63
20°C dans l'eau

Tension
Superficielle 1 8,4/20°C 28,5120°C 28,2/20°C
(dynes/cm2)

Viscosité (cR)
' '
(g cm' I sec' ) 0,326/20°C 0,580120°C 0,425/20°C

Température 68,95 81 1 1 0.6 39-40

d'ébullation (oC)

Tableau1 : Caractéristiques physico-chimiques des solvants utilisés dans l'extraction

des composants aromatiques et médicinaux

26
 Chapitre l Etude bibliographique

1.4 Composition des huiles végétales

Les corps gras d'origine végétale sont essentiellement des glycérides (98 à 99 %). Une
fraction quantitativement mineure, appelée fraction insaponifiable, est également présente
dans ces corps gras. D'autres composés n'appartenant pas à ces deux catégories peuvent y être
présents dans de faibles proportions : les cérides, les chlorophylles et les produits d'altération,
issus de la dégradation des triglycérides durant le stockage.

1.4.1 Les acides gras [30,31 l

Les acides gras sont des molécules peu abondantes sous forme libre dans les matières
grasses fraîches. Ce sont des acides carboxyliques à chaîne aliphatique hydrophobe, saturés
ou non saturés, selon qu'ils contiennent ou non des doubles liaisons. Ils sont notés Cn : m où n
représente le nombre d'atomes de carbone et m est le nombre de doubles liaisons. Les acides
gras sont donc diffèrents entre eux non seulement par la longueur de la chaîne carbonée, mais
aussi par le nombre, la position et la structure spatiale (cis, trans) des doubles liaisons. La
longueur de la chaîne carbonée permet une classification des acides gras volatils avec 2, 3 ou
4 atomes de carbone ; les acides gras à chaîne courte qui possèdent entre 6 et 10 atomes de
carbone ; les acides gras à chaîne moyenne, avec 12 à 1 4 atomes de carbone et les acides gras
à chaîne longue avec plus de 15 atomes de carbone.

1.4.2 Les différents acides gras naturels

1.4.2. 1 Acides gras saturés

L'acide palmitique est un acide gras à chaîne longue, le principal produit de la

synthèse des lipides dans les cellules animales. On le symbolise souvent par les nombres
C 1 6 : 0 pour indiquer qu'il a 1 6 atomes de carbone et aucune liaison é[Link]énique : c'est un
acide gras saturé. Il est présent sous la forme d'un solide blanc, qui fond à 64°C. Son nom
provient de 1 'huile de palme, mais il est abondant dans toutes les graisses et huiles animales et
végétales. C'est un excellent aliment énergétique. Industriellement on utilise l'acide
palmitique pour la fabrication des margarines et des savons durs.

Figures 7: L'acide palmitique (C 1 6 : 0)

27
 Chapitre 1 Etude bibliographique

L'acide stéarique, est un autre acide gras saturé à chaîne longue, qu'on symbolise par
les nombres 1 8:0. Il est également un solide blanc, qui fond à 70°C. Il est abondant dans
toutes les graisses animales (surtout chez les ruminants) et végétales.

CH CH CH CH CH CH CH CH CH

18 \/'\/'\/'\/'\/'\/'\/'\/'\
CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH, 1 COOH

Figure 8 : L'acide stéarique (C1 8 :0)

[Link] Acide gras mono-insaturés

L'acide oléïque, est le plus abondant des acides gras à chaîne longue dans l'organisme
humain. Il est symbolisé par les nombres 1 8 : 1 . L'acide oléique est donc un acide gras
insaturé, plus précisément monoinsaturé. A la température normale du corps humain, il se
présente sous la forme d'un liquide (huile). Il ne se solidifie qu'à 4°C. Son nom provient de
l'huile d'olive, mais il est abondant dans toutes les huiles animales et végétales.

n n - 6 n - 9

Figure 9: L'acide oléique [CI 8 : l (n-9)]

[Link] Acide gras Poly-insaturés

L'acide Iinoléïque est un acide gras à chaîne longue, présent dans les huiles végétales.
On le symbolise par les nombres 1 8:2. C'est un acide gras insaturé, et même polyinsaturé.
A la température de notre corps, c'est un liquide (huile) qui ne se solidifie qu'à -12°C. En
présence d'air, il s'oxyde rapidement (rancissement). Son nom vient de l'huile de lin, mais
il est abondant dans toutes les huiles végétales.

L'acide linoléïque ne peut pas être synthétisé dans l'organisme des animaux. Il est
reçu exclusivement par voie digestive (huiles végétales) et c'est un composé indispensable de
notre ration alimentaire. Parce qu'il doit être présent dans notre alimentation et qu'il est
irremplaçable dans ses fonctions on le qualifie d'acide gras indispensable et essentiel.

28
 Chapitre 1 Etude bibliographique

n-6 n -
9
CH2 CH2 HC=== C H HC=== C H C 2
H CH2 C H , COOH

/\/\/
C� C � C�
12\/
C�
9
\/\/\/\/
C � C� C H2 C�
1

n = 8
1
Figure 10: L'acide linoléique (C1 8 : 12 (n-6 n-9))

L'acide linolénique, est un acide gras à chaîne longue qu'on trouve dans les huiles
végétales et dans les huiles des poissons. On le symbolise par les nombres 1 8:3. Il est un

acide gras insaturé. Il est sous forme liquide (huile) à température ambiante et ne se solidifie
qu'à _1 1 °C. En présence d'air, il s'oxyde rapidement (rancissement). L'acide linolénique ne
peut pas être synthétisé dans l'organisme des animaux. Il est reçu exclusivement par voie
alimentaire (huiles végétales).

n = 18 n-3 n-6 n-9

Figures I l : L'acide linolénique (C I 8 : 3 (n-3 n-6 11-9))

L'acide arachidonique, est un acide gras à chaîne longue, présent dans certaines
huiles végétales. On le symbolise par les nombres 20:4. Il est un acide gras polyinsaturé.
L'acide arachidonique est fabriqué par l'organisme humaine à partir de l'acide linoléique. Il
n'est donc pas un acide gras indispensable. Il est le précurseur direct des hormones
eicosanoïdes.

n - 9 HC=CH
HC=CH n-6 CH2 CH.
/11 'L,14 'L,\<��: 20
CH2
\HC=CH
C C C
a/ '\HC=CH5/ ,\:/
CH2 ,\COOH
n - 12 n - 15 1
Figures 12: L'acide arachidonique [(C20 : 4)(n-6 n-9 n-12 n-15)]

29
 Chapitre l Etude bibliographique

Les acides gras majoritaires de la plupart des espèces oléagineuses cultivées (à

l'exception du coprah) possèdent 1 6 à 1 8 atomes de carbone. La composition relative en acides
gras des huiles de différentes espèces oléoprotéagineuses est présentée dans le Tableau 2.

Acides gras Colza Tournesol Olive Arachide Soja Coton Maïs Palme Palmiste COl1rah
CaproÏdique C6:0 <0,1 1 ,2
Caprylique C8:0 1,1 7,0
Caprique CI0:0 3,2 6,1
Laurique C1 2:0 trace 47,0 46,0
Myristique C1 4:0 <0,1 0,1 0,8 1 ,0 1 6,1 1 8, 1
Palmitique C 1 6 :0 4,8 7,4 I l ,2 I l,1 1 0,3 22,7 1 0,9 44,1 8,0 9,3
Palmitoléique C 1 6 : 1 0,5 0,2 1,1 0, 1 0,2 0,8 trace trace
Stéarique C1 8:0 2,6 4,5 3,2 4,2 4,5 2,3 2,3 6,2 2,7 3,1
Oléique C18:1 56,8 47,3 77,4 44,8 22,8 20,1 24,2 38,0 1 5,9 7,4
Linoléique C 1 8:2 22,1 39,8 7,0 32,0 52,0 51,5 58,6 1 0,1 2,8 2,0
Linolénique C1 8:3 1 1 ,0 <0,5 <1 <0,5 9,6 <1 1,2 <0,5
Arachidéique C20:0 <0,5 <0,5 trace 2.2 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5
Béhénique C22:0 <0,5 <1 2,7 <0,5 <0,2 <0,5
Erucique C22:1 <1 <1 <0,5
Lignocérique C24:0 trace 1,0

Tableau2: Composition ( % ) en acides gras de différents produits d'origine végétalel301.

I.4.3 Les glycérides

Les glycérides sont des esters formés à partir d' acides gras (C 2 à C22) et de glycérol.
Les graisses et les huiles ne sont pas des glycérides simples . Elles contiennent un certain

nombre d'acides gras différents ou non, distribués plus ou moins au hasard parmi les

différentes molécules de glycérides. Ce qui leur confère des propriétés physiques, une

réactivité chimique et un comportement physiologique.

La fraction glycéridique des corps gras d'origine végétale renferme en majeure partie

des triglycérides (les acides gras estérifiant le glycérol pouvant être de diverses natures :

chaîne hydrocarbonée (R), plus ou moins longue, plus ou moins insaturée), des

monoglycérides et des diglycérides, ainsi que des acides gras, y sont présents en faibles

quantités [3 21.

30
 -""
'

Chapitre 1 Etude bibliographique

1.4.4 Les phospholipides

Les phospholipides (phosphatides), présents dans les corps gras végétaux bruts

(jusqu'à 2 % de certaines huiles) sont essentiellement des phosphoglycérides (c'est-à-dire des

dérivés du phosphoryl-3 glycérol), des sphingolipides (dérivés de la phytosphingosine) et des

phospholipides comportant, en outre, des motifs glucidiques (glycolipidesp2l. La partie

glycérol-phosphate est hydrophile alors que les acides gras sont hydrophobes. On représente

souvent les phospholipides par un groupement phosphate hydrophile, et deux chaînes

hydrocarbonés.

G rou l>ement
phosphat e
Hydrophile

�
Glycerol
N.���
OU

Hydlophohe

1> �
1
Acides gras

Figure 1 3 : Comportement des phospholipides face à l'eau

Placées dans de l'eau, les molécules de phospholipides ont tendance à former une

couche monomoléculaire (une molécule d'épaisseur) où seules les portions hydrophiles sont

en contact avec l'eau. Si les phospholipides sont «forcées» à se mélanger à l'eau, ils forment

alors une double couche moléculaire: les acides gras hydrophobes se font face (ils ont plus

d'affinité entre eux qu'avec les molécules d'eau) alors que les portions hydrophiles demeurent

en contact avec l'eau.

31
 Chapitre l Etude bibliographique

1.4.5 Les Cérides

Les cérides sont des esters d'acide gras et de mono (éventuellement di) alcools, de
masse moléculaire suffisamment élevée pour que ces alcools soient insolubles dans l'eau.
Aussi, parmi eux, on compte : les cires naturelles (esters d'acides gras et mono alcools
aliphatiques), les stérides (esters de stérols, de méthyl-stérols ou d'alcools triterpéniques), les
caroténocérides (esters d'acides gras et d'hydroxycaroténoïdes ou xantophylles), etc.

1.4.6 Les stérols

Les stérols de plantes, appelés aussi phytostérols, sont des alcools stéroïdiens,
membres de la famille des triterpènes, comportant le plus souvent 25, 27 ou 29 atomes de
carbone. Le noyau tétracyclique possède le plus souvent une double liaison fréquemment en
position 5, mais que l'on peut rencontrer en position 7, beaucoup plus rarement en position
8(14) ou en position 1 9(1 1). Les groupes méthyle 18 et 19, la fonction alcool en 3 et la chaîne
latérale en 1 7 sont en configuration �. La chaîne latérale qui peut être saturée ou comporter
une ou deux doubles liaisons possède 8, 9 ou 10 atomes de carbone. Leur structure est dérivée
de celle du cholestérol et ne diffère que par un groupement méthyle ou éthyle sur le carbone
24 (Figure 14). La plupart des phytostérols, comme le campestércil et le ,B-sitostérol, ont une
liaison /',.s ainsi qu'un ou deux carbones additionnels substitués à la chaîne latérale au niveau
du carbone 24[32, 33J.

26
Cholestérol (cilOlest-5-èlle-Jf3-ol)

Les groupemenlq OH , CH) et l a chaîne

aliphatique en 17 sont situés du même côté :
ils sont tous en configuration �

3
6
HO

Figures 14: Structure chimique du cholestérol.

Les stérols représentent, en général, une part notoire de l'insaponifiable, soit de 30 à

60 % de l'huile végétale. Le sitostérol et le campestérol apparaissent comme les plus
efficaces. Certains auteurs suggèrent que la variation de leur concentration relative, pourrait
être liée à l'adaptation des plantes à la variation de température[34J . Aussi, les stérols végétaux

32
 Chapitre 1 Etude bibliographique

seraient également impliqués dans de plus larges phénomènes d'anti-oxydation après

l'extraction de huile [3 5,36J .

La majorité des huiles végétales contiennent de 1 g à 5 g de stérols par kilogramme

d'huile, soit 1 00 mg à 500 mg pour 100 g d'huiles. La classe de stérols majoritairement
représentée dans les huiles végétales correspond à celle des diméthylstérols. Leur proportion
atteint 85 % pour la plupart des huiles végétales. Le Tableau 3 présente les gammes de
variation de concentrations en stérols dans l'huile de différentes cultures. Le colza renferme le
maximum de phytostérols totaux (5, 1 3 à 9,79 g /kg). En seconde position, l'huile de tournesol
possède des concentrations variant de 374 à 725 mg/ l00g d'huile ainsi que la plus forte teneur
en �sitostérol[37,3 8J ..

Huiles Phytostérols totaux �-sitostérol Camnestérol Stigmastérol t,5 avénastérol

Colza 5,1 3-9,79 2,84-3,58 1,56-2,48 0,02-0,04 0,13-0, 1 9
Tournesol 3,74-7,25 4,65 0,69 0,75 0,28
Soja 2,29-4,59 1,29-4,59 0,62-0,76 0,45-0,76
Olive 1 ,44- 1 ,50 1 , 1 8- 1 ,21 0,05 0,01 0,17-0,1 8
Palme 0,71-1,17 0,72 0,23 0,04 0.02
Tableau 3 : Composition en stérols majeurs des principales huiles végétales (g/kg) [37J .

En tant que valorisation non alimentaire, les phytostérols possèdent des propriétés de
surfactant utilisées dans l'industrie pharmaceutique pour solubiliser les hormones stéroïdes
dans la formulation de certaines crèmes. De plus, ils présentent des effets curatifs sur la peau
ainsi qu'une action anti-inflammatoire semblable à celle de la cortisone et des corticoïdes. En
tant que bons émulsifiants, les stérols sont utilisés pour la formulation de produits
cosmétiques variés. L'aj out de phytostérols dans les crèmes permet d'améliorer l'hydratation
de la peau et sa tonicité [3 9. Selon les préparations, ils servent d'émulsifiants principaux ou
auxiliaires, modificateurs de consistance et d'apparence, d'agents contrôlant la viscosité ou
d'émollients. Ils sont employés pour la formulation de shampoings, pour lesquels ils réduisent
la charge électrostatique ; de lotions hydratantes, rouges à lèvres, crèmes de corps, solutions
après rasage [3 9J (tableau 4).

33
 Chapitre l Etude bibliographique

Phytostérols utilisés Domaines d'utilisation

90% ,B-sitostérol + 10% campestérol Emollient
45% ,B-sitostérol + 25% campestrol + 20% stigmastérol Cosmétiques
50% ,B-sitostérol + 25% campestérol + 25% stigmastérol Emulsifiant, dispersant, solubilisant
Phytostanol : phytostérols saturés Emulsifiant. dispersant
Tableau 4 Valorisation non alimentaire des phytostérols [39] .

1.4.7 Les Tocophérols

Les huiles et les corps gras, au contact de l'oxygène, sont susceptibles de dégradations
oxydatives. Ce phénomène se déroule spontanément en 2 étapes : les chaînes grasses
insaturées fixent l'oxygène de l'air en formant des peroxydes, puis ceux-ci instables, évoluent
en formant des produits d'oxydation, de dégradation et de polymérisation. Ils sont alors
indésirables aussi bien en raison de leurs effets physiologiques néfastes qu'à cause des
modifications de saveur et d'odeur et des huiles qu'ils entraînent. Les antioxydants sont donc
des molécules oxydables qui, en agissant comme donneurs d'hydrogène vis-à-vis d'un radical
hydroperoxyle, interrompent la réaction en chaîne de formation des peroxydes[32] .

Les antioxydants sont pour la plupart synthétiques (hydroquinone, pyrogallol, acide

gallique et gallate, etc.) et sont rajoutés aux huiles dans l'industrie alimentaire. Ils peuvent par
contre être présents à l'état naturel dans les huiles végétales (vitamine E, polyphénols de
l'olivier et du chêne, sésamol, flavonoïdes, certaines huiles essentielles, etc) [3 2] . Les huiles
peuvent renfermer une quantité plus ou moins importante de vitamines liposolubles. Plus
particulièrement, la vitamine E, présente dans tous les lipides naturels sous différentes formes
moléculaires, est constituée de tocophérols et des tocotriénols. C'est l'anti-oxydant majeur des
milieux lipidiques (huiles, membranes biologiques et lipoprotéines). Les tocophérols et les
tocotriénols sont des composés aromatiques possédant un noyau chromanol (l'atome de
carbone 6 porte un groupement hydroxyle) substitué par une chaîne à 3 unités isopenténiques
condensées. Cette chaîne peut être saturée dans le cas des tocophérols et triinsaturée dans
celui des tocotriénols; les autres substituants définissant les vitamères, a p, y ou 0 [32] .

34
 Chapitre l Etude bibliographique

HO
(,

A) B)
Figure. l 8 : (A), noyau chromane (B) a-tocophérol (vitamine E)

1'.,

OH
""" CH,

R,
--# 0 CH,
CH,
R, Tocopherols

R,

OH
""'" CIi, CH, CH,

0 CH,
--# --# --# --#
CH,
R,
R, Toc<>trienols

Figure. 1 9: Structure moléculaire des tocophérols et tocotriénols

Le noyau 6-0H chromane existe sous 4 formes différenciées par la présence ou non de
groupements méthyles en position 5 ou 7 du noyau (Tableau 5).

Forme RI (position 5) R2 (position 7)

a CH3 CH3

P CH3 H
y H CH3
Ù H H
Tableau 5 : Les quatre formes des tocophérols selon la position des groupements
méthyle sur le noyau 6-0H-chromane.

35
 Chapitre l Etude bibliographique

Les tocophérols présentent des propriétés anti-oxydantes responsables de la stabilité

oxydative de l'huile [401 . In vivo, l' a-tocophérol, appelé vitamine E, a pour fonction de
protéger les structures sensibles à l'oxydation comme les lipides (essentiellement sous fonne
condensée dans les membranes et les lipoprotéines), les bases nucléotidiques de l'ADN et les
protéines. L'activité anti-oxydante des tocophérols protège également les acides gras en
éliminant les radicaux libres et les espèces oxygènes réactives[401 . La composition en
tocophérols varie selon les espèces et, au sein d'une même espèce selon les génotypes. Le
tableau 6 présente la composition en tocophérols et tocotriénols des principales huiles
végétales.

Huiles a-TP ll-TP Z-TP o-TP aTT OTT l!TT oTT

Colza 202 65 490 9
Tournesol 670 27 11 1
Palme 89 18 128 323 72 630
Soja 100 8 1 021 421
Maïs 282 54 1 034 54 49 8 161 6
l
Tableau 6: Teneurs en tocophérols (TP) et Tocotriénols (TT) (Ilg.g. ) dans les principales
huiles végétales [401 .

36
 Chapitre l Etude bibliographique

Référence bibliographiques

[1]. OMS, 2003. Directives sur les bonnes pratiques agricoles et les bonnes pratiques de
récolte relatives aux plantes aromatique et médicinales. Organisation Mondiale de la Santé
Genève, 2003.

[2]. NIPPO, Y., 1992-2001 . Culture des plantes médicales et contrôle de la qualité. Tokyo,
Ministère de la Santé, du travail et des affaires sociales, Japon.

[3]. HOLLEY, J., CHERLA, K., 1998. The medicinal plants sector in India. The International
development research center, South Asia regional office, Medicinal and Aromatic plants
Programme in Asia, Delhi.

[4].TILMAN, D., REICH, P.B., KNOPS, J. WEDIN, D., MIELKE, T., LEHMAN, C. 200 1 .
Diversity and productivity in a long-term grassland experiment. Science, 294, 843-845.

[5] . OMS, 2002. Stratégie de l'OMS pour la médicine traditionnelle pour 2002-2005.
organisation mondiale de la santé,Genève. (Document WHOIEDM/TRM/2002. l).

[6]. JONES, RJ.A., 1985. The soil survey's field capacity data set-an aid to assessing soil
wetnesss. Soil Surv. Land Eval. 5 (1), 1 -12.

[7].WHO, 2002. Quality control methods for medicinal plant materials. Organisation
Mondiale de la Santé, Géneve. WHO Monographs on selected medicinal plants, 2002. Vol. 2.
Genève.

[8]. STEVENS, M.H., CARSON, W.P., 1999. Plant density determines species richness along
an experimental fertality gradient. Ecology., 80, 455-465.

[9]. KLEIJN, D., VERBEEK, M., 2000. Factors affecting the species composition of arable
field boundry vegetation. J. Appl. Eco., 37, 256-266.

[ 1 0]. DHAR, U., RAWAL, R.S., PRETI, J., 2000. Setting priorities for conservation of
medicnal plants- acase study in the Indian Himalaya. Bio. Conserv. 95, 57-65.

[ I I]. ARSSEN, L.W., 2000. On correlation and causations between productivity and species
richness in vegetation : predication from habitat attributes. Basic applied . Ecol. 2, 1 05-1 14.

[ 1 2]. ASSOCIATION FRANCAISE DE NORMALISATION, 1 986. Recueil de normes

Françaises Huiles essentielles, AFNOR, Paris.

[ 1 3]. WILLEM, J.P., 2002. Les huiles essentielles : médecine d'avenir. Editions du Dauphin,
Paris.

37
 Chapitre l Etude bibliographique

[14] . ROUILIER, G., 1 990. Les huiles essentielles pour votre santé. Editions Dangles, St.
Jean-De- Braye, France.

[ 1 5] . LOURENS, AC.U., REDDY, D., BASER, K.H.C., VILJOEN, AM, & VAN VUÛREN,
S.F., 2004. In vitro biological activity and essential oil composition of four indigenous South
African Helichrysum species. J. Ethnophar. 95, 253-258.

[16] . PELLECUR, J., ROUSSEL, c., ANDRAY, A, 1980. Recherche du pouvoir

antifongique de quelques huiles essentielles. Riv. Ital. Essen., 23, 45-50.

[17]. VIOLLON, C., CHAUMONT, J.P., 1994. Antifungal properties of essential oils and
their main components upon Cryptococcus neolormnas. Mycopathologia., 128 (3), 1 5 1-153.

[18]. CHAUMONT, J.P, LEGER, D., 1989. Propriétés antifongiques de quelques phénols et
de composés chimiquement très voisins : relation structure-activité. Plants Med. Phyt., 23 (2),
124-126.

[19]. SIVROPOULOU, J.P., PAPANIKOLAOU, E., KOKKlNI, S., & LANARAS, T., 1 996.
Antimicrobial and cytotoxic activities of origanum essential oils. Agric. Food Chem. J.,
44, 1 202-1205.

[20]. ZAMBONELLI, A. D'AURELIO, A.Z., SEVERI, A., et al., 2004. Chemical

composition and fungicidal activity of commercial essential oils of thymus vulgaris L., J.
Essen. Oil Res. 1 6, (1), 69-74.

[21 ] . MANGENA, T., MUYIMA, N.Y.O., 1999. Comparative evaluation of the antimicrobial
activities of essential oils of artemisia aira, pteronia incana and rosmarinus officnalis, on
selected bacteria and yeast strains. Lett. Appli. Microbiol. 28 (4), 291-296.

[22]. BOURRUEL, C., 1993. Analyse chimique, activités biostatiques et antioxydants

d'extraits de plante aromatiques sélectionnées. Thèse de l'lNP Toulouse,

[23]. CACCIONNI, D., GUIZZARDI, S., BIONDI, D., AGANTIO, R., & GUISEPPE, R.,
1 998. Relationship between volatile components of citrus fruit essential oils and antimicrobial
action on penicillinum digitatum and penicillium italicum. Internat. J. Food Microb. 43 (12),
73-79.

[24]. ROSE, AE., 1965. Technique of organic chemistry: Distillation. John Wiley & Sans.
New York Vol. IV p. 1-30.

[25]. BERNARD, T., 1988. Le concept de raffinage végétale application a l'extraction des
huiles essentielles. Thèse de doctorat de l'lNP Toulouse. N° d'ordre : 145.

[26]. LAWRENCE, B., 1986. A review of the world production of essential oils. (Newsletter
of medicinal and aromatic plants). Herba Hungarica 2, p. 66-79.

38
 Chapitre l Etude bibliographique

[27]. CU, J.Q., 1 990. Extraction de compositions odorantes végétales par divers solvants
organiques. Thèse, de doctorat de l' INP Toulouse, N° d'ordre 393.

[28].GERIN, M., 2002. Solvants industriels: Santé, Sécurité, Substitution. Collection

médicine du travail. Ed. Masson, Paris.

[29]. WINDHOLZ, M., BUDAVARI, S., 1 983. An encylopedia of chemicals, drugs and
biologicals. The Merck Index. Merck & CO., Inc. New York, USA.

[30]. CUVELIER, C., CABARAUX, J.A, DUFRASNE, L, HORNICK, lL., ISTASSE, L., 2004.
Acides gras: nomenclature et sources alimentaires. Ann. Méd. Vét., 148, 1 33-140.

[3 1 ] . INTERNATIONAL UNION OF PURE APPLIED CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY

COMMISSON ON BIOCHEMICAL NOMENCLATURE. 1978. The nomenclature of lipides. J.
Lipid Res., 1 9, 1 14-1 29 . 1 9, 1 14-129.

[32] .BEREAU, D., 200 1 . Huiles et fractions insaponifiables de huit espèces de palmiers
amazoniens. Thèse de doctorat de l'INP Toulouse. N° d'ordre : 1 78 1 .

[33]. BETTACH, N., BANOUB, J., DELMAS, M., 1 997. Etude comparative des graines de
crucifères du genre lepidium, eruca, diplotaxis et sinapsis. II. caractérisation des stérols. OCL, 4
(2) : 1 52-155.

[34]. PALTA, J.P., WHITAKER, B.D., et WEISS, L.S., 1 993. Plasma membrane lipids
associated with genetic variability in freezing tolerance and cold acclimation of selenium
species. Plant Physio. 103, 793-803.

[35]. ABIDI, S.L., 200 1 . Chromatographie analysis of plant sterols in food and vegetable
Oils. J. Chrom., 935, 1 73-20 1 .

[36] .MATTHAÜS, B., BRÜHL, L., 2001 . Comparison o f different methods of the
determination of the oil content in oilseeds. J. Amer. Oil Chem. Soc., 78, 95- 1 02.

[37]. PIIRONEN, V., LINDSAY, D.G., MIETTINEN, TA, TOIVO, J., et LAMPI, A.M.,
2000. Review. Plant sterols: biosynthesis, biological function and their importance to human
nutrition. J. Sci. Food Agri., 80, 939-966.

[38]. LEGER, C.L., 2000. La vitamine E : état actuel des connaissances, rôle dans la
prévention cardiovasculaire, biodisponibilité. OCL, 7 (3), 258-265.
[39]. FOLMER, B.M., 20032. Sterol surfactant: from synthesis to applicationq, Advan.
Colloid. Inter. Scie. 1 03, 99- 1 19.

[40] . DEMIR, C., CETIN, M., 1 999. Determination of tocopherols, fatty acids and oxidative
stability of pecan, walnut and sunflower oils. Deutsche [Link]. 95, 278-282

39
 CHAPITRE II

Etude comparative et caractérisation chimique de l' espèce

Hibiscus sabdariffa L. Perspectives de valorisation

40
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

Chapitre lIA Rappel bibliographique-Hibiscus sabdariffa L

lIA. 1. Autres Dénominations

Nom Scientifique: Hibiscus sabdariffa (L.)

Famille: MALVACEAE
Française: Oseille de Guinée
Anglaise: Roselle
Mexique: la flor de Jamaïque.
Africaine: Karkadé, Bissap.
Thaïlandaise : Kra-chiap
Allemagne Rosellahanf

Calice

Capsule

Figure 1 5 : Plant d' Hibiscus sabdariifa

41
 Chapitre lIA Rappel bibliographigue -Hibiscus sabdariffa

lIA. 2 Description Botanique

Introduction: Une plante herbacée qui peut atteindre de 1 à 2 mètres de haut.

Feuilles: Elles sont ovales, alternées, trilobées ou simples sur des tiges fleuries.
Fleurs: Réparties le long de la tige; les fleurs ont de 7 à 10 cm de diamètre,
roses à la périphérie, devenant j aunes à l'intérieur pour finir avec un
cœur pourpre bordeaux.
Fruits: Le fruit rond dans lequel il y a quelques graines est entouré par le calice
persistant.
Récolte: De juin à septembre pour les feuilles, vers octobre pour les calices, et
fin octobre-début novembre pour les graines.

IIA. 3 Présentation de la plante

Hibiscus sabdariffa, qui fait partie des familles Malvacées, était cultivée à l'origine en
Afrique. Il a été largement distribué dans les zones tropicales et subtropicales, des Indes
occidentales à l'Amérique centrale et en Asie, où l'espèce s'est adaptée. Hibiscus sabdariffa
est présent en Thaïlande, au Vietnam, en Malaisie, en Chine, au Soudan et au Mexique. Il est
aussi présent dans d'autres pays, tels que l'Egypte, le Sénégal, la Tanzanie, le Mali, le Tchad
et la Jamaïque, qui en produisent en petite quantité.

Hibiscus sabdariffa, qui produit des calices contenant des colorants rouges
comestibles, est utilisé comme nourriture, colorant et boisson. Certaines variétés de cette
plante sont employées en tant que plantes ornementales. Les calices rouges gonflés, de type
sabdariffa, sont également séchés, brassés et employés dans le traitement de jus, de gelées, de
crèmes glacées et des saveurs. Une décoction des calices est employée pour faire des boissons
l
froides et chaudes dans plusieurs pays tropicaux et subtropicaux[ l . Eût égard à ses
potentialités (goût, couleur, acidité), hibiscus sabdariffa peut être mélangé à d'autres jus de
fruit : orange, ananas, goyave, tamarin, anacarde. Acide mais sans alcool, d'une couleur rouge
proche de celle du vin, le jus d'hibiscus est une boisson naturelle tonifiante. En Amérique
tropicale et en Afrique subsaharienne, le bissap (Hibiscus) est servi en famille à tout moment.

42
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

A I' occasion de grandes cérémonies, il supplante merveilleusement certaines boissons

occidentales comme le Coca-Cola.
En Afrique, les calices sont fréquemment préparés en pâte ou en sauce en guise de
plat. Les nutritionnistes ont trouvé des calices d 'hibiscus sabdariffa vendus sur les marchés
d'Amérique centrale pour leur richesse en calcium, riboflavine et fer. Les calices, possédant
plus de 3 % de pectine, ont été recommandés comme source de pectine pour l'industrie du
préservatif21 .

lIA. 4 La culture de Hibiscus sabdariffa

Hibiscus est relativement robuste et se développe bien dans la plupart des sols.
L 'Hibiscus sabdariffa aime les climats tropicaux humides. 5 à 8 kg de graines sopt nécessaires
pour ensemencer environ 1 hectare, en fonction de la densité choisie. Les graines ont besoin
d'une température minimale de 1 0cC pour germer mais la température optimale pour le
développement de la plante se situe entre 20 et 35cC, avec des précipitations mensuelles de
1 3 0 à 260 mm pendant les 3 à 4 premiers mois de croissance. Le pH optimum du sol, pour un
bon développement, est de 5-6, et les meilleurs sols sont sablonneux ou de type terreux.

La floraison d'hibiscus est favorisée par des journées courtes (octobre février). Il lui
faut 1 20 à 1 8 0 jours pour étaler ses calices d'un rouge vif. Les calices charnus rouges sont
récoltés après que la fleur soit tombée mais avant que la cosse de la graine ne soit séchée et
ouverte [31 .

lIA. 5 Les Calices

Les calices d' hibiscus sabdariffa constituent la partie la plus importante de la plante
du point de vue économique. Ils contiennent des protéines, des vitamines, des polyphénols,
des pectines, du carotène, des fibres, des minéraux, des anthocyanes. La présence de tous ces
éléments explique l'utilisation de l'hibiscus dans divers domaines.

Le colorant extrait des calices séchés d'hibiscus sabdariffa contient différents

anthocyanes dont les quantités sont relativement élevées : 1,5 g d' anthocyanes pour 1 00 g de
calices séchés. Les principaux anthocyanes (fig. 16) sont : le delphinidine-3-sambubioside et
le cyanidine-3-sambubioside [41 . La relation entre l'activité antioxydante et l'anthocyanine
dans des pétales d'hibiscus sabdariffa a été étudiée à Taiwan. Le résultat démontre que le

43
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

taux d'anthocyanine est élevé dans les pétales d'hibiscus lesquelles sont donc,
potentiellement, de bonnes sources d'antioxydants [5,61 ,

OH

OH
� RI = sambubiose R2=OH

HO
RI = glucose, R2= H
0+
"" R,
,::9' # RI = glucose, R2=OH
RI = xylosylglucose, R2=OH

OR,
� # RI = xylosylglucose, R2=H

OH

Figure 1 6 : Structure chimique des anthocyanes d'hibiscus sabdariffa L.

En Allemagne, les calices rouges sont de plus en plus utilisés comme colorants
naturels dans la confiserie, L'extrait, sous forme de filtrat concentré ou de poudre séchée, est
utilisé comme colorant dans l 'industrie alimentaire ou pharmaceutique. Dans ces deux
secteurs, où l'on cherche des colorants naturels aux dépends des produits de synthèse, les
colorants d'hibiscus sont préférés à ceux de la betterave, d'un rouge trop foncé, ou à ceux du
raisin, moins éclatant, ou encore à ceux de la cochenille qui sont trop chers [7,81 .

IIA. 6 Les Graines

Le calice rouge persistant de l 'hibiscus abrite le fruit rond dans lequel il y a un grand
nombre de petites graines (fig. 1 7). Les graines sont ovoïdes, de teinte brune. A maturité, le
fruit s'ouvre pour laisser apparaître les graines. Les graines d'Hibiscus sabdariffa sont
principalement constituées de lipides, de protéines et d'acides aminés. La teneur de la graine
en huile varie selon l'origine géographique, mais la valeur moyenne se situe entre 1 5 et 22 %.
Elles contiennent donc des quantités considérables d'huile. Dans cette huile, les composés
majoritaires sont l'acide linoléique, l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide stéarique et
l'acide arachidonique [91 .

44
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffà

Figure 17: Les graines de l'hibiscus sabdariffa 1. du Vietnam. (Source: [Link] ).

Les graines d'hibiscus ont été proposées comme nouvelle source d'huile grâce à leurs

qualités, lesquelles ressemblent à celles de l'huile de soja et de coton[9] La teneur en protéine

(20 %) pour les graines d'hibiscus est très proche de celles de l 'okra (Hibiscus esculentus) et
de l'huile de coton (Gossypuim Sp) [9. IOJ . Les acides aminés essentiels et majoritaires des
[9J
graines sont les acides glutamique, aspartique, la leucine et l'arginine .

lIA. 7 Les Feuilles

Grâce à leurs qualités et à leur valeur nutritive, en Afrique occidentale, les feuilles

d'hibiscus sQnt consommées comme des légumes en soupe ou en salade, mélangées avec

d'autres légumes. La feuille d'Hibiscus sabdariffa contiennent une quantité non négligeable
I I 12
de protéines comparables au standard de l'OMS[ . ] Le tableau 7, montre que les feuilles

pourraient constituer, potentiellement, une bonne source de fer, calcium et magnésium, et

[lI J
notamment de zinc grâce à un taux exceptionnellement élevé de ce demier . . Dans la région

sub-saharienne de l'Afrique, durant les périodes où les cultures habituelles (maïs, sorghio,

riz. . . ) sont insuffisantes, à cause des conditions climatiques défavorables, les indigènes

consomment des plantes poussant à l'état sauvage, telles que l'hibiscus ou d'autres plantes,
[9J
en tant que substituts alimentaires . Une étude menée au sud-est du Niger, ( 1 993) a démontré

que les feuilles sont régulièrement consommées durant la saison par 1 00 % des individus
[II 14J
interrogés , ,

45
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

Figure 1 8 : Les calices d 'hibiscus sabdariffa transformés en confitures et en sauces!"]

[11) (%l!l6! (0/0) I"J

Graines Feuille
(Ile/d"!
Graines
Acide amines Feuille (mg/g) Calice (°10)117) Minéraux Acides eras

Aspartate 3 1 ,8 1 6,3 2,5 Ca 12,4 Myristique 0,34

Glutamate 26,6 7,2 5,21 Cr <0,5 Palmitique 14,56

Serine 1 1 ,9 3,5 1,13 Cu 13,5 Stéarique 0,47
Glycine 1 1 ,7 3,8 5,21 Fe 1 19 1 Elaidïque 38,79
Histidine 6,4 1 ,5 0,78 K 19,7 Oléique 22,1
Arginine 17,5 3,6 2,33 Mg 7865 Linoléique 5,04
Thréonine 9,5 3,0 0,84 Mn 1 14 Linolénique 3,46
Alanine 8,5 3,7 1 ,0 1 Mo 15,3 Arachidonique 8,61
Proline 13,3 5,6 0,81 Na 13 Béhénique 0, 1 5
Tyrosine 8,5 2,2 0,38 Ni 8
Valine 13,3 3,8 1 ,05 P 6640
Méthionine 2,9 1 0,54 Se <5,0
Cystéine 3,4 1,3 0,43 Zn 7,9
Isoleucine 10,1 3 0,81
Leucine 17,4 5 1,58

Phénylalanine 13,1 3,2 1 ,03

Lysine 12,2 3,9 1,09
Tryptophane 5,9 ----- ---

Tableau 7: Composants nutritionnels des différents partie de la plant d'Hibiscus sabdariffa .

46
 Chapitre rrA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

lIA. 8 Utilisations médicinales de l'Hibiscus sabdariffa.

Traditionnellement, les médicaments, la décoction, l'infusion d'herbes, de feuilles
d'olivier et d'ail, et spécialement le thé d'Hibiscus sabdariffa, sont utilisés en médication
adjuvant pour contrôler l'hypertension[ 1 81 . En médecine traditionnelle chinoise, les calices
rouges gonflés de type sabdariffa sont également séchés, brassés et employés sous forme
d'infusion pour le traitement de l'hypertension. Une étude menée en Iran, a démontré que la
consommation d'infusions de calices d'Hibiscus sabdariffa permettrait de contrôler
l'hypertension chez des patients, hommes et femmes, atteints d'hypertension modérée[ 19,201 .

Au Sénégal, les calices en décoction sont utilisés comme diurétiques et antiseptiques

urinaires [1 81 Une étude publiée dans le Journal of The Science of Food and Agriculture, en
septembre 2004, par des médecins chinois, ont déterminé l'activité de feuilles d'hibiscus sur
le cholestérol de rats soumis à différents régimes. Selon les médecins chinois, l'extrait aqueux
de fleurs d'Hibiscus sabdariffa neutraliserait l'oxydation du cholestérol LDL (le « mauvais »
cholestérol) et réduirait le taux sanguin de cholestérol LDL chez des rats nourris avec une
alimentation trop riche [2 1 1 .

L'extrait de feuilles d'hibiscus posséderait ainsi un fort pouvoir antioxydant qUi

permettrait la dégradation du cholestérol LDL. Sur des rats nourris avec un régime riche en
fructose, cet extrait aqueux neutraliserait la production du cholestérol oxydé et réduirait le
taux sanguin de triglycérides. D 'autre part, la feuille d'hibiscus diminuerait aussi le taux
sanguin de cholestérol LDL et le rapport cholestérol LDL sur cholestérol HDL chez des rats
soumis à un régime [,22.251 . Donc, les feuilles d'Hibiscus sabdariffa pourraient être utiles dans
la prévention des maladies cardiovasculaires dans lesquelles le cholestérol joue un rôle
important.

47
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdari{fa

lIA. 9 Les marchés des tisanes à partir des calices d' Hibiscus sabdariffa L.
Les premiers marchés d'importation pour les calices d'Hibiscus sabdariffa sont les
Etats Unis et l'Allemagne. L'Angleterre n'est pas un importateur régulier du produit car la
tisane en provenance de l'Allemagne satisfait une grande partie de la demande. Les
principaux clients, pour les importateurs d'hibiscus, sont les fabricants de tisanes car le calice
et la capsule séchés entre dans la fabrication de la plupart des tisanes en même temps que
l'écorce d'ananas, d'orange et le jus de citron[26l.

L'Allemagne est plus gros importateur régulier d'Hibiscus sabdariffa. Les

importations se sont chiffrées à près de 43.000 tonnes, soit 90 millions d'Euros en 1 997 pour
les plantes et les éléments de plantes d 'Hibiscus sabdariffa pour la confection de tisanes,
alicaments et parfums, soit une augmentation de 4 1 % en volume et 72 % en valeur par
rapport aux niveaux de 1 993. On estime que les produits importés, destinés exclusivement à la
fabrication de tisanes, représentaient un quart des importations totales, soit environ 1 0 .000
tonnes (20) millions d'Euros. Le Soudan domine le marché d'importation allemand.
L'hibiscus soudanais est très prisé des utilisateurs mais, en raison de l'embargo de commerce
imposé sur le Soudan par les Etats-Unis, les importateurs sont obligés de s'approvisionner en
produit soudanais à travers l'Allemagne et à un prix élevé26l.

Les Etats-Unis ont importé plus de 5.000 tonnes (22 millions d'Euros) de plantes et parties de
plante pour l'utilisation dans les tisanes en 1 998, soit une augmentation de 78 % en volume et
156 % en valeur par rapport aux niveaux de 1 994. Les tisanes ont gagné en popularité au
cours des cinq dernières armées aux Etats-Unis. Même les principales chaînes de café ont
commencé à vendre ce produit. Parmi les fournisseurs des Etats Unis, on compte la Thaïlande,
le Mexique, l'Egypte et le plus important d'entre eux, la Chine [ l5l,

Les industries allemandes de tisanes pensent que l'hibiscus soudanais offre le mélange
parfait quant à la couleur et au goût pour les bases de tisanes mais elles s'approvisionnent
aussi en hibiscus chinois, thaïlandais, égyptien et mexicain, ces deux dernières en petites
quantités cependant. L'hibiscus chinois donne un liquide violet foncé avec un arrière goût
âpre. L'hibiscus soudanais produit un liquide de couleur orange-rouge, avec un goût
légèrement moins âpre mais plus acide, convenant mieux comme base de tisane [26l.

48
 Chapitre lIA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdartffa

L'hibiscus thaïlaudais donne un liquide qui a une couleur intermédiaire entre celle du produit
de Chine et du Soudan et qui est sucré. Le tableau 8 montre les caractéristiques et le prix pour
les calices séchés d'Hibiscus sabdariffa en fonction de divers fournisseurs [26J .

Fournisseur Couleur du liquide Goût liquide Prix

Chine Violet fonce Apre 800-1.000
Soudau Rouge-orange Acide 1 .500-1 .700
Thaïlande Rouge-violacé Sucré 1 .000-1 .200
Mexique Rouge-orauge Salé 600-700
Egypte Rouge Bordeaux Acide 1 .200-1 .500

Tableau 8: Caractéristiques et fourchettes de prix par tonne d'hibiscus séché [26J •

• prix en euro/tonne d'hibiscus séché.

49
 Chapitre HA Rappel bibliographique -Hibiscus sabdariffa

lIA. 1 0 Conclusion
Le Vietnam et le Sénégal sont absents sur ce marché. L 'Hibiscus sabdariffa 1. est une
plante très bien adaptée au deux pays: il pousse abondamment à l'état sauvage, même sur des
sols pauvres. Pour peu qu'il soit mieux « domestiqué », la valorisation de l' Hibiscus
sabdariffa est à envisager et pourrait apporter des plus-values aux agriculteurs des zones
déshéritées.
Les feuilles d 'hibiscus semblent représenter une excellente source de nutriments essentiels, et
les graines pour l'utilisation d'huile végétale, savon, et d'agro-matériaux. Si ces différentes
voies de valorisation se développent, de simples améliorations dans la technologie de
production pourraient transformer une culture de substance négligée en une nouvelle source
de prospérité pour les pays en développement.

50
 CHAPITRE lIB

Matériels et méthodes : Hibiscus sabdariffa L.

51
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

I1B.I Détermination de la teneur en matière sèche des calices et des graines

d'Hibiscus sabdariffa

Le teneur en matière sèche (NF V 03-903p71 est déterminé sur des graines broyées et
des calices séchés d' Hibiscus sabdariffa. Une masse [Me] de ces graines est introduite dans
un creuset taré [T] puis mises à l'étuve à 1 03 oC jusqu à ou poids constant [MsEc]. La teneur
en matière sèche des graines est donnée par la relation : MS = 1 00 x (ME-MsEc)1 (ME-T)

I1B.2 Méthode d'extraction et analyses partir du calice de l'hibiscus

L'étude comparative des extractions a été effectuée avec d'Hibiscus proviennent de

trois pays : le Vietnam, le Sénégal et Le Mexique. Chaque manipulation a été préparée en
trois exemplaires avec trois solvants: l'eau, l'hexane et le dichlorométhane. L'analyse
qualitative a été réalisée par spectrométrie de masse couplée à un chromatographe en phase
gazeuse (CPG/SM).

I1B.2.1 Procédé classique d'extraction : Hydrodistillation

L'hydrodistillation consiste à immerger la matière première dans un bain d'eau.
L'ensemble est porté à ébullition et l'opération est généralement conduite à pression
atmosphérique. Lit distillation peut s'effectuer avec ou sans recyclage communément appelé
cohobage (Figure 1 9).
Le montage de type Clevenger[28,291 est composé de quatre parties principales :
1 . le réacteur, un ballon dans lequel on introduit la matière et l'eau.
2. la colonne, un cylindre en verre placé au-dessus du réacteur qui recueille la phase
vapeur,
3. Le réfrigérant dans lequel se condensent les vapeurs
4. le vase florentin où vont se séparer la phase organique (huile essentielle) et la phase
aqueuse (eau florale).

Ce système peut être équipé d'un recyclage ou cohobage : un principe de siphon renvoie
l'eau florale du vase florentin vers le réacteur. Un simple robinet au bas du vase permet de
recueillir l'huile essentielle à la fin de la réaction. Le milieu réactionnel, constitué par la
'matière et l'eau, est porté à ébullition grâce à un chauffe-ballon. La température est limitée
par la température d'ébullition de l'eau : 1 00 oC. La composition chimique des huiles

52
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

essentielles dépend largement de l'influence des conditions d'hydrodistillation sur l'essence

contenue dans la plante.

JmiIe _elle

cohobage

chauffe ballon eautmatière végétale

Figure 19: Appareillage d'hydrodistillation de type Clevenger.

lIB. 2.2 Conditions opératoires d 'hydrodistillation

300 grammes de matière végétale et un volume de 3 litres d'eau ont été placés dans un

ballon en verre de 6 litres dans un appareil de type Clevenger. La matière végétale est ainsi
immergée dans l'eau. La distillation s'opère à pression atmosphérique. Le chauffe ballon
permet de chauffer le mélange hibiscus/eau, l'essence est entraînée par la vapeur qui est
condensée dans un serpentin refroidi par un courant d'eau froide (réfrigérant). Un séparateur -
ou essencier - permet de séparer l'eau de l'huile par différence de densité.

I1B.2.3 Distillation -Extraction Simultanées (D.E.S), (Likens-Nickerson)

Le procédé de distillation-extraction simultanée a été conçu par Likens et Nickerson

en 1964, qui ont donné leurs noms à l'appareillage (figure 20P°.31l. Cet appareil est l'un des
plus polyvalents et les plus utilisés pour extraire les arômes.

53
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

L'appareil comprend deux ballons, l'un contenant l'eau et la matière végétale, l'autre

contenant un solvant organique. Dans le ballon de plus grande dimension (500 mL), chargé en
eau, on introduit l'isolat végétal à fractionner. L'autre ballon, plus petit (50 mL), contient un
solvant organique apolaire tel que le pentane, l'hexane, ou le dichlorométhane.

Préparation de l 'échantillon :

• l'échantillon a été préparé avec 25g de matière végétale (hibiscus) et 200 mL d'eau, le

tout est placé dans un ballon de 500 mL.

• Le deuxième ballon de 50 mL contient 30 mL de hexane.

Les deux ballons sont chauffés jusqu'à ébullition de leur contenu. L'eau est destinée à

entraîner les composés volatils par co-distillation, le solvant à les solubiliser. La géométrie de

l'appareil est telle que la vapeur d'eau aromatisée et les vapeurs de solvant se rencontrent

dans un réfrigérant où a lieu une extraction vapeur-vapeur. Au fur et à mesure de la

condensation, les solvants s'écoulent dans une cohobe et se séparent en deux phases vers leur

ballon générateur de vapeurs respectives permettant un cycle continu d'extraction-séparation.

L'évaporation du solvant conduit à la récupération d'une fraction aromatique concentrée. La

position relative des deux tubulures de reflux diffère selon que la densité du solvant est

supérieure ou inférieure à celle de l'eau.

Cette méthode est plus particulièrement utilisée pour l'étude d'une matière première

détenue en quantité très réduite, en vue de déterminer la composition chimique de sa partie

[31 32l
volatile, par exemple une concrète ou un échantillon végétal rare . .

Réfrigérant

Eau + matière
végétale
Ballon à

Chauffe
ballon

Figure 20: Représentation schématique de l'appareillage Likens-Nickerson.

54
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

IIB.2.4 Extraction par Soxhlet

La méthode normée du soxhlet (NF V 03_903)[271 (fig. 2 1 ) a servi de référence pour la

détermination de la concrète. 1 5g des calices d'hibiscus sont disposés dans une cartouche
cellulosique poreux laquelle est introduite dans un extracteur de type soxhlet, équipé à sa base
d'un ballon de 500 mL dans lequel 250 mL d'hexane ou dichloromethane sont introduits
(figure 26). Le solvant est mis en ébullition dans le ballon, sa vapeur passe par le tube latéral
et se condense dans le réfrigérant. Le solvant remplit progressivement la chambre d'extraction
contenant le solide, se charge d'une partie du produit à extraire et la solution est ensuite
siphonnée automatiquement dans le ballon dès que la chambre d'extraction est pleine.
L'extraction dure 6 heures, la durée d'extraction étant calculée à partir de l'ébullition du
solvant. Nous avons fait varier le nombre de siphonnages de 30 pour l' hexane et 36 pour le
dichlorométhane, ce qui correspond à une durée extraction de 6 heures soit un siphonnage
toutes les 1 0 à 1 2 minutes. Le mélange recueilli est soumis à une concentration sous vide, par
évaporateur rotatif. Ce traitement s'effectue à température modérée (40°C). A son issue, on
récupère la fraction concrète. Les fractions de concrète obtenues sont diluées dans l'éthanol
puis glacées à (-15°C) pendant 4 heures et filtrées à froid pour obtenir l'absolu.

Condenseur
Entrée d'eau

Matière vogetale
Tube de vapeur
Tube de sÎphon

Hexane el extTaÎt

Figure.2I: Appareil de type Soxhlet

55
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

lIB. 2.5 Macération

En immergeant 1 5 grammes des calices de 1 'hibiscus dans 200 mL de solvant

(hexane), dans un récipient en verre. On laisse le mélange macérer pendant 3 jours en agitant
tous les 2 jours. Après sept jours de macération, l'extrait est filtré et séché avec du sulfate de
sodium anhydre puis concentré par évaporateur rotatif. On récupère la concrète laquelle est
ensuite diluée dans l'éthanol (5mL) chaud. La solution alcoolique sera placée à -1 5°C pendant
4 heures, puis filtrée à froid pour obtenir l'absolu.

IIB.2. 6 E.M.A.U.S (Extraction, Macération Assistée par Ultrasons).

Cette technique consiste à soumettre la matière première et le solvant à l'action des
ultrasons. Elle permet, en utilisant une technique simple avec une durée d'extraction souvent
réduite. On immerge dans une fiole 1 5 grammes de calices d'hibiscus dans 200 mL de solvant
(hexane). Ce récipient est placé dans un appareil générateur d'ultrasons contenant de l'eau
froide maintenue à une température comprise entre 25-28°C. Le milieu est ensuite agité
pendant 1 60 minutes. L'extrait est filtré et séché avec du sulfate de sodium anhydre puis
concentré par évaporateur rotatif. On récupère la concrète. Cette dernière est diluée dans de
l'éthanol (5mL) chaud, puis elle est placée à environ à -1 5°C pendant 4 à 8 heures. Une
filtration à froid permet d'obtenir de l'absolu.

IIB.2.7 Conditions d'analyse de CPG/SM des calices de l' Hibiscus

A partir de chromatogrammes obtenus sur un spectromètre de masse (MS) TRACE 2000

Finnigan, couple à un chromatographe en phase vapeur (CPG), équipé d'une colonne RTX 5

Resteck de paramètres 30m . 0,25 mm, 0,25 �m. La (composition de la phase stationnaire: 5

% diphényle et 95 % diéthyl polysiloxane), nous avons procédé à quelques identifications.

Paramètres utilisés :

• CPG/SM : TRACE 2000 Finnigan

• Colonne: RTX-5 Resteck 5 % diphényle et 95 % diéthyl polysiloxane
• Température initiale : 100 oC (Imin)
• Température finale: 230 oC
• Gradient de température : 5 oC/minutes

56
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

• Délai : 5 minutes
• Injecteur mode splitless : 250 oC
• Gaz vecteur : 1,2 mL/minutes
• Mode d'ionisation : impact électronique (EI+)
• Tension du détecteur : 350 V
• Type d'acquisition : TIC

L'identification des composés a été réalisée sur la base de comparaison des spectres de
fragmentation obtenus avec ceux de la banque de données WILEY 275. Le spectre de
fragmentation correspond à une répartition des ions regroupés aux valeurs nominales entières
les plus proches de leur masses réelles et dont les intensités sont exprimées en % d'intensité
du pic le plus intense, appelé pic de base.

IIB.3 Détermination de la composition des huiles d'Hibiscus sabdariffa

IIB.3 1 Méthodes d'analyse à partir des graines de l'hibiscus

L'étude comparative des extractions a été effectuée avec des graines d'hibiscus provenant de
trois pays : le Vietnam, le Sénégal et le Mexique. Chaque manipulation a été effectuée en trois
exemplaires.

IIB.3.1.I Extraction à chaud au Soxhlet

La méthode nonne du soxhlet (NF EN ISO 659) a servi de référence pour la

détennination de la teneur en huile. Une quantité donnée de graines d'hibiscus (30 g) est
pesée et ensuite broyée. La poudre des graines d'hibiscus obtenue est ensuite disposée dans
une cartouche cellulosique laquelle est introduite dans un extracteur de type soxhlet, équipé à
sa base d'un ballon de 1 litre dans lequel 200 mL de solvant (cyclohexane) ont été insérés.
L'extraction a été réalisée en trois exemplaires. La durée d'extraction est de 6 heures, durée
que l'on considère suffisante pour épuiser le produit. L'extrait est concentré sous pression
réduit et pesé.

IIB.3.1.2 Extraction à froid (par centrifugation)

Environ 7,0 g de graines d'hibiscus des trois variétés sont broyés et dissous dans 20
mL de cyclohexane et centrifugé à 3500 rpm pendant 5 minutes. La phase supérieure est
prélevée puis filtrée. L'ajout d'isohexane, la centrifugation et le prélèvement de la phase
supérieure sont répétés 3 fois. L'extrait est concentré sous vide.

57
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

33 34
IIB.3.1.3 Accelerated solvent extractor (ASE 200 Dionex) [ , ]

La méthode ASE (Accelerated Solvent Extractor) (figure 22) repose sur le même
principe que la méthode du Soxhelt. Cette récente technique d'extraction par solvant
organique fonctionne à des températures et des pressions élevées de façon à accroître
l'efficacité de l'extraction. L'extraction s'effectue dans des cellules métalliques contenant une
masse de broyat connue et se déroule automatiquement selon les étapes décrites ci-dessous.
Ces paramètres sont programmés préalablement via une interface électronique. A la
différence de la méthode de référence du Soxhlet, cette technique présente l'avantage d'être
rapide (30 min par échantillon), peu onéreuse (utilisation de quantités moindres de solvant) et
nécessitant peu de manipulation (24 extractions programmables). La comparaison des
méthodes ASE et Soxhelt a montré que ces deux techniques permettent d'extraire la totalité
de l'huile. La méthode ASE permet le dosage d'un grand nombre d'échantillons et de
33 3
récupérer les huiles extraites nécessaires à l'analyse du profil en acides gras [ - 51 •
Exemple : extraction effectuée (tableau 9), avec des graines du Vietnam par soxhlet/
ASE. Après évaporation du solvant (sous pression réduit et à 40°C), la quantité d'huile est
pesée et exprimée en g d'huile par rapport à 100g de matière sèche de broyat de grain.

Paramètres Consignes
Température 105 oC
Pression 1 00 bars
Volume de solvant 30 mL
Solvant Cyclohexane
Durée de l'extraction 35 min
Volume de rinçage 5,5 mL
Durée de la purge 120s
Nombre de cycle d'extraction 4

Appairllage graines (g) Solvant (mL) Durée Rendement (%)

ASE 13 30 SO rnin 19.5
Soxhelt 20 200 6 hrs 20.2
• moyenne de 3 essais
Tableau 9 : Rendement de concrètes obtenues lors des extractions ASE/ SoxhJet
dans J'isohexane

58
 Chapitre liB Matériels et méthodes-Hibiscus

Figure 22 : ASE 200 commercialisé par DIONEX [33l

IIB.3 .2 Caractérisation des propriétés physico-chimiques des Huiles

d'Hibiscus sabdariffa

Les analyses normées sont extraites du Recueil des Normes Françaises sur les Corps
Gras, Graines Oléagineuses et Produits Dérivés publié par l'AFNOR[27l . Les caractéristiques
physico-chimique des trois variétés d' huiles étudiées, la masse volumique, le point de fusion,
les indices de réfraction, de saponification, d'acide, d'iode ainsi que la teneur en protéine,
cendre ont été déterminés selon des méthodes normalisées AFNOR[27l . Dans tout les cas, trois
déterminations d'indice ont été réalisées simultanément pour un même essai.

IIB.3.2.1 Indice de saponification

L'indice de saponification, IS, est déterminé par la norme (NF T60-206p7l. Il correspond au
nombre de milligrammes d'hydroxyde de potassium nécessaire pour saponifier 1 g de matière
grasse. 25 mL de KOH 0,5 M (d'hydroxyde de potassium) dont le titre est connu avec
précision sont ajoutés dans un ballon contenant 5 g d'huile. Le tout est porté à ébullition
pendant 3 heures. On y ajoute de la phénophtaléine et le mélange est titré avec HCL 0,5 M
jusqu'à disparition de la couleur rouge. On effectue un essai à blanc (sans huile).
L'indice de saponification est donné par la formule suivante :

59
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

Is = CYo -VI) M*56,1

Ms
Vo: volume d'HCL titrant pour le blanc (mL),
V I : volume d'HCL titrant pour l'échantillon (mL),
M: molarité d'acide chlorhydrique (mollL) (0,4999),
Ms: masse de l'échantillon en (mg)

IIB.3.2.2 Indice d'Acide

L'indice d'acide, (lA), correspond au nombre de milligrammes d'hydroxyde de

potassium nécessaire pour neutraliser les acides gras libres présents dans un gramme de corps
gras AFNOR T60_204[271 . On prépare une solution de KOH O,IM. L'échantillon (10 g
d'huile) est dissout dans de l'alcool préalablement neutralisé avec KOH O,IM en présence de
phénophtaléine. Une coloration violette au point équivalent doit subsister quelques instants.
L'indice d'acidité exprimé en pourcentage d'acide libre est calculé comme suit :

Is = CYo -VI) N x 56,1

Ms
Vo: volume d'HCL titrant pour le blanc en mL
VI : volume d'HCL titrant pour le échantillon en mL
M: molarité d'acide chlorhydrique (mollL) (0,4999)
Ms: masse de l'échantillon en mg.

IIB.3.2.3 Indice d'Iode

Cet indice permet de déterminer l'insaturation globale d'un corps gras (NF T60-
203f27). L'indice d'iode, II, d'une huile végétale se fait par dissolution dans un solvant, dans
lequel on ajoute du réactif de Wijs et une solution d'iodure de potassium. L'iode libre est
ensuite titré par une solution de thiosulfate de sodium. L'échantillon (5 g d'huile) est dissout
dans 20mL d'un mélange à volumes égaux cyclohexane/acide acétique et l'on ajoute 25 mL
de réactif Wijs. Laisser les fioles dans l'obscurité pendant Ih. Ajouter 20mL de solution de
thiosulfate de sodium à O,IM en présence d'empois d'amidon et titrer jusqu'à disparition de
la couleur brune. Effectuer un essai à blanc. L'indice d'iode, II, exprimé en grammes pour
100g de corps, est donné par l'équation :

60
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

Wj = (CVI -V,) N x 12,69)

Ms
VI: volume de thiosulfate titrant pour le blanc en mL
V2 : volume de thiosulfate titrant pour l'échantillon en mL
M: molarité de thiosulfate de sodium (mollL) (0,0985)
Ms: masse de l'échantillon en mg.

IIB.3.2,4 Mesure de la Densité

La densité relative d'une substance est le rapport entre la masse d'un certain volume
de cette substance, à 20°C, et la masse d'un volume égal d'eau, à la même température (NF
T60_204i271 • Les densités des huiles de graines ont été mesurées à l'aide d'un pycnomètre
10mL, à 20°C. Les masses volumiques (g) ont été calculées par rapport à celle de l'eau
distillée à la même température par la fom1Ule suivante :

l' (M2-Mo)/(M1-Mo)
=

M2 : masse du pycnomètre rempli d'huile

Mo : masse du pycnomètre vide
M I : masse du pycnomètre rempli d'eau.

IIIB.3.3 Détermination de la composition chimique des huiles d' Hibiscus

sabdariffa
IIIB.3.3.1 Analyse des acides gras
La teneur en acides gras a été déterminée par analyse des esters méthyliques d'acides
gras en chromatographie phase gazeuse (CPG) selon la norme NF EN ISO 5508 qui nécessite
deux étapes préliminaires : l'extraction et l'estérification des acides gras.

L'extraction des acides gras correspond à la solubilisation des triglycérides contenus

dans l'huile dans un solvant organique. Cette étape est suivie d'une méthyl-trans-estérification
qui consiste à ajouter un groupement méthyle aux acides gras libérés pour fonner des esters
méthyliques d'acides gras pour en faciliter la séparation. En effet, cette dérivatisation permet
de rendre les acides gras plus volatils, garantissant la stabilité nécessaire à l'analyse CPG.
20mg d'huile de graines extraite par soxhlet, sont pesés dans un tube à essais. L'huile est
solubilisée dans 5 mL de Tert-butyl-méthyl éther (TBME). Après agitation, 1 00 ilL sont
prélevés et transférés dans un vial adapté pour l'analyse en CPG.

61
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

IIB.3.3.2 Dosage des esters méthyliques d'acides gras par CPG

La séparation et le dosage des esters méthyliques d'acides gras, par chromatographie

en phase gazeuse (CPG), constituent la dernière étape de l'analyse des huiles. Cette technique
de séparation des composants d'un mélange repose sur la différence d'affinité des substances
à analyser vis-à-vis de la phase stationnaire. En CPG, la phase mobile est appelée gaz vecteur.
La méthode consiste à vaporiser l'échantillon liquide à analyser dans le gaz vecteur
(l'hélium). Le flux gazeux passe dans la colonne de séparation, à travers de laquelle les
composants de l'échantillon se déplacent à des vitesses influencées par le degré d'interaction
de chaque constituant avec la phase non-volatile stationnaire. Les molécules présentant la plus
grande interaction avec la phase stationnaire sont plus fortement retardées et inversement pour
celles dont l'interaction est moins forte. En sortie de colonne, les composés sont détectés par
un détecteur FID (Flame Ionisation Detector) et leur signal est amplifié. L'élution s'effectue
donc par ordre croissant de masses moléculaires (CI 4, C 1 6 , CI 8 , . . . ) et du nombre
[35,36] .
d'insaturations (C I8, C I8:1, C l8 :2, . . . . )
La proportion relative d'acides gras est quantifiée par une interface informatique qui
permet l'intégration de l'aire des pics séparés rapportée à la somme des aires intégrées. La
comparaison du temps de rétention de chaque pic avec le profil d'un mélange d'huile de
composition connue (rapeseed oil mix, Supe1co, USA) permet d'identifier chaque acide gras
séparé.

IIB.3.3.3 Conditions d 'analyse du profil d'acides gras.

1 50 ilL du mélange huile/TBME issus de l'extraction d'acides gras sur huile (FAME)
sont transestérifiés par un ajout de 50 ilL de Triméthylsulfonium hydroxyde (TMSH). Cette
réaction a lieu au moment de l'injection sous l'effet de la température et forme des esters
méthyliques d'acides gras, Le profil d'acides gras d'une huile est réalisé par chromatographie
en phase gazeuse (CPG) sur chromatographe 3800 de Varian® dans les conditions suivantes :

• Colonne : CP Select CB (FAME) (50m*0,25mm,film=0,25Ilm),

• Gaz vecteur: Hélium. Pression en tête de colonne 100 Kpa.
• Température de four : gradient de température, 1 85°C /min, pendant 40 minutes,
puis montée en température de 185 à 250°C à 15°C/min, maintien à 250°C
pendant 1 0 minutes,
• injecteur : splitless à 250 oC,

62
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

• volume injecté : 1 !-IL,

• détecteur : FID à 250°C.

Les données sont traitées à l'aide du logiciel Star.

IIB.3.3.4 Détermination de la teneur en phytostérols

50 !-IL de solution d'étalon interne de cholestanol sont dissous dans du chlorofonne.

Après évaporation du chlorofonne, environ exactement 1 00 mg d'huile de graines sont
ajoutés au cholestanol. La saponification est réalisée par ajout de 2 mL de KOH 1 M dans
l'éthnaol, suivie d'une agitation au vortex et d'un chauffage de 30 minutes à 60°C. Après
refroidissement, les ajouts successifs de 1 mL d'eau distillée et 3 mL d'isohexane, suivis
d'une décantation, pennettent d'obtenir un biphase sur laquelle la phase supérieure hexanique
est prélevée. L'ajout d'isohexane, la décantation, et le prélèvement de la phase supérieure
sont répétés 2 fois. Les 2 phases supérieures sont regroupées et 1 60 !-IL sont prélevés dans un
microtube en vue de leur analyse en CPG.

IIB.3.3.5 Analyses des stérols par CPG

Le dosage des phytostérols a été effectué avec une méthode développée par
(Malcherery-Nagel®). Au moment de l'injection, les phytostérols sont silylés par ajout de
1mL de N-méthyl-N-triméthylsilyl-heptafluorobutyramide (MSHFBA, Macherey-Nagel)
mélangé à 50 !-Il de 1-methyl imidazole (Sigma). Le mélange réactionnel est chauffé 5 min à
105°C pour favoriser la silylation. 1 !-IL de dérivés stérol triméthylsilyl éther sont injectés.

• Colonne : Parkin-Elmer, CPSIL 5CB 30m (D: 0,25mm, film=0,25!-1m),

• Gaz vecteur: Hélium. Pression en tête de colonne 100 Kpa.
• Injecteur : 55°C pendant 0,5min, 200°C/min jusqu'à 320°C, puis 30°C/minjusqu'à
350°C, et 350°C pendant 2,5 min.
• Température de four : 1 60°C pendant 0,5min, 10°C/min jusqu'à 260°C, 2,5°C/min
jusqu'à 300°C, puis 25°C/min jusqu'à 350°C et 350°C pendant 1 ,5 min.
• Détecteur FID : 365°C.
• Volume injecté: 1 !-Il,

63
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

IIB.3.3.6. Extraction de tocophérol

La méthode décrite dans la norme (IUPAC 2,432 et norme ISO 9936 : 1997) concerne
la détermination des teneurs en a, �, y, et 8, tocophérols (appelés globalement tocols) dans les
corps gras par la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), en polarité de phase
normale. Par extension, cette méthode est utilisée pour la détermination des tocols dans les
extraits lipidiques obtenus à partir d'huiles de l 'hibiscus sabdariffa provenant de trois pays.
Une gamme d'étalonnage est utilisée pour réaliser un étalonnage externe basé sur l'aire des
pics. L'extraction des graines à été effectuée à froid par centrifugation en utilisant le
cyc\ohexane. Suivre le même protocole que celui décrit au (IIB.3 . 1 .2), en précisant le matériel
et la méthode d'extraction des graines à froid. A chaque analyse, environ 10 mg d'huile
d'hibiscus des trois variétés sont dissous dans 1 mL de cyc\ohexane. Deux prises d'essai sont
effectuées par échantillon.

IIB.3.3.7 Dosage par étalonnage externe

Une solution-mère de référence de a, �, y, tocophérols, à 200 ppm, est préparée dans

du cyclohexane. La détermination de leur concentration est effectuée par UV lors de chaque
série d'analyses. Pour chaque série de dosage, une solution étalon à injecter est préparée à
partir de chaque solution-mère de a, �, y, tocophérols, préalablement dosée par UV. Les
concentrations sont de 0,2 à 10 ppm.

IIB.3.3.S Condition chromatographique des Tocophérols (CLHP)

Parmi les différentes méthodes d'analyse des tocophérols, la chromatographie liquide
à haute performance (CLHP) sur phase normale a été retenue. L'analyse des tocophérols a été
effectuée sur l'appareil Dionex RF 2000 équipe d'une pompé isocratique P 680.
Paramètres utilisés :
• Colonne: [Link] 1 00 sil 5,0 !lm 250 x 4,0 mm
• Détecteur fluorimètrique, la longueur d'excitation et émission sont à 290 et 3 1 7 nm
• Phase mobile: Isooctane 99,5 %, Isopropanol 0,5 %
• Boucle : 20 !lI.

64
 Chapitre lIB Matériels et méthodes-Hibiscus

IIB.3.4 Détermination de cendres

L'incinération du produit est conduite à 550 oC ± 1 5 oC dans un four à moufle, à

chauffage électrique, jusqu'à une masse pratiquement constante, (NF V 03-922). Les
échantillons pesés de graines broyées d'hibiscus sont chauffés à 550 oC pendant 3 heures. La
calcination est obtenue à 550 oC jusqu'à l'obtention de cendres blanches, gris clair ou
rougeâtres, visiblement dépourvues de particules de charbon. L'échantillon est refroidi dans le
dessiccateur et pesé dès qu'elle a atteint la température du laboratoire. La taux de cendres est
calculé de la manière suivante :

Taux de cendres (%) = (M2-MJ)/M]-Mo

Mo : est la masse, en grammes, de la capsule d'incinération,
M I : est la masse, en grammes, de la capsule d'incinération chargée avec la prise d'essai
M2 : est la masse, en grammes, de la capsule d'incinération avec les cendres.

IIB.3.5 Détermination de la teneur en protéine

Il s'agit du dosage d'azote, réalisé par la méthode Kjeldahl (Kjeltec TM 2200, Foss).
Les premiers dosages ont été réalisés avec une chaîne en flux continu, une fois les
échantillons minéralisés. Par la suite, les dosages ont été effectués avec un système Kjeltec
Tecator, par minéralisation et distillation à la vapeur en milieu basique des sels d'ammonium
formés. 0,2 à 0,8 g d'échantillon sont pesés et mis dans des tubes de minéralisation ; on y
ajoute un catalyseur à base de sulfate de cuivre et de potassium et 1 2 mL d'acide sulfurique
concentré. Après avoir laissé les tubes au repos pendant 2-3 heures, ils sont chauffés à 400 oC
jusqu'à ce que la minéralisation devienne complète (le contenu des tubes devient incolore).
Une fois refroidi, et après ajout de 80 mL d'eau distillée et 60 mL d'une solution de soude à
40%, le milieu a été distillé. Le distillat a été récupéré par bullage dans 30 mL d'une solution
d'acide borique à 4%, additionné de vert de bromocrésol et de rouge de méthyle. L'ammoniac
a été alors titré par une solution d'acide chlorhydrique à 0,l 06M, préalablement étalonné par
de la soude à 0, lM. Le virage est déterminé par le changement de coloration de la solution du
bleu au violet. Le taux d'azote est calculé par la formule suivante :

65
 Chapitre IIB Matériels et méthodes-Hibiscus

% azote = «V-Vo) x 0,2 x 14.01)/ms x 100

V: volume d'acide utilisé pour la titration de l'échantillon en mL

Vo: volume d'acide nécessaire pour le titrage du blanc
ms: masse d'échantillon sec en mg .

La teneur en protéines est calculée selon l'estimation standard qui consiste à multiplier
le pourcentage d'azote par un coefficient reconnu au niveau international de 6,25.

66
 CHAPITRE I1Ct

Résultats et discussion sur les calices de

l'Hibiscus sabdariffa L .

67
 Chapitre nCI . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

ncl. 1. Analyse de l' huile essentielle extraite par l'hydrodistillation à

partir des calices

nCl. 1.1 Etudes préliminaires sur l'hydrodistillation

Pour détenniner le meilleur rendement, en huile essentielle, des calices de l'Hibiscus

sabdariffa, une étude préliminaire a été menée sur l 'Hibiscus sabdariffa du Vietnam.
Plusieurs expériences d'hydrodistillation ont été effectuées en faisant varier la durée
d'hydrodistillation, la quantité de calices séchées et le volume d'eau (tableau 10). Ces
paramètres ont retenu notre attention durant tous les essais afin de suivre l'évolution de la
production horaire et de la nature des composés recueillis. Pour pouvoir conclure quant à la
valeur de ces paramètres, il convient de réaliser un compromis optimum entre :

• la productivité (durée des distillations effectuées),

• la valorisation de la matière première (ou rendement en huile essentielle par

rapport à la matière première consommée). De nos essais, les meilleurs rendements ont été
obtenus avec les conditions suivantes :

• durée limitée d'hydrodistillation : huit heures,

• quantité de matière végétale utilisée : 300 grammes,
• volume d'eau : 3 litres.
No Quantité Eau Matière % Durée de H.E Rendement
2 (% )4
d'essai Matière (Litre) sèche/eau d'humidité distillation obtenu
3
Végétale (gr) ! (gll) (hr) (gr)
1 200 3 66,6 1 5,0 8 0,08 0,04
2 200 3 66,6 1 5,0 8 0,08 0,04
3 300 3 100,0 15,1 8 0,20 0,07
4 300 3 100,0 15,1 8 0,21 0,07
5 400 5 80,0 15,0 8 0,18 0,05
6 400 5 80,0 1 5,0 8 0,17 0,05
7 500 4 125,0 15,1 8 0,18 0,04
8 500 4 125,0 1 5,0 8 0,17 0,03

Tableau 10: Résultats obtenus par l'hydrodistillation d'Hibiscus sabdariffa du Vietnam

1. calice séché
2. % d'humidité de la partie extraite
3. gr d'huile essentielle obtenue par hydrodistillation par I OOgr de matière sèche
4. rendement en gr d'huile essentielle obtenue par 1 OOgr de matière sèche

Nous avons généralisé ces conditions pour l'étude des deux autres espèces d'Hibiscus
sabdariffa, ceux du Sénégal et du Mexique.

68
 Chapitre HCL Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

IlIe1. 1.2 Résultats et discussion sur l'analyse de la fraction volatile obtenue par
Hydrodistillation.

L'échantillon d'hibiscus du Vietnam a été fourni par la Société AMPHARCO, à Ho

Chi Minh Ville (Vietnam). L'hibiscus du Sénégal a été acheté au marché de Thiès (Sénégal),
celui du Mexique a été fourni par la Société AMARE, « Asociacion Mexicana de Agro­
Recursos » (Mexique).

Le calendrier des récoltes, les techniques de cueillette, de conservation et de séchage

nous sont inconnus" . Les résultats des études complémentaires des calices séchés de
l 'hibiscus sabdariffa de trois pays (Vietnam, Sénégal et Mexique), par hydrodistillation
(tableau 10) montrent des variations des différents rendements en huiles essentielles, en
fonction de l'origine de la matière première.

Ainsi, les huiles essentielles ont été obtenues avec un rendement moyen de 6,lxlO-2 %
2 2
pour l'espèce provenant du Vietnam, de 5,2x l O- % pour celle du Sénégal et de 4, lx10- %
pour celle du Mexique (tableau I l). Très peu d'huiles essentielles est présente dans le calice.
L'extraction de cette huile, verte et visqueuse à température ambiante, débute après 1hOO
d'hydrodistillation. L'huile récupérée pourrait être constituée majoritairement d'acides gras
puisqu'elle est solide à température ambiante. En principe, la teneur des plantes en huiles
essentielles est faible, de l'ordre de 1 à 3 %, à l'exception du clou de girofle de (14 à 19%), du
3 3
macis (10 à 13%), de la noix de muscade (8 à 9 %) et de la cardamone (4 à 10 %) [ 6. 7J •

Origine de % Dnre de Huile essentielle" Rendement' Ecartype

l'hibiscus d'humidité distillation [g] [% ]
(hr)
Vietnam 1 1 ,5 6,0 0,19 0,06 0,02

Sénégal 12,0 6,0 0,1 6 0,05 0,03

Mexique 14,00 6,0 0,16 0,04 0,01

moyenne de 3 essaIs
•

Tableau 1 1 : Résultats comparatifs obtenus par hydrodistillation des huiles essentielles

d'hibiscus sabdariffa du Vietnam, du Sénégal et du Mexique.

69
 Chapitre I1C ! . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

Afin d'optimiser ce rendement, nous avons procédé à l'étude cinétique de

l'entraînement à la vapeur d'eau, en fractionnant cette opération en intervalles de 60 minutes.
La figure12 représente les résultats obtenus. On remarque qu'une durée d'entraînement à la
vapeur de 300 à 360 minutes permet de récupérer la majorité de l'huile essentielle. Notons
qu'il convient de limiter au maximum la durée de cette opération, afin d'éviter les
dégradations thermiques.

0,07

0,06

0,05

� 0,04
o

Muique

240 300 360

Temps [min)

Figure 23: Etude cinétique de l'extraction de l'huile essentielle par entraînement à la

vapeur à partir de l'Hibiscus sabdariffa des trois pays.

Le développement des moisissures et des micro-organismes est favorisé par l'humidité

qui peut provenir de la plante elle-même, d'une mauvaise aération du lieu de conservation ou
de 1 'humidité du sol, facteurs qui peuvent accélérer les processus de fermentation ou
d'oxydation de certains constituants végétaux. Aussi, est-il souvent nécessaire, dans un
premier temps, de soumettre les produits récoltés au séchage par le soleil, en sachant qu'un
séchage trop prolongé au soleil influence non seulement la couleur mais modifie aussi sans
doute la nature des composés extractibles[381.

Par conséquent, nous avons jugé important, avant toute extraction, de noter la
couleur[261 et la teneur en humidité des trois échantillons d'hibiscus étudiés. Lors d'une étude

70
 Chapitre IIC ! . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

future, afm d'optimiser les rendements en telle ou telle molécule, il sera également nécessaire
d'étudier aussi la morphologie des espèces d'hibiscus soumises à l'expérimentation.

D'après les résultats de nos déterminations, la teneur en humidité, pour les trois
hibiscus, se situe entre 1 0 et 14 %. Cela montre que le séchage au soleil au stockage n'est pas
totalement efficace. Cependant, il faut reconnaître que ce mode de séchage est le plus simple
et le plus économique, ce qui explique qu'il soit le plus utilisé dans ces pays. De plus, si elle
est bien conduite, c'est aussi la méthode la moins destructrice.

Les extraits d'huiles essentielles provenant de l'hydrodistillation des calices d'hibiscus

du Vietnam, du Mexique et du Sénégal ont été analysés sur un spectromètre de masse couplé
à un chromatographe en phase gazeuse (CPG/SM). L'identification des composés a été
réalisée sur la base de comparaison des spectres de fragmentations obtenus avec ceux de la
banque de données WILEY 275.

RT: o ro _ 9J9S
25.2)

TIC MS
.00

0>:17.002
95

ro "
7
es

00

75
7U

65

..,

55

•
'"

..s

40

35
�JJ6
11
'"
5 6
25

3J
13
15
1 923 :<0,:<6 12
.. 2 10 33.j39
10 SS3 4
::s.j 33.3>
� lh�,..:5:;::.1:jJ;j�::"!!.;J· 'T
�� -'�O:�'3�."�
.,; ",�';;'7�
'5� =:::3Jr!
..;:'Z7:;·.'f.
�lJI':.,,�r-r�
(!;'�� -r ��: :;:."':::�
\=l,��35�aTe;·�1:";::.73;,,:T :=;:6�"�"rJ7é;::;:::
::[04;::::; 4<5
Tlme(snlrll
a 5 10 1S 3J � � $ � � ru

Figure 24 : Chromatogramme de la fraction aromatique d'hibiscus sabdariffa L.

Des signaux des chromatogrammes des huiles essentielles obtenus, nous en avons
identifié 13 (Tableau 12). Nous constatons que la très grande majorité des composés sont
l'acide hexadécanoïque (oléïque) et l'acide octadécadiènoïque (linoléïque). Ils représentent
43,12 % et 45,19 % pour l'hibiscus du Vietnam, 41,40 % et 44,53 % pour celui du Sénégal
et 4 1 ,3 1% et 44,60% pour le celui du Mexique. Nous avons également identifié l'eugénol
dans toutes les variétés.

71
 Chapitre IlCI . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

N° de pic Composés Formule Vietnam Sénégal Mexique

1 décénol C lOH 1S O 0,30 0.28 0,30
2 eugénol C IOH1202 0,54 0,75 0,5 1
3 époxide bisaboléne C 1sH240 0,12 0,10 0,15
4 acide tétradécanoique C 14H2S02 1,05 1 , 22 1 ,27
5 éicosène C2oH3 S 1 ,62 2,06 1 ,70
6 hexadécanoïate de méthyle C 17H3402 4,46 4,35 4,43
7 acide hexadécanoïque C 1sH3402 4 2,12 41,40 41.31
8 octadécadiènoïate de méthyle C 1 9H34 02 3,15 3,13 3,19
9 acide octadécadiènoïque C 1 sH3202 4 5,19 4 4, 5 3 4 4.60
10 docosane C22H46 0,44 0,37 0,50
11 pentacosane C2sHs2 0,52 0,75 0,56
12 heptacosane C27Hs6 0,43 0,62 0,5 1
13 octacosane C27Hs6 0,36 0,37 0,50

Tableau 12: Composés des fractions aromatiques d'hibiscus sabdariffa du Vietnam, du

Sénégal et du Mexique en (%) relatif.

La fraction obtenue est très riche en acides gras, lui conférant cet aspect solide à
température ambiante. La présence d'acides gras, en quantité importante, confirme
3
l'hypothèse d'hydrolyse de triglycérides d'acides gras [ 91 . Il est intéressant de remarquer qu'il
s'agit de composés relativement « lourds ». Il ne faut donc pas chercher l'arôme de l'hibiscus
parmi ces composés « lourds ». Cet arôme proviendrait d'une combinaison des dérivés
terpéniques (pour les notes aromatiques) et des dérivés du sucre (pour l'odeur de caramel).
D'autre part, l'évolution des dérivés aliphatiques d'acides gras peut masquer l'arôme global
de l'hibiscus [40,41 1 . La molécule aromatique peut également être isolée par
distillation/extraction à partir de calices de l'hibiscus ; par contre, le processus de séchage a
pu réduire, particulièrement la quantité de trois arômes dominants, terpinéol, linalol et
limonène. Des calices frais de l'hibiscus sont nécessaires afin d'identifier ces composés
40
aromatiques[ 1 .

72
 Chapitre nCI . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

IICI. 2 Résultats et discussion sur l'efficacité extractive des différentes

techniques et solvants

Dans les tableaux 13, 14 et 15 sont donnés les rendements moyens, en « concrètes », à
partir des calices d'hibiscus du Vietnam, du Sénégal et du Mexique respectivement (masse
« concrète »/masse initiale). Ils ont été calculés sur trois essais pour les quatre techniques
différentes.

Les rendements moyens d'extraits pour les calices d'hibiscus du Vietnam, avec
1 'hexane, sont de

• 1 ,7 % pour la technique du soxhlet,

• 1 ,3 % par les ultrasons (E.M.A.U.S),
• 1 , 1 % pour la macération
• et 0,8 % pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson,

Pour le dichlorométhane ces rendements moyens sont

• de 2,3 % pour la technique du soxhlet,

• 1,7 % pour les ultrasons (E.M.A.U.S),
• 1 ,6 pour la macération,
• 1 ,3 % pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson.

Méthode Durée Mass de Rendement 0/0 Ecart type

d'extraction d'extraction Concrète (g) moyenne

Soxhelt
Rexane 6h 0,24 1 ,7 0,01
Dichlorométhane 0,35 2,3 0,02
EMAUS
Rexane 2h 0,21 1,3 0,06
Dichlorométhane 0,25 1,7 0,01

Macération
Rexane 3 jours 0, 1 8 1,1 0,03
0,24 1 ,6 0,02
Dichlorométhane

DES
Rexane/ Eau 3h 0, 1 1 0,8 0,01
DichlorolEau 0,20 1 ,3 0,02

* moyenne de 3 essais
Tableau 1 3 : Comparaison des rendements en « concrète » d 'Hibiscus sabdariffa du Vietnam
par les différentes techniques d'extraction et de solvants.

73
 Chapitre IlC ! . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdari((a

Pour les calices du Sénégal, les rendements moyens d'extraits, par l'hexane, sont

o de 1 ,4 % pour la technique du soxhlet,

0 1 ,0 % pour les ultrasons (E.M.A.U.S),
o 0,9 % pour la macération,

o et 0,6 % pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson.

Pour le dichlorométhane les rendements moyens sont

o de 1 ,9 % pour la technique du soxhlet,

o 1,5 % pour les ultrasons (E.M.A.U.S),

o 1,4 pour la macération,

o 1,0 % pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson.

Méthode Durée Mass de Rendement % Ecart type

•

d'extraction d'extraction Concrète (g) Moyenne

Soxhelt
Hexane 6h 0,22 1 ,4 0,06
Dichlorométhane 0,28 1 ,9 0,05
EMAUS
Hexane 2h 0,1 5 1 ,0 0,05
Dichlorométhane 0,21 1 ,5 0,01

Macération 0,1 5 0,9 0,03

Hexane 3 jours
0,19 1 ,4 0,02
Dichlorométhane

DES
Hexane/ Eau 3h 0,07 0,6 0,01
DichlorolEau 0,1 5 1 ,0 0,03

moyenne de 3 essaIs
•

Tableau 14: Comparaison des rendements en « concrète » d'hibiscus sabdarifJa du Sénégal

par différentes techniques d'extraction et de solvants.

Pour les calices d'hibiscus du Mexique, les rendements moyens des extraits par l'hexane sont
o de 1,3 % pour la technique du soxhlet,
o 0,9 % pour les ultrasons (E.M.A.U.S),
o 0,8 % pour la macération
o 0,6 %, pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson.

Pour le dichlorométhane, les rendements moyens sont :

o de 1 ,8 % pour la technique du soxhlet,
o 1,4 % pour les ultrasons (E.M.A.U.S),
0 1 ,3 pour la macération
o et 0,9 % pour la distillation-extraction simultanées (DES), Likens-Nickerson.

74
 Chapitre IlC I . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

Méthode Durée Mass de Rendement 0/0 Ecart type

•

d'extraction d'extraction Concrète (g) Moyenne

SoxheIt
Hexane 6h 0,22 1 ,3 0,04
Dichlorométhane 0,28 1,8 0,03
EMAUS
Hexane 2h 0,15 0, 9 0,03
Dichlorométhane 0,21 1,4 0,02

Macération 0, 1 2 0,8 0,04

Hexane 3 jours
0,14 1,3 0,02
Dichlorométhane

DES
Hexane/ Eau 3h 0,08 0,6 0,02
DichlorolEau 0, 14 0,9 0,01
"
moyenne de 3 essaIs

Tableau 1 5 : Comparaison des rendements en « concrète » d' Hibiscus sabdariffa du Mexique

par différentes techniques d'extraction et de solvants.

Quelle que soit la teclmique d'extraction, si on compare les deux solvants, le

dichlorométhane fait preuve d'une efficacité largement supérieure à celle de l'hexane (figure
25). Dans le cas de l'extraction par soxhlet, de bons rendements (2,3 % et 1,7 %) ont été
obtenus quel que soit le solvant. Par contre, l'hexane ne permet pas d'atteindre des
rendements suffisants avec les trois autres techniques d'extraction.

L'efficacité supérieure du dichlorométhane peut s'expliquer par sa polarité et son

faible point d'ébullition (ttb = 40°C) d'où une pénétration efficiente et, d'autre part, par son
pouvoir extractant. Cela favorise la pénétration et la diffusion du solvant dans les cellules ou
organites renfermant l'essence et donc facilite la libération de cette dernière. Le rendement le
plus important a été obtenu par extraction au soxhlet. Cependant, cette méthode consomme de
grands volumes de solvant et le temps d'extraction est long (entre 6 à 8 heures) et la
macération nécessite 3 jours. La macération assistée par ultrasons (EMAUS) peut être
considérée comme une méthode plus rapide et efficace. Elle permet, en utilisant une technique
simple, d'obtenir un rendement élevé en extrait, avec une durée d'extraction souvent
3
limitée[ 91 . L'extraction par Likens-Nickerson montre une faible reproductibilité du fait de
l'équilibre difficile à atteindre entre les vapeurs de solvant et celles de l'eau. Cependant, elles

75
 Chapitre I1C ! . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdarif{a

pennettent de caractériser sélectivement les composés volatils présents dans les calices
d'hibiscus, avec moins des acides gras.

�
�
-
" 1 ,2
"
E
" 0,9
"
"

0::
"

Hexane

Soxhlet Dichlorométhane
EMAUS
Macération
Likens-
Neckerson
Technique d'extraction

Figures 25: Comparaison de l 'influence du solvant et de la technique d'extraction sur le

rendement

I1Cl. 2.1 Résultats des analyses par CPG/SM

Pour l'analyse qualitative, réalisée sur un spectromètre de masse couplé à un
chromatographe en phase gazeuse (CPG/SM), nous avons analysé des extraits en « concrète »
obtenus par différentes techniques, toujours sur des calices d'hibiscus des trois pays cités ci­
dessus: la distillation-extraction simultanées (D.E.S), la macération, les ultrasons (E.M.A.U.S)
ou par soxhlet. Dans les composés volatils de la concrète extraite des calice d'hibiscus, par les
techniques de soxhlet, d'ultrason (EMAUS) et de macération, nous avons identifié un plus
grand nombre (20) de composés lourds en particulier, les hydrocarbures saturés de C14 à C30
et des composants stéroliques (Tableaux 1 6 , 1 7 et 18).
Par exemple, pour les extraits provenant de l 'hibiscus du Vietnam : les composés
majoritaires sont l'acide octadécanoïque (oléique ; 1 9,83%), l'acide octadécadiènoïque
(linoléique ; 43,12%). Mais nous trouvons aussi le l3-sitostérol (15,82%), le stigrnastérol
(5,04%) et le campestérol (4,1 9%).

76
 Chapitre HC L Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

Nous retrouvons des pourcentages analogues pour les autres extraits des hibiscus du
Sénégal ou du Mexique.

TR Composés Formule Soxhlet Ultrason Mécaration D.E.S

8,50 eugénol ClOH1202 0,53 0,67 0,50 1 6,52

9,47 vaniline CSHS03 0,19 0,58 0,1 6
10,19 époxyde de bisaboléne C 1sH24O 0,10
17.40 acide tétradécanoique C 14H2S02 0,05 0,08 0,06 0,09
1 9,04 éicoséne C2oH3S 0,53 0,62 0,42 0,1 8
19,21 farnésylacétone ClsH30 0 6,12
21,25 hexadécanoïate de méthyle C 1 7H34 02 2,66 3,61 2,42 3,01
22,30 acide octadécanoïque C 1 sH3402 1 9,83 20,13 20,01 52,51
24,07 octadécadiènoïate de méthyle C 1 9H34 02 0,13 0,1 5 0,1 1 0,7 1
25,20 acide octadécadiènoïque C 1 sH3202 43, 1 2 44,02 44,32 13,62
28,55 acide éicosénoique C20 H3S02 0,14 0,1 1 0,10
30,19 docosane C22H46 ••••••••
3,68
33,41 pentacosane C2SHS2 ........ 3,12
36,32 heptacosone C27Hs6 ••.••••
0,34
39,25 u-tocophérol C2sH4S02 1,97 2,33 1 ,91
39,53 cholestérol C27H46 2,95 3,49 2,92
41,11 carnpestérol C2sH4SO 4,19 4,22 4,01
4 1 ,35 stigmastérol C29�SO 5,04 5,25 4,82
42,37 jJ-sitostérol C29HsoO 1 5,82 I l ,01 13, 1 1
43,46 lupéol C30HsoO 2,65 3,66 2,63

Tableau 1 6: Composés identifiés d'hibiscus du Vietnam par différentes techniques d'extraction,

avec le dichlorométhane.

77
 Chapitre nc 1 . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

0.00·50.96 25.2082
100
RT:
.,
B.TIC76E7
NL:

95 02071504
90
i
MS

85
80 22.29180
75
o
11)

70 ] "-
65
.,
.!l
ReWli� Abundance
55 :;:..

� 31.34 ë
;>.. )-

50 , �
45 ..,

40 8
.g .g .c

43.,47
Co

35 "2
".� �
El
,�- =8 11)

30 ' :� � .8- ".Q)

25
20
§
Î 'I ]\
�
l �8 46.394
15 it :�><J9.23 / 2�
/g �
33
li � 35.31 36. 3 3
39.3..9.
10 -: 7 08.53 / 1 19.0L j
,g
.
-

55 12 5 28 34 2� 11 1il 1 1!i1 47.A3

0

��'��, lI�..�,��:��[�.,,��I1":�����14�:��·lF��Vt��-:��,-����'��
: jr,-.-�5.����J,1"� r� , ������ ������
����;;;:=
o 5 10 15 � 25
Time (min)
35,
W 40 45 50
Figures 26: Chromatogrammes des absolues d'hibiscus du Vietnam obtenus par Ultrasons
(solvant : (dichlorométhane)

'"
25.21 NL:
R T : O .O O . 5 0 . 9 7

,
, .S!'
u
u
3.83E7

" 42.43 T1C M S

g
.S!' 0
"
02071503
c
:�
• �
" 0 •

ë
·U 0

"
"
� /1 .�
·U
�

l
22.30

"
70
f\.
0
"
0
u

0
0 E
0
ë
.� �
•

'" /
0

li'
Re60

"
ve 55
lall

un 5 0

�� 45
'"
li'
'"
E
E
"il

0
g
.S!'
\,,�,
" , ,
� 41.10.

'0
.S!' .S!'
u u u
0

"
�

."
c

.:
'U
'M �

'0
0 0
c
:!:l
0 ë
'0
il
'" " '"
8\
�
"
� �

,
'u

:.§ "
'0
c
0 � 0
�
30

"
u
c
�
0
,/
�
0

�
'0

:a
·U

�
� 43.46
0

�
0

"
�
•
20
0
6.27 0

"
39.56

/'
8.51

5.45
6�50 9.46

" " " " " "

47.34 47.4 0

"
5.41

20 30
T l m e (min)

Figures 27 : Chromatogrammes des absolues d'hibiscus du Vietnam obtenues par Soxhlet (solvant
dichlorométhane)

78
 Chapitre nc l . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

TR Composés Formule Soxhlet Ultrason Mécaration SDE

8,50 eugénol C I OH 1202 0,48 0,61 0,50 1 5,50

9,47 vaniline CsHS01 0,22 0,72 0,15
1 0, 1 9 époxyde de bisaboléne C 1sH24 O 0, 1 5
17.40 acide tétradécanoique C 14H2S02 0,07 0,10 0,1 1 0,12
19,04 éicoséne C2oH1S 0,52 0,50 0,52 0,17
1 9,21 farnésylacétone C 1 sH1OO 6,12
2 1 ,25 hexadécanoïate de méthyle C 1 7H1402 2,60 3,00 3,90 3,01
22,30 acide octadécanoique C lsH1402 19,83 20,21 1 9,88 53,35
24,07 octadécadiènoïate de méthyle C 1 9H1402 0,12 0,12 0,16 0,71
25,20 acide octadécadiènoïque C1sH] 202 42, 1 0 43,60 43,50 14.00
28,55 acide éicosénoique C20 H1S02 0,13 0,14 0,19
30, 19 docosane C22H46 3,90
33,41 pentacosane C2SHS2 3,20
36,32 heptacosone C27Hs6 0,36
39,25 a-tocophérol C2SH4S02 2,20 2,10 2,60
39,53 cholestérol C27H46 3,12 3,30 2,90
41,11 campestérol C2 S�SO 4,10 4,15 4,20
41,35 stigmastérol C29�S O 4,20 5,20 5,1 1
42,37 fJ-sitostérol C29HSOO 14,82 12, 1 5 13,90
43,46 lupéol CloHsoO 2,50 3,30 3,51

Tableau 17: Composés identifiés d'hibiscus du Sénégal par différentes techniques d'extraction
avec le dichlorométhane.

79
 Chapitre nCl . Résultats et discussion sur les calices de l'Hibiscus sabdariffa

TR Composés Formule Soxhlet Ultrason Mécaration SDE

8,50 eugénol ClOH 1202 0,55 0,58 0,52 16,13

9,47 vaniline CSHS03 0,21 0,62 0,20
1 0, 1 9 époxyde de bisaboléne C1sH24O 0,14
1 7.40 acide tétradécanoique Cl4H2S02 0,02 0,06 0,09 0,15
1 9,04 éicoséne C20H3S 0,50 0,50 0,49 0,22
1 9,21 famésylacétone C1sH300 6,17
21,25 hexadécanoïate de mèthyl C17H34 02 2,90 2,65 4,05 3,12
22,30 acide octadécanoïque CIsH34 02 20,80 20,35 19,40 53,20
24,07 octadécadiènoïate de méthyle Cl 9H3402 0,13 0,1 8 0,15 0,8 1
25,20 acide octadécadiènoïque C1sH3202 42, 12 42,25 43,1 2 13,57
28,55 acide éicosénoique C20 H3S02 0,17 0,22 0,24
30, 1 9 docosane C22H46 3,02
33,41 pentacosane C2sH52 3,1 1
36,32 heptacosone C27Hs6 0,50
39,25 a-tocophérol C28H4S02 1,99 2,45 2,62
39,53 cholestérol C27H46 2,97 3,35 2,97
41 , 1 1 campestérol C2SH4S0 4,30 4,10 3,1 1
41,35 stigmastérol C29H4S0 5,14 5,59 5,20
42,37 p-sitostérol C29HSO O 1 5,35 14,01 1 4, 1 5
43,46 lupéol C30HSO O 2,85 2,66 4,05

Tableau 1 8 : Composés identifiés d'hibiscus du Mexique par différentes techniques d'extraction.

80
 Chapitre IIC r . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

oS. "
TOC �•
. .", "
,

]
',
,
Hydrodistillation
l
,

,
, '
, ,,

1 ,
,
,

t,
''1' '
.CC · 50 .99
1.93 Hl:
"
lie MS
3.S6E7

. ." " 0" .

, , ," ,u,

i
'o " " 0'01'.01

, " ,-, , " ,. , . .. . '1.0' ,. ,. 1 ,• • , 1 . . . . "_,, " ." < ' .0 . <'.n

..
" " " " " 1
..
"
"

!
..
..

J
..
B
.. (DES) Distillation extraction
..
i ..

"
"" . s , .• o
, NL:
'!i
..
• .san
TIC MS
"
n.U. "aH20'

"1'
"

�
1
"

H
s·t< - sl
' • .1 ' 12.10
"
15.4 3
'fi
H...
l, 'i'<..,. 31."
[Link] ••.u

"' e
�
• " , "
Tlm mlo)
" ..
_�O.S5

'Ii
Nt:
G.1GE1
...

1 l\icMS

1
0201150.
"
"

� s.n
.. 4\.SI

" .QI (EMAUS) Ultrason

.
.. .
.
..

il
"

6."
"

J!
..

'ï 22J _
"
\
1�·1I
31.S.

• ..
"' "
'i
..
..

.,

.. . sa.u
S.I'
S.U

,
7.1'

.. "
11
'

.•3
0•

�I 1
" ,
Tlm ( 1.)
, .
1.� .S23I
l : 1 .2

"
:" ·�j.n ,["" .J\

n,n
.;30
'5

..
n.3l lU'

..

NL:
, ..
[Link]

.. TIC MS
0107\503
.. C
.. ..
•
Soxhlet
il � ,1 ·
'UL
" , ..11\.33

TTI
l�.O

'g
: �;: 1. 1 �� rlp·U
\. 28.!;1
'!
S.H
'" 12-,�
.5 :�j99 17,L�,�·e_o

1
.. , .. " " , " ..
"m min)
..
.. D
.. " .5 1

..
! ..

"
"
"
"
" Macération
..
,
•
.. " " " " .. "
Tlm. {ml.)

Figures 28 Comparaison de chromatogrammes des absolues d'Hibiscus du Vietnam obtenus par 5

techniques d'extraction solvant : dichlorométhane

81
 Chapitre IlC! . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

A partir de figure 28, on peut faire deux remarques :

a) Si l'on compare l'extrait obtenu par soxblet avec l'huile essentielle obtenue par
hydrodistillation, on s'aperçoit que les chromatogrammes ne sont pas identiques : les
produits obtenus sont donc différents, le pouvoir « extracteur » d'un solvant est plus
performant que celui de l'eau, même chaude.

b) Que les produits extraits par solvants sont essentiellement des stérols.

Par les techniques de distillation extraction simultanées (DES), nous avons identifié un
composé phénolique «eugénol» que a été obtenu avec un quantité très élevée (figures 28).
L'eugénol est l'un des composants principaux des calices de [ 'hibiscus sabdariffa et est
également l'un des composants importants des clous de girofle. L'eugénol est thermiquement
stable pendant la période de séchage [40,4 11. Dans le tableau 19, nous pouvons remarquer que
les composés, obtenus lors de nos études d'extraction par solvant sur [ 'hibiscus sabdariffa,
sont quasiment les mêmes que ceux mentionnés dans la littérature pour l'hibiscus tiliaceus du
Brésil [401.

Hibiscus sabdariffa Hibiscus tiliaceus I<UI

Nos résultats
benzophénone
acide tradécanoique acide tradécanoique
éicosène éicosène
hexadécanoïate de méthyle hexadécanoïate de méthyle
acide octadécanoïque acide octadécanoïque
octadécadiènoïate de méthyle octadécadiènoïate de méthyle
acide octadécadiènoïque acide octadécadiènoïque
acide éicosènoïque -

a-tocophérol a-tocophérol
cholestérol cholestérol
stigmastérol stigmastérol
campestérol campestérol
�-sitostérol �-sitostérol
Lupéol -

. .
Tableau 19: Composes IdentIfies dans l' « absolue » d'HIbiSCUS sabdariffa L. et d'hibiscus
tiliaceus L" de la famille Malvaceae,

82
 Chapitre IIC I . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdariffa

IlC l . 2.2 Conclusion

Cette étude comparative des méthodes d'extraction des calices de l 'hibiscus

sabdariffa, à partir de 5 techniques d'extraction (Hydrodistillation, Soxhlet, et Liken­
Nickerson, par ultrasons (E.M.A.U.S) et macération), et avec 3 solvants différents
(eaulhexane/dichlorométhane), montre une grande différence qualitative et quantitative.

D'un point de vue rendement d'extraction:

La fraction aromatique des calices d'hibiscus sabdariffa, obtenue en très faible quantité,
2 2
à raison d'un rendement de 4,l x l O- à 6.1 x l O- %. Elle est très riche en acides gras, lui
conférant cet aspect solide à température ambiante_ La « concrète » obtenue par extraction des
soxhlet, macération et ultrason a permis d'obtenir un rendement d'extraction convenable (de
1 ,3 à 2,3 par dichlromethane et 0,8 à 1,7 par l'hexane).

Le temps d'extraction et la quantité de solvant sont nettement réduits lorsque nous

utilisons la méthode d'extraction par ultrasons qui nous semble être la plus efficace. En effet,
avec cette méthode, en utilisant le dichlorométhane comme solvant, le temps d'extraction n'est
que de 160 min seulement. Tandis qu'avec ce même solvant, même en quantité supérieure, la
technique de la macération nécessite 3 jours et celle du soxhlet 6 heures.

Si nous comparons les rendements en fonction des différents paramètres du mode

opératoire, nous constatons que la méthode par soxhlet est relativement performante, quel que
soit le solvant utilisé, hexane ou dichlorométhane, avec un meilleur résultat pour le
dichlorométhane cependant. Dans tous les cas, le dichlorométhane semble être un solvant de
choix pour exploiter les calices d'hibiscus. Mais il est répertorié (C3) dans la classification
CMR 1 • Il est donc recommandé, si c'est possible, de le remplacer par d'autres solvants moins
toxiques.

D'un point de vue de la composition:

Nos résultats montrent que la technique d'extraction employée influence la

composition des produits obtenus. Douze (12) composés ont été identifiés avec l'huile
essentielle (hydrodistillation) alors que ce nombre monte jusqu'à 2 1 avec la « concrète »
(extraction par solvant). Les composés majoritaires correspondent aux acides octadécanoïque

1 La classification CMR répertorie les substances cancérogènes (C) mutagènes (M) toxiques pour la
reproduction, (R). Dans chaque catégorie, le danger diminue de la catégorie 1 à la catégorie 3 . (source :
www. [Link]).

83
 Chapitre lICl . Résultats et discussion sur les calices de l' Hibiscus sabdari((a

(oléique) et octadécadiènoïque (linoléique). Dans les extraits des « concrètes » d'hibiscus,

extraite par la technique de soxhlet, d'ultrason (EMAUS) et de macération, nous avons
identifié, en particulier, des hydrocarbures saturés de C l4 à C30 et un certain nombre de stérols
que sont le �-sitostérol, le campestérol et le stigmastérol. Par les techniques de distillation
extraction simultanées (DES), nous avons identifié l'eugénol en quantité très élevée.
D'ailleurs, ce composé se retrouve dans tous les extraits, en quantités variables.

La présence d'esters méthyliques ou éthyliques d'acide gras peut être considérée

comme un élément caractéristique de cette plante de la famille des Malvacés [40J . Il est
intéressant de noter l'abondance de quelques dérivés du stérol : c'est aussi un autre aspect
typique de l'hibiscus pour son utilisation éventuelle en tant qu'antibiotique et anti­
inflammatoire [40J .

84
 CHAPITRE IIC2.

Résultats et discussion sur les huiles des

graines de l'Hibiscus sabdariffa L

85
 Chapitre HC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

lIe2. Extraction et caractérisation des huiles des graines de l' hibiscus

IIe2. 1.1 Propriétés physico-chimiques des huiles

Les caractéristiques physico-chimiques des trois variétés d'huiles étudiées, la masse

volumique, le point de fusion, les indices de réfraction, de saponification, d'acide, d'iode
ainsi que la teneur en protéines et en cendres ont été déterminée selon des méthodes
normalisées AFNOR[421 . Les tests physico-chimiques peuvent permettre d'évaluer les
caractéristiques des huiles données et ce, pour un objectif bien spécifique. L'analyse de ces
résultats physico-chimiques des trois variétés d'huiles d'hibiscus (Tableau 20) montre de
légères différences caractéristiques.

Les valeurs moyennes des masses pour 1000 graines d'hibiscus sont respectivement
(39,0 g), pour l'hibiscus du Vietnam, (21,3 g) pour celui du Sénégal et (1 9,7 g) pour la
variété du Mexique. Les propriétés physiques des graines déterminent la façon dont elles ont
été manipulées pendant la fabrication[431 . Il est important de noter que, plus les graines sont
lourdes, plus la quantité d'huile extraite sera élevée [441 .

Es�èces Hibiscus sabdariffa L. Literature

Caractéristigue' Vietnam Mexigue Sénégal Soja [",46[ Tournesol [46,47[
Masse des graines 1 000(g) 39,0 ± 0,03 19,70 ± 0,02 2 1 ,3 1 ± 0.01 50-400 30-80

Humidité (%) 8,0 ± 0,8 7,7 ± 0,4 9,0 ± 0,5 2,57 4,96
Huile (%) 22,5 ± 0,1 19,3 ± 0,3 19,4 ± 0,4 1 5,08 40,32

Protéine (N % x 6.25) 23, 1 8 ± 0,2 22,6 ± 0,6 22,4 ± 0,7 17,94 24,1

Cendre (%) 5,2 ± 0,7 4,4 ± 0,5 4,6 ± 0,4 3,50 3,28

Indice de réfraction (25 ° C) 1 ,462 ± 0,5 1,461 ± 0,03 1 ,463 ± 0,02 1 ,472 1 ,469

Masse volumique (25 °C) 0,927 ± 0,001 0,926 ± 0,001 0,928 ± 0,002 0,922 0,923

Indice d'acide (mg KOHlg) 1 ,3 ± 0, 1 1 ,2 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1 ,4 1 ,3

Saponification (mg KOHlg) 1 98,2 ± 0,8 197,2 ± 0,8 196,7 ± 0,7 195,2 1 94,0

Indice d' iode (mg iode/g)wijs 96,6 ± 1,4 95,2 ± 1 .5 95,8 ± 0,8 94,0 82,4
bhydrates de carbone totaux (%) 4 1 ,2 ± 1 , 1 45, ± 1,7 44,8 ± 1,9 55,30 27,34

'moyenne de 3 essais
bhydrates de carbone, calculé par la différence, [ I OO-(humidité + cendre + huile + protéine)] [48.491.

Tableau 20: Indices physico-chimiques des huiles de l'Hibiscus des trois espèces retenues.

86
 Chapitre IIC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

Les rendements d'extraction d'huiles végétales sur des graines de l'échantillon

vietnamien (22,5 %) sont légèrement meilleurs que pour les deux autres variétés, celle du
Sénégal (19,4 %) et celle du Mexique (19,3 %). Ces variations pourraient être expliquées par
la diversité de la maturité du phénotype des huiles végétales. La quantité d'huiles contenue
dans ces trois hibiscus est équivalente à celle issue d'hibiscus provenant du Soudan [50.1 , et
d'Inde [SI l , et également de l'huile de soja[4s1 .

Les graines contiennent des quantités élevées de protéines (23 %) et d'hydrates de

carbone (45 %). Elles constituent une excellente source d'énergie et de protéines et présentent
une bonne teneur en nutriments essentiels. Le contenu des protéines est comparable à celui
des huiles classiques comme celle du tournesol [4647] et du soja [521. La teneur en cendres pour
le trois espèces du Vietnam, du Sénégal et du Mexique sont respectivement de 5,2 %, 4,6 %
et 4,4 %. Ces résultats semblent indiquer que les graines d'hibiscus contiennent un
pourcentage plus élevé en matière minérale. Les valeurs pour l'indice de réfraction et la
densité sont très proches de celles publiées sur l'huile d'olive, l'huile de tournesol et l'huile
S3
de soja[47, 1

Les huiles extraites d'hibiscus présentent toutes un indice de saponification et un

indice d'iode importants. La différence entre les trois hibiscus provenant de trois pays
différents n'est pas significative. Les indices de ces huiles sont comparables à ceux d'huiles
conventionnelles comme le soj a et tournesol [4S,461 . La valeur du taux de saponification indique
le poids moléculaire moyen, tandis que la teneur en iode exprime le degré d'insaturation. La
faible valeur de l'indice d'acide caractérise la pureté et la stabilité des huiles. L'indice
d'acidité pour les trois variétés est faible ce qui pourrait permettre une utilisation alimentaire.

IIC2. 1.2 Composition en acide gras

Les acides gras sont dérivés en esters méthyliques pour être analysés par
chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire. Des mélanges d'esters méthyliques
S4 ss
d'acides gras (FAME) [ , l de référence sont identifiés par des échantillons analysés par
comparaison des temps de rétention des mélange d'esters méthyliques d'acides gras (FAME).
Les acides gras sont identifiés en fonction de leurs temps de rétention. Leur taux est
déterminé par le rapport entre l'aire des pics correspondants et la somme des aires des pics de
tous les acides gras.

87
 Chapitre HC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

Les résultats des analyses d'acides gras des graines de l'hibiscus (tableau 21) montrent
la présence de 12 acides gras. L'acide palmitique (20,2 à 20,4 %), l'acide stéarique (4,3 à 5,3
%), l'acide oléique (29,9 à 37,2 %) l'acide linoléique (35,3 à 41,4 %) sont des acides gras
majoritaires dans toutes les variétés de l'hibiscus. Ces 4 acides gras représentent en moyenne
97 % des acides gras totaux. La variation du taux des acides gras est notable en fonction de la
provenance géographique. Les acides gras saturés (C!6:0, C1 8:0) avec les acides gras
insaturés (C1 8 : ! , C 1 8:2) représentant environ 95 % des acides gras totaux. La teneur en acide
gras de l'huile d 'hibiscus est comparable à celle de l'huile de coton et de soja [46l .

ESI!èces Hibiscus sabdarii[fa L. Litterature

Acides gras' Vietnam Mexigue Senegal Cotonl46]

SojaI46,55]

Myristique C14:0 0,21 ± D,DI 0,22 ± 0,02 0,29 ± 0,04 0,5-1,3 < 0,2
Palmitique C16:0 20,43 ± 0,2 20, 1 9 ± 0,03 20,28 ± 0,33 17-31 8-1 3
Palmitoléique C16:1 0,3 1 ± 0,03 0,37 ± 0,01 0,42 ± 0,07 <1 < 0,2
Stéarique C18:0 4,28 ± 0,4 5,30 ± 0,02 4,39 ± 0,1 2-5
Elaidïque C18: l n9 0,58 ± 0,Q3 0,35 ± 0,01 0,57 ± 0,01
Oléique C18:1 37,20 ± 0,1 29,96 ± 0,10 3 1 ,5 1 ± 1 ,5 1 3-21 17-26
Linoléique C 1 8:2 35,29 ± 2,3 4 1 ,43 ± 0,33 40,59 ± 1,4 34-36 50-62
Linolénique C 1 8:3 0,21 ± 0,03 0,27 ± D,DI 0,24 ± 0,04 <1 4-1 0
Eicosanoïque C20:0 0,64 ± 0,04 0,9 ± 0,01 0,70 ± 0, 1 2 0,31 < 1,2
Eicosenoique C20 : 1 0,27 ± 0,06 0,42 ± 0,1 0,5 ± 0,03 0,41 < 0,4
Béhénique C22:0 0,27 ± 0,02 0,27 ± 0, 1 0,30 ± 0,05 < 0,2 < 0,5
Lignocerique C24:0 0,3 1 ± 0,03 0,43 ± 0,1 0 ,37 ± D,DI

amoyenne de 3 essais
Tableau 2 1 : Teneur en acides gras des huiles de graines d'Hibiscus sabdarifJa L Cg/1 00 g)

En effet dans les pays en développement, les carences en micronutriments, en

particulier en fer, les vitamines liposolubles représentent un problème de santé publique aux
conséquences physiologiques et économiques non négligeables [57,58l . L'huile d'hibiscus est
riche en acides gras mono et poly-insaturés, de type oméga ((0-3, (0-6 et (0-9). Cette
composition correspond parfaitement aux recommandations nutritionnelles actuelles [59l , Par
ailleurs, l'acide stéarique présent dans l'huile d'hibiscus est le meilleur acides gras saturé

88
 Chapitre HC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

pour la santé car il n'augmente pas la concentration en cholestérol et est facilement

transformé en acide oléique par le foie [60I .

Le tableau 22 permet de comparer les résultats de nos recherches sur l'hibiscus du

Vietnam et les résultats trouvés dans la littérature à propos des huiles des graines d'hibiscus
d'autres origines. Ces huiles sont des sources d'acides gras essentiels : acide oléique (CI 8 : 1)
et linoléique (CI 8:2). L'huile d'hibiscus sabdariffa d'Egypte fournit en plus l'acide
linolénique (00-3) à 5 % et l'acide arachidonique (00-6) à 3 %. Ces acides gras sont essentiels
pour le cerveau durant la mutation infantile[61 1 .

Acide gras Hibiscus Hibiscusl'"] HibiscusL" ] Hibiscus]'"] HibiscusL'lJ Hibiscus1b"]

Vietnam sabdarijJa sabdarijJa sabdarijJa cannabinus esculentus
Nos résultats Egypte Inde Soudan
Myristique 0,2 0,3 traces 0,3 traces 0,2
Palmitique 20 15 20 20 19 30
Stéarique 4 - 2 4 -
3
Oleique 37 39 25 38 29 19
Linoleique 35 22 47 36 46 41
Linolénique 0,2 5 1 traces
- -

Arachidonique 0,6 3 -
- -
0,3
Béhénique 0,3 0,2 -
- - -

Tableau 22: Composition comparée en acide gras en (%) entre l'huile d'hibiscus sabdariffa du
Vietnam et celle d'autres hibiscus.

La composition et la nature en acides gras des huiles végétales sont non seulement des
éléments déterminants pour leur intérêt sur le plan alimentaire, diététique et pharmacologique,
3
mais également pour leurs débouchés non alimentaires[6 1 . Les acides gras provenant de
1'hydrolyse chimique ou enzymatique des huiles sont souvent utilisés par les industriels de la
lipochimie en tant qu'intermédiaires suite à leurs modifications par synthèses chimiques. Ils
trouvent alors des applications dans des domaines tels que les émulsifiants, lubrifiants
synthétiques et fluides, ainsi que dans les industries du textile, du papier, pharmaceutique,
3
cosmétique et des matières plastique [6 .641 .

L'huile de Hibiscus sabdariffa du Vietnam (tableau 22) renferme davantage d'acides

gras saturés que les espèces d'Hibiscus cannabinus et l 'Hibiscus sabdariffa d'Egypte, mais
moins que l'Hibiscus esculantus. Cette caractéristique confere à l'huile d'Hibiscus du
Vietnam des applications dans le domaine des biolubrifiants et des biotensioactifs, dans la

89
 Chapitre HC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

composition de détergents (lessives, adoucissants, liquides vaisselle, produits d'entretien et

7
agents de surface), et des produits cosmétiques et pharmaceutiques [6s.6 1 .

IIC2.1.3 Composition en Stérol

Pour la détermination de la composition stérolique des graines de l'hibiscus provenant

de trois pays, nous avons appliqué deux méthodes d'extraction. L'extraction par soxhlet (à
chaud) et l'extraction à froid par centrifugation en utilisant le cyclohexane comme solvant.
L'analyse des insaponifiables obtenus a été réalisée par chromatographie (CPGIFID).

ESJ:!èces Hibiscus sabdariffa L Litterature

Stérols' Vietnam Mexigue Sénégal Coton 1461 arachidel461

Extraction à chaud par cyclohexane

Cholestérol 1 ,67 ± 0,22 1,87 ± 0,30 1,80 ± 0,5 1 < 0,4

Campestérol 12,92 ± 1 , 1 1 5,82 ± 1,3 1 5,81 ± 1 ,3 4-8 16-19

Stigmastérol 3,60 ± 0,91 4,68 ± 1 ,8 4,74 ± 1,2 <1 6-9

fj-Sitostérol 80,16 ± 1,2 74,88 ± 2,5 74,93 ± 1 , 1 86,93 61 -67

d5-Avenastérol 1,93 ± 1 ,3 2,75 ± 1 , 1 2,72 ± 0,2 2-3 7-9

Extraction à froid par cyclohexane

Cholestérol 1,25 ± 0,06 1,82 ± 0,74 2,06 ± 0,88

Campestérol 13,31 ± 1 , 1 1 5,24 ± 1,3 1 5,41 ± 1 , 1

Stigmastérol 3,75 ± 1 ,3 5, 1 5 ± 2,5 5,08 ± 2,1

fj-Sitostérol 79,55 ± 1,5 74,16 ± 1 ,2 73,96 ± 2,2

d5-Avenastérol 2,14 ± 1 ,0 3,63 ± 2,3 3 ,49 ±1,3

, moyenne de 3 essais

Tableau 23: Teneur en stérols de l'huile des graines d'Hibiscus provenant de différentes origines et
extraite selon 2 procèdes.

Il n'existe pas de différence entre les 2 types d'extraction sur la composition en

stérols. Selon les 2 procédés, les 5 stérols majoritaires et présents dans toutes les huiles
étudiées (tableau 23) : le cholestérol, le campestérol, le stigmastérol, le fj-sitostérol et le d5-
avénastérol. Dans toutes les espèces d'huile, le fj-sitostérol est prédominant, (80, 1 6 %) pour
l'hibiscus du Vietnam, (74,93%) pour celui du Sénégal et (74,88 %) pour celui du Mexique.
Le �-sitostérol entraîne la régression de tumeurs bénignes de la prostate et réduit la formation

90
 Chapitre nC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

plaquettaire chez le rat[681 . L'Hibiscus du Vietnam possède la plus forte teneur enji'-Sitostérol.
Le campestérol est présent en grande proportion (12-16 %), le stigmastérol à 3,60-4,74 %, le
d5-avenastérol à 2,14- 3,49. Le cholestérol (1,67-2,06 %) est un stérol majoritairement
présent pour l'ensemble des espèces étudiées (exemples : le coton et l'arachide tableau 23).
Grâce à leur structure et leur fonctionnalité, et à partir des résultats obtenus, plusieurs voies
de valorisation sont possibles. Les stérols végétaux ou phytostérols sont des corps gras
organiques naturels qui font l'objet de nouveaux développements et de nouvelles
applications. Du point de vue alimentaire : une supplémentation en phytostérols aurait un
effet hypocholestérolémiant et limiterait ainsi le risque de maladies cardiovasculaires [6 8.701 .

IIC2.1.4 Détermination des teneurs en Tocophérols

Pour la détermination des teneurs en tocophérols des graines de l'hibiscus provenant
de trois pays. L'analyse est réalisée directement sur l'insaponifiable des huiles de l'hibiscus
extrait à froide par le cyclohexane. Parmi les différentes méthodes d'analyse des tocophérols,
la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) sur phase normale a été retenue.

Esnèces Hibiscus sabdari[fa L Littérature

Tocophérols Vietnam Mexique Sénégal Maïs [46 [ Colza [46]
,
a 1 8,4 ± 0,5 10,2 ± 0,2 8,3 ± 0,1 8-22 15-20

Ji" 0,6 ± 0,2 0,8 ± 0,2 1 ,5 ± 0,1 <3 0,5

,

Y 80,6 ± 0,6 86,1 ± 0,3 87,5 ± 0,4 68-89 62-80

(5' 0,9 ± 0,1 2,7 ± 0,4 2,6 ± 0,5 2-7 1-3
, moyenne de 3 essais

Tableau 24: Teneurs en tocophérols de l'Hibiscus provenant d'origine défférente.

Les résultats des analyses des tocophérols des huiles d'hibiscus (tableau 24) montrent
la présence d'alpha, bêta, gamma, et delta tocophérols. La teneur en tocophérol pour les trois
espèces du Vietnam, du Mexique et du Sénégal sont respectivement de 1 8,4 % 10, 2 %, 8,3 %
pour le alpha, 0,6 %, 0,8 %, 1,5% pour le bêta, 80,6 % 86,1 %, 87,5% pour le gamma et 0,9
%, 2,7 %, 2,6 %)pour le delta tocophérols. Le y-tocophérol est majoritaire et présent dans les
trois variétés d'hibiscus. La teneur en a-tocophérol pour l'huile vietnamienne (18 %) est
légèrement meilleures que pour les autres variétés, Mexique ( 1 0 %) et Sénégal (8 %).

91
 Chapitre HC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

L'huile végétale constitue la meilleure source de tocophérols. Les formes de vitamine

E les plus fréquemment rencontrées à ce niveau sont l'a-tocophérol et le y-tocophérols.
L'huile de palme est la seule à contenir l' a-, le y- et le o-tocotriénols, mais en moindre
quantité. L'huile de tournesol ne renferme que de l'u-tocophérol, qui est aussi la forme
prédominante dans l'huile d'olive. Le y-tocophérols est le représentant majeur dans l'huile de
noix et l'huile de maïs. L'huile de soja, quant à elle, contient surtout du y-tocophérols et du 0-
tocophérol[71 1 . La teneur en acide gras de l'huile d'hibiscus est comparable à celle de l'huile
de coton et de soja. La richesse en composés mineurs apporte à l'huile de table un intérêt
nutritionnel supplémentaire. L'a-tocophérol, présent en quantité importante dans l'huile
d'hibiscus, possède une activité vitaminique E qui lui confère des propriétés anti-oxydantes
bénéfiques pour la santé. Ces molécules jouent un rôle dans la prévention contre les maladies
cardiovasculaires, et particulièrement l'atbérosclérose [721 . L'effet des tocophérols sur d'autres
maladies, telles que certains cancers (prostate, poumons, pancréas) et des maladies
neurodégénératives (Alzheimer), sont actuellement à l'étude et laisse présager de nombreuses
autres vertus de ces molécules[721 .

I1C.2.S Conclusion

Ces résultats confirment l'importance de l'étude de la composition des variétés

d'hibiscus provenant de 3 continents, en stérols, tocophérols, acides gras et par rapport à leurs
caractéristiques physico-chimiques. On a observé des différences significatives liées à la
variété et à l'origine géographique et culturale (effet des sols, du climat, etc). Les propriétés
physico-chimiques des huiles étudiées présentent une grande similarité avec celles relevées
pour l'huile de soj a ou de tournesol. Les indices d'acide, assez bas, témoignent de la parfaite
stabilité des huiles extraites. Les graines d'Hibiscus sabdariffa, qui fournissent 2 0 % d'huile
pour 100 g de tourteau (obtenu après l'extraction des graines), pourraient être bon sujet
d'étude dans les domaines alimentaires à la fois pour les huiles et le tourteau riche en
éléments essentiels (huiles et acides aminés) dans les pays à risques alimentaires. A l'instar
des protéines du soja, les protéines d' Hibiscus sabdariffa trouvent des débouchés dans le
secteur alimentaire, principalement pour l'alimentation animale (bétail et animaux
domestiques).

92
 Chapitre IIC2. Résultats et discussion sur les huiles des graines de l 'hibiscus

La forte teneur en phytostérols des graines de l 'hibiscus, notamment en �-Sitostérol,

(80 %), présente un intérêt particulier dans l'alimentaire grâce aux propriétés de la réduction
du taux de cholestérol sanguin des phytosterol [721 . Par ailleurs, la richesse en stérols des
graines d'Hibiscus permet également d'envisager des applications non alimentaires. Le
domaine des cosmétiques, pharmaceutiques, s' ouvrent également aux phytostérols doués de
propriétés multifonctionnelles.

En effet, les stérols confèrent souvent aux corps gras certaines propriétés
pharmacologiques et cosmétologues spécifiques et rentrent dans la composition de laits
démaquillants, de soins restructurants et de crèmes nutritives contre le vieillissement. Certains
produits incorporent des insaponifiables totaux en cosmétologie. Ces composés
insaponifiables sont aussi bien recommandés dans l'alimentation qu'en médecine, pour leurs
activités anti-cancéreuses et ou anti-inflammatoires.

93
 Références bibliographigue

Références bibliographique

[1]. CLYDESDALE, F.M., FRANCIS, FJ., MAIN, J.H., 1979. Roselle (Hibiscus sabdariffa).
Anthyocyanins colorants for beverages and gelatin desert. J. food protection., (42) 3, 204-207.

[2]. ESSLEN, W. B., SAMMY, G.M., 1973. Roselle a natural red food colorant. food prod.
Dev, (7) 1, 80-86.

[3]. McCALEB, R., 1 996. Roselle production manual (Hibiscus sabdariffa). Herb Research
foundation, USA.

[4]. BRIDLE, P., TIMBERLAKE, C.F., 1997. Anthocyanins as natural food colorant selected
aspects. Food chem., (58) 1-2, 1 03-109.

[5]. TSAI, P.l, MCNTOSH, l, PEARCE, P., CAMDEN, B., JORDAN, B.R., 2002.
Anthocyanin and antioxidant capacity in Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) extract. Food Res.
Inter. 35, 351-356.
[6]. POUGET, M.P, VENNAT, B., et al. 1 990. Identification of Anthocyanins of Hibiscus
sabdariffa L. Lebensmittle Wissenschaft and Techn. 23 (2), 101-102.

[7]. POUGET, M.P., LE JEUNE, B., et al. 1 990. Extraction analysis and study of the stability
of Hibiscus Anthocyanins. Lebensmittle Wissenschaft and Techn. (23) 2, 103-105.

[8] . SATO, K., GODA, Y., YOSHIIHIRA, K., NOGOUCHII, H., 1991. Structure. and contents
of main coloring constituents in the calyces of Hibiscus sabdariffa and commercial Roselle
color. J. food hyg. Soc. Japan, (32) 4, 301-307

[9].AHMED, AW. K., HUDSON, .BJ.F., 1982. The fatty acid composition of Hibiscus
sabdariffa seed oil. J. Sei. Food Agr. 33, 1305-1309.

[10]. ÇAUÇIR, S., OZCAN, M., HACISEFEROOULLARI, H., UOUR YILDIZ M., 2005.
Study on sorne physico-chemical properties of Turkey okra (Hibiscus esculenta 1.) seeds. l
Food Eng. 68, 73-78.

[ 1 1 ] . SENA, L.P., VANDERJAGT, DJ., RIVERA, C., TSIN, A.T.C., MUHAMADOU, O.,
MILLSON, M., 1 998. Analysis of nutritional components of eight famine foods of the
Republic of Niger. Plant Foods Hum. Nut. 52, 17-30.

[12]. WORLD HALEATH ORGNAZATION, 1985. WHOIFAO Report: Energy and protein
requirement.
[13]. REO, P.u., 1 996. Nutrient composition and biological evaluation of mesta (Hibiscus
sabdariffa) seeds : Plant foods Hum. Nut.,! , 27-34.

[14]. SMITH, G.C., GRIVETTI L, E., 1 994. Cultural use of edible wild plants in Burkina
Faso,West Africa. FASEB J., 8, A183.

94
 Références bibliographique

[15]. MORTON, J. F., 1 987. Roselle, Pp. 281-286. ln: C.F Dowing (ed). Fruits of warm
climates, Media, Inc., Greensboro, NC, USA.

[16]. ASSAF, M.H., 1 998. Phytochemical study for the contents of Hibiscus sabdariffa L.
seeds cultivated in Egypt. Bull. Pharm. Scie. (21) 1, 75-80.

[17]. SMITH, G. C., CLEGG, M. S., KEEN, C. L., GRIVETTI L, E., 1996. Mineral values of
selected plant foods common to southern Burkina Faso and to Niamey, Niger, West Africa.
J. Food Sei. Nutr. 47, 4 1 -53.
[18]. MAHMOUD, B.M., ALI, H.M., HOMEDIA, M.M, BENNET, J.L., 1994. Significant
reduction in chloroquine bioavailablity following co administration with the Sudanese
beverages Aradaib, Karkade (hibiscus sabdariffa L.) and Lemon. 1. Antimicrob Chemo., 5,
1005-1009.
[19]. FARJI, H M, TARKHANI, H.A, 1 999. The effect of sour tea (Hibiscus sabdariffa) on
essential hypertension : J. Ethnopharm., 65, 231-236.

[20]. KIRDPON, S., NAKORN, S .N., KIRDPON, W., 1994. Change in urinary chemical
composition in healthy volunteers after consuming Roselle (Hibiscus sabdariffa L) juice. J.
Med. Ass. Rhai. 6, 3 1 4-42.
[21]. CHEN, CH.C., CHOU, F.P., HO, Y.C., LIN.,W.L., et al. 2005. Inhibitory effects of
Hibiscus sabdariffa L. extract on low density lipoprotein oxidation and anti-hyperlipidemia in
fructose-fed and cholestrol-fed-rats. J. Sei. [Link]. (84) 15, 1989-1996.

[22]. TSENG, T.H., KAO, E.S., CHU, C.Y., CHOU, F.P., WU, L., et WANG, C.J., 1 997.
Protective effects of dried flowers extracts of Hibiscus sabdariffa L. against oxidative stress in
rat primary hypertension. Food chem. Toxic., 35, 1559- 1 1 64.

[23] . OBIEFUNA, P.C., Owolabi, et al., 1994. The petai of Hibiscus sabdariffa produces
relaxation ofisolated rat aorta. Inter. J. Pharmacogn. (32) 1, 69-74.

[
[24] . CHOHUAN, U.K., Shukla, R.N., 1984. Sterols of same Malvaceae with particular
emphasis on cholestrol occurence. J. Sei. Res. India. (6) 1 , 49-50.

[25]. AL, M.B., 1991. Investigation of the antispasmodic potential of Hibiscus sabdariffa
calyces. J. Ethnopharm., 3 1 , 249-257.

[26]. FINTRAC INC., 1 999. Etude de Marché sur l 'Hibiscus sabdariffa L. 1746 Washington, DC.

[27].AFNOR, 1 993. Corps gras, graines Oléagineuses, produits dérives. Recueil des Nonnes
Françaises. 5 ème Edition.

[28]. KIRAN, B., SINGH, G., 2002. Essentil oil composition of damask rose distilled under
different pressures and temperature. Flav. Frag. 1., 17, 136-140.

95
 Références bibliographique

[29].KOEDAM, A., 1982. The influence of sorne distillation conditions on essential oil
composition in aromatics plants: Basic and applied aspects. Martinus Nijhoff Publishers
Netherlands. 229-236.
[30]. CAl, 1., LIU, B., QINGDE, SU., 2001 . Comparision of simultaneous distillation
extraction and solid-phase microextraction for the determination of volatile flavor components.
J. Chromo 930, 1-7.
[3 1]. CHAINTREAU, A, 2001 . Simultaneous distillation-extraction: from birth to maturity­
review. Flav. Frag. J. 16, 136-148.
[32]. MÜLLER, P.M., LAMPARSKY, D., 1991. Perfumes art, science and technology., Ed.
Elsevier Applied Science ZÜTich, Switzerland.
[33]. DIONEX, Manuel du système d'extraction rapide ASE 2000. 88 p.
[34]. CAMEL, V., 2000. Approche comparative de trois techniques récentes d'extraction :
SFE, ASE et MAE, Spectre Anal.. 2 1 6, 21-24.
[35]. ZULOAGA" O., ETXEBARRIA, N., FERNANDEZ, 1., MADARIAGA, J., 1998.
Comparison of accelerted solvant extraction with microwave-assisted extraction and soxhlet
for extarction of chlorinated biphenyls in soils samples. Trends. Anal. Chem. (17) 10, 642-647.
[36] WILLEM, 1.P., 2002. Les huiles essentielles : médecine d'avenir. Editions du Dauphin,
Paris.
[37]. KONIG, A.W., RIECK, A, HARDT, L, GEHRCKE, et al., 1994. Enantiomeric
composition of the chiral constituents in essential oils, Part 2: Sesquiterpenes Hydrocarbons., J.
High Res. Chrom .. , 3 1 5-320.
[38] VERES, K., VARGA, A., DOBOS, Z., MATHE, H.I., 2003. Investigation of the
composition and stability of the essential oils of Origanum vulgare ssp, vugare L. and 0.
Vulgare ssp. Chromatographia. (57) 12, 95-98.
[39]. MELECCHI, M.I., MARTINEZ, M.M., ABAD, F.C., ZINI, P.P., 2002. Chemical
composition of Hibiscus tiliaceus 1. flowers : A study of extraction methods. J. Sep. Sei. 25,
86-90.
[40]. CHEN, S.H, HUANG, T.C., HO, C.T., et TSAI, P.J., 1998. Extraction analysis and study
on the volatils in Roselle tea . J. Agr. food chem. (46) 3, 1 101- 1 1 05.

[41]. LAWRENCE., B.M., 1984. The botanical and chemical aspetcs of oregano. Perfum. Flav.
(9) 5, 41-51.
[42].ASSOCIATION FRANCAISE DE NORMALISATION., 1998. Corps gras, graines
oléagineuses, produits dérives, Recueil de normes Françaises., AFNOR NORMES, 5 ème
Edition.
[43]. JULIANO, B. O., PEREZ, C. M., ARD, M. K,.l990. Grain quality characteristics of
export rice in selected markets. Cereal Chem .. 1 92-197.
[44]. AITI, M. B., 2003. Sorne characteristics of nigalla (Nigella sative L.) seed cultivated in Egypt
and its profile. Food Chem., 83, 63-68.
[45].KARLESKIND, A, 1 992. Manuel des corps gras. Ed Tec. & Doc. Lavoisier, Paris., Vol.1-2.
[46]. CAMPBELL, E.l, 1983. Sunflower oil, lAm. Oil Chem., 60, 387-392.

96
 Références bibliographique

[47]. SINGH, N., SINGH, R., KAUR, K., Singh, H., 1 999. Studies of the physico-chemical
properties and polyphenoloxidase activity in seeds from hybrid sunflower (Helianthus annuus)
varieties grown in India. Food Chem. 241 -247.

[48]. BESBES, S., BLECKER, C., DEROANNE, C., DRlRA, N. E., ATTIA, H., 2004. Date
seeds: chemical composition and characteristic profiles of the lipid fraction. Food Chem. 84,
577-584.

[49]. ENNOURI, M., EVELYNE, B., LAURENCE, M., HAMADI, A., 2005. Fatty acid
composition and rheological behaviour ofprickly pear seed oils., Food Chem. 93, 43 1- 437.

[50] ABU-TARBOUSH, H.M., AHMED, S.B., AL-KAHTANI, HA, 1997. Some nutritional
and funcational properties of Karkade (Hibiscus sabdariffa) seed products. Amer. Assoc.
Ceral. Chem. 74 (3), 352-355.

[51]. SAROJINIE, G. RAO, C., LASKSHIMINARAYAN, G., 1 984. Physico-chemical

characteristic and fatty acid composition of Hibiscus sabdarffa and Hibiscus cannabinus.
Indian J. Oil. Tech. Asso. (2) 15, 65-67.

[52]. EL, A.T., Khalil, A.H., 1 994. Characteristics of roselle seeds as a new source of protein
and lipid. 1. Agr. Food Chem., (42) 9, 1 996-1900.

[53]. JACOTOT, B., 1997. Intérêt nutritionnel de la consommation de l'huile d'olive. OCL, (4)
5, 373-374.

[54] INDARTI, E., MAJID, [Link]., HASHIM, R., CHONG, A., 2005. Direct FAME synthesis
for rapid total lipid analysis from fish oil and cod liver oil. J. Food. Comp. Anal. 18, 161-170.

[55]. EDER, K., 1995. Gas chromatographic analysis offatty acid methyl esters. 1. chrom., B.,
671, 1 13 - 1 3 1 .

[56] . JANSSEN, H.G., BOERS, W., STEENBERGEN, H., HORSTEN, R., FLOTER, E . , 2003.
Comprehensive two-dimensional liquid chromatography, gas chromatography: evalution of the
applicability for the analysis of edible oils and fats. J. Chrom. 1000, 385-400.

[57]. CIN, Conférence Internationale sur Nutrition, 1 992. Les grands enjeux des stratégies
nutritionnelles. Rome: FAO/OMS.

(58]. LATHAM, M., 1997. Human nutrition in the developing world, FAO, Rome (Italy).
Food and Nutrition Div., JobNum: W0073E.

[59]. DURAND, G., GUESNET Ph, CHALON, S, ALESSANDRI, JM, LEBRANCHU, Y.,
2002. Importance nutritionnelle des acides gras poly-insaturés. In " Aliments fonctionnels ",
Coord. M. Roberfroid, Ed. TEC & Doc-Lavoisier, 175-212, Paris.

[60] JACOTOT, B., 1994. Acides gras mono-insaturés alimentaires et protéines; intérêt du
régime méditerranéen. OCL., 6 (1), 86-93.

97
 Références bibliographigue

[61]. TSANG, R.C., LUCAS, A., NANY, R., ZLOTKIN, S., 1993. Nutritional needs of the
practical infant science basis and practical guidelines, SM Innis: Fat., Publish: Williams and
Wilkins. Baltimore, USA., pp 65-86.

[62]. CAMCIUC, M., DEPLAGNE, M., VILAREM, G., GASEZT, A., 1998. Okra
Abelmoschus esculentus L. (Moench) a crop with economic potential for set asude acreag
France. Ind. Crops. Prod. 7, 257-264.

[63]. MORIN, L., DRONNE, Y., REQUILLART., 1994. La demande non-alimentaire des
huiles et des graisses. OCL, 1(3), 1 88-191

[64].STEVENS, C.V., VERRÉ, R.G., 2004. Renewable bioresources scope and modiifcation
for non-food applications. Ed. John Wiley & Sons, ltd, West Sussex, England.

[65]. LATON, J.F., 1997. Les lipides en cosmétologie. 1 997. OCL, 4 (4): 275-28 1 .

[66].. WACHTER, R., SALKA, B., MAGNET, A.,1995. Phytosterols-actives substances of

vegetable origin in cosmetics. Cosmetics and toiletries magazine., 1 10, 72-82.

[67]. PARANT, B., 1999. Utilsation des olégaineux de nature oléique-colza , tournesol-dans
l'industrie des tensiactifs. OCL. 6,393-395.

[68]. WORLD HEALTH ORGANISATION 1998. Obsity: preventing and managing the global
epidemic. Technical report series, No. 894. Geneva: WHO, p 276.

[69]. FARQUHAR, R.W., 1996. Plant sterols : their biological effects in humans. Handbook
oflipids in human nutrition, CRC Prss Inc., USA, 1 1-105.

[70].PIAT, J. KERCHOFFS, AJ.M., & MENSINK, R., 2000. Therapeuitc potential ofplant
sterols and stanols. CUITe. Opin. Lipido. I l, 571-576.

[71]. PIIRONEN, V., LINDSAY, D.G., MIETTINEN, T.A., TOIVO, J., et LAMPI, AM.,
2000. Review. Plant sterols: biosynthesis, biological function and their importance to human
nutrition. J. Sci. Food Agri., 80, 939-966.

[72]. LEGER, C.L., 2000. La vitamine E: état actuel des connaissances, rôle dans la prévention
cardiovascular, biodisponibilité. OCL., 7 (3), 258-265.

98
 CHAPITRE III Artemisia annua

Etude agronomique et phytochimique pour le développement

d 'un traitement viable, accessible et efficace du paludisme
au C a mbodge et au Sénégal.

99
 Chapitre HIA Rappel bibliographique Artemisia annua

IIIA.I Rappel bibliographique-Artémisia annua

IlIA. 1.1 Le Paludisme

Le paludisme est une infection due au parasitisme des globules rouge par un
protozoire du geme Plasmodium. Quatre espèces spécifiques de plasmodies parasitent
l'homme : Plasmodium falciprum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium
malariae. Ils se distinguent par leur morphologie, leur prévalence, morbidité, leur aire de
répartition et des particularités de leur cycle[3l . Plasmodium falciparum est l'espèce la plus
fréquente et responsable d'accès fébriles simples susceptible de se transformer en accès grave
dits pernicieux, mortels en l'absence de traitement. P. vivax, P. ovale et P. malariae sont
responsables uniquement d'accès simples [4,5l .

Plasmodium falciparum, le plus intensément implanté et le plus redoutable, est le seul

dounant la mort. Son incubation est de sept à douze jours. Il est responsable de la fièvre tierce
maligne, de l'accès pernicieux et, indirectement, de la fièvre bilieuse hémoglobinurique. Il
évolue sans rechute, avec simplement des reprises, ou recrudescences, sa longévité est
inférieure à un an mais on n'observe pas d'accès dû à Plasmodium falciparum plus de deux
mois après le départ d'une zone d'endémie,

Plasmodium vivax, très répandu, mais mOInS que Plasmodium falciparurn, a une
incubation d'environ quinze jours, pouvant s'étendre jusqu'à neuf mois ou plus. Il est
responsable de la fièvre tierce bénigne, et peut donner des rechutes à brève ou longue
échéance selon les souches.

Plasmodium ovale, sévit en Afrique inter-tropicale. Son incubation peut être longue,
de quinze jours à quatre ans. Il donne également une fièvre tierce bénigne, mais avec des
rechutes tardives, jusqu'à cinq ans,

Plasmodium malarie, est de distribution géographique clairsemée. Après trois

semaines d'incubation, il donne une fièvre quarte, et parfois des complications rénales. Sa
longévité peut aller jusqu'à vingt ans.

1 00
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

IlIA. 1.2 Le Cycle parasitaire

Le paludisme est transmis à l'homme par la piqûre d'un moustique femelle, du genre
Anophèles (figure 29), elle-même infectée après avoir piqué un homme impaludé : la femelle,
en prenant le repas de sang nécessaire à sa ponte, injecte le parasite à son hôte. Les mâles ne
piquent pas. La transmission de Plasmodium d'un homme à un autre se fait donc par
l'intermédiaire du moustique. Il existe un seul cas de contamination inter-humaine directe,
lorsqu'une femme enceinte infectée contamine son enfant par voie transplacentaire. (6l .

(!:) 2003 Stophon L. DoggaU

Figure 29: Moustique du genre anophèles

Le cycle de Plasmodium est complexe et comporte deux étapes essentielles : un cycle

asexué chez l'homme, et un cycle sexué chez le moustique. L'anophèle femelle injecte à
l'homme le parasite sous forme de "sporozoïte". Celui-ci migre rapidement, via la circulation
sanguine, vers le foie. Il pénètre dans la cellule hépatique, où il se divise très activement pour
donner naissance, en quelques jours, à des dizaines de milliers de nouveaux parasites : les
"mérozoïtes". La cellule du foie éclate en libérant ces parasites dans le sang: là, ils pénètrent à
l'intérieur des globules rouges et se multiplient(6l . Lorsque ces derniers éclatent à leur tour,
les mérozoïtes libérés dans la circulation sanguine infectent de nouveaux globules rouges. A
chaque cycle de réplication des mérozoïtes, des parasites sexués mâles et femelles
(gamétocytes) sont formés à l'intérieur des globules rouges.

101
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

IIIA.l.3 Morbidité et mortalité

Le paludisme est la maladie tropicale la plus répandue dans le monde. Elle sévit dans
des zones habitées par 40 % de la population mondiale, soit 2,3 milliards de personnes
exposées. L'incidence annuelle est estimée de 300 à 500 millions de cas chaque année. 90 %
des cas de paludisme concernent l'Afrique sub-saharienne[61 . Après l'échec du plan mondial
d'éradication des années 1 950, le paludisme demeure donc un problème majeur de santé
publique. Depuis 1980, de nouveaux programmes nationaux de lutte sont mis progressivement
en place, mais ils ne parviennent pas encore à le maîtriser. En dehors de l'Afrique, 70 % des
cas mondiaux de paludisme sont observés dans six pays : l'Inde, le Brésil, l'Afghanistan, le
Vietnam, la Colombie, les Iles Salomon[71 . La mortalité qui est pratiquement toujours due à
Plasmodium falciparum est estimée entre 1,5 et 2,7 millions de sujets chaque année, dont
environ 1 million d'enfants de moins de cinq ans [61 .

En Chine, vers le milieu des années 1 970, le lancement d'une campagne décisive de
lutte antipaludique associe la lutte antivectorielle à des actions rigoureuses de dépistage et de
traitement du paludisme. Un résultat important de la campagne menée contre le paludisme en
Chine est la mise au point de dérivées de l'artémisinine pour lutter contre les cas de P.
falciparum résistants à la chloroquine[61 . Par contraste, les moyens déployés pour essayer
d'améliorer la situation du paludisme en Afrique subsaharienne sont relativement limités. La
lente amélioration des conditions de vie et l'accès à un médicament bon marché et efficace, la
chloroquine, ont contribué à une légère tendance à la baisse de la mortalité paludéenne en
Afrique, entre les années 1950 et le début des années 1 980. Mai aujourd'hui, la situation est
alarmante face à la propagation de souches P. falciparum chloroquino-résistantes [81 .

IIIA.1.4 Répartition géographique

Les exigences bioécologiques du cycle parasitaire expliquent en grande partie la
répartition du paludisme dans le monde (figure 30). En zones tropicales et intertropicales
chaudes et humides, le paludisme, principalement dû à P. falciparum, sévit sur le mode
endémique stable, caractérisé par une transmission très intense[91 .

102
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Des intensités de transmission modérée, avec des variations saisonnières très intenses et des
fluctuations d'une année à l'autre, caractérisent une autre forme de paludisme que l'on
désigne sous le nom de paludisme endémique instable et qui s'observe dans la plupart des
autres régions impaludées, notamment en Asie, en Amérique centrale et en Amérique du
Sud[6l . En zones subtropicales et tempérées chaudes, le paludisme, le plus souvent dû à P.
vivax, est saisonnier[9l . Enfin des épidémies de paludisme peuvent aussi survenir dans de
grandes parties de la péninsule indienne, au Sri Lanka, et dans certain pays d'Amérique du
SUd[IOl .

."

Figure 30: Evaluation épidémiologique de la situation du paludisme

� Les zones où il y a transmission du paludisme

� Zones à transmission limitée.
sont figurées les zones dans lesquelles le paludisme a disparu, a été éradiqué ou n'a
jamais sévi.

En Afrique, les taux de transmission, à l'intérieur d'un même pays, peuvent

s'échelonner de situations instables épidémiques à une transmission saisonnière stable ou une
transmission pérenne. De bons exemples de telles variations à l'intérieur d'un même pays sont
fournis par le Soudan, le Kenya, l'Ethiopie ou le Nigéria.

1 03
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

En Asie, la répartition est très variable selon les pays. Au Vietnam, les zones les plus
exposées au risque de transmission du paludisme sont situées d'une part au Nord (Lai Chau,
Hoang Lien Son, et Ha Tuyen), à l'extrême Sud (Minh Hai) et au centre (Kontum, Darlak,
Lam Dong et Song BeilOl, de même, en Thaïlande le risque prédomine essentiellement aux
zones de collines forestières du nord du pays. En Chine, P. falciparum est transmis dans les
provinces de Hainan et de Yunan, le reste du pays est exposé essentiellement à P. vivaxflil .

IlIA. 2 Artemisia annua plante anti-paludique

IlIA.2.I Historique

La mise en évidence scientifique de l'utilité d'Artemisia annua pour le traitement du

paludisme a été réalisée en Chine dans les années 60. Durant cette période de guerre, les
populations vietnamiennes et les troupes américaines subissaient de larges pertes liées au
paludisme. Pour venir en aide à son voisin vietnamien, Mao Zedong lance alors un vaste
programme de recherche dirigé par le professeur Tu You-you de l'Académie de médecine
traditionnelle chinoise, qui vise à valider, à l'aide de techniques modernes, les vertus
thérapeutiques attribuées aux plantes par la tradition. La médecine chinoise est une médecine
ancestrale, et de nombreuses plantes médicinales sont recensées dans une pharmacopée qui
date de plus de 2000 ans. Les chercheurs chinois ont alors recensé toutes les références de
produits qui pouv�ient être efficaces contre la fièvre[ l 2, 131.

La plante qui leur a semblé alors posséder le meilleur potentiel se nomme Qing Hao
(l'herbe bleue) et il s'agit en fait de l'Artemisia annua[ 1 21 . La plus ancienne référence de son
utilisation thérapeutique a été découverte dans une recette trouvée dans une tombe datant de
1 69 Av. JC., où elle était alors prescrite contre 52 sortes de maux dont notamment plusieurs
fièvres et les hémorroïdes. En 1 971, les premiers essais sont effectués chez une souris atteinte
de la malaria'et infestée par le parasite Plasmodium berghesi. En quelques heures, toute trace
du parasite avait disparu du sang de l'animal. Une année plus tard, la molécule responsable de
cet effet est isolée et baptisée " qinghaosu " (extrait de l'herbe bleue). Des traitements à base
de qinghaosu sont rapidement mis en place, et les patients atteints par la malaria guérissent.

104
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

La découverte de ce composé par la Chine permet peut-être d'expliquer la réticence et le

temps qu'ont mis les organismes internationaux à valider ce nouveau traitement. Suite à des
3
contre-expertises américaines, il faudra attendre l'article de Klayman[1 1 en 1 985 pour que la
communauté internationale reconnaisse enfin l'efficacité de l'artémisinine. Cependant, les
essais cliniques scientifiques permettant le lancement d'un nouveau médicament ont demandé
des années à se mettre en place, alors qu'en Chine et au Vietnam des millions de personnes
étaient déjà soignées par l'artémisinine sous différentes formes.

111.2.2 Description botanique

Le genre Artemisia L. appartient à la famille des Fismre 3 1 : Plant d'[Link]

Astéracées (Composées) et compte environ 400 espèces qui sont

principalement réparties dans les régions tempérées de
l'hémisphère Nord. Ce genre est classé dans la sous famille des
Asteroïdeae et la tribu des Anthemideae. A l'intérieur du genre,
seules A. annua etA. klotzchiana présentent un cycle annuel [121 .
Artemisia annua L. (A. annua) est une herbacée annuelle
originaire d'Asie (plus probablement de Chine). Il s'agit d'une
plante très odorante. Elle dégage une odeur aromatique grâce à
ses composés aromatiques concentrés dans la partie aérienne, et
à la présence de canaux à huiles essentielles. La tige principale
de la plante est généralement simple, sillonnée-striée de taille
très variable selon son origine (de 20 cm à 2 m). Des rameaux Source: Savajol Nomad RSI 2004
alternés partent dès la base et possèdent des feuilles aromatiques bi-ou tripennatiséquées, à
lobes dentés-pectinés (Figure 3 1).

Les inflorescences sont terminales et forment une panicule de capitules globuleux de

couleur jaune pâle de 2-3 mm de diamètre. Ces capitules (fig. 32) contiennent des fleurs
centrales hermaphrodites et des fleurs femelles périphériques. Les fleurs centrales possèdent
une corolle tubulaire à 5 lobes, elles sont composées de 5 étamines aux anthères courtes. Les
fleurs périphériques possèdent une corolle glanduleuse formée de 2 à 4 lobes.

1 05
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Toutes les fleurs sont potentiellement fertiles, les ovaires sont inférieurs et uniloculaires et
chacun génère un akène obovoïde de Imm de hauteur, glabre et fillement stri ë J2J . La plante
est naturellement pollinisée par les insectes et le vent. Artemisia annua est une herbacée
annuelle, il s'agit d'une plante de jour court, avec une photopériode critique de 13,5 heures[ J 2]

Figure 32: Capitule d'Artemisia annua. (Source [Link] 2005).

IIIA.2.3 Noms Vernaculaires

Nom Scientifique : Artémisia annua L.

Français : Armoise.
Anglais: Sweet Annie; Annual wonnwood.
Chinois : Qinghao

1 I IA.2.4 Orig ine phytogéog raphique

Artemisia annua est une plante d'origine asiatique. Elle a pour origine les régions
tempérées de Chine (400N). Elle est présente panni la végétation naturelle des steppes, à une
altitude de 1 000- 1 500 mètres. Son aire de distribution naturelle semble cependant beaucoup
plus large, s'étendant du sud de la Sibérie, au Vietnam et au nord de l'Inde[ l3. 14J . Artemisia
annua a depuis été introduite dans un très grand nombre de régions comprenant l'Europe, les
Etats Unis, et l'Amérique du Sud (Argentine). Plus récemment, des cultures expérimentales
J2
ont été mises en place dans des régions intertropicales Afrique, Brésil [ .J6J .

106
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

L'origine des souches d'Artemisia annua est importante car la production d'artémisine
est largement liée à la floraison. Celle-ci étant dépendante de la durée journalière de lumière
(la photopériodicité), les expérimentations en zones tropicales se basent donc sur une
présélection variétale, voire une hybridation, pour pouvoir obtenir des plantes adaptées à leur
milieu. Plusieurs auteurs considèrent que cette plante de floraison de jour court n'atteindrait
pas une biomasse suffisante en zones intertropicales [ I S1 , alors que les expérimentations sur
des souches à floraison tardive montrent de bons résultats de production. La plante, dans ces
régions, semble mieux s'adapter pour la production d'artémisinine en altitude 1 500 m qu'au
niveau de la mer[l 71 .

I1IA.2.5 Utilisation des armoises

Les feuilles d'Artemisia annua ont des propriétés antiseptiques, digestives, fébrifuges.
Les infusions de feuilles sont traditionnellement utilisées pour traiter la fièvre, les rhumes et
les diarrhées. Les feuilles sont également utilisées en application externe, sur les abcès.
Les armoises appartiennent toutes au genre Artemisia. Parmi les plus connues, Artemisia
absynthium sert de base à la préparation de l'absinthe. Cette boisson alcoolisée, aujourd'hui
interdite en France, était traditionnellement utilisée en Europe contre les fièvres paludiques.
Artemisia dranunculus (estragon) est utilisée pour ces propriétés aromatiques en tant que
condiment[ l6, 1 71 .

IIIA.3 L'Artémisinine

IIIA.3.1 Structure chimie et synthèse

artémisinine, est une lactone sesquiterpénique de la série des cardinanes, isolée de

l 'artemisia annua par des chercheurs chinois en 1 972, puis nommé artémisinine en 1985 [1 2, 131 .
De formule brute C I sH220S, sa structure a été établie par analyses chimiques [ 181 et
20 22
spectrales[ l 9, 1 . Sa configuration a été déterminée aux rayons X[21 , 1 . Son spectre infrarouge
l
révèle un pic intense à 1 745 cm, qui correspond à la fonction lactone du composé, ainsi que 3
l
pics, respectivement à 8 3 1 , 8 8 1 et 1 1 15 cm, , qui correspondent à une fonction peroxyde
[21 ,221 En effet, la molécule possède un pont peroxyde, une structure très rarement rencontrée
.
l2
dans la nature[ 1, (figure 33).

1 07
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

CH,
HP ) H
H

0
.-ç- -q
H ......
•
•

o.')•

CH,
0

Figure 33: Molécule d'artémisinine

L'artémisinine pure se présente sous la forme d'aiguilles cristallines, inodores, de

couleur blanche, dont le point de fusion se situe à 156-157 oc. Sa masse moléculaire est de

282,14 (g/mor ! ) La molécule est sensible aux milieux basiques et acides. Elle demeure stable
dans les solvants neutres, même chauffée jusqu'à 150 oc. Elle conserve sa structure lorsqu'elle

est chauffée durant 2,5 min à 200° C mais elle se décompose après 1 0 min à 190 oC. Elle est
13
également stable à la lumière[ l . Et n'absorbe pratiquement pas dans les UV. Cette

observation concernant la stabilité de la molécule à la chaleur est importante à considérer pour

la préparation et le conditionnement du médicament.

III.3.2 Artémisinine mode d'action et les dérivés d ' artémisinine

La première démonstration de l'activité antipaludique de l' artémisinine a été réalisée

en 1 972, lors d'un test in vivo effectué sur des souris infectées avec le parasite Plasmodium
berghei.L'administration d'artémisinine a permis l'élimination du parasite du sang des
[23l
cobayes . Dans les années qui suivirent, les chercheurs chinois réalisèrent de nombreux

essais in vitro et in vivo, y compris chez l'homme, qui confirmèrent l'efficacité de la molécule
contre plusieurs souches de Plasmodium, notamment celles devenues résistantes à la
[24l
choloroquine et à la méphloquine . Son intérêt thérapeutique vient aussi des excellents

résultats obtenus avec certains cas de malaria cérébrale avancée, une forme grave de la

maladie, provoquée par le parasite Plasmodium falciparum lorsque plus de 5 % des

[24l
érythrocytes sont infectés . Depuis, de très nombreux essais in vitro et in vivo ont été
réalisés, de même que de multiples tests cliniques, dont les résultats ont fait l'obj et de revues
[!2 13 25 26l
détaillées , , , .

108
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Ces travaux ont largement confmné l'action de cette molécule contre divers parasites
responsables du paludisme, ainsi que l'efficacité, généralement supérieure, de dérivés tels
que l'artésunate de sodium et l'artéméther. En effet, dans le but d'augmenter la solubilité de
l'artémisinine, ainsi que pour améliorer son action, plusieurs dérivés ont été synthétisés
(figure 34). Les plus prometteurs sont actuellement des dérivés de la dihydroartémisinine et
peuvent être classés en trois catégories : les dérivés carbonatés, les dérivés ester (artésunate de
sodium), l'artésunate, soluble dans l'eau et les dérivés éther (artéméther et artééther) solubles
dans l'huile [27l . Tous ces composés induisent une disparition de la fièvre et des parasites du
sang. Leur action est plus rapide que celle de la plupart des antimalariques classiques [261 et ils
sont généralement bien tolérés [281 .

Artéméther Acide artésunique Dihydroartemisinin

Figure 34: L'artémisinine et ses principaux dérivés utilisés pour le traitement de la
malaria

L'artémisinine agit particulièrement contre le stade érythrocytaire des agents de la

malaria. Cette molécule permet de tuer le parasite de la malaria à tous les stades. Plusieurs
auteurs ont décrit son mode d'action d'un point vue biochimique : une première étape
concerne l'activation de la molécule avec une scission du pont peroxydique de la molécule qui
est catalysée par la présence d'ions Fer libres (Fe II), d'origine hémoglobinique (radical hème
libre). Cette rupture entraîne la seconde phase, nommée alkylation, où est généré un composé
électrophile instable qui forme une liaison covalente avec des protéines synthétisées par le
parasite et interfère ainsi avec son métabolisme. Les membranes du parasite sont alors
endommagées et les vacuoles alimentaires libèrent dans le cytoplasme leurs enzymes
hydrolytiques qui provoquent la mort du Plasmodium [29,301 .

1 09
 Chapitre IIIA Rappel bibliographigue Artemisia annua

Depuis l'isolement de l'artémisinine en 1972, plus d'un million de malades, en Asie, en

Afrique et en Amérique du Sud, ont été traités avec cette molécule ou un de ses dérivés,
principalement l 'artésunate et l'artéméther[31 1. Actuellement, l'artémisinine est disponible en
Chine et au Vietnam, sous forme de capsules et de suppositoires. Elle est moins onéreuse que
ses dérivés mais également moins active ; des résultats probants ont toutefois été obtenus avec
les suppositoires chez des enfants souffrants de malaria aiguë [32). Par ailleurs, l'artéméther,
sous forme injectable, est aujourd'hui enregistré dans plusieurs pays d'Afrique, d'Amérique
du Sud et bien sur d'Asie du Sud-Est. Mais le dérivé le plus prometteur est certainement
l'artésunate, que ce soit sous forme injectable, de comprimés ou de suppositoire. Des
médicaments confectionnés avec cette molécule sont disponibles depuis quelques années déjà
en Chine, en Thaïlande, en Birmanie et au Vietnam et au Brésil [331 .

IIIA.3.3 Toxicité
L'artémisinine et ses dérivés ont l'avantage de présenter peu d'effets toxiques. Les
différents effets secondaires à ces traitements sont : des nausées, des vomissements, des
douleurs abdominales, rarement une bradycardie, une baisse des réticulocytes ainsi qu'une
élévation modérée et transitoire des transaminases. L'emploi de l'artéméther et de ses dérivés,
lors de la grossesse, est contre-indiqué lors du premier trimestre, en raison de l'embryolétalité
observée chez le rat et le lapin, mais l'utilisation d'artémisinine et de ses dérivées n'est pas
considérée comme dangereuse durant les deux seconds trimestres de la grossesse[33] . Parmi les
autres avantages, citons le fait que les traces d'artémisinine et de ses dérivés, quel que soit leur
mode d'absorption, sont rapidement éliminées du sang.

Les composés peuvent cependant avoir, potentiellement, des effets neurotoxiques à

fortes doses. En effet des lésions neurologiques ont été observées dans des expérimentations
sur des chiens et des chats. Artéméther et artééther sont les produits qui présentent les risques
les plus importants d'un point de vue neurophysiologique. Le problème des recrudescence de
crises est souvent soulevé dans les études cliniques utilisant des traitements à base
d'artémisinine et ses dérivés.
Plusieurs médicaments associant artémisinine et d'autres molécules antipaludiques,
telles que des tétracyclines et la méfloquinine, ont été proposés pour diminuer ces risques de
recrudescences [34,351 .

110
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

IIIA.3.4 Résistance

Il n'a pas été signalé de résistance à l'artémisinine ou à ses dérivés. La sensibilité des

isolats cliniques et des souches de laboratoire variait par rapport à ces médicaments, mais
[34 35J
rien ne prouve que ce soit lié à des échecs thérapeutiques , . L' étude de laboratoire a

également montré que des souches résistantes à la méfloquine semblaient moins sensibles à

l' artémisinine. C'est probablement en relation avec le fait que ces deux médicaments ont une
[36J
action synergique . Les observations sur le terrain appuient celles des laboratoires. Par

exemple, on a observé une forte sensibilité in vitro à la méfloquine, la quinine et l'artésunate

pour des isolats provenant du district de Yaha dans le sud de la Thaïlande, région où la

méfloquine donne des taux de guérison élevés dans le traitement du paludisme à falciparum.

Dans le même temps, dans la province de Tak, à la frontière du Myanmar, la sensibilité à

l'artésunate et à la méfloquine a décru entre 1991 et 1 994, période pendant laquelle ni

[36J
l' artémisinine, ni aucun de ses dérivés n'étaient disponibles en Thaïlande .

IIIA.4 Méthodes de production

Parmi les études existantes, de nombreuses sont conduites dans des conditions

contrôlées pour pouvoir mieux comprendre les processus impliqués dans la biosynthèse

d'artémisinine et tenter d'augmenter les productions de ce principe actif. Les expérimentations

portent sur des cultures cellulaires, des cultures in vitro de tissu végétal.

IIIA.4.1 Approche synthétique

La demande d'artémisinine augmentant fortement en comparaIson de l'offre, la

synthèse de la molécule serait une solution attractive pour les laboratoires. Cependant, sa

structure complexe rend une synthèse totale très difficile. La première synthèse totale de la

molécule proposée en 1983 comporte1 3 étapes à partir de la molécule (-)-isopulegol.

Plusieurs autres voies de production, uniquement synthétiques, ont été proposées mais selon
[37J
Dhinghra , elles restent trop complexes, peu productives et économiquement non rentables.

L'alternative à cette synthèse organique totale pourrait être celle d'utiliser des bio précurseurs

proches. Ainsi, l'artémisinine peut être facilement synthétisée à partir d'acide artémisinique

avec un rendement de 40 %. L'avantage de cette méthode est que l'acide artémisinique est
présent en quantité 8 à 1 0 fois supérieure dans la plante que l'artémisinine. Le nombre d'étapes
[J7J
nécessaires pour passer de l'acide artémisinique à l'artémisinine est de quatre à cinq . Un

autre bio précurseur de l'artémisinine est l'artesannuin-B qui peut être également extrait de la
[26J
plante pour la production synthétique d'artémisinine .

111
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

1IIA.4.2 Approche biotech nologique

En considérant que la plante est la meilleure source d'artémisinine, les recherches

biotechnologiques ont été développées pour sa production, ceci incluant la production par des
cultures de tissus, des cultures de cellules et à partir de la plante intacte. La propagation in
vitro d'Artémisia annua a été largement étudiée, elle permet de produire de l'artémisinine à
partir de tissus différenciés. Le niveau d'artémisinine atteint est alors de 0,28%[381 . D'autres
recherches utilisant des techniques de biologie moléculaire en isolant des gènes codant pour la
production d'artémisinine sont en cours[391 .

Malgré tous ces projets, on constate que la production d'artémisinine, à l'aide de ces
techniques, reste coûteuse et peu productive. Ainsi l'artémisinine continue donc à être extraite
de cultures végétales extérieures d'Artemisia annua[401 . Suivant cet axe de recherche,
Delabays et al[401 , considèrent que les principaux progrès qu'on peut espérer dans le domaine
de production d'artémisinine viendraient de la sélection et de l'hybridation de cultivars à haut
rendement de production en artémisinine. Dans son travail de thèse particulièrement complet,
Delabays[ l21, aborde les différentes étapes nécessaires à la domestication d'une espèce et
prouve que, pour Artemisia annua, la sélection de génotype productif est particulièrement
stable et efficace.

IlIA. 5. Les différents stades de croissance et le cycle biologique

IIIA.S.1 La phénologie

La phénologie d'une plante est la description des différents stades de développement

d'une plante au cours de la saison[121 . Peter Blanc [41 1 , distingue 3 étapes principales dans la
phénologie d'A .annua. Elles sont nommées "rosette", "élongation de la tige" et "floraison".
Le premier stade correspond au stade juste après la germination ou la plante forme une touffe
de feuilles sans développement de la tige. Le second est celui de la croissance de la tige ainsi
que des rameaux latéraux jusqu'à l'induction de la floraison. D'autres auteurs Raharianaivo [421
distinguent plusieurs phases dans le stade floraison : un stade " intermédiaire ". La floraison a
également été divisée en huit étapes distinctes qui vont de l'élongation des rameaux florifère à
la maturation des akènes. Delabays [l21 a étudié la variation des durées pour chacune des
étapes, elles sont très variables selon les origines géographiques, les lignées et les conditions

1 12
 Chapitre IIIA Rappel bibliographigue Artemisia annua

de croissance. Le stade rosette dure ainsi de 4 à 8 semaines et le stade élongation de 1 à 5

mois selon le photopériodisme qui détermine la floraison.

I1IA.5.2 L'initiation de la floraison

Un facteur important à prendre en compte pour la culture d'artémisia annua est la

durée du jour. Artémisia annua est une plante de jour court, c'est à dire que sa floraison
débute lors de la diminution de la durée du jour. Selon les lignées et leur origine
géographique, ce caractère est variable car fixé et adapté à un environnement précis. La
variation de durée de jour au cours d'une année diminue en s'approchant de l'équateur et
certains auteurs ont considéré que la culture d'Artemisia annua ne serait pas réalisable en
zones tropicales du fait de ce caractère lié au photopériodisme[431 . Plusieurs expérimentations
ont démontré que la plante peut pousser sous des latitudes tropicales, l'utilisation de lignées
adaptées par sélection ou par hybridation permet l'obtention de teneurs en artémisinine
importantes [121 .

I1IA.5.3 Densité

La densité de plantation d'[Link] joue sur le 8

rendement, des densités importantes permettent 7

G
d'obtenir un rendement supérieur (figure 35), cependant
à de fortes densités la compétition entre les plantes
réduit considérablement leurs tailles. On a une
augmentation importante du rendement jusqu'à environ
1 0 plantes/m2, la courbe arrivant presque à saturation "

o l �___�__�_--;

o 5 10 15 20
___ , , _
(autour de 6 tlha). Si la culture est effectuée dans des
jardins une densité faible (lplante/m2) peut permettre
Density (plants/m2)
d'associer la plante avec d'autres cultures.
Figure 35: Rapport entre densité de culture et rendement [161.

I1IA.5.4 Nutrition, fertilité et sol

Bien qu'il n'existe pas beaucoup de données sur la réponse d'[Link] aux principaux
nutriments (N, P, K), des essais en Inde ainsi qu'aux USA ont montré qu'une carence en azote
provoquait une baisse de la teneur en artémisinine. Or les sources d'azote proviennent

1 13
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

essentiellement des nitrates ions N03- - ou des ions ammonium NH/ - apportés par les
engrais. Comme les ions nitrates N03 - sont très facilement lessivables, l'élément azote risque
de faire ·défaut si on se trouve dans les zones tropicales qui sont soumises à d'intenses
précipitations. Dans ce cas, la méthode et le moment d'application du fertilisant est essentiel.
Il faudra alors fractionner les apports durant la saison des pluies. Dans le cas de la culture à
Mondolkiri le problème ne se pose pas puisque l'on commence la culture à la fin de la saison
des pluies et que celle-ci se [mira avant le début de la saison des pluies suivante.
D'après Laughlin et al [ 16] , [Link] a été cultivée sur une grande variété de sols, et sa
capacité à coloniser des zones « poubelles » montre sa grande adaptabilité. Seul un pH trop
acide (5.0-5.5) peut-être préjudiciable pour certaines variétés. [Link] ne nécessite pas
d'avoir un sol riche pour pousser. De plus l'utilisation d'engrais chimique est inexistante au
Mondolkiri. Les sols basaltiques du Mondolkiri semblent donc pouvoir supporter la culture.

I1IA.5.5 Irrigation

Peu d'études existent concernant l'irrigation d'Artemisia annua. La plante peut pousser
sur des sols et sous des climats très variés, aussi l'irrigation à apporter dépendra
principalement des conditions climatiques. De façon générale, le sol doit rester humide. Ceci
est particulièrement important dans le stade précédent la floraison car un stress hydrique
risque de diminuer considérablement la récolte d'artémisinine[ 16] . En région sèche, Anamed[44]
conseille de planter les plants un peu plus profondément dans le sol (5cm).

I1IA.5.6 La récolte et le séchage

Les observations effectuées sur la localisation, dans la plante, de l'artémisinine et les

variations de concentration selon la saison[1 4] , ont permis de déterminer des techniques
appropriées pour la récolte d'Artemisia annua. Il est important de considérer la phénologie de
la plante pour déterminer sa date de récolte. Les méthodes de récoltes utilisées sont variées :
soit manuelles, soit mécanisées et industrielles. La technique de récolte employée par Nomad
RSI sera la technique manuelle. La concentration d'artémisinine est plus importante dans les
feuilles, c'est donc cette partie qui sera récoltée. La récolte doit être effectuée juste lorsque les
premières fleurs apparaissent. Après la récolte des feuilles, les tiges peuvent être laissées sur
pied et produiront éventuellement de nouvelles feuilles. Les tiges peuvent également servir à
faire du compost. La technique proposée par Anamed[44] est la suivante : en tenant la plante
retirer les feuilles en descendant la main du haut vers le bas. Retirer les morceaux de tiges
puis découper les feuilles en lamelles de 1 cm.

1 14
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Le séchage doit être réalisé à 50°C, soit au soleil en période humide, soit à l'ombre en période
sèche. Après trois jours, les feuilles peuvent être broyées avec une grille à trous très fins.

IIIA.6 Variations de la concentration en artémisinine

IIIA.6 . 1 Selon les parties de la plante

L'artémisinine n'est pas présente dans les racines, elle se concentre dans les feuilles de
la partie supérieure de la plante. Plus précisément, l'artémisinine s'accumule dans des
trichomes glandulaires présents sur la surface des feuilles, sur la corolle et sur le réceptacle
des fleurettes [ 15] .

I1A.6.2 Les différentes lignées

Artemisia annua comme de nombreuses plantes aunuelles et rudérales présente une

grande variabilité morphologique. Peu d'études existent sur ce sujet Delabays [12] a mis en
évidence qu'elle présente un polymorphisme marqué pour plusieurs caractères. Le port de la
plante peut varier considérablement. Du point de vue de sa morphologie florale, les
descriptions montrent une variabilité dans la découpure des feuilles et dans la pilosité de la
plante. Les principaux polymorphismes étudiés sont les caractères phytochimiques. Les
compositions en huiles essentielles [45] ainsi que les teneurs en artémisinine sont également
très variables. Delabays 1[ 12] a démontré l'existence de polymorphismes sur plusieurs
caractères l'habitus, la morphologie des feuilles, la phénologie, la teneur en artémisinine.

Le tableau 25 montre la variation de teneur en artémisinine qui peut aller de 0.02 % à

1 .38% selon sa provenance et selon la partie de la plante sélectionnée. Dans des cultures
réalisées en Suisse à partir de lignées d'origine très diverses, Delabays [12] , montre que le taux
d'artémisinine varie entre 0.05% et 1 .07% dans les feuilles sèches. Plusieurs études ont
montré que la concentration d'autres bio précurseurs de l'artémisinine comme l'acide
artémisinique varie également considérablement, indiquant ainsi qu'il existe pour [Link]
différents chimiotypes selon leur origine géographique[46] .

115
 Chapitre ilIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Origine Type Teneur en

Artémisinine Référence bibliographiques
(% MS)
Allemagne Sauvage 0.02 Singh et al l4/J
USA (Connecticut) Sauvage 0.06 Charles et al [48]
Argentine Sauvage 0.10 Acton et al [49]
Inde Sauvage 0. 1 1 Sharma et al [45]
Chine Hybride 0.14 Charles et al [48]
USA (Dakota) Sauvage 0.21 Charles et al [48]
Espagne Sauvage 0.24 Delabays et al [50]
Vietnam Sauvage 0.46 WaIIaart et al [46]
Pays bas Tétraploïde 0.52 WaIIaart et al [46]
Chine Sauvage 0.60
1
Liu et al [ 8]
Chine Sauvage 0.79 Anonymous [24]
Vietnam Sauvage 0.86 Woerdenbag et al [51]
Chine Sauvage 1.07 Delabays et al [50]
Suisse Hybride 1.38 Delabays [12]
Tableau 25: Teneur en artémisinine dans différents échantillons de feuilles sèche d'Artemisia
annua.

1 16
 Chapitre IlIA Rappel bibliographique Artemisia annua

Références Bibliographiques
[1]. World Health Organisation, 2005. World malaria report. Roll back malaria. WHO,
Geneva, Switzerland.

[2]. BABIKER, H.A., MACKINNON, M.J., 2005. Drug resistance in malaria : !ts population
biology and implications for control. Acta Tropica. 94, 161-162.

[3]. DENlAU, M., 1 995. Paludisme : épidémiologie, étiologie, physiopathologie, diagnostic,

évolution, traitement, principes de la prévention individuelle. Revue du Praticien. 45, 2325-
2333.
[4]. SIMON, F., LAVARDE, V., 1999. Paludisme : épidémiologie, étiologie,
physiopathologie, diagnostic, évolution, traitement principes de la prévention individuelle.
Revue du Praticien. 49, 8 1-87

[5].WERY, M., 1995. Le plasmodium parasites de l'homme. Paludisme ou malaria.

Protozoologie médicale, Ed. de Boeck Université : pp. 149-178.

[6]. DANIS, M., et GENETILINI, M. 1998. Le paludisme, ce fléau mondial. Revue du

Praticien. 48,254-256.

[7]. MALVY, D., DJOSSOU, F., THIEBAUT, R., et LE BRAS, M., 2000a. Plasmodies­
Malaria. Fonnes cliniques, diagnostic. Encyl. Med. Chir. Maladies infectieuses. 80-507-A-
20, pp. 1-16.

[8]. OMS, 1999. Liste des médicaments essentiels. Who drug Information. 1 3, 249-262.

[9]. PERRONNE, C., 2000. Paludisme, Maladies infectieuses 2 ; Ed. Doin : pp. 89-97.

[10]. RECEVEUR, M., BLANC, B., MALVY, D., THIEBAUT, R., et LE BRAS, M., 2000.
Le paludisme au Vietnam : quelle connaissance du risque pour le voyageur ? Bull. Soc. Path.
Ex., 3: pp. 1 1 9-120.

[ 1 1]. BOUCHAUD, O., LANOGHET, C., et COULAUD, J. 1998. Prophylaxie du

paludisme. Revue du Praticien. 48, 279-286.

[12]. DELABAYS, N., 1 997. Biologie de la reproduction chez Artemisia annua L. et

génétique de la production en artemisinine. Contribution à la domestication et à
l'amélioration génétique de l'espèce. Thèse de Doctorat. Université de Lausanne.

[13]. KLAYMAN, D.L., 1 985. Qinghaosu (Artemisinin): an antimalarial drug from China
Science 228, 1 049-1054.

[14]. FERREIRA, J.F.S., JANlCK, J., 1996. Distribution of artemisinin in Artemisia annua .
pp. 579-584. In : [Link] (ed.), Progress in new crops. ASHS Press, Arlington, VA.

[15]. KEYS, J.D., 1996. Chinises herbs. Swindon books company, London. Pp. 2 1 6-217.

1 17
 Chapitre IIIA Rappel bibliographigue Artemisia annua

[16]. LAUGHLIN, J.C., HEARLEWOOD, G.N. and BEATTEAIE, B.M., 2002. Cultivation
of Artemisia annua. pp. 159-195. In, Wright CW (Ed.), Artemisia. Taylor and Francis,
Londres.

[17]. LIERSCH, R., SOICKE, H., STEHIR, et TULLNER, H.U, 1986. Artemisinin in
Artemisia annua during one generation period. Planta medica 7, 387-390.

[ 1 8] . LIU, lM., NI., FAN, lF, TU, Y.Y., WU, Z.H., WU, Y.L and CHOU,
W.S.,[Link] and reaction of arteannuin. Acta Chim. Sin. 37, 129-143.

[19]. ZHONGSHAN, W., NAKASHIMA, T.T., KOPECKY, K.R., and MOLINA, l,

I
1 [Link]: H_ and l3 C_ nuclear magnetic resonance spectral assignments and
luminescence. Cano J. Chem. 63, 3070-3074.
I
[20]. BLASKO, G., CORDELL , G.A., and LANKIN, D.C., 1988. H_ and 13 C_NMR
assignment of artemisinin (qinghaous). l Nat. Prod. 51, 1273-1276.

[21]. ZHANG, S.D., ZHANG, lP., WU, B.M., YAO, J.x., and LIN, X.Y., 1 9 8 1 . Studies on
the crystal structure of bromo Qinghaosu. Acta. Phys. Sin. 30, 976-982.

[22]. LEBAN, L, GOLIC, L., and JAPELJ, M., 1988. Crystal and molecular structure of
qinghaosu. a redetermination. Acta Pharm. Jugosl. 38, 71 -77.

[23]. HEIN, T.T ANONYME, 1 979. Qinghaosu antimalaria coordinating research group.
Antimalarial studies on qinghaosu. Chin. Med. J. 92, 81 1-816.

[24] .HEIN, T.T, 1 982. China cooperative research group on Qinghaosu and its derivatives
as antimalarials. Chemical studies on qinghaosu (artemisinin). J. Trad. Chin. Med. 2, 3-8.

[25]. TANG, W., EISENBRAND, G., 1 992. Chinese drugs of plants origin. Chemistry,
pharmacology and use in traditional and modern medicine. Springer-Verlag, Berlin, 159-174.

[26]. HIEN, T.T., WHITE, NJ., 1 993. Qinghaosu. Lancet. 341, 603-608.

[27]. TRIGG, P.I, 1 990. Qinghaosu (artemisinin) as an antimalarial drug. Econ. Med Plant.
Res. 3, 20-55.

[28]. NOSTEN, F., 1991. Artemisinin: large community studies. Trans. Roy. Soc. Trop.
Med. Hyg. 88, 45-46.

[29]. Mc INTOSH, H.M., OLLIARO, P. 1 998 b. Artemisinin derivatives in the treatment of

severe malaria. The Cochrane Library. London, BMJ Publishing

[30]. BASCO, L.K., LE BRAS, l, 1993. In vitro activity of artemisnin derivatives against
Africa isolates and clones of Plasmodium falciparum. American l Trop. Med. Hyg. 49, 301-
307.

118
 Chapitre mA Rappel bibliographique Artemisia annua

[31]. MESHNICK, S.R., 1 994. The mode of action of antimalarial endoperoxydes. Roy. Soc.
Trop. Med. Hyg. 88, suppl. 1 :31-32.

[32]. WHITE, N., 1994. Artemisinin: CUITent statut. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 88, 3-
4.

[33]. HIEN, T.T, TAN, D.T.H., CUC, N.T.K., et ARNOLD, K., 1991. Comparative
effectiveness of artemisinin suppositories and oral quinine ion children with acute falciparum
malaria. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 85, 210-21 1 .

[34]. BALINT, G.A, 200 1 . Artemisinin and its derivatives. An important new class of
antimalarials agents. Pharm. therap., 90, 261-265.

[35]. WONGSRICHANALAI, C., WIMONWATTRAWATEE., T., SOOKTO, P., et al.

1 998. In vitro suscepetibility of Plasmodium falciparum in Thailand. Bulletin of the world
Health organization.

[36]. EZEDINACHI, E., 1 996. In vivo efficacy of chloroquine, halofantrine,

pyrimethaminesulfadoxine, and qinghaosu (artesunate) in the treatrnent of malaria in Nigeria.
Central Africa Journal of Medicine. 42, 1 09-1 1 1 .

[37]. DHINGRA, V., VISHWESHWAR, R., et LAKSHMI, N., 2000. Minireview. CUITent
status of Artemisinin and its derivatives as antimalarial drugs. Life Science. (66) 4, 279-300.

[38].WHIPKEY, A, SIMON, lE., CHARLES, DJ., and JANICK, l, 1992. In vitro

production of artemisinin from Artemisia annua L. J. Herbs Spices Med. Plants. 1 , 15-25.

[39].WHITE, N., 1997. Assesment of pharmacodynamic properties of antimalarial drugs in

vivo. Antimicrob. Agent. Chemo. 4 1 , 1 4 1 3-1422.

[40]. DELABAYS, N. JENELTEN, U., PARIS, M., PIVOT, D., et GALLAND, N., 1994.
Aspects agronomiques et génétiques de la production d' artémisinine à partir d'Artemisia
annua. Rev. Suisse Vitic. Arboric. Hort. 26, 291 -296.

[41]. PETER-BLANC, C., 1 992. Développement et biologie de la reproduction de

]'Artemisia annua
L. Travail de diplôme, Université de Lausanne 52, p.

[42]. RAHARINAIVO, J.N., 1 993. Contribution au lancement de la culture du qinghaosu ou

Artemisia annua L. comme plante antipaludique à Madagascar. Mémoire de fin d'Etudes,
Ecole Supérieurs des Sciences Agronomiques, Antananarivo, 52 p.

[43]. FERRElRA, J.F.S., JANICK, J., 1 995. Floral morphology of Artemisia annua with
special reference to trichomes. Int. J. Plant Sci. 156, 807-815.

[44]. ANAMED, Artemisia annua Anamed: Malaria et la medecine naturelle:

Documentation. [Link].

[45]. SHARMA, A, BINDRA, R.L., TEWARI, R., 1991. Artemisia annua: Cultiviation,
utilization and chemical studies. CUITent Res. Med. Arom. Plants. 13, 46-60.

1 19
 Chapitre IIIA Rappel bibliographique Artemisia annua

[46]. WALLAART, T.E., PRAS, N., BEECKMAN, A.C., et QUAX, WJ., 2000. Seasonal
variation of Artemisinin precursors in plants of Artemisia annua of different geographical
origin : proof for the existence of chemotypes. Planta medica. , 66, 57-62.

[47]. SINGH, A, VISHWAKARMA, R.A., et HUS AN, A., 1988. Evaluation of Artemisia
annua strain for higher artemisinin producation. Planta medica. 7, 475-476.

[48]. CHERLES, DJ., SIMON, J.E., WOOD, K.V., et HEINSTEIN, P., 1990. Germplasm
variation in artemisinin content of Artemisia annua using an alternative method of
artemisinin analysis from crude plant extrcats. J. Nat. Prod., 53, 1 57-160.

[49] . ACTION, N., KLAYMAN, D.L., 1985. Artemisinin a new sesquiterpene lactone
endoperoxyed from Artemisa annua. Planta Medica. 5 1 , 441-442.

[50]. DELABAYS, N., BENAKIS, A., at COLLET, G., 1 993. Selecation and breeding for
high artemisinin (Qinghaosu) yielding strains of Artemsia annua L. Acta Hort.,330, 203-207.

[5 1 ] . WOERDENBAG, HJ., PRAS, N.G., BANG, B.T., BOS, R., VAN UDEN W., et al.,
1 994. Artemisinin, related sesquiterpenes and essential oil in Artemisia annua during one
vegetation period in Vienam. Planta Med., 60, 272-275.

[52]. MUELLER, M.S., KARHAGAOMBA, LB., HIRT, H.M, WEMAKOR, E., 2000. The
potential of Artemisia annua L. as a locally produced remedy for malaria in the tropics:
gricultural, chemical and clinical aspects. Journal ofEthnopharmacology 73, 487-493

[53]. ALIN, M.H., AHSTON, M., KIHAMIA, C.M. et al. 1996a. Clinical efficacy and
pharmacokinetics of artemisinin monotherapy and in combination with mefloquine in
patients with falciparum malaria. Journal ofClinical Medicine, 41, 587-592.

120
 CHAPITRE IIIB

Contexte du projet de coopération scientifique

inter-universitaire

121
Chapitre IIIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

Chapitre Hill . 1 Contexte du projet de coopération scientifique inter­

univerisitaire

L'objectif global du projet est de contribuer à la lutte contre le paludisme au travers de

recherches coordonnées sur les potentialités de production et d'utilisation de la plante
[Link]. Ce type de recherche s'inscrit dans un objectif de développement international car
sa finalité est de permettre l'accès à des modalités de soins géographiquement et
financièrement accessibles pour les populations rurales du Cambodge et du Sénégal.

Le projet consiste d'une part à établir les conditions de production les plus favorables
dans deux régions du Cambodge et du Sénégal dans lesquelles le paludisme est largement
prévalent et connaît une résistance aux traitements classiques. D'autre part, des recherches
concernant l'extraction des composés actifs de la plante sont menées en parallèle. Ce projet
s'inscrit dans le cadre d'une coopération internationale entre le laboratoire de Chimie de
l'Université de Toulouse, la Faculté de Phannacie de Dakar et l'Université d'Agriculture de
Phnom Penh. Il est financé par l'Agence Universitaire de la Francophonie (AUF), qui
permettra à des étudiants et chercheurs des 3 universités partenaires de se rencontrer et
d'enrichir leurs connaissances.

HIB.1.1 Partenaires et thématiques de recherche

• L'Université Royale d'Agriculture de Phnom Penh au Cambodge mènera des
études agronomiques sur la mise en culture d'artemisia annua dans la province
Mondolkiri : conditions de culture, données environnementales
(ensoleillement, arrosage, dates des semis et des récoltes), caractéristiques du
sol, rendement, afin de définir protocole de mise en culture de la plante
Artemisia Annua pennettant un taux optimum de principe actif.

• Le Laboratoire de Pharmacognosie et Botanique (LPB) des l'Université Cheih

Anta Diop de Dakar: a pour rôle de mener une étude biosytématique comparée
entre les plantes cultivées.

• Le Laboratoire de Chimie Agro-industrielle de Toulouse, (INPT) se charge de

toute la partie extraction et analyse des principes actifs ainsi que des tests des
différentes méthodes d'analyse des parties de la plante :

122
Chapitre IIIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

• déterminer les caractéristiques générales et la composition chimique des

différentes parties de la plante.

• Evaluer les teneurs en principes actifs dans différentes configurations.

• L'ONG Nomad RSI conduit des études agronomIques et assure la mise en

culture de la plante. Cette stlUcture centralise l'ensemble des travaux. Elle sera
à la suite de cette première étude chargée de développer et de permettre
l'application des résultats de ces travaux de recherches dans ses programmes de
solidarité internationale.

Cette étude comparative relève d'un intérêt fondamental car les deux pays concernés
sont fOliement touchés par le fléau du paludisme. Cependant les conditions bioclimatiques
diffèrent largement entre les deux pays et l'étude de faisabilité parallèle entre Asie et Afrique
permet de cerner le potentiel réel d'Artemisia annua.

IIIB.2 Essai de mise en culture d'Artemisia annua par Nomad au Cambodge

et au Sénégal en 2002

En 2002, Nomad a ainsi essayé de cultiver la plante au Cambodge, ainsi qu'au

Sénégal, mais ces 2 essais ont échoue, les plantes étant mortes à des stades précoces. Ainsi
afin de répondre aux questions agronomiques posées par ces échecs de la première mise en
culture, ainsi qu'à celles soulevées par la bibliographie existante sur la culture, Nomad a
voulu mettre en place un véritable essai agronomique au Mondolkiri, ains qu'une plantation
au Sénégal. Les résultats permettent de comparer le potentiel agronomique d'Artemisia annua
dans les deux pays. Cette expérimentation est intégrée au projet A.U.F avec trois universités.
En parallèle de l'expérimentation, une étude ethnobotanique sur les plantes médicinales
utilisées dans le traitement du paludisme, des fièvres et des troubles de l'appareil digestif
auprès des minorités ethniques, s'est déroulée entre les mois de décembre 2003 et d'octobre
2004, financée par l'organisation France Liberté.

Au Sénégal, afin d'assurer une production d 'Artemisia annua et compte tenu des
enseignements de la première année du projet, Nomad a choisi de travailler avec des
associations locales, déjà constituées, reconnues pour leur travail et leurs compétences dans le

123
Chapitre IIIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

domaine. une collaboration avec ENDA-Tiers monde (environnement, développement,

action) dans le tiers monde. Une équipe de l'organisation internationale basée au Sénégal.

Au Cambodge, la présence de l'équipe de Nomad permettra de développer une étude

pluridisciplinaire mettant en valeur l'intérêt de ce type de pratique. L'approche agronomique
nécessite la récolte des données climatiques et édaphiques ainsi que le suivi des cultures.

>- Objectif de l'essai:

• Déterminer si le Mondolkiri possède des conditions adéquates à la culture

d'[Link] par la population locale, en vue de son utilisation comme
antipaludique.
>- Objectifs secondaires :

• Tester une variété adaptée aux conditions agro écologiques du Mondolkiri,

• Chercher un itinéraire technique pertinent, c'est-à-dire lié aux pratiques

agricoles locales.
• Apprécier les résultats de production d'artémisinine. Sont-ils suffisants et
réguliers ?

IIIB.3 Le programme Nomad au Mondolkiri- Cambodge

Depuis 2000, Nomad RSI mène un projet opérationnel de recherche qui porte
spécifiquement sur le paludisme. Cette maladie représente l'une des premières causes de
mortalité et de morbidité du Mondolkiri, particulièrement parmi la population Phnong
bénéficiaire des projets de Nomad. La première phase du projet a consisté en un recueil de
données environnementales, bio-médicales, et ethno-médicales en lien avec le paludisme. La
seconde phase a pour objectif de permettre la mise en place d'interventions de santé autour de
la malaria. Ces interventions portent notamment sur le développement de programmes
d'éducation sanitaire et sur l'amélioration des échanges d'informations entre les groupes cibles
(communautés locales, autorités provinciales de santé et institutions nationales telle que le
Centre National de Malaria (CNM)). La troisième phase a pour objectif de pouvoir proposer
un traitement efficace contre la malaria qui puisse être préparé localement. Dans cette
perspective, la mise en culture et le conditionnement sous forme de thé d'Artemisia annua au
Mondolkiri semble bien correspondre à ces attentes. Cette solution a déjà démontré son
efficacité dans des projets similaires (Anamed, dans près de 50 pays).

124
Chapitre nIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

IIIB .3 . l La situation du paludisme au Mondolkiri

Selon Maurice ( 1993), le poids écrasant du paludisme est un des facteurs essentiel de
la vie des Montagnards, ce qui a contribué à leur isolement. Les habitants des plaines ont
toujours eu une forte aversion envers ces montagnes fortement impaludées. Il cite L.C Brumpt
et V.C Brumpt medecin de l'époque coloniale : « Malgré des conditions de vie défavorables,
les populations montagnardes et forestières, encore au stade de l'organisation tribale, ont pu
subsister dans les régions hautement palustre, hantées par l'Anopheles minimus. Le paludisme
a constitué la meilleure protection de ces tribus faiblement organisées contre des peuples
entreprenant à forte natalité, cherchant sans cesse de nouveaux espaces vitaux » .

Cependant aujourd'hui, comme on a pu le voir dans le paragraphe précédent, les

montagnards du Mondolkiri sont en plein bouleversement de leur société, le paludisme
devient donc un frein à l'essor et au développement économique en affaiblissant
considérablement les forces de ces populations et en maintenant leur faible démographie. Le
taux de mortalité lié au paludisme dans la province est en effet 6 fois plus important que dans
le reste du pays (ADB, 2000).

D'après une étude de l'ONG Health Net International (RNI, 2003), le paludisme est
encore perçue par la population comme étant le plus gros problème de santé. Même si ces
dernières armées le taux d'incidence de la maladie a diminué passant de 76/1 000 en 2000 à
33/1 000 en 2002. Ceci largement du aux actions menées par le Centre national de
malariologie (CNM) ainsi que par les ONG travaillant dans la zone (MDM, RNI, Nomad
RSI), qui ont notamment développé un programme de distribution de moustiquaires de grande
ampleur. Pourtant, les cas de paludisme chronique, généralement non répertoriés, contribuent
à alimenter un cercle vicieux, baisse de l'immunité, faible santé, baisse du travail et
pauvreté l l .

IIIB.3.2 Caractéristiques géographiques et climatiques du Cambodge

Le royaume du Cambodge couvre une superficie de 1 8 1 000 km2 et s'étend sur 580 km
d'est en ouest et sur 450 du nord au sud. Situé entre les latitudes 1 0° et 14°30' Nord, ce pays
tropical présente une ouverture maritime sur le golfe de Thaïlande au sud ouest et partage ses
frontières terrestres avec le Vietnam (est et sud-est), le Laos (extrême nord-est) et la
Thaïlande (ouest et nord). Situé en plein cœur de la péninsule indochinoise, il peut être divisé
en deux régions géomorphologiques principales (figure 41).

125
Chapitre IIIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

La première comprend les plaines centrales qui s'étendent du nord du bassin du Tonlé
Sap au sud du bassin du Mékong. Ces plaines se sont constituées par le comblement d'un
ancien golfe marin par des alluvions et des colluvions issues des fleuves précédemment cités.

C'est une zone fertile qui a été historiquement le lieu de développement de la

civilisation Khmère grâce à la maîtrise de l'irrigation et de la riziculture. La deuxième sous
région se situe aux marges de cet espace et rassemble des chaînes de montagnes riches d'une
grande diversité de minéraux, de sols, de faune et de flore. Ce sont des régions couvertes de
forêts plus ou moins denses, très peu peuplées, elles n'ont jamais été le lieu de peuplement
des khmers et demeurent isolées du pays.
Ainsi on peut déjà se rendre compte que ces deux grands espaces ont un rôle important
sur les dynamiques économiques et sociales cambodgiennes en créant un contraste entre
occupation de l'espace dans les plaines et dans les montagnes, même si aucun déterminisme
géographique ne doit être déduit de ces constatations.

IIIB. 3.3 La zone d'étude: la province de Mondolkiri

La province de Mondolkiri est située au nord-est du Cambodge (figures 36). Le

territoire couvre une superficie d'environ 1 4 000 km2 dont 1 122 200 hectares d'agriculture et
de culture sur brûlis, 225 1 22 hectares d'habitations et 120 231 hectares de montagnes forts et
savane. La province est administrée suivant un découpage en districts (d), en communes (2 1)
et en villages (supérieur à 1 00). Longtemps isolée, l'accès est aujourd'hui plus aisé.

Fignre 36: Carte du Cambodge (Source: www. [Link])

1 26
Chapitre IIIB 1 . Contexte du projet de coopération scientifique inter-univeristaire

De plus, les déplacements à l'intérieur de la province restent très difficiles (ornières creusées
en saison des pluies, rochers émergeant à la surface du sol, zones sableuses au nord de la
province). Historiquement considérée comme le territoire des minorités ethniques, la province
est aujourd'hui composée à 65 % de Phnongs, 30 % de Khmers et 5 % d'autres ethnies
comme les Stiengs , Kruengs, Krols, Jaraïs, Tampuans, ainsi que des Chams, Laotiens et
Vietnamiens.
Capitale provinciale, Senmonorom est située à 380 Km de Phnom Penh. L'accès se
fait quasiment uniquement par la route et dure 8h en saison sèche et 12h ou plus en saison des
pluies. Deux points de frontière avec le Vietnam sont ouverts permettant le développement
d'un commerce transfrontalier.
La province ne possède aucune route goudronnée et, en dehors de la piste reliant la
capitale provinciale à celle du pays, la circulation est très difficile. Ainsi, durant la saison des
pluies, les difficultés de transport laissent beaucoup de zones de la province uniquement
accessibles à pied, à dos d'éléphant ou par charrette. Depuis 2004 des axes routiers
permettant de relier les différents districts de la province sont en voie de réalisation. D'après
les autorités provinciales, la population en 1 999 était de 36300 habitants avec une densité de 2
habitantslKm2• Les estimations pour 2003 montrent une augmentation à 40 000 habitants pour
une densité de 2,8 habitantslKm2• Ceci essentiellement du à l'arrivée de nouveaux migrants
Khmer. (ADB, 2000). (Maurice, 1 993).

127
 CHAPITRE IIIC
Matériels et méthodes : Artemisia annua

128
 Chapitre mCl . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

IIICl. Essai de mise en culture au Cambodge

IIICl.1.1 Les graines d'Artemisia annua

44
La variété des graines utilisée est fournie par Anamed[ l . C'est un hybride issu du
croisement entre lignées provenant d'une variété chinoise et d'une variété vietnamienne
appelée A3. Ce qui soulève la question de la durabilité de la culture. En effet, les graines
produites par la plante ne sont pas réutilisables, elles perdent leur teneur en artémisinine et la
quantité de biomasse est beaucoup plus faible (revue d'information d'Anamed). Afin de
résoudre ce problème, Anamed propose de multiplier végétativement la plante par bouturage.

Après la première année de culture, il est également envisageable d'utiliser une

multiplication végétative par bouturage d'un plant de l'année précédente. D'après Anamed,
une plante de 2 mètres peut être bouturé en 1000 petits tronçons de 2 cm de long qui pourront
être replantés à 1 cm de profondeur pour donner de nouveaux plants.

IIICl.1.2 Sites de mise en culture

IIIC1.1.2.1 Localisation
Site l : La parcelle de l'expérimentation (fig. 37) est située à une altitude de 747m, sur
le versant sud-est d'un vallon du plateau du Yok lai ch, au creux duquel s'écoule un ruisseau.
Le champ est légèrement en pente (inférieur à 5%) contre un petit bois qui longe le ruisseau.
La végétation est composée d'un tapis de graminées de 1 0 à 20 cm de haut. Les sols formés
sur le plateau sont issus de la dégradation de la nappe de basalte. Ils sont très épais, plus de 3
mètres par endroits et majoritairement composés d'argiles, probablement de la kaolinite. La
nature exacte de la roche mère m'étant inconnue et aucune analyse du sol n'ayant était faite, il
m'est difficile de dégager ses caractéristiques pédologiques et l'intérêt agronomique de la
parcelle.
Afin d'améliorer le potentiel de culture, sur chaque micro-parcelle du site 1 , le sol a
été retourné sur 50 cm. De plus, Eupatorium .odoratum a été incorporée afin non seulement
d'alléger le sol mais aussi d'en améliorer sa teneur en matière organique. C'est une plante
envahissante colonisant les milieux dégradés, largement utilisée au Cambodge comme engrais
vert et insecticide. Un apport de fumure animale a été également effectué avant la
transplantation au champ.

129
 Chapitre IIlC 1 . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

Site 2 : Situé sur une petite île de la rivière qui s'écoule à Senmonorom, le site 2 est au
creux de la vallée de l'Oragouis. La végétation est beaucoup plus diversifiée et plus dense que
sur le plateau. On remarque sur la parcelle une prédominance d'Imperata cylindrica (2 à 2,5m
de haut). Le site contient également des touffes d'Eupatorium odoratum (2 à 3m de haut) et de
nombreuses ronces entremêlées. Des espèces caractéristiques des zones humides sont
également présentes. Des arbres de 8 à 1 5m bordent le champ par endroit. Le sol est de
couleur brun-rouge, sa teneur en matière organique semble plus élevée que sur le site 1 ; il
colle et tâche les doigts. Sa situation géographique, bas-fond de vallée, permet en effet au site
de recevoir alluvions et colluvions. Ils se déposent en période de pluie et de crue de la rivière,
rendant ainsi le sol beaucoup plus sableux! limoneux que sur le plateau. La proportion argile/
limon! sable est bien différente de l'autre site, le sol est plus léger, moins compact et plus
humide. De plus il est protégé du lessivage des fortes pluies par un léger couvert forestier,
présent par endroit.

IIIIC 1 . 1 .2.2 Le Climat

En hiver (mi-novembre à mi-février), les températures sont comprises entre 1 0°C et

3 1 °C et entre 16°C et 36°C en été (mi-février à Mai).
Les précipitations durant la saison sèche, qui correspond à la saison de la culture (novembre à
avril), sont inférieures à 200mm.

IIIC1.1.2.3. Dispositif expérimental

Le modèle expérimental correspond à un plan en trois blocs complets aléatoire répétés sur
deux sites (figure 37).

1 30
 Chapitre IllC I . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

Figures 37: Repiquage sur le site 1 (Source N. Savajol Nomad RSI).

Sur chacun des sites trois blocs ont été séparés et les traitements sont répétés dans chaque
bloc. La description des sites permet la construction de ces blocs, chacun devant être le plus
homogène possible.
Pour le sitel ; il a ainsi été décidé d'agencer les blocs perpendiculairement à la pente, afin
d'éviter l'hétérogénéité liée à la pente et à la proximité de la forêt. Le champ est un rectangle
de 38m de long sur 1 8m de large, chaque bloc placé dans la longueur contient 8 modalités de
3m sur 4m (12m2) séparés par des bordures.
Sur le deuxième site, les blocs ont été placés en fonction de l'ombrage créé par les arbres
bordant le champ. Le bloc 1 est ombragé le matin et le soir tandis que les 2 autres blocs ne
subissent pas d'ombrage.

Tableau 26: Récapitulatif des modalités de culture

Caractéristiques RP 2p 4p Ni 82
Plante/m " 1 2 4 1 1
Irrigation Oui Oui Oui Non Oui
Site 1 1 1 1 2
Fertilisation Oui Oui Oui Oui Non
Travail du sol Oui Oui Oui Oui Non
(RP, 2p, 4p, NI, S2 abréVIatIOns des modalItés de culture)

IIIC1 . 1 .2.4 L'analyse de sol (Cambodge)

Le sol est une matrice complexe composée, en première simplification, d'une partie
minérale et d'une partie organique. C'est un milieu vivant, en perpétuelle évolution. La nature
et l'activité d'un sol dépend d'un nombre important de facteurs :
conditions naturelles telles que le climat (température, taux d'humidité, . . . . ),
type de faune et de flore présent
conditions liées à l'activité humaine (agriculture, urbanisme . . . . ) et toutes activités
polluantes (rejets industriels, ménagers, utilisation de fertilisants et pesticides en
agriculture, . . . ).
Le statut organique du sol, évalué par les taux de carbone et d'azote, a souvent été
considéré comme ru:; indicateur fiable de la qualité du sol. Ceci est dû aux effets positifs de la
matière organique sur les propriétés physiques (structure, stabilité, porosité), chimiques
(cations échangeables, capacité d'échange cationique (CEC), pH).

131
 Chapitre mc l . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

L'effet d'une pratique sur le statut du sol, l'hétérogénéité du sol, les risques de maladies et les
contraintes du calendrier agricole pourraient bien diminuer les rendements de la biomasse
végétale.

Le sol des deux sites expérimentaux de culture au Mondolkiri, est basaltique et

majoritairement composé d'argiles, probablement de la kaolinite. La nature exacte de la roche
mère étant inconnue et aucnne analyse du sol n'ayant était faite, il a été difficile de dégager
ses caractéristiques pédologues et son intérêt agronomique. Il nous a semblé donc intéressant
d'étudier dans un premier temps ces échantillons sans appliquer de transformations chimiques
ou physiques.

Les objectifs de cette étude étaient de dresser les propriétés physico-chimiques du

sol (le carbone organique, la CEC et la granulométrie - texture-) pour les utiliser comme
indicateurs de la qualité des sols et de la durabilité des systèmes de culture dans les deux sites
expérimentaux.

IIIC1.1.2.5 Résultats et discussion

Les analyses physico-chimiques ont permis de caractériser les différents sols sur les
deux sites et de corréler les différents variables. Le résultat sont données dans le tableau 27.

Analyse du sol Site-l Site-2

Sables Grossiers (0,2 à 2 mm) 4,7 ± 0,2 9,6 ± 0,1
Sables Fins (0,05 à 0,2 mm) 1 8,4 ± 0.1 27,9 ± 0,3
Limons Grossiers (0,02 à 0,05 mm) 4,6 ± 0,2 8,9 ± 0,5
Limons Fins (0,002 à 0,02 mm) 12,9 ± 0,3 1 5,0 ± 0,4
Argile « 0,002 mm) 54,3 ± 0,1 33,5 ± 0,2
pHeau 5,4 ± 0,1 5,9 ± 0,2
pHKcl 4,4 ± 0,02 5,0 ± 0,01
Carbone organique % 28,9 ± 0,02 26,6 ± 0,02
Matière Organique % 50,1 ± 0,9 45,6 ± 1 , 1
Azote Kjeldhal % 0,23 ± 0,2 0,25 ± 0,4
Rapport C/N 12,6 ± 0,4 10,6 ± 0,3
Capacité d'échange cationique (CEC) 12,27 ± 0,3 12,0± 1,4

132
 Chapitre IllCr . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

(méq/l00g de terre fine)

Potassium échangeable KcmOl+kg-l 0,91± 0,1 1 ,0 ± 0,1
Calcium échangeable Cacmol+kg-l 0,97 ± 0,2 1,8 ± 0,4
Magnésium échangeable Mgcmol+kg- l 1 ,5 ± 0,1 2,3 ± 0,5
Rapport Mg/CEC 12,2 ± 0,3 19,1 ± 0,2
Rapport KlCEC 7,4 ± 0,5 8,3 ± 0,4
Rapport CA/CEC 7,9 ± 0,1 14,9 ± 0, 1
Rapport KlMg 60,8 ± 0,7 43,5 ± 0,3
Cuivre Cu ppm 0,91 ± 0,01 1,02 ± 0,01
Zinc Zn ppm 0,43 ± 0,02 1,7 ± 0,02
Fer Fe ppm 14,7 ± 0,03 27,5 ± 1 , 1
Manganése Mn ppm 1 1,6 ± 0,4 19,4 ± 1 ,3

Tableau 27 : Résultats des valeurs moyennes d'analyses de sol

Les moyennes ont été établies à partir de trois blocs dans chacun des sites expérimentaux, séchant que les valeurs
relatives à chaque bloc ne présentent pas de différences significatives.

- Texture du sol :
La granulométrie permet d'évaluer la stabilité structurale du sol, en particulier les
risques de battance, d'après la proportion existant entre les argiles et les limons, ainsi que la
2
solidité de l'état de la structure du sol"et ses résistances aux agents de dégradation[ l . J.
Le sol du site-l appartient à la catégorie des sols argileux. Les sols argileux
contiennent plus de 25 % d'argile. Ce sont généralement des sols riches qui retiennent bien
l'eau et les éléments nutritifs. Ils sont toutefois mal aérés, mal drainés et ils ont tendance à
être alcalins. De plus, ils sont difficiles à travailler, ils se réchauffent lentement au printemps
et ils se compactent facilement[3J .
Le sol du site-2 est classé parmi la catégorie des sols sableux limono-argileux. Il
contient de 20 à 35 % d'argile, moins de 28 % de limon et 45 % ou plus de sable. Les sols
sableux sont principalement constitués de sables grossiers. Ces sols se travaillent bien et se
réchauffent rapidement au printemps. Ils offrent une bonne aération et un bon drainage.
Les sols limoneux sont surtout formés de sables fins et de limons. Ces sols sont
«battants», c'est-à-dire qu'ils ont tendance à former une croûte en surface sous l'effet des
pluies et des arrosages, ce qui les rend imperméables à l'eau et l'air. Ils se colmatent aussi

133
 Chapitre mc l . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

très facilement, ce qui a pour effet d'asphyxier les racines des végétaux et l'activité des
organismes vivants du sol[l -3] .
En raison de son caractère argileux, le sol du site-I est plus lourd, et plus compact donc peut
engendrer des phénomènes d'asphyxie racinaires. A l'inverse, le sol du site-2 est davantage
sableux et apparaît donc plus équilibré et propice au développement des végétaux.

-Acidité
Les pHeau, pHKC1 permettent de mesurer le degré d'acidité ou d'alcalinité d'un sol. Les
deux sols sont globalement de nature acide (�5,5), ce qui correspond aux conditions idéales
de croissance de l'artemisia annua. Toutefois, notons que le sol du site-I présente une acidité
plus élevée que celui du site-2.

-Teneur en matière organique

La matière organique contribue à la structure du sol et à une bonne alimentation des
végétaux. Il est donc logique que la quantité nécessaire de matière organique soit en rapport
avec la quantité d'argile. La matière organique renferme à la fois du carbone et de l'azote
dans des proportions qui varient avec son état dévolution (rapport CIN, carbone/azote). Un
rapport correct CIN, compris entre 9 et 12, indique un sol sain où la vie microbienne est
active, la matière organique bien décomposée, c'est-à-dire un humus stable [5 ,6] ,

Compte tenu du fait que le pourcentage de carbone organIque des sols argileux
classiques est d'environ 30 %, on peut affirmer que les sols des sites 1 et 2 sont
particulièrement riches en matière organique (site 1 : 50 %, site 2 : 45 %). Ces taux élevés
peuvent être liés à l'historique du sol (ancien marécage) mais aussi à la présence de carbone
fossile important. Cependant, le caractère acide que présentent les deux sites réduit l'activité
microbienne qui induit une modification des formes de matières organiques [6] ,

Au uiveau du rapport carbone/azote, nous pouvons remarquer que le site-l et le

site-2 ont de bons rapports CIN, ce qui leur confère une bonne activité.

-Capacité d'échange cationique (CEC).

Les cations jouent un rôle important dans le sol. Ils n'interviennent pas seulement en
tant qu'éléments nutritifs, mais, ont aussi un rôle essentiel dans le statut acide du sol, le
maintien de l'activité biologique générale et de la structuration du sol. Leur caractérisation

134
 Chapitre mc ! . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

d'analyse est la capacité d'échange cationique (CEC), ou quantité maximale de cations de

toutes sortes qu'un poids déterminé de sol (habituellement 1 00g) est capable de retenir[6]
Il est possible de distinguer 3 types de sols selon leur % de CEC [7] :
• CEC < 10 méq : le sol a une faible possibilité de stockage et il est indispensable de
faire des apports réduits d'engrais à chaque épandage.
• CEC > 15 méq : le sol a un g;ros réservoir de stockage et avant de le fertiliser, il faut
vérifier que la plante a vraiment des besoins très importants.
• CEC entre 10-15 méq : le sol est apte à libérer les éléments minéraux en quantités
normales. La fertilisation consiste à réapprovisionner le sol après avoir observé la
diminution des réserves dans la CEC.
Il apparaît donc que le site 1 aussi bien que le site 2 ,qui possèdent une CEC de 12,
constituent des sols ayant de bonnes réserves en éléments minéraux.

-Teneur en sels minéraux

Dans les sols cultivés, les rapports quantitatifs entre les cations ont une très grande
importance. Il est essentiel de maintenir un équilibre nutritionnel entre les cations bivalents
(Ca++, Mg*) et monovalents (K+) [7,8] . Le calcium est généralement présent en quantité
suffisante pour assurer les besoins des plantes cultivées. Le magnésium et le potassium sont
deux cations indispensables à la vie des plantes : Mg en tant que cofacteur de plusieurs
enzymes et élément constitutif de la chlorophylle, K comme agent catalytique de la synthèse
des glucides et du transfert des divers nutriments [9] .
Les deux sites atteignent une teneur suffisante en sels minéraux et les rapports sels
minéraux - capacité d'échange cationique (CEC) sont convenables, En particulier le sol du
site 2 possède une teneur en calcium et en magnésium presque deux fois plus élevée que celui
du site 1 . Or le calcium et le magnésium sont des éléments minéraux essentiels au
développement végétatif des plantes.

-Tenure en oligo-élément
Les oligo-éléments sont indispensables à la vie des plantes et des micro-organismes du
2 2 2
sol. Certains sont prélevés sous la forme cationique (Fe +, Mn +, Cu2+, Zn +) et d'autres sous
la forme anionique (B, Mo). Bien qu'ils n'interviennent qu'à faible dose, leur rôle
physiologique est considérable. Ils occupent, en effet, des sites actifs au sein des enzymes des
micro-organismes et de la plante : enzymes respiratoires (Cu, Fe), enzymes de la

135
 Chapitre mc! . Matériels et méthodes essai de mise en culture au Cambodge

photosynthèse (Mn, Fe, Zn, Cu) et de la reduction des nitrates absorbés par les plantes (Fe,
MoPl.
Le caractère acide des sols des deux sites accorde une meilleure disponibilité en oligo­
éléments, ce qui explique le fort pourcentage remarqué. La teneur en zinc est plus faible pour
le site 1 (0,43 ppm) et le site 2 (1,7 ppm).
Les sols étudiés sont, en général, assez pauvres en CUlvre. Les teneurs relevées sont
pratiquement toutes en dessous de 2 ppm, cette valeur représentant le seuil critique en cuivre.
Ces faibles teneurs reflètent les fortes teneurs en calcaire de ces sols. En effet, la richesse des
sols en calcaire actif entraîne une insolubilisation des oligo-éléments et diminue leur
assimilabilité8l.

Les teneurs en fer sont élevées, généralement supérieures à 10 ppm, respectivement 1 5

et 27 ppm pour le site 1 et le site 2.
Les teneurs en manganèse sont relativement élevées (12 ppm pour le site ! et 20 ppm
pour le site 2). Le cuivre, le manganèse et le fer joutent un rôle important dans l'hUlllification
car ils catalysent les processus d'oxydation des pOlyphènols [24l.

136
 CHAPITRE IIIC2

Essai de mise en culture au Sénégal

137
 Chapitre IIIC2. Matériels et méthodes : Essai de mise en culture au Sénégal

IlIC2. Essai de mise en culture au Sénégal

lIIC2. 2.1 Historique du projet

Le programme proposé doit permettre le développement de l'utilisation de la plante
Artemisia annua comme remède au paludisme, suivant les recommandations de l'OMS de
«valoriser les ressourèes locales de santé et les médicaments à base d'artémisinine». Pour
cela, plusieurs étapes sont nécessaires : permettre la mise en culture de la plante au Sénégal,
son étude phytochimique et la formation de personnes-relais sur les aspects de culture et de
préparation du médicament.
Dans le cadre du projet de mise en culture de l'Artemisia annua, la mise en place de
cultures expérimentales au Sénégal permet d'explorer les potentialités de cultiver la plante
dans un pays fortement touché par le paludisme. Cette étude est réalisée parallèlement à celle
du Cambodge afin de comparer les résultats dans deux régions concernées par les
problématiques liées au traitement du paludisme.
Ce projet a été réalise en partenariat avec l'O.N.G. sénégalaise ENDA et l'université
Cheikh Anta Diop de Dakar. Le partenariat avec l'université de Dakar se déroule dans le
cadre de l'AUF, et permettra de comparer les résultats obtenus au Cambodge et au Sénégal.
Ainsi toute la logistique et la conception du programme ont été pris en charge par ENDA et
l'université de Dakar.

lIIC2. 2.2 L'objectif général du projet

L'objectif général du projet est l'étude de la mIse en culture et de l'utilisation

thérapeutique de Artemisia annua (AA) au Sénégal,

Les objectifs spécifiques sont :

1 . Une étude agronomique de la plante dans plusieurs conditions de culture (en

conditions expérimentales et dans le cadre d'un projet pilote en conditions rurales)
• Connaître le rendement (biomasse de feuilles fraîches/sèches ; teneur en
artemisinine ; rendement/ha)
• Proposer un itinéraire technique (date de semis, bouturage, période récolte)
• Connaître le potentiel de production pour différents sites
• Evaluer les meilleures options pour développer la culture d'AA en fonction de
l'encadrement technique requis et des objectifs.
2. Une validation de l'efficacité thérapeutique d'AA sous forme d'infusion

138
 Chapitre IIIC2. Matériels et méthodes : Essai de mise en culture au Sénégal

3 . Une étude de marché (coût de production, lieu de distribution, public cible)

4. Une information du public sur l'utilisation d'AA

IIIC2.2.3 La résistance aux antipaludiques au Sénégal

La résistance à la chloroquine a été détectée au Sénégal pour la première fois in vitro

en 1 984 puis in vivo en 1 987, d'abord en Casamance (région de Mlomp). Elle atteint
aujourd'hui plus de 50% dans cette région et a également gagné la majeure partie du pays
entraînant une recrudescence de la mortalité palustre, surtout chez les enfants de moins de 5
ans [11 . I21 . On observe actuellement un taux d'échec thérapeutique supérieur à 25% dans 4 sites
sentinelles (taux en constante augmentation) et une résistance parasitologique in vitro [lIl
variant de 30 à 60% [ 131 . Pour le chlroquine/amodiquine, actuellement, les échecs
thérapeutiques sont de l'ordre de 3 à 7% mais l'apparition rapide de la résistance, dès son
4
introduction et les taux actuellement observés en Afrique de l'Est, font craindre le pire [1 1 .

IIIC2.2.4 Localisation de la mise en culture

Les essais expérimentaux ont été effectués au jardin botanique du centre Madesahel à
Mbour et au jardin botanique de l'université Cheikh Anta Diop à Dakar. ENDA-Madesahle
(méthodes appliquées au développement du sahel) fait partie de l'Association des Jardins
Botaniques de France et des pays francophones. Un essai villageois est de plus mené dans le
périmètre maraîcher des fermes de la région des Niayes.

Pour cela des tests ont été prévus dans le jardin de plantes du Centre Madesahel avec
des parcelles arrosées respectivement à l'eau de robinet et à l'eau de puits. D'autres tests
devraient être faits dans un village sous la supervision de femmes. Cette première phase est
composée de deux étapes de trois mois chacune et avait débuté en juillet 2004.

JIJe2.2.S Semis et élevage des plantules

Le semis a été réalisé dans un bac en bois de 3 cm en sachets individuels. Ils ont été
remplis avec un mélange sable/compost (50/50) préalablement bouilli afin d'éliminer les
graines adventices. Environ 400 graines d'Anamed ont été semées le 02 juin 2004 dans les 2
pépinières. Elles ont été recouvertes par un film plastique :
20 plantes ont été séparées en sachets pour l'expérimentation 1 (effet des
eaux d'arrosage),
1 0 plantes sont arrosées avec de l'eau plate

139
 Chapitre IIIC2. Matériels et méthodes : Essai de mise en culture au Sénégal

et 1 0 plantes avec eau du puits.

La pépinière est arrosée tous les jours à l'aide d'un vaporisateur afin de conserver une
atmosphère toujours humide. 26 jours après avoir été mis en pots, les plants sont transplantés
sur chacun des deux sites. Ils sont arrosés tous les jours après la transplantation pendant une
semaine, puis la fréquence d'arrosage est diminuée, tous les 2 jours puis tous les 3 jours.

140
CHAPITRE IIIC3
Méthodes d ' analyses

141
 Chapitre IllC3 Méthodes d'analyses

IllC3. Methodes d'analyses

I1IC.3.1 Echantillonage du matériel végétal

La quantité en artémisinine a été déterminée sur des échantillons de Artemisia annua

sèches du Cambodge à différents stades de développement physiologique (figure 38) :

• en bourgeons : appariation des bourgeon (A)

• à l'apparition des fleurs (environ 50% de fleurs matures) (B),
• à pleine floraison ( 100% de fleurs matures) (C).

Figure 38 : Stades physiologiques de récolte d'Artemisia annua

(A : feuille au stade bourgeon, B : inflorescence au stade 50% de floraison et C : à 1 00% de
floraison) (Source : Endrias).

et de la date de récolte (févier, mars et avril 2004), par site expérimental et leur modalités de
culture. Environs 90 échantillons ont été extraits, tous les échantillons utilisés sont donc issus de
plantes récoltées au champ, séchées durant une dizaine de jours entre 35 et 40 oC, effeuillées,

142
 Chapitre IllC3 Méthodes d'analyses

puis finement moulues. Chaque analyse comporte donc 4 parties : la biomasse foliaire générale
et les 3 échantillons. Nous avons effectué une mesure de la masse de chacune des ces 4 parties à
l'aide d'une balance. Un échantillon représente la biomasse foliaire sèche d'un individu, ainsi
pour chaque analyse les 3 plantes prélevées au cours de la récolte constitue un échantillon. Le
rendement en artémisinine est aussi lié à la quantité de biomasse produite. Le rendement
correspond à la quantité d' artémisinine produite pour 1 ha, et représente par la formule :

y = masse de matière sèche (kg/ha) x tenenr en artémisinine (g/kg)

I1IC.3.2 Choix de la méthode d'analyse de l'ArtemÎsÎa annua

Pour notre étude de la production d' artémisinine dans l'Artemisia annua pour les deux
sites expérimentaux, il nous fallait disposer de techniques d'analyse de la teneur en
artémisinine à partir d'échantillons de plantes. Il convenait de trouver une méthode alliant les
avantages d'une précision suffisante avec une mise en oeuvre rapide, permettent d'effectuer
un grand nombre d'analyses.
La technique chromatographie liquide à haute pression, avec détection électrochimique
(CLHP-EC), est certainement la méthode d'analyse de l'artémisinine la plus sensible et la
plus sélective. L'utilisation d'un tel détecteur exige cependant un appareillage particulier, car
l'ensemble du système doit être totalement exempt d'oxygène (tuyauterie en acier inoxydable,
chauffage et dégazage continu de la phase mobilei l5J • Par ailleurs, la préparation de
l'électrode de détection, de même que la stabilisation du système de détection nécessite
beaucoup de temps. Enfin, chaque échantillon doit également être dégazé avant l'injection.
Une difficulté majeure de l'artémisinine, due fait de l'absence de chromophore dans la
molécule, c'est qu'elle ne réagit que très faiblement aux UV.

Il s'agit donc d'une méthode délicate d'utilisation, peu adaptée à la réalisation de

grandes séries d'analyses en un court laps de temps, nécessaires aux travaux de sélection.
Pour ces derniers, nous avons finalement opté pour la méthode par chromatographie sur
couche mince avec quantification par densitomètre. Une analyse complémentaire de
l'Artemisia annua du Cambodge a été effectuée par chromatographie liquide haute pression
couplée à la spectrométrie de masse

143
 Chapitre mC3 Méthodes d'analyses

IIIC.3.3 Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)-Densitomètrie

IIIC.3.3.1 Extraction de l'Artemisia annua

4
La méthode CCM s'inspire de celle décrite par Delabays [ 12.5 1 . 100 mg de feuilles et de
fleurs sèches sont réduites en poudre puis mixées pendant 30 secondes dans 5 ml de toluène.
L'extrait est centrifugé (3770 tours/minute) durant cinq minutes. La concentration en
artémisinine est établie en se référant à la droite d'étalonnage.

IIIC.3.3.2 Solution standard

Une solution mère d'artémisinine à 1 mg/ml est préparée dans du toluène. Cinq
standards sont préparés à partir de cette solution pour être déposés sur la plaque de silice.
Leurs concentration en artémisinine sont de 50, 1 00, 1 50, 200, et 250 ng/�L. La lecture se
fait au densitomètre. La droite d'étalonnage est tracée en rapportant la concentration en
artémisinine à la surface de la tache du spot (fig. 40).

IIIC.3.3.3 Dosage de l'artémisinine par (CCM) densitomètre

2,0 �l d'extrait sont déposés automatiquement sur une plaque avec gel de silice
( l Ox20 cm), 5 dépôts par plaque ont été effectués à 1 5 mm du bord inférieur de la plaque, à
20 mm, à 35 mm, à 50 mm, à 65 mm, 80 mm de largeur. L'éluant de migration est composé
d'un mélange d'hexane et d'éther diéthylique. La migration dure 60 minutes. La révélation
s'effectue en immergeant la plaque pendant 1 0 secondes dans une solution composée
d'acide acétique, d'acide sulfurique et d'anisaldéhyde, puis en la disposant pendant 1 0
minutes sur une plaque chauffante réglée à 100CC (tableau 28).
Le dosage est réalisé par densitomètre à l'aide d'un scanner Camag (Camag tic
scanner), couplé à un logiciel. La lecture se fait en absorbance à une longueur d'onde de 530
nm, en utilisant une lampe au tungstène.

144
 Chapitre IllC3 Méthodes d'analyses

Plaque Plaque recouverte de silice 60 F254 (Merk), 25 �m

Application 10x20 cm
Application Dépôts automatiques
Quantité 2 �I
Position Les spots sont déposés à 1 5 mm du bord inférieur de la plaque
Migration
Solvants 24 mL n-hexane et 20 mL diéthyl éther
Distance 4,5 cm
Cuve Cuve à double compartiment
Type Linéaire ascendante
Saturation Une paroi de la cuve est tapissée de papier buvard. La plaque
déposée dans le compartiment vide est conditionnée dans la
vapeur des solvants durant 30 minutes. La chromatographie débute
lorsque la cuve est inclinée de façon à remplir le deuxième
compartiment du mélange de solvants.
Révélation
Révélateur 200 mL d'acide acétique
4 mL d'acide sulfurique
2 mL d'anisaldéhyde
Technique Immersion
Température 100 oC
Dépots automatiques DESAGA TLC-Applicator AS 30
Densitomètre DESAGA CD 60

Tableau 28 : Mode opératoire de la chromatographie sur couche mince et densitomètre

Figures 39 (a) standards d'artemisinine en (%) (b) extraites d'artemisia annua

Sur une plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) .

1 45
 Chapitre IIIC3 Méthodes d'analyses

Droite d'étalonnage de la concentration en Artémisinine

3000

�
v = 17AAY + 10<; 77
2500
R" = 0,9
.a, 2000
,
"C
• 1 500
u
�
<il 1 000

500

0
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5

Artémisinine (%)

Figures 40 : Droite d'étalonnage de la concentration en artémisinine soumise au densitomètre

Une analyse complémentaire de l'Artemisia annua du Cambodge a été effectuée par

chromatographie liquide haute pression couplée à la spectrométrie de masse (LC IMSIMS), et

qui n'a montré aucune différence sigoificative avec le méthode CCM-densitometrie et confirme

les résultats obtenus. (Configuration LC-MSIMS en Annexes.)

3,00805

Y = 24507x - 875,78
R' = 0,9999
2.50805

1.
2,00805

1,50805 • Sériel

- Linéaire (Série1)
1.00805

5,00804

0,00800
2 4 6 8 10 1�
-5,00804

Figure 41: Droite d'étalonnage pour l'analyse quantitative de l'artémisinine par LC- MSIMS

146
 Chapitre IllC3 Méthodes d'analyses

IIIC.4 Analyses statistiques

L'analyse de variance est utilisée de façon à mettre en évidence des différences entre
traitements pour un paramètre donné. La variance a été analysée à deux ou trois niveaux afin
de dégager les effets des principaux facteurs et ceux des interactions entre facteurs, incluant le
stade physiologique, la date de récolte et le site expérimental, les modalités de culture, le
nombre de jours entre la transplantation et la récolte et leurs interactions sur la teneur en
artémisinine et le rendement en artémisinine.
Le test de Newman & Keuls a permis d'analyser statistiquement la différence entre
moyennes avec un seuil de tolérance à 5; 1 et 0, 1 % lorsque l'effet est significatif. Les
analyses de variance ont été réalisées grâce au logiciel Sigmastat CVersion 2,0 USA)

IIIC.S Analyses des sols (Cambodge)

IIIC.S.I Le prélèvement et analyses de sols

Le prélèvement de sol se situe dans deux sites expérimentaux au Mondolkiri Cambodge.

Un échantillon est constitué par le mélange de 3 blocs de prélèvements répartis sure une jugée
homogène. Le sol de chaque site a été recueilli à une profondeur de 0 à 1 0 cm. Les échantillons ont
été séchés à 1 00 oC pendant 24 h.

IIIC.S.2 Granulométrie
Il s'agit de la mise en suspension des particules minérales d'un échantillon de terre fine et
stabilisation de cette suspension en particulier après destruction des agrégats par l'attaque à l'eau
oxygénée. Par la suite, les particules sont dispersées à l'aide d'un dispersant alcalin
(Héxamétaphosphate de sodium). La séparation des différentes classes de particules est réalisée
par sédimentation et par gravité pour les fractions fmes « 50llm) et par tamisage pour les
fractions supérieures. Le prélèvement des fractions fines est effectué à la pipette ( Argile, limon
fin et limon grossier). Les résultats sont exprimés en % de la terre fine.

IIIC.S.3 pH et conductivité électrique

Le pH est déterminé selon la norme française (1SO I 0390) sur une suspension de sol
prépare dans cinq fois son volume. Puis agitation pendant 5 minutes un échantillon de 5 mL de
sol dans 20 mL d'eau. Ensuite la lecture du pH est notée après deux heures par pH ImV-mètre
(pH330/SET). La conductivité électrique, exprimée en IlS/cm, est mesurée par conductimètre
(LF330/SET).

147
 Chapitre mC3 Méthodes d'analyses

IIIC.5.4 La Matière organique

La détermination de la matière organique est faite selon la méthode (AFNOR).
L'oxydation d'un échantillon de sol par le bichromate de potassium en milieu acide, et le dosage
en retour de l'excès du potassium par du sel du Mohr permettent de déterminer le carbone
organique (Corg). La matière organique est obtenue en multipliant le (Corg) par un facteur
(1 ,82) et est exprimée en %.

IIIC.5.5 L'Azote total par la méthode Kjeldahl

Un échantillon contenu dans une papillote de papier est minéralisé en présence de 5 mL

de H2 S04 concentré et d'une pastille de catalyseur Cu-Se (Kjeltabs, perstrop Analytical : 1 , 65 g
K2S04, CUS04 , 1 6mg Se/pastile). La minéralisation est réalisée à froid pendant environ 12
heures, puis à chaud dans un minéralisateur ( 1 0 1 6 Digester, Tecator). La récupération des
produits de minéralisation et le dosage de l'ammoniac sont faits automatiquement par l'appareil
Kjelytec auto 1030 analyser, Tecator. L'azote est exprimé en milligrammes par gramme.

IIIC.5.6 La capacité d'échange cationique

La capacité d'échange cationique (CEe) et le taux de saturation en cations échangeables

sont déterminés au pH du sol à l'aide d'une solution de chlorure de baryum, à faible
concentration ionique selon la norme française (IS01 1 260). Les cations échangeables après
extraction sont dosés par spectrophotométrie d'absorption atomique (perkin Elmer Analsts 1 00) :
le potassium (K) à flamme (air /acétylène) à la longueur d'onde '}.., = 766,5 nm ; le calcium (Ca) à
flamme (air/acétylène) à la longueur d'onde A = 422,7 nm ; le (Mg) à flamme (air/acétylène) à la
longueur d'onde '}.., = 285,2 nm. Ces cations échangeables sont exprimées en centimoles de
charges positives : kg (cmol+lkg) et en % de la CEC.

La CEC est déterminée après saturation du sol par une solution du sulfate de magnésium
(D,IN) et aussi dosage du magnésium qui reste en excès. La CEC est exprimée en centimoles de
charges positives/ kg de sol (cmol+lkg).

148
 Chapitre mC3 Méthodes d'analyses

IIIC.5.7 Dosage des micro-éléments : Fer, Cuivre, Zinc et Manganèse

L'extraction des formes solubles de cuivre (Cu), de fer (Fe) de zinc (Zn) et de manganèse
(Mn) est effectuée dans une solution mixte, ajustée à pH 7,3 de triéthanolamine (TEA, de
chlorure de calcium (CaCb) d'acide diéthylènetriamine -pentaacétique (DTPA) et dans un

rapport prise d'essai/solution égal à 12 (MN).

Le dosage est réalisé par spectrophotométrie d'absorption atomique (Perkin Elmer

Analsts 100) : le fer à flamme (air /acétylène) à la longueur d'onde A = 248,3 nm; le cuivre à
flamme (air/acétylène) à la longueur d'onde A = 324,7 nm ; le zinc à flamme (air/acétylène) à la
longueur d'onde A = 2 13,9 nm. Le manganèse à la flamme (air/acétylène) à la longueur d'onde A
= 279,5 nm. Les micro-éléments sont exprimés en ppm.

IIIC.6 Méthodes de distillation-extraction

L'étude comparative des extractions a été effectuée avec des feuilles sèches
d'Artemisia annua du Cambodge sur des plantes aux trois différents stades de développement
décrits précédemment. Chaque manipulation a été préparée en deux exemplaires. L'analyse
qualitative a été réalisée par spectromètre de masse couplé à un chromatographe en phase
gazeuse (CPG/SM).

IIIC.6.1 L'hydrodistillation

L'échantillon a été préparé avec 30 grammes d 'artemisia, bourgeons, 50% de fleurs, et

1 00% de fleurs dans 200 mL d'eau en deux exemplaires. L 'hydrodistillation a suivi le même
protocole que celui décrit au (lIB.2.1) et précisé dans la partie « matériels et méthodes » sur
l'hibiscus.

IIIC.6.2 Conditions d'analyse de CPG/SM

Les chromatogrammes ont été obtenus sur un spectromètre de masse (MS) TRACE 2000
Finnigan, couplé à un chromatographe en phase vapeur (CPG), équipé d'une colonne RTX 5

Resteck, de paramètres 30m • 0,25 mm, 0,25 [lm. La composition de la phase stationnaire a
été de 5 % diphényle et 95 % diéthyl polysiloxane. Des identifications ont été menées.

149
 Chapitre IIIC3 Méthodes d'analyses

Paramètres utilisés :

• CPG/SM : TRACE 2000 Finnigan

• Colonne: RTX-5 Resteck 5 % diphényle et 95 % diéthyle polysiloxane
• Température initiale : 50 oC ( lmin)
• Température finale: 200 oC
• Gradient de température : 3 oC/minutes
• Délai : 5 minutes
• Injecteur mode splitless : 250 oC
• Gaz vecteur : 1 ,2 mL/minutes
• Mode d'ionisation : impact électronique (EI+)
• Tension du détecteur : 350 V
• Type d'acquisition : TIC

L'identification des composés a été réalisée sur la base de comparaison des spectres de
fragmentations obtenus avec ceux de la banque de données WILEY 275. Le spectre de
fragmentations correspond à une répartition des ions regroupés aux valeurs nominales entières
les plus proches de leur masses réelles et dont les intensités sont exprimées en % d'intensité
du pic le plus intense, appelé pic de base.

IIIC.6.2 Méthode des indices de rétention

Le terme d'indice de rétention est utilisé lorsque les analyses sont pratiquées avec une
programmation de température. L'appellation "indice de Kovats" est réservée à celles réalisées
en condition isotherme. Une fois les deux indices calculés, on les compare avec ceux détenus en
référence pour le même appareillage et dans des conditions opératoires identiques. On parvient
ainsi à présumer l'identification de composés préalablement identités dans d'autres produits.

L'indice de rétention est calculé selon la formule suivante :

IR = 1 00 .liL 1 00 .Z
TBill.:=IR..+
TR(z+ 1)- TR(z)
T R(i): temps de rétention du composé i.
T R(z) : temps de rétention de l'alcane z
T R(z+l ) : temps de rétention de l'alcane z+ 1
Z : nombre d'atomes de carbone de l'alcane z.

1 50
 Chapitre HIC3 Méthodes d'analyses

Figures 42: Chromatogramme d'alcanes (C9 à C lS)

27,02 34,99

22,72
95
1 8 ,29
90 -:
6, 1 1
38,55
85 c 30,99
9,66
80 -:
"
75

70 c

65 c

60 -:
1 3,79
55 -: 41 ,97

50 -:

45 c

40
"
35

30 -:

25 -:

20 -:

1 5 -:

1 0 -:

Q -:
5,1 8 41 122 16,7 1 9 48 25 5 21 8 33,5 3"5 70 40 8 42 7145 24 50 0852 03 55 02
Q 22 " '- _c 1 -'- -'-
Q 55
Time (min)

151
 CHAPITRE III

Résultats et discussion : Artemisia annua

1 52
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

IIID. Résultats et discussion sur Artemisia

IIID1.1 Cultivée au Cambodge

IIID1.1.1 Effets des modalités de culture sur la production d'artémisinine extraite des
fleurs

L'analyse de variance montre l'effet des 3 facteurs mis en œuvre lors de nos
expérimentions (date de récolte, site expérimental et stade physiologique) (tableau 29). Elle
révèle un effet hautement significatif du stade physiologique et du site expérimental et un
effet significatif de la date de récolte sur la teneur en artémisinine. Seule l'interaction "site"
par stade "physiologique" présente un effet significatif sur le pourcentage d'artémisinine.

Date de récolte Site Stade DR*S DR*SP S*SP DR*S*SP Résidus

physiologique
MS 0,0077 0,046 0,046 0,0001 9 0,0023 0,0079 0,00048 900, 1 8
p * *** *** NS NS * NS
• : slgnrficatIfpour p<O,005 ; " slgnrficatIf pour p<O,OI ; *** slgnrficatIf pour p<O,OOOI ; NS: non significatif ; MS :
Mean Square ; p: valeur de probabilité

Tableau 29: Effets de la date de récolte (DR), du site (S), du stade physiologique (SP) et de
leur interaction sur la teneur en artémisinine (%/matière sèche)

Site 1 Site 2
Date de
01102 01103 1 0/04 moyenne 01102 01103/ 1 0/04 moyenne
récolte
Bourgeon 0,85 a 0,83 a 0,82 a 0,83 a 0,86 a 0,85 a 0,85 a 0,85 a
50%
Stade 0,61 b 0,64 b 0,59 b 0,61 b 0,71 b 0,71 b 0,65 b 0,69 b
floraison
physiologique
1 00%
0,55 c 0,57 c 0,55 bc 0,56 c 0,58 c 0,60 c 0,57 c 0,58 c
floraison
moyenne 0,67 a 0,68 a 0,65 a , Ôj67 b. . 0,72 a 0,72 a 0,69 a 0,71a
Pour chaque Site, les valeurs moyennes possédant la même lettre ne sont pas différentes au seUIl de 0:=5%.
En gras, figurent, par site, les valeurs moyennes des valeurs obtenues pour les 3 dates de récolte (ligne) et les 3 stades
physiologiques (colonne).
En grisé, figurent les valeurs moyennes entre site quels que soient la date de récolte et le stade physiologique.

Tableau 30: Effets du stade physiologique et de la date de récolte par site expérimental sur la teneur en
artémisinine (%).

Le tableau 30 présente l'impact des facteurs «stade de développement physiologique»

(bourgeon, 50% floraison et 100% floraison) et de la date de récolte (févier, mars et avril
2004) par site expérimental et de leur interaction sur la teneur en artémisinine.

153
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Il apparaît que la moyenne du pourcentage d'artémisinine est significativement plus

élevée lorsque les plantes sont cultivées sur le site 2 par rapport au site 1 , quels que soient le
stade physiologique de prélèvement et la date de récolte.
Il existe un gradient dans la teneur en artémisinine en fonction de l'âge des fleurs
(stade physiologique), quels que soient le site de culture et la date de récolte. En effet, plus les
fleurs sont immatures, plus la teneur en artémisinine est importante (site 1 : 0,85 ; 0,69 et
0,58% ; site 2 : 0,83 ; 0,61 ; et 0,56% pour les bourgeons, 50% floraison et 1 00% floraison
respectivement). La teneur en artémisinine diminue avec l'apparition des fleurs. La date de
récolte de la matière végétale n'influence pas la teneur en artémisinine quels que soient le site
de culture et le stade physiologique.

IIID1.1.2 Effets des modalités de culture sur la production d'artémisinine

extraite des feuilles

Caractéristiques RP 2p 4p Ni S2
Plante/mL 1 2 4 1 1
Irrigation Oui Oui Oui Non Oui
Site 1 1 1 1 2
Fertilisation Oui Oui Oui Oui Non
Travail du sol Oui Oui Oui Oui Non
. .

(RP, 2p,4p,Nl, S2 : abrevlatlOns des modahtes de culture)

Tableau 3 1 : Rappel des Modalités de culture

L'analyse de variance montre un effet hautement significatif du nombre de jours entre

la transplantation et la récolte sur la teneur et le rendement en artémisinine; tandis que les
modalités de culture influencent uniquement le rendement en artémisinine (tableau 32).

Variable Modalités de Nombre de jours entre la MC *NJ Résidus

culture (MC) transplantation et la récolte (NJ)
Teneur en MS 0,0041 0,072 0,00083 0,34
artémisinine p NS *** NS
Rendement en MS 1 8,79 6 1 ,59 5,33 2,76
Artémisinine p *** *** ***
' : sigmficatlf pour p<O,005 ; " slgmficatlf pour p<O,OI ; ••• slgmficatlf pour p<O,OOOI ; NS: non slgmficatlf; M S :
Mean Square ; p: valeur de probabilité

Tableau 32: Effets des modalités de culture (MC) et du nombre de jours (NJ) entre la
transplantation et la récolte et de leur interaction sur la teneur (% de la matière sèche) et le
rendement (kglha) en artémisinine

1 54
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Teneur en
a) Nombre de jours entre la transplantation et la récolte
artémisinine
70 100 140 moyenne
RP 0,85 a 0,83 a 0,82 a 0,83 a
2P 0,77 b 0,72 b 0,76 b 0,64 b
Modalités de
4P 0,75 b 0,76 b 0,76 b 0,75 b
culture
NI 0,73 b 0,70 b 0,70 b 0,71 b
S2 0,87 a 0,86 a 0,85 a 0,86 a
moyenne 0,79 a 0,67 a 0,68 a

b)
Rendement en artémisinine
Nombre de jours entre la transplantation et la récolte
par surface foliaire
70 100 140 Moyenne
RP 0,77 g 1 ,36 f 2,31 d 1,48 d
2P 1 ,88 e 2,02 e 2,47. d 2,12 c
Modalités de culture 4P 2,26 d 2,60 c 3,36 b 2,74 b
NI 0,39 h 0,1 9 h 0,45 h 0,34 e
S2 2,68 c 5,90 b 7,33 a 5,30 a
moyenne 1,60 c 2,41 b 3,18 a
.
Les valeurs moyennes possedant la meme lettre ne sont pas dIfférentes au seUIl de (1-5 %

Tableau 33: Effets de la modalité de culture et du nombre de jours entre la transplantation et la récolte sur la teneur (% de
la matière sèche) (a) et le rendement (kg/ha) (b) en artémisinine.

La modalité S2 permet d'obtenir le rendement en artémisinine le plus élevé pour

toutes les durées entre la transplantation et la récolte (5,30 kg/ha). Plus la durée entre la
transplantation et la récolte est longue, plus le rendement en artémisinine est élevé (3, 1 8 ; 2,41
et 1 ,60 pour 140, 100 et 70 jours respectivement). Ce résultat peut s'expliquer par la biomasse
végétative dont le rendement est maximal dans le cas où les plantes sont récoltées 140 jours
après leur transplantation (30,8 ; 24,4 et 13,8 pour 140, 1 00 et 70 jours respectivement)
(Tableau 34).

Nombre de jours entre

la transplantation et la 70 100 140 Moyenne Ecart type
récolte

RP 9,85 b 17,9 c 2 1 ,7 b 16,48 6,05

Modalités 2p 1 3,5 b 1 5,3 b 18,1 b 15,63 2,32
de culture 4p 8,3 1 b 9,43 b 12,3 b 10,01 2,06
NI 3,62 c 2,87 d 6,64 c 4,38 2,00
S2 33,6 a 76,5 a 95,4 a 68,50 3 1,67
moyenne 13,8 c 24,4 b 30,8 a

Tableau 34: Effets de la modalité de culture et du nombre de jours entre la transplantation et la récolte sur la
biomasse (g/ plante) à différentes dates de récolte. Source : N. SavajoJ, Nornda RSI 1151

155
 Chapitre HID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

IIIDI. 2 Discussion

I. Modification de la teneur en artémisinine dans les plantes

1. Les teneurs en artémisinine varie selon l'âge des organes reproducteurs
Nos résultats montrent une teneur en artémisinine maximale dans les bourgeons. En
outre, cette teneur diminue avec l'âge de la fleur. Le moment de commencer la récolte est
donc essentiel à déterminer, le taux maximum d'artémisinine dépendant fortement du stade de
développement qu'a atteint la plante. Les auteurs ont remarqué un pic d'artémisinine,
cependant celui-ci peut apparaître, en pleine floraison[ 16, 17] ou juste avant la floraison[18.2ol .

Un facteur important à prendre en compte pour la culture d'artémisa annua est la

durée du jour. Artémisia annua est une plante de jour court, c'est à dire que sa floraison
débute lors de la diminution de la durée du jour. Selon les lignées et leur origine
géographique, ce caractère est variable car fixé et adapté à un environnement précis,

liJ Bourgeon III 50 % flo rais 0 n !il '100'10 floraison

1 ,0
• •
a a

0,9
0,8

��
0,7
� 0,6
:ï;
'" 0,5
�
t!
0,4
«
0,3
0,2
0,1
0,0
Site 1 Site 2 S ite 1 Site 2 Site 1 Site 2

févrie r mars avri l

Figure 43 - Effets des facteurs du site et du stade physiologique par date de récolte

156
 Chapitre IIIDI Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

La variation de durée de jour au cours d'une année diminue en s'approchant de

l'équateur et certains auteurs ont considère lié au photopériodisme[171 . Plusieurs
expérimentations ont démontré que la plante peut pousser sous des latitudes tropicales,
l'utilisation de lignées adaptées par sélection ou par hybridation permet l'obtention de teneurs
artémisinine importantes [21 1 .

D'après Laughlin[221 les variations entre le stade physiologique peuvent être attribuées
aux conditions climatiques, aux écotypes, aux pratiques culturales ou à une combinaison de
ces facteurs. Le moment ou apparaît ce pic étant essentiel afin d'obtenir une concentration
optimal en artémisinine, la détermination expérimentale de ce pic pour toute nouvelle aire de
production est plus pertinente que de se fier uniquement aux publications.

Panni les nombreuses caractéristiques pour lesquelles Artemisia annua présente une
important variabilité, la variation de teneur en artémisinine qui peut aller de 0,02 % à 1 ,38%
selon sa provenance et selon le stade sélection sur la plus forte (Cf. partie bibliographie
IIIA,5,1 0). Cette variation relevée dans la littérature a évidemment de multiples causes. Outre
l'utilisation de méthodes d'extraction et d'analyse très diverses, les conditions de collecte et
. de préparation des échantillons sont également très variables. A cet égard, le soin apporté à la
séparation des tiges et des feuilles est déterminant, puisque l'artémisinine est localisée
1
principalement dans ces dernières [2 1 .

Les expérimentations menées ont mIS en évidence une teneur en artémisinine

maximale, dans les bourgeons. D'après Laughlin[221 , la concentration en artémisinine
commence à augmenter deux semaines avant la floraison, et elle est maximale au début de la
floraison. Ce stade correspondant à la fin du stade de croissance végétative verticale. La
concentration en métabolites secondaires augmente lorsque la plante subit un stress, comme
présence temporaire de brouillard nocturne. Le stress peut être également hydrique[231 . Or le
développement des organes reproducteurs à la suite d'un stress est un phénomène
couramment observé qui permet d'augmenter leur chance de survie. Le rôle physiologique de
l'artémisinine reste difficile à déterminer et n'est que très peu abordé dans la littérature. On
peut toutefois supposer qu'une molécule active, telle que l'artémisinine, a un rôle dissuasif
auprès des prédateurs éventuels, et ainsi permet d'accroître les chances de survie lors de la
floraison. Cette hypothèse pourrait expliquer qu'il y ait une teneurs non négligeable en
artémisnine dans les fleurs et qu'elle soit maximale dans les organes reproducteurs les plus
fragiles comme les bourgeons.

1 57
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Donc pour obtenir des plantes avec une forte teneur en artémisinine, il est très
important de prendre en compte le stade de floraison. Il ne faut pas laisser passer le stade
bourgeons car par la suite la teneur en principe actif chute rapidement avec le développement
des fleurs et cette culture demandera donc un suivi régulier. Une technique pourrait être de
faire des passages réguliers (toutes les deux semaines) dans les plantations et de récolter les
plantes au fur et à mesure que les bourgeons apparaissent.

2. Les teneurs en artémisinine des fleurs varient selon le site expérimental

D'après Brandes et al [IOl , Artemisia annua est une plante colonisant les berges de
rivière ou de ruisseau. De ce fait, il n'est pas étonnant de voir que sur le site 2, situé sur une
île au sein d'une rivière, les plantes se sont beaucoup mieux développées. Non seulement la
fertilité et l'humidité du sol a du jouer mais également sa structure et sa texture, plus de sable
et de limons, donc un sol plus aéré. La disponibilité en eau est un facteur important de la
culture d'Artemisia annua, la modalité non irriguée présente une teneur en artémisinine faible
et attesté donc, la d'une meilleure production en artémisinine des plantes cultivée avec
irrigation durant cette période de l'année. De plus les 2 premiers mois de culture, phase
d'élevage du plant, nécessitent un arrosage régulier. Les 2 sites de l'étude se situent près d'un
point d'eau permettant leur irrigation, ce qui n'est pas le cas du miir champ non irriguée situé
en pleine forêt[ll .

3. Le décalage de la date de récolte ne modifie pas les teneurs en artémisinine des

fleurs

Comme il est évoqué dans la partie bibliographique, la durée pendant laquelle la plante
fleurit peut être très variable. Ainsi entre l'élongation du rameau florifère et la maturation des
akènes, il peut se passer de 1 à 5 mois [21 1 . S'il y a bien une action de la durée du jour sur le
déclenchement de la floraison, il peut être intéressant de voir s'il ne faudrait pas démarrer la
culture d'Artemisia annUQ plus tôt dans l'année afin de lui allouer plus de temps pour se
développer, la récolte se ferait en décembre et ainsi obtenir une production supérieure. De
plus cette période de culture correspond à celle utilisée par les Phnongs, qui cultivent leur
champ en saison des pluies pour récolter le riz en début de saison sèche.
Dans notre essai, la mortalité dans la modalité non irriguée démontre qu'Artemisia
annua ne peut être cultivée sans irrigation à la période que nous avons testée, cependant il
serait intéressant d'essayer la culture avec irrigation réduite durant une saison plus humide.

158
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

1
II. Modifications de rendement en artémisinine

1. Le choix· du site et la densité de peuplement influencent la teneur et le

rendement en artémisinine des feuilles

En ce qui concerne le rendement, en artémisinine des feuilles il apparaît qu'il est plus
élevé sur le site 2 par rapport au site 1 et selon la densité de peuplement et l'apport
d'irrigation. Ces résultats sont liés au développement maximum des feuilles : dans ces
conditions le développement foliaire est optimal.
Ces résultats sont expliqués par le fait que le site principal de culture (sitel), avec
quatre modalités de culture (RP, 2P, 4P, et NI), est situé sur le plateau, un type de terrain qui
n'est pas cultivé par les autochtones, en raison de la compaction, la latérisation et donc la
faible fertilité des sol[ 15J . Malgré l'amélioration de la texture et structure du sol et
l'incorporation d'engrais vert qui a permis à la plante de se développer correctement, les
résultats restent très en deçà de ceux obtenus sur le S2 (site 2), qui est situé sur les dômes. Les
analyses de sol confirment que le S2 est plus fertile, en particulier en termes de teneurs en
éléments minéraux. La culture de la plante sur les dômes herbeux mondolkirien reste possible
mais serait coûteuse en travail et intrants si on souhaite améliorer les rendements. Non
seulement le travail du sol semble indispensable, mais en plus une fertilisation, au moins
azotée, en est indissociable afin d'obtenir des rendements en feuilles suffisants. Ceci peut
s'expliquer par le rendement en feuilles qui est plus élevé dans le cas où la densité est la plus
élevée.
Une solution alternative, mais également coûteuse en travail, serait l'augmentation de
la densité. On a bien vu que pour le site 1 , même à partir de 4 plantes /m2, l'effet de la densité
sur la biomasse produite reste faible. Ainsi, il pourrait être intéressant sur un site comme
celui-là de planter à de fortes densités, plus de 20 plantes/m2, pour envisager une
augmentation du rendement en feuilles à l'hectare[25J .
Sur un site plus fertile, comme le site 2, les plantes se développent mieux, notamment
les axes secondaires qui donnent un port plus buissonnant.(Cf. figure 44), et pourrait
expliquer l'augmentation de biomasse végétative observée.

1 Il est important de rappeler que le rendement intègre la production en biomasse et la teneur en artémisinine.

159
 Chapitre IIID I Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Figures 44 - Site 2 pendant la récolte

2. Le temps entre la transplantation et la récolte modifie le rendement en

artémisinine des feuilles.

La production de biomasse feuilles varie selon les divers facteurs étudiés (période de
semis, humidité, durée de la culture). Il semble que la durée de la culture d'A. annua n'a pas
été assez longue pour obtenir un développement maximum de la plante, 70 à 140 jours entre
le repiquage au champ et la récolte. Ainsi les rendements en feuilles obtenues sont faibles par
rapport à ceux obtenus dans d'autres essais en zone tropicale et peuvent être corrélés aux
rendements en artémisinine. Il faut donc nuancer ces résultats car l'essai a été réalisé sans
utilisation de techniques modernes, avec un budget faible et a peut-être engendré une durée de
culture trop courte. Cette réduction du rendement en feuilles peut expliquer que le maximum
du potentiel de production d'artémisinine ne soit pas exprimé, et donc que le rendement en
artémisinine soit plus faible[28l .
De plus, allonger la durée de la culture permettrait de réaliser plusieurs récoltes dans
un cycle de culture. En effet d'après Kumara[26l , artemisia annua peut être récoltée une
première fois en laissant le pied, qui repartira et donnera une nouvelle récolte, on arriverait
ainsi à 4 récoltes au cours d'un cycle de culture ce qui permettrait d'obtenir des rendements 3
à 4 fois supérieurs. De plus on a vu que la quantité maximum d'artémisinine est atteinte
lorsque la plante est en bourgeon et qu'elle se situe dans les feuilles, on récoltera donc ici au
moment ou le taux d'artémisinine est le plus haut.
Il apparaît à la lecture des résultats que les différentes dates de mise en culture
n'étaient pas assez éloignées pour trouver de différences importantes. On note toute fois pour
la seconde date de culture que, la croissance de la plante était supérieure à toutes les autres, ce
qui pourrait montrer que la culture de la plante est plus favorable en début d'année.

1 60
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

IIID1 . 2 Composés volatiles d'Artemesia annua extraits par l'hydrodistillation

L 'hydrodistillation est réalisée sur la plante d'Artemesia annua (en bourgeons, à

l'apparition des fleurs environ 50% de fleurs matures et en pleine floraison 100% de fleurs
matures). Les conditions opératoires sont décrites dans la partie expérimentale (IIIC.6).
L'analyse qualitative a été réalisée par spectromètre de masse couplé à un chromatographe en
phase gazeuse (CPG/SM). L'identification des constituants a été faite sur la base de la
comparaison de leurs indices de rétention et spectre de masse avec ceux des composés de
référence de la littérature et figurant dans la banque de données.

Stade de Huile essentielle Rendement

développement ' [%]'
[g]

Bourgeon 0,21 0,42 ± 0,02

Début
floraison 0,3 1 0,61 ± 0,03

Floraison 0,52 1,0 ± 0,01

t
moyenne de 3 essais
Tableau 35 : Résultats quantitatifs de l'extraction de l'huile essentielle de l 'Artemisia annua
(site-2) du Cambodge.
Les résultats des extractions par la technique d'hydrodistillation ont montré des
variations des différents rendements en huile essentielle en fonction du stade de
développement des plantes. L'huile essentielle obtenue est visqueuse et possède une couleur
jaune clair avec une odeur très agréable. Les rendements en huile essentielle (Tableau 35)
montrent 0,42 % pour le bourgeon, 0,61 % pour le début de floraison et 1 ,0 % pour la
floraison. Le rendement en huile essentielle d' Artemisia annua varie considérablement selon
le stade de développement de la plante. On constate que le meilleur rendement est obtenu en
floraison (+30 % par rapport au bourgeon et +58 % par rapport à la fleur immature. Le
potentiel et la composition de l'essence dépendent de la maturité de l'organe. Cette
constations tout à fait classique en pharmacognosie, peut s'expliquer par de multiples
facteurs. Ceux-ci sont principalement le stade auquel la plante a été récoltée, associé
probablement au génotype et à l'environnement,
[221
dans lequel elle a poussé .

161
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Constituants T.R. I.R. b Bonrgeons Début floraison Floraison

Monoterpenes

a-Pinène 7,56 939 2,5 0,1 1 ,3

Camphène 8,30 954 6, 1 0,3 3,6
�-Pinène 9,57 978 0,3 0,1 0,3
Myrcène 9,50 992 0,6 3,5 3,1
a-Terpinène 10,20 1 01 7 tr tr tr
p-Cymène 1 1 ,39 1 026 1,0 1,6 1,7
Cinéole-I -8 1 1 ,20 1030 9,2 10,5 15,0

Artémisia Ketone 1 2,55 1062 tr tr tr

Limonène 1 4, 1 0 1029 nd tr tr
Camphre 1 6,40 1 146 51,8 52,3 51,4

Bornéol 17,57 1 1 69 0,2 1,2 0,6

Sesquiterpenes

a-Terpineol 1 8,58 1 1 89 tr 1,0 0,4

Verbenone 2 1 ,53 1205 tr nd 0,1
a-cubebène 23,41 1351 0,1 tr 0, 1
Copaène 26,38 1 377 0,3 2,0 2,1
Caryophyllène 28,29 1408 3,4 3,5 3,2
Farnesène 29,27 1443 4,3 12,6 6,4

Humulène 29,55 1448 1,6 1,5 1,3

Germacrène-D 30,02 1485 13,5 5,7 5,1

a-Cadinène 3 1 ,04 1539 0,2 0,1 0,2

Spathulenol 34,50 1 575 2,5 2,0 3,0
Caryophyllène oxide 36,30 1578 1.5 1 ,7 1 ,2
Globulol 37,45 1 585 0,1 0,18 0,2
Hydrocarbures monoterpénes 10,5 5,6 1 0,0
Monoterpènes oxygénés 6 1 ,0 62,8 66,4
Hydrocarbures Sesquiterpènes 27,5 30,3 22,9
Total 99,0 98,7 99,3

, identification réalisée à partir des indices de rétention, des bibliothèque (NIST, Agilent, France) et de la
littérature
b indice de rétention calculé à partir des alcanes.
Nd: non détecté
tr : traces « 0.1 %).

Tableau : 36 Composition chimique (%) de l'huile essentielle de l'Artémisia annua

162
 Chapitre HID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

Le tableau. 36 donne la composition chimique des huiles essentielles recueillies par

hydrodistillation. Elles sont principalement constituées d'hydrocarbures monoterpéniques,
monoterpènes oxygénés et sesquiterpènes oxygénés. Les compositions chimiques obtenue sont

pratiquement identiques, seules les abondances de certains composés varient. Les signaux des
chromatogrammes des huiles essentielles nous ont permis d'identifier 22 composés.
Globalement, nous constatons que la très grande majorité des composés sont le camphre, le
Cinéole-I -8, le germacrène-D, et le famesène quel que soit le stade de maturité des fleurs.
Toutefois, ces 4 composés présent des différence vis-à-vis du stade de développement de la
fleur. En effet, le camphre (tr : 1 6,41) représente environ 50 % de l'huile essentielle et ne
varie que très peu en fonction du stade de maturité.
En revanche, on observe un maximum pour le 1 , 8 cinéole (tr : 1 1,39) en fin de
floraison (15 %) alors que le pourcentage de famesène (tr : 29,3 1) est maximal au début de la
floraison (12,6) et le germacrène (tr : 3 1 ,03) au niveau des bourgeon (13,5 %).

16,41
100
Bourgeon
80

60

40
8,30 1 1 ,39
20 , 37 ,00
3506
7 ,51L 3
5, <3_ 18,1 0 22,30 25,2.9 26" _3.7 ,9 AQ,39 44,35 47 ,0? �,2 51.2555,0
0
1 6,43
100
Début floraisou
80

60

40 1 1 ,40
9,59
20 1 8,1 5
1 12>75 44, 1 1 46,59
5,3_4],5.8Jl,30 5 .. 18,58 24, 53 26,42
. A9.,37 51, 5!:;,01
0 . .

16,40
100-
Floraison
80- .

60, 1 1 ,39

40

20 8,1 4 9,57

0
5,2.1
1 1
7 ,5
1
il- l l ] : 12,55
1
.

1
,
1 1 ' I ) J I I I 1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Time (min)

Figure 45 : Chromatogramme d'huile essentielle d'Artemisia annua

163
 Chapitre IIID 1 Résultats et discussion Artemisia annua- Cambodge

IIID1 . 3 Conclusions

Afin d'obtenir des plantes avec une teneur en artémisinine optimale, notre étude
montre qu'il est important de prendre en compte le stade de floraison. Le « bourgeon »
accumule le maximum d'artémisinine : en effet, la teneur en principe actif chute rapidement
avec le développement des fleurs. Une technique pourrait être de faire des passages réguliers
(toutes les deux semaines) dans les plantations et de récolter les plantes au fur et à mesure que
les bourgeons apparaissent.
Le site a aussi un effet significatif sur la biomasse et le choix de site fertile pour mettre en
place des cultures d'Artemisia annua est donc primordial. Faire appel à des fertilisations n'est
pas envisageable du fait de leur prix et des problèmes que cela pose dans la mise en culture de
plantes médicinales.
Artemisia annua est également la source d'huile essentielle qui se trouve dans les
feuilles et les fleurs. L'huile essentielle extraite d'Artemisia annua à atteint un maximum au
stade plane floraison. L'étude en composés volatils de l'huile essentielle a également révélé la
présence de 'maximum variant selon le stade de maturité comme dans le cas du camphre,
germacrène et 1-8, cinéole dont la concentration est optimale dans les bourgeons et floraison.
Avec l'intérêt croissant pour Artemisia pour la production de médicaments antipaludéens, le
volume potentiel d'huile essentielle disponible est intéressant pour l'industriel parfumerie ou
des industries chimiques en général.
L'essai de mise en culture d'artemisia annua au Mondolkiri a permis de montrer que
la plante peut être cultivée dans cette région, avec un rendement et une teneur en artémisinine
suffisants. Le résultat le plus significatif est l'importance de l'humidité du sol pour le bon
développement de la plante, en l'absence d'un système d'irrigation la parcelle de culture
devra être située sur une zone relativement humide (82 par rapport à 8 1 ) .

164
Résultats et discussion sur Artemisia annua
Cultivée a u Sénégal

165
 Résultats et discussion sur Artemisia cultivée au Sénégal

IIID2. Cultivée au Sénégal

IIID2. 1.1 Date de récolte et nombre de jours entre la trausplantation et la récolte

A Chaque date de récolte espacée de 1 5 jours les plantes ont été récoltées afin d'être mesurées
et pesées. Les analyses de la teneur en artémisinine ont été réalisées par CCM densitomètre
sur le matériel sec. La figure 46 montre que la hauteur des plantes augmente jusqu'à 105 jours
après le repiquage

300 a

250

]: 200

150

j 100

50

20 40 60 80 100 120
o +-----�----�--�
o
Nombre de jours entre la récolte et la transplantation

Figure 46: Hauteur de plantes nombre de jours entre la transplantation et la récolte

Les valeurs moyennes possédant la même lettre ne sont pas différentes au seuil de (X=5 %

La teneur en artémisinine est caractérisée par une augmentation régulière en début de culture
entre 1 5 (juillet) et 75 jours de culture (septembre). Le taux maximum d'artémisinine,
(0.56%), est donc obtenu 75 jours après la transplantation au champ au mois de septembre.
Puis se stabilise dés lors que la plante entre en floraison, 2 mois et demi après le repiquage
(figure 47)
0.7

0.6
i
g..
a a

�
'c
••
0.5
,
b __ v! 1
.� DA
ro
t--
"

c
•
0.3
§
�
0.2
a 20 40 60 80 100 120

Nombre de jours entre la récolte e t l a transplantation

Figures 47 : Evolution de la teneur en artémisinine (%/ à la matière sèche) en fonction du

nombre de jours et la transplantation
Les valeurs moyennes possédant la même lettre ne sont pas différentes au seuil de (X=5 %

166
 Résultats et discussion sur Artemisia cultivée au Sénégal

La figure 48 montre que la masse de feuille récoltée diminue entre 75 et 105 jours. Cette
période (75) correspond également au pic de teneur en artémisinine (figure 47), la
concentration diminuant ensuite sensiblement. C'est également à cette période que les fleurs
apparaissent induisant un assèchement des feuilles du à l'investissement de la plante dans la
floraison. Le pic en artémisinine correspond bien à l'apparition de bourgeon (comme observé
au (Cambodge). Cette période correspond à l'installation de la saison sèche au Sénégal, il
semble donc que le stress hydrique est induit une floraison suivi d'un flétrissement du
feuillage.

80

70
2"
'"
c
60
C.
a
S 50
'"
()
.J::

.'"
40

'"
If)

If)
30
'"
If)

20
0
E
ii5
10

0
0 20 40 60 80 1 00 1 20

Nombre de jours entre la récolte et la transplantation

Figure 48 : Biomasse des feuilles sèches (g/plante)

Les valeurs moyennes possédant la même lettre ne sont pas différentes au seuil de a=5 %

1 67
 Résultats et discussion sur Artemisia cultivée au Sénégal

IIID2. 1.2 Conclusion

Les résultats de cette étude, même si celle ci reste modeste scientifiquement comparé au
protocole expérimental mis en place au Cambodge, permettent de confirmer les
caractéristiques culturales de la plante. La période de récolte optimale, associant une teneur en
artémisinine forte et une biomasse importante, est courte (autour de 75 jours de culture au
Sénégal). Elle correspond à la période d'apparition des bourgeons. Il est important de noter la
sensibilité de la plante à la sécheresse, cette donnée étant particulièrement importante en
Afrique sahélienne. Les teneurs en artémisinine obtenues au Sénégal sont plus faibles que
celles du Cambodge. Ceci peut être lié à divers facteurs tels que le climat ou le respect du
protocole de récolte et de séchage, ces facteurs n'ont pas pu être identifié dans le cadre de
cette étude étant donnée les différences de conditions expérimentales. Entre autres les
difficultés de gestion (matérielles et humaines) étaient plus fortes au Sénégal qu'au
Cambodge (ou Nomad dispose d'une équipe permanente).

1 68
 Références bibliographique

Références bibliographiques

[1]. USDA-SCS, (United states departement of agriculture soil conservation services)., 1 974.
Definiation and abbreviation for soil description. West Technical Services Centre, Portland,
OR.

[2]. JONES, R.J.A., SPOOR, G., THOMASSON, A.J.,. 2003. Vulnerability of subsoils in
europe to compaction: a preliminary analysis. Soil. Tillage. Res. 73, 1 3 1- 1 43 .

[3] . SCHOENEBERGER, P.J., WYSOCKI, D.A., BENHAM, E.C, 1 998. Field book for
describing and sampling soils. Natural resources conservation services, USDA, National Soil
Survey Center, Lincoln, NE USA.

[4]. FARHURST, T.H., LEFROY, R.D .. B., MUTERT, E.W., et al. 1 998. Soil fertility
recapitatlization in acid upland soils in Southeast Asia: the exmaple of Indonesia. In:
Procedings of the 1 6th World Congress ofSoil Science, Montpeller, France.

[5] RAWLS, W.J., PACHEPSKY, Y.A., RITCHE, lC., 2003. Effect of soil organic carbon
on soil water retentation. GEODERMA., 1 1 6, 61-76.

[6]. BREMNER, lM., MULVANEY, C.S 1982. Nitrogen total: methods of soil analysis part
[Link] and microbiological properties. Agrononmy, Vol 9, 2"d Edition. American Soc.
Agronomy, Madison, WI, USA, pp. 595-64 1 .

[7]. SOLTNER, D., 1996. Les bases de la production végétale. Tome 1 Le sol et son
amélioration. 21 e édition, Collection Sci. Tech. Agr., 463 pages.

[8] . McGRATH, S.P., CUNLIFFE, C.H., 1985. A simplified method for the extraction of the
metals Fe, Zn, Ni, Pb, Cr, Co, and Mn from soils and sewage sludges. l Sc. Food. Agr. 36,
794-798.
[9].MARSCHNER, H., 1 995. Mineral nutrition of higher plants. Second Edition, Academic
Press Inc, 889 pages.
[ 1 0] . DUCHAUFOUR, PH., 1991. Pédologie sol, végétation, environnement. Edition Mosson
3 ém édition. 289

[ I l ] MARQUET, I., 2003. Accessibilité aux antipaludiques au Sénégal effets de

l'introduction de l'association Artesunate/Amodiaquine. Mémoire de DESS de Santé
Publique, Université d'Orsay-ParisXI.

[12]. SOKHNA C., MOLEZ JF., NDIAYE P. et coll. Test in vivo de chimiosensibilité de
plasmodium falciparum à la chloroquine au Sénégal : évolution de la résistance et estimation
de l 'efficacité thérapeutique. Bull. Soc. Pathologie exotique 1 997 ; 80(2) : 83-89.

[ 1 3 ] . AGNAMEY P., BRASSEUR P., CISSE M. et coll. Amodiaquine-artesunate versus

amodiaquine for uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in African children ; a
randomised, multicentre trial. The Lancet 2002 ; 359 : 1 365- 1 3 7 1 .

1 69
 Références bibliographique

[14]. FAYE O., LO M., GAYE O. et coll. Connaissances et circuits thérapeutiques relatifs au
paludisme en zone rurale Sénégalaise. Médecine tropicale 1997 ; 57 : 1 6 1 -164

[1 5].SAVAJOL, N., 2004. Expérimentation sur un antipaludique, l 'Artemisia annua, au

Cambodge. Mémoire de fin d'études. Nomad RSI, Toulouse.

[16]. SINGH, A, VISHWAKARMA, R.A., et HUSAN, A., 1988. Evaluation of Artemisia

annua strain for higher artemisinin producation. Planta medica. 7, 475-476.

[17]. FERREIRA, J.F.S., 1995. Floral morphology of Artemisia annua with special reference to
trichomes. Int. J. Plant Sei., 1 56, 807-8 15.

[18]. ACTION, N., KLAYMAN, D.L., 1985. Artemisinin a new sesquiterpene lactone
endoperoxyed from Artemisa annua. Planta Medica. 5 1 , 441-442.

[19] .WOERDENBAG, H.J, 1994. Artemisinin related sesquiterpenes and essential oils in
Artemisia annua during a vegetation period in Vietnam. Planta Med., 60, 272-275 .

[20]. LIERS CH, R., SOICKE, H., STERH, et TULLNER, H., 1986. Formation of artemisinin
in Artemisia annua during one generation period. Planta Med. 7, 387-390.

[21 ] . DELABAYS, N., 1 997. Biologie de la reproduction chez Artemisia annua L. et

génétique de la production en artemisinine. Contribution à la domestication et à l'amélioration
génétique de l'espèce. Thèse de Doctorat. Université de Lausanne.

[22]. LAUGHLIN, J.C., HEARLEWOOD, G.N., BEATTEAIE, B.M., 2002. Cultivation of

Artemisia annua. pp. 1 59-1 95. In, Wright CW (Ed.), Artemisia. Taylor and Francis, Londres.

[23].WALLART, T.E., PRAS, N., BEECKMAN, A.C., et QUAX, W.J., 2000. Seasonal
variation of Artemisinin precursors in plants of Artemisia annua of different geographical
origin : proof for the existence of chemotypes. Planta medica, 66, 57-62.

[24] . BRANDES,D., MÜLLER, M., 2001 . 44th lAVS Symposium : vegetation and ecosystem
functions Artemisia annua accessful invading species. Freising-Weihenstephan: Technical
University Braunschweig, 2 1 p.

[25]. LAUGHLIN, le., 1 993. Effect of agronomic practices on plant yield and antimalarial
constituents of Artemisia annua L. Acta Hort, 33, 53-6 1 .

[26]. KUMARA, S . 2004. High yields of Artemisinin- a review. Royal. Soc. Trop. Med. Hyg.
88, suppl. 1, p.21-22.

[ 2 7 ] MUELLER, M.S., RUNYAMBO, N., WAGNER, 1.,

BORRMANN, S., DIETZ, K.,
HEIDE, L., 2004. Randomized controlled trial of a traditional preparation of Artemisia annua
L. (Annual Wormwood) in the treatment of malaria. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 98, 3 1 8-
321.

[28].WILLCOX, M . , BODEKER, G., BOURDY, G., DHINGRA, V., FALGUET l ,

FERREIRA, J.F.S., GRAZ B., HIRT, H-M., HSU, E., DE MAGALHAES, P,
PROVENDIER, D., and WRIGHT, C.W., (2004), Artemisia annua as a traditional herbaI

1 70
 Références bibliographigue

antimalarial In: Traditional medicinal plants and malaria, Merlin L Wilcox, G. Bodeker and
P. Rasaoanaivo (eds.) Boca Raton, CRC Press

[29]. SCHOENEBERGER, P.J., WYSOCKI, DA, BENHAM, E.C, 1998. Field book for
describing and sampling soils. Natural resources conservation services, USDA, National Soil
Survey Center, Lincoln, NE USA.

[30]. FARHURST, T.H., LEFROY, R.D .. B., MUTERT, E.W., et al. 1 998. Soil fertility
recapitatlization in acid upland soils in Southeast Asia: the exmaple of Indonesia. In:
Procedings ofthe 1 61h World Congress of Soil Science, Montpeller, France.

[3 1] RAWLS, W.J., PACHEPSKY, Y.A., RITCHE, J.C., 2003. Effect of soil organic carbon
on soil water retentation. GEODERMA., 1 16, 61-76.

[32]. BREMNER, J.M., MULVANEY, C.S 1 982. Nitrogen total: methods of soil analysis
part [Link] and microbiological properties. Agrononmy, Vol 9, 2"d Edition. American
Soc. Agronomy, Madison, WI, USA, pp. 595-64 1 .

[33]. SOLTNER, D., 1 996. Les bases de l a production végétale. Tome 1 Le sol et son
amélioration. 2 1 e édition, Collection Sci. Tech. Agr., 463 pages.

[34]. McGRATH, S.P., CUNLIFFE, C.H., 1985. A simplified method for the extraction of the
metals Fe, Zn, Ni, Pb, Cr, Co, and Mn from soils and sewage sludges. J. Sc. Food. Agr. 36,
794-798.
[35].MARSCHNER, H., 1 995. Mineral nutrition of higher plants. Second Edition, Academic
Press Inc, 889 pages.
[36]. DUCHAUFOUR, PH., 1 9 9 1 . Pédologie sol, végétation, environnement. Edition Mosson
3 ém édition. 289 Pages.

171
Conclusion générale et perspectives

1 72
 Conclusion Générale et Perspective

Conclusion Générale et Perspectives

Mon travail de thèse avait pour objectif d'étudie les méthodes et les conditions d'extraction
des composés d'intérêt pour des pays en voie de développement extraits à partir de l'Hibiscus
sabdariffa .
Dans une première partie, l'étude menée sur Hibiscus pennis de mettre en évidence
l'influence des conditions opératoires de différentes techniques d'extraction, a partir de calice
(huile essentielle, et concrète) et à partir de graines (huile végétale).
Nous avons pu détenniner les caractéristiques et la composition chimique des fractions
aromatiques extraites des calices et des graines d'Hibiscus en vue de leur valorisation
industrielle.
Le choix des méthodes d'extraction et analytiques pour détermination de la composition des
huiles des graines,a été effectué sur la plate-fonne lipochimique (UMRA INRJENSIACET).
L'analyse des composés aromatiques des calices d'hibiscus a été réalisée à l'ENFA Ecole
Nationale de Fonnation Agronomique (Toulouse)

Dans un premier temps, les huiles essentielles et les concrètes extraites de calices d'Hibiscus
sabdariffa provenant de 3 pays différents (Mexique, Sénégal, Vietnam) ont été comparées
pour la composition chimique et le rendement d'extraction. Il apparaît que l'origine des
calices n'influence pas la composition chimique alors que le rendement d'extraction varie : il
est plus élevé lorsque les calices proviennent du Vietnam par rapport au Mexique et enfin au
Sénégal. Puis, 4 techniques d'extraction différentes des concrètes ont également été
comparées, ainsi que l'utilisation de 2 solvants différents dans le but d'optimiser le rendement
d'extraction. Les résultats nous ont pennis de quantifier l'influence du rapport pondéral
matière végétale/solvant et de la durée d'extraction sur le rendement. Quelle que soit la
technique d'extraction, l'efficacité du dichlorométhane est largement supérieure à celle de
l'hexane.
L'analyse qualitative de l'huile des graines d'Hibiscus que le pourcentages d'acides gras et les
teneurs en stérols sont tout à fait remarquables et qu'elle peut se positionner comme nouvelle
source d'huile végétale pour l'alimentation. C'est un champ d'application intéressant
pennettant de valoriser l'Hibiscus sabdariffa du Vietnam, du Sénégal et du Mexique. Après
séparation des acides gras saturés (acide palmitique + acide stéarique) et des acides gras in
saturés (acide linoléique + acide oléique). La diversité des acides gras dans l'alimentation

1 73
 Conclusion Générale et Perspective

humaine et leur apport en quantités appropriées et équilibrées étant nécessaire pour la

prévention d'un grand nombre de maladies liées à la sous alimentation des pays en voie de
développement. La richesse, en acide linoléique et oléique, de l'huile des graines d'hibiscus
s'avère être une bonne matière première pour la consommation après raffinage dans les pays à
vocation agricole.

En s'appuyant sur des données bibliographiques nos résultats ont montré que 1 'hibiscus
sabdariffa possède également de sérieux atouts pour d'autre utilisations alimentaires comme
la génération des nouvelles boissons, entant que colorants, de plus en plus utilisés en
alimentation.

Enfin un bilan de nos investigations sur la constitution chimique très complexe de cette huile
essentielle ou absolue a été exposé, en particulier pour les composés les plus volatils.
En conclusion, ce travail a permis d'obtenir une idée de la composition chimique générale de
l 'Hibiscus sabdariffa qui pourra servir de point de départ pour les futurs travaux de
recherches dans la perspective d'une valorisation de cette espèce végétale.
Nous proposons de complètes les données acquises par les orientations suivantes:

• Amélioration du rendements en huile essentielle, grâce aux données concernant la

production durant la période récolte (cueillette, séchage . . . ),

• Etude de la stabilité et des propriétés des colorants anthocyanes présentes dans les de
calices d'Hibiscus sabdariffa,.
• Etude de la tige d' Hibiscus sabdariffa pour définir leurs propriétés des fibres surtout la
cellulose,
• Prospection pour la valorisation des acides gras, par exemple : acide palmitique
(plastifiants détergents, lubrifiants) acide linoléique (peintures, résines) contenues
dans les graines d'Hibiscus.
• Proposition de nouvelles formulations aromatiques pour de nouvelles boissons à partir
des calices d'Hibiscus,
• Implantation locale d'unités de productions industrielles de ces boissons.

174
 Conclusion Générale et Perspective

Une seconde plante a fait l'objet d'une partie de mon travail de thèse et participe également à
la phase préliminaire qui permettra de déterminer le potentiel réel d'Artemisia annua au
Cambodge et au Sénégal comme plante antipaludique.
L'essai de mise en culture d'artémisia annua au Mondolkiri (Cambodge) a permis de montrer
que la plante peut être cultivée dans cette région, avec un rendement et une teneur en
artémisinine suffisants. Le résultat le plus significatif est l'importance de l'humidité du sol
pour le bon développement de la plante, en l'absence d'un système d'irrigation la parcelle de
culture devra être située sur une zone relativement humide.
Ce travail a également permis d'amorcer une réflexion sur l'itinéraire technique (densité,
dates de mise en culture, irrigation, . . . .) , mais celui-ci dépendra du système de culture qui
devra être mis en place (plantation ou micro culture locale).
D'un point de vue agricole, Artemisia annua semble pouvoir s'intégrer au Cambodge, il serait
intéressant de comparer les rendements dans des régions de plaines. L'utilisation de bouture
peut aussi être une perspective intéressante favorisant une multiplication rapide et peu
coûteuse par rapport aux graines hybrides. Cependant les premiers essais en cours montrent
une initiation rapide de la floraison qui risque de limiter les rendements.
L'introduction d'une plante et sa domestication reste un processus long. Ce projet a permis de
réunir les compétences de plusieurs organismes universitaires autour d'un objectif commun:
trouver un traitement accessible contre le paludisme.
Cette démarche et ces expérimentations innovantes au Cambodge ont atteint leur objectif en
permettant de prouver la faisabilité de la culture. Les rendements en artémisinine, même
s'ils n'atteignent pas ceux obtenus dans d'autres régions tropicales, sont encourageants pour un
premier essai. L'utilisation de ces résultats et la poursuite du travail pourraient permettre au
Cambodge d'intégrer Artemisia annua dans son système agricole. La gestion de ces cultures
demandera une attention particulière pour être intégrée aux différents systèmes traditionnels.
Mais la possibilité d'utiliser Artemisia annua en association avec d'autres cultures est une
option à explorer.
La production de matériel végétal ne résout cependant pas la question de sa
commercialisation et de sa transformation. La transformation par un laboratoire cambodgien
(université de pharmacie) pourrait être une solution permettant une production de médicament
peu coûteux. Etant donné la législation cambodgienne, l'utilisation d'infusion de feuilles
d'Artemisia annua ne pourra être prescrite qu'après des essais épidémiologiques rigoureux.
Même si des travaux montrent l'intérêt de ce mode de prescription[27,281 , d'autres essais
soulèvent la polémique vis-à-vis de cette méthode et conseillent l'utilisation d'association

175
 Conclusion Générale et Perspective

artemisinine-mefloquinine pour limiter les risques de recrudescence de crises. Il serait

certainement intéressant de porter des recherches sur l'association d'Artemisia annua et
d'autres plantes antipaludéennes en tisane suivant les formules traditionnelles chinoises.
Les teneurs en artémisinine obtenues au Sénégal sont plus faibles que celles du Cambodge.
Ceci peut être lié à divers facteurs tels que le climat ou le respect du protocole de récolte et de
séchage, ces facteurs n'ont pas pu être identifiés dans le cadre de cette étude étant données les
différences de conditions expérimentales. Entre autres les difficultés de gestion (matérielles et
humaines) étaient plus fortes au Sénégal qu'au Cambodge (ou Nomad dispose d'une équipe
permanente).

A l' issu de cette étude, les résultats montrent que la culture en Artemisia annua peut être
envisagée en zones tropicales, cette culture demande cependant une technicité relativement
importante, même si le marché d'Artemisia annua semble lucratif et pourrait permettre de
développer des médicaments produits localement, des itinéraires techniques agronomiques
rigoureux doivent être suivis et la mise en culture d'Artemisia annua pour être durable
demande une attention particulière au transfert technique. Dans ce sens les collaborations avec
les universités Cambodgienne et Sénégalaise se sont révélées particulièrement appropriées
permettant de créer une dynamique d'échanges scientifiques entre pays du Sud à partir d'une
équipe toulousaine rassemblant laboratoire universitaire et ONG.

176
ANNEXES

1 77
 Annexes

témoins d'arlémisinine (1 glL MeOH) analysés 3 fois chacun

1
3
Std Std 2 Std 3
(ppm) Aire (ppm) Aire (ppm) Aire
0,01 1 ,46E+02 0,01 1 , 1 3E+02 0,01 9,55E+01
0,025 3,71 E+02 0,025 2,65E+02 0,025 3,77E+02
0,05 1 ,03E+03 0,05 1 ,08E+03 0,05 4,66E+02
0,1 2,65E+03 0,1 1 ,90E+03 0,1 1 ,97E+03
0,5 1 , 32E+04 0,5 1 ,01 E+04 0,5 1 ,29E+04
1 2,51 E+04 1 2 , 1 9E+04 1 2,44E+04
2 5 , 1 2E+04 2 4,57E+04 2 4,93E+04
5 1 , 33E+05 5 1 , 1 8E+05 5 1 , 37E+05
10 2,68E+05 10 2,42E+05 10 2,61 E+05
2 0 99991 R2 0 99977 R2 0,999 5

0,01 1 , 05E+02 0,01 1 ,85E+02 0,01 1 ,0 1 E+02

0,025 2,76E+02 0,025 3,39E+02 0,025 4,25E+02
0,05 1 , 0 1 E+03 0,05 1 ,01 E+03 0,05 1 , 09E+03
0,1 1 , 97E+02 0,1 2 , 1 9E+03 0,1 1 , 54E+03
0,5 1 ,05E+04 0,5 1 , 1 2E+04 0,5 1 , 14E+04
1 2 , 1 4E+04 1 2,26E+04 1 2 , 1 7E+04
2 4,49E+04 2 4,63E+04 2 4,55E+04
5 1 , 1 4 E+05 5 1 , 1 8E+05 5 1 , 1 9E+05
10 2,27E+05 10 2,42E+05 10 2,49E+05
R2 0 ,99992 R2 2
9 Q

0,01 1 ,97E+02 0,01 1 ,53E+02 0,01 9,55E+01

0,025 3,69E+02 0,025 3,30E+02 0,025 3,77E+02
0,05 9,83E+02 0,05 1 ,25E+02 0,05 4,66E+02
0,1 1 ,74E+03 0,1 1 ,82E+03 0,1 1 , 97E+02
0,5 1 , 06E+04 0,5 9,72E+03 0,5 1 , 29E+04
1 2,09E+04 1 2,21 E+04 1 2,44E+04
2 4 , 1 6E+04 2 4,1 6E+04 2 4,93E+04
5 1 , 1 4E+05 5 1 , 1 5E+05 5 1 , 37E+05
10 2,21 E+05 10 2,26E+05 1 0 2,61 E+05
2 9 59 2 6 2
0,99920

Moy
aires SEM
0,01 1 , 32E+02 3,37E+01 l,[Link]

0,025 3,48E+02 4,01 E+01 �.[Link]

r_ZOO1,,_US,1*

RI.O,''''
0,05 8,07E+02 3,03E+02 �.[Link]

0,1 1 ,58E+03 6,22E+02 • S.,i....l.

1,50t.05
0,5 1 , 1 4 E+04 1 , 07E+03
- Li�'.i••
1 2,27 E+04 1 ,27E+03 [Link]
(S••; .... I)

1
2 4,62E+04 2,55E+03 5,00[.04

5 1 ,23E+05 8,59E+03
0,00[·00

1
10 2,44E+05 1 ,39E+04 2 • , • " b
R'
-5,ooE.04
0 9998

Annexe 1 . Standard artémisinine droite d'étalonnage pour l'analyse quantitative de

par LCIMSIMS

1 78
 Annexes

1 10 % d'artémisinine1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
O +--
bourgeon début floraison floraison

Annexe 2. Teneur en artémisinine (%) à la matière sèche en fonction de stade

physiologique de la plant analyses par LCIMSIMS

1 79
 Annexes

,
rlf�r
�§�iè� ;=���g�����i;

�.....

:!

Annexe 3 Chromatogrammes du standard d'artémisinine et d'extrait d'Artemisia annua

180
 Annexes

Conditions d' analyse LCIMSIMS

Spectrométrie de mass : QTrap (Constructeur Applied biosystems

Pump : Agilent 1 1 0 G l 3 12A
Autosampler Agilent 1 1 00 G13 13A
Q I Mass (amu) : 283,20
Q3 Mass (amu) : 247,20
CE (Energy collision) : 1 5,00
DP (Dedustrering Potential) 5,0
FIA (Flow Injection Analyses) Sans colonne
Flow rate: (flLlmin) 500
A(%): MeoH 100 %
Volume injecté: 20 flL

181