Les techniques chromatographiques

HISTORIQUE

1906: description de la méthode de séparation de pigments végétaux par Tswett

Les grandes étapes de l’évolution de la

chromatographie

1906 - M. TSWETT
1931 - Séparations préparatives (KHUN et LEDERER)
1938 - REICHSTEIN : chromatogramme liquide. Développement de la chromatographie sur
couche mince (ISMAILOV ET SHRAIBER)
1940-1943 - TISELIUS : analyse frontale et développement par déplacement. Chromatographie
par échange d’ions (SAMUELSON)
1941 - MARTIN et SYNGE : chromatographie de partage sur gel de silice.
1944 - CONSDEN, GORDON et MARTIN : chromatographie de partage sur papier
1940-1947 - WILSON, DEVAULT, WEISS, GLÜCKAUF, MARTIN, SYNGE et d'autres
développent des théories détaillées de la chromatographie.
1952 : mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en
anglais.
1979 : première séparation chirale par HPLC.
2

1
 Définition

La chromatographie sépare les constituants d'un mélange

(les solutés) par entraînement au moyen d'une phase
mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire
(solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des
solutés entre ces deux phases.

Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention

(exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité
(due à la phase mobile).

La chromatographie est une méthode

basée sur la différence de miscibilité
d'un soluté entre deux phases.
Cette technique s’apparente à
l’extraction…

avec la constante d'équilibre K = [S2]/[S1]

K s'appelle aussi le coefficient de partition.

Application: extraction de la caféine avec du
chloroforme dans une décoction de thé.
K = [caféine(CHCl3)]/[caféine(eau)] = 8,36.

2
Chromatographie en phase liquide : applications

exploiter les interactions

entre les solutés et les 2
phases

pour les séparer en fonction

de leur affinité respective

Solutés à
séparer

les identifier et/ou les

doser
Phase Phase
mobile stationnaire

Principes généraux de la chromatographie

Phase mobile

Pompe(s)

Système
Echantillon d’injection

Système de Phase stationnaire

séparation « la colonne »

Système de
détection Chromatogramme

collecteur de
fractions Composés isolés

Schéma d’un système chromatographique 6

3
 Facteurs intervenant dans le partage des
molécules à séparer :

- la solubilité dans un solvant liquide : dans la

chromatographie de partage

- la taille, la forme : dans la chromatographie d'exclusion

- la polarité : dans la chromatographie d'adsorption, et

d'adsorption en phase inversées

- la charge électrique : dans la chromatographie par

échange d'ions

- la présence de groupements d'atomes formant des sites

particuliers : dans la chromatographie d'affinité
7

Nature des supports (matrice) de la phase stationnaire

polystyrene with divinyl benzene : Sepharose media are based on chains of

produce highly spherical agarose, arranged in bundles and with
(monodispersed), small (10, 15 or 30 different degrees of intra-chain cross-linking,
μm), porous particles that facilitate high to give a range of rigid, macroporous
resolution separations at high flow rates matrices with good capacity and low non-
specific adsorption

4
Résolution: efficacité et sélectivité

poor selectivity good selectivity

efficacité (N) élargissement des pics

sélectivité (α) degré de séparation entre les pics
9

Chromatographie d’échange d’ions

10

5
 Chromatographie sur échangeurs d’ions
Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une résine
cationique est chargée négativement.

Résine-G- / X+ + cation+ Résine-G- / cation+ + X+

11

Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une résine

anionique est chargée positivement.

Résine-G+ / Y- + anion- Résine-G+ / anion- + Y-

12

6
 Charge nette d’une
protéine

13

Charge nette d’une protéine

protéine 1
protéine 2
pI3 protéine 3
pI1 pI2

5.5 < pH < 7.5

pour la plupart des
protéines

14

7
 Elution

• élution par augmentation de la force ionique de l’éluant: gradient de NaCl

Æ les composés éluent en fonction de leur charge nette au pH de
travail (de la plus faible à la plus élevée)
• élution par changement de pH
15

Elution : influence du gradient sur la séparation

Start buffer: 20 mM Tris, pH 7.0
Elution buffer: 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.0

16

8
Groupes fonctionnels utilisés comme échangeurs d’ions

Stabilité de l’état d’ionisation sur une

large gamme de pH

17

Echange d’ions appliqué à

la purification de protéine

..\..\Documentation\Protein
purification\GE-Healthcare_Handbook
series\Animations\GE_Ion
Exchange.swf

18

9
Chromatographie d’exclusion
ou filtration sur gel ou perméation de gel

tamisage
moléculaire

19

Chromatographie d’exclusion

20

10
 Particules de gel
sphériques, poreuses

Chromatographie
d’exclusion sur gel

..\..\Documentation\Protein purification\GE-
Healthcare_Handbook GE_Gel Filtration.swf

21

Théorie de la chromatographie d’exclusion

On considère une colonne de volume total Vtotal remplie d'un gel
solvaté :

Vtotal = V0 + Vi + Vg

• V0 = volume d'eau externe aux granules

• Vi = volume d'eau interne aux granules
• Vg = volume du gel

Un soluté est distribué dans l'eau interne et l'eau externe selon un

coefficient de partage, Kd :
ƒ si Kd = 0, le soluté est totalement exclu.
ƒ si 0 < Kd <1, le soluté est partiellement inclus. Le taux
d'inclusion augmente avec Kd.
ƒ si Kd = 1, valeur théorique correspondant à une inclusion totale
d'un composé dans le gel.
ƒ si Kd > 1, le soluté est inclus et adsorbé. 22

11
 La constante Kd est égale à :

concentration du soluté dans l'eau interne

Kd =
concentration du soluté dans l'eau externe

Æ fraction de la phase stationnaire disponible pour la diffusion

d’une molécule donnée

Kd = (Ve – V0) / (Vt – V0)

•Vt = volume total (il est mesuré en remplissant la

colonne d'eau)
•V0 = volume mort (il est déterminé en mesurant le Ve
d'une substance totalement exclue), correspond à
environ 30% du volume total de la colonne
Ve = volume d’élution d’une substance donnée

23

Application n°1 : purification de protéines

Æ élution des solutés dans l'ordre

inverse des masses moléculaires

V0 : volume de la phase mobile

Vi: volume de tampon à
l’intérieur de la matrice = Vs,
volume de la phase stationnaire
= Vt-V0-Vg

Gamme de fractionnement
24

12
Application n°2 : détermination de la masse molaire
d’un composé

25

On définit le coefficient de partage entre la phase liquide

et la phase gel:

KD = (Ve - V0) / (Vt - V0)

On trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (KD) (ou

masse molaire = f(KD) sur une échelle semi-
logarithmique).

La partie linéaire de cette droite (en rouge) permet de

déterminer la masse molaire d'une molécule X dont le
volume d'élution a été mesuré dans les mêmes
conditions, en reportant son KD.

26

13
 Chromatographie d’affinité

27

Chromatographie d’affinité

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support

macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur
qui présente une affinité biologique pour un soluté de l'échantillon à
analyser.

Trois types d'affinités sont utilisées :

• affinité enzyme-substrat
• affinité récepteur-ligand
• affinité antigène-anticorps

Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien

l'anticorps. Ceci permettra de purifier l'enzyme, le récepteur ou
l'antigène, respectivement.

28

14
 Les 3 étapes d'une chromatographie d'affinité

1 - Etape de FIXATION : Le mélange de molécules contenant le composé à

purifier est chargé sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une
affinité pour la colonne sera retenue par l'effecteur greffé sur la phase
stationnaire.

2 - Etape de PURIFICATION (ou lavage): En continuant à faire passer du

tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminantes sont éliminées
et éluées.

3 - Etape d'ELUTION : La molécule purifiée est décrochée de la colonne et

29
est recueillie dans l'éluat.

Souvent l’un des partenaires de l’interaction est une

protéine (P), l’autre sera qualifié de ligand (L) de cette
protéine.

liaison
P+L PL
élution

La constante définissant cet équilibre est la constante de

dissociation (Kd) :

[P].[L]
Kd =
[PL]
30

15
 Elution par altération des conditions
permettant la liaison

Æ pH, force ionique, température, compétiteur …

liaison élution
31

Purification de protéines
par chromatographie
d’affinité
..\..\Documentation\Protein
purification\GE-Healthcare_Handbook
GE_Affinity.swf

32

16
 Elution : les différentes stratégies

Méthode 1. Changement de
composition du tampon qui
n’altère ni le ligand, ni la cible

Méthode 2. Changement de pH
vers des pH extrêmes ou ajout
d’agents chaotropiques (urée,
chlorure de guanidinium) qui
peuvent altérer la cible
temporairement ou de manière
permanente

Méthodes 3 et 4. Compétition d’une substance

qui va déplacer la cible soit en se liant à
l’effecteur (cas 3), soit en se liant à la cible
même (cas 4)
33

Purification des protéines portant une étiquette (‘tag’) :

expression hétérologue dans E. coli

Site de coupure
spécifique d’une
protéase Multiple cloning site
permettant l’insertion
Gène codant pour la du gène de la protéine
GST en N-terminus de d’intérêt
la protéine d’intérêt

34

17
Purification des protéines portant une étiquette (‘tag’) :
Histidine-tag
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

CH2

CH2

Æ Coordination d’un atome métallique bivalent

(Ni2+ ou Cu2+ ou Zn2+)
Æ Elution : compétition avec l’imidazole

Æ Conditions dénaturantes possible (6M

chlorure de guanidinium ou 8M urée)
Æ En absence d’agents chélatant (EDTA, EGTA,
citrate) et de réducteurs (DTT, DTE, β-ME) 35

Purification des protéines portant une étiquette (‘tag’) :

GST-tag

GST= glutathione S-transferase (Mr 26 000 Da)

Æ Affinité pour le glutathion immobilisé sur la matrice
Æ Élution de la protéine d’intérêt par compétition
avec le glutathion
Æ Conditions dénaturantes impossible
Æ Possibilité d’utiliser agents chélatant et réducteurs

36

18
 Chromatographie
d’interaction hydrophobe

Cas particulier de la
chromatographie d’affinité

37

Chromatographie d’interaction hydrophobe :

le rôle de l’eau

38

19
Principe de la chromatographie d’interaction hydrophobe

Conditions favorisant Conditions défavorables à la

la liaison liaison
39

Chromatographie d’interaction hydrophobe et

hydrophobicité de surface des protéines

40

20
 Purification de protéines
par chromatographie
hydrophobe
..\..\Documentation\Protein
purification\GE-Healthcare_Handbook
GE_Hydrophobic Interaction.swf

41

Chromatographie de partage

42

21
 Chromatographie de partage sur papier

Chromatographie liquide-liquide, essentiellement qualitative, fondée sur la

(ré)partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non
miscibles: l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile
Æ basée sur la différence de solubilité des espèces à séparer

support : solide poreux, inerte, imprégné de liquide (cellulose, gel de silice...)

43

Principe chromatographique

Séparations basées sur les différences de distribution des solutés

entre deux phases non miscibles

[Sorg] [Sorg] : concentration en soluté S

coefficient de partage : K = dans la phase organique
[Saq] [SSaq] : concentration en soluté S
dans la phase aqueuse.

Plus K est faible, plus le composé est fortement absorbé dans la phase aqueuse, en général
assimilé à la phase stationnaire, et plus la rétention est grande, et vice versa.

La valeur de K dépend :

• de la structure du composé qui détermine son affinité pour chacune des phases
• de la nature de la phase stationnaire qui est un adsorbant ou un solvant pour chacun des
composés
• de la phase mobile, seulement si elle est un liquide, et donc un solvant pour chacun des
composés
• de la température qui affecte les pressions de vapeur et les solubilités
44

22
 Chromatographie d’adsorption

45

aBsorption aDsorption
b

En physique et en chimie, l'absorption, par opposition à adsorption,

consiste à joindre la molécule absorbée à une autre ce qui entraîne sa
disparition par transformation ou modification chimique
46

23
 Chromatographie d’adsorption
Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la (ré)partition des solutés entre
l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une
force de rétention (par adsorption) par la phase stationnaire et une force
d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration
différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.

Répartition des molécules entre les deux phases dont l’une est solide.
Ici les molécules sont adsorbées à la surface du solide.

47

Chromatographie d’adsorption en phase inversée

C'est une chromatographie d'adsorption liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire se
distingue par son apolarité. Elle est constituée, la plupart du temps, par des silices apolaires
greffées. Il existe des greffons apolaires de taille différente, de 2 à 18 atomes de carbone
(C2 à C18), donc de polarités différentes.

La phase mobile est polaire et hydrophile. Les séparations sont fondées sur des interactions
hydrophobes entre les molécules à séparer et la phase stationnaire.

Plus un soluté est apolaire, plus il sera retenu au niveau de la phase solide stationnaire.
A l'inverse, plus un soluté est polaire, plus il sera entraîné par la phase mobile liquide.

Silices greffées (apolaires)

Dans la pratique, cette chromatographie ne
s'applique qu'en HPLC, elle porte le nom de
RP-HPLC (ou Reverse Phase HPLC, ou
HPLC en phase inverse).

La RP-HPLC s'applique bien à la séparation

de petites molécules apolaires : lipides, acides
aminés, peptides.

48

24
Chromatographie d’adsorption en phase normale

Silices polaires greffées

49

Chromatographie sur couche mince

Schéma d’une CCM

Æ phase stationnaire : solide (alumine Al2O3 ou gel de silice SiO2)
fixé sur un support inerte

chromatoplaque

atmosphère saturée en
vapeur de solvants

dépôts
solvant(s)

Facteur de rétention :

Chromatographie liquide-solide, utilisée essentiellement en analyse qualitative,

fondée sur la différence d’adsorption, sur la phase stationnaire, de chacun des
solutés entraînés par l’éluant
Æ les constituants migrent avec la phase mobile selon leur polarité
50

25
 Solvants pour la
chromatographie
en phase normale

51

Solvants pour la chromatographie en phase inverse

52

26
 Elution isocratique ou gradient d’élution

Mode isocratique plus le temps d’élution est long, plus les pics seront élargis

Gradient
les pics sont plus fins : les pics ‘tardifs’ sont soumis à
un plus fort pouvoir éluant que les pics ‘de tête’
Æ tend à « compresser » la zone d’élution et donc à
affiner les pics

53

Phase normale : adsorbant polaire

Æ Séparation/purification des composés polaires
la polarité du solvant augmente dans le
sens de la flèche

la polarité de
l'échantillon
augmente

A est plus polaire que B 54

27
 Phase inversée : adsorbant apolaire
Æ Séparation/purification des composés apolaires
la polarité du solvant augmente dans le
sens de la flèche

la polarité de
l'échantillon
augmente

A est plus polaire que B 55

Chromatographie en phase liquide

type phase stationnaire

adsorption solide poreux
solide à la surface duquel se trouvent des
échange d'ions
effecteurs (composés ioniques ou hydrophobes,
Interactions
ligands) qui permettent, à l'aide d'un solvant
hydrophobes
approprié, l'échange de solutés (ions, protéines,
liquide/solide affinité
récepteurs) présents dans la phase mobile

exclusion
(filtration sur gel solide dont la dimension des pores permet la
ou perméation de séparation des espèces selon leur taille
gel)

partage solide poreux inerte enrobé de liquide

phase normale (de moins en moins utilisée)
liquide/liquide
partage solide poreux sur lequel sont greffées
phase inversée des chaînes hydrocarbonées non-polaires

56

28
Principe d’un appareil HPLC
phase mobile

Tampon A Tampon B

Pompe A Pompe B

Chambre de
mélange

boucle vanne
d’injection d’entrée

échantillon

phase
stationnaire

détection
UV, pH,
vanne
conductivité de sortie
spectromètre de
poubelle
masse (LC-MS)

collecteur de
fractions
57

Pompes

58

29
 Pompes à double piston

Æ débit de la pompe plus constant

(certains détecteurs sont sensibles aux
‘pulsations’ du débit)

59

Injecteurs à boucle
échantillon :
échantillon : sortie
échantillon : entrée
sortie échantillon : boucle
boucle
entrée
1
6
2

3 éluant : sortie
éluant : entrée éluant : entrée 5
vers la colonne
4

éluant : sortie
vers la colonne

Remplissage de la boucle Injection sur la colonne

(mode ‘load’) (mode ‘inject’)

60

30
 Détecteurs

Détecteurs Système Limite de détection

Spectrométrie de masse (MS) GC, HPLC < 0.1 ppb
Ionisation de flamme (FID) GC < 1 ppm
Absorbance (DAD) HPLC, GC 1 ppb
Indice de réfraction (RID) HPLC, GC 1 ppm

IRTF HPLC, GC > 10 ppm

Diffusion de la lumière (LALLS) HPLC, GC > 10 ppm

Viscosimétrie
Conductivité
Électrochimique (redox reaction) HPLC, GC
Fluorescence
RMN
61

Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC)

Æ phase mobile = gaz vecteur (gaz porteur)

Æ la plus performante au point de vue de la séparation,

est réservée aux produits volatils et thermostables.
(Masse moléculaire < 500 Daltons)

• gaz - liquide (la plus répandue)

• gaz - solide Chromatogramme de
l'essence de géranium

62

31
 Principes chromatographiques de
séparation

63

Résolution: efficacité et sélectivité

poor selectivity good selectivity

efficacité (N) élargissement des pics

sélectivité (α) degré de séparation entre les pics
64

32
 Paramètres liés à la rétention

65

Constante Définition Commentaires

V0 Volume mort (ou volume C’est le volume de rétention du non-retenu.
vide, en mL) Il est lié au vide entre et dans les particules
de la colonne V0 = D x t0 (pour une silice de 5 μm, 50-75% du
volume géométrique de la colonne).
Æ correspond au volume de phase mobile
dans la colonne si on néglige les volumes
morts de l’injecteur et du détecteur.

t0 Temps de rétention d’un Un composé non retenu est un composé

composé non-retenu (mn) sans interaction avec la phase stationnaire
ou temps mort (ne pas confondre avec un composé exclu).

D Débit en ml/min D=V0/t0

tR Temps de rétention mesuré Temps passé par le composé dans

au l’appareillage chromatographique mais qui
sommet du pic (mn) est susceptible de varier en fonction :
- du débit (fuite, …)
Ve = D x tR
- de la température (saison, …)
- de la phase mobile (évaporation, additifs
de stabilisation, …)
- du vieillissement de la colonne
66

33
 Constante Définition Commentaires
t’R Temps de rétention Temps de séjour d’un composé passé dans
réduit ou sur la phase stationnaire
t’R’ = tR – t0

k’ (ou k) Facteur de capacité (ou Paramètre fondamental caractérisant la

facteur de rétention) rétention du composé par le système
k’ = tR’ / t0 = (tR - t0 ) / t0 chromatographie (ou vitesse de progression
des composés sur la colonne)

Æ permet de comparer, pour un soluté donné, S’apparente au coefficient de partage K :

différentes colonnes chromatographiques exprime le rapport de la quantité de soluté
dans la phase stationnaire à la quantité
de soluté dans la phase mobile
Indépendant du débit ou de la longueur de
la colonne
Pour un même composé, si on observe :
- k’ < 1 : élution trop rapide
- 1 < k’ < 5 : élution optimale
- k’ > 5 : élution trop lente

67

Paramètres liés à l’efficacité de l’appareillage

68

34
L’efficacité d’une colonne dépend du degré d’élargissement du pic qui se produit à mesure
que l’analyte parcourt la colonne. Cet élargissement dépend du temps de séjour de l’analyte
dans les 2 phases :
• tR grand : pics larges
• tR petit : pics fins

L’efficacité d’une colonne s’évalue à partir de l’un ou l’autre de ces deux termes :
• H = hauteur équivalente à un plateau théorique
• N = nombre de plateaux théoriques

L’efficacité augmente quand N augmente ou quand H diminue à L constante.

σ est la variance, ω est la largeur du pic à la base, δ (ou ω½ ) la largeur du pic à mi-hauteur :

et

ou

69

Notion de plateau théorique

Pour un soluté S donné :

plateau (i-1) H SMi-1 ↔ SSi-1

plateau (i) H SMi ↔ SSi
plateau (i+1) H SMi+1 ↔ SSi+1

pouvoir de séparation des chromatographies les plus utilisées

Nombre de plateaux N/par mètre de H (HETP) en

Type de chromatographies
théoriques N colonne mm

CPG (colonne remplie de 2 m) 2000 1000 1

CPG (colonne capillaire de 25 m) 100000 4000 0,25

LC classique de 50 cm 100 200 5

HPLC de 10 cm 5000 50000 0,02

70

35
detector response

71

Le nombre de plateaux théoriques et effectif

Nth et Neff : efficacité de la colonne

2
2 ⎛ ⎞
⎛t ⎞ t
Nth = 16 ⋅ ⎜ r ⎟ = 5.54 ⋅ ⎜⎜ r ⎟⎟ ω = largeur du pic à la base
⎝ω ⎠ ⎜ ω1 ⎟
⎝ 2⎠ ω½ = largeur du pic à mi-hauteur
2
2 ⎛ ⎞ 2
⎛t −t ⎞ t −t ⎛ k ⎞
N eff = 16 ⋅ ⎜ r 0 ⎟ = 5.54 ⋅ ⎜⎜ r 0 ⎟⎟ = N th ⋅ ⎜ ⎟
⎝ ω ⎠ ⎜ ω1 ⎟ ⎝1+ k ⎠
⎝ 2 ⎠

L L = longueur de la colonne
H =
N = nombre de plateaux théoriques
N

72

36
 Constante Définition Commentaires
N Efficacité On appelle plateau théorique la
(pic portion de phase stationnaire
symétrique) dans laquelle un soluté est en
équilibre de répartition entre la
phase mobile et stationnaire
(chaque plateau pouvant alors
être assimilé à une ampoule à
décanter)

H Hauteur d’un plateau théorique Un H faible est synonyme d’une

H=L/N meilleure efficacité
(L : longueur de la colonne)

dp Diamètre des particules Généralement indiqué

"granulométrie"
As Asymétrie Asymétrie de pic à 10% de la
As = B/ A hauteur
Si B>A : phase stationnaire
saturée, migration trop rapide
Si A>B : composé trop retenu,
temps de rétention rallongé
73

Influence de la taille des particules de phase stationnaire sur la résolution

74

37
 Paramètres liés à la séparation

75

Constante Définition Commentaires

α Sélectivité Précise les positions relatives de deux pics

α = t’R2 / t’R1 = k2 / k1 adjacents
α ≠ 1 : condition nécessaire mais non suffisante à
α≥1 une bonne résolution.
Æ il faut en plus un retour à la ligne de base
du premier pic avant que le second ne
démarre.
Rs Résolution En HPLC analytique, on estime que la résolution
minimale pour détecter deux pics de hauteur
voisine doit être de 0.6 mais doit être de 1.5 pour
un retour à la ligne de base.
ƒ Rs < 1 mauvaise résolution
ƒ 1 < Rs < 1.5 résolution acceptable
ƒ Rs > 1.6 trop bonne résolution, le temps
d’analyse est rallongé

76

38
 La résolution Rs

a) les pics se recouvrent;

b) la distance séparant les sommets des

pics est plus grande mais les largeurs à la
base sont les mêmes qu’en a);

c) la distance séparant les sommets des

pics est égale à celle trouvée en a) mais les
largeurs à la base sont plus petites qu’en b).

∆tR
Rs =
ω
Rs = 2 (tR2 – tR1) / (ω2 + ω1) ω : largeur des pics à la base
ω1/2: largeur à mi-hauteur
Rs = 1.18 (tR2 – tR1) / (ω1/22 + ω1/21)
77

Optimisation

1 α −1 k2 1 α −1
Rs = ⋅ ⋅ ⋅ Ν 2th = ⋅ ⋅ Ν eff
2
4 α 1+ k2 4 α
I II III
(l’indice 2 se rapporte au composé le plus retenu)

Pour accroître Rs, on peut augmenter l’un de ces trois facteurs :

I sélectivité,
II rétention des solutés,
III efficacité de la colonne.

On optimisera d’abord I (paramètre thermodynamique déterminant) puis

II et III (cinétique des échanges).

78

39
1.Variation de Rs avec α

La résolution augmente avec la sélectivité qui mesure les différences

de distribution de deux substances entre les deux phases. La
sélectivité étant fonction des coefficients de distribution des
constituants du mélange à analyser, elle peut être modifiée :

- en changeant la nature et la composition de la phase mobile et

en jouant sur le pH

- en changeant la nature de la
phase stationnaire

- en modifiant la température

Si α = 1, il n’y a pas de séparation quelle que soit la valeur de N.

Si α passe de 1,1 à 1,2, la valeur de Rs double.
Si α > 2, la valeur de Rs ne change presque pas.

79

2. Variation de Rs avec k

Si k est nul (tR=t0), les deux solutés sortent simultanément de la colonne

après écoulement du volume mort et la résolution est nulle.

La résolution augmente en même temps que k mais de moins en moins

vite puisque k/(1+k) tend rapidement vers 1 et le gain en résolution
devient négligeable. À ce moment, le temps de rétention devient très
long et le pic de plus en plus large.

On peut mettre en œuvre un gradient d’élution de façon à ramener les

facteurs de capacité des solutés à des valeurs convenables (entre 2 et
5), ou encore modifier le taux de greffage, la surface spécifique du
support ou la composition de la phase mobile.

80
k'=5

40
3. Variation de Rs avec N

La valeur de Rs est proportionnelle à la racine carrée du nombre de

plateaux théoriques.

Si la longueur de la colonne est multipliée par 2, Rs est multiplié par

1,4.

Cependant, N demeure un facteur important dans le processus de

séparation des pics en chromatographie.

Il est possible de réduire le diamètre des particules ou d’augmenter

la vitesse de la phase mobile pour augmenter l’efficacité.

81

Loi de Darcy
La perte de charge ou pression appliquée ∆P entre l'entrée et la sortie de la
colonne (la pression de sortie étant généralement atmosphérique) est
donnée par la loi de Darcy

avec
∆P : perte de charge dans la colonne
Ф : facteur de remplissage de la colonne (ou facteur de résistance à
l’écoulement)
L : longueur de la colonne
η : viscosité de la phase mobile (Pa.s ou Cp)
η(eau) = 0,89 Cp, η(MeOH) = 0,54 Cp, η(ACN) = 0,34 Cp
u : vitesse linéaire moyenne de la phase mobile
dp : diamètre des particules de la phase stationnaire

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 Influence du débit
Equation de Van Deemter- Knox

Equation de Van Deemter (en C.P.G) ou équation, pratiquement équivalente, de

Knox (en chromatographie liquide) qui relie la hauteur équivalente à un plateau
théorique (HEPT, H) à la vitesse linéaire moyenne de la phase mobile u :

H(u) = A + B/u + C u
diffusion résistance
turbulente diffusion au transfert
longitudinale de masse

traduit la dispersion du soluté à

cause de la diffusion du soluté
dans la colonne

Attention aux unités utilisées, on exprime généralement :

u en cm/s et h en cm.

Dans ces hypothèses :

A sera en cm ; B sera en cm2/s et C sera en s 83

Hopt = 2 (BC)½ si on néglige A

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Signification physique des termes A, B et C

A : terme de remplissage
Ce terme est en relation avec le profil d'écoulement de la phase mobile à travers la
phase stationnaire.
Æla phase mobile circule plus ou moins facilement en fonction de la taille des
particules, leur répartition, la régularité du remplissage ou du tassement de la colonne
Æsi des chemins préférentiels sont créés, les équilibres entre la phase stationnaire et la
phase mobile ne se font plus correctement ce qui diminue l'efficacité de la colonne (la
phase mobile va circuler préférentiellement dans les zones "moins remplies") = diffusion
turbulente d'Eddy
Æphénomène parfois négligeable en HPLC ou en CPG sur colonne capillaire alors A=0
(équation de Goley)
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Signification physique des termes A, B et C

B : terme de diffusion dans la phase mobile
Ce terme est particulièrement important en CPG, il est une conséquence du second
principe de la thermodynamique qui veut que l'entropie (donc le désordre)
augmente spontanément.
Æla séparation chromatographique étant une "mise en ordre", elle s'oppose à cette
augmentation de l'entropie donc du désordre
Æles molécules ont toujours une tendance naturelle à occuper au maximum
l'espace qui leur est offert et à se mélanger à nouveau entre elles : particulièrement
vrai si le débit de la phase mobile est trop faible ⇒ les molécules se mélangent alors
plus vite qu'elles ne se séparent, donc diminution de l'efficacité pour les très faibles
débits (H→∞ quand u →0)
C : terme de transfert de masse
Le terme C est dû à la résistance au transfert de masse du soluté entre les deux
phases
Æil devient prépondérant lorsque le passage est trop rapide (débit de phase mobile
trop élevé) pour que les équilibres puissent s'établir correctement.
Æles solutés sont alors entraînés hors équilibre et les séparations ne se font plus
correctement
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