Les listérioses : diagnostic, physiopathologie, prophylaxie

Olivia Legallant

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Olivia Legallant. Les listérioses : diagnostic, physiopathologie, prophylaxie. Sciences pharmaceu-
tiques. 1994. �dumas-02452842�

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[Données à caractère personnel]
 UNIVERSITE Joseph FOURIER - GRENOBLE 1-Sciences Technologie Médecine

U. F. R. DE PHARMACIE

Domaine de la Merci - La Tronche

ANNEE: 1994 No D'ORDRE : :f-o Z S"

TITRE DE LA THESE

LES LISTERIOSES :
DIAGNOSTIC, PHYSIOPATHOLOGIE, PROPHYLAXIE

THESE

Présentée à l'Université Joseph FOURIER - GRENOBLE 1

pour obtenir le grade de : DOCTEUR EN PHARMACIE.

Par

Mlle : LEGALLANT Olivia

[Données à caractère personnel]

Cette thèse sera soutenue publiquement le 20 Juin 1994, devant

Mme le Professeur J. ALARY, Président du jury

Mme A. VILLET, Maître de Conférences

Mme M. BLANC, Pharmacien.

 -1-

A mes Parents,
A ma Famille,
A tous mes Amis.
 - 2-

A mon Président du Jury et Directeur de Thèse,

Madame le Professeur J. ALARY,

Professeur de Chimie Analytique à l'U.F.R. de Pharmacie de Grenoble.

Vous m'avez fait l'honneur de juger cette thèse, soyez-en remerciée.

Pour votre amabilité et vos conseils, veuillez trouver ici, l'expression de toute ma gratitude.
 - 3-

A Madame A. VILLET, Martre de Conférences,

Laboratoire de Chimie Analytique de I'U. F. R. de Pharmacie de Grenoble.

Vous avez fait preuve d'une grande disponibilité et votre aide m'a été précieuse.

Je vous en suis profondément reconnaissante.

 -4-

A Madame M. BLANC, Pharmacien,

Laboratoire E.R.C.E.M.

Vous avez bien voulu faire partie de mon jury de thèse.

Je suis sincèrement touchée par votre gentillesse.

 - 5-

LES LISTERIOSES :
DIAGNOSTIC, PHYSIOPATHOLOGIE,
PROPHYLAXIE
-6-
 - 7-

.SOMMAIRE
 - 8-

1ère PARTIE:
HISTORIQUE

2ème PARTIE:
LE GERME

3ème PARTIE:
EPIDEMIOLOGIE

4ème PARTIE :
PHYSIOPATHOLOGIE

Sème PARTIE :
DIAGNOSTIC

6ème PARTIE :
·TRAITEMENT

7ème PARTIE:
PROPHYLAXIE

Sème PARTIE :
LISTERIA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

9ème PARTIE :
BESOINS DE LA RECHERCHE
 - 9-

INTRODUCTION
 - 10-

La France, comme de nombreux pays, possède une industrie agro-alimentaire

relativement développée et exportatrice ; de ce fait, la listériose pose un double problème
de santé publique et économique.

Ceci, associé à la peur éprouvée par certains consommateurs, doit amener les
pouvoirs publics à prendre des mesures d'hygiène et de prévention.

C'est pourquoi, il nous a paru intéressant de faire la synthèse des connaissances

sur:

- la bactériologie des Listeria,

- l'épidémiologie des listérioses,

- la pathologie des listérioses,

-le diagnostic des listérioses,

- le traitement des listérioses,

-la prévention des listérioses,

- la contamination des denrées alimentaires par les Listeria,

- la détection des Listeria dans les aliments,

- les moyens de lutte contre les Listeria.

Néanmoins, de nombreuses incertitudes persistent comme nous le verrons et la

recherche a encore beaucoup de progrès à faire dans l'optique de mattriser totalement
cette bactérie extrêmement dangereuse pour certains ; nous nous proposons donc de citer
quelques caractéristiques qui mériteraient d'être étudiées.
 - 11 -

1ère PARTIE:

HISTORIQUE
 - 12-

Listeria monocytogenes, espèce-type du genre Listeria (du nom du chirurgien an-

glais Lord Lister) a été isolée en 1926 par MURRAY et coll. (404) à l'Université de Cam-
bridge lors d'une épizootie chez des lapins et des cobayes présentant une mononucléose
sanguine et des lésions de nécrose hépatique ; ils lui donnèrent le nom de Bacterium mo-
nocytogenes.

Mais, des infections à Listeria ont certainement été rencontrées avant cette pre-
mière description.

HÜLPHERS en Suède l'a décrite en 1911 chez le lapin sous le nom de Bacillus hepatis.

DUMON et COTON! (155) isolèrent, en 1918, un germe "diphtéroïde" dans le liquide

céphalo-rachidien d'un soldat italien atteint de méningite purulente, en Champagne.

La publication mentionnait seulement l'existence d'une bactérie nouvelle évoquant le

"bacille du rouget du porc" ou Erysipelothrix rhusiopathiae.

La souche isolée avait été conservée à l'Institut Pasteur.

A partir de 1924, le germe a été isolé chez de nombreuses espèces et a reçu diffé-
rents noms:

-chez la gerbille en Afrique par PIRIE (445) en 1927 (Listeria hepatolytica),

- chez le porc en 1924 par des russes (X Bacil/us),

- chez le mouton en Nouvelle-Zélande par GILL en 1929 (Listerella ovis),

- chez d'autres animaux présentant des troubles moteurs par MATIHEWS en

1928, SEASTONE, BIESTER et SCHWARTE en 1939 (Listerel/a monocy-
togenes bovis ou suis selon l'espèce).
 - 13-

D'autres noms ont été recensés à savoir :

- Corynebacterium infantisepticum,

- Corynebacterium parvulum,

- Erysipelothrix monocytogenes.

Le premier isolement chez l'homme a été effectué par NYFELDT en 1929 lors d'un
syndrome mononucléosique (Bacterium monocytogenes hominis) et dès 1933, BURN a
démontré le rôle de cette bactérie dans l'infection périnatale.

Le nom officiellement admis depuis 1941, suite aux travaux de COTONI (115), est
Listeria monocytogenes.

A partir de 1950, REISS, POTEL et KREBS (464) ont décrit la forme septicémique
du nouveau-né ou granulomatosis infantiseptica et SEELIGER (501) (502) a montré que
Listeria monocytogenes jouait un rôle important en pathologie ; la relation entre la gestation
et la listériose est alors établie.

Mais, l'origine de la contamination est plus difficile à découvrir.

En ce qui concerne les animaux, une relation évidente entre les épisodes de listé-
riose et la consommation d'ensilage est reconnue dès 1960.

Chez l'homme, c'est seulement en 1981 qu'une origine alimentaire est prouvée et
que la première épidémie de 1985 en Californie due à la consommation d'un fromage frais
de type mexicain par la communauté hispano-américaine est élucidée.

Les autres épidémies importantes datent de 1981 au Canada où est incriminée une
salade de chou, en 1983 au Massachusetts où l'agent responsable est un lait pasteurisé,
en 1987 en Suisse suite à la consommation de Vacherin Mont d'Or produit dans le canton
de Vaud et enfin en 1992 en France où l'agent est de la langue de porc en gelée.
 -14-

2ème PARTIE:

·LE GERME.
 - 15-

1. POSITION TAXONOMIQUE.

Selon la classification française de PREVOT (450), Listeria monocytogenes appar-

tient è l'ordre des "Actinobactériales", famille des Actinomycetaceae dont elle constitue le
sixième genre voisin de Corynebacterium et Erysipelothrix.

La classification américaine du Bergey's Manual est différente :

- dans l'édition de 1957, Listeria monocytogenes est classée dans la famille des
Corynebacteriaceae avec les genres Corynebacterium, Erysipelothrix, Micro-
bacterium, Cellulomonas et Arthrobacter (535),

- dans l'édition de 197 4, le germe est classé après la famille des Lactobacilla-
ceae dans une rubrique "genre d'affiliation incertaine" (80) (596) avec les
genres Erysipelothrix et Caryophanon.

Ce genre comprend quatre espèces : Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans,

Listeria grayi et Listeria murrayi, mais Listeria monocytogenes est l'espèce-type du fait de la
rareté des autres.

STUART et coll. (536), è la suite d'expériences d'hybridation ADN-ADN ont proposé de

. créer un nouveau genre Murraya, comprenant Murraya grayi spp. grayi et Murraya grayi
spp. murrayi, mais ces taxons sont rarement rencontrés, et jamais è partir de matériel hu-
main.

- dans l'édition de 1986 (500), le genre Usteria est regroupé avec six autres
genres dans un ensemble hétérogène de bacilles à Gram positif réguliers ne
formant pas de spore ou section 14 regular, nonsporing, Gram positive rods
d'après des résultats de taxonomie numérique et de séquençage de I'ARN
ribosomique 16S (Tableaux 1 et Il).

Ces conclusions sont corroborées par un faible G + C mol. %, la présence d'acides lipo-
téichoïques ainsi que l'absence d'acides mycoliques (473).
 - 16-

Longtemps considéré comme proche des genres Listeria et Erysipelothrix, le genre Co-
rynebacterium a été éloigné.

De plus, Listeria grayi, Listeria murrayi et Listeria denitrificans sont classées comme
étant d'affiliation incertaine.

Dernièrement, Listeria denitrificans, décrite en 1948, a été retirée du genre Listeria sur
des arguments génétiques, chimiques, biochimiques et de microscopie électronique pour
être classée dans le genre Jonesia comprenantl'espèce unique Jonesia denitrificans (472),
alors que Listeria murrayi et Listeria grayi ont été reclassées dans le genre Listeria.

Le genre Listeria appartient donc au groupe des bacilles à Gram positif réguliers
ne formant pas de spore avec les genres Lactobacillus, Erysipelothrix, Brocothrix, Kurthia,
Caryophanon et Renibacterium ; Listeria monocytogenes en est l'espèce-type et sept espè-
ces (Figure 1) sont dénombrées :

- Listeria monocytogenes décrite en 1926,

- Listeria grayi décrite en 1966,

- Listeria murrayi décrite en 1973 (582),

- Listeria innocua décrite en 1981 (507),

- Listeria seeligeri décrite en 1983,

- Listeria welshimeri décrite en 1983,

- Listeria ivanovii décrite en 1984 (508).

 -17-

Tableau 1 :Groupe des bacilles réguliers à Gram positif.

Catalase Type resp Mobilité Habitat

Lactobacillus - A.A.F - Produits fermentés

non pathogène

Bacilles fins sou- E.r::t.s ~ 72e l o tb.r.i. x - A.A.F - Rouget du porc:

vent en filaments pathogène

Bacilles fins sou- Brochothrix + A.A.F - Produits carnés :

vent en filaments non pathogène

Bacilles courts [:isteria + A.A.F + Saprophyte:pathogène

souvent en courtes 20-25"C chez l'homme et
chaînettes l'animal

Bacilles en chaîn- Kurthia + A.S + Intestin des animaux

nettes, coccoïdes de la ferme
dans les cultures Produits carnés :
âgées non pathogène

Bacilles courts en Ca.r:~o'f2hânon + A.S + Intestin de la vache

chaînettes non pathogène

Bacilles courts Benj,bac~erj,um + A.S - Pathogène du poisson

souvent par paires

A.A.F : aéra-anaérobie facultatif

A.S : aérobie strict

Tableau Il : Principaux caractères différentiels des bactéries à Gram positif

(morphologie exclue).

listeria Coryné- Enterococcus Erysipe/othrix Streptoccus

monocytogenes bactéries faecalis Lactobacillus rhusiopathiae Bacil/us agaloctiae
Mobilité
Granulations
+(25°C) - - - - + -
métachromatigues - ± - - - - -
~P.Qres - - - - - + -
Catalase + + - - - + -
Hémolxse + d ± - - + +
Nitrates - +(-) - - ' - + -
Mannitol - - + -ou+ - ± -
Esculine + - + - - - -
Uréase - -ou+ - - - -ou+ -
SH2 - - - - + - -
Test Anton + - - - -. - -
 - 18-

Figure 1 :Structure phylogénétique du genre Listeria.

HolloLOGIE ADN/ADN

25 50 75 100 %

L. t!\!AAAYI

!:.:...!!!ill
l. !!ONOCYTOGENES
l. INHOCUA
BRAHCHE
~ES CLOSTRIDIUM l. IIELSHIMEAI

1---- l. IVANOVII

l. SEEL IGER 1

______
&RANCH[
nf!; CORYH~FORMES

----..,................
JONESIA DENITRIFICANS
( "L i5rwAiiËHÏT~ .,
~ O.J 0.2 0.3 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
5A8

Listeria innocua a été isolée à partir de l'environnement par SEELIGER (507) en

1981 et est considérée comme une espèce non pathogène.

Listeria seeligeri et Listeria welshimeri ont été décrites en 1 983 par ROCOURT et
GRIMONT (468) et classées primitivement comme Listeria monocytogenes non pathogè-
nes et ensuite distinguées par des études d'hybridation ADN-ADN (467).

Listeria ivanovii a été décrite précédemment sous le nom de Listeria monocytoge-

nes sérovar 5 ou Liste ria bulgarica en 1975 par IVANOV et appelée Liste ria ivanovii depuis
1 984 ; elle est uniquement responsable de maladies chez le mouton (508).

Il. HABITAT. (336)

Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquitaire présentant les caractères

d'une bactérie tellurique puisqu'on la retrouve dans :

- le sol où l'extrême résistance est fonction de la nature du terrain, de la tempé-

rature ambiante et de la saison malgré l'absence de spore.

Elle peut survivre un à deux ans dans le sol alors que dans un prélèvement maintenu à
4°C, la survie peut être de plusieurs années.
 - 19-

- la végétation où elle est présente dans 10 % des ensilages et d'autant plus

qu'ils sont de mauvaise qualité et donc que leur pH augmente, favorisant
ainsi la survie et la multiplication du germe.

Elle est présente sur les pourtours et en surface du silo mais aussi dans le fumier, les
plantes, la paille, les poussières et les boues.

L'environnement plante - sol constitue donc un réservoir mais le problème est de sa-
voir si c'est une flore normale ou s'il y a eu contamination.

- l'eau : Listeria monocytogenes est souvent présente dans les eaux de rivière et
les effluents mais jamais dans l'eau de mer.

- l'homme et les animaux (63) (471) :

. le taux de portage dans les matières fécales (147), la gorge et le pharynx

d'individus sains varie selon les auteurs de 0,6 à 44 % (173) (294),

. 10 à 30 % des ovins, bovins, porcins, poulets, animaux sauvages sont

porteurs de Listeria monocytogenes au niveau des sécrétions nasales et
des matières fécales.

Ill. CARACTERES BIOCHIMIQUES. (336)

Listeria monocytogenes est un bacille à Gram positif, aéra-anaérobie facultatif avec

tendance à la microaérophilie, psychrotrophique, catalase + et oxydase -.

Ill. 1. METABOLISME GLUCIDIQUE.

Il est de type fermentatif donnant naissance à du phosphate de dihydroxyacétone

et du glycéraldéhyde lequel est transformé en acide pyruvique puis en acide lactique, étha-
nol et butanédiol et ceci sans production de gaz ; cette séquence chimique est cormue
sous le nom de voie d'Embden-Meyerhof.
 -20-

Sont fermentés les glucose, fructose, mannose, L-rhamnose, méthyl-0-

mannoside, amygdaline, salicine, cellobiose, maltose, tréhalose, gentobiose, D-arabitol,
lévulose, lactose, saccharose, glycérine, dextrine, galactose, mélézitose, sorbitol alors que
les 0-lyxose, mannitol, amidon, 0-xylose, arabinose, raffinose, mannite, dulcite, inuline,
inositol, dulcitol et adonitol ne le sont pas.

L'esculine est hydrolysée rapidement en esculétine ou 6, 7 dihydroxycoumarine et

0-glucose grêce à une [3-glucosidase.

Un système phosphoénolpyruvate (PEP) : fructose phosphotransférase (PTS) gé-

nérant du fructose-1-phosphate et permettant l'initialisation du métabolisme glucidique a
été mis en évidence chez Listeria monocytogenes (397).

Ill. 2. METABOLIS ME AZOTE.

Il est peu actif et on peut remarquer:

- l'absence de nitrate réductase,

- l'absence d'uréase car l'urée n'est pas hydrolysée,

-l'absence de production d'indole et de H2S,

- l'absence d'activité protéolytique du fait que Listeria monocytogenes ne liquéfie

pas la gélatine ni le sérum coagulé,

- l'acidification du lait tournesolé sans coagulation.

Ill. 3. METABOLISME LIPIDIQUE.

KHAN et coll. (291) ont mis en évidence la présence d'une lipase et/ou lécithinase
suite à l'hémolyse sur gélose au sang de cheval contenant comme substrat du jaune d'œuf,
de la lécithine et de la tributyrine.
 - 21 -

Ill. 4. AUTRES CARACTERES DE DIFFERENCIATION AVEC LES AUTRES

ESPECES. (Tableau Ill) (Figure 2) (Annexe 1)

Il s'agit de :

-la réaction de Voges-Proskauer en présence de potasse et d'a-naphtol posi-

tive : couleur rouge vif en raison de la production d'acétolne par fermentation
du 2, 3 butanédiol,

- la réaction au rouge de méthyle positive par virage au rouge vif du fait de la

fermentation acide-gaz mixte,

- l'hémolyse sur gélose au sang de mouton,

- le test de CAMP : hémolyse en présence de Staphylococcus aureus et Rho-

dococcus equi (469),

EPREUVE DE CAMP

-Réalisation

Ensemencer une souche de Staphylococcus ai.Jreus B-hémolytique (telle que

ATCC 25178) et une souche de Rhodococcus equi (telle NCTC 1621), de manière
verticale, sur la gélose au sang de mouton. Espacer ces deux stries verticales afin
de pouvoir ensemencer entre elles, à l'horizontale, et sans les toucher, les
souches à examiner.
Après 24 - 48 heures d'incubation à 35°C, examiner les boîtes pour observer la
réaction d'hémolyse dans la zone adjacente aux stries verticales.
L'némolyse produite par L. monocytogenes est exaltée à proximité de la strie dü
Staphylococcus ; l'hémolyse produite par L. ivanovii est exaltée à proximité de ir~
s~n8 de Rhodococcus.
Lors de cette épreuve, les autres espèces demeurent non t1émolyt1ques.
L'épreuve de Camp permet la différenciation entre L. ivanovii et L. seeligeri, et
celle des souches de L. seeligeri faiblement hémolytiaues. qui ont pu être lues non
hémolytiques, de L. welshimeri

-Commentaires

Cette épreuve facilite l'appréciation du pouvoir B-hémolytiq.ue des espèces L.

monocytogenes et surtout L. seeligeri. Il est recommandé. d'utilis8r une souct1e de
S. aureus ayant une zone de B-hémolyse importante et une souche de
Rhodococcus equi qui, en exaltant la B-hémolyse de L. ivanovii, la fait paraître
sous un aspect caractéristique en forme de pelle.

Les deux souches sont disponibles au Laboratoire Central d'Hygiène Alimentaire -

43, rue de Dantzig- 75015 PARIS.
 -22-

- le pouvoir pathogène pour la souris par injection par voie intrapéritonéale

d'une suspension concentrée (1 09 cellules) entralnant la mort de la souris
dans une période de 7 jours,

POUVOIR PATHOGENE POUR LA SOURIS

Faire d~évelopper la culture en TSB-YE pendant 24 heures à 35·~c. Ensemencer

une deuxième fois dans 2 tubes de TSB-YE pendant 24 heures à 35°C.
A partir des deux tubes, rassembler au total 10 ml de culture dans un tube de
16x125 mm bouché à vis et centrifuger à 1600xg pendant 30 mn. Eliminer le
surnageant et remettre en suspension le culot avec 1 ml de solution à 0.85 p. 100
de chlorure de sodium.
Cette suspension contiendra approximativement 101 O bactéries par ml.
Injecter par voie intrapéritonéale des souris blanches de race Suisse de 16-18 g
avec 0,1 ml de la suspension concentrée. Chaque souris reçoit ainsi 109 cellules
microbiennes.
Observer la mort de l'animal pendant une période de sept jours.
Les souches non pathogènes ne tuent pas, mais 109 cellules pathogènes tueront
généralement en moins de cinq jours.
Cette épreuve devra être contrôlée avec des souches reconnues pathogènes et
non pathogènes.

- le test d'ANTON par introduction dans le sac conjonctival de l'œil de lapin ou

de cobaye de 2 à 3 gouttes d'une suspension bactérienne et apparition
d'une conjonctivite purulente en 2 à 5 jours guérie par administration locale
d'ampicilline.

IV. MORPHOLOGIE ET STRUCTURE. (336)

Listeria monocytogenes est un bacille Gram positif de 0,5 tJm à 2 tJm de long, as-
porulé, acapsulé bien qu'une capsule ait été observée dans certaines conditions de culture
(503), immobile à 37°C, mobile à 20°C par 4 à 5 cils péritriches (mobilité en pirouette à
l'état frais, en sapin renversé ou en ombrelle ou en parapluie sur gélose mobilité), nepos-
sédant pas de granulations métachromatiques.
 -23-

Tableau Ill Diagnostic différentiel des espèces du genre Listeria.

1 1
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S. au,.ua R. aqu/
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• en t .t • )ours
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 -24-

Figure 2 : Schéma dichotomique pour l'identification d'une souche bactérienne apparte-

nant au genre Listeria (Listeria murrayi exclue).

l Production d'acide à partir du D-Xylose

•
Positive

CAMP test avec R. equi Hémolyse spontanée

N6gatlf NegatJvc Positwe

!
/,----__..I._----.., t
r------~~------~

• •
C1\t.-1P test avec S. aureus
Hémolyse sç.Jotaoèe

L. ivanovii Positive NégatiVe Nega:.' POSitif

RhanQ

'·t
CAMP test avec S. aureus

..___ Pos1fl egat1·r

N' 1 L. innocua 1 L. monocytogenes\

Rharr(V Rham G)

RhanQ Rh arr@
 -25-

La morphologie est variable puisque deux formes peuvent être rencontrées :

-des bêtonnets fins, courts, petits (coccoldes), trapus, réguliers, de 0,4 à 0,5
~m de diamètre, de 0,5 à 2 ~m de longueur, à extrémités arrondies, parfois
incurvés ou effilés, seuls ou en paires ou en courtes chalnettes (3 à 5 bacté-
ries) présentant un arrangement en palissade évoquant des Corynébactéries
ou en V,

- des coques allongés, irréguliers, isolés, en diplo ou en courtes chatnettes,

rappelant les Streptocoques et les Entérocoques.

Les cultures êgées donnent des formes filamenteuses se décolorant facilement et

pouvant être confondues avec des cultures d'Haemophilus.

Dans les produits pathologiques, Listeria monocytogenes a l'aspect d'un bêtonnet

assez court, trapu de 1 à 15 ~m de long, extra ou intracellulaire.

Incluse dans le cytoplasme des grands mononucléaires, elle se dispose en amas enche-
vêtrés, en "paquet d'épingles".

KEELER et coll. (298) ont étudié la structure de la paroi et ont mis en évidence
une fraction protéique, des sucres aminés et 5 amino acides ; ils pensent que le facteur
lipidique isolé par STANLEY (531) et produisant une monocytose sanguine chez les ani-
maux monogastriques serait également localisé à ce niveau.
 -26-

De plus, CONKLIN et coll. (111) ont isolé, par extraction phénolique, un composé
toxique pour l'embryon de poulet voisin d'une endotoxine et similaire au lipopolysaccharide
de Salmonella abortus equi, agent d'avortement chez les animaux.

FIEDLER (190) a proposé un modèle macromoléculaire de l'organisation de la

paroi cellulaire.

Des micrographes électroniques de celle-ci ont montré qu'elle était typique des bactéries
Gram positif c'est-à-dire une fine structure homogène entourant la membrane cytoplasmi-
que et sans membrane externe caractéristique des bactéries Gram négatif.

Les parois cellulaires isolées sèches sont constituées d'environ 35 % de peptidoglycane

se composant d'acide méso-diaminopimélique.

Les hydrates de carbone sont essentiellement représentés par des acides téichorques à
savoir des polymères liés de façon covalente à un site spécifique du peptidoglycane.

Ces acides sont composés de glycérol ou de ribitol, de sucres neutres, de sucres N-

acétylaminés et de phosphate.

Deux types d'acides téicholques existent parmi les sérotypes de Listeria.

Dans les premiers, les résidus ribitol sont liés de façon covalente par des ponts phospho-
diester entre C1 et C5 et sont parfois substitués par de la N-acétylglucosamine en C2 ; ce
type est associé aux sérotypes 1/2a, b et c, 3a, b et c et 7.

Dans le second, la N-acétylglucosamine est intégrée dans la chaine ; ce type est associé
aux sérotypes 4a, b et d ; les parois cellulaires contiennent aussi des acides lipotéichorques
dans lesquels une moitié glycolipidique comme un diglycéride galactosyl-glucosyl est lié de
façon covalente à un phosphomonoester terminal de l'acide téicholque. Cette région lipidi-
que relie la chaîne polymère à la membrane cytoplasmique.

Une protéine de la paroi cellulaire (P58) a été purifiée à partir de Listeria monocy-
togenes par extraction avec un détergent et chromatographie en gel puis caractérisée (33).
 -27-

Elle a un poids moléculaire de 58 kDa, est fortement hydrophobe, contient des groupe-
ments thiol et est située partiellement à la surface des cellules bactériennes.

La production de cette protéine prédomine chez Listeria monocytogenes alors qu'elle est
indétectable chez Listeria seeligeri et Listeria innocua.

Les souris qui survivent à l'infection listérienne expérimentale produisent des anticorps
contre P58 ; cette protéine pourrait donc être utilisée comme marqueur pour le sérodia-
gnostic de la listériose.

V. CARACTERES CULTU RAUX ET CROISSANCE. (336)

Divers facteurs ont été étudiés :

- la température : Listeria résiste et peut se développer au froid du fait de son

caractère psychrophile.

La température optimale de culture est située aux alentours de 30-3rC mais Listeria
peut se développer entre 4 et 45°C (350).

Selon AUDURIER et BERCHE, des cultures restent viables plusieurs mois à la tempéra-
. ture du laboratoire et plusieurs années à 4°C (336) ; la croissance à 4°C représente donc
un intérêt pour l'isolement à partir des produits pathologiques.

Listeria est sensible à la chaleur et la pasteurisation la détruit bien que l'on ait des don-
nées contradictoires à ce sujet; la destruction débute dès 55°C.

Listeria compte parmi les plus thermotolérants des germes non sporulés.

- le potentiel d'oxydoréduction : Listeria présente un métabolisme aéra-anaéro-

bie facultatif avec une nette tendance à la microaérophilie.

Par contre, SEELIGER, BOJSEN MüLLER, SUC et MOATII affirment que la croissance
est plus abondante sous une tension réduite en oxygène et ils préconisent des cultures
dans des conditions faiblement aérobies ou en atmosphère enrichie en gaz carbonique.
 -28-

BUCHANAN et coll. (85) pensent que la présence d'oxygène, lors de l'incubation en aé-
robiose, inactive Listeria monocytogenes.

D'autres pensent que la présence d'oxygène permet à Listeria monocytogenes de sup-

porter des pH acides (186).

- le pH : la croissance est obtenue entre pH 5,6 et 9,6 avec un optimum à pH

neutre.

- l'activité de l'eau : Listeria peut se développer dans des milieux contenant

10 % de NaCI à pH 7 et à 25 oc (359) et peut survivre pendant 15 jours dans
10,5% de NaCI à 37°C (512), 1 an dans 16% de NaCI à pH 6 (271), 8 se-
maines dans 20% de NaCI à 4°C (504).

-les additifs: les nitrites (290) seuls ne peuvent pas inhiber Listeria mais l'as-
sociation de 100 ppm de nitrites, de 3% de NaCI et un pH de 5,5 à 4°C
s'avère intéressante pour inhiber une culture de Listeria (83) (359) (360).

Listeria est sensible au propionate de sodium à 0,3% (pH 5-5,6, 13 et 35°C) (168) et à
8 % (77), au benzoate de sodium de 0,8 à 1 % à re (161 ), à 0,3 % (pH 5-5,6, 13 et 35°C)
(163) (608), au sorbate de potassium à 1 % (76), 0,3 % à pH 5 ou 0,15 % à pH 5 (acide
tartrique) (163) (167), au BHA (100 ppm), au BHT (300 ppm) et à la tertiobutylhydroqui-
none ( TBHQ) (1 0 ppm) ; TBHQ est plus polaire que le BHA et le BHT donc une plus petite
proportion est incorporée dans la phase lipidique des aliments (61 0).

- les intéractions :

. température - salinité : Liste ria survit d'autant mieux en milieu hypersalé

(25,5% de NaCI soit Aw =0,72) que la température est proche de aoc
(1 09) (359) (360) (512) .

. pH - salinité - nitrites : l'association semble diminuer le seuil inhibiteur de

chacun d'eux utilisé seul (511 ).
 -29-

. Listeria- flore compétitive : les bactéries lactiques (3) (41) (50) (124) (135)
(136) (197) (244)(252)(253)(269) (340) (384) (413)(451) (480) (495)
(496) (498) (525) (528) (554) (599) (611) et les carnobactéries (86) (87)
(497) inhibent Listeria en occupant les mêmes niches écologiques ou en
produisant des bactériocines à effet bactériostatique ou bactéricide mais
Pseudomonas ne semble pas affecter la culture de Listeria (193) (380).

-les désinfectants: Listeria monocytogenes n'est pas un germe particulière-

ment résistant puisque des mesures simples de nettoyage - désinfection
sont efficaces.

En effet, Listeria est sensible aux aldéhydes (557), aux produits chlorés (chlore (158),
hypochlorite de sodium (330), disochlorine (557)), aux produits iodés, aux ammoniums
quaternaires (198) (557), aux composés phénoliques (557) et aux alcools (557) dans les
conditions habituelles de leur emploi (température, temps d'action, concentration) (405).

BEST et coll. (44), ont montré l'efficacité du gluconate de chlorhexidine, du glutaraldé-

hyde, de la chloramine-T, de l'acide phosphorique et du formaldéhyde.

Plusieurs formulations de décontamination ont été étudiées pour désinfecter des surfa-
ces en polypropylène et en acier inoxydable (37 4) (376) artificiellement contaminées par
Listeria monocytogenes à savoir (482) :

-une suspension pure de chaque listériaphage (H387, H387-A et 2671) de la

famille des Siphoviridae,

- un mélange de quantités égales de ces 3 phages,

-1 à 100 ppm de solution de désinfectant chimique; le QUATAL (N-

alkyldiméthyl-benzylammonium HCI10,5% et glutaraldéhyde 5,5 %),

- une combinaison de phages et de QUATAL.

 - 30-

Les résultats de ces expériences montrent que :

-les suspensions de phages à des concentrations de 3,5.1 0 8 PFU/ml sont aussi effica-
ces qu'une solution à 20 ppm de composé ammonium quaternaire (QUATAL) dans la
réduction des populations de Listeria monocytogenes,

-l'efficacité des 3 phages est équivalente sur les deux surfaces,

- le mélange des 3 phages présente une meilleure efficacité sur l'acier inoxydable que
sur le polypropylène ce qui suggère un effet synergique des 3 phages quand ils sont
utilisés en combinaison pour désinfecter les surfaces en acier inoxydable,

- le développement de résistance contre les bactériophages, phénomène bien connu,

peut être minimisé ou évité en utilisant des mélanges de 2 ou plusieurs phages ayant
un mode d'infection des cellules bactériennes différent,

- les combinaisons de deux ou plusieurs phages ou les suspensions phages-QUATAL

présentent une activité synergique donc l'utilisation des listériaphages en combinai-
son avec un désinfectant chimique peut améliorer le taux de destruction de Listeria
monocytogenes ; la combinaison d'un désinfectant biologique et d'un désinfectant
chimique apparalt donc plus efficace que l'utilisation de chacun individuellement,

- une concentration en QUATAL de 50 ppm est nécessaire à la destruction totale de

toutes les souches sur surfaces en acier inoxydable et en polypropylène,

-la suspension listériaphage-QUATAL est plus efficace pour inactiver les cellules Listeria
sur surfaces en acier inoxydable que sur polypropylène,

- l'activité biologique des 3 phages n'est pas affectée par des concentrations en QUA-
TAL de 50 ppm et un temps de contact de 4h mais des concentrations de 75 à 100 .
ppm réduisent les titres phagiques,

En raison de leur spécificité élevée, les bactériophages ont des impacts minimes sur l'éco-
logie microbienne des aliments, des matériaux de fabrication et de l'environnement et l'effi-
cacité des composés chimiques peut être influencée par des facteurs de l'environnement
comme le pH, les résidus organiques, la dureté de l'eau et la température.
 -31 -

De ce fait, l'addition de listériaphages à un composé ammonium quaternaire permet de

réduire la concentration des produits chimiques pour détruire la population entière des cel-
lules de Listeria contaminantes.

La combinaison d'un agent chimique avec des bactériophages apparalt donc être un
moyen de réduire la concentration en composés dangereux pour l'environnement tout en
maintenant la même activité désinfectante envers Listeria monocytogenes.

L'effet synergique observé des listériaphages et de QUATAL montre donc une voie d'accés
prometteuse dans l'amélioration du niveau de destruction.

Mais, des travaux supplémentaires doivent être faits pour optimiser les conditions physi-
ques et chimiques et améliorer l'efficacité de cette nouvelle approche de biodésinfection.

- les antibiotiques : Listeria monocytogenes est sensible à de nombreux antibio-

tiques notamment la pénicilline G, l'ampicilline et l'amoxicilline.

Peu de résistance a été démontrée.

Listeria monocytogenes n'est pas modifiée par la dessiccation et par la lumière.

Elle cultive en présence de 40 % de bile, de 0,5 % de tellurite de potassium, de

polymyxine et d'acide nalidixique mais pas en présence de citrate de sodium.

L'adjonction de glucose (443) favorise la culture.

En effet, toutes les espèces se développent en présence de glucose et par voie aérobie
forment de l'acide lactique et/ou de l'acide acétique alors que la voie anaérobie ne donne
lieu qu'à la formation d'acide acétique.

Au cours de l'incubation aérobie, de petites quantités d'acide isovalérique, d'acide 2-

hydroxyisovalérique et des traces d'acide isobutyrique sont formées.

L'ajout de leucine stimule la formation d'acide isovalérique.

 -32-

Les fermentations anaérobies du glucose sont suivies de 60 à 80 % de lyse cellulaire

mais celle-ci est moins importante en condition aérobie.

Par voie anaérobie, seuls les hexoses et les pentoses favorisent la croissance tandis que
par voie aérobie, le maltose et le lactose favorisent la croissance de certaines souches mais
le saccharose ne favorise pas la croissance de l'ensemble des souches.

Usteria grayi et Listeria murrayi utilisent les galactose et glucose pour leur croissance
alors que Listeria monocytogenes et Listeria innocua n'utilisent que le glucose.

La glucosamine, la N-acétylglucosamine et l'acide N-acétyl muranique favorisent les

croissances aérobie et anaérobie, tout comme le glucose et leur présence stimule l'utilisa-
tion du lactose par les souches "lactose-négatives".

La croissance en présence de N-acétyl-glucosamine et d'acide N-acétyl muranique,

composés des parois cellulaires bactériennes et fongiques, suggère que la digestion des
bactéries et des champignons présents dans les aliments peut permettre la colonisation et
la survie de Listeria monocytogenes dans ces aliments en raison de la capacité de Listeria
monocytogenes à utiliser le tréhalose et le cellobiose des champignons.

Le glucose, la caséine, la chitine et les parois cellulaires bactériennes (Lactococcus lac-

tis) permettent la survie.

Il a été suggéré que Listeria monocytogenes puisse digérer les parois cellulaires de la
microflore secondaire et obtenir le carbone et l'énergie durant la colonisation des aliments.

L'étude des besoins nutritionnels et métaboliques de Listeria monocytogenes

montre que les acides aminés tels que la leucine, l'isoleucine, la valine et la cystéine sont
indispensables et que la présence d'ions Fe2+, Mg 2+, Ca 2+ et l'adjonction de thioglycolate
sont nécessaires (456).

Sur gélose nutritive, les colonies sont rondes, lisses, translucides, petites (moins
de 1 mm de diamètre), dites smooth mais après quelques jours elles s'élargissent, s'opaci-
fient (type rough).
 -33-

La méthode de HENRY (261) en transillumination oblique permet d'observer des colo-

nies de coloration bleu-vert.

Sur gélose au sang, les colonies sont lisses, légèrement bombées et présentent
une zone d'hémolyse de type ~·

En milieu liquide, Listeria donne un trouble intense et homogène.

VI. STRUCTURE ANTIGENIQUE. (336) (Tableaux IV et V)

En 1935, SEASTONE puis JULANIELLE et PONS ont divisé le genre Listeria en

deux groupes sérologiques : le type 1 isolé chez les rongeurs et le type Il isolé chez les
mammifères.

En 1940, PATERSON l'a divisé en quatre types sérologiques en se basant sur

l'étude des antigènes somatiques 0 et flagellaires H ; les types 1 , 3 et 4 diffèrent par l'anti-
gène 0 et le type 2 a un antigène H différent.

Enfin, SEELIGER (505) (506) et DONKER-VOET (147) ont complété ce schéma

antigénique par l'introduction de nouveaux types pour aboutir à la classification actuelle.

Les acides téichoïques de la paroi représentent les antigènes somatiques 0 au nombre

de 15 et numérotés de 1à XV.

Les cils confèrent à la bactérie une propriété antigénique H dont 5 antigènes ont été
individualisés et auxquels on attribue les lettres A, B, C, D, E.

La combinaison des deux types antigéniques 0 et H définit le sérovar complet de la sou-

che.

On distingue actuellement 18 sérovars à savoir 1/2 (a, b, c), 3 (a, b, c), 4 (a, ab, b, c, d,
e, f, g), 5, 6 (a, b), 7 dont certains sont spécifiques d'une espèce donnée comme le sérovar
5 qui est spécifique de Listeria ivanovii.

L'antigène flagellaire E est spécifique de Listeria grayi et Listeria murrayi.

 -34-

Les sérovars 1/2a, 1/2b et surtout 4b sont le plus souvent rencontrés en France chez
l'homme.

Il n'y a pas de rapport entre un sérovar particulier et son origine géographique.

Des antigènes communs existent entre Listeria, Staphylococcus aureus, Streptococcus

faecalis et Bacillus.

Ce sérotypage est réalisé par agglutination sur lame au moyen d'antisérums spé-
cifiques et complété du lysotypage.

Le gêne flaA (152) codant pour la protéine flagellaire de Listeria monocytogenes a

été isolé en utilisant un anticorps monoclonal spécifique de flagelle.

L'analyse de la séquence ADN d'un clone positif révèle la présence d'une zone de lec-
ture ouverte de 287 acides aminés de masse moléculaire 30,4 kDa.

La comparaison de cette séquence avec les flagelles d'autres bactéries montre un degré
significatif d'homologie aux extrémités N et C de la protéine.

L'ARNm flagellaire a une taille de 1 kb, taille attendue pour un ARNm monocistronique
et l'expression dépendante de la température des flagelles est régulée au niveau transcrip-
tionnel.
 -35-

Tableau IV : Sérovars de Listeria monocytogenes et des espèces voisines (506).

Désignation
Antigenes 0 Antigènes H
Paterson Seeliger et
Oonker· Voet
112· a (Ill) A 8
1/2 b (Ill) A B C
2 1/2 c (Ill) B D

3 3 a (Ill) IV A B
3 b (Ill) IV (Xli) (Xlii) A B C
3 c (Ill) IV (Xli) (Xlii) B D

4 4 a (Ill) (V) Vil IX A B c

4 ab (Ill) v VI Vil IX x A B c
4 b (Ill) v VI A B c
4 c (Ill) v VIl A 8 c
4 d (Ill) M VI VIII A B c
4 e (Ill) v VI (VIII) (IX) A B c ~

l.isteria tvanovii 5 (Ill) (V) VI (VIII) x A B c

7? (Ill) Xli Xlii A B c '

Usteria mnocu8lal 6 a(41) (Ill) v (VI) (VIl) (IX) xv A B c

6 b(4 g) (Ill) (V) (VI) (VIl) IX x. Xl A B c
M. grayi subsp grayi (Ill) Xli XIV E
M. gra';'l subsp muna';'l (Ill) Xli XIV E
lai D"IUIIIIS combinlisotiS sont CllllllUes.

Tableau V : Répartition des différents sérovars.

l!.mgnoc:x;:togenes L. i va novi i I.. innocug L.welshime;ri ;w. seel,ige;ri l.!,mY;t;tâ:X:i

L,g;ra:x:i

composition
serovar 1/2 (a,b,c) 6 (a,b) 1/2b antigénique
3 (a,b, c) 5 4 (ab) 6 (a,b) 4 (c,d) identique
4 (a,ab,b,c,d,e) S.nd 6b mais diffé-
7 S.nd rent des
autres L.

s.nd sérotype non déterminé

 -36-

VIl. BACTERIOCYNOTYPIE. (336)

Listeria monocytogenes élabore des bactériocines appelées monocines de HA-

MON (122) (240) (326) (427) ; cela permet d'envisager une bactériocynotypie.

Ces monocines sont également actives sur d'autres souches de Listeria, sur certains
Bacillus aureus, Bacillus mycoïdes et sur certains Microcoques.

Des bactériophages·(279) (539), isolés de souches lysogènes, sont utilisés pour la

lysotypie (12) (13) (14) (426) (470) (474) (475).

Un lot de 29 bactériophages a permis de reconnaitre deç1ysotypes (370) (371).

Cette méthode se révèle être efficace pour déterminer l'origine de certains foyers épi-
démiques.

La lysotypie doit être précédée de la sérotypie car les phages ont une activité lytique
spécifique de sérovar.

Malheureusement, elle n'a pas permis d'établir de relation phagovar - sérovar - hôte -
origine géographique.
 -37-

3ème PARTIE:

EPIDEMIOLOGIE
 -38-

1. CARACTERISTIQUES GENERALES. (477)

1. 1. INCIDENCE. (463) (476)

La listériose est une maladie relativement peu fréquente avec 10 à 15 cas par mil-
lion d'habitants.

En 1984, l'analyse de GOULET et coll. (228) a permis d'estimer à 1, 13 pour

100000 habitants la fréquence de cette maladie alors que l'étude de RALOVICH (457) l'es-
time à 0,327.

Mais depuis 1986, il semblerait que l'incidence fléchisse et ceci peut-être grâce
aux efforts des réseaux de surveillance et de prévention ; cela est encore trop tôt pour l'af-
firmer.

En effet, le nombre de cas pour 100000 habitants était de 2 en 1986, de 1, 6 en 1987,

de 1,5 en 1988 et 1989 et de 1,1 en 1990.

Ce fléchissement concerne essentiellement les formes materna-néonatales dont l'inci-

dence est passée de 67 en 1986 à 30 en 1990.

Mais les femmes enceintes sont toujours une cible privilégiée puisqu'elles ont un risque
de développer la maladie multiplié par 40 à 75 par rapport au reste de la population.

L'incidence des formes non materna-fœtales a peu diminué puisqu'elle est passée de 1
à 0,74 entre 1986 et 1990.

Par contre, l'incidence est particulièrement élevée chez les sujets immunodéprimés avec
13 pour les cancéreux et 200 pour les transplantés en 1987 soit des risques multipliés res-
pectivement par 17 et 250 par rapport à la population générale.

Chez les sujets sans immunodépression connue, l'incidence varie de 0,2 à 0,4 en 1987
et 1988.
 -39-

Elle augmente avec l'ège avec 1,4 chez les sujets ègés de 65 ans et plus mais reste
beaucoup plus faible que dans les autres catégories à risque.

Aux Etats-Unis, elle était de 0, 7 cas pour 100000 habitants en 1986 et 0, 7 4 entre
1989 et 1990.

Au Canada, elle varie de 0,17 à 0,23 selon les années entre 1987 et 1990.

Au Danemark, elle varie de 0,2 à 0,8 selon les années entre 1981 et 1990.

En Suisse, elle a chuté de 5 durant l'épidémie de 1983-1987 à 0,3 en 1990.

1. 2. MORTALITE. (477)

La listériose est l'infection d'origine alimentaire entachée de la plus forte létalité

avec un taux de 30 % environ.

Les séquelles neurologiques sont souvent à redouter chez les sujets ayant souffert
de méningite, de méninge-encéphalite ou surtout d'encéphalite.

Aux Etats-Unis, LUCHANSKI et coll. (352) ont signalé qu'entre 1973 et 1987, Lis-
teria monocytogenes a été la seconde cause de décès dûs aux infections à transmission
alimentaire derrière les Salmonelles (respectivement 25 et 32 %).

1. 3. DUREE D'INCUBATION. (463) (477)

Elle est variable et estimée entre 1 et 90 jours avec une médiane de 35 jours, soit
de 1 à plusieurs semaines.

Cela soulève à nouveau la possibilité que la maladie clinique soit déclenchée chez
un porteur de germes par une cause telle qu'une infection virale intercurrente.
 -40-

1. 4. DOSE INFECTANTE. (236) (477)

On ne sait pratiquement rien sur la dose minimale infectante et il n'y a pas non
plus d'étude quantitative fiable sur la corrélation entre la quantité de nourriture contaminée
absorbée et le risque infectieux.

Il est vraisemblable qu'elle dépende de la réceptivité de l'hôte (463) et de la nature

même de l'aliment. Cela reste à vérifier.

1. 5. FACTEURS DE RECEPTIVITE.

La listériose résulte de plusieurs facteurs à savoir :

- le sexe ; on peut effectivement observer :

. une faible prédominance de garçons touchés de la naissance à 1 an,

. une égalité chez les enfants et les adolescents,

. peu d'hommes du fait de la listériose materna-fœtale entre 20 et 40 ans,

. deux périodes à partir de 41 ans :

-une prédominance d'hommes de 41 à 70 ans,

-une égalité de 71 à 100 ans .

. le pic des nouveau-nés et nourrissons reste de loin le plus important,

. la listériose maternelle est prédominante de 21 à 40 ans,

. la listériose de l'enfant et de l'adolescent reste rare de 2 à 20 ans,

 - 41 -

. la listériose de l'adulte et du sujet âgé reste fréquente et d'autant plus que

l'âge augmente.

La néonatalité et la vieillesse majorent la réceptivité et la gravité de l'infection à

cause de l'immaturité immunologique du nouveau-né et de la diminution des moyens de
défense des sujets vieillissants.

- les conditions de vie :

. l'habitat : la maladie semble plus fréquente chez les personnes dont les
conditions d'habitat et d'hygiène sont précaires,

. la profession :certaines professions semblent plus exposées à savoir

les vétérinaires, les éleveurs, les tanneurs, les agriculteurs, les éboueurs,
les gardes-chasse, les équarrisseurs et les employés d'abattoirs, de
fromageries, de cuisine.

- le rOie du terrain :

. au cours des états physiologiques : la grossesse est un facteur favorisant

mais pas de gravité chez la femme puisque peu de méningites ont été
enregistrées chez la femme enceinte.

En effet, la grossesse, par les profondes modifications métaboliques et endocriniennes

qu'elle entraYne dans l'organisme, peut devenir un terrain favorisant le développement de
Listeria monocytogenes ; de plus, le placenta est sans doute un foyer favorable à la multi-
plication bactérienne.

La contamination peut se produire pendant la grossesse ou même lui être antérieure et

c'est à la faveur de la gravidité que la virulence de Listeria monocytogenes, présente à l'état
quiescent dans le tractus génital, s'exalterait.

. au cours des états pathologiques : l'existence d'une maladie antérieure ou

d'une infection peut favoriser l'éclosion d'une listériose et contribuer à sa
gravité.
 -42-

-les affections hépatiques: l'éthylisme semble être un facteur non négli-

geable du fait de l'hypochlorhydrie présente chez les alcooliques (156)
d'où leur réceptivité particulière,

-les maladies métaboliques comme le diabète (419),

-le SIDA,

-les infections bactériennes: des bactéries pathogènes comme Mycobac-

terium tuberculosis, Salmonella typhimurium et les espèces apparte-
nant au genre Cephalosporium peuvent sensibiliser un sujet à Listeria
monocytogenes.

-les infections virales: la listériose peut être la maladie de sortie de cer-

taines viroses comme la grippe, la varicelle, la rougeole ou l'hépatite
virale (552).

Elle est une complication de la mononucléose infectieuse (322) et non l'agent respon-
sable comme on l'avait cru au départ.

- les hémopathies, réticulopathies et tumeurs bégnines diminuent la résis-

tance à Listeria monocytogenes.

- le rôle de certaines thérapeutiques :

. la corticothérapie exalte la virulence de Listeria monocytogenes (234),

. les malades traités par les immunodépresseurs au cours de greffes

rénales sont très sensibles aux bactéries opportunistes dont Listeria
monocytogenes (415),

. les radiations ionisantes ont une incidence sur l'apparition des listé-
rioses (534),
 -43-

. la chlortétracycline administrée au cobaye entrafne une modification

de la flore intestinale d'où la prolifération de Listeria monocytogenes.

1. 6. REPARTITION. (Annexe 11)

1. 6. 1. DANS L'ESPACE GEOGRAPHIQUE.

La listériose semble plus fréquente dans les pays industrialisés (Europe, Amérique
du Nord) que dans les régions tropicales.

Par contre, on ne sait pas si cette maladie existe mais n'est pas diagnostiquée ou
si elle n'existe pas dans les pays en voie de développement.

En Allemagne, elle appartient aux maladies à déclaration obligatoire.

En France, la répartition géographique étudiée par le Centre National de Réfé-

rence des Listeria de Nantes montre que l'Ile de France et Rhône-Alpes, régions les plus
peuplées, restent les principaux fournisseurs de souches.

Mais, l'examen de la répartition des principaux sérovars parmi les souches isolées dans
les diverses régions montre que celle-ci n'est pas homogène avec une prédominance gé-
nérale du sérovar 4b.

1. 6. 2. DANS LE TEMPS.

Il semble que la listériose obéisse à des fluctuations périodiques :

- selon les saisons : on observe des prédominances printanières et automnales.

- selon les années : une certaine périodicité a été décrite aux Etats-Unis et en
Hongrie tous les 2 à 4 ans.

Il est à noter que depuis 1985, une augmentation notable de la réception des sou-
ches au Centre de Référence des Listeria est apparue avec 408 souches en 1985, 1276 en
1986, 1719 en 1987, 3103 en 1988.
 -44-

Par contre, on observe une diminuation du nombre de souches à partir de 1989 avec
1713 en 1989, 1647 en 1990 et 1455 en 1991 ; ceci est dO à la saturation des capacités
du Centre donc seul le nombre de souches traitées est donné mais le Centre en a reçues
beaucoup plus.

En 1992, le Centre a dO faire face à un accroissement des envois de souches du fait de

l'épidémie ; il en a traitées 2060.

Il. RESERVOIRS.

Pendant longtemps, l'épidémiologie de la maladie s'est résumée au schéma sim-

ple d'une anthropozoonose ; le règne animal représentant dans ce cas le seul réservoir.

Animaux sauvages 1 J Animaux domestiques

~Homme .-----------

L'animal infecté peut être source de contamination par les excréta (urine et fèces),
par les sécrétions des muqueuses atteintes (génitales, conjonctivales, rhinopharyngées)
. mais aussi par les produits alimentaires.

De nos jours, la listériose ne peut plus être considérée comme une zoonose ; on
considère donc d'autres sources de contamination.

Il. 1. L"ENVIRONNEMENT.

Du fait de la grande résistance de Listeria monocytogenes aux agents biologiques,

chimiques et physiques, le milieu extérieur constitue un réservoir important où la survie de
Listeria monocytogenes est étonnante.
 -45-

Listeria monocytogenes est largement distribuée dans l'environnement puisqu'on

la retrouve dans l'eau de rivière ou d'effluents, la paille, les produits d'ensilage, le fumier, les
plantes, le fourrage, la terre, les boues, les poussières, probablement contaminés par les
déjections d'origine animale.

L'étude de COX et coll. (119) montre que la contamination de l'environnement

peut être hiérarchisée comme suit :

- égouts, siphons de sol, orifices d'évacuation des eaux résiduaires : 54 %,

- eaux stagnantes, condensats : 40 %,
- sols : 45 %,
- déchets : 33 %,
- matériels : 19 %,
-autres: 17 %.

La charge est d'autant plus importante que le milieu est humide et qu'il subsiste
des nutriments issus d'un nettoyage incorrect.

En ce qui concerne la contamination d'un environnement domestique, il ressort

d'une étude faite aux Pays-Bas que la contamination touche 17 % des lavettes, 6 o/o des
sacs à poussières des aspirateurs, 3 o/o des parois des compartiments légumes de réfrigé-
rateur (97).

Listeria monocytogenes est présente dans le sol, mais il n'a pas été prouvé qu'elle
pouvait s'y multiplier.

Une question reste en suspens ; Listeria monocytogenes est-elle un hôte normal

de la flore tellurique ou bien y a t'elle été introduite par les réservoirs humains ou animaux ?
 -46-

1. 2. LES DENREES ALIMENTAIRES.

L'ensemble des aliments peut être contaminé pour deux raisons ; d'une part, Lis-
teria est un germe ubiquitaire largement répandu dans l'environnement, qu'il s'agisse de la
terre, de la végétation ou encore des eaux d'égouts mais aussi dans le contenu intestinal et
d'autre part, elle est résistante aux conditions du milieu extérieur et plus particulièrement,
elle est capable de se multiplier à des températures aussi basses que 4°C.

Sont contaminés :

- les œufs : la contamination peut s'effectuer au cours de la septicémie listé-

rienne du poulet, accompagnée de lésions nécrotiques de l'oviducte ; ils sont
un bon vecteur.

KAMPELMACHER (294) a isolé Listeria monocytogenes de 29 % des fèces d'individus

apparemment sains, travaillant dans un élevage industriel de production d'œufs.

- le lait et les produits laitiers constituent un réservoir important : GRAY (336) a

rapporté que sur 652 vaches ayant eu un avortement listérien, 53 avaient
éliminé des bacilles dans le lait.

De plus, la localisation intra-mammaire de Listeria monocytogenes peut passer inapper-

çue sans manifestation inflammatoire organique.

C'est ainsi que des fromages ont été incriminés dans des épisodes de listériose.

- les viandes, salaisons et carcasses de volailles et d'autres animaux sont con-

sidérés comme des vecteurs de listériose car les animaux en cause peuvent
héberger Listeria dans les cas de septicémie avec localisation pluriviscérale.
 -47-

Il. 3. LES MALADES.

Presque toutes les sécrétions ou excrétions des malades à savoir les liquides fœ-
ta-maternels, le LCR dans les méninges, les urines, les fèces souvent bacillifères, les sé-
crétions des muqueuses conjonctivales et rhinopharyngées mais aussi les lésions cutanées
de l'enfant et les placentas représentent un danger en tant que sources probables de con-
tamination.

Il. 4. LES PORTEURS DE GERMES CHRONIQUES, CONVALESCENTS OU

SAINS.

Des femmes sous traitement et présentant des avortements listériens ont éliminé
des Listeria pendant au moins 20 semaines (460).

Certains sujets atteints de formes atypiques constituent un réservoir important.

On dénombre également beaucoup de porteurs sains comme des femmes dont la

grossesse sert de révélateur à une listériose inapparente, du personnel d'abattoir, de fabri-
cation de produits de charcuterie et de laboratoires.

Ceci est dû au fait que Listeria monocytogenes peut vivre à l'état commensal dans le
. tube digestif, le rhinopharynx et l'appareil génital.

Le portage sain chez l'homme varie de 0,6 à 44% des sujets examinés.

Des animaux sains, non seulement domestiques (ovins, bovins, porcs, poulets)
mais aussi sauvages sont également porteurs de germes dans les sécrétions nasales et les
matières fécales ; le taux de portage est de 10 à 30 %.

La listériose ne serait donc pas une anthropozoonose comme on l'avait cru mais
une maladie hydrotellurique ou une sapronose du fait du caractère ubiquitaire et saprophyte
de ce germe facultativement pathogène.
 -48-

Ill. MODES DE CONTAMINATION. (Schémas 1, 2, 3)

Ils sont au nombre de deux. (386)

Ill. 1. CONTAMINATION DIRECTE.

Il s'agit du mode le moins fréquent car ceci suppose que la listériose soit une ma-
ladie contagieuse avec transmission par contact direct avec l'individu malade.

Ill. 1. 1. CONTAGION INTER HUMAINE.

C'est le cas de la listériose congénitale où la transmission est verticale et se fait

selon quatre mécanismes :

- la voie hématogène transplacentaire à la suite de l'infection de la mère dans

les mois précédant l'accouchement.

Dans ce cas, Listeria monocytogenes gagne le placenta puis le fœtus par la voie san-
guine et entraîne la naissance d'un enfant prématuré septicémique.

- l'origine endométriale est la plus fréquente ; le point de départ est un abcès

rétroplacentaire pouvant rester quiescent ou se compliquer d'une placentite
miliaire ce qui entraTne une infection grave du fœtus ou du nouveau né.

- la voie ascendante transmembranaire avec un point de départ cervico-vaginal

puis Listeria monocytogenes pénètre dans la cavité amniotique que les
membranes soient rompues ou non.

- la contamination durant l'accouchement lors de la traversée des voies génita-

les contaminées ou par déglutition ou inhalation de matières virulentes au
cours de l'expulsion.

WENKEBACH (583) a rapporté un cas de contamination vénérienne où Listeria

monocytogenes a été isolée de l'urètre de cinq hommes ayant eu une partenaire commune.
 -49-

Des cas d'infections nosocomiales en maternité et nourricerie ont été rapportés ;

dans ce cas, la listériose prend le visage d'une infection croisée néonatale (323).

Le schéma est le suivant : un premier enfant naft d'emblée très infecté et un deuxième
enfant né quelques heures avant ou après le premier manifeste, dans les jours qui suivent
sa naissance, les signes d'une listériose méningée.

Dans ce type d'infection, les modes de contamination sont de deux ordres :

- une transmission directe par contact entre nouveau-nés (couveuse de transport

commune), par contact entre une mère infectée et un nouveau-né sain ou par les
actes médicaux (accouchement dans la même salle, enfants soignés dans la
même nourricerie),

- une transmission indirecte par le matériel utilisé en salle de travail (sonde de dés-
obstruction ou d'aspiration à usages multiples, thermomètre non désinfecté, cou-
veuse).

Une infection nosocomiale à Listeria monocytogenes 4b est survenue en janvier 1991

dans une maternité de Grenoble (280).

Les trois enfants impliqués sont nés dans un intervalle de 24 h.

Le prématuré à l'origine de la contamination était asymptomatique.

Deux autres nouveau-nés sans risque infectieux périnatal ont présenté une méningite,
l'un à 5 jours de vie à la maternité, l'autre à 11 jours de vie.

Les trois souches isolées présentaient les mêmes sérovar et lysovar.

L'enquête épidémiologique a fait suspecter une contamination en salle de prise en

charge néonatale et lors des soins aux enfants.
 -50-

La transmission s'est effectuée en deux étapes : une première au moment de l'accou-

chement ou juste en post-partum entre un enfant infecté et un autre sans risque infectieux;
une deuxième entre ce deuxième enfant incubant sa listériose en cours d'hospitalisation,
devenant porteur, et un troisième contaminé en fin d'hospitalisation et incubant sa listériose
à son retour à domicile.

Le respect des consignes d'hygiène à tous les stades de l'hospitalisation est donc indis-
pensable pour éviter ce genre d'infection.

Ill. 1. 2. CONTAGION INTER ANIMALE.

Il s'agit de la listériose congénitale animale et d'enzootie d'amplitude variable chez

les animaux vivant en groupe comme la méninge-encéphalite des moutons pouvant affecter
1 à 2 % de l'effectif et la listériose des poulets pouvant atteindre 30 % de l'élevage.

Ill. 1. 3. TRANSMISSION DE L'ANIMAL A L'HOMME.

Elle est démontrée chez des ouvriers agricoles en contact avec des avortons et
des membranes fœtales lors de la parturition ou chez des vétérinaires qui ont effectué des
manœuvres obstétricales ou pratiqué des avortements.

Ill. 2. CONTAMINATION INDIRECTE.

C'est le mode le plus fréquent.

L'homme peut se contaminer par :

- le milieu extérieur : sol, poussière, fumier,

- les sécrétions et excrétions animales : membranes fœtales, fèces,

-les productions animales et les aliments contaminés; c'est la transmission

alimentaire ; différents aliments ont été la source d'épidémies.
 -51 -

Schéma 1 : Schéma épidémiologique des listérioses selon KUBASIAK (315).

milieu ext6rieur
contaminé animaux infectés
(sol, eau)

rwtur du sol
oisea~x. insectes ---------elimai
'::.1 terrains listériologiqucs

POLU.JfiON \'EGETALE

l
sécrétions, massive: faible : légtnnes excrétions
excrétions ensilage

r PORTAGE DIGESTIF

circonstances, terrains favorables

A"ill'-1AL
( LISTERIOSE
J IIO>f>IE )

( J
cr:ontagion "-contamination
inter-animale inter-humaine

contamin.ati.(!Jn
directe ou indirecte
 -52-

Schéma 2 : Schéma épidémiologique des listérioses d'après HUMBERT et AUBERTIN

(274).

contact dnect (cutané ou muqueux) : rare

·--·----l
1
sécrétions et excrétions 1
• utéro-vaginales
• membranes fœtales
• fecès en constances

\
lavorosantes

animal sauvage
ou domestique
• malade
1 milieu
extérieur
• sol
homme
• port.eur
malade

• porteur convalescent • tumrer • sarn

• porteur sam • poussrr?res
foetus

J
nouveau-né
1
contammatron

l____
1
g~nllale

contamrnation drgestrve œufs. lall. vrande) : lréquence)

----····-··
----------··-····-
 -53-

Schéma 3 : Cycle épidémiologique d'après PEREZ (436).

'

/ l
1
 -54-

IV. EVOLUTION. (477)

Les modifications du mode de vie survenue depuis 1960, caractérisées notam-

ment par un développement sans précédent de la chaîne du froid qui favorise non seule-
ment la survie mais également la croissance de Listeria monocytogenes dans les denrées
alimentaires sont incontestablement responsables, dans une grande proportion, du nombre
de cas de listériose.

De plus, l'augmentation du nombre de cas de listériose observée depuis 1960 est

vraisemblablement liée en partie à un meilleur recensement du nombre de cas.

IV. 1. SURVEILLANCE.

De nombreux pays industrialisés ont instauré des systèmes de surveillance qui ont
pour mission :

- d'évaluer l'incidence annuelle,

- de détecter la survenue d'épidémies,

- de rechercher l'origine alimentaire de ces infections.

IV. 1. 1. EN FRANCE. (Annexe Ill)

En France, la surveillance est assurée par l'intrication de trois Ministères ; Santé,

Agriculture et Finances et de deux Centres de Référence : celui de Nantes qui assure la
sérotypie des souches et celui de Paris (Institut Pasteur) qui effectue la lysotypie.

Elle se fait ainsi :

-les bactériologistes signalent les cas au médecin de la DDASS dès l'isolement

d'une Usteria monocytogenes et envoient la souche pour sérotypage et lyso-
typage aux deux Centres concernés.
 -55-

-le médecin de la DDASS réalise l'enquête cas-témoin rétrospectivement por-

tant sur l'alimentation du mois précédant la date de l'isolement de Listeria
monocytogenes.

Deux témoins sont appariés au malade sur l'ège, le sexe, le lieu de domicile et le type de
pathologie sous-jacente ou sur le terme de la grossesse.

- la DDASS prévient les services vétérinaires (DSV) et les services de la ré-

pression des fraudes (DDCCRF).

- la DSV réalise des prélèvements au domicile du malade et la DDCCRF dans

les magasins d'alimentation où le malade effectue habituellement ses achats.

Le résultat du typage est communiqué secondairement à la DDASS.

Les informations collectées (questionnaires, résultats de prélèvements microbiolo-

giques) sont analysées et recoupées au niveau d'une cellule de crise (Laboratoire National
de la Santé, Centres Nationaux de Référence, Direction Générale de la Santé, Direction
Générale de l'Alimentation, Direction Générale de la Consommation, de la Concurrence et
de la Répression des Fraudes) afin d'orienter les investigations ultérieures.

IV.1. 2. DANS LES AUTRES PAYS.

La surveillance est pratiquée :

- en Europe : Allemagne, Belgique, Bulgarie, Danemark, Espagne, Finlande,

Grande-Bretagne, Italie, Pays-Bas, Suède, Suisse et Yougoslavie.

- en Amérique du Nord et du Sud : Argentine, Brésil, Canada et Etats-Unis.

- en Océanie : Australie et Nouvelle-Zélande.

- en Afrique et en Asie : Pakistan et Afrique du Sud.

 -56-

La plupart des pays envoient leurs souches à leur Centre de Référence pour le
sérotypage, quand celui-ci existe ; le lysotypage étant effectué à Paris à l'Institut Pasteur
pour certains d'entre eux ; les autres ayant leur propres structures.

IV. 2. CAS SPORADIQUES. (476)

La listériose évolue essentiellement sous forme de cas sporadiques ; dans ce cas,

il est difficile d'en identifier l'origine.

Mais, certains aliments ont été incriminés comme des fromages, des produits car-
nés (poulet insuffisamment cuit, dinde cuite au micro-ondes, hot dog cru, saucisses), des
champignons salés, une tablette de luzerne ou des poissons.

Ce furent les rares cas où une denrée contaminée par la même souche que celle
ayant provoqué l'infection a pu être retrouvée dans le réfrigérateur du patient.

Il ne faut pas négliger une contamination croisée à l'intérieur du réfrigérateur ce

qui rend l'identification de l'aliment encore plus difficile.

En France, HUMBERT et coll. (275) n'ont recensé que 1021 cas entre 1970 et
1975 alors que GOULET et coll. (229) en ont recensés 630 en 1984 et 811 en 1986.

IV. 3. EPIDEMIES. (476) (477)

IV. 3. 1. LISTERIOSES D'ORIGINE ALIMENTAIRE. (Tableaux VI, VIl, VIII)

Elles sont assez anciennes puisque la première décrite dans la littérature a été
observée en 1960-1961 en Allemagne Fédérale avec 81 cas.

Les épidémies de Halle (Allemagne Démocratique) en 1986 et d'Anjou en 1975-

1976 ont été très importantes puisqu'on a recensé respectivement 281 et 167 cas (126
formes fcato-maternelles et néonatales et 41 chez l'adulte).
 -57-

Celle d'Anjou avait duré une vingtaine de mois et avait fait l'objet d'investigations appro-
fondies incluant notamment la recherche de Listeria dans le lait ; malgré cela, la source n'a
pas pu être identifiée.

Ces épidémies semblent de plus en plus fréquemment observées notamment sur

le continent nord-américain où 6 épisodes ont été décrits depuis 1979 ; on peut citer l'épi-
démie de 1981 au Canada où une salade de chou (coleslaw) provenant d'une entreprise
locale et distribuée à travers toute les Maritimes a été incriminée comme véhicule. Les
choux avaient été contaminés avant leur arrivée à l'usine de traitement par suite de la fertili-
sation des plants au moyen de fumier (lisier) provenant d'un troupeau de moutons porteurs
de Listeria monocytogenes.

Citons aussi les épidémies de 1979 à Boston (Massachusets) impliquant des crudités,
de 1 983 à Boston due à la consommation de lait entier ou à 2 % de matière grasse pas-
teurisé, de 1975 à Los Angeles (Californie) où l'aliment contaminant était un fromage frais
de type mexicain consommé par la communauté hispano-mexicaine fait avec du lait pas-
teurisé auquel on avait ajouté du lait cru.

En Europe, l'infection jusqu'alors la plus retentissante a été observée en Suisse

dans le canton de Vaud avec 122 cas de 1983 à 1 987.

C'est seulement le 20 Septembre 1987 que le coupable fut désigné ; il s'agissait du Va-
cherin suisse Mont d'Or.

Il fut alors interdit à la vente et à la production, ce qui déclencha une psychose en Suisse.

Le stock entier de fromage fut alors détruit, les 11 caves d'affinage artisanal du canton de
Vaud produisant à lui seul la totalité du fromage soit 800 à 1000 tonnes/an fermées et la
production complètement arrêtée.

En France, aucune épidémie importante n'a été observée depuis celle d'Anjou en
1975-1 976 jusqu'à celle de 1 992 où 279 cas ont été répertoriés avec 63 décès et 22 avor-
tements (230) (Annexe IV).
 -58-

Cette bouffée épidémique se situe au deuxième rang par le nombre de cas parmi celles
décrites depuis 1980.

Elle est due à une souche de sérovar 4b et de lysovar

2389/2425/327 4/2671/47/108/340.

Après une enquête cas-témoin portant sur plusieurs types d'aliments (charcuterie et
fromage), le responsable a pu être identifié ; il s'agit de la langue de porc en gelée vendue
à la coupe dans les rayons de charcuterie.

Depuis le 1 Janvier 1993, aucun cas n'a été recensé ; l'épidémie semble donc terminée.

Cette épidémie a montré que des aliments jusqu'alors peu suspectés pouvaient être
contaminés et qu'il existe une contamination croisée des aliments à la coupe sur l'étal des
distributeurs.

Les pouvoirs publics ont alors préconisé des mesures de contrOle renforcées dans l'in-
dustrie agro-alimentaire ainsi que des mesures de prévention (hygiène alimentaire) desti-
nées aux personnes à risque.

Le bilan de cette épidémie est donnée en annexe (Annexe IV).

Durant l'été 1993, des rillettes bretonnes ont été à l'origine d'une nouvelle épidé-
mie de listériose de 33 cas dont 4 décès et 4 avortements.

IV. 3. 2. LISTERIOSES NOSOCOMIALES.

Elles sont presque uniquement limitées aux maternités, assez rares et essentiel-
lement causées par un problème d'hygiène.

Le premier cas a été rapporté en 1936.

Parmi les infections répertoriées, on peut citer celle du Costa Rica en 1990, les
deux du Canada en 1990 où un stéthoscope a été incriminé, celle de Suisse en 1990 et
celle de Grenoble en 1991 , laquelle a déjà été décrite précédemment.
 -59-

Tableau VI : Caractéristiques des principales épidémies de listériose humaine

(nombre de cas supérieur à 20).

Lieu i Date 1Nombre ls·

: de cas ! erovar • Origine

Europe 1

RFA 1Brème1 1960-61 1 81 -lb

1963 20 -lb
RDA !Halle! 1966 281 1/2
France 1Anjou 1 1975-76 1 167 -lb
RFA rBasse Saxe 1 1983 1 24 4b
Su1sse 1\'audl 1983-87 1 12:! -lb fromage
Autriche 1Linz 1 1986 20 l/2a
1
'
Amérique du :'llord ' 1
..
i
i
Canada 1Ne lie. Ecosse 1 ! 1981 41 -lb .. coles1aw
USA (Boston! ! 1979 23 -lb crudités'?
USA 1Houston1 1983 10 1/2b

.
USA !Boston 1 1983 49 -lb lair·~
USA iCalif~miel 1985 142 -lb fromage
USA 1Pennsylvanre1 1987 !1 36

Autres continents !
' i
Nelle. Zélande tAucklandl i1969 :!0 4b
1980 ,i 29
1
Wb
, 1981
; 1
rChristchurchl 18 -lb
Afrique du Sud (Johannesburg> 1 1977-78
1
14 -lb
! i
~ i ;

"' Souches de séro\·ars rarits.

Tableau VIl : Principales épidémies de listériose classées selon le nombre de cas.

Véhicule
Nombre
Lieu Date Durée alimentaire
de cas
majeur
Grande-Bretagne 1987-89 ~> 300 2 ans 1/2 Pâté
France 1992 279 10 mois Langue de porc
en gelée
France (Ouest) 1975-76 167~* 2 ans n. i.
USA (Californie) 1985 142* 7 mois 1/2 Fromage
Suisse (Vaud) 1983-87 122 4ans Fromage
Usa
(Massachusetts) 1983 49* 2mois Lait?
Canada
(Nv. Écosse) 1981 41* 6mois « Coleslaw »
n. i. : Non identifiée.
* Nombre total de cas, sans mention du nombre de cas épidémiques.
PAYS ET ANNEE DENREE MISE EN CAUSE NOMBRE DE CAS MORTALITE -4
Dl
a'
1 ii
DJ
CANADA, 1981 SALADE COMPOSEE 41 CAS 17 (24%) c

..~
USA, BOSTON, m
LAIT PASTEURISE
a:
"U
49 CAS 14 (29%)
1983 CD-
3
(i)
fi)
USA, CALIFORNIE FROMAGE FRAIS a.
86 CAS 29 (34%)
1985 " MEXICAIN "
(1)

!!
CD-
::::!.
0 0>
GRANDE BRETAGNE
- - --
fi) 0
FROMAGE A PATE MOLLE 1 CAS CD
1986

-
a.
0
::J

ë
::::!.
VACHERIN 92 CAS 29 (31 %) cc
SUISSE, 1983 ::r
(1)

!!!.

-
~r
SUISSE, 1987 VACHERIN 30 CAS 4 (13%) (1)
::J
Dl
~-

- - --
SUISSE, 1988
VACHERIN 1 CAS ~
(/)
c:
fi)
"U
aCD-
CD

~
 -61 -

4ème PARTIE:

PHYSIO-
PATHOLOGIE

1
 -62-

1. MECANISME DE LA MALADIE. (36) (37) (38) (39) (220) (306)

Listeria monocytogenes est un micro-organisme à multiplication intracellulaire fa-

cultative ; il se multiplie à l'intérieur des cellules y compris les macrophages de l'organisme
infecté.

Les bactéries peuvent ensuite passer d'une cellule à l'autre sans jamais ressortir dans le
milieu extracellulaire.

La porte d'entrée de l'infection chez l'homme est localisée aux voies aériennes su-
périeures dans les cas d'angines, de pharyngites et d'infections pseudogrippales et surtout
au tube digestif après absorption d'aliments contaminés (37).

Il est également possible que le germe atteigne le milieu gastro-intestinal par l'excrétion
biliaire (70).

Après franchissement de l'épithélium intestinal, les cellules M, cellules épithéliales

spécialisées de l'intestin, lesquelles ont des propriétés phagocytaires, pourraient servir de
porte d'entrée mais cela n'a pas encore été démontré.

De toute façon, les bactéries gagneraient le système lymphatique puis la circulation san-
guine où elles seraient immédiatement phagocytées par les macrophages résidents du
système réticula-endothélial, en particulier par les cellules de KÜPFFER du foie et par les
macrophages de la rate.

Depuis les travaux de MACKANESS (363), on sait que Listeria monocytogenes

peut se multiplier dans les phagocytes et créer des granulomes inflammatoires au contact
des endothéliums vasculaires, lesquels sont surtout constitués de polynucléaires et de ma-
crophages.

Si les défenses immunitaires ne peuvent pas contrôler l'infection, les bactéries

envahissent secondairement de nombreux organes en franchissant les endothéliums capil-
laires : le placenta, la peau, le système nerveux central.
 -63-

A l'heure actuelle, on ne sait pratiquement rien du mécanisme moléculaire du pro-

cessus d'invasion, ni du mécanisme du tropisme neure-méningé et fœto-placentaire ; en
revanche, le mécanisme de la croissance intracellulaire est actuellement en grande partie
élucidé grace à une approche génétique utilisant des transposons (205) (206) (296) (327)
(447).

Ces éléments génétiques mobiles, qui codent pour la résistance à un ou plusieurs anti-
biotiques sont capables de s'insérer sur le chromosome bactérien et ainsi d'activer un
gène.

Par exemple, le transposon Tn 1545 est capable de s'insérer dans le gène de structure
de l'hémolysine (38).

1. 1. PENETRATION DANS LES CELLULES.

La mise en contact de souches virulentes de Listeria monocytogenes avec des

cellules de l'hôte déclenche une internalisation rapide des bactéries dans les cellules par un
phénomène de phagocytose induite après intéraction spécifique entre un récepteur cellu-
laire et une protéine p60 (79) ancrée dans la membrane de Listeria monocytogenes appe-
lée internaline (207).

La phagocytose est réalisée par des phagocytes professionnels (monocytes, ma-

crophages) et des phagocytes dits non professionnels (cellules épithéliales, hépatocytes,
cellules endothéliales).

Cette protéine p60 est codée par le gène iap (protéine associée à l'invasion) (603).

Il s'agit d'un polypeptide de 484 acides aminés contenant une séquence signal de 27
acides aminés.

La protéine p60 mature possède un poids moléculaire de 47,5 kDa et un point isoélec-
trique de 9,3 donc il s'agit d'une protéine basique.

Ce poids moléculaire est inférieur au poids moléculaire déterminé par SOS-PAGE de 60

kDa.
 -64-

Les séquences d'acides aminés des protéines apparentées à p60 codées par des gè-
nes apparentés à iap de Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, Listeria
welshimeri et Listeria grayi indiquent des régions communes de près de 120 acides aminés
aux deux extrémités N et C alors que la portion médiane d'environ 240 acides aminés varie
considérablement selon les espèces.

Les protéines apparentées à p60 de Listeria grayi, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri et
Listeria welshimeri contiennent chacune une séquence de 54 acides aminés qui est ab-
sente dans les protéines p60 de Listeria monocytogenes et Listeria innocua.

Cette protéine contient un domaine consistant en 19 répétitions Thr-Asn présent uni-

quement chez Listeria monocytogenes et Listeria innocua ; seul l'arrangement de ces répé-
titions diffèrent chez ces deux espèces.

L'utilisation d'un antisérum polyclonal spécifique (anti p60) marqué indirectement de

façon immunomagnétique dirigé contre la protéine extracellulaire de 60 kDa de Listeria
monocytogenes purifiée sur gel suivie de la microscopie électronique a permis de montrer
que 25 o/o de cette protéine extracellulaire est associé à la surface cellulaire (483).

L'immunoblot des protéines extracellulaires avec des anticorps polyclonaux anti-p60

montre une réaction croisée avec des protéines de 58 à 67 kDa des souches de Listeria de
différents sérogroupes mais pas avec Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Listeria grayi et
· Listeria murrayi ni avec aucune souche d'autres bactéries d'autres genres (237) (483).

L'homologie observée entre p60 et les autres protéines est aussi remarquée avec une
protéine p54 d'Enterococcus faecium composée de 507 acides aminés et située à la sur-
face des cellules mais dont la fonction n'est pas connue.

La protéine p60 produite par Listeria monocytogenes montre une activité bactériolytique
détectée en gels dénaturant polyacrylamide contenant une souche de Micrococcus lyso-
deikticus tuée par la chaleur.

Du fait de cette activité hydrolase, p60 peut être impliquée dans l'invasion des cellules pha-
gocytiques non professsionnelles et avoir un rOie dans la division cellulaire.
 -65-

La protéine p60 peut être classée comme autolysine listérienne avec la N-acétyl murami-
dase, la N-acétylglucosaminidase, la N-acétyl muramyi-L-alanine amidase, l'endopeptidase,
la transglycosylase impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires importantes comme la
croissance de la paroi cellulaire, le turnover et la scission de septum.

La purification de la protéine p60 conduit à son aggrégation et à la perte de la rupture

des chatnes cellulaires et de l'activité bactériolytique.

Un résidu cystéine à l'extrémité C à la position 347 de p60 présent aussi dans toutes les
protéines apparentées à p60 des autres espèces Listeria semble être essentiel à son acti-
vité bactériolytique.

Le groupe sulfhydryle de cette unique cystéine est bloqué de façon réversible par le groupe
méthanethiol (CH3S) du M MTS ou méthyl méthanethiosulfonate.

La protéine majeure extracellulaire p60 de Listeria monocytogenes semble être néces-

saire à l'adhérence du micro-organisme aux fibroblastes de souris 3T6 et à l'invasion des
fibroblastes de souris 3T6 mais pas à l'adhérence aux cellules épithéliales humaines Caco-
2 donc l'adhérence de Listeria monocytogenes aux cellules épithéliales Caco-2 semble être
indépendante de p60 (402).

La propriété d'adhésion de p60 de Listeria monocytogenes est directement corrélée au

domaine de répétition.

Seule la protéine p60 de Listeria monocytogenes est capable de permettre aux mutants R
montrant une synthèse réduite de p60 d'adhérer aux fibroblastes 3T6 de souris.

L'expression du gène iap est contrôlée au niveau post-transcriptionnel (311) et non pas
par le gène PrfA.

Le gène iap ne peut pas être inactivé sans une perte de viabilité cellulaire, indiquant que
p60 est une protéine essentielle pour Listeria monocytogenes et probablement aussi pour
d'autres espèces de Listeria.
 -66-

1. 2. MULTIPLICATION CELLULAIRE.

Les bactéries phagocytées s'échappent rapidement du compartiment phagolyso-

somal et accèdent directement au cytoplasme des cellules où s'effectue la réplication bac-
térienne.

La sortie du phagolysosome est liée à la sécrétion d'une exotoxine, la listériolysine

0, protéine de 58 kDa active à pH 5,5.

Cette toxine détruit la m~mbrane vacuolaire, dont elle reconnait le cholestérol, qui en-
toure la bactérie dans le cytoplasme.

Cela permet à la bactérie, après pénétration dans une cellule, d'échapper à l'acidité et
aux protéases, sans oublier chez les macrophages la redoutable bouffée oxydative de la
vacuole de phagocytose.

Listeria peut alors se multiplier dans le cytoplasme moins hostile.

La bactérie se multiplie mais sans faire exploser les cellules qui l'abritent ; elle dé-
tourne à son profit leur cytosquelette pour se déplacer dans le cytoplasme.

1. 3. DISSEMINATION DE CELLULE A CELLULE.

Listeria monocytogenes est capable de polymériser l'actine dans le cytoplasme

cellulaire ; ce phénomène est essentiel pour la dissémination et indispensable à la viru-
lence.

Cette polymérisation est liée à la présence d'une protéine inductrice de la paroi de

Listeria monocytogenes, la protéine ActA , polypeptide de 90 kDa (309).
 -67-

Une étude de microscopie par immunofluorescence et de microscopie électronique utili-

sant un marquage immunomagnétique a montré que la protéine ActA était nécessaire à
l'intéraction des bactéries avec les composés du système microfilamentaire des cellules
hôtes pour générer un mouvement intra- et intercellulaire et à l'initiation de l'accumulation
d'actine par la bactérie et n'était apparemment pas directement impliqué dans la génération
de la queue d'actine contrairement-à ce qu'on pensait (410) (547) (548).

La localisation, la distribution et l'expression du polypeptide ActA dans Listeria monocy-

togenes ont été étudiées après isolement de cette protéine par chromatographie d'affinité.

Les résultats montrent que ActA est située à la surface des bactéries infectant les cellules à
tous les stades du cycle de l'infection et est facilement accessible aux anticorps ActA.

Listeria ivanovii est considérée comme pathogène pour les animaux mais a rarement été
associée aux infections humaines.

On a prétendu que Listeria ivanovii était déficiente en gène ActA qui dans Listeria monocy-
togenes code pour une protéine nécessaire à l'intéraction actine - cellules hôtes.

La microscopie à fluorescence et la microscopie électronique ont démontré que Listeria

ivanovii pouvait envahir les cellules de mammifères, lyser la membrane phagosomale, po-
lymériser l'actine des cellules hôtes, réorganiser l'actine pour former des queues et dissé-
miner de cellule à cellule (295).

Cependant, aucun ADN homologue au gène ActA ne peut être détecté par PCR.

De plus, Listeria ivanovii ne possède pas de protéine de surface de 90 kDa codée par ActA
dans Listeria monocytogenes.

Lorsque Listeria monocytogenes atteint la membrane de la cellule hôte, elle la dé-

forme, créant une protusion cellulaire pouvant mesurer plusieurs dizaines de fois la lon-
gueur de la bactérie.

Si cette protusion touche une autre cellule, elle s'y enfonce et y introduit la bactérie pa-
rasite emprisonnée dans une vacuole à double membrane.
 -68-

La sortie de cette vacuole se fait grâce à l'action d'une phospholipase C ou lécithinase

(561) sécrétée par la bactérie et digérant la phosphatidylcholine.

Listeria monocytogenes s'échappe alors de la double membrane qui . J'entoure et qui

provient de chacune des deux cellules impliquées.

Et le cycle recommence ...

Ce cycle est original gJ:ace à la protéine bactérienne qui altère, par un mécanisme
encore inconnu, le comportement de J'actine cellulaire.

La bactérie peut ainsi être propulsée à travers la cellule, poussée par la polymérisation
progressive d'une tralnée d'actine, semblable à la queue d'une comète (304).

La vidéomicroscopie a montré que la tête de cette comète ou bactérie se déplace aussi

vite que la queue d'actine se forme.

Ce cycle est schématisé ainsi :

 -69-

Il. FACTEURS DE VIRULENCE. (336)

La virulence de Listeria monocytogenes est attribuée à la sécrétion de diverses

substances extracellulaires comme l'hémolysine et les enzymes oxydatives comme la cata-
lase, la peroxydase, la superoxyde dismutase, qui permettent l'entrée et la survie dans les
macrophages et les cellules intestinales.

Il. 1. HE MOLYSINE. (336)

Elle apparart être le produit toxique majeur essentiel à la croissance et à la survie

intracellulaires (316) de la bactérie à l'intérieur des cellules phagocytiques où elle participe
à la lyse de la membrane phagolysosomale en formant des pores permettant ainsi l'accès
de la bactérie libre invasive au cytoplasme hôte (114).

Listeria monocytogenes est [:3-hémolytique sur gélose au sang de cheval ou de

mouton et le CAMP test décrit par CHRISTIE, ATKINS et MUNCH-PETERSEN (107) pour
les Streptocoques B montre qu'il existe une accentuation très nette de l'hémolyse au point
d'intersection des cultures en strie d'une souche de Staphylococcus aureus ou de Rhode-
coccus equi et de Listeria monocytogenes (469) (523).

Listeria ivanovii et Listeria seeligeri donnent également une hémolyse tandis que les
. autres Listeria ne sont pas hémolytiques (Tableau Ill).

Cette activité hémolytique de Listeria monocytogenes est due à la sécrétion d'une

exotoxine thiel-dépendante (211) (212) (283) (284) (332) (391) (431) (514) récemment
purifiée et dénommée listériolysine 0 codée par le gène lisA ou hlyA.

Elle est antigéniquement apparentée aux cytolysines thiel-dépendantes des Step-

tocoques A, des Bacillus spp. et des Clostridium spp. dont le prototype est la streptolysine
0 (389).

Elle ressemble donc aussi la tétanolysine, la perfringolysine 0, la pneumolysine et l'al-

véolysine (213).
 -70-

C'est une protéine de poids moléculaire 58 kDa dont la séquence complète a pu

être déterminée par clonage et séquençage (390) (563).

Elle est constituée de 504 acides aminés associés à une séquence signal nécessaire à
la sécrétion de la protéine par la bactérie et comporte une unique cystéine (540) située
près de la région C terminale qui serait indispensable à son activité lytique.

Elle agit uniquement à pH acide de 5,5 (211) qui est celui des phagosomes après
fusion phagolysosomiale.

Elle est soluble, antigénique (216), oxygène labile et a l'activité d'une lécithinase
ou d'une phospholipase.

Elle se fixe au cholestérol de la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes

grâce au groupe thiol de son unique cystéine ; cette fixation se fait indépendamment de la
température et ne peut avoir lieu que si la toxine n'est pas oxydée.

On pense que la toxine interfère avec le groupe hydroxyle du cholestérol et qu'elle s'en-
fouit dans la double couche lipidique par l'intermédiaire de liaisons hydrophobes avec la
chaine aliphatique du cholestérol.

De ce fait, la membrane lipidique serait désorganisée, perdrait sa perméabilité, entral-

nant la mort cellulaire.

Chez l'animal, cette toxine est létale, entraînant des troubles de la conduction car-
diaque et une lyse des macrophages et des hépatocytes.

Elle joue un rôle important dans la virulence puisqu'il existe une étroite association
entre la capacité à produire une hémolysine et la virulence des souches ; en effet, toutes
les souches pathogènes sont hémolytiques.

Les propriétés toxiques et létales sont les suivantes :

- elle agit sur les lysosomes isolés provoquant la libération d'hydrolases acides,
 - 71 -

- elle déprime le système réticulo-endothélial,

- elle est létale chez la souris par voie intraveineuse,

- elle agit au niveau des hépatocytes, du tissu cardiaque et probablement des

membranes cellulaires de divers organes.

Sa sécrétion est fortement stimulée par une carence en fer, condition réalisée
dans les tissus.

Le taux d'hémolysine dépend de l'aération ; il augmente plus en culture statique

qu'en culture aérée (34).

L'activité hémolytique est plus grande en culture statique qu'en culture aérée pour un
même taux de fer.

L'activité hémolytique est augmentée dans un milieu contenant 2,5 % de NaCI

mais diminuée en présence d'une concentration supérieure à 2, 5 % (126).

KCI s'avère plus efficace que NaCI (406).

NaCI ou KCI permettent un transport de LLO plus efficace à travers la membrane.

L'expression de l'hémolysine est réprimée par un dissacharide, le cellobiose (430).

La production de listériolysine 0 et l'activité hémolytique sont réduites quand les

cellules sont cultivées à 26°C en présence de 0,2 %de glucose ou à 37°C en présence de
1 %de glucose donc à des températures de croissance plus faibles (26°C) et à des con-
centrations en glucose plus élevées(~ 0,3 %) (132).

Elles sont 64 fois plus faibles à 26°C et 128 fois plus faibles à 3JCC en présence de 0,6
et 1 % de glucose qu'à 3JOC avec 0,2 % de glucose.
 -72-

Le glucose mais aussi l'a.-méthyl glucoside (a.MG) (analogue au glucose non métaboli-
sable) peuvent réduire la production d'hémolysine et les effets du glucose et de l'a.MG ne
sont pas inversés par addition d'AMP cyclique (cAMP) avec et sans 3-isobutyl-1-méthyl
xanthine (inhibiteur de cAMP phosphodiestérase).

L'activité hémolytique et la production de la listériolysine 0 sont considérablement rédui-

tes entre pH 5 et 6 et la production optimale est à pH 7 (366).

Donc, la production et l'expression de LLO dans Listeria monocytogenes sont contrôlées

par le pH externe (366), par la température de croissance au niveau de la transcription et
par des concentrations en glucose élevées dont l'effet peut être simplement dO à un abais-
sement du pH du milieu de croissance résultant du métabolisme de Listeria monocytoge-
nes et non pas à l'augmentation d'osmolarité.

L'étude de l'influence du tellurite de potassium sur le phénotype hémolytique de

Listeria spp. (189) montre que :

- le tellurite de potassium augmente les tailles des zones d'hémolyse manifes-

tées par Listeria monocytogenes et cet effet semble être dO à une augmen-
tation de l'effet cytolytique de la listériolysine 0,

- le tellurite de potassium diminue l'hémolyse produite par Listeria ivanovii et cet

effet semble être dO à une inhibition de la sphingomyélinase C produite par
cette espèce.

Donc, l'addition de tellurite de potassium en milieux de culture sélectifs Listeria permet

de différencier et d'énumérer les Listeria spp. hémolytiques de façon exacte.

Il. 2. AUTRES FACTEURS. (336)

Des fractions toxiques de Listeria monocytogenes ont été préparées par rupture de
la paroi bactérienne et extraction à l'aide de différents solvants organiques ; elles montrent
un degré variable de toxicité.
 -73-

On recense:

-la fraction lipidique isolée par STANLEY en 1940 (531) de la paroi bactérienne
et provoquant une monocytose sanguine chez les rongeurs par injection in-
traveineuse ; elle est un facteur accessoire de virulence pour SEELIGER.

-le complexe El de PATOCKA (378) (432) isolé de la surface des bactéries

vivantes par une méthode voisine de celle utilisée pour extraire l'endotoxine
des bactéries à Gram négatif.

Il renferme 60 % de protéines, 18 % de polysaccharides et 8 % de lipides.

MARA et coll. (379) ont défini les propriétés immunologiques de ce complexe ; il est
amphiphile, antigénique, cause des transformations blastiques, une hypersensibilité (test
sur peau), une splénomégalie, augmente l'effet du BCG expérimental (tuberculose) et la
néoplasie chez la souris.

- une phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol codée par le gène pic

ou picA (208) (223) (224) (392).

La maturation de la pro-enzyme de 33 kDa à la phospholipase C spécifique du phos-

phatidylinositol (PI-PLC) de 29 kDa de Listeria monocytogenes nécessite la production de
· la métalloprotéase à zinc codée par le gène mpl (448).

Ce gène est impliqué dans l'expression de la virulence de Listeria monocytogenes et

l'activité PI-PLC est exprimée seulement chez les espèces pathogènes Listeria monocyte-
genes et Listeria ivanovii.

L'expression de PI-PLC est réprimée par un dissacharide, le cellobiose (430).

La virulence d'un mutant déficient en phospholipase peut être réduite par insertion d'un
transposon Tn 1545 dans le gène mpl (461) ; en effet, il ne produit pas la PI-PLC de 29
kDa, une exoenzyme probablement impliquée dans la dissémination de cellule à cellule par
hydrolyse du phosphatidylinositol ancré dans la membrane par le glycosyl ; cette hydrolyse
est suivie de libération de diacyl glycérol.
 -74-

Les souches mutantes déficientes en gêne pic sont incapables de sortir de la vacuole à
double membrane.

Elle n'a pas d'activité détectable sur le phosphatidylinositol-4-phosphate et le phosphati-

dylinositol-4,5 diphosphate impliquées dans la traduction du signal dans les cellules des
mammifères.

La séquence d'acides aminés de cette PI-PLC est homologue à celle de Bacillus thurin-
giensis, de Bacillus cereus et de Clostridium perfringens.

Son activité est stimulée par NaCI et ZnS04.

- une métalloprotéase à zinc codée par le gène mpl impliqué dans la virulence
de Listeria monocytogenes grace à son action sur PI-PLC et associé au
gène hlyA (144) (393),

- une superoxyde dismutase (578) située dans la paroi bactérienne et capable

de détruire les ions su peroxydes extracellulaires et les radicaux oxygénés
libres.

- une catalase (307) dont le rôle dans la virulence n'a pas été encore prouvé.

Sa production et son activité sont induites par un milieu riche en fer et par l'aération ..

La catalase et la superoxyde dismutase sont considérées comme des facteurs de

virulence car elles participent à la détoxification des oxydants cytotoxiques (radical supe-
roxyde (02 ·), peroxyde d'hydrogène et radical hydroxyl (OH) produits durant la bouffée oxy-
dative dans les macrophages et les polynucléaires neutrophiles (579).

Les activités catalase et superoxyde dismutase sont augmentées en milieu aéré et

quand la culture a lieu en milieu contenant 2,5 % de NaCI alors qu'elles sont diminuées en
présence de plus de 2,5% de NaCI (126) (406).

- une phosphqtase alcaline.

 -75-

La virulence de Listeria monocytogenes est déterminée par une classe de 5 gènes

dans l'ordre:

- picA codant pour une PI-PLC,

- hlyA ou lisA codant pour la listériolysine,
- mpl codant pour une métalloprotéase,
- actA codant pour une protéine impliquée dans la polymérisation d'actine,
- plcB codant pour une lécithinase.

L'expression de ces gènes est régulée positivement par un activateur transcriptionnel

(333) (334) (587) ou protéine de 27100 Da codé par le gène PrfA situé devant picA.

PrfA régule donc les gènes nécessaires à la nucléation des filaments d'actine, la dissé-
mination de cellule à cellule, l'invasion, la mobilité bactérienne intracellulaire ; il est néces-
saire pour les évènements se produisant dans le cytoplasme aussi bien que dans la va-
cuole (1 03) (200) (201 ).

Une mutation du gène PrfA stoppe le gène lisA mais aussi abroge la production de la
phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol et de la métalloprotéase, deux produits
des gènes de virulence exprimés seulement par les souches Listeria pathogènes.

Des mutations à l'intérieur de chacun de ces gènes réduisent considérablement la viru-

. lence et inhibent Listeria rendant les mutants incapables de se multiplier et/ou de dissémi-
ner dans les cellules infectées.

L'expression de tous les facteurs de virulence connus pour être régulés positivement par
la protéine PrfA est réprimée à des températures de croissance plus faibles (335).

L'activité hémolytique et donc la production de listériolysine sont faibles ou pas détectées

quand la croissance a lieu à 20 ou à 30°C alors qu'elles sont 8 à 16 fois plus élevées à
3JOC bien que le produit du gène PrfA soit transcrit aussi bien à 20 qu'à 3JOC et que son
initiation se fasse au même nucléotide à ces deux températures.

La listériolysine est le seul produit de gène contrôlé par PrfA observé quand Listeria mono-
cytogenes est cultivée à 3JOC en milieu riche.
 -76-

Les protéines dépendantes de PrfA supplémentaires (PdPs), actA (92 kDa), une pro-
téine de 38 kDa de fonction inconnue et une protéine de 34 kDa qui représente probable-
ment picA et près de 5 PdPs non encore identifiées fonctionnellement, sont synthétisées
préférentiellement sous conditions de croissance stressantes telles que le choc thermique
ou les conditions de culture en phase stationnaire (529).

Toutes les PdPs sont soit sécrétées soit localisées à la surface cellulaire.

Par contre, la synthèse de catalase, de su peroxyde dismutase, de lmaA et de p60 n'est pas
sous le contrôle de prfA bien qu'elles soient associées à la virulence de Listeria monocyte-
genes.

Les souches de Listeria monocytogenes déficientes en gène PrfA régulateur produisent

de la listériolysine en petites quantités, cependant détectables.

L'analyse transcriptionnelle révèle l'existence d'un promoteur indépendant de PrfA res-

ponsable de l'activité hémolytique donc de l'expression du gène listériolysine dans les sou-
ches déficientes en régulateur PrfA (145).

La transcription du gène PrfA se fait à partir d'un promoteur non identifié antérieurement
(prfAp2) situé près du codon initiateur prfA (145).

·Ce promoteur permet l'expression du gène PrfA donc la sortie de la vacuole des cellules
hôtes mais pas l'induction de la polymérisation d'actine par les bactéries et la dissémination
de cellule à cellule.

La transcription à partir des promoteurs prfAp1 et prfAp2 est augmentée en absence du

gène fonctionnel PrfA, suggérant que la protéine prfA contribue à la régulation de sa propre
expression.

L'utilisation du gène PrfA comme sonde ADN montre que ce gène est spécifique des
espèces pathogènes de Listeria et aucune réaction n'est obtenue avec les souches des
autres espèces de ce genre.
 -77-

La sonde ADN est obtenue par amplification PCR d'un fragment de 1060 bp à partir d'un
plasmide ADN d'environ 1 fg hébergeant le gène PrfA cloné.

Listeria ivanovii n'héberge pas de séquence homologue au gène PrfA ce qui suggère que
l'expression de la virulence est régulée différemment.

Ill. REPONSE IMMUNITAIRE. (38)

Listeria monocytogenes déclenche une réponse immunitaire thymo-dépendante (à

médiation cellulaire T), sans intervention des anticorps dans le processus de guérison.

Les lymphocytes T spécifiques semblent recruter et activer les monocytes san-

guins d'origine médullaire dans les foyers infectieux par l'intermédiaire des lymphokines.

L'afflux de macrophages dans les tissus infectés aboutit à la constitution de granu-

lomes inflammatoires où les bactéries sont détruites.

Les convalescents gardent une résistance acquise de longue durée due à la pré-
sence de cellules T-mémoire.

IV. POUVOIR PATHOGENE NATUREL.

IV. 1. CHEZ L'ANIMAL. (Tableaux IX et X)

Pratiquement toutes les espèces animales, qu'elles soient domestiques ou sauva-

ges, peuvent être atteintes mais certaines sont plus sensibles que d'autres.

La listériose est une maladie qui affecte essentiellement les ovins (dans plus de 3
cas sur 5) et plus rarement les bovins et les caprins.

Dans l'espèce porcine, la listériose- maladie est exceptionnelle alors que le por-
tage asymptomatique est fréquent.
 -78-

La maladie peut revêtir trois aspects :

- une forme septicémique chez les sujets jeunes, les rongeurs, plus rarement
les volailles,

- une forme nerveuse ou méningo-encéphalitique chez le mouton et les rumi-

nants en général,

- une atteinte génitale avec avortement chez les ruminants et les rongeurs.

IV. 1. 1. BOVINS ADULTES.

La neurolistériose est une manifestation fréquente mais des avortements ont été
décrits de même qu'un cas de mastite (556).

Quatre cas d'avortements ont été attribués à Listeria ivanovii entre 1988 et 1990
bien que celle-ci donne plus fréquemment des avortements chez le mouton (4).

Des vaches traitées par la dexaméthasone ont présenté un taux de Listeria mono-
cytogenes 15 fois supérieur dans le lait (588).

IV. 1. 2. OVINS.

La listériose apparalt sous forme d'encéphalites, de méningites et d'avortements,

ainsi que des mammites.

Chez le mouton, la forme la plus fréquente est la forme nerveuse ou méningo-

encéphalitique, appelée "circling disease".

Des phases de torpeur entrecoupées de périodes d'excitation pendant lesquelles les

animaux effectuent des mouvements incoordonnés ou répétitifs sont observés.

Les animaux "poussent au mur'' ou tournent toujours dans le même sens d'où le nom de
"circling disease" puis apparaissent rapidement des paralysies et de la dyspnée.
 -79-

L'issue est fatale dans la plupart des cas avec ou sans traitement (97).

IV. 1. 3. PORCS. (58) (116) (157) (346) (458)

La listériose évolue généralement de manière discrète mais lorsqu'un inoculum de

Listeria est ingéré par un organisme affaibli ou stressé, une infection peut se déclarer et
revêtir diverses formes :

- une septicémie associant une forte fièvre et responsable d'une mortalité pou-
vant atteindre 100 %chez les porcelets (346) (458),

- des troubles de la gestation avec en particulier des avortements bien que l'état
général de la truie ne soit souvent que peu affecté,

- des troubles du système nerveux dus à l'inflammation des méninges et de

l'encéphale et caractérisés par de l'inappétence, des tremblements et des
contractions musculaires, une rigidité des membres antérieurs et une para-
lysie des membres postérieurs.

Cette forme clinique, apparentée au tétanos, sévit chez les porcelets sous la mère.

Les porcs peuvent aussi présenter une nécrose hépatique.

Le diagnostic ne pourra être établi qu'après isolement des Listeria du contenu in-
testinal, du foie, de la rate, du cerveau et de la mœlle épinière.

La listériose est tout de même une maladie relativement rare chez le porc.

Le développement des élevages en claustration pourraient expliquer la faible inci-

dence de cette maladie chez le porc qui est la conséquence soit d'une contamination de-
puis le réservoir hydrotellurique, soit d'une contagion entre espèces différentes, soit du ré-
veil d'une infection latente.

Les cas de listériose se déclarent en général pendant les mois d'hiver et la trans-
mission s'effectue par voie orale.
 -80-

IV. 1. 4. RONGEURS.

Chez les lapins, les souris, les cobayes, la forme la plus fréquente est septicémi-
que.

IV. 1. 5. OISEAUX.

On observe une forme septicémique mais aussi des lésions dégénératives au ni-
veau du myocarde.

IV.1. 6. CHEVAUX.

La maladie est rare.

IV.1. 7. VOLAILLES.

La forme septicémique prédomine.

IV. 1. 8. LAMAS.

Un cas de listériose a été décrit chez un lama êgé de 3,5 mois qui a d'abord pré-
senté des signes de désordre vestibulaire périphérique unilatéral et les jours suivants des
signes progressifs d'encéphalite (558).

Le traitement avec des antibiotiques (flunixine méglumine) et des anticonvulsivants n'ont

pas stoppé la maladie et le lama a été euthanasié.

L'examen post-mortem a révélé une otite médiane-interne et une méninge-

encéphalomyélite suppurative diffuse ; de plus, Listeria monocytogenes a été isolée du
LCR et du tissu cérébral.
 - 81 -

Tableau IX Espèces sensibles à Listeria monocytogenes.

ANIMAUX OOMI::STiQUE5 .~NltO.IIX SAUVAGES

CROV!'E:

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Tableau X · Symptomatologie de la listériose animale.

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 -82-

Donc, tous les animaux peuvent être atteints mais Listeria touche plus particuliè-
rement les poulets, les moutons et les vaches, principalement à la saison froide.

Listeria monocytogenes est presque exclusivement incriminée alors que Listeria

ivanovii n'entrafne que des àvortements.

La maladie varie en fonction de l'espèce, de la virulence de la bactérie et du mode

de contamination.

IV. 2. CHEZ L'HOMME. (27) (42)

IV. 2. 1. SUJETS ET TERRAINS A RISQUE.

Les sujets à risque sont les suivants :

-les femmes enceintes essentiellement au cours du 3° trimestre,

- les nouveau-nés,

-les sujets âgés,

-les greffés rénaux,

- les hémodialysés,

- les sidéens,

-les individus atteints d'intoxications chroniques (alcool, drogue),

- les individus atteints de maladies ou d'infections intercurrentes, cancers pul-

monaires, digestifs ou hématologiques, infections virales,
 -83-

Les terrains à risque sont les suivants:

- les maladies néoplasiques et en particulier les lymphomes Hodgkiniens ou

non,

- les thérapeutiques immunosuppressives suite à des greffes d'organes ou la

corticothérapie ou la chimiothérapie anticancéreuse,

- l'hypoacidité gastrique,

- le diabète,

- les hépatopathies alcooliques ou non,

-les collagénoses,

- les néphropathies chroniques,

IV. 2. 2. LISTERIOSE DE L'ADULTE.

La listériose de l'adulte est exceptionnelle avant l'âge de 12 ans.

Au-delà, elle se manifeste essentiellement par une atteinte du système nerveux

central; méningite et méninge-encéphalite ou encore une septicémie.

Les formes extra-neurologiques non bactériémiques sont beaucoup plus rares.

Tout dépend du terrain.

IV. 2. 2. 1. Infection du système nerveux central ou atteinte neuro-méningée.

Elle concerne 30 à 50 % des listérioses de l'adulte et comprend principalement les

méningites ou méninge-encéphalites et plus rarement les rhombencéphalites et les abcès
cérébraux.
 -84-

Une bactériémie est associée dans plus de la moitié des cas.

IV. 2. 2. 1. 1. Symptomalogie.

Le début est généralement franc avec une fièvre et des céphalées souvent inten-
ses et précoces, précédant de plusieurs jours un syndrome méningé peu différent des au-
tres méningites bactériennes.

Des signes méningés frustres et une fébricule à 38°C sont aussi observés.

Les signes neurologiques, maximaux au tronc cérébral, sont de pronostic sévère

et apparaissent parfois après institution de l'antibiothérapie.

Les observations sont diverses, à savoir :

- des paralysies des nerfs crâniens intéressant une ou plusieurs paires et qui
pourraient évoquer à tort une lésion focalisée :

. des paralysies oculo-motrices (3° paire (nerfs oculaires communs) et 6°

paire (nerfs oculaires externes)) touchant principalement la musculature
extrinsèque, un ou plusieurs nerfs pouvant constituer une ophtalmoplégie
complète.

Le caractère partiel de certaines paralysies signe une atteinte nucléaire possible.

Une ophtalmoplégie internucléaire a également été rapportée.

Des paralysies de fonctions, paralysie dans le regard latéral, déviation des yeux, un
nystagmus horizontal peuvent venir perturber la course oculaire .

. la paralysie de la 7° paire (nerfs faciaux) est fréquente, unilatérale ou bilaté-

rale (40% des cas) ; elle est à l'origine de paralysie faciale de type péri-
phérique ou d'une hé mi-anesthésie faciale.
 -85-

. l'atteinte de la branche sensitive ou motrice du trijumeau (5° paire) peut

aggraver les troubles de la déglutition alors que l'atteinte des nerfs glosso-
pharyngiens (9° paire) et spinaux (11 o paire) est responsable de l'impos-
sibilité de fermeture de la glotte ce qui empêche la déglutition et constitue
un risque majeur de fausse-route .

. l'atteinte du nerf hypoglosse (12° paire) contribue à la déviation de la lan-

gue.

. l'atteinte du nerf auditif (8° paire) est à l'origine d'un syndrome vestibulaire.

- un syndrome cérébelleux (26) statique et cinétique est fréquent (1 fois sur 5),
souvent bilatéral, mais prédominant d'un cOté est à l'origine de mouvements
anormaux séquellaires intriqués avec des perturbations d'origine extra-pyra-
midale.

-des troubles du tonus et des mouvements anormaux extra-pyramidaux, à

composante athétolde, ou évoquant une dyskinésie volitionnelle d'attitude
sont souvent observés, mais ils sont masqués les premiers jours par des
troubles de la conscience et des paralysies démasquées progressivement au
cours de l'évolution.

-les autres atteintes neurologiques sont moins suggestives de listériose mais

sont tout aussi importantes :

. les troubles de la conscience vont de l'obnubilation au coma et peuvent

s'aggraver sur plusieurs jours malgré l'institution d'une antibiothérapie
adaptée ou survenir brutalement, en même temps que des crises
convulsives principalement chez le sujet immunodéprimé.

Ils sont responsables de la mort ou d'importantes séquelles.

. les crises convulsives ou l'état de mal sont sévères.

 -86-

. un déficit hémiplégique peut s'installer d'emblée, contemporain d'une forme

méningo-encéphalitique avec ou sans trouble de la conscience.

La tomodensitométrie permet de rechercher un abcès en cours de formation.

- des désordres neuro-végétatifs ont été observés :

. dilatation gastro-intestinale aiguê nécessitant une aspiration digestive con-

tinue, un vomito negro, ulcères aigus duodénaux secondairement hémor-
ragiques ou. perforés (254),

. collapsus, anurie dont le rOie des immuns complexes n'est pas impossible
(231).

Ces symptOmes permettent de distinguer quatre principaux aspects cliniques :

- méningite à liquide trouble ou à liquide clair dont le diagnostic est identique à

celui des méningites bactériennes et virales.

Une méningite à Listeria est fréquente chez le sujet immunodéprimé et une antibiothé-
rapie doit être entreprise avant les résultats de l'hémoculture et du LCR.

- méninge-encéphalite associant un syndrome méningé et une atteinte neuro-

logique disséminée et faisant penser à une tuberculose ou une affection vi-
rale.

- rhombencéphalite débutant par des céphalées intense, une fièvre à 38°C,

suivis, 8 à 10 jours plus tard, sans trouble majeur de la conscience, de ma-
nière insidieuse et progressive, par des paralysies des paires craniennes
sans modification importante du LCR orientant vers une pathologie extra-
infectieuse du tronc cérébral.

- déficit neurologique focalisé dans un contexte infectieux avec des signes d'ab-
cès ou d'encéphalite pré-suppurative (329) (491 ).
 -87-

Le LCR est stérile donc l'hémoculture et la ponction de l'abcès permettront de poser le

diagnostic (573).

IV. 2. 2. 1. 2. Evolution.

Elle est sévère et ceci est fonction de l'atteinte neurologique et de l'éventuelle pa-
thologie associée :

-les formes méningées pures ont une évolution favorable sauf les formes coma-
teuses compliquant une hémopathie ou une autre pathologie immunodé-
pressive.

- les abcès survenant principalement chez les sujets immunodéprimés ont une
évolution défavorable.

- les méninge-encéphalites ont une évolution sévère.

IV. 2. 2. 2. Autres infections listériennes.

IV. 2. 2. 2. 1. Les septicémies.

Survenant habituellement sur un terrain immunodéprimé, elles prennent une allure

pseudo-typholde et se compliquent parfois de multiples localisations : pneumonie, endo-
cardite survenant principalement sur des lésions cardiaques préexistantes, valve native,
prothèse mécanique ou bioprothèse, ostéomyélite, arthrite, cholécystite, péritonite, hépatite
ou abcès hépatique.

La principale manifestation est la fièvre, à laquelle peuvent s'associer des signes

non spécifiques comme une asthénie, un malaise, des troubles digestifs à type de nausée,
crampes, vomissements, diarrhées.
 -88-

IV. 2. 2. 2. 2. Les atteintes cardia-vasculaires.

Elles sont les suivantes :

-l'endocardite (24) (133) (446) siégeant sur le cœur gauche et dans la majorité
des cas sur une lésion préexistante.

- la péricardite (268) dont la preuve bactériologique est apportée par l'hémocul-

ture et dont le mécanisme pourrait être inflammatoire par réaction aux anti-
gènes.

- la myocardite suppurée probablement par embolie septique pour Mc CUE

(361 ), purulente et associée à une nécrose et un volumineux abcès du sep-
tum pour TIGE (545).

Elle peut aussi être associée à une méningite sous la forme d'une hypokinésie ventricu-
laire gauche et une diminution de la fraction de raccourcissement à l'échographe, réversible
en 15 jours et à l'origine d'un collapsus à pression veineuse centrale.

- un anévrysme mycotique (250) (321 ).

IV. 2. 2. 2. 3. L'hépatite.

La localisation hépatique de Listeria est bien connue puisque la constatation d'im-

portants foyers de nécrose du foie sur l'animal a donné naissance à l'appellation Listeria
hepatolytica.

On peut observer des abcès miliaires du foie au cours de septicémies mais aussi
une atteinte hépatique prédominante (242) (612) survenant sur un foie antérieurement sain
et s'accompagnant d'une nette élévation des transaminases comme dans le cas d'une hé-
patite virale.

La guérison est possible.

Une surcharge en fer au cours de l'hémochromatose favorise une hépatite.

 -89-

IV. 2. 2. 2. 4. Autres troubles.

On a pu obseNer :

- des arthrites septiques à Listeria monocytogenes (598),

- des pneumopathies certainement dues à une contamination aérienne,

- des pleurésies purulentes,

- des lymphadénites ceNicales ou sous-maxillaires,

- des conjonctivites ou kérato-conjonctivites par contact direct accidentel asso-

ciées parfois à une tuméfaction des glandes parotides ou sous-maxillaires.

Une endophtalmie a été décrite chez un greffé rénal recevant de la ciclosporine et

de la prednisone (5).

Le schéma clinique initial était une uvéite hypertensive aiguê avec un hypopion.

En dépit de la paracentèse et d'une antibiothérapie appropriée, l'énucléation s'est avé-

rée nécessaire.

Une urétrite par contamination vénérienne et une angine ont été rapportées.

Des bactériémies isolées sans signe clinique ont été révélées surtout chez les
sujets immunodéprimés ayant une pathologie digestive (colite ulcéreuse, cancer, cirrhoses)
évoquant une porte d'entrée digestive.

Quelques obseNations de collapsus ou décès en quelques heures sans autres

signes cliniques ni lésions anatomiques ou histologiques patentes suggèrent le rôle possi-
ble de toxines.

Le rôle des immuns complexes a été incriminé dans la suNenue d'une insuffi-
sance rénale aiguê (231 ).
 -90-

IV. 2. 3. LISTERIOSES MATERNO-FCETALES.

La fréquence en France est de l'ordre de 1/250 grossesses, ce qui représente en-

viron 30 % de l'ensemble des listérioses.

IV. 2. 3. 1. Listériose de la femme enceinte.

Elle peut survenir à n'importe quel moment de la grossesse mais la fréquence est
maximale au début du troisième trimestre, puis diminue pendant le huitième mois.

Au cours des deux premiers trimestres, la listériose est responsable de fausse

couche alors que lorsqu'elle survient au cours du troisième trimestre, elle peut être la cause
de mort in utero et surtout d'un accouchement prématuré et d'une infection néonatale.

L'infection listérienne est le plus souvent latente chez la mère ou réduite à un épi-
sode fébrile, pseudogrippal ne correspondant pas à l'infestation microbienne proprement
dite puisqu'il n'y a pas de corrélation entre les lésions histologiques constatées et la chrono-
logie de l'accès fébrile, et à de volumineux abcès placentaires peut correspondre un accès
fébrile contemporain de l'accouchement.

On peut penser que l'accès fébrile maternel corresponde à une réinfestation de la

mère à partir de lésions endométriales ou placentaires constituées depuis un temps indé-
. terminé ; ceci n'implique pas l'atteinte simultanée obligatoire du fœtus.

Cet épisode fébrile est noté dans plus de la moitié des cas mais ne justifie pas
obligatoirement une antibiothérapie et ceci à tort.

Il survient un mois, une semaine avant l'accouchement ou en est contemporain.

Une antibiothérapie bien adaptée et rapidement instituée permet de ·mener à

terme la grossesse et de donner naissance à un enfant normal.
 -91 -

Outre cet épisode fébrile, d'autres manifestations cliniques ont été observées :

-une infection urinaire (5 à 20% des cas),

- un épisode pseudogrippal avec toux et fièvre,

- une diarrhée,

- une intervention pour appendicite ou volvulus, précédant de peu l'accouche-

ment,

- un ictère ou subictère,

- des septicémies, des méningites ou méninge-encéphalites ; dans ce cas,

l'évacuation du contenu utérin, le plus souvent spontané, est indispensable
au contrOle de l'infection,

-un syndrome de détresse respiratoire de l'adulte (A.D.R.S.) à la 33° semaine

d'une grossesse normale jusque-là (67) ..

Une hémoculture et une analyse du liquide amniotique révèlent la présence de Listeria

monocytogenes dans le cas d'une pneumopathie probablement listérienne associée à une
- insuffisance circulatoire aiguê, des signes biologiques de coagulation intravasculaire dis-
séminée, une hypoxie sévère nécessitant une ventilation assistée.

La listériose de la femme enceinte se caractérise par :

- sa symptomatologie difficile à interpréter,

- son caractère bénin pour la mère,

- son retentissement grave pour le fœtus.

 -92-

IV. 2. 3. 2. Transmission mère-fœtus. (477)

Elle peut se faire par plusieurs voies :

- une voie hématogène transplacentaire, voie sans doute la plus fréquente et se

rencontrant au cours d'une bactériémie ou d'une septicémie maternelle,

- une voie locale utérine ; un foyer endométrial quiescent et réveillé par la gros-
sesse ou constitué pendant celle-ci atteint le fœtus par contiguïté, c'est-à-
dire par le placenta ou au travers des membranes puis du liquide amnioti-
que,

- une voie transmembraneuse à partir d'un portage vaginal,

- une contamination directe du fœtus ; lors de l'expulsion dans les voies génita-
les basses, le nouveau-né pourra être contaminé par inhalation, déglutition,
par voie conjonctivale et ceci à partir d'un portage vaginal,

- une contamination à la pouponnière de l'hôpital est possible.

voie hématogène transplacentaire

voie locale utérine

(origine endométriale)
---Ill voie ascendante
transmembranaire
e
 -93-

IV. 2. 3. 3. Listériose néonatale.

Sa fréquence est difficile à apprécier mais on admet un chiffre de 0,2 à 0,3 % des
naissances, soit en France 1800 à 2500 cas annuels (493).

Une fois sur deux, il s'agit d'un mort-né et 2/3 des nouveau-nés infectés sont pré-
maturés ce qui associe les risques de la maladie infectieuse et de la prématurité.

IV. 2. 3. 3. 1. Symptomalogie.

Les symptômes apparaissent immédiatement à la naissance ou après un délai de

quelques jours, en général dans les 28 jours de vie.

On distingue :

- les infections précoces survenant dans les 5 premiers jours de vie correspon-
dant à la forme septicémique et à la contamination transplacentaire,

- les infections tardives survenant au-delà et correspondant à la méningite et à

la contamination par contage au passage des voies génitales maternelles
infectées.

On observe aussi des formes respiratoires asymptomatiques.

IV. 2. 3. 3. 1. 1. La forme septicémique.

Les premières manifestations apparaissent immédiatement ou quelques heures

après la naissance et sont celles de toute souffrance néonatale à savoir : hypothermie,
troubles du rythme et encombrement respiratoire, cyanose, somnolence, coma.

Les réflexes archal"ques sont diminués ou absents et l'enfant est hypotonique.

 -94-

On peut observer des troubles digestifs, un ictère avec hépatosplénomégalie mais

surtout des éruptions maculeuses, macula-papuleuses ou des papules centrées par une
vésicule ou une pustule voire une éruption fugace ne durant que quelques heures, des
granulomes dans le pharynx jaunatres et saillants, une conjonctivite purulente ; ces signes
sont plus évocateurs et fréquents.

On lui donne le nom de granulomatose septique infantile ou granulomatosis infan-

tiseptica.

L'évolution est le plus souvent mortelle en quelques jours.

IV. 2. 3. 3. 1. 2. La méningite.

Les premiers symptômes apparaissent après quelques jours et correspondent à

des troubles digestifs, diarrhée, anorexie, de la fièvre ou de l'hypothermie, voire des con-
vulsions ou un coma et justifiant la rachicentèse sans attendre le syndrome méningé.

Peuvent être associés des troubles respiratoires, toux, dyspnée, cyanose, quelque-
fois une conjonctivite et une anémie hémolytique.

IV. 2. 3. 3. 1. 3. Les formes respiratoires.

La symptomalogie se limite à une cyanose, un tirage, une polypnée entrecoupée

d'apnée (316).

IV. 2. 3. 3. 1. 4. Autres formes.

On a pu observer une conjonctivite isolée, d'évolution bégnine et des formes

asymptomatiques.

IV. 2. 3. 3. 2. Evolution.

Elle est sévère pour les formes septicémiques disséminées et les méningites avec
environ 4 % de décès.
 -95-

Listeria monocytogenes possède donc un triple tropisme préférentiel :

- le système nerveux : méninges et encéphale,

- les organes riches en tissu du système réticule-endothélial : glandes salivai-

res, oculaires, ganglions, mésentère, foie, rate,

- les tissus du tractus génital féminin : tissus fœto-maternels.

V. POUVOIR PATHOGENE EXPERIMENTAL. (336)

De nombreuses espèces animales comme le lapin, la souris et le cobaye sont

sensibles à l'infection listérienne expérimentale.

De ce fait, plusieurs voies d'inoculation ont été utilisées.

V. 1. VOIE CONJONCTIVALE.

Le test d'ANTON consiste à instiller une goutte d'une culture de 24 heures dans le
sac conjonctival du lapin ; ceci provoque, en 36 à 48 heures, une conjonctivite purulente.

Dans le pus conjonctival, sont retrouvés des cellules épithéliales, des polynucléai-
res, des mononucléaires et des germes intracellulaires.

V. 2. VOIE INTRAVEINEUSE.

L'injection intraveineuse chez les animaux monogastriques provoque une septi-

cémie rapidement mortelle.

L'autopsie permet d'observer la teinte verdâtre de la paroi abdominale, avec des

foyers multiples de nécrose du foie et parfois du myocarde et des méninges.

La DL50 par cette voie est de 104 -1 0 6 selon les races de souris et les souches
bactériennes.
 -96-

V. 3. VOIE SOUS-CUTANEE.

L'inoculation sous-cutanée de lapins produit une réaction inflammatoire locale puis

une évolution comparable à celle de la voie intraveineuse, mais plus lente.

La monocytose sanguine apparaft en 3 à 7 jours.

V. 4. VOIE INTRAPERITONEALE.

L'issue est rapidement mortelle chez les lapins et les souris.

La DL50 chez la souris est de 3,9 à 4,5.1 06 pour les souches hémolytiques et de
1, 5.1 09 pour les souches non hémolytiques.

V. 5. VOIE ORALE.

Cette voie a peu d'effet sur la plupart des animaux de laboratoire, mais GRAY
(336) signale que l'infection par voie orale ou conjonctivale de lapines gravides se traduit
par un avortement ou par la naissance de petits infectés.

V. 6. VOIE CEREBRALE.

Les souris peuvent être infectées avec 3 ou 5 bactéries mais la maladie résultante
ne reproduit pas ce qui est observé dans les encéphalites ou les méninge-encéphalites des
ruminants ou des rongeurs.

L'inoculation à l'œuf embryonné de poulet a été proposé comme modèle dans

l'investigation du pouvoir pathogène des souches de Listeria.

On observe, après 48 heures, des lésions du foie, du myocarde et du système nerveux

central.
 -97-

Le mécanisme du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes peut être expli-

qué par une action toxique, le rôle des formes L, la virulence se manifestant par la capacité
de Listeria monocytogenes envers l'action bactéricide des phagocytes, mais surtout par la
présence intracellulaire.

En effet, RACZ, TENNER et MERO (452) ont montré, grace à une étude au microscope
photonique, la multiplication de Listeria monocytogenes dans les cellules épithéliales de la
vessie après induction d'une cystite chez le cobaye par introduction de 10 9 bactéries dans
la vessie.

L'oligosaccharide hydrosoluble, le N-acétyl-chitohexose protège la souris de l'infec-

tion par élévation de la fonction d'immunité cellulaire (550).

L'ampicilline libre est moins efficace que celle qui est enfermée dans un liposome
pour le traitement d'une listériose expérimentale chez la souris (184).
 -98-

Sème PARTIE :

DIAGNOSTIC
 -99-

1. SIGNES DE SUSPICION. (27) (170) (Tableau Xl)

Ils sont les suivants :

-signes cliniques:

. les symptômes neurologiques, septicémiques chez l'adulte,

. un syndrome pseudogrippal avec éventuellement une infection urinaire

et/ou des troubles digestifs, une rupture prématurée des membranes,
un accouchement prématuré et anormalement long, une élévation ther-
mique au cours du travail chez la femme enceinte,

. un syndrome septicémique, neurologique, une détresse respiratoire, une

éruption cutanée précoce, une blépharo-conjonctivite unilatérale ou bilaté-
rale chez l'enfant,

orientent le diagnostic vers la listériose.

- signes métaboliques : une acidose métabolique dès la naissance et une hy-

poglycémie,

- signes anatomopathologiques comme l'aspect spécifique des nodules listé-

riens,

- signes biologiques et hématologiques :

. le LCR peut être clair, trouble ou purulent, mais l'aspect cytologique de type
panaché comprenant à la fois polynucléaires et lymphocytes est très évo-
cateur d'une méningite à Listeria,

. la protéinorachie est à 1 g/1,

. la glycorachie est abaissée,

 -100-

. la lactacidorachie rapportée à la lactacidémie est élevée,

. l'ionogramme peut révéler une hyponatrémie par antidiurèse, facteur

d'œdème cérébral dans les atteintes cérébro-méningées,

. l'hémogramme et surtout la formule d'ARNETH (répartition des globules

blancs polynucléaires selon le nombre apparent de leurs noyaux ; elle
renseigne sur la production et J'age des polynucléaires) présentent des
anomalies : monocytose rare, neutropénie brutale et brève, polynucléose
modérée ou remplacée par une leucopénie et annoncée par la myélémie,
thrombopéni~ souvent associée à une coagulation intravasculaire dissé-

minée, anémie peu significative, élévation du taux de fibrinogène (> 3 g/1),

-signes immunologiques: augmentation des lgM, non modification du com-

plément.

Tableau Xl : Arguments diagnostiques devant une méningite à liquide clair.

---
Glycorachie Examen direct
Cellularité (% de glycémie) . (% positivité) Autres

listériose !
panachée ;;:.40% Bacille Gram positif hémocultures
(40-50% neutrophiles) (<40%)
Tuberculose 90-100 %, lymphocytes <40% BAAR* (40%) autre localisation
Cryptococcose 90-100 %, lymphocytes <40% encre de Chine (50-80 %) antigène cryptocoque (sang
et LCR)
Herpès 90-100 %, lymphocytes >40% - IFN** et antigène viral
(LCR), EEG, scanner, RMN

• : Bacille acido-alcoolo-résistant (coloration de Ziehl) ; • • : interféron

 -101 -

Il. DIAGNOSTIC DES DIFFERENTES LISTERIOSES. (27)

Il. 1. LISTERIOSE DE L'ADULTE.

Le LCR est très variable dans son aspect et sa composition :

- l'aspect est trouble, clair ou parfois franchement purulent,

- la cytologie peut être faite exclusivement de polynucléaires (liquide purulent)

ou de lymphocytes (liquide clair) ou panachée,

- le nombre d'éléments est variable : les polynucléaires sont innombrables dans

les méningites purulentes, alors que dans les méninge-encéphalites, on
dénombre moins de 20 à 30 éléments,

- la protéinorachie est supérieure à 1 g/1 mais est normale dans les atteintes
neurologiques prédominantes,

- la glycorachie est abaissée,

- la lactacidorachie rapportée à la lactacidémie est élevée,

- la culture n'est pas constamment positive.

L'hémoculture doit être systématique.

Les investigations neuroradiologiques orientent le diagnostic :

- la scintigraphie cérébrale au technétium 99 peut montrer un ou plusieurs

foyers de fixation suggérant une vascularite avec effraction de la barrière
sang/cerveau,

- la tomodensitométrie cérébrale montre des images hémisphériques hypoden-

ses prenant ou non le contraste, compatibles avec une encéphalite présup-
purative plus rarement avec un abcès,
 -102-

- l'angiographe n'est en rien spécifique.

Les urines, les selles, l'ascite, le liquide pleural, la ponction articulaire mais aussi
des prélèvements au niveau d'une adénopathie cervicale ou de l'appendice peuvent aider
au diagnostic.

Il. 2. LISTERIOSE DE LA FEMME ENCEINTE.

L'hémoculture est systématique devant toute fièvre et peut apporter à elle seule la
preuve de l'infection.

L'uroculture est rarement positive.

Le prélèvement vaginal n'a pas d'intérêt car le vagin ne semble contaminé que lors
de l'accouchement (337).

L'amniocentèse par voie transabdominale est d'un grand intérêt car elle permet
d'instituer rapidement une antibiothérapie et de déclencher le plus tôt possible l'accouche-
ment (441).

Au cours de l'accouchement, l'examen placentaire associe l'hémoculture et le pré-

lèvement des lochies.

L'examen du placenta permet d'observer des lésions macroscopiques : petits nodules

miliaires en grain de riz, bien limités, jaunâtres, ou abcès plus volumineux d'1 cm ou plus et
plages nécrotiques ou infarctoïdes, visibles sur la face utérine.

Le frottis amniotique se fait par raclage de l'amnios à hauteur de la plaque choriale et

étalement, recherche de polynucléaires et de germes, coloration de Gram, évaluation de la
densité.

L'examen histologique confirme les lésions macroscopiques et apporte la preuve d'une

contamination du placenta avec des abcès de tailles diverses et des zones de nécrose.
 -103-

La topographie rétroplacentaire des gros abcès, l'importance et la constance de l'atteinte

inflammatoire de la caduque membraneuse suggèrent une atteinte endométriale.

Il. 3. LISTERIOSE DU NOUVEAU-NE.

L'isolement se fait par hémoculture à partir du LCR, du méconium (ou par écou-
villonnage rectal), du liquide gastrique, des sécrétions nasales, pharyngées, du sébum
(aisselle, ain~, oreille), d'éventuelles pustules cutanées ou d'une conjonctivite.

Les examens se font parallèlement à ceux de la mère.

Le LCR est hypertendu, trouble ou purulent, parfois xanthochromique ou hémor-

ragique, riche en albumine.

La radiographie pulmonaire montre des opacités micronodulaires, un aspect ma-

croréticulé ou une image évocatrice de bronchopneumonie.

On observe aussi une hyperleucocytose avec polynucléose, rarement une mono-

nucléose.

Ill. IDENTIFICATION. (170)

Ill. 1. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE.

111.1.1. EXAMEN DIRECT APRES COLORATION DE GRAM.

Il n'a de valeur que pour les prélèvements peu ou pas contaminés par une flore
associée.

On observe un petit bacille ou coccobacille régulier à Gram positif.

Les cultures en milieux solides présentent des morphologies plus courtes que cel-
les en milieux liquides ; de plus, les Listeria provenant de cultures êgées sont plus longues,
plus filamenteuses et plus décolorées que celles issues de cultures jeunes.
 -104-

Ill. 1. 2. MISE EN CULTURE ET IDENTIFICATION.

Les prélèvements sont enrichis puis isolés sur milieux sélectifs spécialement con-
çus pour Listeria.

L'identification repose sur la réalisation d'une hémolyse sur gélose au sang de

mouton, d'une galerie APl 20E constituée de 20 tests à savoir 10 hydrates de carbone et
1 0 enzymes et d'une hydrolyse de l'esculine.

Un point important est constitué par le diagnostic bactériologique différentiel ; ain-

si, il ne faut pas confondre les formes filamenteuses et décolorées de Listeria monocytoge-
nes avec un bacille Gram négatif comme Haemophilus, de même les formes courtes avec
les formes allongées d'un Streptocoque ou d'un Entérocoque tous deux catalase négative.

La différenciation avec les Bacillus est aisée puisque les colonies ont une morphologie
différente et ils sporulent, de même qu'elle est facile avec les Corynébactéries qui sont des
bacilles Gram positif irréguliers et ne peuvent pas être simultanément mobiles et P-
hémolytiques.

Parmi les bacilles Gram positif réguliers et non sporulés, certains comme Kurthia sont
aérobies stricts ce qui les différencient des Listeria.

Erysipelothrix rhusiopathiae, bien qu'aéra-anaérobie est immobile, catalase négative

mais produit de l'hydrogène sulfureux.

La plupart des confusions se fait avec les Lactobacillus qui sont pourtant immobiles et
catalase négative.

Brochothrix est le genre le plus proche de Listeria mais est immobile et ne se développe
pas à 37°C (Tableau Il).
 - 105-

Le diagnostic différentiel doit aussi s'effectuer au sein du genre Listeria par l'inter-
médiaire de l'hémolyse (Listeria grayi, Listeria innocua, Listeria murrayi et Listeria welshi-
meri sont non hémolytiques) complétée par le CAMP-test avec Staphylococcus aureus
(Listeria monocytogenes et Listeria seeligeri positif) et Rhodococcus equi (Listeria ivanovii
positif) mais aussi par l'acidification du mannitol (Listeria grayi et Listeria murrayi positif) et
du xylose (Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri positif) (Tableau Ill) (Figure
2) (Annexe 1).

Ill. 1. 3. METHODES RAPIDES.

Elles sont utilisées après un enrichissement et font appel à :

- des réactions immunoenzymatiques ou d'immunofluorescence directe à l'aide

d'anticorps monoclonaux spécifiques,

-des sondes nucléiques marquées, complémentaires de séquences d'ARNr ou

de gènes comme c'est le cas pour l'hémolysine ou le facteur d'hypersensibili-
té retardée,

- une amplification génique.

Les résultats sont disponibles en 2 à 3 jours au lieu de 7 avec les autres métho-
·des.

Ill. 2. CARACTERISATION.

Ill. 2.1. METHODES PHENOTYPIQUES. {478)

Elles sont indispensables pour:

- la surveillance en routine,

- savoir s'il s'agit de l'apparition d'une souche unique ou de souches variées lors
d'une augmentation du nombre de cas,
 - 106-

- typer un grand nombre de souches isolées d'aliments de manière à détecter

l'aliment responsable.

Ill. 2. 1. 1. Sérotypie.

C'est le rôle du Centre National de Référence des Listeria situé à Nantes, créé en
Septembre 1981 par arrêté ministériel (117).

Ce Centre a pour mission de collecter les souches de Listeria isolées en France

tout au long de l'année dans. des cas de listérioses humaines et d'établir ou de confirmer
l'identité de la bactérie en contrôlant la pureté de la souche et en la soumettant à des tests
bactériologiques afin de déterminer le genre Listeria et l'espèce.

Cette méthode ou combinaison antigénique de SEELIGER et H6HNE (506) con-

siste à immuniser des lapins afin d'obtenir des antisérums spécifiques, à purifier ces antisé-
rums bruts polyclonaux et à les utiliser dans un test d'agglutination sur lame.

Les souches sont mises en contact avec les antisérums 0 pour le typage des anti-
gènes somatiques 0 etH pour le typage des antigènes flagellaires H ; dans ce deuxième
cas, le bouillon tryptone phosphate est supplémenté en formaline.

DON KER-VOET (147) et SEELIGER (505) (506) ont défini 18 sérovars pour Lis-
·teria monocytogenes, correspondant à différentes combinaisons des 5 antigènes flagellai-
res et 15 antigènes somatiques (Tableau IV).

Les trois sérovars 1/2a, 1/2b et 4b représentent 98% des souches de Listeria mo-
nocytogenes impliquées en pathologie humaine avec 60 % pour le sérovar 4b, 28 % pour
le sérovar 1/2a et 15% pour le sérovar 1/2b, selon le Laboratoire National de la Santé.

C'est une méthode longue et fastidieuse dont les difficultés essentielles· résident
en la préparation d'antisérums spécifiques de qualité stricte et dans le manque de discrimi-
nation de la méthode.
 -107-

Ill. 2. 1. 2. Lysotypie (426) (470) (47 4) (475).

Elle est réalisée au Centre National de Référence pour la lysotypie et le typage

moléculaire des Listeria à l'Institut Pasteur à Paris.

En 1977, AUDURIER et coll. (12) (13) (14) ont mis au point un système de typage
par les bactériophages spécifiques de genre mais non d'espèce et de sérovar (279) car la
plupart des souches de Listeria monocytogenes sont lysogènes et, par conséquent, héber-
gent des prophages ; la lysotypie .est donc une sensibilité aux bactériophages isolés de
souches lysogènes sachant que certaines souches peuvent libérer plus d'un phage.

La sélection de 29 bactériophages isolés de souches de Listeria monocytogenes, Liste-

ria ivanovii et Listeria innocua a permis d'identifier des lysovars (370) (371) et de déterminer
le phagovar de 54 % des souches de sérogroupe 1/2 et de 77 % des souches de séro-
groupe 4.

Les suspensions de phages sont titrées afin de déterminer la dilution test (RTD ou plus
grande dilution du phage produisant une lyse semi-confluente de la souche) par application
sur les couches de bactéries en phase de croissance logarithmique étalées sur gélose
tryptone.

La lecture est effectuée à l'aide d'une lentille manuelle et d'une lumière à transillumina-
. tian oblique par détermination du nombre et du type de plaques développées sur gélose.

Les résultats sont exprimés ainsi :

- CL = lyse confluente,
-SC= > 200 plaques (lyse semi-confluente),
- ++ = ?: 50 plaques,
- + = 20 à 49 plaques,
- ± = ~ 19 plaques,
- 0 = < 1 plaque.

Cette procédure fait appel à une série de 12 phages pour le sérovar 1/2 et 15 phages
pour le sérovar 4b.
 -108-

Les phages obtenus à partir des souches de sérogroupe 1/2 typent seulement les sou-
ches de ce sérogroupe.

Cette méthode est limitée par le nombre élevé de souches non typables mais elle est
fiable, standardisée et est un instrument utile pour tracer l'origine des souches dans les
études épidémiologiques permettant ainsi de comprendre les épidémies humaines de lis-
tériose en établissant de fortes présomptions d'identité des souches impliquées dans les
cas.

Un système danois de typage de Listeria monocytogenes par les phages (214)

utilise des phages libérés par induction grace à la mitomycine c à partir de souches de
Listeria monocytogenes cliniques et alimentaires ; celle-ci s'avère être un inducteur plus
puissant que les UV (345).

Ce système consiste en deux sous-systèmes : un pour le typage de souches de Listeria

monocytogenes de sérogroupe 1 contenant 12 phages et un autre pour le typage des sou-
ches de Listeria monocytogenes de sérogroupe 4 contenant 14 autres phages.

La propagation des phages est effectuée à la surface des boTtes de gélose Levinthal
(gélose BHIA supplémentée en sang de cheval défibriné) supplémentée en Ca 2+ et préa-
lablement recouverte de souches à tester.

La gélose Levinthal est la plus appropriée pour observer le contraste entre les plaques
de lyse et la couche de croissance bactérienne environnante.

De toutes les conditions étudiées à savoir :

- temps d'incubation : 2, 4 et 6 h,
-dilution: 1/0°, 1/10°, 1/100° et 111000°,
-température d'incubation : 220C, 30°C et 35°C,

seules les boTtes recouvertes avec des cultures en bouillon de 6 h dilué au 1/1 ooo en solu-
tion saline à 30°C produisent des couches bactériennes reproductibles d'épaisseur conve-
nable pour la lecture.
 -109-

Plus de la moitié des phages isolés des souches de sérogroupe 1/2 réagissent avec des
souches de sérogroupes 1/2 et 4.

La grande majorité des phages isolés des souches de sérogroupe 4 réagit avec seule-
ment les souches de même sérogroupe.

Les résultats pour les deux sous-systèmes sont respectivement :

- reproductibilité : 2 90 % et 2 94 %,

- typabilité : 92 o/o et 87 %,

- pouvoir de discrimination : 80 o/o et 87 o/o ; il est estimé par l'index discriminatoire.

Le pouvoir discriminatoire de cette méthode est le plus élevé avec un index discrimina-
toire (Dl) de 0,88 suivie des méthodes REA, MEE et ribotypage avec des valeurs Dl de
0,87, 0,83 et 0,79 respectivement (420).

Les souches de sérotype 1/2 sont mieux discriminées par les méthodes de typage molécu-
laire, en particulier par la REA, avec un Dl de 0,92 alors que les souches de sérotype 4
sont mieux discriminées par la méthode de typage par les phages, avec un Dl de 0, 78.

· La combinaison de la REA et de la MEE est la plus discriminante.

Le typage par les phages est une méthode de typage rapide et peu coûteuse mais pas
aussi reproductible que les méthodes de typage moléculaire.

Cette méthode est donc celle qui convient le mieux à un screening de masse alors que
pour l'étude des relations entre quelques souches, les méthodes de typage moléculaire,
REA et MEE seront préférées, en combinaison ou pas.

LOESSNER et coll. (343) (344) (345) ont mis au point une nouvelle méthode de
typage ou procédure de typage inversée avec 21 bactériophages.
 - 110-

Les boîtes de typage prêtes à l'emploi sont préparées par pré-application de suspen-
sions de phages sur gélose tryptone puis recouvertes de culture de Listeria en bouillon.

Les boîtes stériles séchées (aucune moisissure à la surface) sont préinoculées avec les
suspensions de phages grêce à un applicateur multi-seringue de 4 à 6 J.JI ; de ce fait, 1 ml
de chaque suspension de phage peut permettre de préparer près de 200 boTtes de typage
d'où une efficacité deux fois meilleure par rapport à la méthode conventionnelle.

Le glycérol est ajouté aux préparations de phage ; de ce fait, les gouttes appliquées sont
rapidement absorbées sur la gélose.

Les boTtes préparées peuvent être directement utilisées ou stockées à 4°C jusqu'à utilisa-
tion.

Aucune perte dans l'activité de phage n'est observée pendant un stockage de deux semai-
nes.

Les boîtes sont évaluées sous lumière oblique.

Les particules de phages ne diffusent pas la lumière à travers la gélose ; elles restent dans
l'aire circulaire corncidant avec la goutte d'inoculation.

- 16 phages sont isolés par technique d'induction UV (A006, 8051, 8052, 8053, 8054,
8055, 8056, 8101, 8110, 8111, A 118, A153, 0441, A538, 8545 et 8653) à partir de sou-
ches lysogéniques Listeria.

La combinaison de ces 16 phages avec les phages utilisés habituellement permet de ré-
duire le nombre à 21 phages à savoir; A511, A118, A502, A006, 8653, 8054, 8051,
8055, 8025, 0441, 8545, 8053, 8056, 8101, 8110, C707, 8024, 8012, 8035, A020,
A500 spécifiques de genre pour Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii,
Listeria seeligeri et Usteria welshimeri.

Les phages A118, 8110 et 8653 sont capables de lyser les souches non typables avec le
premier set de phages.
 - 111 -

La procédure inversée offre un nombre d'avantages subtanciels.

L'avantage majeur de cette méthode est qu'il est possible de préparer les boTtes dans un
laboratoire et de les utiliser dans un autre.

Ces boTtes préparées prêtes è l'emploi rend le clonage et la trituration des phages, difficul-
tés majeures, non nécessaires.

L'évaluation des résultats de la procédure inversée est simplifiée par le fait que les réac-
tions inhibitrices sont réduites.

Les réactions communes dans le typage par les phages sont dues è la présence de
bactériocines ou autres substances inhibitrices et/ou protéines libérées par les cellules hO-
tes lysées.

La typabilité des souches est de 89,5% avec 21 bactériophages.

Cette méthode, comparée à la méthode traditionnelle est plus fiable, plus efficace, plus
facile è utiliser et demande moins de travail donc représente un intérêt pour le microbiolo-
giste mais ces deux méthodes sont en accord puisque 97,6% des souches typables mon-
trent le même schéma par ces deux procédures (171 ).

Ill. 2. 2. METHODES DE TYPAGE MOLECULAIRE.

Elles permettent :

- de confirmer l'émergence d'un clone responsable de l'augmentation des cas

humains,

- d'identifier avec plus de certitude l'aliment suspect,

- de caractériser la souche dans un but taxonomique.

 - 112-

Ces méthodes sont :

- l'analyse de la mobilité électrophorétique des enzymes constitutives

(Multilocus Enzyme Electrophoresis) ou typage électrophorétique des enzy-
mes,

-le ribotypage,

- l'analyse des profils de restriction d'ADN chromosomique après digestion avec

des enzymes à.très nombreux sites de coupure et électrophorèse conven-
tionnelle ou après digestion avec des enzymes reconnaissant peu de sites
de restriction et électrophorèse en champ pulsé,

- la technique de génération de polymorphisme par amplification au hasard de

segments d'ADN (RAPD) constituant une alternative à la lysotypie
(amplification génique aléatoire),

- les réactions immunoenzymatiques faisant appel à des anticorps monocle-

naux,

- les profils plasmidiques mais on connart encore peu de plasmides chez Liste-
ria monocytogenes,

- la cytométrie en flux.

Ces méthodes ne sont employées que dans des situations épidémiques.

 -113-

Ill. 3. DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE.

On recense:

- la séroagglutination : elle fait appel à des anticorps dirigés contre les antigè-
nes 0 et H des types 1 et 4b, mais la présence d'anticorps est inconstante
car certains sujets indemnes ont des titres élevés et d'autres ayant contracté
l'infection ne produisent pas d'anticorps; on ne prend en considération que
les titres ~ à 320 ou une montée significative du titre des anticorps à 15 jours
d'intervalle.

Il existe des faux positifs du fait des communautés antigéniques avec les bactéries à
Gram positif comme les Staphylocoques et les Entérocoques.

Le laboratoire OSIBIO propose une méthode utilisant des sérums anti-Listeria 0

types 1, 4 et Poly ou antiglobulines de lapin, de titre élevé, stables et déshydratées pour
l'identification de Listeria monocytogenes par la technique d'agglutination sur lame et en
tube (Annexe V).

Les sérums 1 et 4 sont spécifiques de ces sérotypes tandis que le Poly contient les ag-
glutinines des sérotypes 1 et 4 de Listeria monocytogenes.

Les antigènes Listeria 0 types 1 et 4 sont des suspensions de Listeria monocytogenes

de sérotypes correspondants, ajustées au pH et à la densité recommandés.

L'échantillon à tester est cultivé dans un bouillon ou sur une gélose tryptonée.

La lecture est effectuée après une incubation de 2 heures à 50°C pour la technique en
tube alors qu'elle est immédiate pour celle sur lame.

L'agglutinotest Listeria ou Tetrakit du laboratoire OSI est constitué d'une suspen-

sion stabilisée de particules de latex de polystyrène sur lesquelles sont adsorbés les dé-
terminants antigéniques les plus significatifs du genre Listeria c'est-à-dire les antigènes 1 et
4, 0 et H ; ce test se fait sur lame (Annexe VI).
 - 114-

Cette méthode est souvent pratiquée chez la femme enceinte mais le résultat
étant aléatoire et tardif, elle est de plus en plus remplacée par un isolement de la bactérie
par hémoculture lors de l'épisode fébrile.

Cette méthode peut aussi faire appel à des anticorps fluorescents Usteria Poly
utilisés en technique directe d'immunofluorescence pour l'identification de Listeria monocy-
togenes de sérotypes 1 ou 4 (laboratoire OSIBIO) (Annexe V).

Ces anticorps fluorescents sont des antiglobulines Listeria de lapin, stables, déshydra-
tées, de titre élevé et conjuguées à la fluorescéine.

Après frottis de l'échantillon sur lame ou dépôt de la culture mise en suspension dans
un tampon, sont ajoutés les anticorps conjugués puis l'incubation est réalisée 30 minutes à
température ambiante.

Il existe aussi un test ELISA par chimioluminescence dans lequel l'anticorps mo-
noclonal anti-Listeria capture l'antigène du LCR ; celui-ci réagit avec l'isothiocyanate de
fluorescéine conjuguée au même anticorps monoclonal anti Listeria (FITC-anti FITC) (492).

La présence d'antigène est détectée par un essai de chimioluminescence utilisant un

luminomètre.

RUSSEL (485) a comparé le test d'anticorps immunofluorescents (IFAT) et le test

ELISA pour la détection des anticorps et a montré que le test ELISA est moins spécifique
que le test IFAT.

- les réactions de fixation du complément pour lesquelles le taux significatif est

de1/10°,

- les épreuves de détection de l'hypersensibilité retardée par réaction cutanée

utilisant des extraits bactériens mais pas effectuées en pratique courante,

- la réaction dot-blot utilisant la listériolysine 0 comme antigène.

 - 115-

6ème PARTIE :

TRAITEMENT
 - 116-

1. BASE BACTERIOLOGIQUE ET PHARMACOCINETIQUE DU CHOIX

DES ANTIBIOTIQUES. (55) (479) (566)

1. 1. ASPECT BACTERIOLOGIQUE OU SENSIBILITE.

Listeria monocytogenes est une bactérie très sensible et sa sensibilité reste stable.

Toutefois, des plasmides de résistance ont été démontrés pour le chloramphéni-

col, l'érythromycine, la streptomycine et les tétracyclines (175) mais pas pour les bêtalac-
tamines bien que quelques souches résistantes à l'ampicilline (459) aient été décrites.

Le diagnostic doit être établi très vite de manière à instituer une thérapeutique
précoce donc efficace.

Le choix thérapeutique est fondamental et repose sur l'antibiothérapie.

Le traitement doit être adapté, efficace et bien supporté donc l'utilisation d'un anti-
biotique actif contre le gemie est de rigueur et la connaissance de son pouvoir de diffusion
dans les tissus et principalement à travers la barrière méningée en vue de l'obtention d'un
-
taux de concentration suffisant est nécessaire.

L'activité bactéricide et bactériostatique de l'antibiotique est déterminée par l'anti-

biogramme minimum standard qui comporte habituellement les antibiotiques suivants :
pénicilline G, chloramphénicol, gentamycine, tétracycline, érythromycine, triméthoprime,
sulfaméthoxazole et éventuellement clindamycine étant donné la résistance naturelle de
Listeria monocytogenes vis-à-vis de ce dernier ; la lecture est effectuée après 18 heures
d'incubation à 35°C.

La sensibilité peut être déterminée par la méthode de diffusion sur gélose

MUELLER HINTON supplémentée avec 5 % de sang de mouton défibriné suivie d'une
incubation de 20 heures à 35°C.
 - 117-

Une étude suite à l'épidémie Suisse (479) a permis de mesurer les CMI de 20
antibiotiques vis-à-vis de 7 4 souches de Listeria monocytogenes isolées lors de cette épi-
démie, par cette méthode.

Toutes les souches ont été sensibles entre autres aux pénicillines et à l'association tri-
méthoprime - sulfaméthoxazole.

Par contre, elles ont été résistantes aux céphalosporines.

Aucun effet bactéricide n'a été obtenu avec les antibiotiques utilisés seuls mais les as-
sociations ampicilline - gentamycine, amoxicilline - gentamycine, imipénème - gentamycine
et triméthoprime - sulfaméthoxazole ont été bactéricides.

L'association ampicilline - rifampicine est à peine antagoniste. (Tableau Xli)

Tableau Xli : Activité inhibitrice de 20 antibiotiques vis-à-vis de 7 4 souches cliniques de

Listeria monocytogenes isolées en Suisse.

Concentration Minimale Inhibitrice (J.Jg/ml)

Antibiotique Valeurs limites CMI50% CMI 90%
Pénicilline 0.06-0.5 0.25 0.5
Arnpicilline 0.12-0.5 0.25 0.5
Arnoxicilline 0.12-0.5 0.25 0.25
Arnoxicilline +
·Ac. clawlanlque O. 12/0.06-0.25/0.12 0.25/0.12 0.25/0.12
Pipéracilline 0.5-4 4 4
Céfalotine 1-4 4 4
Céfoxitine 8-64 64 64
Ceftriaxone 8-128 64 128
lmipeneme 0.03-0.25 0.12 0.12
Gentamlcine 0.25-1 0.5 0.5
Chloramphénicol 4-8 8 8
Erythromycine 0.12-0.25 0.25 0.25
Roxithromycine 0.25-0.5 0.5 0.5
Sulfaméthoxazole 16-32 16 32
Triméthoprime 0.03-0.25 0.06 o:06
Triméthoprime +
Sulfaméthoxazole 0.03/0.57-0.12/2.28 0.03/0.57 0.06/1.14
Ciprofloxacine 0.5-2 1 1
Rifampleine 0.03-0.25 0.12 0.12
Vancomycine 1-2 2 2
Teicoplanine 0.25-0.5 0.5 0.5
 - 118-

Listeria monocytogenes est inhibée "in vitro" par de nombreux antibiotiques in-
cluant les pénicillines GetA (CMI 90 < 0,5 1-Jg/ml), les cyclines (CMI 90 < 0,25 1-Jg/ml), les
macrolides (CMI 90 < 0,25 1-Jg/ml), le chloramphénicol (CMI 90 =8), les aminosides (CMI
90 <1 ), la vancomycine (CM 1= 1 ), la triméthoprime et le cotrimoxazole.

En revanche, les céphalosporines ne sont généralement pas actives in vitro envers Lis-
teria monocytogenes.

Ceci est tout à fait net avec les céphalosporines de deuxième et troisième générations (CM 1
90 > 128 1-Jg/ml).

Bien que certaines céphalosporines de première génération aient des CM 1acceptables (2 à

4 !Jg/ml pour la céfaloridine et la céfazoline, 8 !Jg/ml pour la céfalotine), elles s'avèrent inca-
pables de modifier le cours évolutif d'une listériose expérimentale (297).

Deux autres produits par ailleurs actifs sur les bactéries à Gram positif possèdent une
remarquable activité in vitro envers Listeria monocytogenes ; il s'agit de la rifampicine (263)
=
et de la coumermycine (CM 1 0, 06) (264).

MOELLERING et coll. (398) puis BOISIVON (62) ont montré que la pénicilline et
l'ampicilline étudiées à concentration thérapeutique n'exercent pas d'activité bactéricide
envers Listeria monocytogenes.

Ceci est également observé pour les cyclines, le chloramphénicol et les macrolides.

En revanche, l'association ampicilline - gentamycine, de même que le cotrimoxazo-

le exercent une synergie bactéricide "in vitro" tout à fait nette.

A l'inverse, les associations ampicilline - chloramphénicol (601) et ampicilline - rifampi-

cine seraient régulièrement antagonistes envers Listeria monocytogenes.
 - 119-

En résumé, parmi les bêtalactamines, les molécules les plus actives sont les pé-
nicillines A (amoxicilline et ampicilline) avec des CMI basses ; elles sont bactériostatiques
dans les premières heures mais deviennent bactéricides après 24 h de contact pour des
concentrations nettement supérieures à la CM 1.

Les uréidopénicillines et les carboxypénicillines, l'imipénème et la pénicilline G sont ac-

tifs avec des CM 1moins favorables que les précédentes.

Les céphalosporines de première et deuxième générations sont peu efficaces alors que
celles de troisième génération doivent être proscrites du fait de leurs CMI élevées.

Les aminosides du groupe gentamycine, tobramycine sont très actifs (CMI basses) et
présentent un effet bactéricide rapide; ils sont synergiques avec les pénicillines A.

Les macrolides tels que l'érythromycine, de même que le chloramphénicol et les tétra-
cyclines sont bactériostatiques et d'efficacité intermédiaire.

La fosfomycine et les fluoroquinolones sont peu actives, de même que les nouvelles qui-
nolones (péfloxacine) et l'acide nalidixique, la polymyxine et la colimycine.

La rifampicine, d'excellente activité, n'est que bactériostatique.

L'association triméthoprime - sulfaméthoxazole bactéricide peut être utilisée en alterna-

tive aux pénicillines A, associée ou non aux aminosides.

La vancomycine a été utilisée dans quelques cas avec succès, mais un cas de ménin-
gite d'un sujet traité avec la vancomycine et la gentamycine pour une infection à Staphylo-
coccus aureus à la suite d'un cathétérisme cardiaque a été rapporté.

On remarque aussi que parmi les antibiotiques actifs, aucun pris isolément n'a ·d'activité
bactéricide in vitro.
 - 120-

Une bactéricidie est donc obtenue avec les associations amoxicilline - gentamycine, tri-
méthoprime - sulfaméthoxazole, gentamycine - triméthoprime - sulfaméthoxazole, amoxicil-
line - triméthoprime - sulfaméthoxazole, rifampicine - triméthoprime - sulfaméthoxazole,
imipénème - gentamycine avec un effet synergique.

Par contre, les associations rifampicine - ciprofloxacine et amoxicilline - ciprofloxacine

sont bactéricides.

Les associations d'une bêtalactamine avec du chloramphénicol ou de la rifampicine ou

de l'érythromycine ou une tétracycline sont antagonistes.

1. 2. ASPECT PHARMACOCINETIQUE.

L'antibiothérapie se heurte à trois difficultés :

- le site intracellulaire de Listeria monocytogenes,

- les localisations neurologiques rendant le franchissement de la barrière hé-

moméningée obligatoire,

- le terrain souvent immunodéprimé,

d'où le triple impératif de prescrire une antibiothérapie :

- ayant un taux de pénétration intracellulaire suffisant,

- franchissant bien la barrière hémoméningée,

- assurant une bactéricidie in vivo.

Cette exigence pharmacocinétique comporte deux versants :

-de façon générale, Listeria monocytogenes est source d'infection à localisa-

tions intra et extracellulaires.
 - 121 -

L'antibiotique doit pouvoir éradiquer les bactéries non seulement dans les liquides in-
terstitiels et les compartiments transcellulaires mais également dans les cellules macro-
phagiques.

De nombreuses études ont prouvé que les bactéries phagocytées par les polynucléaires
sont protégées de l'action des bêtalactamines présentes dans le milieu extracellulaire.

Par contre, il a été démontré que la pénicilline peut tuer une souche virulente de Listeria
monocytogenes dans les macrophages de la souris à condition que la concentration soit
plus de trois fois la CMI.

La situation intracellulaire de Listeria monocytogenes ne semble donc pas être un obs-

tacle à l'emploi des bêtalactamines ; de même, le cotrimoxazole, la rifampicine, les cyclines,
les macrolides et le chloramphénicol pourront également être utilisés du fait de leur bonne
pénétration intracellulaire.

- les listérioses neuroméningées sont des infections à la fois intraméningées et

intracérébrales dont les séquelles et les évolutions fatales sont généralement
dues à l'atteinte cérébrale.

Les antibiotiques employés doivent donc accéder à concentration suffisante et ceci pen-
dant toute la durée du traitement au sein de ces deux structures, lesquelles ne possèdent
. pas un comportement identique face aux antibiotiques.

L'état inflammatoire du territoire méningé avec hypercytose et hyperprotéinorachie ma-

jore le passage des bêtalactamines surtout dans le LCR et des aminosides mais seulement
en phase aiguê d'inflammation méningée pour ces derniers alors qu'il n'influence pas le
passage du triméthoprime dans le LCR.

Au niveau cérébral, le passage des antibiotiques dépend de facteurs physico-chimiques

comme le degré de liposolubilité qui intervient de façon plus importante que dans le cas du
passage hémoméningé.

Le chloramphénicol est plus concentré dans le tissu cérébral que dans le LCR alors que
la pénicilline G a une moins bonne concentration cérébrale que méningée.
 -122-

Les concentrations intrathécales de triméthoprime et de sulfaméthoxazole représentent

respectivement 40 % et 20 % de la concentration sérique.

Ainsi, la pénicilline, l'amoxicilline, le chloramphénicol, la rifampicine, l'imipénème,

le triméthoprime et les quinolones ont un comportement pharmacocinétique favorable alors
qu'il est défavorable pour les cyclines, les aminosides, les macrolides et la vancomycine.

Les diffusions placentaire et fœtale sont satisfaisantes pour l'amoxicilline.

Il. TRAITEMENTS DES. DIFFERENTES SITUATIONS CLINIQUES. (55)

L'usage est d'utiliser pour le traitement des formes sévères (neuroméningée, ma-
terna-fœtale) et/ou survenant chez l'immunodéprimé une association d'ampicilline ou
d'amoxicilline et d'aminoside.

Il. 1. LISTERIOSE NEUROMENINGEE.

C'est un traitement d'urgence reposant sur l'association amoxicilline (200 mg/kg/j)

en six perfusions courtes et d'un aminoside type streptomycine, gentamycine, framycétine
(6 mg/kg/j) par voie intraveineuse, générale et/ou intrathécale.

La durée n'est pas clairement codifiée mais, en général, elle est de 3 à 4 semai-
nes pour éviter toute récidive éventuelle.

En cas d'allergie aux bêtalactamines ou de forme encéphalitique dominante, l'as-

sociation chloramphénicol- aminoside peut être proposée.

Le cotrimoxazole (2 x 240 mg/j quelques jours puis 2 x 2 comprimés à 800 mg/j

pendant 2 à 4 semaines) par voie intraveineuse est une alternative intéressante, de même
que l'association amoxicilline - cotrimoxazole en intraveineuse ; cela reste préférable pour
traiter les listérioses neuroméningées lorsque les signes d'inflammation méningée ont ré-
trocédé.

Exceptionnellement, on fera appel à la corticothérapie indiquée lors de décompen-

sation cardiorespiratoire.
 -123-

La rifampicine est un médicament potentiellement intéressant dans ce cas de fi-

gure mais il n'existe pas d'étude clinique documentant son efficacité.

De plus, les associations rifampicine - quinolone ou rifampicine - cotrimoxazole mérite-

raient une attention particulière en raison de leur excellent comportement pharmacocinéti-
que et justifieraient des études bactériologiques expérimentales et cliniques faisant défaut
actuellement.

Il. 2. SEPTICEMIE A LISTERIA.

Pour certains, une monothérapie par amoxicilline serait suffisante dans de nom-
breux cas, l'addition d'un aminoside n'étant indiquée qu'en cas de facteurs de mauvais pro-
nostic (âge > à 50 ans, maladie sous-jacente, greffe rénale, défaillance cardiaque, rénale
ou respiratoire).

Il. 3. LISTERIOSE NEONATALE.

Devant une infection précoce (premières 48 h), le traitement doit être débuté en
urgence, après réalisation des divers prélèvements et faire appel à une amoxicilline ou une
uréidopénicilline par voie intraveineuse.

On peut aussi proposer la triple association amoxicilline, céphalosporine de troi-

. sième génération et aminoside.

Le traitement de référence de la listériose systémique précoce et de la méningite

néonatale est l'association amoxicilline (200 mg/kg/j) par voie parentérale (1 M ou IV) et
gentamycine (3 mg/kg/j) en deux injections par voie intramusculaire et la durée est de 10
jours en cas de septicémie et d'au moins 3 semaines devant une méningite.

On associe généralement un traitement symptomatique de la détresse respiratoire

et des traitements généraux telle qu'une exsanguinotransfusion en cas d'ictère ou de syn-
drome hémorragique de manière à stimuler les moyens de défense de l'enfant en lui appor-
tant des agents anti-infectieux ou des éléments figurés actifs.
 - 124-

L'antibiothérapie doit tenir compte de divers facteurs :

- absorption digestive plus lente,

- vitesse de diffusion des injections intramusculaires irrégulières,

- grandes variations du volume des liquides extracellulaires modifiant les con-

centrations sériques et tissulaires,

- hypoalbuminémie laissant une partie de l'antibiotique libre,

- immaturité enzymatique hépatique conduisant à un retard d'élimination,

- immaturité rénale avec risque d'accumulation.

Il. 4. LISTERIOSE DE LA FEMME ENCEINTE (MENINGITE EXCLUE).

La prescription d'amoxicilline par voie orale pendant 1 0 jours et la pratique d'hé-

moculture doit être systématique devant toute fièvre isolée inexpliquée persistant plus de 5
jours ou devant tout état pseudogrippal (fièvre, frissons, courbatures) survenant chez une
femme enceinte.

Dans le cas où les hémocultures sont positives, on associe amoxicilline (6 à 12 g/j)

et gentamycine (4 mg/kg/j) par voie intraveineuse pendant 15 jours.

Certains préconisent une poursuite de l'amoxicilline (4 g/j) per os jusqu'à terme

dans le cas où la listériose survient au cours du troisième trimestre de la grossesse.

Un macrolide sera utilisé en cas d'allergie à la pénicilline.

Les antibiotiques utilisés chez la femme enceinte doivent être :

- efficaces sur l'infection maternelle,

- diffusibles à travers la barrière placentaire,

 - 125-

- bactéricides,

- dépourvus de toxicité pour le fœtus ( pas de tétracyclines en raison de leur

action nocive sur les phanères et le squelette).

Il. 5. LISTERIOSE DE L'IMMUNODEPRIME.

L'association amoxicilline - aminoside aux doses citées précédemment est de ri-

gueur bien que le cotrimoxazole par voie intraveineuse semble être une alternative intéres-
sante chez les patients immunodéprimés.

L'association ampicilline - aminoglycoside reste le traitement de référence.

En cas d'intolérance aux bêtalactamines, de résistance primaire à l'ampicilline ou

d'échec secondaire à l'association ampicilline- gentamycine, le cotrimoxazole trouve une
excellente indication bactériologique et pharmacocinétique en cas de listériose neuromé-
ningée.

Le chloramphénicol associé aux aminosides reste une alternative envisageable

pour les formes encéphalitiques graves.

Enfin, la rifampicine, en association avec les quinolones ou le cotrimoxazole, méri-

. terait d'être évaluée.
 -126-

7ème PARTIE :

PROPHYLAXIE
 - 127-

1. MEDICALE. (55)

1.1. VACCINATION.

Des essais de vaccination ont été tentés chez la souris (226), pour l'instant sans
succès.

Chez l'animal, la prophylaxie vaccinale est encore du domaine expérimental ; elle

ne se justifie pas du fait du prix élevé des vaccins.

1. 2. IMMUNITE. ALLERGIE.

Listeria monocytogenes est un parasite intracellulaire facultatif ; il n'est pas détruit

par les macrophages.

Cette résistance appelée "résistance cellulaire acquise" est proche de l'hypersen-

sibilité retardée et du mécanisme de rejet des greffes d'où la fréquence plus élevée chez
les sujets immunodéprimés.

Listeria monocytogenes est un germe peu antigénique n'entraînant pas de stimu-

lation importante des mécanismes de défense immunologique ; l'immunité est essentielle-
ment de type cellulaire ; elle est spécifique en empêchant toute réinfestation d'une souris
immunisée et non spécifique en protégeant l'organisme des infections à Brucella, Mycobac-
téries et champignons à développement intracellulaire.

On a remarqué que la vaccination par le BCG aurait pour conséquence une pro-
tection contre Listeria.

1. 3. PREVENTION DE L•INFECTION GRAVIDIQUE.

Elle est primordiale du fait du retentissement infectieux sévère chez le fœtus et du

dépistage systématique par prélèvement vaginal ou par sérologie decevant et peu rentable.
 -128-

Elle repose sur l'amélioration du pronostic de la listériose néonatale par :

- un dépistage systématique et un traitement précoce de l'infection maternelle ;

cela consiste en une hémoculture principalement mais aussi un examen
cytobactériologique des urines, des prélèvements nasopharyngés, vaginaux
(culs de sac et col) ainsi qu'une antibiothérapie par ampicilline systématique
devant tout épisode fébrile de la femme enceinte.

-un examen anatomique et bactériologique (frottis et culture) systématique du

placenta, des prélèvements effectués au niveau des muqueuses (buccale,
anale, vulvaire, nasale) et des prélèvements de sang et de LCR dès l'accou-
chement en présence d'un prématuré fébrile ; la positivité de ces examens
permettra d'instituer une thérapeutique précoce du nouveau-né et de la mère
infectés ; cela constitue une prévention efficace.

On peut réaliser une antibiothérapie pendant le travail ou une immunisation de la

mère au cours du troisième trimestre de la grossesse; ceci est à l'étude.

L'antibiothérapie de trois semaines par l'ampicilline de la mère contrôlée par la

négativation des prélèvements cervicaux permet d'éviter une nouvelle atteinte du fœtus lors
d'une grossesse ultérieure dans le cas où le diagnostic n'est fait que pendant ou après l'ac-
couchement.

Enfin, certains préconisent une antibiothérapie prophylactique mais elle est jugée
dangereuse par d'autres (66) (543).

Il. SANITAIRE. (55)

Il. 1. MESURES PARTICULIERES.

Elles émanent du Laboratoire National de la Santé pour la France et du "Center for

Disease Control" pour les Etats-Unis et touchent deux catégories de personnes.
 - 129-

Les mesures concernant toutes les personnes sont les suivantes :

- cuire soigneusement les aliments d'origine animale,

-laver soigneusement les légumes crus et les herbes,

- conserver séparément les viandes non cuites des légumes et des aliments
cuits ou prêts à être consommés,

- éviter la consommation de lait cru ou d'aliments au lait cru,

- laver mains, couteaux et planches à découper après la manipulation d'ali-

ments non cuits,

- nettoyer fréquemment (au moins deux fois par mois) et désinfecter ensuite
avec de l'eau javellisée le réfrigérateur.

Les personnes à risque (femmes enceintes, immunodéprimés et personnes

êgées) doivent en plus:

- ne pas consommer en l'état les produits de charcuterie cuite Uambon, épaules

cuites tranchées sur les lieux de vente, pêté, produits en gelée) et leur préfé-
rer des produits préemballés,

- réchauffer jusqu'à ébullition avant consommation les restes alimentaires ou les

aliments prêts à être consommés,

- ne pas consommer d'aliments ayant séjournés dans le réfrigérateur plus

longtemps que la date limite de consommation,

- enlever la croate des fromages,

- éviter les fromages à pate molle et les bleus et leur préférer les fromages à
pate cuite ou fondue qui ont subi un traitement thermique détruisant les Lis-
teria,
 -130-

LES 24 FROMAGES MIS A L'INDEX

Fromages suisses à pâte molle retirés de Fromages français à pâte persillée, re-
la vente : tirés de la vente en Suisse :
Munsterlinger Mônchen-Mutschli ; Co- Léger Bresse Bleu Servas ; Bresse Bleu
raul de Gruyère ; Vacherin fribourgeois ; Servas;
Reblochon. Fourme Bresse Bleu Servas ; Blubry' s
Fromages suisses à pAte dure ou mi- Bresse Bleu.
dure encore dans le commerce : Fromage italien à pAte molle retiré de la
Rutti Vacherin; Rutti raclette; Rutti Til- vente en Suisse :
sitar. Gorgonzola Impérial.
Fromages français à pAte molle retirés Fromage autrichien l pite molle retiré
de la vente en Suisse : de la vente en Suisse :
Touré de l'Aubier ; Munster Jerome Lis- Saint Paulin.
beth ; Crème de Bleu Diapason ; Demi- Fromages français interdits en Suède et
Pont I'Evêque ; Pont d'Auge Pierre Le- en Allemagne :
vasseur ; Munster ermitage ; Brie la Re- Fourme de Bresse (listeria trouvées) ;
nommée Xertigny ; Vacherin et Touré de l'Aubier (présomp-
Marquis de Crémembert Saint Hubert ; tion de contamination). Le Lys Bleu, un
QUE CHOISIR 7 Edelweiss de Cléron (petit vacherin) ; moment suspecté par la Suède, a été,
Brie Président. depuis, lavé de tout soupçon. •
(-:J~'f\VtH ~f:)

Les femmes enceintes doivent également consulter un médecin tout de suite en

cas de poussée de fièvre isolée sans cause évidente ou accompagnée de syndromes mé-
ningés.

Celui-ci fera effectuer une hémoculture et une recherche de germes au site infectieux en
connaissant la faible rentabilité du prélèvement vaginal.

En milieu obstétrical, il convient d'être particulièrement vigilant à la désinfection de

la salle d'accouchement, du matériel obstétrical et aux soins donnés aux nouveau-nés en
nourricerie en raison du risque d'infection nosocomiale.

Effectivement, il est nécessaire d'instaurer des consignes d'hygiène rigoureuses en salle

de travail et lors des soins aux nouveau-nés pour éviter tout risque de transmission à un
stade où l'infection n'est souvent ni connue ni même suspectée ;

- hygiène des mains rigoureuse,

- utilisation de matériel à usage unique,

 - 131 -

- nettoyage et désinfection corrects des surfaces et du matériel d'examen ou de soins

à usages multiples,

- organisation des locaux de façon à pouvoir examiner les nouveau-nés dans leur
chambre en évitant les contacts avec les autres.

Il. 2. MESURES GENERALES.

La prophylaxie sanitaire comporte :

- le dépistage et le traitement des animaux malades ou porteurs de germes,

- la désinfection des locaux, des pâturages, du matériel,

- le contrôle des ensilages,

- l'assainissement des eaux potables et usées,

- la destruction des produits d'avortement,

- la lutte contre les rongeurs,

- le contrôle des engrais et des sols,

-la protection du personnel vétérinaire et du personnel des abattoirs et d'autres

industries alimentaires,

- les enquêtes sérologiques et bactériologiques réalisées dans l'entourage des

malades permettant de déceler les porteurs sains,

- la désinfection des locaux de l'hôpital et des crèches lors de la survenue d'une

listériose,

- la prévention de l'infection gravidique,

 -132-

- l'hygiène de l'habitat, des matériels de fabrication,

- le nettoyage et la désinfection des usines,

-la désinfection des caves d'affinage; celle-ci est plus difficile que celle des
autres lieux de fabrication car il faut conserver les "bonnes" bactéries et éli-
miner les "mauvaises" ; la cave sera ensuite réensemencée avec des bacté-
ries nécessaires à l'affinage des fromages,

-le contrOle des denrées alimentaires; l'éradication de Listeria des produits

alimentaires est la base de la prévention ; elle repose sur l'application dè
traitements listéricides (chauffage ou irradiation) ou listériostatiques
(acidification, congélation) en fonction du type d'aliments considérés.

Cette éradication s'exerce à différents niveaux:

- aux différentes étapes de la chaîne alimentaire qu'il s'agisse de la production (traite,

élevage), de la transformation, de la logistique (transport, entrepOt), de la distri-
bution (coupe) avec la mise en place d'un système global de prévention
(assurance qualité),

- au niveau du consommateur comme nous l'avons vu précédemment.

Cette éradication sera traitée en détail dans la Bème partie au§ VIl.

Nous pouvons également citer le rOie primordial du bactériologiste dans la sur-

veillance épidémiologique des cas de listériose afin d'éviter la dispersion d'une épidémie.

Il doit, en effet :

-envoyer régulièrement toutes les souches de Listeria monocytogenes, isolées

de patients, au Centre National de Référence,
 - 133-

- contacter la Direction Générale de la Santé et le Laboratoire National de la

Santé lors d'une augmentation anormale du nombre de cas, afin d'éviter
l'évolution vers une épidémie.

La prévention repose donc essentiellement sur des mesures individuelles pour la

contamination directe et la surveillance de la qualité des denrées alimentaires, autant de
mesures difficiles à observer en raison de la distribution de la bactérie dans la nature et de
sa résistance.
 -134-

Sème PARTIE :

LISTER/A DANS
LES DENREES
ALIMENTAIRES
 -135-

1. CONTAMINATION DES DENREES ALIMENTAIRES.

1.1. ORIGINE DE LA CONTAMINATION. (97)

Listeria monocytogenes est un germe banal de l'environnement ainsi qu'un germe

saprophyte que l'on peut isoler de la surface des sols humides, boueux, incultes ou en ja-
chère, de la plupart des végétaux, principalement les feuilles fanées ou en voie de décom-
position mais, de façon moins fréquente des sols cultivés.

La contamination des ensilages est donc fréquente et ceci d'autant plus que ces
derniers auront été préparés sans précaution, seront souillés de terre ou insuffisamment
tassés.

Elle peut atteindre 12000 à 100000 germes par gramme et peut persister des années.

On a également remarqué que des ensilages de bonne qualité mais dont le pH est infé-
rieur à 4 peuvent contenir des Listeria, mais à des taux tout de même moindres.

Les effluents sont fréquemment contaminés (élevages, abattoirs, industries ali-

mentaires diverses).

Les traitements d'épuration n'affectent que peu ou pas les Listeria donc elles sont
-retrouvées dans presque la totalité des eaux de surface, rivières, lacs et canaux.

La pérennité de la contamination du milieu extérieur est assurée par les apports

constants issus des activités humaines et l'existence de réseNoirs animaux domestiques
ou sauvages.

Le portage sain s'effectue au niveau du tube digestif et de l'appareil respiratoire, et

ceci aussi bien chez les hommes que chez les animaux.
 -136-

Les matières premières des industries alimentaires peuvent également être con-
taminées:

-les viandes, le lait et les produits animaux, consommés en l'état, du fait des
techniques de production comme le phénomène de bactériémie ou une
erreur dans fa technologie de production des denrées telles que la contami-
nation de la surface des viandes par des matières fécales lors de l'éviscéra-
tion ou le rinçage des rayons contaminés par le lait lors de la traite.

Listeria est aussi présente de façon inévitable dans les filières.

- les produits transformés crus, préparés à partir de matières premières variées,

manipulés, stockés au froid, transportés, présentent un risque de contamina-
tion plus élevé ainsi qu'une intensité plus grande.

- les produits transformés cuits ayant subi· un chauffage à cœur au moins

équivalent à un traitement de pasteurisation sont en principe exempts de
Liste ria.

Cependant, les possibilités de recontamination après cuisson sont multiples :

- par les locaux et le matériel nettoyés selon un protocole inadéquat ou lorsque le

même local héberge plusieurs types de fabrication (produits crus et produits cuits);
c'est le cas des tapis roulants,

-par l'ambiance: eau (conduites d'eau, prises d'eau, condensations), air véhiculant
des poussières ou des aérosols contaminés d'où l'importance de mattriser les flux,

- par certains vecteurs animés comme l'homme vecteur actif (porteur sain) ou passif,
transmettant une contamination d'un milieu à un autre, mais aussi les insectes et
les rongeurs.
 -137-

La maîtrise des Listeria dans ce type de produits est essentielle car les germes introduits
accidentellement rencontrent un substrat nutritif et des conditions favorables pour leur déve-
loppement (milieux riches, absence de flore compétitive, stockage long à température
basse).

1. 2. FREQUENCE DES CONTAMINATIONS. (97)

1. 2. 1. PRODUITS CARNES.

L'isolement de Listeria à partir des carcasses est classique comme le montrent les
chiffres suivants :

-jusqu'à 57 % des carcasses de volailles,

- de 6 à 30 % des carcasses de bovins,

- près de 5 % des carcasses de porcs,

Il semble qu'un prélèvement effectué par écouvillonnage de la surface d'une car-

casse, peu de temps après l'abattage, ne permette pas d'isoler Listeria alors que le prélè-
vement de lambeaux superficiels après quelques heures de réfrigération le permet.

La contamination est soit d'origine fécale au moment de la préparation des carcas-

ses sur la chatne, soit due à l'environnement au cours de la réfrigération et du stockage du
fait des manipulations, des contacts avec des carcasses ou d'autres surfaces polluées ou
de l'entreposage dans une atmosphère contaminée (poussières et aérosols).

Des prélèvements ont été effectués dans deux abattoirs suisses pour bovins et
porcins et examinés quant à la présence de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp.
(21 9) ; l'abattoir 1 est une exploitation importante et moderne tandis que l'abattoir 2 est plus
petit et plus traditionnel (Figures 3, 4, 5) (Tableaux Xlii, XIV).

931 échantillons de peaux, carcasses, organes et contenus intestinaux de bovins et de

porcins et 247 échantillons de l'environnement (équipement, surfaces de travail, sol, parois)
ont été collectés.
 -138-

Tableau Xlii : Contamination des bovins analysés.

Paramètre n Listeria spp. (%) L. innocua L. monocytogenes (%)

Contenu intestinal 24 2 (83%) 2 0

Rate 24 0 0 0
Poumons 24 2 (8.3%) 1 1 (4.2%)
Peau de l'animal vivant 32 5 (15.6%) 4 1 (3.1%)
Peau après saignée 56 24 (42.8%) 18 8 (14.3 %)
Carcasse après dépouillement 32 0 0 0
Carcasse au pesage 32 1 (3.1%) 1 0
Carcasse en local frigorifique 80 1 (1.2%) 1 0

Figure 3 : Contamination par Listeria spp.

des carcasses bovines de l'abattoir 1 .

Pourcentage
d'échantillons
positifs l%1
60,-----------------------------------------------

lfEii L.monocyto~enes D L.lnnocua J

30:

i
20'

0
Animal Après Après Au Après
vivant saignée dépouillement pesage douchage
n • 32 44 32 32 56
 -139-
Tableau XIV : Contamination des porcins analysés.
Paramètre n Listeria spp. (%) L. innocua L. monocytogenes (%)

Contenu intestinal 30 2 (6.7%) 2 0

Rate 36 1 (2.8%) 1 0
Poumons 36 3 (8.3%) 3 0
Amygdales 171) 1 (5.9%) 1 0
Musculature 36 0 0 0
Peau de l'animal vivant 56 13 (23.2%) 13 0
Peau après saignée 92 47 (51.1%) 41 9 (9.8%)
Peau après épilage 24 0 0 0
Peau après suspension 74 41) (5.4%). 3 1 (1.3%)
Peau après flambage 422) 0 0 0
Peau au pesage 56 1 (1.8%) 1 0
Peau en local frigorifique 92 8 (8.7%) 2 6 (6.5%)
Carcasse: face interne 36 1 (2.8%) 1 0
1) = uni uement de l'abattoir 2 P rcenta e .
uni~uement de l'abattoir 1 d'~~hantip~ns Figure 4 : Contam1nat1on par L1stena spp.
positifs (%] des carcasses porcines de l'abattoir 1.
60-----------------

~If& L.monocytogenes =:: L.innocua 1

i
40[

30

20:
!
[120 5<t.l

10
_ _: :1.:-;

0
Pourcentage Animal Après Après Après Après Au Après
d'échantillons vivant saignée épila ge suspension flambage pesage douchage
positifs (%] n • 24 42 24 24 42 24 42
60------------------

, 4 6-ll. [:ill] L.monocytogenes C L.innocua 1

40:
i

Figure 6 : Contamination par Listeria spp.

des carcasses porcines de l'abattoir 2.

0 '----'----'----""<'="""'
Animal Après Après
vivant saignée suspension pesage
n • 32 50 50 32 50
 -140-

La peau se révéla être une source importante de contamination et une dissémination

des germes, par contact direct ou indirect, lors de l'amenée, de l'étourdissement et de la
saignée des animaux, a pu être démontrée, du fait de l'augmentation du pourcentage
d'échantillons positifs de 20 à 50 %.

Le dépouillement des bovins, de même que l'échaudage et le flambage des porcs en-
traînent une diminution puisque 1,2% des carcasses bovines et 8,7 o/o des carcasses por-
cines étaient encore positives en local frigorifique.

Quant aux postes de travail, le dépouillement des bovins, l'étourdissement et la suspen-

sion des porcs, l'évacuation des carcasses vers les locaux frigorifiques se sont révélés être
fortement contaminés.

De ce fait, la séparation stricte du personnel travaillant dans la partie "sale" (amenée des
animaux, étourdissement et saignée) de la partie "propre" est d'une très grande impor-
tance, de même que d'éviter tout contact entre des installations fixes (portes, murs, po-
diums de travail) et les carcasses.

La contamination de la viande de porc peut se faire à trois niveaux (8) :

- en élevage : elle est faible du fait des conditions modernes d'élevage

(bâtiments fermés, alimentation granulée).

Le taux de Listeria monocytogenes dans les déjections est supérieure chez les porcs
nourris avec des végétaux frais ou du maïs humide.

- à l'abattage : à ce niveau, la contamination, bien que faible, est due à :

. la technologie d'abattage : la chaîne comporte plusieurs points critiques :

- anesthésie-saignée car les électrodes des pinces d'anesthésie, le sol à

ce niveau, le couteau de saignée sont fréquemment contaminés d'où
la nécessité de désinfecter aussi souvent que possible le couteau de
saignée et de limiter les mouvements du personnel chargé de l'anes-
thésie et de la saignée vers d'autres postes.
 - 141 -

- échaudage : dans les bacs d'échaudage avec immersion, du fait des

battements cardiaques ou d'inspirations réflexes, les germes peuvent
pénétrer dans la plaie de saignée, la bouche et le tractus respiratoire
d'où la contamination des poumons à ce niveau.

Listeria n'est pas détruite à la température de l'eau d'échaudage (61-63°C).

- épilage, flambage, polissage : la pression exercée par les racloirs lors de

l'épilage extériorise les fèces ce qui peut souiller la peau.

La décontamination superficielle est effectuée au niveau du four à flamber mais les fla-
gelleuses sont sources de nouvelles contaminations par l'eau.

- éviscération : si le tractus n'est pas correctement sectionné et prélevé, le

contenu intestinal peut polluer la carcasse.

Le douchage des carcasses ne permet pas de décontaminer les surfaces, au contraire

l'eau représente une source de contamination .

. l'hygiène du personnel : les mains, les vêtements et les instruments sont

les sources les plus fréquentes de contamination mais l'homme en tant
que porteur sain constitue aussi un réservoir.

. la réfrigération : les manipulations de carcasses par les opérateurs et les

contacts entre carcasses favorisent les contaminations croisées du fait de
l'aptitude des Listeria à se développer à basses températures .

. le nettoyage et la désinfection des locaux et matériels dont l'insuffisance ou

l'absence permet la multiplication de Listeria et la contamination des
carcasses.

-des produits finis: la contamination est beaucoup plus fréquente et le risque

est augmenté par la longueur du process et le nombre d'interventions.
 -142-

On distingue :

- les viandes fraîches pouvant être contaminées par l'environnement (sol, eaux, ma-
tériel de nettoyage et de découpe comme les scies, les couteaux et les tables de
travail), par le personnel et par les contacts entre les morceaux ce qui favorise les
contaminations croisées.

Le tranchage, le hêchage, le malaxage sont des opérations très contaminantes.

A ce niveau, la quantité de Listeria résulte de la qualité de la matière première et de

l'hygiène de l'abattage et de la découpe.

- les produits cuits : 50 % des échantillons de pêté peuvent contenir des Listeria car
de multiples recontaminations peuvent survenir après la cuisson, si l'hygiène n'est
pas respectée.

La quantité de Listeria est ici le reflet de la qualité de l'environnement des denrées et de

la maîtrise des process.

En général, quel que soit le type de viande, la contamination touche :

- 8 à 87 % des viandes hêchées ; elles sont donc un excellent milieu de culture,

- 25% des viandes fralches,

- 10 à 43 % des charcuteries crues,

- 5 % des charcuteries cuites,

- 12 à 37 % des produits à base de viande prêts à consommer,

- 47 % des volailles.
 -143-

Une enquête menée, en 1991 par les Services Vétérinaires du Ministère de l'Agri-
culture, montre une contamination de :

- 14,8 % des produits de saucisserie fraîche, produits fumés et saucissons

secs,

- 1,2 o/o des plats cuisinés à base de viande,

L'intensité de la contamination est variable : de 20 à 100/g du fait du phénomène

de compétition de flore.

1. 2. 2. PRODUITS LAITIERS.

Les laits crus sont contaminés de façon variable et d'autant plus que l'alimentation
de la femelle laitière comporte de l'ensilage.

Les chiffres, pour l'espèce bovine, sont les suivants :

- 5 % pour les laits crus de vache (1 0 à 1000/ml),

- 10 à 23% pour les fromages à pâte molle (10000 à 107/g),

- parfois 20 % pour les laits pasteurisés, en cas de pasteurisation mal effectuée

et de recontamination après traitement.

1. 2. 3. PRODUITS DE LA MER.

4 à 8 % des poissons, crustacés et coquillages sont contaminés (200/g) de façon

discrète.

1. 2. 4. VEGETAUX.

Ils sont fréquemment et intensément contaminés (salade, chou, céleri, tomate) du

fait de l'épandage de fumier, des lisiers, des boues de station d'épuration (10 7/g).
 -144-

Il. INCIDENCE ET CROISSANCE DANS LES DENREES ALIMENTAI-

RES.

Il. 1. PRODUITS CARNES.

La contamination touche une grande variété de viandes avec une incidence

{CFU/g) variant grandement du fait des différences des méthodes de détection comprenant
des facteurs comme la méthode utilisée, la taille de l'échantillon, le nombre de colonies et la
source de l'échantillon (commerce de détail ou grande surface).

Les contaminations se produisent, en général, en surface.

Listeria monocytogenes a récemment été trouvée dans le cœur des muscles de 5

des 11 0 échantillons de rôti de bœuf, de porc et d'agneau (288).

Ces organismes sont probablement présents dans le muscle au moment de l'abattage.

Le sérotype 1 est principalement trouvé dans les viandes courantes bien que dans
le pâté responsable de l'épidémie survenue en Angleterre en 1989, le sérotype 4b ait été le
plus fréquemment isolé (400).

Alors que la plupart des cas de maladies humaines semble être due au sérotype
4b, quelques auteurs affirment. que la viande n'est pas impliquée dans les éruptions de
listériose d'origine alimentaire.

Ceci n'est pas complètement vrai, puisqu'il y a eu plusieurs épisodes de listériose spo-
radique et épidémique impliquant le sérotype 1.

Mais il est évident que plusieurs produits de viande contaminés apparaissent contenir
des taux plus bas que la plupart des fromages à pâte molle.

Le poulet semble être hautement contaminé ; les études montrent un taux de

contamination de l'ordre de 10 à 60 % et le sérotype 1 comme sérotype dominant.
 - 145-

Les facteurs influençant la colonisation des poulets rOtis ont été examinés et il ressort de
cette étude que les plus jeunes oiseaux sont plus sensibles que les plus ègés (16).

En effet, dans le cas des poulets êgés d'un jour, une moyenne de 10 2 à 10 6 germes ap-
porte une colonisation de 20 % (3 des 15) et 73 % (11 des 15) des oiseaux infectés.

La volaille peut se contaminer dans l'environnement durant la production ou à partir des

poulets porteurs sains durant le traitement (16) (21 0).

Certaines études montrent que Listeria monocytogenes est incapable de pousser

dans la viande stockée à 4 ou à 25°C (287), d'autres démontrent le contraire (108) (218)
(513).

L'étude menée dans la viande hâchée à 4°C a montré que le nombre de Listeria
reste inchangé durant plus de 30 jours, ce qui confirme le comportement psychrotrophe
des Listeria (513).

Le nombre de Listeria diminue d'environ 1 log CFU/g de viande de bœuf hêchée

stérile stockée à 8 oc puis demeure constànt.

L'hypothèse la plus vraisemblable est que la viande manque d'un élément nutritif néces-
saire à la croissance des Listeria et que la dégradation du muscle par les bactéries protée-
. lytiques comme Pseudomonas fluorescens peut permettre à la croissance de Listeria de se
produire, du fait de la libération d'éléments nutritifs directement assimilables (227).

Le lactate de sodium (1,8 % ), l'érythorbate de sodium (0, 1 % ), le kappa-

carraghénane (1 %) et les alginates liant la viande (l'alginate de sodium (0,4 %), l'acide lac-
tique (0,6 %) et le carbonate de calcium (0,075 %)) n'ont pas d'effet sur le nombre de Lis-
teria dans la viande de bœuf hâchée crue, stockée en aérobie à 4°C.

Par contre, les alginates et le kappa-carraghénane entrafnent une faible destruction de

Usteria monocytogenes dans la viande de bœuf hèchée cuit~ stockée en aérobie à 4°C
(243).
 -146-

La croissance semble être fortement dépendante de la température et du pH de la

viande, du type de tissu et du type et de la quantité de microflore secondaire.

re ou moins, Listeria monocytogenes est incapable de croltre dans la viande

En effet, à
avec une microflore de 1 0 5 CFU/g alors qu'à 25 oc, aucune croissance n'est observée avec
une microflore de 107 CFU/g.

La croissance dépend du type de produit et du pH, comme l'ont montré GLASS et

DOYLE (218) ; en effet, elle s'effectue à pH s 5 et la volaille la supporte mieux que les au-
tres viandes comme le rôti de_ bœuf, les saucisses et les hot dogs pour lesquels les facteurs
inhibiteurs sont le pH, la combinaison pH - activité de l'eau et la fumée liquide.

, Les préparations de fumage liquide utilisée pour la fabrication des saucisses ont effective-
ment une activité antilisteria du fait de leur teneur en phénols (256).

La croissance est supérieure dans la viande grasse comparativement à la viande maigre,

ce qui est probablement dO à une plus courte phase de latence (394).

D'autres ont trouvé une croissance similaire avec des phases de latence légèrement plus
longues dans les tissus gras (143).

La congélation, la déshydratation en surface et la réfrigération simulant un spray

. ne semblent pas affecter la survie.

L'emballage sous vide est source de résultats contradictoires ; en effet, la crois-

sance est aussi bonne dans le bœuf emballé sous vide que stocké à l'air mais meilleure
que dans le blanc de poulet emballé sous vide (143) alors qu'elle est inférieure dans ce
dernier comparativement à celui recouvert d'un film (1 00).

La croissance est meilleure à ooc dans le bœuf emballé sous vide à pH 6 qu'à pH
5,6 (232).

La croissance est possible dans la viande emballée sous vide stockée à 0, 2, 5 et

1aoc mais impossible dans le bœuf emballé sous 100 % de co2 à une température supé-
rieure à 5°C et à pH élevé (215).
 -147-

La survie de Listeria monocytogenes est mauvaise dans le poulet cru stocké en

atmosphère anaérobie modifiée mais bonne en présence de 5 % d'02 (600).

Les effets de quatre conditions de l'environnement gazeux (1 00 % 0 2 , 30 o/o C02 +

air, 30 % C02 + N2, 100 % C02) et de la température sur le comportement de Usteria mo-
nocytogenes ont été étudiés dans le blanc de poulet (248).

A 1 oc, l'organisme ne pousse dans aucune de ces conditions.

A 6°C, la croissance est meilleure en aérobie qu'en présence de C02 .

A 15°C, la croissance se produit dans tous les cas.

La croissance en présence de C02 est expliquée par le fait que les atmosphères enri-
chies en C02 suppriment la microflore aérobie.

Donc, conserver la viande sous 1 00 % de C02 est le moyen le plus efficace d'en étendre
la durée de vie.

Le niveau initial de Listeria monocytogenes dans les saucisses fermentées (553)

est réduit de 100 fois durant la fabrication (217), sauf dans le cas des saucisses coupées
préparées sans levain lactique et portées à 32,2°C pendant 6 h ; dans ces conditions, le
. nombre de Listeria est multiplié par 1 00.

Une faible diminution du nombre de Listeria est observée dans les saucisses
"summer'' fabriquées sans levain (41 ).

Listeria monocytogenes présente initialement à un taux supérieur à 1000 CFU/g

de saucisses peut survivre durant la fermentation, le séchage et le stockage réfrigéré du
salami dur fermenté (286).

Ces observations différentes résultent probablement de différences physiques et

chimiques entre les saucisses comme le pH, l'activité de l'eau (Aw), les taux de sel et de
nitrite et la flore secondaire.
 -148-

Les Lactobacilles semblent être les organismes majeurs exerçant un effet antiliste-
ria par production de bactériocine alors que les Pseudomonas favorisent la croissance
comme nous l'avons vu précédemment.

Les différentes études concernant la compétition flore lactique - Listeria font appel aux
souches suivantes :

- Carnobacterium piscicola (86) (87) (497) isolée de viande de bœuf hâchée inhi-
bant Listeria monocytogenes à 5°C ou à 19°C mais surtout à 5°C par produc-
tion d'une bactériocine thermostable à activité bactéricide,

- Lactobacillus sake libérant une bactériocine ou sakacine A (340) (496) (498)

(528) possédant une activité bactériostatique plutôt que bactéricide envers des
lactobacilles variés et plusieurs bactéries Gram(+) d'origine alimentaire comme
Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes mais pas envers les bacté-
ries Gram (-), sous conditions éliminant les effets de faible pH, de peroxyde
d'hydrogène et de bactériophage lytique.

Dans les saucisses, Listeria monocytogenes est capable de pousser à pH 6,3 mais
l'addition de Lactobacillus sake empêche la croissance des Listeria durant les premiers
jours suivant la fabrication.

, A pH normal (5-7), Listeria monocytogenes ne se multiplie pas et l'addition de Lactobacillus

sake réduit le nombre de Listeria monocytogenes.

La sakacine A (265) purifiée par précipitation par du sulfate d'ammonium et chromato-

graphie montre qu'elle est constituée de 41 résidus d'acides aminés et qu'elle a une masse
moléculaire calculée de 4308,7, ce qui est en accord avec la valeur déterminée par spec-
trométrie de masse.

Le gène structural (sakA) code pour un produit primaire de 59 acides aminés qui est clivé
entre les acides aminés 18 et 19 pour conduire à la sakacine A active.

Son effet antagoniste est éliminé par traitement avec les protéases mais elle est thermos-
table.
 -149-

- Lactobacillus bavaricus (599) possédant une action antagoniste envers Listeria

monocytogenes en viande emballée sous vide, traitée par la chaleur et stockée
aux températures de réfrigération.

Cet effet a été examiné dans trois systèmes à savoir des cubes de bœuf, des cubes de
bœuf en sauce et des cubes de bœuf en sauce contenant de glucose.

A 4°C, Listeria monocytogenes est inhibée ou tuée par Lactobacillus bavaricus ; cela dé-
pend du taux initial de contamination.

A 1 aoc, on observe une réduction de 10 fois du pathogène sauf dans le bœuf sans sauce.

Ce système montre une inhibition transitoire du pathogène durant la première semaine de

stockage puis une croissance.

Une bactériocine est détectée dans les échantillons donc l'inhibition ne peut pas être attri-
buée à l'acidification mais bien à la production de bactériocine.

L'addition de sauce contenant du glucose et un taux d'inoculation plus élevé sont très effi-
caces pour réduire les populations de Listeria monocytogenes.

Des températures de réfrigération plus faibles augmentent l'action antagoniste.

La nature protéinique de la bactériocine est confirmée par addition d'a-chymotrypsine

(pancréase. bovine type Il).

Donc, non seulement Lactobacillus bavaricus pousse et produit une bactériocine à tempé-
rature de réfrigération mais aussi est efficace aux valeurs de pH non acides.

D'autres souches de Lactobacilles ont été étudiées à savoir Lactobacillus del-

bruekii spp. lactis, Lactobacilllus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lac-
tobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus lactis spp. lactis (340).
 -150-

- Pediococcus acidilactici (50) (413) (499) produisant une bactériocine ou pédio-

cine à effet bactéricide sur Listeria monocytogenes mais aussi sur Lactobacillus
spp. et Clostridium perfringens dans la viande fraîche et les saucisses (135)
(197) (611 ).

La fermentation des saucisses sèches peut réduire les populations de Listeria monocy-
togenes (197).

L'inactivation efficace de Usteria monocytogenes est observée quand le pH de la partie fer-

mentation du procédé est inférieur à 4,9 (197).

La pédiocine (260) est responsable pour une part de l'activité antilisteria durant la fermen-
tation.

L'inhibition de Usteria monocytogenes durant le séchage est améliorée par la présence de

pédiocine.

La production de pédiocine contribue donc à l'augmentation de l'inhibition durant la fermen-

tation et le séchage de la fabrication des saucisses.

Les Listeria sont inactivées dans les exsudats portés à 4°C pendant 29 jours et pous-
sent dans les exsudats portés à 25°C pendant 6 jours (611 ).

La pédiocine provoque une létalité rapide de Listeria monocytogenes dans les exsudats
portés à 4°C mais ensuite l'inactivation est similaire à ce que l'on observe dans l'exsudat de
contrôle (Listeria monocytogenes seule) ou l'exsudat contenant Listeria monocytogenes +
Pediococcus acidilatici (611 ).

A 25°C, Usteria monocytogenes pousse en présence de Pediococcus acidilactici durant les

premières 64 h d'incubation mais la population décroît ensuite de façon appréciable (611 ).

En présence de pédiocine, on observe une décroissance graduelle de Listeria monocyte-

genes durant toute la période de stockage à 25°C (611 ).
 - 151 -

Donc, l'ajout d'additifs biologiques peut potentialiser et amplifier l'activité listériostatique et

listéricide intrinsèque de l'exsudat de saucisse (611 ).

La pédiocine est bactéricide et est sensible aux enzymes protéolytiques.

Elle est stable entre pH 3 et 9 et apparemment plus stable dans une plus faible partie de
cette étendue de pH.

A pH 3,6, la pédiocine est stable aux températures de traitement thermique de l'ordre de

65 à 121 oc ; son activité diminue significativement quand elle est chauffée à pH 7.

L'activité inhibitrice de la pédiocine est perdue en présence d'alpha-amylase, suggérant

qu'elle contient une moitié glucidique nécessaire à son action antibactérienne.

La pédiocine se présente sous la forme de monomères et d'aggrégats possédant des

poids moléculaires de l'ordre de 80 à 150 kDa.

La pédiocine présente une meilleure activité lorsqu'elle est encapsulée dans des liposo-
mes de phosphatidylcholine avant addition aux systèmes par rapport à la pédiocine libre et
non encapsulée et ajoutée aux systèmes contenant un émulsifiant Tween 80 par rapport
aux systèmes sans Tween 80 (136).

- Pediococcus damnosus et Pediococcus pentosaceus (340) (384) (525) à effet

antibactérien sur Listeria monocytogenes en jus de viande hèchée incubé à
6°C et à 15°C,

- Leuconostoc gelidum (252) (253), bactérie lactique hétérofermentative isolée de

viande emballée sous des taux de co2 élevés.

Elle pousse bien à température de réfrigération mais pas à 25°C.

Elle produit une substance inhibitrice, la leucocine (252), qui est inactivée par la trypsine
mais pas par la catalase ou par chauffage à 62°C pendant 30 minutes.

Elle est produite assez t6t en cycle de croissance à 1, 5 et 25°C.

 -152-

Cette substance inhibe un grand nombre de bactéries apparentées étroitement aux

bactéries lactiques aussi bien qu'Enterococcus faecalis et Listeria monocytogenes.

- Leuconostoc mesenteroïdes (124) produisant une mésentérocine active contre

Listeria monocytogenes mais sans effet sur plusieurs bactéries lactiques.

La substance antimicrobienne est une protéine ; son activité est complètement détruite
par la pronase.

Elle est relativement stable à la chaleur (1 oooc, 30 minutes) et partiellement dénaturée

par le chloroforme.

La SOS-PAGE a permis de déterminer le poids moléculaire apparent à environ 4,5 kDa.

D'autres souches de Leuconostoc ont été étudiées à savoir Leuconostoc cremoris et

Leuconostoc blayaisense (340),

Un Enterococcus hirae (520) (521) isolé d'intestin bovin produit une bactériocine ou hi-
raecine S inhibant d'autres Enterococci, Listeria monocytogenes et d'autres Listeria spp.
mais aucune autre bactérie Gram(+) et pas de bactérie Gram négative.

L'agent antimicrobien est inactivé par la pronase et la papal"ne et est insensible à la cata-
. lase, à l'effet tampon, au chauffage à 1oooc pendant 60 minutes et à la congélation-
décongélation.

L'activité antimicrobienne n'est pas due au peroxyde d'hydrogène ou à la formation d'acide

et elle n'est pas non plus une activité lysozyme ou muramidase.

Il. 2. LAIT ET PRODUITS LAITIERS.

Les fromages sont les plus intensivement examinés en raison de leur association à
la listériose d'origine alimentaire.
 -153-

La contamination des fromages à pate molle est essentiellement localisée à la

surface (30) (296) ; ceci semble être dû au pH bien qu'un large gradient de pH se déve-
loppe durant l'affinage ; la croissance se fait parallèlement à l'augmentation du pH durant
l'affinage.

Ceci est aussi à associer à la protéolyse de surface due aux moisissures (15).

Le lait cru doit être considéré, par les producteurs laitiers, comme une source de
contamination bien que celui-ci possède un système lactoperoxydase consistant en une
enzyme : la lactoperoxydase,, du thiocyanate et du peroxyde d'hydrogène possédant une
activité antimicrobienne large et entre autre sur les Listeria (54) (139) (140) (165) (209)
(292) (293) (518).

L'oxydation du thiocyanate SCN - , catalysée par la lactoperoxydase et par H20 2 , génère

l'anion hypothiocyanite OSCN - qui est en équilibre avec l'acide hypothiocyaneux ; ces deux
composés peuvent oxyder les groupes sulfhydryle (-SH) des enzymes métaboliques inhi-
bant la croissance bactérienne.

Plusieurs mécanismes d'action ont été rapportés pour expliquer cette inhibition :

- extension de la phase de latence ou aucune croissance,

- consommation d'oxygène réduite,

- production de lactate par les organismes fermenteurs réduite,

- inhibition des enzymes métaboliques clés comme l'hexokinase, la glycéraldéhyde 3-

phosphate deshydrogénase et la D-lactate deshydrogénase,

- inhibition de la consommation de glucose,

- altération de la membrane cytoplasmique avec fuite d'ions et de matériel absorbant

dans l'UV,

- inhibition de la synthèse d'acides nucléiques et de protéines.

 -154-

Le système lactoperoxydase (LPS) améliore la destruction thermique de Listeria mono-

cytogenes et de Staphylococcus aureus.

En effet, l'activation de LPS suivie du traitement thermique entralne une mort plus rapide
des Listeria tout en respectant les pathogènes d'origine laitière.

L'inhibition de ce système est réversible par addition de composés contenant des grou-
pes sulfhydryle comme la cystéine, le dithiothreitol et la glutathion aussi bien que des taux
élevés de catalase ou par chauffage du lait aux températures de pasteurisation.

Le niveau de lactoperoxydase dans le lait cru décroTt durant l'incubation de 7 jours mais
la décroissance est plus prononcée à soc qu'à 4°C.

L'activation du système LPS est donc une procédure permettant de contrôler le déve-
loppement de Listeria monocytogenes dans le lait cru aux températures de réfrigération.

Listeria monocytogenes peut survivre à la fabrication et à l'affinage de beaucoup

de fromages, en particulier le Camembert (488), un peu moins le Cottage (486), le Parme-
san (609), le Trappist (314), le Cheddar (487) et le Colby (606).

Listeria monocytogenes survit et se multiplie quand elle est inoculée directement dans le
lait servant à la fabrication du Camenbert mais le taux de croissance est réduit à faibles
. températures de stockage (15).

Des taux de croissance plus élevés se produisent en surface comparativement au centre.

Usteria monocytogenes est concentrée dans le lait caillé et peu dans le petit lait
dans lequel elle survit, de même que dans le beurre et le yaourt.

La croissance est lente mais pas totalement inhibée par les levains lactiques utili-
sés dans la fabrication du fromage.

Elle est bonne dans les produits laitiers de 4 à 35°C.

 - 155-

La présence de Pseudomonas dans le lait peut améliorer la croissance de Listeria

monocytogenes (183) (380).

Listeria monocytogenes survit à la fermentation du lait écrémé par Streptococcus

cremoris (585) ou Streptococcus lactis (99) et durant le stockage réfrigéré.

La fermentation avec la bactérie thermophile Lactobacillus bulgaricus est plus

préjudiciable à la croissance et la survie que la fermentation avec des levains lactiques
mésophiles (495).

La croissance dans le petit lait est meilleure que dans d'autres produits laitiers flui-
des ; ceci est dQ au pH et à la présence ou l'absence de Penicillium camemberti ; la crois-
sance est améliorée en présence de Penicillium camemberti et à pH élevé (489).

Listeria monocytogenes est capable de résister un certains nombre de jours dans

les saumures et le lactosérum constituant des sources potentielles de contamination (23).

Une saumure contaminée peut infecter un grand nombre de fromages puisqu'elle sert à
plusieurs fabrications.

De même, dans une unité de production, le sérum se retrouve fréquemment au niveau

du sol et des Listeria peuvent persister dans le sérum stagnant dans des fissures du sol,
, ainsi qu'au niveau des regards d'égouts et d'autres orifices (396).

Donc, la recherche de Listeria monocytogenes dans ces produits doit être inclue dans les
plans de contrôle préventifs en fromagerie et toutes les surfaces doivent être le plus rapi-
dement possible nettoyées et désinfectées.

Un Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides (257) isolé de lait de chèvre

inhibe la croissance de Listeria monocytogenes par production d'un composé nommé mé-
sentéricine.

Il s'agit d'une molécule protéique montrant un spectre inhibiteur étroit limité au genre
Listeria.
 -156-

Le poids moléculaire détecté par SOS-PAGE est de 2,5-3 kDa.

La bactériocine est purifiée par une simple procédure en trois étapes : un surnageant
brut obtenu à partir d'une culture en phase stationnaire en milieu défini est soumis à une
chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose, suivie d'une ultra-filtration à travers une
membrane de 5 kDa et finalement une CLHP en phase inverse sur colonne C4.

Le microséquençage de la bactériocine pure et des fragments tryptiques montre que la

mésentéricine est un polypeptide de 36 acides aminés dont la structure primaire est proche
de celle de la leucocine A-UAL 187 (252), laquelle contient un résidu supplémentaire à
l'extrémité C.

A la différence de la leucocine A-UAL 187 (252), la mésentéricine montre un mode d'ac-

tion bactéricide.

Les bactéries corynéformes (554) telles que Brevibacterium linens, Arthrobacter

nicotianae et Arthrobacter nucleogenes isolées de fromage montrent des zones claires
d'inhibition donc un effet antagoniste sur Listeria.

Arthrobacter nicotianae et Arthrobacter nucleogenes sont plus efficaces envers Listeria

innocua et Listeria ivanovii qu'envers Listeria monocytogenes.

La nature des effets inhibiteurs demeure peu claire.

La caractérisation de la nature de l'antagonisme montre que les filtrats perdent leur ac-
tivité inhibitrice par chauffage et la taille moléculaire des substances inhibitrices est plus
élevée que 12-14 kDa.

Streptococcus lactis producteur de substance de type bactériocine est isolé du lait

écrémé stérile et présente une activité inhibitrice sur Listeria monocytogenes (584).

Cet effet inhibiteur est mis en évidence pour une forte contamination en Streptococcus
lactis.

L'acidification du milieu accentue l'effet inhibiteur sur la croissance.

 -157-

Il. 3. PRODUITS DE LA MER.

Ces produits sont beaucoup moins étudiés.

15 des 57 échantillons de crevettes, de chair de crabe, de queue de homard, de

poisson ou fruits de mer à base de suri mi étudiés se sont révélés positifs (57 4).

58 des 691 échantillons de poisson fumé ou mariné à chaud et 49 des 434

échantillons de poisson fumé à froid étudiés renferment des Listeria (281 ).

L'étude du comportement de Listeria monocytogenes au cours de la fabrication et

du stockage du saumon fumé contaminé expérimentalement en surface, mariné, fumé à
26-30°C et stocké à 4°C ou à 1aoc pendant 30 jours montre qu'aucune modification n'est
observée au cours de la fabrication alors qu'au cours du stockage, le nombre de Listeria
augmente ; de plus, si des Lactobacilles (flore des poissons fumés) prédominent au début
du stockage, on observe une inhibition des Listeria (238).

Par ailleurs, l'étude du comportement de Listeria monocytogenes durant la fabrica-

tion et le stockage de la truite fumée à chaud contaminée expérimentalement en surface,
marinée, fumée à chaud (65°C pendant 20 minutes) et stockée à 4 et 8-10°C pendant 20
jours montre qu'aucune Listeria n'est obtenue ; si la truite est inoculée après fumage, au-
cune modification n'est observée au cours du stockage à 4°C mais une augmentation a lieu
au cours du stockage à 8-10°C d'où l'importance du maintien de la chaîne du froid (282).

Le poisson salé et séché ne semble pas renfermer de Listeria (202).

On note une augmentation d'environ 5 log en 14 jours du nombre de Listeria dans

les crevettes, la chair de crabe, le surimi et le poisson blanc stockés à re et stérilisés au
préalable avant inoculation (351 ).

En Amérique du Nord, des crevettes cuites congelées, de la chair de crabe conge-

lée en conserve, du saumon fumé, des coquilles Saint-Jacques, du homard congelé en
conserve et du surimi ont été retirés du marché suite à la découverte d'une contamination.
 - 158-

Des Listeria monocytogenes viables ont été obtenues à partir de crevettes conta-
minées expérimentalement bouillies après restauration à 4°C (355).

Le fumage a un rôle antilisteria dans les filets de sardines (32).

Il. 4. ŒUFS.

Listeria monocytogenes peut survivre dans les œufs crus réfrigérés pendant 22
jours (325), dans les œufs entiers, dans le jaune d'œuf déshydraté et dans les œufs liqui-
des (68) et croître dans les œufs cuits (325).

La croissance s'effectue dans toutes les portions après traitement par la chaleur.

Les temps de génération à 5°C sont de 1,7 jours dans les jaunes d'œufs, de 1,9
jours dans les œufs entiers cuits, de 2,3 jours dans les jaunes cuits et de 2,4 jours dans les
blancs cuits.

Dans l'albumen cru, le nombre de Listeria diminue de 5 log en 22 jours à 5°C

(517).

L'effet antilisteria observé dans l'albumen cru est probablement attribué à une ou plu-
sieurs de ses fractions, notamment l'avidine, le lysozyme et l'ovoflavoprotéine.

Pour certains, l'effet antibactérien de l'albumen est principalement dû au lysozyme et il

est renforcé par l'ovomucoïde, la conalbumine ou un pH alcalin (567).

De plus, le préchauffage de l'albumen entraîne une réduction de son activité antibacté-

rienne.

Cet effet antibactérien du lysozyme du blanc d'œuf est bactériostatique (98) (272) (527).

Le lysozyme du blanc d'œuf tue ou empêche la croissance de Listeria monocytogenes

dans plusieurs aliments.
 -159-

Il est plus actif dans les légumes que dans les denrées animales comme le saucisson de
porc frais (bratwurst) et le Camembert.

Pour une activité maximale dans certains aliments, I'EDTA est nécessaire en addition au
lysozyme.

Il peut donc être utilisé comme agent de conservation dans plusieurs aliments spéciale-
ment ceux préparés à partir de végétaux frais.

Il. 5. VEGETAUX.

Les pommes de terre et les radis sont régulièrement contaminés (258), mais aussi
les salades préemballées (522) (562).

Le sérotype 1 est prédominant.

Les sources de contamination sont le sol, l'eau, l'engrais animal, la végétation

pourrie et les effluents des égouts.

La croissance est bonne dans le jus de laitue à 5°C (395) (532).

L'étude de la thermorésistance de Listeria monocytogenes dans le jus de chou

. montre qu'un chauffage à 58°C pendant 10 minutes peut inactiver 105 cellules/ml (46)
(112).

De plus, à 30°C, la population augmente dans le jus de chou non clarifié stérile conte-
nant 0 à 1,5% de NaCI et diminue en présence de plus de 2% de NaCI.

A 5°C, la population est réduite de 90% en présence de plus de 5% de NaCI après 70

jours.

La croissance à 30°C aboutit à une diminution du pH de 5,6 à 4,1.

La létalité se produit à 30°C quand le jus de chou est ajusté à pH::;; 4,6 avec de l'acide
lactique et aucune cellule viable n'est détectée après 3 jours à pH::;; 4,2.
 - 160-

A 5°C, la vitesse de létalité à pHs 4,8 est plus lente qu'à 30°C.

La croissance dans le jus de chou clarifié avec 2 % de NaCI à 30°C a lieu alors qu'une
dose supérieure à 1,5 % de NaCI est létale dans le jus de chou non clarifié.

Par contre, à 4°C, Listeria monocytogenes survit dans le jus de chou pendant long-
temps.

La croissance de Listeria monocytogenes dans la laitue hêchée à 5, 12 et 25°C

après 14 jours a été étudiée; elle est d'1 log à 5°C et 25°C et de 3 log à 12°C (532).

D'autres expériences montrent que l'organisme meurt après 14 jours.

Ces différences sont attribuées aux différences de pH et à la compétition de flore.

Listeria monocytogenes peut survivre et se multiplier durant le stockage au froid

des salades préemballées pendant 4 jours.

La survie et la croissance dans la laitue est influencée par la hêchage, le traitement

au chlore, l'atmosphère modifiée et la température (48).

L'étude de la croissance de Listeria monocytogenes à 15°C dans les végétaux

. frais stockés à l'air ou sous atmosphère contrôlée met en évidence une augmentation de 4
log en 6 jours dans les asperges, le broccoli et le chou-fleur alors qu'à 4°C, l'augmentation
est de seulement 1 log après 14 jours dans les asperges et dans le broccoli et le chou-fleur,
la diminution est de 0,5 log (40).

L'étude du comportement de Listeria monocytogenes inoculée dans les tomates

crues et dans les produits à base de tomates (49) montre que les taux de létalité et de
croissance dans les tomates crues en tranches ou entières stockées à 1 0 et 21 oc ne sont
pas infhJencés par le traitement antérieur des tomates avec du chlore ou l'emballage sous
une atmosphère de 3 % d'02 et 97 % de N2.
 - 161 -

La croissance se produit dans les tomates entières à 21 oc mais pas à 1aoc tandis que
la létalité se produit dans les tomates en tranches stockées à ces températures mais la
vitesse de létalité est plus faible à 10°C qu'à 21 oc en raison de la présence d'acide acéti-
que.

Les populations de Listeria monocytogenes inoculées dans les jus et les sauces de to-
mates à 5 oc demeurent constantes pendant 14 jours alors qu'à 21 oc, on observe une dé-
croissance graduelle.

Listeria monocytogenes meurt rapidement quand elle est mise en suspension dans le
ketchup à 5 et 21 oc du fait du faible pH.

Donc les tomates, contrairement à la laitue, au broccoli, aux asperges et au chou-fleur

ne sont pas un bon substrat de croissance pour les Listeria.

Une étude portant sur le comportement des Listeria dans les carottes montre une
diminution de la population listérienne dans les carottes crues entières et râpées mais pas
dans les carottes cuites et une diminution du nombre de Listeria monocytogenes en sus-
pension cellulaire dans laquelle sont plongées des carottes crues (47).

Le nombre de Listeria à 5°C augmente au bout de 7 jours.

Le traitement de coupe, le traitement au chlore et l'emballage sous atmosphère modifiée

n'ont pas d'effet sur la survie et la croissance de Listeria monocytogenes.

La présence de jus de carottes crues dans un bouillon tryptone phosphate à la concen-

tration de 1% réduit la population à 30°C.

Le stockage à 15°C provoque un effet létal plus rapide qu'à 5°C.

Il se peut que les carottes crues possèdent un composé inhibant la croissance des Lis-
teria mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour caractériser à un niveau
moléculaire le ou les composés présents dans les carottes crues qui sont toxiques pour les
Listeria.
 -162-

L'étude du mécanisme biochimique pour l'effet anti-levure de la phytoalexine 6-

méthoxymelléine des carottes suggère que ce composé exerce ses effets toxiques en inter-
agissant avec les membranes cellulaires et en modifiant les fonctions associées à la mem-
brane mais on ne sait pas si ce composé est toxique pour les Listeria (7).

Le développement microbien des carottes emballées sous vide stockées à 4, 10 et

15°C est plus lent qu'en aérobie (91 ).

Dans les carottes stockées à 8°C, le nombre de Listeria diminue après 3 jours puis
augmente après 7 jours à un taux similaire à celui présent initialement (409).

Les végétaux, particulièrement s'ils sont coupés ou ablmés, procurent un excellent

milieu de culture.

Selon FAR BER et coll. (180), il n'y a pas de Listeria dans les végétaux crus et se-
lon PETRAN et coll. (440), il n'y en a pas dans les végétaux frais et congelés.

Aucune étude de contamination de fruit n'est recensée.

Ill. THERMORESISTANCE. (151)

Ill. 1. DANS LE LAIT.

Suite à l'épidémie de 1983 au Massachusets où un lait pasteurisé a été incriminé

et où aucune évidence de pasteurisation mal faite n'a été prouvée, on a suggéré que la
position intracellulaire de l'organisme procurait un milieu protecteur.

Les différentes études conduites sur la pasteurisation sont contradictoires.

L'étude de la thermorésistance de Listeria monocytogenes en suspension dans le

lait cru et chauffé dans des tubes en verre scellés montre que l'organisme ne peut pas sur-
vivre à la pasteurisation HTST (71, JOC pendant 15 secondes) (69).
 -163-

L'infection de quatre vaches suivie d'une pasteurisation du lait obtenu indique que
les organismes intracellulaires situés dans les leucocytes polymorphonucléaires peuvent
survivre aux conditions de la pasteurisation HTST (154).

Usteria monocytogenes a été isolée du lait pasteurisé à 71,7-73,9°C pendant 16,4 se-
condes mais pas à 76,4-77,8°C pendant 15,4 secondes.

De plus, les leucocytes sont dégradés dans le lait non pasteurisé après 3 jours de
stockage à 4 oc puis détériorés après 4 jours en débris cellulaires ce qui suggère que lais-
ser le lait non pasteurisé à 4 oc pendant 4 jours ou plus pourrait éliminer l'effet protecteur
que les leucocytes procurent en augmentant la résistance à la chaleur.

On peut donc supposer que la capacité de Usteria monocytogenes à survivre à la pas-

teurisation est due à l'effet protecteur thermique procuré par la position intracellulaire dans
les leucocytes polymorphonucléaires (154) (194).

Pour BUNNING et coll. (92), la position intracellulaire de l'organisme n'augmente

pas significativement la thermorésistance et Usteria monocytogenes peut survivre à la
pasteurisation industrielle HTST, qu'elle soit intra ou extracellulaire.

La différence entre ces deux dernières études vient du fait que BUNNING et coll.
(92) soumettent le lait aux ultrasons tandis que DOYLE et coll. (154) non.

Les ultrasons permettent la libération de Listeria monocytogenes à partir des phagocytes

et par conséquent Listeria monocytogenes est soumise à un environnement oxygéné toxi-
que ; elle n'est donc plus obtenue sur milieux solides sélectifs.

Listeria monocytogenes a été isolée à partir de lait cru inoculé immédiatement

avant traitement thermique de 69 à 73°C pendant 15 secondes et à partir de lait chauffé à
69-72°C après incubation de 2 jours à 3 semaines (187) (188).

L'étude de la survie de Listeria monocytogenes intra et extracellulaire dans le lait

contaminé naturellement montre que bien que l'organisme soit obtenu à partir de lait
chauffé à 60-66°C, aucune cellule viable n'est obtenue après traitement à 69°C pendant
16,2 secondes (179).
 -164-

LOVETI et coll. (348) affirment que Listeria monocytogenes ne survit pas à la

pasteurisation HTST alors que FERNANDEZ-GARAyzABAL et coll. (187) (188) ainsi que
BEARNS et GIRARD (28) pensent le contraire ; ils furent d'ailleurs les premiers à rapporter
que Listeria monocytogenes était capable de survivre à la pasteurisation.

Pour CRAWFORD et coll. (120), la présence de Listeria monocytogenes dans le

lait pasteurisé HTST n'est que le résultat d'une contamination post-pasteurisation.

L'étude du choc thermique (48°C pendant 15 secondes) sur l'augmentation de la

thermotolérance de Listeria monocytogenes soumise à la pasteurisation HTST (71 ,re
pendant 15 secondes) (94) montre que cette dernière est augmentée soit par le choc
thermique soit par la position intracellulaire.

Listeria monocytogenes exposée à des températures sous-létales de 44 à 48°C avant

d'être soumise à une température finale acquière donc une thermotolérance.

Listeria monocytogenes cultivée à 43°C est plus thermotolérante que celle cultivée
à température plus basse ou que celle endommagée par la chaleur à 43°C (307) ; ceci
implique que Listeria monocytogenes dans un aliment réfrigéré peut acquérir une thermoto-
lérance si cet aliment est endommagé par la chaleur (368) (369).

Après chauffage à 62,8°C en tubes scellés en bouillon trypticase-soja contenant

. de l'extrait de levure (TSBYE), l'obtention de cellules endommagées par la chaleur sur
TSBYE est supérieure en anaérobie, du fait de la sensibilité à l'oxygène, plutôt qu'en aéro-
bie.

De plus, l'addition exogène de catalase mais pas de superoxyde dismutase augmente

légèrement l'obtention de cellules endommagées par la chaleur en aérobie (307).

D'autres ont démontré qu'il n'y avait pas de corrélation entre les taux intracellulai-
res de catalase et de superoxyde dismutase et la thermotolérance ; en effet, lors du chauf-
fage, on observe une inactivation de ces enzymes donc le développement de produits oxy-
génés toxiques comme 0 2 - et H20 2 puis un radical hydroxyl ; cette inactivation convertit
Listeria monocytogenes en un micro-organisme anaérobie tué rapidement en présence
d'oxygène moléculaire (125) (126).
 -165-

Ces différentes observations laissent trois questions en suspens :

- quelles sont les conditions anaérobies de chauffage pour lesquelles on peut

trouver Listeria monocytogenes ?

- est-ce que les organismes maintenus à 39°C environ dans la mamelle ne se

multiplient pas pour acquérir une thermotolérance ; et, si cela est vrai,
combien de temps dure t-elle?

-est-ce que les conditions ou les composés comme l'eau oxygénée dans les
phagocytes induisent une thermotolérance supplémentaire ?

Ill. 2. DANS LA VIANDE.

L'addition de graisse de bœuf n'améliore pas la thermorésistance alors qu'elle est

augmentée par la présence de sel.

Le phénomène de choc thermique est à prendre en compte quand les viandes

sont chauffées lentement jusqu'à une température finale interne.

La croissance à hautes températures ainsi que le choc létal aboutit à la production

de membranes thermostables (45) et la synthèse de protéines (604) dont la listériolysine
. lesquelles entraînent une augmentation de la thermorésistance.

La thermorésistance de Listeria monocytogenes augmente après un choc thermi-

que sous-létal (93).

Les cellules endommagées par la chaleur et placées à 4°C maintiennent leur

thermotolérance pendant près de 24 h après le choc thermique (181).

Les cellules cultivées à 43°C ont une thermorésistance plus grande que celles qui
sont cultivées à 37°C et endommagées à 43°C (307).
 -166-

Une dose de 1 00 cellules/ml de bouillon trypticase-soja non endommagées est

nécessaire pour la pathogénicité alors qu'une dose de 10000 cellules endommagées par la
chaleur est considérablement moins pathogène (356).

La perte de l'activité hémolytique accompagne la diminution de la virulence.

De plus, les cellules endommagées par la chaleur et restaurées sont aussi pathogènes
que les cellules non endommagées.

Il apparaît que Listeria innocua possède une thermorésistance similaire è Listeria

monocytogenes et que le sérotype 1/2a est plus thermorésistant que le sérotype 4.

Une période optimale de restauration des cellules endommagées par la chaleur

semble être de 6 à 9 h en milieu non sélectif.

De plus, les sucres, les sels, les polyols comme le glycérol ou le mannitol dimi-
nuent l'endommagement par la chaleur alors que le fructose et le chlorure d'ammonium
augmente la létalité (526).

L'ajout de catalase ou de pyruvate aux milieux sélectifs ne semble pas améliorer la

restauration des cellules endommagées par la chaleur (382) (526).

Listeria innocua M1 est développée comme un indicateur biologique non patho-

gène pour évaluer l'inactivation thermique pour Listeria monocytogenes par sélection d'un
mutant résistant è la rifampicine et è la streptomycine (176).

IV. CONGELATION.

La congélation entralne un pourcentage élevé de létalité et d'endommagement

(160).
 - 167-

La comparaison de la congélation de Listeria monocytogenes à -18°C 30 minutes

et dans l'azote liquide à -198 oc 10 minutes montre que :

-la solidification nécessite 15 minutes à -18°C et environ 1 minute à -198°C,

-la congélation et le stockage 1 mois en tampon phosphate (PB) à -18°C pro-

voque 87 o/o de létalité et 79 o/o d'endommagement et 54 et 45 o/o respecti-
vement en bouillon tryptose (TB) à -180C,

- la congélation e~ le stockage 1 mois dans l'azote liquide en tampon PB ne

provoque pas de mort ou d'endommagement et un peu de mort et d'en-
dommagement dans TB,

-la congélation à -198°C suivie du stockage 1 mois à -18°C aboutit à 60 o/o de

létalité et 36 o/o d'endommagement dans PB alors qu'en TB on observe 61 o/o
de létalité et 44,2 o/o d'endommagement,

- des congélations - décongélations répétées produisent plus de létalité et d'en-

dommagement qu'un cycle unique de congélation - décongélation.

La congélation et le stockage à -18°C de Listeria monocytogenes en tampon

phosphate avec ou sans glycérol, matière grasse du lait, lactose, caséine (159) montrent
. que:

- 2 ou 4 o/o de glycérol protège Listeria monocytogenes de la mort et de l'en-

dommagement pendant près de 6 mois à -18 oc,

- 2 o/o de lactose, de matière grasse du lait et de caséine procure une meilleure

protection que le glycérol (2 o/o) donc les composés du lait protège Listeria
monocytogenes de la mort et de l'endommagement mais moins que le
glycérol,

- la protection du lactose et de la matière grasse du lait contre la mort durant le

stockage à -18°C est observé durant 4 semaines et contre l'endommage-
ment durant 5 mois et 4 semaines respectivement,
 -168-

-la protection de la caséine contre la mort et l'endommagement se produit du-

rant le stockage à -18 oc pendant prés de 6 mois,

- le petit lait n'apporte aucune protection durant la congélation et le stockage,

- l'augmentation de concentration en matière grasse du lait de 2 à 4 o/o ne mo-

difie pas la mort de Listeria monocytogenes mais diminue l'endommagement
seulement durant les premières 24 h de stockage,

- un changement similaire de la concentration en lactose aboutit à une diminu-

tion de la létalité de Listeria monocytogenes durant le stockage pendant prés
de 6 mois et à une diminution de l'endommagement seulement durant les
premières 24 h de stockage.

V. CONTROLE DE LA CROISSANCE ET EFFETS ANTILISTERIA.

Listeria monocytogenes peut se multiplier à des pH compris entre 5 et 9 et peut

persister plus longtemps à faible pH, à faible température plutôt qu'à 30°C.

Listeria monocytogenes tolère NaCI.

En effet, Listeria pousse dans une solution à 6 %, son nombre demeure inchangé dans
une solution à 16 o/o et diminue dans une solution à 26 o/o (271) (512).

Le nitrite de sodium (NaN02) ne peut pas inhiber Listeria monocytogenes mais

une combinaison de 100 ppm de nitrite, 3 o/o de NaCI et un pH de 5,5 en bouillon trypti-
case-soja peut inhiber la croissance à 5°C alors que 25000 ppm de nitrite seul ne peut pas
empêcher la croissance à pH 7,4 (290) (511 ).

De faibles température et pH augmentent l'efficacité des acides benzolque et sor-

bique (162) (167) (168).

Exposer Listeria monocytogenes à une solution de propionate de sodium à 8 o/o

pendant 60 minutes cause 87 o/o d'endommagement (77).
 - 169-

Le propyl de parahydroxybenzoate est efficace pour inhiber la croissance (433).

Les échantillons trempés dans la fumée liquide et ensuite emballés sous vide et
réfrigérés montrent une réduction du nombre de Listeria après 72 h alors que le nombre
des échantillons non traités reste inchangé (394).

L'activité antilisteria est attribuée à un contenu élevé en phénols polaires dans la fumée
liquide.

Le clou de girofle et l'origan sont les plus inhibitrices des épices et herbes testées
suivies de la sauge, du romarin, de la muscade alors que le poivre noir, le chili, la cannelle,
l'ail, la moutarde, le paprika, le persil et le poivre rouge n'inhibent pas la croissance (172).

L'effet inhibiteur de certains acides gras et monoglycérides sur la croissance des

Listeria a été étudié (568).

L'acide laurique, l'acide linolénique et le glycérylmonolaurate ont la plus forte activité

bactéricide à la concentration de 10 à 20 j.Jg/ml alors que les acides linoléiques conjugués
au potassium et l'acide linoléique sont bactéricides à la concentration de 50 à 200 j.Jg/ml.

Par contre, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide oléique, le gly-
cérylmonomyristate et le glycérylmonopalmitate ne sont pas inhibiteurs à la dose de 200
_j.Jg/ml.

La nisine a un effet inhibiteur (35) (276) (289) (377) (399) mais ce dernier est
moindre en présence d'une forte concentration en matière grasse et d'émulsifiant non ioni-
que comme le Tween 80 alors que la lécithine (émulsifiant an ionique) n'a pas d'effet.

La sensibilité à la nisine est augmentée par l'addition de 2 % de NaCI ou par l'abaisse-

ment du pH du milieu de 6,5 à 5,5 avec les acides lactique ou chlorhydrique (245).

La présence d'acide gluconique utilisé dans la préparation du Cottage peut limiter

la croissance de Listeria monocytogenes.
 - 170-

Aucun survivant n'est détecté dans le lait caillé et le petit lait du lait coagulé par l'acide
gluconique alors qu'un faible nombre apparaît dans le lait caillé mais pas dans le petit lait
du lait coagulé par l'acide chlorhydrique (166).

L'addition de poudre de cacao (2 et 10 %) au bouillon de culture inactive Listeria

monocytogenes et cet effet est plus rapide lors de culture agitée ; de plus, l'apport de ca-
séine (1,5 ou 3 o/o) contrecarre l'inactivation (434).

Ce sont les méthylxanthines: la caféine et la théobromine, constituants principaux de la

poudre de cacao, qui sont inhibitrices (435).

Le degré d'inhibition des acides acétique, citrique et lactique augmente quand la

température diminue et l'acide acétique est le plus préjudiciable suivi de l'acide lactique et
de l'acide citrique ; ceci coYncide avec leur degré d'indissociation à savoir que l'acide acéti-
que qui a la constante de dissociation la moins élevée est le plus nuisible (1) (428).

L'acide acétique provoque la plus grande inactivation mais l'acide citrique cause le plus
grand degré d'endommagement suivi de l'acide lactique et de l'acide acétique (2).

Bien que le taux de croissance soit plus faible à 25°C qu'à 3JDC, l'inhibition due au pH et
aux acides est identique à ces deux températures (605) .

. Alors que les valeurs de pH initial diminuent et/ou les concentrations en acides augmen-
tent, les taux de croissance de Listeria monocytogenes diminuent (605).

A concentrations équimolaires d'acides, le pH intracellulaire est le moins modifié par l'acide

citrique et le plus par l'acide acétique (605).

Les bactéries lactiques (3) (41) (50) (86) (87) (124) (135) (136) (197) (244) (252)
(253) (269) (340) (384) (413) (451) (480) (495) (496) (497) (498) (525) (528) (599) (611)
ont un effet inhibiteur dans la viande et la salaison, de même que les bactéries corynéfor-
mes, bactéries lactiques atypiques, comme Brevibacterium linens, Arthrobacter nicotianae
et Arthrobacter nucleogenes dans les fromages où elles peuvent être utilisées comme fer-
ments (554).
 - 171 -

Enterococcus faecalis possède aussi un effet inhibiteur sur Listeria monocytogenes

mais son activité est limitée par l'absence de substrats peptidiques dans le milieu (1 0)
(364).

Les carnobactéries (497) inhibent Listeria monocytogenes par sécrétion de bacté-

riocines mais cette activité inhibitrice est éliminée par la trypsine mais pas par le traitement
thermique.

VI. METHODES D'ISOLEMENT ET DE DETECTION.

La détection des Listeria dans les denrées alimentaires rencontre plusieurs difficul-
tés è savoir :

- leur faible nombre,

- la présence d'une flore annexe importante,

- les altérations subies lors des process alimentaires.

d'où le développement de méthodes plus rapides faisant appel è l'immunologie ou è la

biologie moléculaire.

VI. 1. METHODES CONVENTIONNELLES.

Ces méthodes font intervenir trois étapes :

- une ou deux phases d'ENRICHISSEMENT en milieux liquides sélectifs ou non

sélectifs ; la deuxième phase permet d'augmenter l'efficacité de cette pre-
mière étape,

-un ISOLEMENT en milieux solides sélectifs,

-une CONFIRMATION/IDENTIFICATION.

Ces méthodes sont officielles.

 -172-

VI. 1. 1. ENRICHISSEMENT.

Quelle que soit la technique utilisée, l'enrichissement consiste en une incubation

d'un échantillon alimentaire, clinique ou de l'environnement homogénéisé en présence d'un
bouillon d'enrichissement sélectif ou non sélectif, à diverses températures pendant des
temps variés.

Un certain nombre de bouillons ont déjà été décrits (90) (95) (381 ).

Les plus utilisés sont :

- le bouillon EB, dans la méthode FDA de LOVETI (acriflavine, acide nalidixi-

que, cycloheximide) (347) (348) (349) (350),

-les bouillons primaire et secondaire de DOMINGUEZ-RODRIGUEZ, modifiés

par DONNELLY et BAIGENT ou LEB 1et LEB Il modifiés (acide nalidixique,
acriflavine) ou UVM 1et UVM Il, dans la méthode USDA de McCLAIN et LEE
(357) (358),

- le bouillon FRASER (199) ou bouillon LEB Il de McCLAIN et LEE, modifié par

addition de chlorure de lithium, de citrate ferrique ammoniacal et d'esculine,
dans les méthodes FDA et USDA modifiées et dans la méthode officielle
actuellement en vigueur en France dans laquelle l'enrichissement primaire
est effectué en bouillon FRASER-DEMI où les quantités d'acide nalidixique
et d'acriflavine sont réduites de moitié.

Ce bouillon est actuellement le plus utilisé car le plus sélectif du fait de la présence d'es-
culine et de citrate ferrique ammoniacal rendant le diagnostic aisé.

VI. 1. 2. ISOLEMENT.

L'isolement est réalisé à partir du bouillon d'enrichissement sur milieu gélosé sé-
lectif renfermant un mélange d'antibiotiques ne permettant que la croissance des Listeria,
de gélose eUou peptone ou tryptone, d'extrait de levure et d'autres produits nutritifs.
 -173-

Les différentes géloses sont incubées entre 30 et 37 oc, 24 à 48 h.

Les fonctions des principaux composés sont les suivantes :

- les peptones (polypeptone, peptone de soja), la tryptone et les extraits

(levure et viande) fournissent une diversité d'éléments nutritifs néces-
saires à la croissance des Listeria ; en particulier, l'extrait de levure est
une source de complexe vitaminique B,

- le glucose et l'amidon représentent les sources énergétiques du déve-

loppement,

- le chlorure de sodium améliore la sélectivité en assurant l'équilibre os-

motique,

- les phosphates agissent en tant que substances tampons pour le main-

tien du pH,

- l'actidione ou cycloheximide inhibe le développement des moisissures

saprophytes contaminantes et des levures et supprime la croissance
de la microflore secondaire Gram (+),

- l'acriflavine est un agent sélectif possédant des propriétés bactériostati-

ques pour la plupart des bactéries à Gram positif et est faiblement anti-
fongique,

- l'acide nalidixique inhibe la croissance de la flore à Gram négatif en blo-

quant la réplication de l'ADN des germes qui lui sont sensibles,

- le phényléthanol inhibe la croissance des bactéries à Gram négatif,

- la glycine anhydre inhibe la croissance de la flore à Gram négatif et po-

sitif,
 - 174-

- le chlorure de lithium inhibe les Entérocoques (Streptocoques du groupe

0) susceptibles d'hydrolyser l'esculine,

- la ceftazidime inhibe la microflore secondaire,

- l'esculine est un glucoside produisant du glucose et de l'esculétine

laquelle réagit avec le citrate ferrique ammoniacal pour donner un
complexe brun foncé à noir dans et autour des colonies.

Listeria monocytogenes est exigeante dans ses besoins nutritifs et nécessite un sucre,
nw~acides aminés (leucine, isoleucine, valine, méthionine, arginine, cystéine, glutamine,

histidine et tryptophane), quatre vitamines (riboflavine, thiamine, biotine et acide thioctique)

et une source convenable de fer pour sa croissance (118) (449) (515) (516) (581 ).

De nombreuses géloses ont été décrites (6) (11) (19) (29) (81) (82) (84) (1 02)
(142) (146) (148) (149) (153) (178) (204) (221) (222) (239) (241) (255) (294) (308) (317)
(342) (354) (444) (449) (453) (454) (455) (530) (538) (541) (549) (607).

Les plus utilisées sont :

-la gélose McBRIDE modifiée en quantités d'agents sélectifs (chlorure de li-

thium, cycloheximide, acide nalidixique) ou gélose MMA ou MMLA ou MBGA
(331), dans la méthode FDA et la méthode USDA modifiée,

- la gélose LPM ou Lithium chloride-Phenylethanoi-Moxalactam, dans la mé-

thode USDA et la méthode FDA modifiée.

La gélose LPM est une gélose sélective combinant les caractéristiques des géloses
BAIRD-PARKER (17) et McBRIDE et du moxalactam lequel possède un très large spectre
d'activité contre la plupart des bactéries Gram (+) et Gram (-) incluant Staphylococcus,
Proteus, Bacillus et Pseudomonas spp.

- la gélose OXFORD de CURTIS (chlorure de lithium, colistine, céfotétane, acri-

flavine, esculine, fosfomycine) (121 ), dans les méthodes FDA et USDA modi-
fiées et la méthode officielle française.
 -175-

Cette gélose est un bon milieu sauf pour Listeria seeligeri et Listeria welshimeri en raison
de la présence de fosfomycine.

- la gélose PALCAM ou Polymyxin, Acriflavin, Lithium chloride, Aesculin, Manni-

tol élaborée par VAN NETIEN et coll. (559) (560) contenant de la po-
lymyxine, de l'acriflavine, du chlorure de lithium et de la ceftazidime.

L'incorporation d'esculine, de sels ferriques, de mannitol et de rouge de phénol font de

cette gélose un milieu sélectif et différentiel.

Les Listeria hydrolysent l'esculine en glucose et esculétine laquelle forme avec les sels
ferriques un complexe noir.

Elles ne fermentent pas le mannitol donc ne font pas virer le rouge de phénol.

Les colonies de Listeria sont donc gris-vertes avec une dépression centrale plus foncée
voire noire, sont légèrement incrustées dans la gélose et sont entourées d'un halo noir.

Les souches d'Entérocoques ou de Staphylocoques donnent des colonies grises avec

un halo brun-vert ou des colonies jaunes avec un halo jaune d'où le diagnostic aisé.

Les géloses PALCAM et OXFORD permettent une réduction élevée du développement

de la microflore contaminante et une lecture moins fastidieuse donc sont actuellement les
plus utilisées.

Vl.1. 3. CONFIRMATION DU GENRE ET IDENTIFICATION DE L'ESPECE.

Elles se font en deux étapes.

VI. 1. 3. 1. Caractérisation biochimique et morphologique.

Elle fait appel à deux types de méthodes.

 - 176-

VI. 1. 3. 1. 1 . Méthodes classiques.

-Tests de confirmation du genre.

La méthode conventionnelle d'identification décrite dans le "Bacteriological Analyti-

cal Manual" (BAM) fait appel aux tests suivants :

- la coloration de Gram avec dans J'ordre les réactifs suivants : cristal violet
(coloration), Jugal (fixation), alcool-acétone (différenciation Gram (+)-Gram (-))
et safranine (recoloration) ; tes Listeria sont des petits bacilles Gram(+).

-la recherche de la catalase; les Listeria sont catalase (+).

-la mobilité à température ambiante (20-25°C) ou à l'état frais avec une sus-
pension dans NaCI 0,85% sur lame recouverte d'une lamelle et examen au
microscope en contraste de phase avec un objectif à immersion ; les Listeria
sont des bacilles minces, courts, animés de légers mouvements rotatifs ou
d'une mobilité en pirouette.

- l'hydrolyse de J'esculine, en bouillon au pourpre de bromocrésol supplémenté

en esculine 24 à 48 h à 3rc ; l'hydrolyse de l'esculine est visualisée par Je
virage de l'indicateur au jaune-gris.

- la production d'acétoïne grâce au test de VOGES-PROSKAUER en présence

de potasse et d'a-naphtol ; le virage au rouge vif indique que la réaction est
positive.

mais aussi:

-la mobilité en milieu SIM, par ensemencement en piqûre centrale et examen

après incubation 48 h à 30°C de la croissance autour de la piqûre ; les
Listeria poussent autour de la piqûre et présentent le plus souvent une
mobilité typique dite en ombrelle ou en parapluie.
 -177-

- la recherche de l'oxydase ; test complémentaire pour distinguer les Pseudo-

manas.

-l'examen en transillumination oblique à 45° selon la technique de HENRY; le

faisceau doit être suffisamment puissant pour illuminer convenablement la
boTte en la dirigeant de manière à atteindre le fond de la boite sous un angle
de 45°; les Listeria présentent des surfaces bleues-grises et granuleuses.

Fal::i':::t.~Ju d'"~':io :,o~~rce.

lummeuse blanchi'
Ot):~•:~,at1o:1 •.:r' pos1t:on
iJ!_:' ~)·~'.J<c~lalre a la boi:e

miro1r plat

- Tests d'identification de l'espèce.

Ils sont les suivants :

- hémolyse par inoculation à la surface d'une gélose au sang ou test à l'aide

des hématies.
 -178-

-la fermentation du D-xylose, du L-rhamnose, de l'a-méthyi-D-mannoside et du

mannitol en bouillon tryptone contenant du bleu de bromothymol comme
indicateur ou en milieu liquide au pourpre de bromocrésol (7 jours à 3JDC) ;
la production d'acide par les Listeria fait virer l'indicateur au jaune.

- le CAMP-test (1 07) sur gélose trypticase soja contenant du sang de mouton

avec des ensemencements verticaux de Staphylococcus aureus et de
Rhodococcus equi et horizontaux et parallèles (stries en échelle) entre les
stries verticales des souches à tester.

Les ensemencements doivent être espacés d'environ 1 cm entre les stries horizontales
et d'environ 1 à 2 mm entre chaque strie horizontale et les stries verticales de Staphylococ-
cus aureus et Rhodococcus equi.

Staphylococcus aureus possède un zone d'hémolyse importante et Rhodococcus equi

exalte la f3-hémolyse de Listeria ivanovii et la fait apparaître sous un aspect caractéristique
en forme de pelle.

Les hémolyses de Listeria monocytogenes et de Listeria seeligeri sont exaltées à

proximité de la strie de Staphylococcus aureus (plus faiblement pour Listeria seeligeri).

Les autres espèces sont non hémolytiques.

Un nouveau test CAMP fait appel à une réaction hémolytique synergique entre Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus et Corynebacterium equi sur gélose au sang
(367).

Une lyse synergique des cellules de sang de mouton est observée avec Listeria monocyte-
genes et soit Staphylococcus aureus soit Corynebacterium equi.

L'intéraction entre Listeria monocytogenes et Corynebacterium equi n'implique pas appa-

remment une étape de pré-sensibilisation ; une exposition simultanée aux cellules de sang
de mouton aux deux extraits est nécessaire.
 - 179-

- la réduction des nitrates, en bouillon nitrate de potassium 5 jours à 37 oc puis

ajout des réactifs nitrate 1 (acide sulfanilique - acide acétique) et 2 (alpha-
naphtylamine - acide acétique) et si nécessaire de la poudre de zinc.

Ce test est à réalisé si la souche est mannitol(+).

- ta production d'uréase,

- la production d'H2S,

- l'étude de pathogénécité sur souris.

VI. 1. 3. 1. 2. Méthodes rapides.

-Galerie APl 50CH (bioMérieux) (Annexe VIl).

Cette méthode consiste en 5 bandes plastiques contenant chacune 1 0 cupules de

substrat deshydraté reconstitué lors de l'inoculation de la suspension de micro-organisme.

La fermentation des substrats d'hydrates de carbone est déterminée par change-

ment de couleur de l'indicateur de pH (rouge de phénol).

- Système MAST-ID.

Il s'agit d'une méthode de fermentation des hydrates de carbone basée sur l'incor-
poration de substrats d'hydrates de carbone variées autoclavables et d'un indicateur de pH
(bleu de bromothymol) dans une gélose de base tryptone.

Les tests de fermentation sont positifs si la colonie et la gélose autour passent du

bleu au jaune après 24h d'incubation.

L'utilisation d'une technique d'inoculation en plusieurs points permet l'identification

et la détermination d'espèces d'un grand nombre d'organismes identifiés comme étant des
Listeria spp. avec des quantités minimales de matériel et de travail.
 -180-

De plus, elle peut être adaptée pour déterminer la production d'acétorne et l'hydro-
lyse de l'esculine.

L'hydrolyse de l'esculine est indiquée par le noircissement de la gélose environnante.

Un test Voges-Proskauer positif est obtenu si les colonies virent au rouge après addition
de KOH et d'a.-naphtol.

Les résultats pour les souches dont les espèces sont déterminées par le système
MAST-ID sont en accord avec ceux obtenus avec le système APl 50CH (299).

Le système MAST-ID est peu coûteux et, utilisant une technique d'inoculation en plu-
sieurs points, permet le criblage en boite de Petri de 9 cm.

Le système APl 50CH est plus cher et plus long ; il convient donc seulement à l'examen
de petits nombres de souches.

Les deux méthodes MAST-ID et APl 50CH permettent l'obtention de résultats en 24h
d'incubation à l'opposé des tests de fermentation d'hydrates de carbone conventionnels qui
nécessitent 5 jours.

-Galerie APl Listeria (bioMérieux) (56) (Annexe VIII).

La galerie APl Listeria, nouvellement apparue, permet de remplacer certains tests

et de faire un diagnostic différentiel rapide au sein de l'espèce Listeria.

Il s'agit d'une nouvelle bande de 10 tests pour l'identification biochimique en 24 h

des isolats de Listeria sans test complémentaire.

Un nouveau test différencie Listeria monocytogenes de Listeria innocua sur la base

de l'absence d'arylamidase pour la première.
 - 181 -

Ce système consiste donc en 10 tests :

- différenciation entre Listeria innocua et Listeria monocytogenes basée sur la

présence ou l'absence d'arylamidase (Dl M test),

-hydrolyse de l'esculine,

-présence d'a-mannosidase,

-production d'acide à partir de D-arabitol, D-xylose, L-rhamnose, a-méthyi-D-

glucoside, D-ribose, glucose-1-phosphate et D-tagatose.

Trois caractéristiques biochimiques sont positives pour toutes les espèces : hydro-
lyse de l'esculine et production d'acide à partir de D-arabitol et d'a-méthyi-D-glucoside.

On observe une production d'acide à partir de glucose-1-phosphate pour Listeria ivanovii

et à partir de D-tagatose pour Listeria welshimeri.

Ce test fournit trois nouveaux marqueurs :

- fermentation de D-tagatose pour Listeria welshimeri,

-fermentation de glucose-1-phosphate pour Listeria ivanovii,

remplaçant le CAMP-test avec Rhodococcus equi,

- DIM évitant le CAMP-test avec Staphylococcus aureus; c'est un nouveau test

basé sur la détection d'arylamidase présente dans les souches de Listeria
innocua et dans la majorité des autres souches non monocytogenes.

Les changements de couleur des tests sont notés et permettent d'établir un profil
numérique à 4 chiffres.
 -182-

Le système APl Listeria est facile à utiliser (seulement une bande), les tests ne
sont pas nombreux (dix) et sont simples à interpréter; il apparaTt donc être un outil particu-
lièrement prometteur en routine dans de nombreux laboratoires.

En raison de ses nombreux avantages, la galerie APl Listeria est le moyen d'iden-
tification de Listeria utilisé dans les laboratoires d'analyse microbiologique.

Mais, il est nécessaire de réaliser une hémolyse en raison de la difficulté à lire le test
Dl M.

-MICRO-ID Listeria (laboratoire AES) (20) (466) (Annexe IX).

Ce test a été adopté par I'AOAC International comme alternative aux méthodes
biochimiques approuvées par la FDA (262).

Ce test contient des disques de papier filtre imprégnés de substrats/réactifs chimi-

ques spécifiques des enzymes endogènes de Listeria spp. qui sont convertis en produits
finaux métaboliques visualisés par des changements de couleur.

Ce système incluant plusieurs tests conventionnels permet une identification

d'espèces en 24 h au lieu de 7 jours avec la méthode biochimique conventionnelle (262),
mais il doit être utilisé en combinaison avec le CAMP-test pour différencier, en particulier
Listeria monocytogenes CAMP-test (+) de Listeria innocua non hémolytique et n'acidifiant
·pas le rhamnose d'une part mais aussi Listeria seeligeri et Listeria ivanovii hémolytiques de
Listeria welshimeri non hémolytique et n'acidifiant pas le rhamnose.

Le kit des 15 tests est facile à utiliser et simple à interpréter mais 8 des 15 tests
(PD, H2S, 1, OD, LD, M, U, ONPG) sont considérés superflus pour la différenciation de
Listeria spp.

La lecture permet d'établir un code à 8 chiffres en ajoutant les valeurs numériques

pour chaque groupe de 3 tests et en tenant compte aussi de la réaction hémolytique.
 -183-

- AutoMicrobic (bioMérieux) (246) (Annexe X).

Il a été adopté par I'AOAC International pour la caractérisation biochimique de

Listeria spp.

C'est un système d'identification microbien automatisé in vitro faisant appel à une

chambre d'incubation avec un lecteur optique, une unité de remplissage et de scellage
pour l'inoculation et un ordinateur ; chacune des deux fiches d'identification contient 30
tests biochimiques.

Les kits sont inoculés avec la même culture pure de chaque organisme et incubés
en microaérophilie pour la fiche GPI (Gram (+)) et une partie des tests de la fiche GNI
(Gram(-)) et en anaérobie pour la deuxième partie des tests de la fiche GNI.

Le lecteur optique mesure les changements de couleur et/ou turbidité et les

transmet à l'ordinateur qui les analyse et les interprète afin de classer l'organisme en genre
et/ou espèce.

Les 11 tests de la fiche GPI à savoir bacitracine, opticine, NaCI 6 %, bile 10 %, bile
40 %, esculine, rouge de tétrazolium, glucose, salicine, tréhalose et cellobiose et deux
réactions de la fiche GNI (rhamnose et xylose) permettent de déterminer l'espèce.

Le CAMP-test, la [3-hémolyse sur gélose au sang de mouton et/ou les tests de

réduction des nitrates sont nécessaires pour différencier les espèces en trois groupes donc
pour la confirmation finale.

Les organismes sont classés en différentes catégories à savoir:

- Listeria monocytogenes et Listeria innocua en catégorie LM,

- Listeria ivanovii et Listeria seeligeri en catégorie LI,

- Listeria welshimeri en catégorie LW,

- Listeria grayi et Listeria murrayi en catégorie LG,

 -184-

-non Usteria en catégorie O.

Les cultures classées Listeria monocytogenes/Listeria innocua sont confirmées

Listeria monocytogenes si la culture démontre une hémolyse r:3 et une hémolyse exaltée
avec Staphylococcus aureus ou Listeria innocua si elle ne démontre pas d'hémolyse r:3 et
une hémolyse inhibée avec Staphylococcus aureus et Rhodococcus equi.

Les cultures classées Listeria ivanovii/Listeria seeligeri sont confirmées Listeria

ivanovii si la culture démontre one hémolyse (3 et une hémolyse exaltée avec Rhodococcus
equi ou Listeria seeligeri si elle démontre une hémolyse (3 et une hémolyse exaltée avec
Staphylococcus aureus et inhibée avec Rhodococcus equi.

Les cultures classées Listeria welshimeri sont identifiées Listeria welshimeri.

Les cultures classées Listeria grayi/Listeria murrayi sont confirmées Listeria grayi si
la culture est incapable de réduire les nitrates ou Listeria murrayi si la culture est capable
de réduire les nitrates.

Le système AutoMicrobic peut être consédéré comme une alternative objective et

rapide aux tests biochimiques conventionnels décrits dans la méthode BAM ; en effet, la
précision de la méthode des deux fiches GPI et GNI est comparable à celle de la méthode
conventionnelle pour la caractérisation biochimique des espèces Listeria.

- RAP-/0.

Ce système a été décrit par LACHICA (319).

Il s'agit d'une identification rapide de Listeria monocytogenes et d'autres espèces

Listeria en moins de 8 h après la formation de colonies sur gélose LCA et faisant intervenir :

- une détermination rapide de l'activité hémolytique,

- une acidification du rhamnose et du xylose,

 -185-

- des tests supplémentaires complétant l'identification rapide et consistant en :

. une microscopie à contraste de phase pour étudier la morphologie cellulaire

et la mobilité,

. le test de production de catalase,

. le test de viscosité KOH remplaçant la coloration de Gram.

Les souches sont donc cultivées sur gélose LCA ou gélose chlorure de lithium-
ceftazidime (317) consistant en une gélose BHIA supplémentée en agents sélectifs à sa-
voir chlorure de lithium, glycine anhydre et ceftazidime pentahydratée.

Des colonies bien isolées, blanches, finement texturées, denses, en forme de coupole et
atteignant un diamètre de 2,5 mm ou 2 mm pour Listeria ivanovii sont obtenues après 40 h
à 30°C.

La gélose LCA joue un rôle critique dans le RAP-10 en permettant sélectivement la

croissance des Listeria sous forme de grandes colonies possédant une activité catalase
élevée; LCA inhibe les bactéries Gram(-).

La reconnaissance des colonies sur gélose LCA fait appel à la technique SHOT ou
technique de transillumination oblique de HENRY simplifiée (318) ; les colonies apparais-
sent bleutées.

RAP-10 consiste donc à soumettre ces colonies bleutées par la technique SHOT à
une batterie de tests sans étape de purification préalable.

Les tests utilisés sont:

- le test d'activité hémolytique consistant à disposer un disque stérile de p ly-

sine au centre d'une gélose au sang (7 h à 35 oc).
 - 186-

Les colonies de Listeria monocytogenes et Listeria seeligeri (CAMP-test avec Staphylo-

coccus aureus (+)) donnent un éclaircissement à proximité du disque de f3 lysine sur la
gélose au sang.

Listeria ivanovii (CAMP-test avec Rhodococcus equi (+)) montre une hémolyse rapide
sans potentialisation par le disque de la 13 lysine staphylococcique.

Les autres Listeria ne montrent pas d'hémolyse.

- l'acidification rapide des sucres par production d'acide à partir de rhamnose et

. de xylose sur gélose colorée en violet supplémentée en sucre à étudier
jusqu'à une concentration finale en hydrate de carbone du milieu de 1 %.

En 6 h, les colonies de Listeria monocytogenes virent au jaune sur gélose violette sup-
plémentée en rhamnose mais pas sur gélose violette supplémentée en xylose.

On observe l'inverse avec Listeria seeligeri.

Seules les colonies de Listeria seeligeri, Listeria welshimeri et Listeria ivanovii deviennent
jaunes sur gélose xylose.

- la microscopie à contraste de phase par remise en suspension des colonies

sur lame dans de l'eau distillée ; la lame est recouverte d'une lamelle et
examinée avec un microscope à contraste de phase pour la morphologie
cellulaire et la mobilité.

- le test de la catalase par ajout à la suspension cellulaire précédemment prépa-

rée d'une goutte d'eau oxygénée d'un côté de la lamelle et observation d'une
effervescence immédiate d'un bout à l'autre de la lamelle,

- le test de viscosité KOH par réalisation d'une suspension dans une goutte de
KOH sur lame et observation d'une masse visqueuse avec les bactéries
Gram(-) alors que les bactéries Gram(+) comme Listeria sont imperméables
à l'action lytique de l'alcalin ; Listeria est donc négative au test de viscosité
KOH.
 -187-

Des tests supplémentaires comme la fermentation du mannitol et la réduction des

nitrates sont nécessaires pour différencier les souches rhamnose (-) de Listeria innocua de
Listeria grayi, Listeria murrayi et Jonesia denitrificans.

L'omission des tests de fermentation du mannitol, le CAMP-test avec Rhodococ-

cus equi et la mobilité en parapluie n'a pas d'effet sur l'efficacité du RAP-10 dans
l'identification des souches diverses de Listeria monocytogenes.

RAP-10 est une procédure rapide pouvant être effectuée par une seule personne
travaillant en conditions aseptiques et elle ne nécessite pas un équipement spécial ni des
réactifs instables.

Les souches sont ensuite caractérisées phénotypiquement.

VI. 1. 3. 2. Caractérisation phénotypique.

VI. 1. 3. 2. 1. Sérotypage.

Il est effectué au Centre National de Référence de NANTES et repose sur une ag-
glutination sur lame avec des antisérums ; il s'agit d'une combinaison antigénique.

VI. 1. 3. 2. 2. Lysotypage.

Il est effectué au Centre National de Référence pour la Lysotypie et le Typage Mo-

léculaire à l'Institut Pasteur à PARIS et repose sur une sensibilité à un certain nombre de
bactériophages.

VI. 1. 4. METHODES REFERENCEES.

Ces méthodes sont diverses à savoir:

- le procédé d'enrichissement à froid sélectif (CE),

- la méthode FDA,
 -188-

- la méthode USDA,

- les méthodes faisant l'objet de notes de service de la part de Ministère de

l'Agriculture.

VI. 1. 4. 1. Procédé à froid (CE ou Cold Enrichment).

Ce procédé ou méthode traditionnelle fait appel à une réfrigération de l'échantillon

après dilution en bouillon non sélectif comme le bouillon tryptone ou en bouillon nutritif gé-
néralement en bouillon tryptone phosphate (TPB) et incubation à 4°C plusieurs semaines
voire des mois.

L'enrichissement en bouillon nutritif peut être suivi après 1, 4 et 8 semaines d'un

enrichissement en bouillon sélectif consistant en un bouillon nutritif supplémenté en acide
nalidixique et en thiocyanate de potassium.

L'enrichissement est suivi d'un isolement à 24h sur gélose sélective, par exemple
MMA ou LPM +AC puis une fois par semaine (au bout de 1, 2, 4, 6, 10 et 12 semaines).

Les géloses sont incubées à 35°C.

L'inconvénient majeur de ce procédé est sa longueur ; en effet, la détection peut

prendre 3 mois.

L'avantage de ce procédé réside en sa sélectivité puisque l'incubation à 4°C sup-

prime la croissance de la plupart des micro-organismes mais les Listeria se multiplient len-
tement avec un temps de génération de 1,5 jours.

Plusieurs théories expliquent le succès de cette procédure.

La première théorie est que cette méthode met à profit la nature psychrotrophique des
Listeria, permettant aux organismes de prendre le dessus sur les contaminants qui sont
capables de pousser sous conditions de stockage réfrigéré et peuvent même mourir pen-
dant un temps prolongé sous stockage à froid.
 -189-

La deuxième théorie est que Listeria dans les échantillons cliniques peuvent exister
dans un stade intracellulaire à l'intérieur des monocytes, macrophages ou d'autres cellules
phagocytiques donc un stockage à froid prolongé facilite la libération de Listeria à partir de
cette position intracellulaire.

Les premières modifications importantes apportées à ce procédé sont :

- l'utilisation de l'illumination oblique décrite par HENRY (261) et réalisée par

réflexion d'une source lumineuse blanche à partir d'un miroir de telle façon
que la lumière touche le fond de la boîte de Petri avec un angle de 45°.

Par examen avec soit une lentille grossissante soit un microscope en utilisant la lumière
transmise obliquement, Listeria apparaTt légèrement surélevée, petite, lisse, bleue à bleue-
verte.

-le développement d'une gélose sélective par McBRIDE et GIRARD (354) utili-
sant la production d'une étroite zone de bêta-hémolyse par les colonies
poussant sur gélose au sang et l'aptitude de Listeria -ci résister au phénylé-
thanol, à la glycine anhydre et au chlorure de lithium, les agents différen-
tiels/sélectifs clés de la gélose.

Sur gélose McBRIDE, Listeria apparatt comme une goutte de rosée entourée par une
faible zone d'hémolyse, ce qui permet leur différenciation des contaminants produisant des
hémolyses prononcées.

- l'utilisation d'agents sélectifs comme l'acide nalidixique et la trypaflavine en

combinaison en milieux sélectifs.

BEERENS et TALLON-CASTEL (31) ont démontré que l'incorporation d'acide nalidixi-

que en milieu d'enrichissement sélectif est utile pour supprimer la croissance des contami-
nants Gram(-).
 - 190-

RALOVICH et coll. (455) ont démontré que l'incorporation d'acriflavine en milieu d'enri-
chissement sélectif supprime la croissance des contaminants Gram(+), procurant un milieu
hautement sélectif qui facilite la sélection des Listeria des contaminants environnants.

VI. 1. 4. 2. Méthode FDA de LOVETT (347) (348) (349) (350).

La méthode FDA ou "US Food and Drug Administration" de LOVETI s'applique à

tous les aliments sauf la viande rouge et la volaille.

Cette méthode a probablement subi plus de vérifications que n'importe quelle nou-
velle méthode et certains changements ont été réalisés depuis sa première utilisation.

Elle fait appel à un enrichissement en bouillon EB à 30°C puis à un isolement sur

gélose MMA à 1, 2 et 7 jours d'enrichissement.

MMA est incubée 48h à 35°C.

Les colonies sont examinées avec une lumière oblique ; les colonies suspectes sont
transférées sur TSA et soumises aux analyses biochimiques.

La méthode FDA modifiée fait appel à un enrichissement en bouillon EB puis à un

isolement sur trois géloses différentes, à savoir MMA, OXFORD et LPM à 1, 2, 4 et 7 jours
d'enrichissement.

Elle s'applique à tous les aliments.

La méthode FDA modifiée avec bouillon FRASER fait appel à un enrichissement

primaire en bouillon EB, à un enrichissement secondaire en bouillon FRASER puis à un
isolement sur MMA, OXFORD et LPM à 1, 2, 4 et 7 jours d'enrichissement.

Elle s'applique à tous les aliments.

 - 191 -

Certaines précautions sont nécessaires à savoir :

- prendre des colonies blanches aussi bien que des colonies bleues à bleues-
grises.

- ne pas augmenter la concentration en cycloheximide.

Des taux élevés de ce composé peuvent réduire la détection des Listeria.

-incuber les boTtes McBRIDE modifiée jusqu'à 72h.

Les colonies Listeria peuvent être mieux observées à 48 et 72h.

- réfrigérer la solution acriflavine - cycloheximide et l'utiliser dans les 10 jours de

sa préparation,

- analyser le bouillon d'enrichissement à 3-4 jours en plus de 1 et 7 jours ; en

effet, les essais après 48-96h d'incubation peuvent donner de meilleurs ré-
sultats que ceux après 24h d'incubation.

VI. 1. 4. 3. Méthode USDA de McCLAIN et LEE (357) (358).

La méthode USDA ou "US Department of Agriculture" de McCLAIN et LEE

s'applique à toutes les viandes rouges et les volailles.

Elle fait appel à un enrichissement en deux étapes, à savoir primaire en bouillon

LEB 1 ou UVM 1 à 30°C puis secondaire en bouillon LEB Il ou UVM Il à 24 h à 30°C, suivi
d'un isolement sur gélose LPM à 24 h d'enrichissement.

LPM est incubée 48h à 35°C.

Les colonies sont examinées avec une lumière oblique ; les colonies suspectes sont
transférées sur TSA et soumises aux analyses biochimiques.
 -192-

La méthode USDA modifiée fait appel à un enrichissement primaire en bouillon

LEB 1et secondaire en bouillon LEB Il à 1 et 7 jours suivi d'un isolement sur trois géloses
différentes, à savoir LPM, MMA et OXFORD à 1 et 7 jours d'enrichissement.

Elle s'applique à tous les aliments.

La méthode USDA modifiée avec le bouillon FRASER fait appel à un enrichisse-

ment primaire en bouillon LEB 1et secondaire en bouillon FRASER à 1 et 7 jours suivi d'un
isolement sur LPM, MMA et OXFORD à 1 et 7 jours d'enrichissement.

Elle s'applique à tous les aliments.

VI. 1. 4. 4. Comparaison des méthodes FDA et USDA (538) (572).

(Tableau XV)

La sélectivité est améliorée dans le cas de la méthode FDA par l'utilisation du

bouillon FRASER et des géloses LPM et OXFORD.

La méthode USDA modifiée est aussi efficace que la méthode USDA modifiée
avec bouillon FRASER.

Le procédé d'enrichissement en deux étapes améliore la détection de Listeria spp.

dans les aliments en inhibant la croissance des autres micro-organismes durant
l'enrichissement.

Listeria monocytogenes est isolée de façon plus efficace sur gélose OXFORD que
sur géloses MMA et LPM.

La méthode USDA est légèrement plus efficace que la méthode FDA.

 METHODE FDA METHODE USDA
Méthode FDA Méthode FDA Méthode FDA Méthode USDA Méthode USDA Méthode USDA
modifiée modifiée avec FB modifiée modifiée avec FB
ECHANTILLONS Tous les aliments Tous les aliments Tous les aliments Tous les viandes Tous les aliments Tous les aliments
(sauf les viandes incluant les incluant les rouges et les et les échantillons et les échantillons
rouges et la viandes rouges et viandes rouges et échantillons de de l'environnement de l'environnement
volaille) et les la volaille et les la volaille et les l'environnement
échantillons de échantillons de échantillons de
~
l'environnement l'environnement l'environnement C"

BOUILLONS 25 g + 225 ml EB 25 g + 225 ml EB 25 g + 225 ml EB 25 g + 225 ml 25 g + 225 ml 25 g +225 ml

iD
llJ
LEB 1
c
D'ENRICHISSEMENT LEB 1 LEB 1
><
TEMPS 1, 2 et 7 jours 1, 2, 4 et 7 jours 1, 2, 4 et 7 jours 24 h 1 et 7 jours 1 et 7 jours ..<
D'INCUBATION A 30°C 1
~
ENRICHISSEMENT 0,1 ml dans FB 0,1 ml dans LEB Il 0,1 ml dans LEB Il 0,1 ml dans FB 1
s:ro-0 1
__,.
SECONDAIRE 24-48 h à 35°C 24 h à 30°C 24 h à 30°C 24-48 h à 35°C 1
o. (.()
<D (..,)
MILIEUX DE MMA 24-48 h à MMA, LPM et MMA, LPM et LPM LPM, MMA et LPM, MMA et (/)

CULTURE 35°C OXFORD 24-48 h OXFORD 24-48 h OXFORD OXFORD ïl

1

0
à 3oc·c à 30°C 1
)>
TESTS DE Catalase Catalase Catalase Catalase Catalase Catalase m.
CONFIRMATION Hémolyse Hémolyse Hémolyse Hémolyse Hémolyse Hémolyse c
1
en
Mobilité Mobilité Mobilité Mobilité Mobilité Mobilité 0
)>
Coloration de Coloration de Coloration de Coloration de Coloration de Coloration de
Gram Gram Gram Gram Gram Gram
Sucres Sucres Sucres Sucres Sucres Sucres
CAMP-test CAMP-test CAMP-test CAMP-test CAMP-test CAMP-test
MR-VP MR-VP MR-VP MR-VP MR-VP MR-VP
Sérologie Sérologie Sérologie Sérologie Sérologie Sérologie

après purification après purification après purification après purification après purification après purification
sur TS.A-YE surTSA-YE surTSA-YE surTSA-YE surTSA-YE surTSA-YE ------

--. -----~·-··-- ··-·--·----·----·--·----"

 - 194-

VI. 1. 4. 5. Comparaison des méthodes FDA et USDA avec le procédé CE.

- FDA et CE (444) :

La comparaison des procédés CE (TPB et MMA) et FDA (EB et MMA) montre que
la méthode FDA est plus efficace que la méthode CE pour le poulet mais pas pour le fro-
mage.

- USDA et CE (256) :

La comparaison des procédés CE (TPB puis bouillon sélectif et LPM + AC) et US-
DA (LEB 1, LEB Il et LPM) montre que:

- les deux méthodes combinées sont significativement meilleures qu'une seule

méthode.

- la méthode USDA est plus efficace et plus sensible que la méthode CE pour
isoler Listeria monocytogenes à partir de la viande, de la volaille et des
végétaux.

-les deux méthodes sont aussi efficaces l'une que l'autre pour isoler Listeria
monocytogenes à partir des produits laitiers.

- FDA. USDA et CE (120) :

La comparaison de ces trois procédés montre que la méthode USDA s'avère être
la meilleure pour isoler Listeria monocytogenes à partir d'une grande variété d'aliments.

VI. 1. 4. 6. Etude comparative de trois protocoles de recherche de Listeria

spp. et de Listeria monocytogenes (462). (Figure 6)

Cette étude a été réalisée par le laboratoire inter-régional de la Concurrence, de la

Consommation et de la Répression des Fraudes de MONTPELLIER.
 -195-

Elle consiste à comparer trois protocoles de recherche de Listeria spp. et Listeria

monocytogenes dans des produits alimentaires à savoir des produits laitiers (fromages au
lait cru), des produits végétaux (salades, herbes aromatiques) et des produits de la pêche
(crevettes crues et cuites).

Les trois méthodes comparées sont :

- la méthode FRASER utilisant le milieu d'enrichissement liquide de FRASER,

-la méthode MLEB utilisant le milieu d'enrichissement liquide MLEB ou Modi-

fied Enrichment Broth (bouillon trypticase soja supplémenté en extrait de
levure, chlorhydrate d'acriflavine, acide nalidixique, cycloheximide),

-la méthode UVM utilisant les milieux d'enrichissement primaire UVM 1et se-
condaire UVM Il.

Tous les isolements sont effectués sur milieux d'isolement sélectifs PALCAM, OX-
FORD et MOX.

Pour ces trois méthodes, la recherche fait appel à trois étapes :

-un enrichissement en bouillon sélectif (FRASER, MLEB, UVM 1et UVM Il),

- un isolement sur milieu sélectif après 24 h (sauf pour UVM 1), 48 h et 7 jours
d'incubation.

L'isolement à 48 h est effectué à partir d'une subculture du bouillon d'enrichissement

incubé 24 h à 30°C.

L'incubation est poursuivie 7 jours seulement si les isolements à 24 h et 48 h sont né-

gatifs.
 - 196-

Figure 6 : Méthodes de recherche de Listeria monocytogenes.

Prise d'essai
25 g d'aliment

-/ Dilution au +1/10 ème

'u
Jo M.L.E.B. FRASER U.V.M 1

t
30•C-24 h 30"C-24 h 30"C-24 h·

/
U
Ulm! Ulml UO.lml
dans!Oml ® dans lU ml dans!Oml

r~~ ~Il
~LEB.

OXF OXF
PAL PAL
MOX 30 4h

wcl""
MOX 30"C 24 h

37"C-24;48h 37"C-24/48h

30'C
® 30'C
~ 30'C
~
OXF OXF OXF
PAL PAL PAL
:v!OX MOX MOX
37"C-2.J/4Sh 37"C-2'lJ:48h 37"C-24/48h

® ~ ®
OXF
OXF OXF
I'A.L PAL PAL
'v10X MOX MOX
37"C-24/48h 37"C-24/48h 37"C-24/48h

Identification
/
des =lonies caractéristiques de li5feria

@ : lsolemem sur mtiteux ge!oses sèlect!ls â partrr d'une anse non égouttée de bouilloo (OXFord. PALcam

u
MOXJ

Réa.llsatlor j"..me subc"tllhlrP

 -197-

- une identification/confirmation des colonies caractéristiques avec les tests sui-

vants, après isolement de 5 colonies caractéristiques de Listeria spp. obte-
nues sur chaque milieu sélectif sur gélose TSAYE :

. la transillumination oblique de HENRY avec une lampe à faisceau de lu-

mière blanche ; les colonies du genre Listeria ont un reflet bleuté, une
surface finement granuleuse et légèrement convexe,

. une recherche de la catalase avec de l'eau oxygénée; le genre Listeria est

catalase (+),

. un test d'utilisation du 0(+)-xylose et du a.-L-rhamnose,

. une hémolyse sur gélose au sang,

. un CAMP-test avec Staphylococcus aureus et Rhodococcus equi sur gé-

lose au sang (activité hémolytique) faisant appel à un ensemencement
des souches en stries horizontales parallèles tracées entre deux stries
verticales d'ensemencement de Staphylococcus aureus et de Rhodococ-
cus equi ; Listeria monocytogenes présente une hémolyse exaltée du
côté de la culture de Staphylococcus aureus,

. une coloration de Gram ; les bactéries du genre Listeria sont de petits ba-
cilles Gram(+), fins, disposés en palissades.

Les résultats montrent que :

-la méthode FRASER est supérieure à la méthode MLEB,

- la méthode UVM donne des résultats pratiquement identiques à la méthode

FRASER mais les résultats positifs après un enrichissement de 7 jours sont
plus nombreux avec la méthode UVM et la méthode FRASER donne des
résultats positifs plus rapidement pour quelques échantillons,
 -198-

- les différences d'efficacité observées peuvent être expliquées par la composi-

tion des bouillons d'enrichissement :

. le bouillon MLEB contient trois antibiotiques : l'acriflavine, l'acide nalidixique

inhibant la croissance de la microflore secondaire Gram(+) et Gram(-) et
le cycloheximide possédant une action antifongique,

. le bouillon FRASER renferme du chlorure de lithium au lieu du cyclohexi-

mide ; le chlorure de lithium inhibe la plupart des Entérocoques,

. le bouillon FRASER possède un pouvoir tampon élevé, réduisant les varia-

tians de pH, alors que le bouillon MLEB n'est pas tamponné (la subcul-
ture a pour rôle de remonter le pH vers la neutralité),

. le bouillon FRASER doit donc son efficacité à sa mattrise du pH et à sa

composition en agents inhibiteurs, favorables à une meilleure récupéra-
tion des cellules lésées,

. le bouillon MLEB renferme du glucose pouvant affecter la récupération des

cellules lésées car la flore contaminante peut utiliser ce glucose et ainsi
acidifier le milieu.

Il ressort donc de cette étude comparative que la méthode FRASER utilisant le

milieu d'enrichissement liquide de FRASER est la méthode la plus efficace et la plus rapide
pour la recherche des Listeria puisque la plupart des résultats sont obtenus après un enri-
chissement de 24 h et de 48 h.

VI. 1. 4. 7. Méthodes référencées en FRANCE. (Tableau XVI)

En France, le Ministère de l'Agriculture a émis des notes de service concernant la

détection de Listeria monocytogenes suivant les aliments.

Elles sont au nombre de 3.

 -199-

- une note de service concernant les produits carnés (Annexe Xl).

Elle fait appel à un enrichissement primaire en bouillon UVM 1 puis un enrichissement

secondaire en bouilon FRASER à 24 h suivi d'un isolement sur gélose OXFORD à 24 h.

- la note de service du 17 Juillet 1992 concernant les produits laitiers (Annexe

Xli).

Elle fait appel à un enrichissement en bouillon EB puis un isolement sur géloses OX,
PALCAM et MOX.

- la note de service du 24 Juin 1993 concernant tous les produits (Annexe Xlii).

Elle fait appel à un enrichissement primaire en bouillon FRASER-DEMI suivi d'un isole-
ment sur géloses OXFORD ou PALCAM et d'un enrichissement secondaire en bouillon
FRASER et enfin à un isolement sur géloses OXFORD ou PALCAM.

Cette méthode est actuellement celle qui est employée dans les laboratoires de micro-
biologie, du fait de sa spécificité élevée (3 isolements).

Dans la plupart des cas, les laboratoires font appel à un isolement sur gélose PALCAM
et à une identification au moyen d'une galerie APl Listeria associée à un CAMP-test avec
Staphylococcus aureus et Rhodococcus equi après purification des colonies obtenues sur
·gélose PALCAM sur gélose PCA.

L'article 2 de l'arrêté du 13 Mai 1992 concerne la méthode de dénombrement de

Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d'origine végétale destinés à la con-
sommation humaine par comptage des colonies à 3rc (Annexe XIV).

Elle fait appel à un enrichissement et à un isolement sur géloses OXFORD, MOX et

PALCAM puis à un repérage des colonies caractéristiques.

Ces colonies sont isolées en stries à la surface de la gélose TSAYE.

 ECHANTILLONS Produits carnés Produits laitiers Tous les produits

ENRICHISSEMENT 25 g + 225 ml UVM 25 g + 225 ml EB 25 g + 225 ml FRASER-DEMI

TEMPS D'INCUBATION 24h à 30°C 48 h à 30°C 18-24 h à 30°C

24-48 h à 30°C (lait cru)
48 h et 7 jours à 30°C (fromages)
-1
Dl
ENRICHISSEMENT 0,1 ml+ 10 ml FRASER 24h à 0,1 ml+ 10 ml FRASER 48h à D"
i"
SECONDAIRE 30°C 3rc Dl
c
ox
..~
MILIEUX DE CULTURE OXFORD 24-48 h à 3rC à 18-24 h et à 42-48 h OXFORD

-
PALCAM ou PALCAM :s::
CD-
MOX :T
0
a.
TESTS DE CONFIRMATION Coloration de Gram Coloration de Gram Coloration de Gram CD
(/) tV
-. 0
Catalase Catalase Catalase CD- 0
co:
Mobilité à l'état frais et en milieu Mobilité à l'état frais et en milieu Mobilité à l'état frais et en milieu (ti
:::J
0
SIM SIM SIM CD-
CD
(/)

Epreuve de CAMP Epreuve de CAMP Epreuve de CAMP CD

:::J
Réduction des nitrates Réduction des nitrates Réduction des nitrates ï1
-.
m
:::J
Fermentation des hydrates de Fermentation des hydrates de Fermentation des hydrates de 0
CD
carbone carbone carbone
Hydrolyse de l'esculine Hydrolyse de l'esculine Hydrolyse de l'esculine

après repiquage des colonies sur après repiquage des colonies sur après repiquage des colonies sur
gélose TSAYE pour purification gélose TSA YE pour purification gélose TSAYE pour purification
~~··
 -201 -

Les boTtes de gélose sont examinées et les colonies suspectes sont repérées â l'aide
d'un faisceau lumineux blanc sous un angle de 45°.

Les colonies typiques sont soumises â l'épreuve de la catalase, â la coloration de Gram,

au test de fermentation du xylose et du rhamnose, â l'épreuve du CAMP et â la mobilité â
l'état frais au microscope â contraste de phase avec un objectif à immersion et sur gélose
mobilité (milieu SIM) par ensemencement en piqûre (mobilité en parapluie).

VI. 2. METHODES RAPIDES.

Elles ont été mises en place du fait des nombreux inconvénients des techniques
classiques comme :

- la lourdeur de la mise en œuvre,

- les nombreuses manipulations,

-la nécessité de personnel spécialisé,

- les longs délais de réponse.

Mais, elles ne permettent pas de faire des dénombrements et par conséquent sont
utilisées actuellement uniquement en routine dans les deux Centres de Référence.

VI. 2. 1. METHODES IMMUNOLOGIQUES OU IMMUNOENZVMATIQUES.

Ces méthodes sont basées sur l'intéraction entre un anticorps monoclonal (51)
(96) (177) (195) (259) (372) (385) (407) (408) (519) (551) (614) ou polyclonal (425) et un
antigène.

Elles nécessitent au préalable un enrichissement de 24 à 48 h.

 -202-

VI. 2. 1. 1. Kits ELISA.

-Kit Listeria Tek (ORGANON TEKNICA CORP) (Annexe XV).

Il s'agit d'une procédure en une étape utilisant deux anticorps monoclonaux dirigés
contre les antigènes de Listeria spp. selon une technique Sandwich dans un essai ELISA.

L'échantillon est incubé simultanément avec l'anticorps monoclonal de capture ou anti-

corps de couverture détectant -un épitope spécifique de l'antigène des Listeria et avec
l'anticorps monoclonal conjugué à la peroxydase de raifort ou anticorps détecteur détectant
un second épitope spécifique sur le même antigène déjà détecté par l'anticorps monoclo-
nal de capture.

Le conjugué composé d'anticorps monoclonal marqué par une enzyme reconnaTt selon
une réaction de type Sandwich l'antigène du complexe immunologique antigène présent
dans l'échantillon - anticorps monoclonal lié à la plaque.

L'enzyme du conjugué réagit avec le substrat TMB ou 3, 3', 5, 5'-tétraméthylbenzidine

en solution dans du peroxyde d'hydrogène en développant une coloration bleue directe-
ment proportionnelle au taux d'antigène.

La réaction est stoppée par addition d'acide fort (H2S04 2N) et vire du bleu au jaune.

L'absorption est mesurée au spectrophotomètre à 450 nm.

Ce test est:

-très sensible et spécifique puisque deux anticorps monoclonaux différents

sont utilisés ; un pour la capture de l'antigène et un autre pour la conjugai-
son enzymatique,

- rapide puisque les résultats sont obtenus en 2 h,

- simple à réaliser,
 -203-

- facile à interpréter,

- aussi sensible et précis que les meilleures méthodes de culture,

- sans danger car il ne fait pas appel à des cultures vivantes, à de la radioactivi-
té ou à des phages et demande peu de place.

Il peut être appliqué aux produits laitiers, aux denrées animales et aux échantillons
environnementaux.

-Kit Listeria Tecra (3M) (Annexe XVI).

Il utilise des anticorps polyclonaux.

Les deux kits ELISA (Listeria-Tek et Listeria-Tecra) ne présentent pas de diffé-

rence significative par rapport à la méthode de culture décrite dans le Manuel Analytique
Bactériologique (BAM) ou méthode FDA officiellement reconnue comme méthode AOAC
pour détecter Listeria spp. mais le kit Listeria-Tecra est légèrement plus sensible que le kit
Listeria-Tek.

Ces deux méthodes ELISA (kits Tek et Tecra) sont donc recommandées comme alter-
natives à la méthode BAM (416).

VI. 2. 1. 2. TRANSIA (Annexe XVII).

Ce test est:

- rapide car les résultats sont obtenus 1h30 après enrichissement,

- simple car il s'effectue en cinq étapes sur une partie aliquote stérilisée du mi-
lieu liquide d'enrichissement de 48 h,

- précis du fait de l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques du genre

Listeria,
 -204-

- fiable, du moins autant que la méthode officiellement recommandée,

- sans danger car les échantillons sont stérilisés à 1oooc,

- économique, son coût étant moins élevé que celui des méthodes convention-
nelles.

Les cinq étapes de ce test sont les suivantes:

1 - répartition de l'échantillon enrichi dans un puits sensibilisé par un anticorps

monoclonal fixé sur les parois,

2 - réaction immunologique par ajout d'anticorps monoclonal conjugué à la pe-

roxydase et incubation à 37°C,

3 - lavage des puits,

4- ajout de substrat enzymatique TMB dans les puits et incubation à 20°C,

5 - ajout de solution d'arrêt dans les puits.

Le résultat est obtenu par lecture de l'absorbance des puits à 450 nm à l'aide d'un
lecteur calorimétrique ElA de microplaques.

VI. 2. 1. 3. VIDAS Listeria (LIS) (bioMérieux) (Annexe XVIII).

Le test VIDAS Listeria LIS automatisé permet la détection des antigènes de Liste-
ria dans les produits alimentaires et les échantillons d'environnement selon une technique
Sandwich en moins d'1 h après pré-enrichissement et enrichissement par la méthode ELFA
(Enzyme Linked Fluorescent Assay) assurant d'excellentes sensibilité et spécificité.

Il s'agit d'un test unitaire original puisque libre de toutes les contraintes liées à la
distribution des réactifs (aucune aiguille de prélèvement, pas de seringue, pas de tubulure,
pas de contact entre les réactifs et les instruments).
 -205-

Le cône à usage unique sert de phase solide et de système de pipetage.

Sa surface intérieure est recouverte d'anticorps anti-Listeria adsorbés et les autres réac-
tifs prêts à l'emploi sont pré-répartis dans la cartouche.

Une aliquote de bouillon d'enrichissement est placée dans la cartouche et subit un cycle
d'aspiration/refoulement.

Les antigènes se fixent sur les anticorps monoclonaux anti-Listeria adsorbés sur la sur-
face interne du cône.

Les anticorps conjugués marqués à la phosphatase alcaline sont aspirés et refoulés

dans le cône puis se fixent sur les antigènes de Listeria fixés eux-mêmes sur les anticorps
de la paroi du cône.

Le conjugué non fixé est éliminé par lavage.

Le substrat 4-méthyl-ombelliférylphosphate en solution dans l'azoture de sodium est

introduit.

L'enzyme restant sur les parois du cône catalyse la transformation du substrat en un

produit fluorescent; la 4-méthylombelliférone dont l'intensité est mesurée à 450 nm.

Les résultats sont analysés automatiquement par l'ordinateur.

VI. 2. 2. METHODES DE TYPAGE MOLECULAIRE.

VI. 2. 2. 1. Méthodes basées sur l'ADN.

VI. 2. 2. 1. 1. Tests d'hybridation (401) (589).

Ces tests utilisent des sondes nucléiques d'ADN ou d'ARN naturelles ou synthéti-
ques marquées ou non et sont basés sur l'unique capacité d'une molécule d'ADN ou
d'ARN à s'hybrider de façon spécifique avec une séquence complémentaire.
 -206-

L'avantage majeur des sondes d'acides nucléiques est leur capacité d'information
à savoir la connaissance des séquences d'ADN génomique obtenues à partir de gênes
clonés.

Les sondes naturelles (105) (127) (128) (131) (169) (494) (602) sont basées sur
des gênes ou portions de gênes tels que hlyA codant pour la [3-hémolysine (61) (130),
lmaA codant pour un facteur d'hypersensibilité retardé DTH-18 (9) (422) et iap (msp) co-
dant pour une protéine extracelluleire de 60 kDa associée à l'invasion des cellules phago-
cytiques non professionnelles (193) (301) (31 0) clonés dans un plasmide.

L'ADN plasmidique est extrait par un mélange détergent- lysozyme puis purifié par cen-
trifugation en gradient de densité au chlorure de césium - bromure d'éthidium.

Le fragment du gêne est obtenu par traitement de cet ADN avec des enzymes de res-
triction.

Les fragments résultants sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose et obtenus
par électroélution à partir du gel.

32
Les sondes sont marquées au P, à la peroxydase de raifort en présence de glutaral-
déhyde ou à la digoxigénine-11-dUTP.

L'utilisation de sondes synthétiques (oligonucléotides) (129) comme sondes mon-

tre de nombreux avantages ; les sondes sont plus courtes (10 à 50 bases) d'où leur
meilleure spécificité et l'hybridation de l'ADN cible est plus rapide qu'avec les sondes clo-
nées naturelles (200 bases ou plus).

Il s'agit de sondes d'ARN synthétisées à partir de fragment de gênes tels que hlyA ou
msp (300) obtenu à partir d'un plasmide amplifié par du chloramphénicol et purifié par
centrifugation en gradient de densité au chlorure de césium et bromure d'éthidium puis
digéré par des enzymes de restriction, purifié par électroélution, cloné dans les vecteurs de
bactériophage et séquencé.

32
Les oligomers sont marqués au P, à la digoxigénine ou à la phosphatase alcaline.
 -207-

Certaines sondes basées sur I'ARNr (137) (569) (570) (571) sont utilisées pour hybrider
I'ARNr 16S (71 ).

La méthode conventionnelle fait appel à plusieurs étapes à savoir :

1 - une lyse des cellules déposées sur papier filtre ou sur membrane en nylon
ou cellulose par les micro-ondes en présence d'un mélange lysant ou par la
vapeur alcaline,

2 - une neutralisation,

3 - une fixation des acides nucléiques dénaturés par séchage ou irradiation,

4- une hybridation précédée ou non d'une préhybridation,

5 - une détection :

. par autoradiographie,

. immunologique avec des anticorps anti-digoxigénine conjugués à la phos-

phatase alcaline.

Les substrats pour la phosphatase alcaline sont : le nitrobleu de tétrazolium et le 5-

bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate de toluidine.

D'autres méthodes peuvent être utilisées comme :

- la méthode soustractive (1 04) (365) faisant appel à un ADN marqué radioacti-

vement et enrichi spécifiquement en séquences d'ADN spécifiques d'un or-
ganisme par élimination de ces séquences présentes chez d'autres espèces
(hybridation par croisement) et servant de sonde soustractive.
 -208-

-le dosage de protection homogène en chimioluminescence (HPA) (424).

HPA est un type unique de dosage de la sonde ADN dans lequel la séparation de la
sonde non hybridée en excès avant la détection du complexe sonde- cible n'est pas né-
cessaire.

HPA implique un marquage chimique direct de l'ADN sonde avec l'ester d'acridine du-
rant la synthèse d'ADN de telle façon que l'ester d'acridine est positionné précisément en
situation intérieure sur la sonde pour la protéger sélectivement au moment de l'hybridation
entre la sonde et la cible.

L'hybridation se fait en solution donc l'efficacité est très élevée.

Après hybridation de la sonde ADN avec sa cible ARNr, le marquage chimioluminescent

(acridine) de la sonde non hybridée est sélectivement inactivé par hydrolyse chimique diffé-
rentielle; ainsi, il y a une perte rapide de chimioluminescence associée à la sonde non hy-
bridée alors que la chimiolumiscence associée à la sonde hybridée n'est pas affectée.

La formation d'un hybride entre la sonde et la cible est détectée au luminomètre après
addition du réactif de détection.

La sonde montre une sensibilité de 100 % et une spécificité de 100 % pour Listeria mo-
nocytogenes.

La limite inférieure de détection est de 104 -1 05 cellules.

Les sondes marquées avec des radio-isotopes offrent une grande sensibilité mais pré-
sentent des problèmes de sécurité.

Les dérivés de l'ester d'acridine peuvent facilement être incorporés dans les oligonucléoti-
des grêce au premier groupe aminé aliphatique du nucléotide (575).
 -209-

Les autres avantages des sondes d'ADN marquées à l'ester d'acridine sont la longue demi-
vie du réactif, le court temps du dosage, la haute sensibilité de la détection, la compatibilité
avec le système de mesure de la lumière et la soumission aux procédures automatiques
(575).

HPA est donc une méthode prometteuse pour la confirmation des colonies et peut être
une alternative intéressante aux tests de confirmation couramment utilisés.

HPA est une méthode sensible, spécifique, facile à réaliser et rapide (30 à 40 minutes).

-l'hybridation directe des colonies sur filtres hydrophobes (HGMF) (Hydrophobie

grid-membrane filter) après marquage avec une peroxydase de raifort (438)
(439).

Après le développement de couleur du chromogène, un compteur commmercial (HGMF

Interpreter) est capable de détecter et de compter les organismes électroniquement.

Cette méthode d'hybridation colorimétrique ou technique d'hybridation directe des colo-

nies sur HGMF avec détection électronique et comptage automatique ne montre aucune
différence avec la technique classique d'hybridation.

Elle peut donc être utilisée en microbiologie alimentaire.

-l'essai Gene-Trak (302) (303) (305) (306).

Il basé sur la détection de séquences uniques d'ARNr 16S de Listeria en utilisant une
32
sonde ADN synthétique complémentaire marquée au P ou à la fluorescéine.

La détection peut être non-isotopique ou colorimétrique avec un anticorps anti-

fluorescéine marqué à la peroxydase de raifort puis une visualisation au moyen d'un subs-
trat ; elle implique alors deux sondes : une sonde détectrice contenant un ligand, la fluores-
céine, pour la détection enzymatique postérieure et une sonde capture contenant un do-
maine polydésoxyadénylate (dA) qui sert à lier le complexe cible - sonde dans des tubes
plastiques recouverts de polydésoxythymidine ; ces deux sondes hybrident les régions ad-
jacentes de la cible ARNr 16S Listeria.
 -210-

32
Mais, elle peut aussi être isotopique avec une sonde marquée au P par comptage de
32
l'activité P sur chaque filtre grace à un détecteur Gene-Trak ou un compteur à scintillation
sans fluide.

L'essai Listeria Gene-Trak est un test rapide, sensible et spécifique de Listeria monocy-
togenes.

- le test Gen-Probe (414) (51 0).

Il est basé sur une réaction d'hybridation entre une sonde d'ADN simple marquée par
chimioluminescence et une séquence unique complémentaire dans la région ARNr 16S de
Listeria monocytogenes

Ce test peut se faire selon deux méthodes avec une sonde fournie par le kit :

1 - mise en contact de la sonde avec le bouillon d'enrichissement en tube test

"Accu Probe",

2- centrifugation d'une aliquote du bouillon d'enrichissement, décantation du surna-

geant, remise en suspension du culot dans un tampon phosphate puis application
de la méthode 1 à la solution concentrée 5 fois.

Une réaction d'hybridation se produit en phase liquide entre une sonde non-isotopique
d'ADN spécifique de Listeria monocytogenes marquée à l'ester d'acridium et I'ARNr cible
des cellules lysées.

. Après hybridation, le marquage chimioluminescent des sondes non hybridées est inacti-
vé de façon sélective par une étape d'hydrolyse différentielle.

L'addition de solution alcaline de peroxyde d'hydrogène permet de détecter une légère

émission à 430 nm au Juminomètre due à l'ester d'acridium lié à l'hybride ADN-ARNr.

Ce test s'avère moins sensible, moins spécifique et plus long que la PCR (412).

La sonde est à 100 o/o sensible et à 100 o/o spécifique pour les colonies isolées.
 - 211 -

La limite de détection minimale en solution saline physiologique est établie à près de 105
CFU Listeria monocytogenes.

- le test ELISA-HNA (169).

Il s'agit d'une hybridation entre de simples brins d'ADN (ADN préparé à partir d' ARN
32
total de Listeria monocytogenes) marqué au P et leurs brins complémentaires.

La sonde d'ADN est hybridée en phase aqueuse avec les molécules d'ARN cible ; les
hybrides HNA spécifiques sont capturés par des anticorps spécifiques de HNA.

Les molécules HNA capturées sont révélées avec un conjugué enzymatique de strep-
tavidine (immunodétection).

Une hybridation en phase aqueuse offre l'avantage d'augmenter la vitesse des réactions
d'hybridation, elle assure l'accessibilité complète des séquences cibles et le faible niveau
d'interférence avec le matériel extérieur en fluides biologiques permet la quantification par
essai direct de l'échantillon avec des marquages non-isotopiques.

- l'hybridation ADN-ADN "optique" (249).

Il s'agit d'une méthode d'appariement ADN-ADN étudiant le degré d'homologie ADN-

ADN entre les ADN de différentes espèces de Listeria.

Listeria grayi et Listeria murrayi sont facilement séparées par l'œil et apparaissent dis-
tinctes des autres espèces.

Les souches de Listeria ivanovii sont regroupées.

Les espèces Listeria, surtout Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria welshi-
meri et Listeria seeligeri sont étroitement apparentées.
 -212-

VI. 2. 2. 1. 2. Analyse de restriction enzymatique (REA ou Restriction Enzyme

Analysis) (174) (185) (417) (418) (590) (591).

L'ADN est digéré par des endonucléases de restriction et la détection est réalisée
par électrophorèse et hybridation avec une sonde.

Deux sortes d'endonucléases de restriction sont utilisées à savoir :

- des enzymes de restriction produisant un nombre suffisant de bandes distin-

guables par électrophorèse comme Hhal, Hindlll, Haelll, EcoRI, Pstl,
BamHI ; dans ce cas, la digestion est suivie d'une électrophorèse en gel
conventionnelle (1 01 ),

- des enzymes de restriction caractérisées par de rares séquences de recon-

naissance (à faible fréquence de clivage: low-frequency cleavage) : Apal,
Smal, Notl, Ascl.

Les Listeria étant caractérisées par un faible contenu ADN G+C, on choisit des enzymes
de restriction ayant des séquences de reconnaissance contenant seulement les nucléotides
G et C en présence de tampon de clivage contenant de la sérum albumine de bovin.

Dans ce cas, la digestion est suivie d'une électrophorèse en champ pulsé (PFGE) (72)
(73) (88) (89) (270) (320) et l'utilisation de sondes à ADN marquées radioactivement n'est
pas nécessaire car un petit nombre de fragments sont visualisés.

La REA se fait en plusieurs étapes :

1 -une extraction de l'ADN par lyse des cellules par centrifugation,

2 - une digestion enzymatique,

3 - une séparation des fragments d'ADN par électrophorèse,

4 - une possible hybridation Southern blot (18),

 -213-

5 - une détection par coloration du gel d'agarose avec du bromure d'éthidium,

6 - une visualisation des résultats avec une lampe UV à ondes courtes à travers
un filtre rouge (visualisation par fluorescence) et photographie du gel.

VI. 2. 2. 1. 3. Polymorphisme d'ADN ou PCR.

- PCR simple (43) (65) (138) (192) (225) (365) (403) (411) (481) (544)
(580) (586) (602).

La PCR ou Polymerase Chain Reaction permet une amplification exponentielle

grâce à une polymérase (Taq-polymérase) d'une séquence cible d'ADN suivie d'une élec-
trophorèse en gel d'agarose (détermination de la taille des produits amplifiés) pour la plu-
part ou hybridation.

La PCR a été utilisée pour amplifier les gènes ou portions de gènes tels que hlyA
(203), lmaA et iap (78) ou les régions comprises entre les loci génétiques des gènes 16S
et 23S d'ARNr procaryote (285) (570) (571) (577).

La PCR se fait en plusieurs étapes :

1 - une lyse par centrifugation permettant de récupérer l'ADN,

2 - une amplification en tampon contenant des amorces et la Taq ADN polymé-

rase (490) en plusieurs cycles,

3 - une détection des produits amplifiés ou produits PCR par :

. électrophorèse en gel d'agarose ou bis-acrylamide puis coloration du gel

avec du bromure d'éthidium.

Mais la visualisation de l'ADN par coloration au bromure d'éthidium peut rendre l'interpré-
tation des résultats difficile du fait de la production d'amplifications non spécifiques et de la
sensibilité limitée de cette technique.
 -214-

. hybridation avec une sonde ADN pour améliorer la sensibilité et la spécifici-

té des analyses PCR (365).

Mais de telles méthodes impliquent des procédures d'hybridation ADN-ADN intenses et

nécessitent l'utilisation de sonde marquée d'où le prix élevé du test.

Une PCR suivie d'une hybridation avec une sonde ADN synthétique inversée a été rap-
portée ; en effet, les produits PCR marqués à la digoxigénine-11-dUTP sont déposés sur la
sonde liée à la membrane (75) .

. hybridation avec une sonde ARN (57) non marquée formant un hybride
ARN-ADN avec l'ADN cible immobilisé sur une membrane donc après
électrophorèse ; l'hybride peut être détecté par un essai immunoenzyma-
tique (Ac reconnaissant l'hybride).

Les avantages de la sonde ARN sont les suivants :

- les hybrides ARN-ADN sont plus stables que les hybrides ADN-ADN,

- les Ac reconnaissent les hélices de l'hybride ARN-ADN d'où la non-nécessité

d'introduire des marqueurs chimiques sur la sonde.

- PCR immunomagnétique ou essai MIPA (magnetic immuno-polymerase

chain reaction (PCR) assay) (196) (592).

La PCR immunomagnétique (MIPA) combine une séparation immunomagnétique

à la PCR c'est-à-dire une séparation magnétique des Listeria par des particules magnéti-
ques recouvertes d'anticorps monoclonaux spécifiques des Listeria suivie d'une amplifica-
tion de la séquence ADN de Listeria monocytogenes par PCR.

Les anticorps monoclonaux seuls ne font pas la discrimination entre Listeria mono-
cytogenes et les autres Listeria spp. ; cet inconvénient est remédié par la PCR après la
séparation magnétique.
 -215-

La combinaison de la capture immunologique et de la détection ultérieure de Us-

teria monocytogenes séparée par la PCR surmonte les désavantages majeurs des deux
méthodes utilisées seules.

- PCR dans laquelle une des amorces est biotinylée et la digoxigénine-11-

dUTP est incorporée durant l'élongation (267).

Les produits PCR biotinylés sont capturés sur supports solides recouverts de
streptavidine et la phosphatase alcaline conjuguée à l'anticorps anti-digoxigénine est liée
ensuite à la digoxigénine incorporée.

La détection peut être obtenue avec des substrats calorimétriques, fluorescents ou

luminescents pour la phosphatase alcaline.

Elle se fait en deux étapes :

1 - une capture des produits PCR en microplaques ou avec des billes recouvertes de
streptavidine,

2 - une génération de signal grâce à 3 substrats différents donnant des signaux fluo-
rescents, calorimétriques et luminescents après ajout aux puits ou aux billes
recouverts de streptavidine et incubation à l'obscurité :

. 4-méthylombelliféryl phosphate (4-MUP) en tampon diéthanolamine pH 9,6 et

mesure de la fluorescence au fluorimêtre,

. paranitrophénylphosphate (PNPP) en tampon 2-amino-2-méthyl-1-propanol pH

10,3 puis ajout de soude et mesure de l'absorbance à 405 nm au spectropho-
tomètre,

. 3-(2'-spiroadamantane)-4-méthoxy-4-(3"-phosphoryloxy)-phényl-1, 2-dioxétane
(AMPPD) en tampon diéthylamine pH 10 puis ajout de MgCI 2 et exposition aux
RX.
 -216-

Les billes magnétiques sont plus sensibles car leur capacité de liaison est supé-
rieure à celle des puits.

- PCR + LCR (22) (593) (594).

La LCR est une méthode sensible et spécifique basée sur une différence de paires
de bases uniques dans la région V9 ou V2 du gêne ARNr 16S (ADNr 16S).

Le principe repose sur- la liaison de deux amorces oligonucléotides synthétiques

adjacentes qui hybrident seulement un brin de l'ADN cible.

Le produit lié est séparé à partir des amorces par électrophorèse en gel de polya-
crylamide dénaturant et détecté par autoradiographie.

L'absence de produit lié indique un changement de paire de bases unique dans la

séquence cible.

Une amplification PCR primaire de I'ADNr 16S est combinée avec une amplifica-
tion LCR secondaire avec une ligase thermostable (21 ). pour produire une méthode sensi-
ble et spécifique.

L'amplification primaire par PCR permet d'augmenter la sensibilité de cette méthode.

La détection est isotopique ou non avec un substrat chromogénique ou paranitrophényl-

phosphate (pNPP) à 450 nm (détection calorimétrique) ou avec un substrat luminogénique
Lumi-Phos 530 à 450 nm (détection chimioluminescente).

La détection luminogénique non-isotopique avec Lumi-Phos 530 est plus rapide que la
détection chromogénique non-isotopique avec la pNPP (3h/12h) ; elle permet d'accomplir
la LCR couplée à la PCR en 1Oh alors que la méthode de détection isotopique le fait en
24h.
 -217-

- PCR + REA appliquée aux RFLP (338) (564).

Cette méthode consiste à étudier le polymorphisme des fragments de restriction

en fonction de leur longueur donc à déterminer les RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) dans les séquences nucléotidiques des gênes associés à la virulence et
amplifiés par PCR.

Elle consiste à amplifier l'ADN ou les gênes tels que hly A (61 ), iap, mpl ou prfA
par PCR avant de les soumettre à des endonucléases de restriction et à une électropho-
rèse puis à une coloration avec du bromure d'éthidium et à une visualisation sous lumière
UV à 302 nm.

La PCR de même que la MEE montrent un schéma de restriction pour les sou-
ches de sérovars 1/2b, 3b et 4a et un autre pour les souches de sérovars 1/2a, 1/2c et 3a
donc une parfaite corrélation est observée entre MEE et RFLP bien que ces deux métho-
des détectent différents types de variations dans le chromosome.

En effet, MEE détecte des variations dans les séquences de codage altérant la charge et
donc la mobilité électrophorétique des enzymes constitutives alors que RFLP détecte des
changements de séquences de nucléotides résultant en un gain ou une perte de sites de
reconnaissance d'enzymes de restriction.

Les diversités structurales dans Listeria monocytogenes se produisent à la même vi-

tesse que les changements dans les gènes codant pour les enzymes cytoplasmiques es-
sentielles et les antigènes de surface immunogéniques utilisés dans le sérotypage.

Les différences structurales observées dans les gênes codant pour la virulence peuvent
être des mutations silencieuses c'est-à-dire non reliées à la virulence ou modulant le mé-
canisme de pathogénèse.

L'analyse RFLP apparaTt être utile pour la caractérisation de Listeria monocytoge-

nes.
 -218-

Un des problèmes de l'analyse RFLP est le nombre élevé de bandes (1 00 à 1000) obte-
nues par restriction de l'ADN génomique avec les enzymes de restriction ayant des sé-
quences de reconnaissance de 4 ou 6 bases.

Ceci la rend difficile à appliquer à une grande série de souches afin de déterminer le degré
d'inter-relation.

- PCR + RAPD (Randomly Amplified Polymorphie DNA) (123) (324) (362)

(387) (388) (597).

La PCR permet d'obtenir des profils d'ADN polymorphique amplifié au hasard qui
sont analysés par électrophorèse en gel d'agarose.

L'analyse RAPD est une variante de la PCR dans laquelle une seule amorce est
utilisée.

Cette méthode de typage RAPD peut se faire après lyse ou à partir de cellules
entières. Dans ce dernier cas, elle ne nécessite pas d'extraction d'ADN au préalable ; les
cellules entières sont incubées dans le mélange de réaction.

Cette méthode est simple et rapide comparée à REA et MEE.

Cette analyse des profils RAPD obtenus par PCR est en complète corrélation avec
le typage par les bactériophages.

Donc, l'analyse des profils RAPD est proposée comme une alternative à la lysoty-
pie car l'amorce unique génère des profils permettant une discrimination entre les souches
de même sérotype.

VI. 2. 2. 1. 4. Typage des plasmides (312) (328) (437).

Il s'agit d'une méthode de typage de l'ADN plasmidique ou de l'ADN extrachromo-

somique.
 -219-

Ce typage nécessite une extraction de l'ADN extrachromosomique, une restriction

par des endonucléases et une électrophorèse en gel d'agarose.

L'analyse de restriction, l'essai d'hybridation et la MEE montrent un degré élevé d'homo-

logie entre les différents plasmides (191) (313).

Bien que Listeria spp. hébergent des plasmides, les profils plasmidiques ont une
valeur limitée du fait de l'instabilité des plasmides, du faible nombre de souches en conte-
nant et de l'identité de la plupart- des schémas de restriction.

VI. 2. 2. 2. Ribotypage (Ribosomal DNA fingerprinting) (11 0) (277) (278)

(537) (565).

Il s'agit d'une nouvelle méthode de caractérisation au même titre que la sérotypie

et la lysotypie ou technique d'empreintes d'ADN ribosomique non-isotopique afin de carac-
tériser Listeria monocytogenes en utilisant I'ARNr 168 et 238 ; elle permet d'obtenir des
ribovars.

Il s'agit d'un polymorphisme de restriction des régions des gènes d'ARN faisant
appel à une digestion par les endonucléases de restriction, une hybridation de l'ADN chro-
mosomique avec une sonde d'ARNr clonée, incluant le gène ARNr 168 ou 238 et marquée
32
avec de la dUTP-11-digoxigénine (18) (233) ou au P et une autoradiographie ou une dé-
tection immunologique.

Le typage d'ARNr a été décrit pour la première fois en 1986 (235).

Le ribotypage apparait être une méthode de typage moléculaire bien reproductible

et peut être un complément utile à d'autres méthodes telles que le sérotypage, le lysoty-
page, la MEE et la REA pour l'étude épidémiologique de la listériose.

Cette méthode présente deux avantages.

Du fait de la conservation des gènes ribosomaux, une sonde universelle peut être utili-
sée pour la caractérisation de plusieurs organismes.
 -220-

De plus, cette procédure permet d'obtenir un nombre convenable de bandes (5 à 15) de

différentes tailles moléculaires car les bactéries contiennent de nombreux opérons.

L'ARNr peut donc être utilisé pour déterminer le degré de relation génétique parmi
les souches et pour l'épidémiologie moléculaire des espèces microbiennes.

En général, les souches apparentées épidémiologiquement appartiennent au

même ribotype.

VI. 2. 2. 3. Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE) (25) (52) (53) (59) (60)
(421) (442) (509).

Il s'agit d'un système de typage par électrophorèse des enzymes ou analyse de la

mobilité électrophorétique des enzymes métaboliques constitutives ou analyse des profils
d'isoenzymes.

Les différentes enzymes étudiées sont l'acide phosphatase (ACP), l'aconitase

(ACO), l'adénylate kinase (ADK), l'alpha-naphtyl acétate estérase, l'alpha-naphtyl acide
phosphatase, l'alanine deshydrogénase (ADH) (ALD), la catalase (CAT), l'a-esté rase, la (3-
estérase, la 2-alpha-naphtyl propionyl estérase 1 (NP1) (EST-a.), la 2-alpha-naphtyl propio-
nyl estérase 2 (NP2), la J3-naphtyl propionyl estérase (EST-J3), la fumarase (FUM), la glu-
cose-6-phosphate deshydrogénase (GP6) (G6P), la NADP-dépendante glutamate deshy-
drogénase (GLD) (GD2), la glutamique-oxalo acétique transaminase, la NAD-dépendante
glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase (GP1 ), l'indophénol oxydase (IPO), l'isoci-
trate deshydrogénase (IDH), la lactate deshydrogénase (LDH), la leucyl-glycyl (ou glycine)-
glycine peptidase (LGG), la mannose 6-phosphate isomérase (MPI), la nucléoside phos-
phorylase (NSP), la L-phénylalanine-L-Ieucine peptidase (PLP), la 6-phosphogluconate
deshydrogénase (PGD) (6PG), la phosphoglucomutase (PGM), la phosphoglucose isomé-
rase (PGI).

Elle permet de déterminer les types électrophorétiques ou électrophorétypes (ET)

reflétant le génotype chromosomique.

Elle fait appel à 3 étapes : lyse, électrophorèse et identification des "taches".

 -221-

La MEE a été employée pour étudier la structure génétique et l'épidémiologie de

nombreuses bactéries.

Les isolats bactériens sont différenciés selon la variation dans la mobilité électrophoréti-
que d'un grand nombre d'enzymes métaboliques constitutives.

Elle permet d'estimer les niveaux de diversité génétique et la relation parmi les isolats de
populations naturelles donc de distinguer les isolats bactériens.

Pour chaque enzyme, la mobilité relative est établie par marquage de la distance de
migration relative à partir de la cathode c'est-à-dire que les enzymes les plus proches de
l'anode donnent la marque la plus faible.

VI. 3. AUTRES METHODES.

VI. 3. 1. TYPAGE DES MONOCINES (595).

Il est rendu possible du fait de la production de monocines par la plupart des sou-
ches.

VI. 3. 2. SEPARATION IMMUNOMAGNETIQUE (IMS) (524).

Il s'agit d'une nouvelle approche d'extraction et d'isolement des bactéries pathogè-

nes directement à partir d'aliments, de bouillons d'enrichissement ou de culture pure et de
suspensions hétérogènes faisant appel à des gouttes immunomagnétiques (1MB) liées de
façon covalente à des anticorps monoclonaux dirigés contre les flagelles de Listeria mono-
cytogenes.

La sensibilité de cette méthode est influencée par :

- la procédure de couverture,

- le temps d'incubation,

- Je nombre de gouttes immunomagnétiques.

 -222-

Les résultats obtenus par ce test d'agglutination et par l'hybridation dot blot sont
en étroite corrélation.

VI. 3. 3. CYTOMETRIE EN FLUX (FLOW CYTOMETRY OU FCM) (148) (150).

La cytométrie en flux des populations bactériennes marquées par fluorescence fait

appel à une immunofluorescence en combinaison avec des mesures du contenu en ADN et
de taille.

Elle permet une caractérisation morphologique, une différenciation des autres

bactéries entre autres les Streptocoques en fonction des paires de bases nucléiques et une
détection fluorescente des cellules en suspension traversée par un rayon laser après trai-
tement avec des colorants appropriés.

Elle s'effectue après un enrichissement sélectif par analyse des intéractions cellu-
laires avec le rayon d'après un certain nombre de paramètres tels que :

-la taille (morphologie) mesurée grace à une lumière diffuse,

-le contenu en ADN (acides nucléiques) grace au marquage par l'iodure de

propidium (Pl) de la suspension bactérienne,

- l'intensité d'immunofluorescence grace au marquage de l'antisérum spécifique

de Listeria par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC),

- l'antigénécité de surface.

La cytométrie en flux fait appel aux étapes suivantes :

1 - une rupture des chaines cellulaires par ultrasons et centrifugation,

2 - une dilution du culot dans l'éthanol pour fixer les acides nucléiques puis
dans une solution de ribonucléase (RNase A) pour extraire l'ADN.
 -223-

Le traitement à la Rnase avant coloration par le Pl rend la coloration d'ADN spécifique,

en réduisant l'ampleur de la distribution d'ADN et en affinant le signal de fluorescence
d'ADN.

3 - un marquage :

. direct par remise en suspension des cellules dans un antisérum types 1 et

4 anti-Listeria polyvalent marqué· par l'isothiocyanate de fluorescéine
(FITC),

ou

. indirect par incubation des cellules avec l'antisérum type 1 Listeria 0, l'anti-
sérum type 4 Listeria 0 ou l'antisérum Listeria polyvalent et remise en
suspension dans lgG, lgA, lgM de chèvre anti-lapin marquées à FITC,

4 - une addition d'iodure de propidium en solution dans du citrate trisodique ou

coloration de l'ADN par immunofluorescence,

5- une détection au rayon laser.

La FCM permet une détection rapide et fiable mais possède deux inconvénients :

- pas de corrélation parfaite entre les résultats par FCM et par culture,

- degré élevé de faux positifs malgré l'utilisation d'anticorps monoclonaux spéci-

fiques de Listeria pouvant surmonter cet inconvénient.

La FCM peut aussi détecter des cellules mortes.

La FCM est appliquée à:

- ta caractérisation des agents des infections orales,

 -224-

- la différenciation des espèces bactériennes en fonction des paires de bases

nucléaires,

- la caractérisation de l'accumulation intracellulaire de polyphydroxybutyrate

dans Alcaligenes eutrophus,

- la détection de Legionella spp. dans l'eau.

VI. 3. 4. BIOLUMINESCENCE (ATPMETRIE) (375) (429).

Il s'agit d'une bioluminescence luciférine - luciférase (libération des photons à partir

du complexe luciférine- luciférase en présence d'ATP et mesure du flux de photons) per-
mettant d'estimer le nombre de bactéries retenues sur gels neutres et amphiphiles et pré-
sentes dans l'éluat afin de déterminer les propriétés de surface hydrophobe par chromato-
graphie d'intéraction hydrophobe.

On observe une bonne corrélation entre le nombre de bactéries viables et le con-

tenu en ATP.

La détermination de I'ATP est plus rapide que celle du nombre de bactéries viables
par estimation de l'adsorption de Listeria monocytogenes sur octyi-Sépharose ce qui fait de
cette bactérie un organisme hydrophile.

VI. 3. 5. IMPEDANCEMETRIE. (64)

La conductimétrie indirecte utilise une technique d'impédancemétrie bactérienne

automatique rapide (mesure de la variation de conductance du milieu de culture due à l'ac-
tivité métabolique des micro-organismes c'est-à-dire à la dégradation des éléments nutritifs
et à leur transformation en composés chargés entraînant des modifications des caractéris-
tiques électriques du milieu).

La croissance en bouillon impédance Whitley fait nattre des changements con-

ductimétriques indirects, lesquels sont améliorés par addition de glucose.
 -225-

VI. 3. 6. CARACTERISATION DE LA LISTERIOLYSINE 0 (LLO). (383)

Il s'agit d'un procédé simple et très efficace pour stabiliser l'activité hémolytique de
la LLO de Listeria monocytogenes après purification par immunoaffinité.

La LLO est partiellement purifiée par précipitation par du sulfate d'ammonium puis
purifiée par chromatographie d'affinité et soumise à une SOS-PAGE en gels convergents
isoélectriquement.

L'activité hémolytique de la LLO est stabilisée par élution directe en tubes conte-
nant un tampon alcalin (lysine - KCI - éthylène glycol pH 11 ,5}.

L'utilisation d'une procédure de chromatographie par immunoaffïnité en deux éta-

pes (élution de la LLO avec un tampon acide acétique pH 2,8 et collecte des éluats en
tampon alcalin contenant de l'éthylène glycol 50 % pH 11 ,5} peut purifier facilement la LLO
tout en conservant son activité hémolytique.

VI. 3. 7. ACTIVITE PHOSPHOLIPASE C. (423}

Cet essai simple consistant à recouvrir les colonies formées sur gélose tryptone
supplémentée en extrait de levure et en NaCI avec du L-a.-phosphatidylinositol - agarose
comme substrat permet de contrôler la présence de l'activité Phospholipase C spécifique
de phosphatidylinositol (PI-PLC} après une incubation de 5 jours à 3JOC.

Les colonies actives PI-PLC montrent des halos turbides autour des colonies du fait de
la libération de diacyl-glycérol insoluble à partir du substrat.

L'activité PI-PLC est un marqueur exact permettant la discrimination entre les espèces
pathogènes et non pathogènes puisqu'elle est détectée seulement chez les espèces pa-
thogènes Listeria monocytogenes mais pas chez Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Lis-
teria innocua, Listeria murrayi et Listeria grayi et peut être inclus dans un schéma de diffé-
renciation des différentes espèces Listeria pathogènes et non pathogènes.
 -226-

VIl. MAITRISE DE LISTERIA MONOCYTOGENES.

VIl. 1. NIVEAU ZERO EN LISTERIA : UNE SITUATION IRREALISTE. (236)

(Annexe XIX)

La résistance rend son élimination complète difficilement réalisable.

D'après les conclusions du groupe d'experts de l'OMS en Février 1988 (236), les
seuls aliments pouvant être considérés comme exempts de Listeria sont ceux qui ont subi
un traitement assainissant (cuisson, pasteurisation, irradiation, acide organique ... ) et dont
on a évité toute recontamination ultérieure (consommation immédiate ou mise sous embal-
lage clos ... ).

Il conviendra donc, selon les recommandations du Conseil Supérieur d'Hygiène

Publique de France, de maintenir le taux de Listeria à un niveau le plus bas possible à sa-
voir de respecter la limite fixée de 100 Listeria par gramme d'aliment. (Annexe XX)

VIl. 2. CLASSIFICATION DES PRODUITS EN FONCTION DU "DANGER

LISTE RIA". (236)

Quatre catégories de produits sont distinguées en fonction de leur technologie.

VIl. 2.1. VIANDES ET PREPARATIONS DE VIANDE.

Dans ce cas, la viande n'a subi aucun traitement autre que le froid et éventuelle-
ment le hâchage.

On distingue :

- la viande réfrigérée : on constate qu'à la surface d'une viande, la croissance

est essentiellement fonction de la température à pH de l'ordre de 5,6; par
exemple, à aoc aucune croissance n'est observée en 15 jours alors qu'à
15°C elle peut atteindre 2 puissances logarithmiques dans Je même temps.
 -227-

La flore d'accompagnement inhibe de façon importante les Listeria.

- la viande de bœuf sous vide : il existe un effet pH, un effet température et un

effet de compétition entre Listeria monocytogenes et les bactéries lactiques à
2°C et à 4°C.

En effet, à ces températures et à pH 5,6, le niveau de Listeria monocytogenes est

constant et la croissance des bactéries lactiques est forte alors qu'à pH 6,5 et à 2°C la si-
tuation est inversée.

- la viande hêchée : le comportement est identique à celui observé dans la

viande en morceaux; la multiplication est pratiquemment nulle à 4°C et aoc,
elle débute après 48 h à 20°C et 7 jours à 15°C.

En absence de flore de compétition, la croissance atteint 3 puissances logarithmiques

en 24 h à 12°C et en 48 h à 8 oc alors qu'elle n'est pas observée en présence d'une flore
d'accompagnement élevée.

Dans ce cas, il s'agit de respecter de façon scrupuleuse la chaîne du froid ; le froid

devra être précoce et continu et ne pas excéder+ 2°C ou+ 3°C.

La cuisson de ces produits détruira éventuellement les Listeria présentes.

VIl. 2. 2. PRODUITS CRUS A CONSOMMER EN L'ETAT (PRODUITS CRUS,

FERMENTES, SECHES OU NON).

Ces produits se caractérisent par des conditions générales d'anaérobiose relative,

la présence de sel, associant une acidification et le cas échéant la dessiccation.

Bien que l'expérience montre que Listeria monocytogenes ne se multiplie que peu
ou pas dans les produits séchés, salés et/ou fermentés secs, il convient de ne pas exclure
la possibilité d'une multiplication dans les produits crus à consommer en l'état.

Il est possible d'agir sur la maturation du produit en séchoir pour maitriser la pré-
sence de Listeria monocytogenes et de définir une valeur d'Aw maximale.
 -228-

VIl. 2. 3. PRODUITS CONDITIONNES AYANT RECU UN TRAITEMENT THERMI-

QUE DANS LEUR CONDITIONNEMENT.

L'application d'un barême temps/température correct permet de détruire les Liste-

ria.

Le critère "absence de Listeria dans 25 g" doit donc être respecté dans ce type de
produits.

En effet, on peut considérer qu'un traitement thermique de 2 minutes à 70°C est

suffisant pour garantir 10 réductions décimales de Listeria monocytogenes.

Listeria monocytogenes est donc un micro-organisme dont la thermorésistance ne

pose pas de problème particulier compte tenu des traitements thermiques et du barême de
cuisson traditionnellement pratiqués.

VIl. 2. 4. PRODUITS ASSAINIS PAR UN TRAITEMENT THERMIQUE ET SUJETS

A RECONTAMINATION.

La présence de Listeria monocytogenes dans l'environnement de production

(locaux, surfaces et matériaux de contact, fluides, air, eau, personnel) constitue une source
de danger.

La fréquence de recontamination dépend des procédures de maftrise mises en

place.

On distingue :

- les produits remanipulés, reconditionnés sous vide ; dans ce cas, la flore lacti-
que exerce un effet de compétition important et d'autant plus efficace que
certaines souches de Lactobacilles peuvent sécréter des bactériocines,
substances inhibitrices.
 -229-

- les produits manipulés, prétranchés en aérobiose car les conditions de con-

servation en aérobiose n'arrêtent habituellement pas la multiplication de Lis-
teria monocytogenes.

Les seuls aliments pouvant être considérés comme exempts de Listeria sont ceux
auxquels on a appliqué un traitement listéricide juste avant ou après leur conditionnement.

VIl. 3. REGLEMENTATION ET RECOMMANDATIONS. (236)

VIl. 3. 1. EN FRANCE.

La Fédération Française des Industries Charcutières (F.I.C) (Annexe XXI) et le

Conseil Supérieur d'Hygiène Publique de France (avis du 8 Septembre 1992) (Annexe XX)
considèrent que le critère retenu de 100 Listeria monocytogenes par gramme correspond à
un compromis entre un niveau de sécurité satisfaisant et la sensibilité des méthodes cou-
rantes d'analyse et que la dose minimale infectante est sans doute plus élevée pour un
consommateur n'appartenant pas à une catégorie à risque.

Un taux de contamination supérieur à 10000/g est considéré comme inadmissible.

VIl. 3. 2. MESURES NATIONALES PRISES PAR CERTAINS ETATS.

VIl. 3. 2. 1. Suisse.

Par une modification du 25 Février 1988 de l'ordonnance sur les exigences hygié-
niques et microbiologiques relatives aux denrées alimentaires, objets usuels et biens de
consommation, les autorités helvétiques ont adopté une position sévère concernant Listeria
monocytogenes : "Listeria monocytogenes dans les denrées alimentaires prêtes à la con-
sommation : non décelable dans 10 grammes".

Les prélèvements sont effectués sur les lieux de production ou les entrepôts cen-
traux ou de distribution ; dans le cas où ils sont effectués sur les lieux de vente, il est tenu
compte d'une éventuelle contamination par contact mais elle n'est pas précisée.
 -230-

Le secret professionnel est maintenu entre les autorités helvétiques et les indus-
triels concernés lors de la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments sauf en
cas de situation épidémiologique potentiellement grave.

VIl. 3. 2. 2. Italie.

Une circulaire du Ministre de la Santé et de la Nutrition-Division Ill présente un

plan de surveillance des secteurs zootechnique, agricole et agro-alimentaire concernant
Listeria monocytogenes.

Les mesures adoptées sont les suivantes :

- au niveau du secteur de production ; en cas de présence de Listeria monocy-

togenes, il faut procéder :

. à une suppression temporaire de la production,

. au lavage et à la désinfection de tous les ateliers de production,

. à des prélèvements d'échantillons en différents points des ateliers,

. au retrait du marché du produit contaminé.

Les levées d'interdiction de production et de commercialisation ne sont effectuées

qu'après la désinfection des locaux et l'obtention de trois contrOles analytiques négatifs à
des jours différents dans une période maximale de 15 jours.

-au niveau du secteur de commercialisation; des contrOles peuvent être effec-

tués sur des produits commercialisés.

Le retrait du marché des produits contaminés serait obligatoire dans un délai maximum
de 3 jours et cela au frais du producteur ou du circuit de distribution.
 -231-

VIl. 3. 2. 3. Canada.

Le Ministère de la Santé et du Bien-être Social, Direction Générale de la Protection

de la Santé a émis un document en Décembre 1989 intitulé "Politique Administrative-
Surveillance de la Conformité : aliments contaminés par Listeria monocytogenes".

La position est plus souple.

Les facteurs à prendre en considération pour l'établissement du système de sur-

veillance sont :

- le potentiel de développement de Listeria monocytogenes dans un aliment

donné {pH, Aw, agents de conservation),

-la connaissance des principaux produits incriminés {produits laitiers),

- l'absence de preuve établissant une liaison certaine entre la présence de Lis-

teria monocytogenes à un faible taux dans un aliment et un cas de listériose.

Le système de surveillance permet une demande de rappel en cas de contamina-

tion de produits laitiers où le risque de développement est important (lait pasteurisé) et où il
n'y a pas de croissance connue {crème glacée, fromages à pâte dure) et d'aliments prêts à
consommer où il y a risque ou pas de développement.

Parallèlement, les autorités encouragent l'élaboration de "guides de bonnes prati-

ques d'hygiène" faisant appel à la démarche H.A.C.C.P.

VU. 3. 2. 4. Grande-Bretagne.

Dans le rapport "Contamination des aliments : Listeria et Listériose - réponse du

Gouvernement au 6° rapport (1988-1989) du Comité des Services Sociaux'', le gouverne-
ment prône une réglementation concernant l'hygiène et la contamination des aliments par
Listeria monocytogenes fondée sur le développement, l'élaboration ou la modification au
niveau de la production, de la distribution et de la vente de "guides de bonnes pratiques et
d'hygiène" où la démarche H.A.C.C.P. est utilisée.
 -232-

VIl. 3. 2. 5. Allemagne.

Les autorités allemandes ont présenté dans une communication publiée dans le
bulletin du Ministère de la Santé, les mesures à prendre en cas de contamination par Lis-
teria monocytogenes.

Elles tiennent compte de la nature, du mode de contamination, de la finalité des

aliments concernés mais aussi des niveaux de Listeria monocytogenes dénombrés.

Ces mesures différencient les aliments où la norme "zéro Listeria" est possible de
ceux où elle ne l'est pas.

VIl. 3. 3. REFLEXIONS DE L'OMS. (236)

VIl. 3. 3. 1. Recommandations aux autorités sanitaires pour assurer

la protection du consommateur.

Les objectifs sont de :

- diminuer l'incidence de la listériose d'origine alimentaire,

- limiter ou éliminer lorsque cela est technologiquement possible la charge en

Listeria monocytogenes des aliments,

- renforcer la confiance des consommateurs dans l'innocuité des aliments.

Le groupe d'experts réuni à Genève en Février 1 988 a classé les aliments en 4

catégories :

- aliments crus (légumes et viande),

- aliments crus transformés (aliments crus mélangés à d'autres ingrédients

comme les salades préparées, le saucisson fermenté, les fromages au lait
cru),
 -233-

- aliments préparés où un procédé listéricide a été employé et remanipulés

(certains fromages, viandes d'abattoir découpées ou transformées par la
vente au détail),

-aliments fabriqués (sous conditionnement scellé) où un procédé listéricide a

été appliqué (lait pasteurisé, produits laitiers, viandes cuites sous emballage
hermétique).

Les recommandations-sont les suivantes :

- encourager activement les recherches permettant la réduction et l'élimination

de la contamination des aliments crus ainsi que la réduction de la contami-
nation des aliments préparés,

- entreprendre ou poursuivre des campagnes d'éducation du public visant à

aider les consommateurs à éviter la contamination des aliments crus ou
préparés,

- veiller à ce que les consommateurs n'aient .pas un sentiment de fausse sécuri-

té vis-à-vis des aliments crus ou préparés,

- s'assurer que les denrées préemballées ayant subi un traitement listéricide

soient exemptes de Listeria monocytogenes jusqu'à leur date limite de
consommation,

- encourager l'utilisation des rayonnements ionisants pour éliminer Listeria mo-

nocytogenes dans les aliments à risque préemballés,

- envisager le retrait des aliments préparés ou préemballés contaminés,

-retirer du marché toute denrée alimentaire à l'origine de cas de listériose hu-

maine et étudier en détail toutes les suites et conséquences possibles de
cette mesure avant sa mise en exécution,
 -234-

- collaborer avec les secteurs de l'industrie alimentaire intéressés de manière à

prévenir et limiter la contamination,

- coopérer avec l'industrie alimentaire, les universités et les instituts de recher-

che pour coordonner la recherche fondamentale,

- mettre en place et maintenir des structures de surveillance pour prévenir tout

risque d'épidémie,

-échanger des données par le canal du Centre collaborateur de l'OMS de Ber-

lin qui coordonne le programme de surveillance de l'OMS,

-éduquer tous les professionnels de la Santé.

VIl. 3. 3. 2. Recommandations aux industries alimentaires.

Elles sont les suivantes :

-promouvoir la méthode H.A.C.C.P. et assurer la qualité microbiologique des

produits par l'éducation et la formation de tous les travailleurs,

-appliquer la méthode H.A.C.C.P. pour identifier les germes pathogènes, dé-

couvrir les sources de contamination et les éliminer, reconnaTtre les modes
de contamination et les éliminer, déterminer les conditions favorables à la
survie et à la croissance des germes pathogènes et veiller à ce que les trai-
tements bactéricides (chaleur, irradiation) et les méthodes de désinfection
assurent la destruction de Listeria monocytogenes,

- conduire et promouvoir des recherches pour développer de nouveaux moyens

supprimant ou limitant la croissance de Listeria monocytogenes,

- coopérer avec les autorités chargées de la réglementation,

 -235-

-collaborer avec les fabricants d'équipements destinés à l'industrie alimentaire

de manière à faire progresser la conception de ces équipements en vue
d'une meilleure hygiène,

- collaborer avec les autorités chargées de la réglementation et de la santé pu-

blique à l'élaboration de codes de pratiques hygiéniques pour les différents
secteurs de la production alimentaire,

- collaborer avec les organisations internationales comme l'OMS et nationales et

avec les universités pour élaborer des programmes d'enseignement de la
microbiologie alimentaire tenant compte de l'approche H.A.C.C.P.,

- entreprendre des recherches dans le but d'apporter de nouvelles solutions

technologiques au problème de la présence de Listeria monocytogenes dans
les denrées ne subissant pas de traitement listéricide avant consommation.

VIl. 3. 4. RECOMMANDATIONS DU COMITE NATIONAL D'ORIENTATION SUR

LES CRITERES MICROBIOLOGIQUES. (341)

Deux documents ont été rédigés en 1988 par le "Center for Control Disease"
(C.D.C.) (USA) pour mieux contrôler Listeria monocytogenes ; il s'agit de l'AMI et du FDA-
MIFIICA.

En effet, la surveillance de Listeria monocytogenes aux Etats-Unis est très déve-

loppée.

Ces documents concernent divers points à savoir :

- les installations :

. toutes les surfaces doivent être nettoyables et désinfectables.

Cela suppose que les surfaces soient lisses, sans fissures, non poreuses et autovidan-
geables,
 -236-

. les plans des installations doivent contrôler les mouvements de Listeria

monocytogenes entre les aires de production crue et cuite (traffic des
employés, activités de manipulation des aliments et mouvements du
personnel),

. les systèmes de réfrigération et de ventilation doivent pouvoir être nettoyés

et désinfectés pour réduire la contamination provenant de l'air,

. la pression doit être maintenue dans toutes les aires de production de

viande prête à consommer,

. la vidange du sol doit être conçue de telle façon qu'elle empêche l'eau de
stagner et les sols doivent être recouverts de matériaux facilement net-
toyables,

. l'humidité de l'environnement doit être contrôlée pour empêcher la conden-

sation,

. les insectes nuisibles et la vermine doivent être exclues des équipements.

- les équipements :

. ils doivent être appropriés et jugés acceptables par l'agence de réglemen-

tation,

. ils doivent être maintenus dans un état de travail convenable.

Seuls les matériels approuvés doivent être utilisés dans les équipements en contact
avec les aliments.

Les procédures de maintenance doivent être établies et enregistrées,

. ils doivent être utilisés de telle manière qu'ils ne deviennent pas une source
de contamination par inadvertance,
 -237-

. l'aptitude à la réfrigération doit être suffisante pour maintenir les températu-

res des pièces appropriées aux opérations à effectuer,

. les autres dispositifs doivent être proprement installés et calibrés à chaque

étape du process.

- les procédures de fabrication :

. réduire la contamination durant le process,

. empêcher la croissance de Listeria monocytogenes durant le process,

. éliminer Listeria monocytogenes des produits.

- le personnel :

. éduquer le personnel aux programmes de GMP et H.A.C.C.P. et le respon-

sabiliser afin qu'il suive les pratiques d'hygiène,

. promouvoir le recyclage à propos des programmes GMP et HA. C.C.P. et

impliquer le personnel dans les efforts à fournir pour améliorer les prati-
ques d'hygiène,

. utiliser toute la technologie disponible pour aider le personnel à maintenir

les conditions d'hygiène comme :

- le lavage des mains et des pieds,

- le port des gants, charlottes, blouses et tabliers,

- la séparation des zones de production propre et sale.

Il faut donc éviter le contact entre ces aires comprenant les employés, le personnel su-
pervisant et les inspecteurs.
 -238-

. éliminer les sources de contamination de l'environnement de production de

la viande prête à consommer,

. fournir une surveillance afin d'aider les employés à maintenir les pratiques
d'hygiène.

- les procédures de nettoyage et de désinfection :

. avoir un personnel adéquat et suffisant,

. prévoir un temps suffisant pour le process de nettoyage/désinfection,

. fournir une surveillance adéquate du personnel,

. développer et publier des procédures écrites de nettoyage et de désinfec-

tion pour chaque pièce de l'équipement et pour chaque aire de produc-
tion,

. utiliser des dispositifs et des produits efficaces pour assurer un nettoyage et

une désinfection corrects,

. développer des programmes d'entraînement pour le personnel chargé du

nettoyage et de la désinfection,

. promouvoir des procédures aussi nouvelles que possible pour le nettoyage

et la désinfection des installations d'air conditionné, des sols et des
systèmes de vidange,

. incorporer quelques pratiques de nettoyage et de désinfection dans le plan

HA. C.C.P. en tant que points de contrOle critique,

. établir des programmes d'échantillonnage de l'environnement pour Listeria

monocytogenes afin de vérifier l'efficacité des procédures de nettoyage et
de désinfection.
 -239-

Quelques recommandations sont ensuite données :

- aux commerçants :

1 - rester chez soi en cas de maladie et ne pas être en contact avec des ali-
ments ou les aires de production d'aliments.

2 - pratiquer une bonne hygiène personnelle lors de la fabrication, de la ma-

nipulation et de la préparation d'aliments.

3 - se laver toujours les mains lors de la sortie des aires où sont manipulés
des végétaux crus, de la viande, de la volaille, du poisson et des fruits de
mer avant de passer dans l'aire de manipulation des aliments cuits.

4 - préparer des aliments à partir de matériaux frais et sains.

5 - empêcher la contamination croisée des aliments cuits en stockant les ali-

ments crus et préparés séparément et en évitant Je contact entre les ali-
ments cuits et les équipements contaminés par les aliments crus.

6 - prendre fréquemment la température des aliments.

7- cuire les aliments à température suffisante pour détruire Listeria monocy-

togenes (63 °C).

8 - maintenir les aliments au chaud à une température supérieure à 60°C.

9 - contrOier la multiplication de Listeria monocytogenes à une température

inférieure à 4°C.

10 - réchauffer rapidement à 7 4 oc.

11 - congeler les aliments périssables immédiatement et les maintenir dans

cet état jusqu'à ce qu'ils soient préparés.
 -240-

12 - maintenir les aliments dans un lieu de stockage, de préparation et de

service hors des insectes et des animaux nuisibles.

13 - laver selon les instructions des fabricants.

14 - utiliser un bon détergent et de l'eau à 43-49°C pour le lavage manuel

des plats.

Eliminer toutes les salissures et rincer avec de l'eau chaude.

Désinfecter avec de l'eau bouillante (7JOC) ou utiliser un désinfectant chimique approu-

vé.

15 - utiliser des équipements satisfaisant aux normes de la National Sanita-

tion Foundation pour assurer un nettoyage et une désinfection faciles.

- aux consommateurs :

1 - consulter le médecin en cas de sensibilité.

2 - suivre les règles de préparation des aliments.

3 - nettoyer mains et ustensiles avant de manipuler les aliments et spéciale-

ment après manipulation d'aliments crus.

4- réchauffer les aliments à température supérieure à 7 4°C.

5 - maintenir les aliments chauds au chaud (> 63°C).

6- maintenir les aliments froids au froid(< 4°C).

7 - cuire la viande, la volaille et les produits de la mer de même que les ali-
ments congelés ou réfrigérés de façon adéquate.

8 - refroidir les aliments rapidement dans des récipients peu profonds.

 -241-

9 - séparer les aliments crus et cuits spécialement quand ces derniers sont
achetés déjà cuits.

10 - envelopper ou couvrir les aliments dans le réfrigérateur.

11 -maintenir la température du réfrigérateur entre 1 et 4°C.

12 - éviter le lait cru et les fromages faits à partir de lait non pasteurisé.

VIl. 4. MOYENS DE LUTTE.

Ces moyens passent en partie par le respect des règles éditées par le Laboratoire
National de la Santé pour la France et du C. D. C. pour les Etats-Unis ; elles ont été citées
précédemment.

Les principales mesures à prendre, que ce soit dans l'industrie alimentaire, dans
les magasins de détail ou à domicile, sont les suivantes :

·- séparer les aliments non contaminés de ceux qui le sont,

- limiter la teneur en eau des aliments,

- éliminer les conditions favorables à la transmission ..

La contamination croisée devrait disparaitre grâce à une conception efficace de

l'équipement et à des méthodes d'hygiène correctes ; de même, la contamination par con-
tact devrait être réduite au minimum.

Les produits crus et les produits cuits doivent être gardés séparés de manière à
éviter la contamination croisée par les manipulateurs, les surfaces de contact et les autres
moyens de transmission.

Les procédés listéricides (pasteurisation et cuisson), s'ils sont appliqués correcte-

ment, éliminent Listeria monocytogenes et la recontamination peut être évitée si l'on ob-
serve de bonnes pratiques d'hygiène.
 -242-

VIl. 4. 1. SURVEILLANCE DE L'ENVIRONNEMENT. (236)

Le Comité National d'Orientation sur les critères microbiologiques (USA) a indiqué

que la mattrise de Listeria peut nécessiter éventuellement des modifications dans les lieux
de travail et que cette maTtrise est particulièrement délicate quand on travaille simultané-
ment sur des protéines et des substances végétales offrant des conditions idéales pour la
croissance en raison de la coexistence de souillures organiques, d'humidité élevée et de
basses températures.

Les installations doivent être conçues de façon à éviter "des niches" à Listeria
(points faibles de l'hygiène) et de manière à permettre des opérations adéquates de net-
toyage et de désinfection.

La surveillance nécessite :

-des surfaces lisses, sans fissures, nettoyables (sols, plafonds, murs),

- un matériel adapté, facilement démontable et accessible au nettoyage,

-la mattrise de la contamination des équipements de climatisation (nettoyabilité

des gaines et des grilles ou ailettes de distribution d'air conditionné eUou
mise en place d'un système efficace de préfiltration de l'air),

- des circulations internes permettant d'éviter les contaminations croisées,

- l'utilisation de l'eau réduite au strict nécessaire (risque de vapeurs, flaques),

- les systèmes de nettoyage - désinfection doivent avoir fait la preuve de leur

efficacité,

- l'existence de dispositions d'hygiène applicables au personnel.

 -243-

La responsabilité du personnel est déterminante comme principale source de

transfert de contamination d'où la nécessité :

- d'un effort permanent d'éducation à respecter les bonnes pratiques de fabrica-

tion et les pratiques sanitaires,

- de circulation permanente d'informations sur ces bonnes pratiques,

- d'utilisation de tous les moyens de protection disponibles en termes de con-

ception (identification des travaux propres et sales) aussi bien que de fonc-
tionnement (lavage des mains, des bottes, etc ... ),

-de mise en place d'un système de surveillance aidant le personnel à maintenir

ses performances,

- de mise en place d'un plan qualité.

L'accessibilité et la nettoyabilité des surfaces, leur aptitude à permettre l'écoule-

ment et le drainage facile de l'eau restante, puis le maintien d'une ambiance sèche sont les
deux exigences prioritaires nécessaires pour tirer tout le bénéfice de l'éducation au compor-
tement sanitaire du personnel.

La règle de base la plus importante est la suivante : la désinfection n'est efficace

que si elle intervient sur une surface débarrassée des souillures et que si les quantités de
matière active déposée ainsi que les temps de contact prescrits sont respectés.

VIl. 4. 2. METHODE H.A.C.C.P. (236) (Figure 7) (Tableau XVII)

En 1988, l'OMS a recommandé aux industries agro-alimentaires de lutter contre la

présence eUou la prolifération des Listeria dans les aliments en vue de protéger la santé
publique, d'où la mise en place de la méthode ou système H.A.C.C.P.

Ce système est une démarche qualité signifiant "Hasard Analysis Critical Control
Point" ou "Analyse des dangers et points critiques pour leur maTtrise".
 -244-

Cette démarche a l'avantage de focaliser les actions sur des problèmes bien iden-
tifiés au lieu de prendre toutes sortes de précautions sans en connaTtre bien la portée mais
aussi de permettre des effets maximaux pour un coût minimal, tout en garantissant un haut
niveau de sécurité.

Les principes fondamentaux sont :

- la description complète du process alimentaire et l'établissement d'un dia-

gramme des flux,

- l'identification et l'analyse des dangers à chaque étape du process amenant à

la détermination des points à risques (PR),

- la détermination des points critiques (PC) pour un danger défini et le choix des
actions permettant de limiter ou de faire disparaître ce danger (points criti-
ques pour la maftrise ou PCM),

-la détermination des méthodes de contrOle applicables à chaque point critique

(MPC),

-Je choix des méthodes de contrOle de l'efficacité du système H.A.C.C.P.

Cette méthode comporte plusieurs étapes.

VIl. 4. 2. 1. Etape préliminaire.

La Direction Générale de l'entreprise décide d'amorcer une démarche H.A.C.C.P;

il s'agit de l'initialisation.

C'est un groupe de travail qui en est chargé ; il a pour mission de définir les ob-
jectifs (dangers microbiologiques, chimiques, physiques ... ), le champ d'action (produit, pro-
cess spécifique, stade final ou intermédiaire ... ) et le niveau de qualité requis.
 -245-

Il comprend en général 2 à 8 personnes réprésentant différents secteurs de l'en-

treprise comme la qualité, la production, les contrôles, la recherche et développement, le
marketing, les achats, le commercial, la logistique...

Cette étape préliminaire conduit à l'établissement du diagramme de fabrication du

produit aussi détaillé que possible.

Ce diagramme comprend :

- les opérations unitaires successives de fabrication et les transferts,

- l'identification de toutes les matières premières utilisées,

- l'enregistrement des paramètres de production (temps, température ... ),

- l'identification de toutes les surfaces au contact des produits (matériels, mains,

gants ... ),

- la prise en compte de l'environnement des produits (atmosphère, système de

nettoyage ... ).

VIl. 4. 2. 2. Analyse des dangers.

Ils peuvent être de natures très diverses à savoir physique, chimique ou microbio-
logique mais il ne faut retenir que ceux dont l'apparition peut être raisonnablement envisa-
gée à chacune des étapes.

Il est donc nécessaire de faire l'inventaire des différents dangers ainsi que des me-
sures préventives visant à les éliminer ou à les réduire.

VIl. 4. 2. 3. Points critiques pour la maitrise (PCM).

Il s'agit d'une activité, d'une étape, d'un procédé, d'un processus dont les paramè-
tres peuvent être modifiés et qui, s'ils sont maTtrisés, peuvent supprimer ou minimiser les
dangers.
 -246-

Tableau XVII: Etapes du système HA. C.C.P.

ETAPES OBJECTIFS RESULTATS

- 1NITIA LISA Tl ON
- CONSTITUTION D'UN _... DIAGRAMME DE
GROUPE DE TRAVAIL FABRICATION
- ÀNAL YSE DES PROCEDES

2: ANALYSE DES DANGERS 'J[:fH!r=ICATIOtJ rF:S ~~;i.'JGt::fiS

EVALUATION DE L..i\
PROBABILITE D'APPARITION +Hl ER AR CHISA TION
- IDENTIFICATION DES MESURES DES Di'..t~GERS
PREVENTIVES DESTINEES t, LES
MAITRISER

3: POINTS CRITIQUES - IDENTIFICATION DES CCP EFERENTIEL

POUR LA MAlTAISE: - ETABLISSEMENT DE ·u~L ç::URS D"E~HREPRISE: (1)
( CCP ) CIBLES -spec:!1cations
-procedures
-modes opératoires

- DEFINITION D'UN SYSTEME +REFERENTIEL

D'OBSERVATION D'ENTREPRISE (Il)
- DEFINITION DES ACTIONS -echantillonnage
CORRECTIVES -methodes de
contrôle
-conduite à tenir

DEFINITION DES PROCEDURES + AUDIT

DE VERIFICATION DU SYSTEME SYSTEME
HACCP DOCUMENTAIRE
ENREGISTREMENT
SYSTEMATIQUE DES DONNEES
 -247-

Figure 7 : Arbre de décision pour !•identification des points critiques de maTtrise

{C.C.P.)

,,
POUR CHAQUE ETAPE DU DIAGRAMME:
EXISTE-T-IL UNE (DES) MESURE(S) PREVENTIVE(S) ?

t
OUI NON

UNE CONTAMINATION CORRESPONDANT AU(X) DANGER(S) IDENTIFIE(S)

PEUT-ELLE DEPASSER UN NIVEAU ACCEPTABLE, OU ENCORE PEUT-IL Y AVOI
ACCROISSEMENT DU (DES) DANGER(S) JUSQU"A ÛN NIVEAU INACCEPTABLE ?

OUI NON

UNE ETAPE ULTERIEURE PEUT-ELLE ELIMINER

LE(S) DANGER(S)IDENTJFIE(S), OU ENCORE EN
REDUIRE L'OCCURRENCE A UN NIVEAU ACCEPTABLE?

t
N N
'
OUI

CETTE ETAPE EST-ELLE DESTINEE A ELIMINER

UN DANGER, OU ENCORE A REDUIRE SON
OCCURRENCE A UN NIVEAU ACCEPTABLE?

OUI NON

L 1 ETAPE CONSTITUE
UN C.C.P.
 -248-

Pour chaque point critique, on définit des valeurs cibles mesurables donc contrô-
lables (température, pH, Aw ... )

VIl. 4. 2. 4. Surveillance.

Elle consiste à définir la fréquence des observations, des enregistrements systé-

matiques (plans d'échantillonnage, fréquence des contrOles), leurs modalités pratiques
(fiches de laboratoire, cartes de contrOle) en vue de vérifier que les valeurs cibles sont res-
pectées.

Les techniques physiques et chimiques (température, pH, observations visuelles)

sont préférées aux techniques microbiologiques car elles sont plus rapides.

Des actions correctives spécifiques sont prévues lorsque les déviations par rapport
aux valeurs-cibles définies sont décelées.

Ces actions doivent être suffisamment explicites pour pouvoir être appliquées im-
médiatement et sans équivoque.

VIl. 4. 2. 5. Evaluation de l'efficacité.

Elle passe d'abord par la vérification que la procédure est appliquée, par exemple
au cours d'un audit interne ou d'essais (analyse bactériologique).

L'ensemble des données recueillies fait l'objet d'une collecte, d'une exploitation et
d'un archivage (ingrédients, traitements, rapports d'essais, dossiers concernant les dévia-
tions, procédures d'adaptation du système H.A.C.C.P.).

VIl. 4. 3. AUTRES METHODES.

VU. 4. 3. 1. Lors de la préparation.

Elles font appel essentiellement aux règles d'hygiène visant à minimiser les con-
taminations ou à inhiber la prolifération des Listeria.
 -249-

Les principes sont :

- prévention des contaminations sur la chaine d'abattage passant par :

. Je respect des principes de base de l'hygiène,

. la qualité sanitaire des animaux abattus,

. la sensibilisation du personnel,

. le nettoyage et la désinfection des locaux et du matériel.

Les points critiques à ce niveau sont :

- l'anesthésie et la saignée où tout déplacement vers les autres postes de la chalne

doit être évité et où la décontamination régulière du couteau et le nettoyage en
continu de la table de saignée sont nécessaires,

- l'échaudage où le douchage des carcasses avant immersion permet de limiter les

phénomènes d'inspiration réflexe et de réduire la pollution de l'eau,

- l'éviscération où la pointe du couteau doit être maintenue tournée vers l'opérateur

afin d'éviter les perforations intestinales,

- la séparation des onglons est à mettre en œuvre le plus tOt possible sur la chaine,

- Je transit des carcasses doit permettre d'éviter les contacts entre les carcasses et les
installations fixes (portes, murs, postes de travail).

-séparation des secteurs propres et souillés,

- marche en avant des produits, sans retour en arrière ni entre-croisement des

courants de circulation (les matières premières éventuellement souillées ne
doivent pas entrer en contact avec les produits transformés),
 -250-

- utilisation précoce, rapide et continue du froid.

Le respect de la chaine du froid est essentiel pour limiter au mieux la multiplication de

Listeria monocytogenes.

Un équipement de réfrigération doit donc être en parfait état de fonctionnement et de

capacité suffisante et doit permettre également de maintenir une ambiance sèche, facteur
limitant le développement de Listeria.

Les aliments doivent être disposés dans les chambres froides de telle façon qu'ils ne
soient pas en contact les uns avec les autres et que l'air froid puisse correctement circuler,

- agrément du cadre de travail : espace, aération, atténuation des bruits, entre-

tien des locaux et du matériel,

- formation et sensibilisation du personnel à l'hygiène.

Le personnel doit disposer de façon à répondre à la politique d'hygiène menée par l'en-
treprise:

- de locaux et de matériel correctement conçus et entretenus,

-d'une tenue vestimentaire répondant aux exigences des industries agro-

alimentaires,

- d'une formation à l'hygiène dynamique et permanente.

- nettoyage et désinfection des locaux et du matériel.

Un plan de nettoyage - désinfection doit être clairement défini et appliqué rigoureuse-

ment.
 -251 -

VIl. 4. 3. 2. Lors de la commercialisation.

Deux points sont primordiaux ; il s'agit de :

- l'importance de la chaine du froid à savoir :

. le respect des températures à cœur des denrées,

. le transport par camion avec raccourcissement des temps de chargement

et de déchargement, maintien du fonctionnement des groupes frigorifi-
ques des camions et réfrigération des quais,

. la distribution en évitant les surcharges des présentoirs et en respectant les

températures de conservation.

- l'importance de l'humidité ; le produit alimentaire doit être la plus sec possible.

VIl. 4. 3. 3. Lors de la conservation.

Ce point a déjà été vu par ailleurs mais il est important d'insister sur la séparation
des aliments crus et cuits dans une réserve froide, sur la cuisson suffisante des aliments et
sur le nettoyage et la désinfection des couteaux et de la paroi intérieure du réfrigérateur et
sur Je lavage des mains.

VIl. 4. 4. DECONTAMINATION DES ALIMENTS.

Il convient ici de rappeler que, selon l'OMS, les seuls aliments que l'on puisse
considérer exempts de Listeria sont ceux qui ont été pasteurisés, irradiés, cuits ou conser-
vés au vinaigre, à condition que toute recontamination ultérieure ait été évitée, soit par la
consommation immédiate, soit par la mise sous emballage clos.
 -252-

La décontamination se fait différemment selon les aliments :

- les aliments carnés :

. irradiation ou radurisation (164) (182) : une dose de 2 kGy permet de dé-

truire 10000 Listeria monocytogenes (273).

Du point de vue microbiologique, toxicologique et nutritionnel, elle ne présente aucun

risque pour la santé humaine jusqu'à 1 0 kGy.

Elle est généralement effectuée sur le produit emballé, évitant ainsi toute recontamina-
tion.

Les obstacles à sa mise en place sont de nature économique (coût d'installation élevé),
psychologique (réticence des consommateurs) et politique (stratégie de lutte).

Une dose de 2, 5 kGy est efficace pour des poulets (339).

L'exposition de la viande de porc à une source de radiation au cobalt 60 de 6,6 kGy/h à

des doses de 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, et 6 kGy montre qu'une dose de 2 kGy entralne une réduc-
tion de 7 log (542).

Une dose de 1,5 kGy pour la viande et de 3-4 kGy pour le foie permettent de réduire la
croissance de la flore d'altération (Pseudomonas, Enterobacter) et d'éliminer la flore patho-
gène (Listeria) (141 ).

Par contre, la survie dans la Mozzarella et la glace a été démontrée (251 ).

Seules les viandes de !volaille congelées et séparées mécaniquement sont autorisées à

être décontaminées par cette technique par l'arrêté ministériel du 25 Septembre 1895.
 -253-

- biopréservation : les bactéries lactiques (3) (244) (340) (480) telles que
Lactobacillus spp. (451) (495) (496) (498) (528) (599), Pediococcus spp.
(41) (50) (135) (136) (197) (269) (384) (413) (525) (611), Leuconostoc
spp. (124) (252) (253) et Carnobacterium spp. (86) (87) (497) et les bac-
téries corynéformes (554) sécrètent des bactériocines ayant un rôle dans
l'inhibition des Listeria.

Ces bactériocines sont donc des substances inhibitrices sécrétées selon des mécanis-
mes variés dont la plupart ne sont pas clairs, dont la nature protéique est confirmée par
démonstration de leur sensibilité aux enzymes protéolytiques et dont la production est af-
fectée par le milieu de croissance, le pH et la température de croissance (3).

Ces substances possédent généralement des spectres d'activité antibactérienne étroits

et des modes d'action bactéricide ou bactériostatique.

Cette technique semble trouver ses applications plutôt dans les produits de charcuterie.

La nisine est la bactériocine la plus connue produite par les bactéries lactiques (276).

Elle a un spectre d'activité large sur les bactéries Gram (+) et les espèces Salmonella va-
riées et autres bactéries Gram (-) (533).

Elle altère la perméabilité de la membrane cytoplasmique, conduisant à une effusion d'aci-

des aminés et une diminution du potentiel membranaire et des gradients ioniques (7 4)
(484).

Une autre bactériocine, la lactostrepcine 5 (Lac 5) produite par Streptococcus cremoris

(613), rompt l'intégrité de la membrane cellulaire des cellules de Lactococcus lactis et donc
conduit à une fuite d'ions et d'ATP.

La lactococcine A (555), qui agit préférentiellement sur les lactococci, augmente la per-
méabilité de la membrane cytoplasmique des cellules entières, inhibe le transport des aci-
des aminés dans les cellules sensibles et cause une effusion d'acides aminés préaccumu-
lés.
 -254-

La mésentéricine Y1 05 (257) (373), bactériocine produite par Leuconostoc mesenteroi-

des Y1 05, est un peptide de faible poids moléculaire composé de 36 acides aminés qui est
hautement thermostable et acidostable et dont la structure primaire ressemble étroitement
à d'autres bactériocines récemment découvertes ; leucocine A-UAL 187 (252), pédiocine
PA-1 (197), sakacine P (546) et curvacine A (546).

Elle possède diverses propriétés :

- elle diminue le potentiel membranaire.

En effet, la mesure par cytométrie en ftux montre que mY1 05 diminue l'incorporation de la
sonde potentielle fluorescente rhodamine 123 (Rh123) se produisant seulement dans les
cellules possédant des membranes intactes donc diminue le potentiel membranaire ce qui
induit une perméabilisation de la membrane cytoplasmique des cellules cibles aboutissant
à un échange libre d'ions à travers la membrane.

- elle inhibe le transport de leucine et d'acide glutamique principalement mais aussi

d'acide alanine amino-isobutyrique (analogue non métabolisable de l'alanine) et de
lysine.

En effet, l'incorporation de leucine et d'acide glutamique se fait beaucoup moins rapide-

ment.

- elle induit une effusion partielle d'acides aminés préaccumulés à partir des cellules qui
ont antérieurement accumulé de la leucine ou de l'acide glutamique.

Ceci suggère que la libération de leucine et d'acide glutamique est médiée non pas par un
transporteur mais probablement par une simple fuite à travers la membrane et qu'une petite
fraction d'acides aminés transportéS dans les cellules est incorporée dans les protéines
durant le temps d'incubation.

La non-accumulation et l'effusion d'acides aminés à partir des cellules sensibles sont en

accord avec les données indiquant que mY1 05 diminue le potentiel membranaire des bac-
téries cibles.
 -255-

- elle agit sur les mitochondries en augmentant le stade 4 de la respiration et en dimi-

nuant le stade 3 de la respiration.

-elle inhibe I'ATP synthétase donc diminue la synthèse d'ATP.

-elle inhibe l'adénine nucléotide translocase tandis que l'affinité de I'ADP pour son
transporteur n'est pas modifiée.

Le premier évènement de l'action de mY105 peut être la formation directe ou indirecte de

pores dans la membrane plasmatique transportant l'énergie, spécialement celle de sa cible
naturelle hébergeant des phospholipides particuliers et/ou une organisation protéique puis
la dépolarisation et l'effusion de composés cytoplasmiques de faible masse moléculaire.

De tels pores ne peuvent pas être formés par seulement une molécule mais plutôt par des
molécules peptidiques qui s'aggrègent ou agissent en conjonction avec d'autres molécules
membranaires pour établir un pore fonctionnel.

La pédiocine JO (1 06) (413) (465) (499), bactériocine pediococcale thermostable pro-

duite par Pediococcus acidilactici JD1-23, agit sur la force motrice du proton et la perméa-
bilité au proton de Listeria monocytogenes donc sur la membrane cytoplasmique.

Les cellules de contrOle, traitées avec la bactériocine inactivée par la trypsine à pH de 5,3 à
6,1 maintiennent un gradient de pH et un potentiel membranaire d'approximativement 0,65
unité de pH et 75 mV.

Cependant, ces gradients sont rapidement diminués dans les cellules après exposition à la
pédiocine JO, même si aucune lyse cellulaire ne se produit.

Les cellules entières traitées avec la bactériocine sont deux fois plus perméables aux pro-
tons que les cellules de contrOle.
 -256-

Les résultats suggèrent que l'action inhibitrice de la pédiocine JO envers Listeria monocy-
togenes est dirigée contre la membrane cytoplasmique et que l'inhibition de Listeria mono-
cytogenes peut être causée par l'effondrement du gradient de pH eUou du potentiel mem-
branaire par liaison à un récepteur cytoplasmique spécifique et par l'augmentation de la
perméabilité au proton dans les cellules de Listeria monocytogenes.

Bien que JO soit active sur Listeria même à pH proche de la neutralité, il apparalt que la
bactériocine agisse comme un proton non couplé dans Listeria monocytogenes.

La pédiocine AcH produite par Pediococcus acidilactici produit une fuite d'ions K+ et des
matériels absorbant l'UV et rend les cellules sensibles perméables à l'o-nitrophényi-(3-D-
galactopyranoside.

La pédiocine inhibe le transport actif du glucose.

L'utilisation de bactéries lactiques bactériocinogéniques ou de leurs bactériocines

comme conservateurs potentiels doit donc attirer l'attention de l'industrie alimentaire.

Ceci est spécialement vrai pour les bactériocines dérivant des microflores des aliments fer-
mentés et non des pathogènes gastrointestinaux.

. traitement au C02 à haute pression (576) : Listeria monocytogenes mise en

suspension dans de l'eau distillée est complètement tuée par un traite-
ment au C02 à 6,18 MPa (61 ,2 atm) à 35°C pendant 2 h alors que le
traitement à N2 dans les mêmes conditions ne possède pas d'effet bacté-
ricide.

Dans les aliments, le traitement au C02 à 13,7 MPa (131, 1 atm) à 35°C pendant 2 h est
efficace pour éradiquer Listeria.

- le lait : pasteurisation et stérilisation.

- les végétaux : contrôle des ensilages.

 -257-

L'utilisation du four micro-ondes n'a de valeur que si la température est maintenue

pendant près de 2 minutes ou si la température est égale en tous points de l'aliment (113)
(353).

Cette méthode n'est pas efficace pour certains (134) (247) (266).
 -258-

9ème PARTIE :

BESOINS DE LA
RECHERCHE
 -259-

1. EPIDEMIOLOGIE. (154)

Il faudrait :

- déterminer l'incidence réelle chez l'homme d'où des efforts accrus pour diag-
nostiquer la listériose,

- développer de meilleurs systèmes de surveillance de la listériose, notamment

des systèmes dê collecte de données afin de mieux détecter l'exacte inci-
denee des cas sporadiques et mieux percevoir le début des épidémies.

Il s'agit donc de recueillir des informations sur les cas, en particulier sur les facteurs de
risque, les données démographiques, les sources possibles de l'infection, les détails clini-
ques et les sérotypes et lysotypes des souches isolées.

- améliorer les techniques sérologiques pour évaluer l'état immunitaire et la ré-

ceptivité des femmes vis-à-vis de Listeria monocytogenes avant la gros-
sesse,

- rechercher le rOie des infections intercurrentes et d'autres facteurs qui font

d'un porteur inapparent un malade par diminution des résistances ou d'au-
tres mécanismes,

- mettre au point des alternatives à la lysotypie, comme le typage par les isoen-
zymes, le ribotypage et le typage par les gènes de restriction.

Il. VIRULENCE ET PATHOGENICITE. (154)

Il faudrait :

- faire la lumière sur le mécanisme de la pathogénèse,

- déterminer les doses minimales infectantes surtout quand la quantité réelle de

Listeria monocytogenes dans la nourriture en cause a pu être mesurée,
 -260-

- étudier de façon génétique les facteurs de virulence de même que l'expression

de la virulence en fonction des différentes conditions de croissance,

- développer des méthodes de substitution pour évaluer la virulence comme les

épreuves sur œuf.

Ill. METHODOLOGIE. (154)

Il faudrait développer :

- des méthodes d'isolement différentielles,

- des méthodes quantitatives de dénombrement de Listeria monocytogenes

dans les aliments.

IV. CONTAMINATION DES DENREES CRUES ET ELABOREES. (154)

Il faudrait établir :

- les cycles de contamination de Listeria monocytogenes ; ceci comprend le rôle

des déjections humaines et animales, la dissémination dans l'environnement
par l'épandage et les eaux de surface, le rôle de la vermine dans la dissémi-
nation vers les animaux d'abattoirs, les ateliers de préparation des aliments
et les denrées alimentaires,

- les sources de Listeria monocytogenes et les points d'entrée dans la chaîne

alimentaire,

- les mesures de prévention de la contamination des ateliers de préparation et

de la recontamination après fabrication.
 -261 -

V. ROLE DES TECHNIQUES DE FABRICATION. (154)

Il faudrait étudier :

- les effets du traitement thermique sur Listeria monocytogenes dans les ali-
ments autres que le lait de vache, par exemple la viande,

- l'emploi de l'irradiation des aliments pour supprimer Listeria monocytogenes

de certains fromages à pâte molle sans nuire aux qualités organoleptiques,

- la mise au point de techniques supprimant Listeria monocytogenes d'aliments

"prêts à consommer'' et utilisant les plus récentes découvertes,

- l'amélioration des équipements de fabrication pour faire avancer les progrès de

l'hygiène dans la production alimentaire.

VI. ROLE DES FACTEURS EXTRINSEQUES ET INTRINSEQUES. (154)

Il faudrait étudier le rôle de ces facteurs pris isolément ou s'ajoutant les uns aux
autres (pH, Aw, flore microbienne, additifs alimentaires), plus particulièrement pour les ali-
ments soumis à de longs délais de distribution.

VIl. LISTERIA AUTRES QUE LISTERIA MONOCYTOGENES. (154)

Une étude sur le rôle de ces germes serait nécessaire car ils sont un excellent
indicateur de souillure post-fabrication.
 -262-

CONCLUSION
 -263-

Listeria monocytogenes, bactérie pathogène, doit attirer l'attention des pouvoirs

publics, des industriels, des commerçants et de la population.

Du fait de son caractère ubiquitaire, Listeria monocytogenes peut être rencontrée

un peu partout à condition que le milieu soit favorable à sa survie d'une part et à son déve-
loppement d'autre part.

Elle est très invasive et sécrète une toxine, la listériolysine, qui lui permet d'être
libérée dans le cytoplasme d'une cellule hôte après phagocytose et de s'y multiplier.

L'incidence est faible mais le taux de mortalité est élevé ; de ce fai) des progrès
doivent être faits dans l'optique de déterminer la dose infectante.

En raison de la succession des épidémies, les pays concernés par le problème se

sont attachés à la combattre le mieux possible par la mise en place d'un plan de sur-
veillance très strict, impliquant plusieurs organismes.

Listeria monocytogenes, fort heureusement, ne touche pas toute la population

puisque seuls les nouveau-nés, les femmes enceintes, les immunodéprimés, les person-
nes agées développent la maladie principalement sous la forme de méningite et de septi-
cémie.

Les autres catégories d'individus peuvent être contaminés mais leur état de santé suffi-
samment sain leur permet de ne pas être atteints par la maladie.

Le diagnostic de toute listériose devra être très rapide de manière à instituer un

traitement adéquat et efficace.

Le respect des règles d'hygiène et des mesures préventives établies par le Labora-
toire National de la Santé et par le "Center for Disease Control" ainsi que la mise en place
d'un plan de surveillance doivent permettre une nette réduction du nombre de cas ; de
plus, les femmes enceintes devront consulter leur médecin à la moindre poussée de tem-
pérature inexpliquée.
 -264-

Un des moyens de lutte le plus important est de contrôler la contamination des

denrées alimentaires ; par conséquent, ceci implique de connaftre le comportement des
Listeria dans celles-ci.

Les méthodes d'isolement et de détection doivent donc être les plus performantes pos-
sibles mais aussi les plus rapides ; un effort doit être fait dans cette optique.

De nombreuses incertitudes demeurent cependant au sujet des Listeria ; de ce

fait, la recherche a encore beaucoup de progrès à faire en particulier le développement de
meilleurs systèmes de surveillance, l'étude du mécanisme de pathogénèse, la détermina-
tion de la dose minimale infectante, la mise au point de méthodes d'isolement et de dé-
nombrement mais aussi d'alternative à la lysotypie comme le ribotypage, le typage par les
isoenzymes, l'analyse RAPD ...

La contamination des denrées alimentaires au cours des différentes étapes de leur fabri-
cation doit également être étudiée de façon détaillée.

Il ne faut tout de même pas que la peur de la maladie ne devienne une véritable
psychose puisque quelques moyens de prévention et de lutte sont déjà connus et les fem-
mes enceintes si elles sont bien surveillées et traitées à temps, ne font courir aucun risque
à leur enfant.
 -265-

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li

li

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PLAN

,..
 -353-

INTRODUCTION. 9 à 10

1ère PARTIE:
HISTORIQUE. 11 à 13

2ème PARTIE :
LE GERME. 14 à 36

1. POSITION TAXONOMIQUE. 15 à 18

Il. HABITAT. 18 à 19

Ill. CARACTERES BIOCHIMIQUES. 19 à 22

111.1. METABOLISME GLUCIDIQUE. 19,20
Ill. 2. METABOLISME AZOTE. 20
Ill. 3. METABOLISME LIPIDIQUE. 20
Ill. 4. AUTRES CARACTERES DE DIFFERENCIATION
AVEC LES AUTRES ESPECES. 21, 22

IV. MORPHOLOGIE ET STRUCTURE. 22 à 27

V. CARACTERES CULTU RAUX ET CROISSANCE. 27 à 33

VI. STRUCTURE ANTIGENIQUE. 33 à 35

VIl. BACTERIOCYNOTYPIE. 36
 -354-

3ème PARTIE :

EPIDEMIOLOGIE. 37 à 60

1. CARACTERISTIQUES GENERALES. 38 à 44
1. 1. INCIDENCE. 38, 39
1. 2. MORTALITE. 39
1. 3. DUREE D'INCUBATION. 39
1. 4. DOSE INFECTANTE. 40
1. 5. FACTEURS DE RECEPTIVITE. 40à 43
1. 6. REPARTITION. 43, 44
1. 6. 1. Dans l'espace géographique. 43
1. 6. 2. Dans le temps. 43, 44

Il. RESERVOIRS. 44à 47

Il. 1. L'ENVIRONNEMENT. 44, 45

Il. 2. LES DENREES ALIMENTAIRES. 46

Il. 3. LES MALADES. 47

Il. 4. LES PORTEURS DE GERMES CHRONIQUES,

CONVALESCENTS, SAINS. 47

Ill. MODES DE CONTAMINATION. 48 à 53

Ill. 1. CONTAMINATION DIRECTE. 48 à 50

Ill. 1. 1. Contagion inter humaine. 48 à 50

Ill. 1. 2. Contagion inter animale. 50

Ill. 1. 3. Transmission de l'animal à l'homme. 50

Ill. 2. CONTAMINATION INDIRECTE. 50

IV. EVOLUTION. 54 à 60

IV. 1. SURVEILLANCE. 54 à 56

IV. 1. 1. En France. 54,55

IV. 1. 2. Dans les autres pays. 55, 56

IV. 2. CAS SPORADIQUES. 56

 -355-

IV. 3. EPIDEMIES. 56 à 60
IV. 3. 1. Listérioses d'origine alimentaire. 56 à 58
IV. 3. 2. Listérioses nosocomiales. 58

4ème PARTIE :

PHYSIOPATHOLOGIE. 61 à 97

1. MECANISME DE LA MALADIE. 62 à 68
1.1. PENETRATION DANS LES CELLULES. 63 à 65
1. 2. MULTIPLICATION CELLULAIRE. 66
1. 3. DISSEMINATION DE CELLULE A CELLULE. 66 à 68

Il. FACTEURS DE VIRULENCE. 69 à 77

11.1. HEMOLYSINE. 69 à 72
Il. 2. AUTRES FACTEURS. 72 à 77

Ill. REPONSE IMMUNITAIRE. 77

IV. POUVOIR PATHOGENE NATUREL. 77 à 95

IV. 1. CHEZ L'ANIMAL. 77 à 82
IV. 1. 1. Bovins adultes. 78
IV. 1. 2. Ovins. 78, 79
IV. 1 . 3. Porcs. 79
IV. 1. 4. Rongeurs. 80
IV. 1. 5. Oiseaux. 80
IV. 1. 6. Chevaux. 80
IV. 1. 7. Volailles. 80
IV. 1. 8. Lamas. 80
IV. 2. CHEZ L'HOMME. 82 à 95
IV. 2. 1. Sujets et terrains à risque. 82, 83
 -356-

IV. 2. 2. Listériose de l'adulte. 83 à 89

IV. 2. 2. 1. Infections du système nerveux central
ou atteinte neuroméningée. 83 à 87
IV. 2. 2. 1. 1. Symptomatologie. 84 à 87
IV. 2. 2. 1. 2. Evolution. 87
IV. 2. 2. 2. Autres infections listériennes. 87 à 89
IV. 2. 2. 2. 1. Les septicémies. 87
IV. 2. 2. 2. 2. Les atteintes cardia-vasculaires. 88
IV. 2. 2. 2. 3. L'hépatite. 88
IV. 2. 2. 2 .4. Autres troubles. 89
IV. 2. 3. Listérioses materno-fœtales. 90 à 95
IV. 2. 3. 1. Listériose de la femme enceinte. 90, 91
IV. 2. 3. 2. Transmissions mère-fœtus. 92
IV. 2. 3. 3. Listériose néonatale. 93 à 95
IV. 2. 3. 3. 1. Symptomatologie. 93,94
IV. 2. 3. 3. 1. 1. La forme septicémique. 93, 94
IV. 2. 3. 3. 1. 2. La méningite. 94
IV. 2. 3. 3. 1. 3. Les formes respiratoires. 94
IV. 2. 3. 3. 1. 4. Autres formes. 94
IV. 2. 3. 3. 2. Evolution. 94, 95

V. POUVOIR PATHOGENE EXPERIMENTAL. 95 à 97

V.1. VOIE CONJONCTIVALE. 95
V. 2. VOIE INTRAVEINAUSE. 95
V. 3. VOIE SOUS-CUTANEE. 96
V. 4. VOIE INTRAPERITONEALE. 96
V. 5. VOIE ORALE. 96
V. 6. VOIE CEREBRALE. 96

5ème PARTIE :

DIAGNOSTIC. 98 à 114

1. SIGNES DE SUSPICION. 99, 100

 -357-

Il. DIAGNOSTIC DES DIFFERENTES LISTERIOSES. 101 à 103

Il. 1. LISTERIOSE DE L'ADULTE. 101, 102
Il. 2. LISTERIOSE DE LA FEMME ENCEINTE. 102, 103
Il. 3. LISTERIOSE DU NOUVEAU-NE. 103

Ill. IDENTIFICATION. 103 à 114

Ill. 1. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE. 103 à 105
Ill. 1. 1. Examen direct après coloration de Gram. 103
Ill. 1. 2. Mise en culture et identification. 104 à 105
Ill. 1. 3. Méthodes rapides. 105
Ill. 2. CARACTERISATION. 105 à 112
Ill. 2. 1. Méthodes phénotypiques. 105 à 111
Ill. 2. 1. 1. Sérotypie. 106
Ill. 2. 1. 2. Lysotypie. 107 à 111
Ill. 2. 2. Méthodes de typage moléculaire. 111, 112
Ill. 3. DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE. 113, 114

Sème PARTIE :
TRAITEMENT. 115 à 125

1. BASE BACTERIOLOGIQUE ET PHARMACOCINETIQUE

DU CHOIX DES ANTIBIOTIQUES. 116 à 122
1. 1. ASPECT BACTERIOLOGIQUE OU SENSIBILITE. 116 à 120
1. 2. ASPECT PHARMACOCINETIQUE. 120 à 122

Il. TRAITEMENTS DES DIFFERENTES SITUATIONS CLINIQUES. 122 à 125

Il. 1. LISTERIOSE NEUROMENINGEE. 122, 123
Il. 2. SEPTICEMIE A LISTERIA. 123
Il. 3. LISTERIOSE NEONATALE. 123, 124
Il. 4. LISTERIOSE DE LA FEMME ENCEINTE. 124, 125
Il. 5. LISTERIOSE DE L'IMMUNODEPRIME. 125
 -358-

7ème PARTIE:
PROPHYLAXIE. 126 à 133

1. MEDICALE. 127, 128

1.1. VACCINATION. 127
1. 2. IMMUNITE. ALLERGIE. 127
1. 3. PREVENTION DE L'INFECTION GRAVIDIQUE. 127, 128

Il. SANITAIRE. 128 à 133

Il. 1. MESURES PARTICULIERES. 128 à 131
Il. 2. MESURES GENERALES. 131 à 133

Sème PARTIE :
LISTERIA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES. 134à257

1. CONTAMINATION DES DENREES ALIMENTAIRES. 135 à 143

1. 1. ORIGINE. 135 à 137
1. 2. FREQUENCE. 137 à 143
1. 2. 1. Produits carnés. 137 à 143
1. 2. 2. Produits laitiers. 143
1. 2. 3. Produits de la mer. 143
1. 2. 4. Végétaux. 143

Il. INCIDENCE ET CROISSANCE

DANS LES DENREES ALIMENTAIRES. 144 à 162
Il. 1. PRODUITS CARNES. 144 à 152
Il. 2. LAIT ET PRODUITS LAITIERS. 152 à 156
Il. 3. PRODUITS DE LA MER. 157, 158
Il. 4. ŒUFS. 158, 159
Il. 5. VEGETAUX. 159 à 162
 -359-

Ill. THERMORESISTANCE. 162 à 166

Ill. 1. DANS LE LAIT. 162 à 165
Ill. 2. DANS LA VIANDE. 165,166

IV. CONGELATION. 166 à 168

V. CONTROLE DE LA CROISSANCE ET EFFETS ANTILISTERIA. 168 à 171

VI. METHODES D'ISOLEMENT ET DE DETECTION. 171 à 225

VI. 1. METHODES CONVENTIONNELLES. 171 à201
VI. 1. 1. Enrichissement. 172
VI. 1. 2. Isolement. 172 à 175
VI. 1. 3. Confirmation du genre et identification de l'espèce. 175 à 187
VI. 1. 3. 1. Caractérisation biochimique et morphologique. 175 à 187
VI. 1. 3. 1. 1. Méthodes classiques. 176 à 179
-Tests de confirmation du genre. 176 à 177
-Tests d'identification d'espèce. 177 à 179
VI. 1. 3. 1. 2. Méthodes rapides. 179 à 187
- Galerie APl 50CH. 179
- Système MAST-ID. 179,180
- Galerie APl Listeria. 180 à 182
-MICRO-ID. 182
- AutoMicrobic. 183, 184
- RAP-ID. 184à 187
VI. 1 . 3. 2. Caractérisation phénotypique. 187
VI. 1. 3. 2. 1. Sérotypie. 187
VI. 1. 3. 2. 2. Lysotypie. 187
VI. 1. 4. Méthodes référencées. 187 à 201
VI. 1. 4. 1. Procédé à froid (CE). 188 à 190
VI. 1. 4. 2. Méthode FDA de LOVETT. 190, 191
VI. 1. 4. 3. Méthode USDA de McCLAIN et LEE. 191, 192
VI. 1 . 4. 4. Comparaison des méthodes FDA et USDA. 192, 193
VI. 1. 4. 5. Comparaison des méthodes FDA et USDA
avec le procédé CE. 194
- FDA et CE. 194
 -360-

- USDA et CE. 194

- FDA, USDA et CE. 194
VI. 1. 4. 6. Etude comparative de trois protocoles de recherche
de Listeria monocytogenes et Listeria spp. 194 à 198
VI. 1. 4. 7. Méthodes référencées en FRANCE. 198 à 201
VI. 2. METHODES RAPIDES. 201 à 221
VI. 2. 1. Méthodes immunologiques ou immunoenzymatiques. 201 à 205
VI. 2. 1. 1. Kits ELISA. 202, 203
-Kit Listeria Tek.- 202, 203
- Kit Listeria Tecra. 203
VI. 2. 1. 2. TRANSIA. 203, 204
VI. 2. 1. 3. VIDAS Listeria (LIS). 204, 205
VI. 2. 2. Méthodes de typage moléculaire. 205 à 221
VI. 2. 2. 1. Méthodes basées sur l'ADN. 205 à 219
VI. 2. 2. 1. 1. Tests d'hybridation. 205 à 212
- Méthode conventionnelle. 205 à 207
- Méthode soustractive. 207
- Dosage de protection homogène
en chimioluminescence (HPA). 208, 209
-Hybridation directe sur HGMF
(Hydrophobie grid-membrane filter). 209
-Test Gene-Trak. 209, 210
- Test Gen-Probe. 210, 211
- ELISA-HNA. 211
- Hybridation DNA-DNA "optique". 211
VI. 2. 2. 1. 2. Analyse de restriction enzymatique (REA). 212 à 213
VI. 2. 2. 1. 3. Polymorphisme d'ADN ou PCR. 213à219
- PCR simple. 213, 214
- PCR immunomagnétique. 214, 215
- PCR dans laquelle une des amorces est biotinylée
et la digoxigénine-11-dUTP est incorporée
durant l'élongation. 215, 216
- PCR + LCR. 216
- PCR + REA appliquée aux RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism). 217
 -361 -

- PCR + RAPD (Randomly Amplified Polymorphie DNA). 218

VI. 2. 2. 1. 4. Typage des plasmides. 218, 219
VI. 2. 2. 2. Ribotypage. 219, 220
VI. 2. 2. 3. Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE). 220, 221
VI. 3. AUTRES METHODES. 221 à 225
VI. 3. 1. Typage des monocines. 221
VI. 3. 2. Séparation immunomagnétique (IMS). 221,222
VI. 3. 3. Cytométrie en flux (Flow Cytometry ou FCM). 222 à 224
VI. 3. 4. Biolumiscence (ATPmétrie). 224
VI. 3. 5. lmpédancemétrie. 224
VI. 3. 6. Caractérisation de la listériolysine O. 225
VI. 3. 7. Activité Phospholipase C. 225

VIl. MAfTRISE DE LISTERIA MONOCYTOGENES. 226 à 257

VIl. 1. NIVEAU ZERO EN LISTERIA :
UNE SITUATION IRREALISTE. 226
VIl. 2. CLASSIFICATION DES PRODUITS EN FONCTION
DU "DANGER LISTERIA". 226 à 229
VIl. 2. 1. Viandes et préparations de viande. 226, 227
VIl. 2. 2. Produits crus à consommer·en l'état. 227
VIl. 2. 3. Produits conditionnés ayant reçu un traitement
thermique dans leur conditionnement. 228
VIl. 2. 4. Produits assainis par un traitement thermique
et sujets à recontamination. 228, 229
VIl. 3. REGLEMENTATION ET RECOMMANDATIONS. 229 à 241
VIl. 3. 1. En France. 229
VIl. 3. 2. Mesures nationales prises par certains états. 229 à 232
VIl. 3. 2. 1. Suisse. 229,230
VIl. 3. 2. 2. Italie. 230
VIl. 3. 2. 3. Canada. 231
VIl. 3. 2. 4. Grande-Bretagne. 231
VIl. 3. 2. 5. Allemagne. 232
 -362-

VIl. 3. 3. Réflexions de l'O.M.S. 232 à 235

VIl. 3. 3. 1. Recommandations aux autorités sanitaires
pour assurer la protection du consommateur. 232 à 234
VIl. 3. 3. 2. Recommandations aux industries alimentaires. 234, 235
VIl. 3. 4. Recommandations du Comité National d'Orientation
sur les critères microbiologiques. 235 à 241
VIl. 4. MOYENS DE LUTTE. 241 à 257
VIl. 4. 1. Surveillance de l'environnement. 242 à 243
VU. 4. 2. Méthode HACCP. 242 à 248
VIl. 4. 2. 1. Étape.Préliminaire. 244
VIl. 4. 2. 2. Analyse des dangers. 245
VIl. 4. 2. 3. Points critiques pour la maftrise (PCM). 245, 248
VIl. 4. 2. 4. Surveillance. 248
VIl. 4. 2. 5. Evaluation de l'efficacité. 248
VIl. 4. 3. Autres méthodes. 248 à 251
VIl. 4. 3. 1. Lors de la préparation. 248 à 251
VIl. 4. 3. 2. Lors de la commercialisation. 251
VIl. 4. 3. 3. Lors de la conservation. 251
VIl. 4. 4. Décontamination des aliments. 251 à 257

9ème PARTIE :
BESOINS DE LA RECHERCHE. 258 à 261

1. EPIDEMIOLOGIE. 259

Il. VIRULENCE. PATHOGENICITE. 259, 260

Ill. METHODOLOGIE. 260

IV. CONTAMINATION DES DENREES CRUES ET ELABOREES. 260

V. ROLE DES TECHNIQUES DE FABRICATION. 261

 -363-

VI. ROLE DES FACTEURS EXTRINSEQUES ET INTRINSEQUES. 261

VIl. LISTERIA AUTRES QUE LISTERIA MONOCYTOGENES. 261

CONCLUSION. 262 à 264

 -364-

ANNEXES
 - 365-

ANNEXE 1:
Interprétation des données des analyses pour l'identification des espèces.

Toutes les espèces Listeria se présentent sous forme de petits bacilles

Gram positif et leur mobilité est observée par examen d'un état frais et en milieu
SIM. Elles sont catalase positive, n'hydrolysent pas l'urée et acidif1ent la pente et
le culot d'une gélose TSI sans produire d'H2S Elles utilisent le mannitol, le
rhamnose et xylose, avec production d'acide. Toutes les espèces, exceptée L.
denitrificans (qui présente des réactions -+-/-) donnent des réactions ~~~ en bouillon
MR-VP (tests au rouge de rnéthyle et test de Voges-P"oskauer)

Une culture utilisant le mann1tol avec procuct1on d'acide correspond à L. gray1 ou

L. murrayi. La différenciation entre ces deux espèces est basée sur la réduction du
nitrate: L. mu rra yi réduit le n1trate.

Une culture réduisant le n1trate pe,Jt correspor-~cre a l'espèce L. murrayi ou L.

denitrificans. L'utilisation du mann1toi peut d1frérenc1w ces deux espèces, L.
denitrificans n'utilise pas le mannitol. De plus. L. denitrificans prése:;tf-; ~~~c
réaction MR-VP différente.

L. monocytogenes,· L. ivanovii et L. seeligeri (faiblement) produisent une hémolyse

lors d'un ensemencement en piqûre dans la gélose au sang de mouton. Parmi ces
3 espèces, seule L. monocytogenes n'utilise pas le xylose et présente une
réaction au rhamnose positive.
La difficulté concernant la différenciation entre L. ivanovii et L. seeligeri peut être
résolue par l'épreuve de Camp ou le pouvoir pathogène sur la souris. L. seeligeri
n'est pas pathogène pour la souris et présente un~ exaltation de l'hémolyse à
proximité de la strie de Staphylococcus.

L. ivanovii est pathogène pour la souris et montre une exaltation de l'hémolyse à

proximité de la strie de Rhodococcus. Parmi les espèces non hémolytiques, L.
innocua peut donner des réactions rhamnose-xylose semblables à L.
monocytogenes, mâis n'est pas pathogène pour la souris. L. innocua est la seule
espèce donnant parfois des résultats négatifs à la fois pour le rhamnose et le
xylose. L. welshimeri qui est rhamnose négatif peut être confondue avec une
souche de L seeligeri faiblement hémolytique jusqu'à l'application de l'épreuve
de Camp.

Lorsque tous les résultats sont disponibles, le sérotypage des cultures devient
indispensable.
 -366-

ANNEXE 11·

Listériose en France en 1988, 1989 et 1990.

LA LISTÉRIOSE EN FRANCE EN 1988

étude à partir des souches adressées au centre national de référence
E. P ESPAZE ', J. ROCOURT •• et A. L. COURTIEU ', Centre national de référence des Listena

_a surveillance epJdemiOiog,que de ta listeriose huma1ne est assuree en Figure 1

~·ance ·3; par un cena1n nombre d'organismes parm1 lesquels figurent te Repartition mensuelle des serovars de L. monocytogenes isolées
Centre nat1onat de reference des Ltsfena IC.N.R.I et te Centre 1nternat1onal de de 390 cas de listériose humaine en 1988
~fSotyp1e des Ltstena iC.I.L.L.J. La fonct1on essentielle de ces deux labora-
:o~res est d'assurer ta caracrensat1on des souches de L. monocytogenes par 50
'<dent1ftcat1on et la determmat1on du serovar IC.N.L.) et du phagovar • 112a
C.t.L.L.i Les echanges hebdomada~res de souches et d'1nformat1ons entre 9 1/2b
·es deux laborato~res permettent donc une analyse reguliere de l'evolution de
cette mfect1on.
40
m 4b

~r 1988. 2 699 souches de Ltstena ont ete adressees au C.N.R. so1t une aug- 30
:nentatlon de 57 °o du nombre de souches par rappon a 1987 [2] et de
~ 11 par rappon a 1986 [ 1] L'ongme de ces souches est la su1vante
~omme. 390 souches, animal, 111 souches. env~ronnemen!, 105 souches 20
1i1ments et 1ndustne alimentaire, 1 888 souches Ce dern1er ch1ffre, conslde-
·"ble et en constante augmentation depu1s 1 986. temo1gne des preoccupa-
10
··ons ue l'1ndustne foce a l'ongme al1menta1re de ta l1stenose huma1ne.

CARACTERISTIQUE DES SOUCHES

Jan Fév Mar Avr Mal J11i .l11il kAJ Sep Oct Nov DOC
Souches d'origine humaine
_es 390 souches reçues de France en 1988 correspondent a 390 cas de IIS- 145 °ol. assoc1ees a des sept1cem1es (21 °·o) et en septicémies 1solees (69 o.al.
·,.nose. so1t une augmentation de 7 co par rappon a 1 987. Toutes les sou- Les terra1ns les plus souvem retrouves sont l'ethylisme, les cancers, les
ches ISolees appartiennent a l'espece L. monocytogenes confirmant une nou- hemopathies. les traitements Immunosuppresseurs, le diabete et tes greffes
,etle fo1s que seule cette espece constitue un danger potentiel pour la sante d'organes. Une assoc1at1on listenose-SIDA a ete signalee dans deux cas.
Jubli(lue.
Repartition geographique: pour ta prem1ere fo1s cette annee, des souches 1 .2. Souches d'origine alimentaire
•)nt e!e adressees de toutes tes reg1ons de la France continentale tradu1sant 2305 souches d'ongme non humaine ont ete adressées au C.N.L. en 1988.
··mteret general susc1te par la l1stenose et permettant d'avoir une VISion plus so1t une augmentation de 75 J,o par rapport a l'annee precedente. Ce ch1ffre
qiobale de son epidem1olog1e. rend compte du fa1t que su1te aux problèmes susc1tes par t'origine alimen-
Repartition mensuelle: pour la prem1ere fo1s egalement, il a ete possible de taire de la listenose huma1ne, les denrees alimenta~res font t'objet de nom-
cecueillir ta totalite des dates d'isolement des souches. La repart1t1on men- breux contrôles dans notre pays.
;uelle globale des ISolements est caractensee par un nombre eleve de cas Ne seront cons1derèes ici que les 1 888 souches. adressees apres isolement
:Jendant tes sept prem1ers mo1s de l'annee, avec tro1s penodes d'augmenta- a partir de produitS destineS a la COnsommatiOn humaine et pourvues d' infor-
:IOn perceptibles en Janvier. mars et mai-)Uin-Juillet. matiOnS suffisantes quant a leur ongme. Leur d1stnbution selon les especes
Cette courbe de distnbut1on des Isolements d1ffere de celle observee en est la su1vante: L. monocytogenes: 1 221 souches. L.mnocua: 609 souches.
1987 •fig 1 ). L. seeltgen : 34 souches et L. welshimen : 24 souches. L. monocytogenes et
Repartition selon les formes cliniques : L. mnocua sont les especes les plus frequemment rencontrees dans les den-
rees alimenta~res, comme cela est auss1 observe dans les autres pays.
La ltstenose foeto-materhe/le (femmes enceintes et nouveau-nes) 1 69 cas.
\/lerps ou femmes encemtes 66 cas. Sang 47. placenta· 57. prelevement
2. ANALYSE DES SEROVARS
vag1nal et loch1es 15.
Nouveau -nes 99 cas. L.C.R 14, sang 3 7. l1qu1de gastrique . 71, meco- 2.1 Souches d'origine humaine
n,um Ou selles · 41. La repart1t1on selon le sexe est la su1vante sexe mascu- Les serovars 1 '2 a, 1.'2 b et 4 b constituent à eux seuls 98,5 °•o des souches
'•n 54 '0-o, sexe fèm1n1n 46 '·o 1solees ttabt. 1 ), les autres serovars n'etant que tres exceptionnellement ren-
Souches reçues avec des 1nformat1ons 1nsuff1santes 4. contres en pathologie humame. En revanche, il est remarquable de constater

La its/enose de l'enfant et de l'adulte 221 cas.

:_·,negaie repart1t1on des cas selon le sexe (sexe masculin 64 °·o, sexe fem1- · Ldboratoire de bactenologte. U f_R de medecme. 1, rue Gaston-Vetl. 44035
n1n 36 °'o) est conforme a celle des annees passees 11, 2). Les tableaux cllni- Nantes Cedex et Un1te d'ecologie bacterienne
'IUes se rep~rt1ssent en men1ng1tes et/ou m,enmgo-encephal1tes Isolees •• Institut Pasteur. 25 rue du Docteur-Roux. 75015 Pans.
 -367-
<ldf le serovar 4 b. largement prèdommant depuis l'ouverture du C.N.R. en des serovars de L. monocytogenes montre que 78 °1o des souches appar
1982. enregistre un net recul en 1988 et ne représente plus ,que 45% de la tiennent au serogroupe 1/2, contre seulement 18 ~'o pour le serovar 4 b
total1te des souches contre 63 o10 en 1987; à l'opposé, une nette augmenta- Cette Importante proportion des souches de serogroupe 1.'2 dans les der
tion du serovar 1/2 a de 22 ~·o à plus de 38 o1o est observée. rées alimentaires est tout à fait comparable aux chiffres obtenus en 1 987 et
ne peu( donc expliquer a elle seule l'appantion brutale en 1988 du grand
Tableau 1 nombre de cas de listènose de ce sèrogroupe.
Evolution des sérovars de L. monocytogenes isolëes Tableau 2
dans les cas de listériose humaine en 1986 (335 cas), Répartition en pourcentages des sérovars de 1 185 souches
1987 (366 cas) et 1988 (390 cas) de L. monocytogenes provenant de produits alimentaires
destinés à la consommation humaine
Sérovars 1986 1987 1988
Produits carnés Laits Fromages
Sèrovars
o,o o, '•o 246 souches 183 souches 756 souches

1 2 ii 38,5
o.o % G,c-
15 22
1 2 b 14 13 15 1 2 d 22 69 52
4 b 69 63 45 t 2 /.• 10 12 Hl
Autres 2 2 1,5 t 2 c 41 3 8
3 a 3
3 b 1 1 4
3 c 1
Répartition géographique des sérovars : la distribution géographique 4 b 22 14 18
selon le sèrovar n'est gas homogène, montrant une grande variation d'une 4 c 1
reg1on a l'autre et une certaine tendance générale à la baisse des pour-
centages du serovar 4 b par rapport a ceux enregistres en 1 987. Rares sont
3. ANALYSE DES LYSOVARS
les règ1ons pour lesquelles ceux-ci dépassent 60 °1o (Alsace 65 °10, Centre
79 "'o. Languedoc 78% et Provence- Côte d'Azur 70 %). Les pourcentages 3.1 Souches d'origine humaine
du serovar 4 b sont faibles en Haute-Normandie 18 %, Île-de-France 27 %, 66 °•o des souches françaises d'origine humame 1solées en 1988 étaient
Llmousm 37 Ofo, Nord et Pays de la Loire 38 %. Dans certaines règ1ons le typa bles, pourcentage supérieur de 8 O;o à ceux obtenus en France en 1987
pourcentage de sèrovars 4 b et celui des autres sèrovars sont totalement Ce pourcentage demeure toutefois infèneur a celui obtenu dans d'autres
onverses par rapport à 1987 (Bretagne où il passe de 85 Ofo à 45 %, pays durant la meme période et pour la même catègone de souches. Le pour-
Champagne- Ardenne de 81 à 43 ~·o. L1mousm de 80 à 37 °1o et Poitou-Cha- centage de souches typa bles va ne également selon le sèrovar : 1 /2 à, 7 5 °-'c.
rentes de 69 à 33 °1o). En general. dans la plupart des règ1ons. le pourcentage 1 /2 b, 24 °·o. 4 b, 71 °1o. Si la lysotyp1e est un typa ge particulièrement d1scri·
de 4 b decroit par rapport à l'an passé. Toutefois, d'autres règ1ons présentent minant et donc utile lors d'enquêtes èp1dèmiolog•ques, ce fort taux de sou
une evolutiOn mverse. Il en est a1ns1 pour l'Aquitaine et la Basse-Nornnand)e ch es non typa bles constitue parfois un handicap; ce fut notamment le cao
ou les pourcentages de serovar 4 b passent respectivement de 36 q.o à 59% lors d'une bouffée èpidém1que regroupant 10 cas survenus dans la region
et de 33 °1o à 54% (fig. 2). pans1enne, pour laquelle les souches isolées ne purent être typees par les
Répartition mensuelle des sérovars : plusieurs p1cs ont été observés à des phages avec cette méthode [3].
epoques d1f1erentes selon les serovars : 1/2 a en Janvier et juillet. 1/2 ben L'analyse des lysovars de ces souches montre, comme en 1987, une grande
fevner et juillet, 4 b en Janvier, mars et mal-JUin (fig. 1 ). variété, ce qui suggère que la listériose humaine a pnnc1palement sèv1 sous
forme de cas sporadiques. Certa1ns lysovars rassemblent de deux a une
2.2. Souches d'origine alimentaire d1zame de souches, sans qu'aucune association géographique ou temporelle
pu1sse être mise en évidence.
La repartition des serovars deL. monocytogenes pour les produits carnés, les Toutefois, trois lysovars ont ètè plus fréquemment retrouvés (un _t:Jour le
la1ts et les fromages est rapportee dans le tableau 2. L'etude de la rèpart1t1on serovar 4 b et deux pour le sèrovar 1/2 a). La distribution mensuelle de ces
souches permet de penser que la listériose humame a été caracténsèe en
F1gure 2
1988 par plusieurs pics èp1démiques causés chacun par une souche unique
Répartition régionale du sérovar 4 b de L. monocytogenes isolées
comportant de 1 5 à 28 cas :au moms 3 en janvier et mai et un autre entre
dans 390 cas de listériose humaine en 1988
jumet août. La rèparti:1on géographique de ces cas englobe plus1eurs depar-
tements. L'ensemble de ces resultats évoque l'existence de cas groupes.
davantage dans le tem;Js que dans l'espace, ce qui complique notablement
les enquêtes èpidèmiologiques comme ce fut récemment souligné [3].
3.2. Souches d'origine alimentaire
La confrontation des résultats de la lysotypie des souches d'origine huma1ne
avec ceux des souches d'origine alimentaire ne peut apporter d'éléments
s•gn1f1catifs en dehors d'enquêtes épidèmiolog1ques précises. En effet, la
caracteristique de la lysotopie étant de grouper spécifiquement les souches a
1'1nteneur d'un même sèrovar. associee par ailleurs à une Qis.!!ibut1on 1négale
des sérovars des souches d' origme hum ame et alimentaire, rendent difficile
la mise en ev1dence d'un l1en entre ces deux categories de souches dans l'ab-
solu. Toutefois. la constitution d'une telle banque de données s'avère parti-
cullerement utile lors de l'émergence d'une bouf1èe épidémique [3].
4. CONCLUSION
En mat1ere de listènose humaine, l'année 1988 a donc été caracterisee par
une mversion nette de la repartitiOn des sèrovars des souches : le sèrovar 4 b.
qui etait en France et dans d'autres pays le sérovar dommant. n'a plus corres-
pondu qu'a seulement 45 o,o des isolements. À notre connaissance, aucun
phenomene s1milaire n'a été constaté dans d'autres pays durant cette
période. L'observation de bouffées épidémiques causées par des souches du
sèrogroupe 1/2, plus nombreuses qu'auparavant, pourrait expliquer, tout au
moms partieliement, cette repartition peu habituelle. La caractérisation fine
des souches de L. monocytogenes responsables d'infections humaines ains1
que la centralisation des résultats apparaissent donc comme des éléments
essent•els de la surveillance de la listènose huma1ne à l'échelle nationale.
Auss1, conv1ent-il de souligner comb1en l'envol régulier au C.N.R. des
souches de L. monocytogenes isolées par les biologistes est fondamental
pour cette surveillance. Qu'ils en soient ici remerciés.
LITIERATURE CITEE
~o.~ A·s~e lor lomltr'lf
Ill Espaze. E P.. Courtoeu. A L Rapport du Centre national de référence des
A~" AQVII&IMf! MPy Mdt-PI,4'tnhs Listeria 1986. Bull. ep1demiOI. hebd. · 1987. 39, 153 155.
Auvervne Nor t.ord-PPIS d• C111lttS 121 Espaze, E P, Rocourt, J., Courtoeu. A. L. La listériose en France en 1987. Etude
0
~t.v.

ao,. Bourgogne Br'io 911SSf' Nonnl'l.ndlt o-•o., à partir des souches adressees au Centre national de reference. Bult. ep1demwl.
B~ Brt!t~ne Hf\lo Hllutf' Nonn.llndtf!
:.e" Ct!r'll~ Pdl PIIYS Of'- Lot~ 0•1-550! hebd. 1989. 12. 46-4 7
C.ha Champe.Qr'le-.\rclennes Pte l'tcl'llrdtl" 131 Lemagny F. Rebiere 1, Rocourt J, Hubert B Listériose humaine : enquéte
r::o Franche Corn!~ Pot Pott ou Chlilrmtfs 05&-700! épidémiologique de deux épisodes épidémiques en France, en 1988 et 1989.
l,jf IIP "pFMncf' PCA Prvwnc• -CÔif! d'Azur
._111r\ Ll'l.nqv•"oc ~Aousstllol'l Rha Rhône - Alpts 071-1000! Bull. epidem10/. hebd. 1989. 38, 162-163
:..ur Ltmovstn
 -368-

LA LISTERIOSE EN FRANCE EN 1989

Étude à partir des souches adressées au centre national de référence.

ESPAZE E.P.*, ROCOURT J:• et COURTIEU A.L.*

La su,-\·E:illance èpidèmiologique de la listériose humaine est assurée en France -Nouveau-nes. 106 cas LCR 14. sang 43, !iq~ide gas!·iqCJe 71. :Teconium
;:Jôr ~n cer:ain nombre d'organismes parm1lequels figurent le Centre National ou selles. 41 La repar:itioc selon le sexe es~ lç sJ,vante sexe or.asculm 54.o•o,
de "iéference des Lister/a !CNL; et le CE: nt re National de Lysotypie et de Typage sexe féminin. ~6 o,a.
cno!ecu!ai,.e des Liste ria (IP) La fonction essentielle de ces deux laboratoires est -Souches reçues avec des mforrr.a!1or.s lf"'sufiisa'"~1es · 1.
d'assurer la caractérisation des souches deL. monoc(fogenes par l'rder-tifica-
tion et la determination du sérovar (CNL) et du phagovar (IP) Les ècf-,anges
La l.·stèiose de l'enfant et de l'adulte· 215 cas.
"·ebdomadaires de souches et d'mformatior.s entre les deux laboratoires
permettent donc une analyse régulière de l'évolution de cette infection. Linégale répart1tion des cas selon le sexe 'se x~ r:-.ascclin. 64 o.,, se x P. femi1w1
36 °·o) est conforme à celle des années passées {1, 2! Les tableaux c'""quc; s8
En 198g, mille six cent quatre-vingts souches de Listeria ont été adressées au
répartissent en mér.ingi:es et·ou méningo-encépr.alites isolées i'/.:l a,,) o•·
CNR L'origine de ces souches est la suivante· homme, 420 souches, animal,
70 souches, environnement, 4 7 souches; aliments et industrie alimentaire,
a
associE-es des septicém1es t2 3 o.(.} et er. sep~icémies isolees (4 7::-) ; e·; ln,·-
rai'1s les plus SO"Jvent re~rouvés sont les cancers, l'éthylisme, le~ ira1:r;rnents
989 souches Une souche prover;éit de l'alimentation animale et 1113 souches
immJnc-suppcesseurs, les greffes d'organes, les hémopathies et le d1JD€ie st
d'origi'1e non h~maine nous étaient adressées sans informations.
unE essociat1or listértose-SIDA o ét~ sig1alée dans 7 cas.

1. CARACTÉRISTIQUE DES SOUCHES Une soucfJe reçue sans a Jeun re,....seigner'ltnt n'a pt. é~re d2ssée dans aucune
des fo~mes cl1f'ic;ues prëcédemrnent ef1visagées.
1.1. Souches d'origine humaine
Dar ....,lles souches reçues, 416 ont été isolées en France en 1989, correspo~dant 1.2 Souches d'origine alimentaire
c:; ~ 16 ces de !:s!ériose, soit :.Jne augmentation de 7 °·: par rapport 51988. Tou~ es Parmi les souc>,es d'o•ig:ne non humaine ad,essèes au CNL en 1988. douze
les souches isolées appartiennent 6 l'espèce L monocytogenescorfirrr.an~ Jne cen! soixa!""1te on! pu ê~r€ é~udlees re~dant cc,rrw~e du fait que !es de:--~ees ai;-
"c"·,·elie fois que se ole cette espèce constitue un danger potentiel pour le santé r.--.ec.!aires font l'obJet de nombreux contrê>les da% noirE pays.
i)ubltque.
Ne seront co~sidèrées ici que les 95 7 souches. ac,essèes après 'solemenl ~
-Répartition géographique: ces souches ont été adressées des 23 •égions pa:i1r de prodJi~s destinës 2. !a co;.somma~ion hurr.c1r·f e~ pou :vues d';,- ·'u• ••1 }-
l·a~çaises et des DGM- TOM, les régions les plus peu;Jiées fournissant le plus a
tiens suffîsarJ~e~ quant leur OfiQine Leur dist~;b~tiOr selon !es esnècss ~:;1.
g•<;r,d nombce de cas. la S(;Îv:snte L. mo,.,ocytogenes ·627 souches. L. in noe ua ·2 7 5 Sûuch;:·.;, L see/ 1 -
- Répartition mensuelle: la répartition mensJelle globale des isolements se geri · 34 SO:.JChes, L. \velshirneri. 14 souches, L. iv·anov1i. 4 souches 81 1 CJfa~"·
ca•ac:érise pa• le pe:it nofTlbre de cas retrouvés pendant le pcemiertrimes:re de 1 souche. L. manocr1ogenes e1 L. /nnocua dt:-rne'Jrer.t tes espèce•} ·c~ ~~u,
:·2r-.~.ee. po'liculièrëment en jan\·ier et février. Deu) pics sppareissent l'ur. en héqJerr.'ilent ~encc·n~·êes dans les der·êes atime.,taires, comme cefd c~.il
avri!, mai, jutn, judle1 qui cu!n-1ine en juin et r·aJtrt en octobre et novembre. La auss; observé dans les a ut res pays.
courbe de distribution mensuelle des isolemr,nts d1ffère de celle observée en
1988. (Fig. 1).
Il. ANALYSE DES SÉROVARS
2.1. Souches d'origine humaine
Les sérovars 1 2 a. 1. 2 tet 4 b constituent à eux seuls 96 o,, des souches isoiês:'
(tableau 1).les autres serovar5 n'etant que très raremen~ rencontrés en av;·hu· ~­
gie h J<r.aine Le sércvar 4 b, largement prédominant de;:JUis l'ouver\,_,r~ d•1: ;i'i.
en 1982, mais qui avait enregistré un ne: recul en 1988 ne représentan: o•us ~u·
a
4 5 °·t de la totalité des souches (2) contre 63 °~. en 1987 (1 ), remonte 64 o•c e:,
1989 Le sèro·,ar 1.'2 a qui représe:ntait 38D!c des souches en 1988 n'er, reor;O-
sente plus que 20 °·é en 1989.
-Répartition géographique des sérovars
La distributio~ gf>ographique des sérovars n'est pas homogène, variant d'une
a
région à l'aJtre Contrairement l'an passe, de nombreuses r8gions, une quli:-
Mols zaine au moins, ont des pourcentages d'isolement du sèrovar 4 b supérieur 6
Figure 1 60%.
Rer.ort•tion rnE:~sLJe!IE des sërova•s deL monocytogenes isolées en 1989 de 416 ca~ de
l15!e•;:J5E huma•ne.

-Répartition selon les formes cliniques: Centre Natio~.al de, Rëfërence de lrsotypie et de T}page- mo:écula;re des Lr:;i.~·-rë
La IJs:ériose foeto-maternel/e (femmes enceintes et nouveau-nés)· 200 cas. Laborato1re de Bacteriologre UFR dfo Médecine 1, r~e Gastor.-Veî[, 44035 Nante~. V'"CL~:.
•• CentrE "la~IQ;,al de Réfërence de l\'Sotypîe et de Typage- moiéc..rlaire d~:: L;.~r~u··
- f.!.ères Ou f~mmes enceintes: 93 cas. Sang 55, placenta· 62, prélèvement Département de- Bact~riologie et de tv'lycologie. lnstr1..rt Pss.teur, 25 rue du Ur.- f-.o~~
'ag,nal ou lochies: 15. 7 5015 Paris.
 -369-
Tableau 1 Ill. ANALYSE DES LYSOVARS
t Vû 1U! IQn deS P0UfCEP1 ag&S deS dl~feret'ltS serO.\lBr$ de[. m~nOCyfOgf!neS iSOléeS dans leS 3.1. Souches d'origine humaine
cas dE:' 1!Sie'•(ISE: hurna1n~ er: 1987 \366 ca&), }988 (390 cas; e1 1989 ~416 cas).
51% des souches françaises d'origine humaine isulées en 1989 or,: é:é lysoty-
pables. ce pourcentage variant selon les sérovars: 1.'2 a: 7 3 °'o. 1. 2 b 2 7 O!o,
Sérovars 1987 1988 1989 4 b. 5oo;,,_ Le pourcer.tage to:al est respectivement inferieur de 6°': et de 15 Oie.
aux résultats de 1987 et de 1988 (1, 2). s'avé•ënt également ir,férieur à ceux
1 2a 22' ·38.5 20 übtenus pour les souches de mëme origine prc.venont. durant la mË:me période,
1 2b 13 15 12 des pays élrangers.
4b 63 45 64 Deux grands pjcs épidémiques ont été observes en 1989. principalement
hutres 2 1.5 4 causés:
-l'un, situÉ er.~re lo mi-mars et jUillet. Q".Jl s'es~ ca~actérisé:
• Pc.Jrcer,tage
1 i par l'émergence de souches du sérovar 2425:
Parmr le5 régions pour lesquelles un nombre suffisant de souches a étÉ isolé,
Les 15 ir.fections provoquées par les souches dé lys:-var 242 5 correspondaient
les pourcentages les plus élevés de sérovar 4 b se retrouvent en LangJedoc-
Roussillon (100%). Limousin (86 o•o). Alsace (7 5 °1c). Bourgogne (7 5 %) et Pro-
à des formes cliniques variées, dissémir.ees dans 12 départements différents.
Onze cas ont fait l'objet d'investigations épidémrologiques immédiates par la
vence-Alpes-Côte d'Azur (74 %). Toutefois ils sont bas pour le Centre (17 Dio) et
Direction Gênérale de la Sante et le Laboratoire National de la Santé. interroga-
pour Poitou-Charentes (180/o).
toire précis recherchant une transmission alimentaire avec anal1•ses cas
Pour certaines régions le pourcentage desérovar 4 b et ceux des autres sérovars témoins. Toutefois l'origine, possiblement commune de ces cas, puisque les
a
s'inversent totalement par rapport 1988. Il en est ainsi pour Bretagne (71;45). souches étaient identiques quant au sérovar et au lysovar n'a pu être mise en
Champagne (64;43). Haute-Normandie (75;18). lie-de-France (52/27). évidence en raison d'un cer:ain nombre d'éléments parmi lesquels large dis-
Limousin (86;37). Lorraine (71:43). Midi-Pyrénées r,67i43). Nord (69 38) et persion géographique. trop courte durée du pic épidémique. trop faible
Rhône-A!pes (67/48). Le pourcentage de sérovar 4 b reste bas en Pays de la nombre de cas (3).
Loire (42.'38) et continue de baisser en Poitou-Charentes (18 ·33) (figure 2).
21 l'éme•gence de souches du l1•sovar 1444-312:
Les infections causées par le lysovar 1444-312 ont été essentiellerrent retrou-
vées dans les regions Provence-Alpes-Côte d'Azur et Rhône-Alpes.
3; enfin par une remarquable augmer.~a!Jon, d·~:-ant cet~e même période, du
nombre de cas de listériose, enregistrée a StrasboJrg 14). 14 cas entre le
30 mars et le 13 juillet. correspondant a 6-8 f0is :e nombre attendu er fonction
de5 observations concernant les années précédentes. Cette bouffee épidémi-
que s'est caractér!sêe par de~ souches de sëro\ars e~ de lysovârs tres vanées.
Ceci permet de penser que ces or.fections pourra1ent avoir dE>s origines drverses
e1 que t'appar;tion subi!e de ces divers cas en une courie p€riodE- pc.-..r~a1\ Ë1re
!1ee à un OL. plusie:.us facteurs prédisposar-1s nc·r. encore 1der:~~~és. hfpothf:se
vec~derr.ment av&n:ee par sc~wortz et al. 1 ,5),
-l'autre. sit.JE entre SeptEmbre et Décerr,bre. pa' des souches nor. !\'50!ypa-
bies :respor:sables pour CE s€rOvôr du fa1b!€- pourcer.iage dE SOuches :ysotypa-
bies en 1989).
3.2 Souches d'origine alimentaire
Les soJches de L:'stetië: provenant dE- denrées ali~er~a1·es sont !~·so!, ;:lees a fm
de cor.st~~uer une bônq;..~e de donnees im:-:'lE>d:a!emen! e).plo11ab:e foiS de
!'e;mergencE d'unE- bc...;HeE ép1démique. Ces SG..J.::hes son! égalemt-n! St 1 (>~eil·
lE-es afin de dê-~ecter l'éventuetle apparition r::r ~C·"Tlbre anormal cl:~ :juuci1es
ëppa'1enant à un lysovar précedemmen1 obsecce locs d'une ép1dé'""1. lou·ie-
fois. la confrontation des résul:ats de la 1\'sotypie deo souches d'origine airrnen-
taire avec ceu)· des souches d'originE h.Jrr.ainE ne peu1 a~porter d'elérr.en1s
signtf,catifs 8n dehors d'enquêtes eprdémiologiques.
•.:w 1;.-· .... , ·-t' ~ ,..,., • '
.. _ ·-..'tc";'>t •-1:, ..'\:.c ....,.+ts
E"- s~ . . •"fil"'' '•"' '•c.-r;'. ~ •• ~. : •• s CONCLUSION
:: .... ;~·'"'··t' l?',c S ·~ !0 •.;o.., ~· ~.,
-''•" -o., f •.,-~. ~.e ~.;·-!~~ Er. 1988. lz l:st~r1C'SE- humaine s'était caractérisée, en France par unE îrvers1on
o • ,': t• • e•rt
:~et tt--
d
de la répôr"1Î~tOr des sërcn.-ars des so~c~es .le sérova; 4 b ne ~eprês~:rtant
~
: ·• F :~"'!.' f []5&--:-~

~ :• r..., •.• ,
~t F: ':. :• ""'"'fS
0" :: .. r!us que 45 ~:.:!es rsc!e:ments Dès 1989,12 sitw"a~ior, oG1€-~ie •.He s'es~ ;-f!abtle,le
... ::1 .... ;,..:loc .Ao.~:s to~. sE-re;. ar .ll t correspo'ldar.1 a 64 °': des isvlemen~s contre 20 o: pou~ !e s.érc,ar
1 2 a La si~ ua: lon !ra~sr1oîremen1 observee er. 1~88 é~ait probabler.ent due à
la surve~Je de p!usiE>urs boJffèes é;:oidemiques ca;.:sees par des souches
Rë;-ar<,,1•vr reg•v.,ole d..: se~ovar 4t· je- L monoq'iog!:"ES ·~: ~.;::; da:--s t.. if .:as de '·E;er•cse 2t:·pa~enant au serovar 1 2 a.
1- ...,~ â-rf€- en ~ 989
L'ép,dt2ï-'io~ogie de la ::s~érios.e en F~ance, u~ilisar.: le :,2rovar et :e iy5ovar
cc.~mE: mo~'er, d'apprE-cta:ion, apparai! commE e~ên! ê>.t~Émerr.en! c..:.:-nplexe.
-Répartition mensuelle des sérovars: les ries des d'vers sérovars concor- O~servés a !'echellt :.at.orale, les pics quoiqùE: llis~~~th.~és sur prus1e..~.-s dépar-
jen1 avec ceu;.. de la distribu~ion généra•.e des isc'emer.ts e1 s:Jnt re~rc.uvés tt-r--~Ents apparat~Sênt !~tbu~aires de f'ët"Tïerge:,~e d'u'îe OU p!L.tSIEJ~S SOuChes
er avril. mai, juin, jJillet d'une për1 et en octobce. novembre d'a~tre ~art. • É-~.'ldèmiques )l, ~ôrd1~ qu'a !'échelle locale une bo.Jffée- pe;J! étre c~ ... sëE- par
'',gure 1). des souches t·ès d·~êJE-ntes comrne en tér."1oigr1e ce!!E dE- St:-asboJr; 4; Pd rm·
res sys!Emes assu:-ar1t la S;Jrved!ance de fa listÊ-"'•Ose dans drvers ;.ays, ce!u
2.2 Souches d'origine alimentaire d::>ni '10\JS dlsposo~.s en France est pa~iculiErerT"ent bien adapte al::s1 q._:'e,·
La repartition des sérova•s deL. monoc;1ogenes po"r les produ1ts cac nés. les :errGigne !'a.-.a!~·se des bc_;;Jtf€es epid~r1iques sur'\oen~es en 1989 Si Jn5 de
laits et les fror.-.ages est rappor.ée dans le tableau 2. L'étude de la répér':ition ces bSJv"Hée~ ava•t ê·.·ofué en ~me épidémie, d est éviden~ q~e cet!E dt:rr;,ëre
de~ sèrovars deL. monocytogenes montre q~e 70°: des souches appa:1rennent a~rai: pu ë:re ac,alysée dès son début.
au sérC)groupe 1 '2, contre seulement 14 °·( pour le sèrovar 4 b Le sérovar 3 ba
E!E retrouvé dans12 °·è· des isolements Le sérovar 1 2 c est le sÉrovar dom mant LITIÉRATURE CITÉE
retrouvé dans 42 °·(· des isolements.
[ 1) Espaze, E.P .. Rocourt. J, CoJrtieu, A.L.- La listériose en France en 1!iil ..
- Etude à partir des souches adressées au Centre National de Réi6
Table:au 2 renee. B.E.H.: 1989.12,46-47.
Pépâil it ior E:-rr pourcentages des sérc., a•s dE; 589 souches del mnnoc,-togf'nf"·s pre"~venant [2] Espaze. E.P .. Rocourt. J,, Cour:ieu, AL- La listériose en France en 19C
df p1::•duits arime"taires des!inés à la corsomr-.ation hurr;ame.
- Etude à partir des souches adressées au Centre National de RéM·
renee. B.E.H.: 1990, 1. 1-2.
Sérovars Produits carnés laits Fromages
[3] Lemagny, F., Rebière. 1., Rocourt, J., Hubert, 8.- Listériose humain:'
enquête épidémiologique de deux épisodes épidémiques en Franc:è.
91 souches 47 SQJC~es 451 so~ohes
en 1988 et 1989. B.E.H.: 1989, 38,162-163.
1 2a 38' 75 35
1 2b 5 13 21 [4] Rocourt, J. Espaze. E.P .. Mine k. R , Cati mel. 8 .. Hubert. 8 , Courlieu, A L.-
1 2c 43 2 8 Cluster of listeriosis isolates with different serovar and phagov;,::
3a 1 4 characteristics. Lâncet: 1989. 2. 1217-1218.
3b 16 [5] Sc~wartz, 8 .. H~;xter, D .. Broome. C.V .. Higbtower, AW .. Hirschhorn. R C.
3c 1 1 Porter, J D .• Ha 1•es. P S .. Sibb, W.F. Lorber, B .. Fa ris. D.G. -lnvesti!)a1io:·
4b 12 10 15 of an outbreak of listeriosis: new hypothesis for the etioloÇJy r.'
epidemie Listeria monocytogenes infections. J.!nfect Dis .. 1 989. 15''.
• P::• ..;rce~.toge 680 385.
 -370-

LA LISTERIOSE EN FRANCE EN 1990

Étude à partir des souches adressées au Centre national de référence
J. ROCOURT··, E. P. ESPAZE *, A. F. MIEGEVILLE *, B. CATIMEL *,A. L. COURT/EU •

La surveillance épidemiolog•c;ue de la listériose humaine est assurée en Figure 1

France, depuis rlusieurs ac,cees [1]. par un cer.ain nombre d'organismes Répartition mensuelle des sérovars de L. monocytogenes
;:,crmi lesquels ~iguren: le Cer~·e na:ior.al de rMérence des Listeria !C.N.R.) et isolées en 1990 de 299 cas de listériose humain~
le Centre natior.al de lyse.~ ,·pie et de !l'page moléculaire des Listeria
•C 1\J.L.T.M.l.). La fonction essectieile de ces 2 laboratoires est d'assurer la Sé-rovar 1'?.a
caractérisation des souches de L. monocytogenes par l'identification et la .!C Sé•cvar i·2b
déterminalion ou sérovar •C.N.L.) et du phagovar '.C.N.R.L.T.M.L.). Les
échanges hebdomadaires de SC.Jches et d'informât ions ~;nt re les 2 laboratoi-
res permettent une ar.ai\'Sé re'gulièr~; de l'évolution de cette infection. 30
En 1990, 1 617 souches de Listeria ont été adressées et étudiées au C.N.R.
L'origine de ces souches est la sui1·ante homme, 311 souches; animal, 2C
6.: souches; environnement, 191 souches, aliments et industrie alimentaire,
1 03 6 souches.

CARACTËRISTIQUE DES SOUCHES

Souches d'origine humaine Jan Fév t-l ar Av r Mai Jui Juil Ao~ Sep Oct Nov Déc
311 des souches reçues, ont eté isolées en France en 1990 · 309 souches de Mois
a
L. monocytogenes correspondent 309 ir>lections et 2 souches de Usteria
inn oc ua isolées d'un prèlè,ecr.ent vaginal et d' ~n méconium n'ont aucune (24 fois). les hémopathies (14 fois). le diabète (13 fois) et les gceffes d'o;·_
signification clinique. On observe donc une diminution de 25 °·( du nombre ga11es (12 fois). Une association listér'1ose-SIDA a été signalee 3 fois.
de cas par rapport a·,989 :~ = 41 6 ). 1\ n'y a pas d'explication évidente à cela,
a.;cun biais dans le recuei: des souches n·a,ant été observé et plus de Il semble que la diminution des cas répertoriés en 1990, par rapport 1989, a
400 souches ayant été, par ia suite, reç~es en i 991. correspondent essentiellement à une baisse des formes périnatale''
( 11 D contre 200), le nombre de formes de l'adult€ évoluant peu i 196 conlre
Réparûtion géographique 21 5). 3 fois il n'a pas éte' possible, faute de renseignements, de classer le~
cas dans l'une des formes cliniques envisagées.
Ces souches ont été ad.essees de 21 des régions françaises et des D.O.M.-
T.O.M. Les régions les plus ;:-·e~plées ont fourni. cette année encore, le plus Souches d'origine alimentaire
grand nombre de so~ches.
Les 1 036 souches étudiées en 1 990 par le C.N L rendent comp:e des nore-
breux contrôles dont font l'objet les denrées alimen:aices dans notre pAys
Répartition mensuelle
Ne seront considérées ici que 900 souches, adressées après isolement à
La répartition mensJelle glo~ale des isolements se caractérise par le petit par.ir de produits destinés à la consommation humaine pourvues d'inforrn;, ..
r•ombre de cas observés pt>r::!ant les 4 derniers mois de l'année. 2 pics ont tions suffisantes quant à leur origine. Ces souches appartierment 4 esp,~· a
été observés, l'un en janvier ·.25 cas) l'autre culminant en juin (22 cas). La ces, leur distribution est la suivante : L. monocytogenes : 620 souch~;c
co~rbe de distribution des isolements diffère de celle observée en 1989 L. innocua : 233 souches, L. seeligeri: 22 souches, L. welshimert: 26 so• ··
(fig. 1). ches. L. monocytogenes et L. innocua demeurent les espèces les pluG ·;ri.
quemment rencontrées dans les denrées alimentaires, comme cela est âtJ,;::·
Répartition selon les formes cliniques observé dans les autres pays depuis de nombreuses années.
La listériose fœto-maternefle (f~;mmes enceintes et ·nouveau-nés) : 11 0 cas.
ANALYSE DES SËROVARS
Mères ou femmes enceintes 54 cas. Sang : 27. placenta : 47, prélèvement
vagir,al ou lochies : 11. Souches d'origine humaine
No~veau-nès: 56 cas. L.C.R.: 7, sang· 20, liquide gastrique. 42, méconium Les sérovars 1/2a, 1/2b et 4b constituent à eux seuls 95% des soue hec
ou selles : 18. La répartitior. selon le sexe est la suiq;nte . sexe masculin : isolées, les autres sérovars n'étant que rarement rencontrés eP pathologi'
4 7 °·b, seAe féminin : 53 Ofo. humaine. Une nette modification de la répartition des sérovars est observé~
en 1990 par rapport à 1989 et 1988 : diminution du nombre de 1/2a p8r
La listériose de l'enfant et de l'adulte : 1 96 cas. rapport à 1 988 et diminution du nombre de 4b par rapport à 198S.
L'inégale répartition des cas selon le sexe (sexe masculin : 62,5 0/o, sexe
féminin: 37,5 °'è·) est conforme à celle des années passees [1]. Les tableaux
cliniques se répartissent en méningites et méningo-encéphalites isolées • Ce:ntr& national de référence des Listeria. Laboratoire de bactériologie, U.f.R. r!s
mE:decine, 1, rue Gaston-Veil, 44035 Nantes Cedex et Centre national de référenr...:r~
(27 %), ou associées à des septicémies (14 %). et en septicémies isolées de l)'sotypie et de !ypage moléculaire des Listeria.
(51 Dio). Les terrains les plus souvent communiqués sont les cancers •• Département de bactériologie et de mycologie, Institut Pasteur. 25, rue d~e
(46 fois). les traitements immuno-suppresseurs (29 fois), l'éthylisme Docteur-Roux, 75015 Paris.
 - 371 -

Répartition géograph1que_ etes serovars CONCLUSION

La distribution géographi~ue des sérovars n'est pas homogène, variant L'analyse fine de l'épidémiologie de la listériose en France grâce à la dét&rmi-
d'une région à l'autre. L'al'l[lée 1990 se caractérise par une diminution nation conjointe du sérovar et du lysovar des souches responsables d'infec-
concEerr.ant la plupàrt des tègicins, du pourcen:age de cas humains dus à tions humaines est régulièrement effectuée depuis 1987. De net1es varia-
L. monocytogenes 4b. Parmi les regions ayant adressé au moins 10 souches tions dans la distribution des sérovars 1l2a et 4b ont été observées durant
au C.N L., seules Limousin, Alsace, Picardie et Rhône - Alpes, Haute-Nor- ces 4 années, alors que la proportion el le nombre de souches du sérovar
n-.andie et ile-de-France présent-ent des pourcentages de serovars 4b supé- 1/2b varient peu (tabl. 1 ). Il apparaît que :
rieurs à 50. - les années 1988 et 1 990 se caractérisent par un& diminution du pourcen-
tage des souches appartenant au sérovar 4b, 1988 se distinguant de 1990
Répartition mensuelle des sérovars par un plus grand nombre d'isolements de 1/2a (150 vs. 80) qui s'explique
par les bouffées causées par ce sérovar en 1988;
La répartition mensuelle du sérovar 4b correspond à la distribution générale - l'année 1989 se distingue de 1990 par un plus grand nombre de souches
avec des pics en janvier et juin et une nette diminution des cas au dernier 4b (2 66 vs. 1 53), différence liée là encore il des bouffées épidémiques pro-
trimestre. Cet effondrement des isolements de souches du sérovar 4b expli- voquées par ce sérovar [1,2]. les nombres de souches appartenant au séro-
que lrès vraisemblablement la baisse du nombre de cas enregistrés au der- var 1/2a sont voisins {84 vs 80);
nier trimestre de l'année 1 990. En ce qui concerne le sérovar 1/2a, les plus - la répartition et les nombres de souches des serovars 1!2a et 4b isolées
grands nombres d'isolements ont été enregistrés aux mois de mars, août, au cours des années 1987 et 1 989 sont semblables [ 1,2].
octobre et nevembre (en octobre et novembre, le sérovar 1/2a a représenté
plus de la mOitié des subcultures de L. monoC}1ogenes reçues) (fig. 1). Tableau 1
Répartition des sérovars de 556 souches de L. monocytogenes
Souches d'or'igine alimentaire. provenant de produits alimentaires
destinés à la consommation humaine
La répartition des sérovars deL. monocytogenes pour les produits carnés, les
laits e: les fromages est rapportée dans le tableau 1 Globalement 74 o,; des
souches cppartiennent au sérogroupe 1/2, contre seulement 17,5% au Sérovars de Produits carnés Laits Fromage:.1
monocytogenes ( 133 souches) (93 souches) (330 souches)
sérovar 4b. Le sE:rovar 1.12c est retrouvé dans 38 °tc des isolements prove-
nant de produits carnés. Les souches de L. monocytogenes, provenant de % Ofo %
produits végétaux (29 isolements) et piscicoles (30 isolements) appartien-
°
'.en: aux s~rovars du groupe 1:'2 et 4b dans respectivement 45 et 45 1c des 1:'2 im• . . . . . . . . . . . . . .
1/2 a . . . . . . . . , .... . 25,6
2,1
51,6
0,9
48,2
;J•od.,its végétaux et dans 71 et 10 °-t des produits piscicoles. Chez ces der-
niers un pourcentage élevé (1 9 %) du sérovar 3a a été observé. 1/2 b . . . . . . . . . . . 15 15 22::
1/2 c ............. . 37,6 0 4,t
1/2 ag .............. . 0 0 0,3
3 a ................ . 0 2,1 0,6
ANALYSE DES LYSOVARS 3 b ................ . 3 1.1 ~.9
3 c ............... .. 6 0 0,3
Souches d'origine humaine 4 b ................ . 12,8 26 17
4 c ........ . 0 0 0,3
6 5 °-é des so~ches de L. monocytogenes isolées chez l'homme en 1 990 ont 4 d . . . . . . . . . . . . . . . .. 0 2,1
/,té lysotypables, ce pourcen~age variant selon les sérovars (1/2a : 78 Ofo,
1, 2b: 36 Ole, 4b: 7 5 Die). Ces résultats corroborent ceux obtenus durant les 3 • 1.'2 im : 1/2 immobile.
dernières années L'analyse de ces données confirme sans ambiguïté celles
de la sérotypie, à savoir qu'aucune grande épidémie, comparable à celles En conclusion, l'année 1990, caractérisée par le plus faible nombre ti•o r ..o·, · :c;
observées durant l;; derr.ière décennie sur le continent nord-américain ou en listériose et !'a!:>sence de bouffées épidémiques, pourrait constrlt.er une
Suisse n'est apparue en France en 1990. Plus précisément encore. à la difté- année de référence con::ernant les cas sporadiques (nombre et répartition
re'lce des années précédentes aucune bouffée épidémique de 10 à 20 cas des sèrovars). Les sérovars 1... 2a et 4b apparaissent en conséquence comme
r,'é pu ft re net~ernent jr,dividuarisée, notamment durant le pic du printemps- des indicateurs essentiels pour la surveillance de la listériose humair1:!.
éte. Tout au plus, 17 souches de sérovar 4b non lysotypables ont-elles été
a
cbse"\·i,es en janvier (contre seulement 2 5 les autres mois), traduisant très Ces observations démontrent qu'il existe de grandes lluctGations dans l'epi-
dérr,iologie de la listériose humaine, ce qui justifie une surveillance cons~an:e
CEC:a;oement la fin du pic de l'automne 1989 [1 ]. Aucur. phagovar particulier
n'a donc significativEement émergé durant l'année 1990. Les souches des et at:en:ive. Nous remercions vivement tous les !:>rologistes qui, par 1cmvo:
l;·>c·,·ars respons;;bles des bouHées épidémiques précédemment notées en 'apide et régulier des souches qu'ils isolent, participent activemenl ;, l;:
1987, ~ 988 et 1989 [1,2] n'ont été retrouvées que sous forme de quelques sur,•eiliance de celle infection.
cas sporadiques disséminés sur plusieurs départements et dispersés sur
pl~sieurs mois. L'absence de pic épidémique objectivé& par les résullats de
BIBLIOGRAPHIE
la sérotypie el dE la lysotypiE des souches pourrait vraisemblablement expli- [1] ESPAZE E.P., ROCOURT J., COURTIEU A.L.- La listériose en Franc•} ,H'
q~er la diminution du nombre de souches é:udiées en 1 989. Afin de pallier 1989. Étude à partir des souches adressées au Centre national (1,·
fes difficultés d'interprétation de la tysotypie, rencontrées notamment avec référence. BEH.. n° 3,1991, p. 9-10.
1er souches nor, typa bles, des méthodes dE typage moléculaire seront dans [2] LE MAGNY F., REBIERE 1., ROCOURT J., HUBERT 8. - Li~d;·~t>;;­
l'a·.-Enir appliqJées aux souches deL. monocytogenes isolées lors de bouHées humaine: enquête épidémiologique dt deux épisodes épidémiques el'
E:pidémiques. France, en 1988 et 1989 B.EH., n° 38 1989, p. 1 62-16:!
 -372-

ANNEXE Ill:

Surveillance épidémiologique en France.

·REPUBLIQUE FRANÇAISE
NJ.NISTEIU~ MINl'GTERE MINlSTll:JUt
DE J.' ECONOMIE, E'!' DE L • AGRI CUJ}l'UIUï: DE LA SANTE ET DE
J>RR li'TNANCES l~'J' 1m LA 1~onwr l1' ACT lON HUMANITAl RE

Djrcction ~6n~rnlA Jl:i J"e>r.•'l iorr géné1•nl o Direction g6n6ralc

dA la c.onc:u rt'cl'l<:.·c~ d 0. 1 ' a J j ru<.~ nt n l ton de ln sant.é
do la consommation et
do la répression
des fl~a.udes

Le Nini.~LI·f~ de l'E:conoll)j(;, ct des l~ïnarlccs,

le t-linlsLro de l'Agl·icultm•e t:.•t de la Fol'êl
cL le Mlnislrc de IIi Santé eL da l'Action huma.nl.taiz.·e,

)bjet épidémie da Jfst.6riosc.

Dcpuif.l le lO mnl'~ dernier, nou~ UtH:iÎI>luug li une flambée ~p1d6mfquc dl!

listùriose or.cfJ~lonnéG par la rnômc souche de Listoria monoo)'togonas : sougJ•C?.
eo1•ov~u· 1b, lyoova.J• 23A!>/2-t25/32?-4/267l/47/I.00/340. ]Je nullll.JJ·~ ù~ t.:tll:l ~ignulés
à ce jour est d~:~ 14 7, dont 32 décès ct B avol'LCIOC!Ilts ; la. distl•lhulicm
gl-r.g,.tlphi··gw e~o:l ll•(!f; ]apgo : 57 d6}.Jâl·tomcrüo. L 1r!SCI1t. ca.uaal n 1n ).>U êt.rc mi&
on 6vldenee pour l'instant.

Une cellule de c1•is0 l'<'!unissant les L~·ois directcu).'S 'généz•aux de 16

sant.é. de l'alimenlat.ion, dn ln norH'.ll1'1't~t·wc, d& la co:n.~;ommalion ot dè 1.'1
)•épl'Osslon des ft•twdos assm•0 le ~uivi de J'épidémie ct cool•donne lc:s
invest!g&L!(ltll:; pour en déle1·rnhwl" l'or·ürine.

Dan~=: le Cl:ldl'o de ceLle épi.d6mic, un disposltlf l')art.iculie.l', faJ&:atd

inlervenh· los sOI•vices oxtél"l<~m·s de la san l.fl (DDASS), do la dil'ecUon g6néralt:
do l'a.limentalion (djJ'ocUons dos scJ•vlccs véLé1•inah•es) ct de la dh•oct..lon
géné1•a.l~ de la concm•renec!, d(! la consommation et de la J'61H·ession des
fl'audos, a été mis en pletce. '

CeUo note rapp~lln cc dispositif 1 que nous VOU$ d~mandons de

coordonnc1' 1 ot pr6ciso certains points.
 - 373-

1- La DDASS N:;t oho.rgôc dG J'cnqu<H.c sur chaque nouveau cas de

lJ.t.Jlél·!ol:le tJJgnal6.

Pour cela, il (;ou v h::oÙJ'U

- d'nlc:1;t-<~1· d(~ nouveau par un c~o'u'l'ier tou~ luo ltt.hontt..oh·cs d•analyse

btolc>gJqtw p)•Jv<'h~ de vot.J•c départ.ernt!lll. tlcs labol'aLoh.•os pLiolics ct hospH.aHc:rs
ont. 6~6 !r);())'lrH5~, f-'Ql' aiUGUPE:) en l~1u• demandant de eigna.les· )er; nouveaux l;tih'
de hsi6J.'lose a ln J)DASS, dos l'isolement d'une souche de List.ez•it.1
mnnn~.Vf.f>i/fHlAt.:. nnFI r.R.J;: J:l0111'1'11if.'nt. Ôll'c.> C.DIDJnliTI~CJU6e pal' t.6J6phon.c Ô, un
num61.•o l'é.!:Wl'\'6 à (:(!(. (!ffet, t'ai' ailleUl'Fl 1 t..out.e souc:hc de Lister/s.
monofJyiost~nos isolée ~ovra ~b·ü c~nvo:vl'\n Î'l. 1'lt·,Rti1.ut. P~~,:tr_'t..tt• de Pa 1•!s:, II<H'''ico
d~ lyF.:ot.ypie des LiF.:Lol'ia, pom• icicnt..lf~cotion compl~t..c do la souche i
- d'asl:mJ•eJ' \Hw J•elf.l.nce bi-hobdonwdah·r~ d~~ labot·nt.oli•es hospitallc:~,.
JJOtH' vél'lfiel' qu<-: tous !cr: Ctlt:; onl bl<m ét..é signalés aux services de la DDASS.

do réalis~l' l'enqu(.!t.c, qui consisLt!l'a :

* d'une PHl't
un lntel'J'og(~t.oil'f:t ùu patient sur seF:I habitudes
l~ll
fllintentail't.H·;, à l'alde dLI
quasLi(mnai.rc• envo~-é flUX DDASS a.u mois de .iuin
l'11ll(!flllon des médnoins ét.~:~ni appelée su1· la pJ•éc:islcw dorr: l'éponEïe~·
appo1·t.6es an co qui <!Oilccl'llC la. dél'I<HIIinat.ic.H1 dc~s. aJimcn1A; consommés, lcl!r
ntaJ·quo t!ummerclalc!, lem· prêscntAt..fon (préemballé ou 11 ÈI. la coupe'' ) 1 lo~
cool•donn6r~~J p1•éclacs du lieu d'achat, M!n d 10l'icntel' les il1vestlgat.ions dcb
deux 8lJLJ"'f~8 SCI'Vlt:OS COI'Wùl'tlé8 1

* ù'tnüJ•e Pa)'t, on uno infoJ'Illtlf.ion imll16diat.e des s0J•vkes vét.éJ•lnair<.•6

afin qua ceux-ni l'éaliscnt des pJ.•6U!lvcmcnts au dornici.IG dea malades, eL de 1.1·,
direcUou ù6par1.om<.mt.alo de ln concurl'(!)ncc, de la conf.;omma.l.ion cl de 111
t•P.pt•csaion des fl·audos poul' co qui. conec~J·bc los ]feux d'approvisionnement
dos mall\dc~:;,

Il irnp<"Jl'tc lllll~ lP.s r.:eJ•vtecs de lt'l lJD ..\SS demandent. au pat..lent.. ou à lii~e
pJ•oches de coru;ül'V<n' les o.limcl'lt.s présents danl:l le réfrigél.'atcm• du domicile
et a.it.h·tmt.. Po.t..L(.mlion des médecin~ tJ•aitauls sm• la nécossilô de catte
consm·vat.ion.

2- La dll'oct.ion dos servicos vétérinaires, dès que les sm~vJces de la

nPASS hd auront. comu\Lilliqué les 6Mmcnts néC(!Ssaires (nom ot adJ•cssc du
malade), cffectur~l'll dos prélèvements de .iQJ.l§ les alhncnts préseut,s dans le
t•6f'l•ig6t•ateur du malade c::t furu procédeJ' à leul' analyse. Dans la mesul'C du
pos~lble, elle vei1lcwa à. ce que soil J'éalis6e une estimation du nombt•e de
LfstcJ•itJ monoc,vt,oga-n~lii l'1'ét>t.HIL dnns l'alhtWllt ( <. ou > lOU/iC). l.es souc}ws
iaol6os sePoni aussitôt a.drc1ss6cs à PlnaLiiuL PasteUI' de Pa1.•is pout· lysot..ypftgc;
{1 CGt conseillé d 1Adl'èfi:SCl' \Ul llljiljiiiUJll dO !5 (;Q]Onics pal' l:llitnont pOSit.if,

3- IMll dt:rcot.ion d6part.emcmt.al~ de 1#1 concurrence, do la consommation et

do la réprossion dofl fraudes, lorsque les seJ•vkcs de la DDASS lui auront
tl•anflm!c, auil.c à 11cxplc)!U:ttion du LJUCI:>lLioruH~Jro des malades, la Hstc des
produits allrnenta.h•er-; ct les lieux dtach~l ht~bitt1els du mala.de, ttccornpagnés
d 1 uuo fdctltifioa<.iol'l du mR.lt:\dc conc\':'l'né, ''é~:tlh-mra sans délai düH préH~vemcnts
alimaJ."!la.iros (PB1) dans cos lieux d 1appt•ovlsionnemeni ct fora pJ•océdet• à des
d6t'lomlH•otncntr" d(: I,ist<'.•J'/I'l monoc\1-'togtJne~:; dans. ces aliments par les
labcl'at.oh~es h')ttn'l'éSionaux d<~ t-1tlssy, Rennes 1 l3ol•deaux. Montpellier. MaJ·~eille
ot Sb•o.ou()Ul'S 1 conf(wmémcl'd, aux inr:o!.J·uuUorll:l des 24 et. 26 juin de1•nter. Les
gm~dtêF.I iso16ns soi·onl immédiatement a.d1·c~~sécs à l'lnsiil.ut Paat.eLu· de Pal'iEl
pout• h•f.lot:.•pa~c, O. t•tdson de· 5 colonlcr:; p~cu· ~;tlimcnt poslt-ff, En pluhi des
infor•malions sm• l'fdenlil~ des l:>J'Oduits prél~vés (natu2·e, marquo, fahl•icant.,
t'l.um6J•o do loi.., da.tc llmit<:) 1 leB cnq1.1êtcurs devcunL r~cueJllfl' des dlérnanil:l ~lU'
lP.fl ch•cuit.s d 1a.ppl'ovfgionnemeni 1 sur leB condilionl:l de conseJ•va.tJon et. les
dêlaiG cl0 1'oi:.atlot1 de ccB pt•oduit.s dans les dlvr~rr:; luu.~utdlll.i ~:~ignal6s.'
 -374-

Pal' aillCUl'ôt il fllll'l()l+e (]LW, danf) celte eilttet.tion upiùéullquo, )e.!.

Pl'Ofcsslonnels intemdffont. les contl·ôles et val'lficalions auxquol.s ils sont ll'lt'll.t<&
en application de l'aJ•tlcJo ll-4 de 1a loi modifi6e du l.er aoiH. 100o el d(
l'al•ticle lei' de la loj rJ' 65-54~~ du 8 juHlot l965 modifi6c. A cette fin, r10us
demandons quns les direetclll'H dépal'tcmetllaux des set•vlc:nR vrH~l'inah•e.~~: ot dë
la dh•ectfon de la conctii'l'enc<.~, do la. con~ommalion ct.. de lu J.•épl'esafon de.li
r1•audês adJ.'essent une lett.re commune aux pJ•oduct.eut't:> et aux impol•latouJ•s ri(..
J:..ll'odt!H.. s alirn(mluires [J>J·oduits laiuc~)·B, pJ•oduils de charct~l.crio, viandes et
viand<:S hâchécs, J'll'oduits de satJI'h'lF-Jerle, pât.f~sel'i.es à la ct·èmo lndustl'icllc.>s
p1·oduit.s vég6t~:~u.x dits de J\'(.~ et de Vc gammer:t) 1 afin qu~~ cos opé1•atP.tH'6
fflssent par\'enh• à 1'lnstilul Past.oul' de Pat•is (Contre national de l'éfércncc
l">OtiJ' le lyc,wt:r·page- des LitsLudu) 28 l'UC du lJJ•, HOU», 'lfi724 Pa1•is Céde:x 11) -
téléphone : 45 68 83 31. ~ té1éfax : 45 ûB 89 53, poUl' une J.dcnt.ifJcaUon pl'édac.•.
Loutct,. ~m•~hl'? do J.Jst.e1•ùl moJloo,,•iogonef:i qui a.m·u élé hsoléo dans lo cadre de
lr.HIJ:'s contrôles. Vou.s trouveJ'~Y.. cu atuwxc ]1'.1. Jcltl'c-t,~·pc qu'i1 convient de leur
ad1•esr.:~1', -
En outl'e, les r.:eJ•vioes. cornpP.l.Ant.~.; p1•oc:édo1'ont au 1·ctL•tlft clc la
corH.:ornnHtlion des alimt.~nt.s otl das Jot.s d'alhncnls dans les ch·cuits de
Pl'Odudion, d 1import.at.ion et de dlslrlbution, }Ol'BQUl'! ~~~-~ nP.m•ér~s tn•6sent<wont.
uno cont.am!t&aticm o.véré~ ptu· J,ùr;ic:ria mcmocytogencs.

Enfin, compte-tchu de cotte sH.. uaiion épidémique, il vous est demandé de

fa.h•o en BOl:'Le que, dans cbo.cun des 3 sm•vjcos dépuriementa.ux concm·nés, soit
assut·,~c dut·uni cotte P'h·iodc de vacances llne pcJ•ma.nencc 11a1• une pc1.•sonne
comp6tenle on hygiène Alhnentail'e. 8n m~t.ro, vous vous a.ssut·ere~ que sc
tienne )•ogulièt•emG-nt. une nhudon de cor.; 3 sm•v1<:el:l 1 soit sous vot~·e · aUlol'iLé,
soii dh•P.ctement ct1ire eu~, afin de faiN~ le point su1· l'invesUga.tion des
nouv"'RI.IX cae ; cha.oun d'eux adl'c51':>cra. à tSuu mlnisièro de t.Ut..ella un bilan
descriptif,

Nous vous remeJ•ciohs de veille l' à une st.l'ict..o applic-ation d<~ ces
hu:tJ•uctions, donl la miao en plfl.r.r. 0~( itnm6dlat.~.

llOLU'le Ollt11Btl'P. pout• le ministl•c

de l'économie P.t de la st:~.ni6 et de
d~s flmmucs J'acUon ·humanitaire.,

1-------
Le Directeur Général de la
;;..~·~-

7e"n·Pnrncofs GTR ARJ>

 -375-

MlNlSTERE DE LA SANTE ET DB L1 AOTlON HUMANITAIRE

LABORATOIRE NATIONAL DE LA SANTE - DIRECTION OENERALE DE LA SANTE

( DOSS~ER MEDICA~ J
LISTERIOSE NON MATERNO·NEONATALE

NOM Pt•énom : Date de na1.ssance : _!_/_ Sexe

Dato dos p~omio~s signes cliniques d'infection à L1ster1a : ___ ! ___! __

P~éciser ces signes :

Date d 1 hoepitnlisat:f.on 1 _/_/_

Terrain
EthyH.smo (_) Hépatopathie (_) laquelle
Diabète {_) Insulinodépendant (__ )
Cancev, h~mopathia maligno {__ ) préciser :

Transplantation {__ ) laquelle : Data : __ !_/_

Hâmodialyso ( __ )

Autre lmmunodépl'Gss:l.on (_) laquelle :

Traitement immunodopl'oseour ou corticothérapie dans les 3 mois avant Je début de

la maladie ?
OUI (__ ) NON (__ ) Si OUI, lequel :

f.Qt"Jjlt; eHn1.gue de listériose

Septicémie ( __ ) Mlm:!.ng.ito (__) Mêningoencéphalite (_)
localiséee (_) où :

Sites de .E_rêlèvement pos~.tifs à Listcria monocyt.ogenes:

LOR (___ ) Hêmocul ture (
-) Autre ( ) pt•éc~.B91'

Dato du premier prélèvement positif à Listcria monocytogenes . 1 1

SérovBl' : Lysotype :

Evolution Décès ( __ ) dale : _!_!_ Inconnu (_)

S6quollo~ ( __ ) pvêoisor !
 -376-
MlNISTERE DE LA SANTE ET DE L'ACTION HUMANITAIRE
J.AAORATOIRE: NATIONAL DE LA SANTE . . DIRECTrON GENERALE DE LA SANTE

LISTERIOSE MATERNO·NEONATALE
MER~ ~u FEMMME ENCIUNTE

NOM Prénom Dato da naissance : _/_/_ Sexe

Y-n-t-11 eu dee eign~r:J. ul:luiquoa 6voquanL une infection ? OUI (_) NON (_)
Si OUI. date des promi~rs signes cliniques : _/__ / __
Pr6ciao~ ces signoo t

Data des dernières r6gles 1 _/_/_

Data de l'accouchement ou de l'avortement t _!_!_

S.f.l.es de p1·6lèvement poe~ t:l.i' à Listeria 111onocytogonos r

H6moculture (_) Placentn (_) Loch~es (_) Vagin (_)
Autres (__ ) pr6oisev:
Date du Pl'emior Pl'61èvement pos.:l. t~ f à Liataria monocytogen~s : _l_l_
Sérovar 1 l&sot~pe :

NOUVEAU .. NE
NOM 1 Dato de naissance : __ /_/__ Sexe :

Accouchomont vivant (__ _) Mort•n€J (_) Avortement (__ )

Tot'&ne (nombre de somll:lnos d'aménorrhée) Po~ds do naissance

Etat de aant~é pendant la aeiUaino de vie :

JJ:t·~miêt·e
Pns do manifestations cl..:l.n~.quos (_) Syndro~no infectieux (_)
Syndrome ~6ning6 ( ) Aut~oo aignes ( __ ) l9squ~l~ '

Sites de prâlôvomonts positifs A Listeria monocytogonos

Hémoculture (_,.) L.O.R (_) L, amniotique (_} L. gastz-lqua (_)
Prélèvements p6riphêriquas {__ ) lesquels t
Autros (__ ) préciser :
Dnte du premier prélêvomont positif A l"istoria monocytogenos __! __ !__
Sérovar 1 ~sotypo :

Rvol ut::f.nn J Décès (__ ) date: _l _l_ Ouér~ son (. .) lnconnuo (_)
S6quelles (__ ) p~éciser :
 -377-
Ministère de la Santé ct de. /!Action Humanitaire
Laboratoire National de la Sam~ Epld~mlologfc, J rue Lncre.telle., 75015 PARIS Té/:(1) 48 28 28 69
Dlrcctlot~ Générale de la Sant4 Bur~au JC, 1 place Fontetwy~ 75007 PARIS Tél:(l) 46 62 45 50

QUESTIONNAIRE LISTERIA , ENQUETE CAS-TEMOIN

MALADE C..> TEMOINU Date du questionnaire : _ 1_/._

Pour les témoins, référencos du malade sur lequel il est apparié :

NOM: Date d'isolement : ~ !_/_ Age : Sexe:
~-~------------------------~-~~~~~---------------------------~---~~~~~~-~---·
NOM: Prénom: Age: Sexe:

Département du domicJle : Terrain favorisant Jlimmunodéprcssion:

T616phono; Profession :

Quç8tioumdre compl~té: T616phonc U Courrier U Hôpital U Domicile U

Hôpital : Service : Téléphone:
Nom de l'enqu~tcur : Coordonn6es :
Prélbvcmcnts dans Réfrigérateur du Malade : dcmand6s U effectués(_)

·Avez-vous prJs récemment des médicamentn contre les maux d 1cstomac 1 OUJU NONU
Si OUI, lcsquols : ......... *.............................. .
Avez-vous pris des laxatifs depuis 2 moJs ? OUlU NONU Quand :
Avez-vous eu récemment de la fièvre U, une diarrhée U ?
Avez-vous effectué un séjour hors de votre département ? OUlU NONU Si OUI, Ucu: .............. ..
Date: ..../.... /.... Durée :.................. -. •.... ~ ..
--------------------- .. -····- .
ALIMENTATION PENDANT LE MOJS PRECEDANT LA DA1'E D ISOLEMENT
. 1
. ... ·- ····-·-

Avez-vous pris des repas en dehors de chez vous? OUI U NON U

Si OUI~ ob et ft6quenoo ..................................................................................... -... ---···-···-·····
................ .
illll.llltlltllt6111 ltltlelt41tltftllltllttltt l t l l t t l l t t t l lot t t l 1 t lllt 11 til t f • ~ 1 Ill Il ... Il til l i l l l i t t Il t t Il t t t l t l l t t l t l l t t l tttlllttlllf4 1' t • • • • •••t 41 •1 t Ilot- Il. l i 6t l t t l t t Il t • t t t t l l t l t t l i t

Daus quels établissements effectuez-vous régullèrentent. vos achats?

Ornm1cs surfaces U J..csqucllcs (nom ct locallt6)7 : .......................................... ..
Epiceries U Marché U Traiteur U Chaîne& nsurgclés" U

, ___
CIIARCUTERIE-POJSSONS-VIANDES
Consommation"' Conditionnement• MDtQmL Lieu d'achat
PATÉ (PROOSBZ lA vAlUtrrfi) 1

RILLBTIBS
CHIPOLATAS
CHAIR A SAUCISSE
SAUCISSES 1ypo STRASBOURG
c:'.Onsomméos aprèR cuiRRon U froides U
SAUMON FUME
AutreG POISSONS FUMES 1
Cl-lAIR DB CRABE, SURIMl 1
JAMUQN$tt~~< 1

rtfréquc.nce ,• 0 jamais1 1:<1 foi.v/t.•cm, 2.·> 1 foJ.r:fsem

ttt:pour le condlti01mement, Indiquer l'initiale: Pré-(E)mballé, d ltl (C)oupe~ (F)abrication maison
•n Sl à Ja Coupe, P•·(;clscz (I,)a·é-tra.uché à l'étal, (T)nmc.bé devant vous
-·---- -··---·-----·-·----·----·- ·~ ---·· ------- ~~--- -- ------ ---------~-- -- ------
 - 378-

STEACK HACHE fréqucnc.c:_ Heu d'achat:

=--------:-
de: Boeuf W de Cheval U A~hct6 Congelé U En barquettes U Hlich6 devant vous U
Consomm6 ; Saignant U A point U Très cuit (__)

POULET fréquence:_
PouJol entier U Poulet en morceaux ( culssc~> ou ailes ) U
Vous est-il arrivé de consommer le poulet un peu rosé? OUI U NON L)
OEUFS fréquence:_ consomm~tt crus U à 1~ coque U sur le plat U
pochés U omelette(. ) autre (. _) précJscz: ........... ..
Ueu d'acl1at :...... ~····~···············
, EAU EMBOUTEIJ.J,F.F. 011T (_) NON U Marque:

PRODUITS 4KME GAMM~ (Salade épluch~ prete à l'emploi; Carottes, Choux, C61cri ct Autres Crudit~
Jap6cs, Cll sachet. prêtc.~ à l'emploi) ouru NONU Sf oui, Marque!_ _ _~--------
.-
PLATS PREPARES (rayon charcuterie des supermarchés ou traiteur) ouru NON(__)
Si ouf, Lieu d'achat: -------~---------

PATISSEIUES INDUSTRIELLES I..csquc)lcs? ... ,....................... ''" .............. ,................. .

fréquence:_ Lieu d'achat: ........................... ..

PRODUITS LAITIERS
Consommation• Conditionnement Marquc(s) ot Lieu d'achat si cliff. habHttc.l

lAIT
LAIT CRU
CREMB FRAICHE
consommée crue
FROMAOES BlANCS
YOGHOURTS
DESSERTS à base de lait

•fréquence : 0 jamais, 1: <.1 fols/sem, 2: > 1 fois/sem

FROMAGES
Jamais U rarement U
1 fois/sem U 3-4 fois/scn1 U tous les jours ( )
Mangez-vous les fromages: peu fait U moyennement fait U très fait U
Mangez-vous la croate do certains fromages? OUIU NONU
Lieu d'achat habJtuel :

Pouvez-vous cocher les fromages que vous vous souvenc?: avoir consomm6s dans le mois préœdant la maladk
CAMEMBERT U au lait pasteurisé (7~11 Frs) U au lait cru (12-20 Frs) U
Entourer les MARQUES consommées 1
Lanquetot Lcpetit · Vall6c Isigny sainte mère Le RusUque Charles VU ~seure
Chatelain Président Coeur de Lion Coeur de Nonnandic Paqucrcucs Bortrafld Le Médiéval
Ligueil Donbonmtc-Normnnd Bride) Le Racé Gault ct MUJau Le Saint Normand l.c Gille
L'Dtcndarà Nomumd Grand Terroir Marque spécifique au magasin (ex: FORZA à J>risunic), précisez: .......... .

Atatres marques: ................ ,, .... 1

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , , , , , , , • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 -379-
FROMAGES (sultc)
T'our le conditiotmctnctJ~ indiquer l'~'tltlfllo: (B)oite, Pré-(E)mballé., à la (C)oupc, (R)apé.
FJ'I.quenc(! : Ojamaf.~~ 1:<1/ois/se.mJ 2:> 1 fois/scm1

Consommatjon Conditionnement. Mal'qm..,Licu d•achat si diff. habituel, C"roOtc consommé-t:

BRIE
SAINT-MARCELLIN
C'APRICR DR&;; DTRUX
SAINT-AI..BRBY
MUNSTER
VACIŒRIN
ORUYBRB~BMMnNTI-IAL _
G. RAPR RN SACHET
.PARMESAN
COMTE
BEAUFORT

RJ.RU D'AUVERGNE
BLEU DES CAUSSES
FOURME D'AMBERT
FOURME MONTBRISON 1
BLEU DB DRESSE 1
ROQUEFORT 1 _ ......
GOUDA
EDAM
BONBBL
MfMOI..BTTB
SAINT-PAULIN
TOME DE SAVOIE
PYRENEBS
COULOMMIERS
PONT J.'RVEQUE
CANTAL
CHAOURCE
MAROILLES
OOURSAULT
LIVAROT
SAINT-NECTAIRE
REBLOCHON
I{ACLE'ITB
I'OURB DB VAUDJER
MORRJRR

CHEVRE ~ 1 --~-------~-------
!:JREBIS _ )
rROMAOBS FONDUS __ 1

~UTRBS FROMAGES ou préparation en contenant :

REMARQUES
 -380-

ANNEXE IV:

Epidémie de 1992.

ÉPIDÉMIE DE LISTÉRIOSES EN FRANCE

A. LEPOUTRE *, C. MOYSE·. C. ROURE*, J. ROCOURT··. V. GOULET···. A.-L. COURTIEU ••••

Entre le 18 mars 1 992 et le 22 juin 1992, 90 souches de Listeria mono- Les médecins cliniciens ou biologistes qui auraient connaissance de cas de
cytogenes sérovar 4 B et lysovar 2389/2425/3274/2671/4 7/108/340 ont listérioses sont invités a le signaler :
été identifiées au sein des souches humaines adressées au Centre national - à la D.D.A.S.S. de leur département;
de référence des Listeria (fig. 1 ). Ces souches ont toutes le même sérovar - à la D.G.S., Bureau des maladies transmissibles, Dr A. Lepautre.
4 8.11 s'agit d'une augmentation anormalement élevée de ces souches, puis- Tél. : (1) 46 62 45 50;
que seulement 1 5 souches de ce type avaient été enregistrées chaque année - au Laboratoire national de la Santé, Dr V. Goulet.
entre 1987 et 1990. Dans l'état actuel des connaissances, il s'agit de la plus Tél. : (1) 48 28 28 69.
importante bouffée épidémique enregistrée en France depuis 1987.
Enfin, les souches doivent être envoyées au Centre national de références
Cette épidémie se caractérise par une proportion relativement faible de cas des Listeria, Laboratoire de bactériologie de la Faculté de médecine de
fœto-maternels : 29%, habituellement les cas fœto-maternels représentent Nantes ('"'').
la moitié des formes cliniques). Ces listérioses ont entraîné 20 décès dont
1 7 adultes et 3 nouveau-nés, et 5 avortements.
La répartition géographique des cas est assez large, 42 départements étant
pour l'instant impliqués (carte 1 ).
PRÉVENTION DE LA LISTÉRIOSE D'ORIGINE ALIMENTAIRE
Ce lysovar particulier a déjà été incriminé dans des phénomènes épidé-
Particulièrement pour les personnes à risque
miques:
(femmes enceintes, personnes âgées ou immunodéprimées)
en Suisse (1983-1987), épidémie due au vacherin Mont d'Or;
- en Californie (1 985). épidémie due à un fromage de type mexicain; Q) Eviter les fromages à pâte molle ou persillée et les bleus ; ne pas en consommer
- au Danemark (1987), origine alimentaire non identifiée. la croûte.
Bien que ce lysovar ait été impliqué à 3 reprises dans des phénomènes épi- Œ> Cuire soigneusement les aliments d'origine animale.
démiques le niveau de sa virulence est varié.
@ Laver soigneusement les légumes crus et les herbes aromatiques.
D'un point de vue analytique, la concentration des cas dans le temps, et dans
une moindre mesure dans l'espace, et le fait que les souches soient toutes du @) Éviter la consommation de lait cru {non pasteurisé) ou d'aliments au lait cru.
même lysovar suggèrent fortement une origine alimentaire commune. Les ® Les restes alimentaires ou les plats cuisinés devraient être réchauffés soigneu·
aliments les plus souvent incriminés dans l'apparition d'épidémies de listé- sement avant consommation.
rioses d'origine alimentaire sont les fromages à pâte molle, en particulier les ® Conserver les viandes non cuites séparément des légumes et des aliments cuits ou
fromages au lait cru, les pâtés et rillettes, la viande hachée et les produits de prêts à être consommés.
la quatrième gamme (légumes crus prêts à l'emploi et vendus sous vide).
([) Se laver les mains. nettoyer couteaux et planches à découper après la manipulation
L'enquête alimentaire des cas signalés par le C.N.R. a été entreprise, d'aliments non cuits.
58 patients ont été interrogés. Les témoins appariés sur une pathologie
sous-jacente éventuelle, l'âge et le lieu d'habitation, sont interrogés dans un
deuxième temps. Des recherches microbiologiques sur les aliments conser-
vés dans le réfrigérateur des cas récents ont également été entreprises.
L'importance de cette bouffée épidémique et la gravité de la listériose (la
létalité de l'affection est de 22% à 33 %) incitent à tout mettre en œuvre D.G.S., Bureau des maladies transmissibles.
Centre national de référence de lysotypies des Lister/a, Institut Pasteur, Paris.
pour stopper cette épidémie, d'une part en insistant sur les règles hygiène- Laboratoire national de la Santé, Unité épidémiologie.
diététiques (cf. recommandations ci-jointes), en particulier auprès des per- C.N.R. des Listeria, Laboratoire de bactériologie, Faculté de médecine. Hôtel-
sonnes a risque, d'autre part en améliorant le recensement des cas. Dieu, place Alexis-Ricordeau, 44035 Nantes Cedex.

Répartition géographique des souches épidémiques Distribution hebdomadaire des souches épidémiques
adressées au CNR (15/3-22/6) de L. monocytogènes
Nb de soucfles

Hol'tbrl! de souches 10 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

n
: :~
•
'1
2 - 3
4 - 6
12 -

.'
'-

• ,.
~ ~ 8

• ,l...
2.

J1 J3 JS F2 F4
J:1 J4 M2 A2 .M A!S/M1U2 113 M4 MS Jl J2
FI F3 Ml M3 Al A3

•: donnée• provisoires
 -381 -

L'ÉPIDÉMIE DE LISTÉRIOSE EN FRANCE

(SITUATION AU 13 AOÛT 1992 [D.G.S.-L.N.S.-C.N.R.])

A cette date. 173 malades ont été recenses chez lesquels la souche épidé- Figure 2. - Distribution hebdomadaire des cas de listériose
mJologique deL. monocytogenes a ete isolée. On compte a ce jour 55 cas de [Lysovar épidémique] (L.N.S .. 1 3 août 1992)
forme materna-néonatale, soit 32 Ofo, les autres cas etant des formes non
materna-néonatales. 40 déces ont été signalés dont 5 nouveau-nés.
1 2 avortements ont été notifiés.
Parmi les 118 cas de forme non materna-néonatale on a retrouvé 73 fois la
not1on d'un terrain favorisant l'immunodépression.

-
Le tableau suivant donne la répartition en fonct1on de l'âge (précisé dans
117 cas) et l'existence ou non d'une immunodépression.

Classe d'âge 1-64 ans > 64 ans Total

, ' l
r
~

_L.l.ulll :hl1Ill.~--
Nombre de cas total . 58 59 117 - 1 1

Deces 12 (20,7 °rol 23 (39,0 %) 35 (29,9 %)

'--=---•=--.
Cas avec terrain tavonsant .. 36 37 73
Deces .... 11 (30.6 %1 17 145,9 o/o) 28 (38.4 %)

Cas sans terram favorisant. .... 22 22 44

Decès 1 ~4.5 0;0) 6 (27,3 Oro) 7 (15,9%)

La distribution mensuelle des cas de listériose epidemique est présentée

dans la figure 1, avec une référence au nombre total de cas adressés au Cen-
tre de reference pour la lysotypie. Figure 3. - Répartition géographique des cas épidémiques
( 1 5 mars - 13 aoùt 1992)

F1gure 1. Distribution mensuelle des cas de listériose

(1 0 août 1992) LHS u1oen2
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~: 2~ 3
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1?/
'"'
'/; ~,:

M R !·1 R m:-: s
Source lnstttut Pasteur.

La f1gure 2 montre la distribution hebdomadaire des formes épidémiques Plus dr 1 000 prelevements al1menta~res ont été réalisés par les D.S.V. entre
materne-néonatales et autres. le 29 juin et le 28 juillet 1992; 1 500 établissements de produits laitiers sont
contrôles regulierement et 400 autres l'ont été depuis le début de l'épidémie.

Enfin. on trouvera une répartition géographique des cas de listériose épidé- A la date du 4 août. les d~rect1ons de la Répression des fraudes avaient déja
mique par département (fig. 3); à noter un prem1er cas épidémique en Gua- prélevé et examiné 650 échantillons alimentaires provenant des magasms
deloupe. où se fourntssent habituellement les malades.
L'angine de l'épidémie n'a pu encore étre mise en évidence. mais la multipli-
cation des prélèvements devrait aboutir â des orientations plus prèctses.
L'enquéte se poursuit, en etroite collaboration avec les services concernés :
Il semblerait que nous assJstJons a une diminution du nombre de cas décla-
- au niveau central : D.G.S. et L.N.S., Direction générale de l'Alimentation et
rés chaque semaine; cependant, il convient d'étre vigilants. Rappelons l'im-
Direction générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répres-
portance de s1gnaler immédiatement à la D.D.A.S.S. du département tout
sion des fraudes; nouveau cas identifié par les services de bactériologie et d'adresser en
- sur le terrain : D.D.A.S.S., Directions des services vétérinaires et de la urgence les souches pour lysotyp1e à l'Institut Pasteur de Paris, seule certi-
Répression des fraudes. tude du caractère épidémique.
La m1se en place dans chaque département d'une cellule d'interventiOn
Les services de l'Institut Pasteur assurent les analyses bactériologiques regroupant les services des trots ministères concernés et placée sous l'auto-
(:ysotypie) des prélèvements humains et alimentaires (après isolement par nié du préfet, montre. s'il en était besoin, l'intérét que portent les pouvoirs
les laboratoires regionaux, pour les prelevements alimentaires). publics à identifier l'origine de cette épidémie.
 -382-

Ministère de la Santé et de l'Action Humanitaire

Laboratoire National de la Santé
UF Epidémiologie
· 1 rue. Lacretelle 75015 Paris
48 28 28 69

FLAMBEE DE LISTERIOSE EN FRANCE

Situation au 20 août 1.992

NOMBRE DE MALADES ( souche·épfdémique) : 182 depuis le 18 mars 1992

dont Forme materne-néonatale 55 (31 %)

Autres cas 125 (69 %)
Non précisé 2

DISTRIBUTION MENSIJEIJ,E DES CAS: mars- .. 7cas

(1 "non précisé") avril : 33 cas
mal :53 cas
JUin : 43 cas
juillet : 30 cas
août : 15 cas

selon la forme : MATERNO-NEO AUTRES

(2 "non précisé")
MARS 2 5
AVRIL 7 26
MAI 14 39
ru rN 18 25
JUIL 13 17
AOUT 1 13

DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DES CAS : 67 départements concernés

dont 1 DOM (Guadeloupe)
 -383-

EQRME MATERNO-NEONAIALE: 55 cas concernant 58 foetus ou pQUV~:U:-:Ii~S

· (3 grosse$Se'S gémellaires) ·:. ·.· :~.·· ,:.... ··.,..>

5 décès + 12 avortements.

AllTRES....E.O. : 125 cas dont 74 cas pour lesquels îl existe la notion d'un terrain
favorisant l'immunodépression

39 DECES (31 %).

62 MENINGITES ou MENINGOENCEPHALITES
(souche isolée dans le liquide céphalo-rachidien)

Répartition selon l'âge et l'existence ou non d'une immunodQ1-1ressjon

' ' '
connue :

Classe d'âge 1-64 ans > 64 ans Tot ar

~lb total de c:as 58 59

D~ds 16 (27,6%) 23 (39,0%)

Cas avec terrain 36 37 '73' '

D&:ès 1.5 (41,7%) 17 (45,9%) 32 (43,8%)

Cas sans terrain 22 22 44

Décès 1 (4,5%) 6 (27,3%) 7 (15,9%)

ENQUETE CAStrEMOlNS :

Nombre de questionnaires "alimentaires" de malades (souche épidémique) reçus : 128

Nombre de questionnaires appariés (1 cas/2 témoins): 81
 DlSTRJBUTJON HEBDOMADAIRE DES CAS I;)E USTERIOSE (Lysovar épidémique}

18 LNS 20100/92
J,.

16
m3 Autres forrnes
14
• Formes Malerno-néonala/es

12

10 w
OJ
_f!,.

0+---~

.1- 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 . 22 23 24 25 . 26 Zl 28 29 30 31 32 33
janvler février mars avril mai juin juillet août
 -385-

L'ÉPIDÉMIE DE LISTÉRIOSE EN FRANCE

Situation au 10 septembre 1 992 (D.G.S. - L.N.S. - C.N.R.)
élepuis le 13 aoüt 1 992. da:e du dernier point présenté dans le B.E.H. LE DISPOSITIF D'INVESTIGATION
(n° 33. 1992). 43 nouveaux cas de listérioses dus è la même souche de Lis-
:eria monocyte-genes (même séro·:ar 4 B e! même lysovar) on~ été recensés. Depuis le mois de juin 1992. "ne investigation épidémiologique et bactério-
a
Cela porte 216 le nombre de cas connus depuis le 18 mars '1992, et situe logique a été mise er· p:ace, pour :e,lter de retrouver l'arigine de cette E:;:>idé-
l'eprd&,..,ie acluelle ~la troisième place des èprsodes épidémiques de listé- mie. L'identité de la souche bactérienne d'un patient à l'autre et l'augmenta-
:-ioses d'origine alimen!aire, décrits dans la li~téraL.Jre Le nc.mbn; de cas inci- :ion rapide dans Je a~mps du nombre de cas. pl&ident for:err:en~ en faveLJi
dents qu1 semblait dirr,i!"luer au debut du mois d'août a réaug:-nenté depuis; d'une ongine alimen!aire comrnune a J'er.sembje des cas Lë ~ërge ~epar,d,on
''ép,df:.m1e es:t toujours évolu!ivt: oc~"Jellernent ~f!g. 1 ). Ces cas de :istéïioses des cas sur le t&rntoîre a conduit :·ensemble de:s rr.ëdee~r.s de san~é f)'Jbliq~e
c!:Jes à !a même souche de L:Steria monocvrogenes :-eprésentent 43 °~ de des D.D.A.S S . des serJices vét&rinaires et des se.'\·rces dt: :a répress;oc de~
!'e~së~-ble des cas de !isteri:;ses recensés en:re le 18 mars et le 10 sep- fraudes à paniciper a ~·enquête.
t~-:1bre 1 992. Le dispos1t1f est le suivant :
1. - Distribution hebdomadaire
~'ïgure - les bacté;iolog,stes sigr.alent les cas au mE'decir de la D O.A S S., dès
des cas de listériose (lysovar épidémiqué) l'isolement d'une Lis:eria monOC)~ogenes. et envoient la souche pour lyso:y-
L.N S. 10-09-1992 {semaine 3_7) page a l'institut Pasteur de Paris;
- le r:-rédeci~ de D.D.A S.S. réalise l'enqc;ête cas-témoins sur les habitudes
alimentaires en utilisant un queStlonr.ai,.E adâpté a l'é;::;idémle act·welle. La
" D.D.A.S.S. prévient égëlement les services vétérinaires ,O.S v.:
e: les servi-
" ces de la répression des ~r<udes !D.D.C.C.R.F.);
- ceux-ci réalisent des prélèvements, au domicile de ~-aiade pour la D.SV .•
et dans les rr:agasins d'alimentation où Je r..alade effec;ue habi~vellement
ses achats. pour la rèpressior. des fra~des. Ces prelèvemër.ts sont realisés le
plus ';;pider.,ent pcss1ble à partir du srgr.ëlement des cas. afin d'augmenter
les :~·-ances de retrcuver un eliment con!aminé.
L'investigatior. des cas est faite avant la confirmatior, par lïrstitu~ Pas!eur de
la ~a:ure é::'rd&.-nrque ou nor. de la souche. Le résultat du tyrage de la bac-
; J + ' 1 • t 1 IC " 'l' '' '' '1 ·~ •1 T. 1' Z = 1• ~ ~ r 2'1 2S X 3' Xl l1 loO JI »
térie est commc:nique seconcairement a
la D.D.A.S.S.
,....._. •...ni lU"'· ~..c .oUI --""!~

:Jirec~sment ou indirec!t?:T•ent ces cas de lis~&~iose ont entraîné 50 décès. LE POINT SUR LES INVESTIGATIONS
~ déci:-s et 13 ëvortements parmi les formes .~a~erno-néonatales. 45 décès
:.hez f'58'"Jite. Les fvïmes rr.aterno- nÉ-ona!ales représer.!ent 31 o.c. des cas L 'enquëte cas-té.rnoins
jepc;is le début de l'épid~mie. Parmi les cas adultes. 9C (60 D·é) avaient un
8rr&;n favorisënt J'imrTl~nodé;::ressîon. a
À !'heure actc;elle (9 se~:e,..bre). le ou !es ;:>roduits l'origir.e de la contam:-
na!;on n'ont pas été re~roi.Jvês, rr:ais les ~ésul~ats de l'ee~q...rê!e perme:1en·~
73 C::-partE-:r.ents dont fa GuaCelc-...;pe, ont eu au moins un cas de listériose
déjà d'o·ien:er les re:herches.
;;:-ide"'iq~e depuis le 18 !T.ars bien qu'il n'y ait pas de regroupement spatial
:~air des cas, certaines régicns comme la rÉgion Rhône- Alpt;s, ~'Alsace, et le L'analyse des questionr.arres de l'enquête ces-téfTloins ;plüs des 3.'4 de<:
jmo·..;sin ont une incidence partic~tièrement élevée (fig. 2). pet•ents ont été interrogés actuellement) ne met pas en é,·idence de
d1Hérence significative de consomrnatior. alimer~aire entre les pa~ients et les
FigJre 2. - Incidence des cas de listériose de souche épidémique témoins, /'enquête alirr.en~aire pe~me! cependant de constater qJe seuls
(au 3 septembre 1 992) certains produits, tels que le jambon cwit, sont con&cmmés par plus de 50%

-
des malades.
inc.id, /J ~illien Plusieurs hypothèses permettraient d'e>pliquer l'absence de di7férenc''
observée en~re les patients et les ~émoins :
o. 0 - z D - le produit fait partie des aliments pour lesquels les patien:s ne savent po;;
2.! - 4 CJ
4.1
1.1
- '
!1.1
Z7ZI préciser les marques consommées (un camembert ou un pâté à la coupe par
exemple), dans ce cas les résultats de l'analyse sont biaisés car le question-
naire ne mesure pas réellement l'exposition au risque;
- plusieurs produits différents sont à l'origine des contaminations des
patients. Dans ce cas il existe probablement un lien entre ces ditféren~~
produits. Le point commun entre ditfé.rents aliments peut être un produic·
adjuvant (emballage, gelée ... ) qui se retrouve dans plusieurs alime~ts dil1{.-

û
rents. il peu: être une contamination croisée des aliments dans les rayons ~
la coupe des rr.agesins. une introductioc de le souche épidémique chez pk-
sieurs producteurs à partir d'un point commun. Toutes ces hypotheses sont
possibles. et c'est l'analyse minutreuse des résultats des enquêtes rnicroblo-
... loç;iques qui permettra d'en retenir certaines plutôt que d'autres .

Les pri:lèvem~nts bactér;o!ogiques

Les prélèvements réalisés au domrcile des rnalades n'ont permis de retrouver
la souche épidémique que dans 1 seul cas. Il s'agissait d'un patient c::;:

)nsornmait tout les matins du jambon cuit fabriqué par un pet1t producteur mr~ee par la souche épidémique de Listeria monocvtogenes. Il s'agissait de
cal. Ce jambon distribué localement ne peut pas être à l'origine de la conta- ~-rodu•tS de cr.arcuterre pour la plupart (pàlé, ,ambon C.Jit) mars auSSI de
ination des autres cas épidémiques L'entreprise a néanrnoins été fermée. fr(>ma-ges.
H ailleurs les services vétérrnaires ont effectue des prélèvements systéma- Ces pr.:•dûit> de provenance différer,te on1 èté retrouvés contarr.1cés par la
;ues dans les rntreprises productrrces de frornage et de charcuterie (B.E.H. souche epidemique dans 5 rayons de vente La cor.tamication croiséé de ces
33. 1992). Bien que la présence de Listt:ria monoC)1ogenes ait été retrou- a:m1EP~S lors de leur manipula!1on dans le rr.ag:asin t-st ~~c,t.at;!e .::u mc.1ns
,e dans près de 10 °t des entceprises. 5 souches de Listeria provenant de ~~ur .J'"'·E pë:tle des produits Ces pre:mie:rs rèst.:l~ats s'1/s r.e per:'""·ë~~ent pas
produits cilférents, sur 695 (0.7 °'ol. apparter.aient a la souche épidé- de pre"dre de~. mesures d'ir.terd1C~1on vis·il-~··rs d'un pr~·duit cr.~ cor.d~lt a
ique. Cet:e proportion est iderr!ique celle qur était observée dans les a réaliser .Jn€ serie dE: p~élèvements chez IE:S f;:;brican~s des prodJI!S oU une
.nées precE'dentes pour cette mtme souche de Listeria monocytogenes. souche de Liste:iâ éptdf:m1que a été retrouvee Les prerr•ers résuf~ats com~
~s 5 souches provenaient de 3 fromages différents qui n'étaient distribués muniq...~es par les services vétérinaires sont nega~lfs, mais toutes les ar.alyses
re localement. n'ont pas encore été réalisées actuellement.
s ar.al 1•ses réalisées à la distribution (1 400 prélèvements et 965 analyses Les précautions alimentaires (B.E.H n° 33_. 1 992) des:inées aux ferr-rnes en-
alisées) sur les produits habituellement consommés par les malades ont ceintes. aux patients immunodeprimes et aux pecsonnes âgees sor.t toujours
rmis de retrouver une Listeria monocytogenes dans 231 prélèvements c'actualite. De plus il faùt recomrrander d'é\•ite' les prod ..lits de c~.arcuterie
4 D.é des prélèvements analysés). Une trentaine de produits était conta- consommés sans cuisson et achetés à la coupe, y compris le jâr.bon cuit.
 -386-

ÉPIDÉMIE DE LISTÉRIOSE EN FRANCE

Bilan final et résultats de l'enquête épidémiologique
V. GOULET", A. LEPOUTRE**, J. ROCOURT"**, A..-L. COURTIEu····, P. DEHAUMONT·····, P. VEJr•• ...

1. INTRODUCTION [D.G.A.L.]). Les médecins des D.D.A.S.S. étaient chargés de mener une
enquête cas-témoins, les vétérinaires des D.S.V. d'effectuer des prélève-
Fin mai 1992, le Centre national de référence de lysotypie des Listeria (insti- ments a1; niveau des réfrigérateurs des malades et les agents D.D.C.C.R.F.
tut Pasteur) a détecté une augmentation anormale de cas humains causée d'effectuer les prélèvements au niveau de la distribution dans les établisse-
par une souche unique de Listeria monocytogenes (sérotype 4b, lysovar ments ou s'approvisionnaient les malades. Parallèlement, la D.G.A.L. et la
2389/2425/327 4/26 71/4 7/1 08/340). Des que l'épidémie a été confirmée, D.G.C.C.R.F. avaient demande de renforcer les contrôles dans les entreprises
les pouvoirs publics ont alerté le corps médical en leur recommandant de dif- de production et de distribution.
fuser les mesures de prévention pour les personnes à risque (B.E.H. n° 25).
Les données sur cette épidémie ainsi que les recommandations ont été Figure 2. - Épidémie de listériose en Francè
périodiquement réactualisées (B.EH. nos 33 et 38). Incidence par million d'habitants

2. ENQUÊTE ÉPIDÉMIOLOGIQUE 02102/!J

2.1. Description de l'épidémie HULLE D

< Z.l cas/H 0
Du 18 mars au 23 décembre 1992,279 cas de listériose dus à cette souche 2.,·5 cu/11 ~
épidémique ont été identifiés en France. Ces cas représentent 41,5 % de 5.1-1.5 c"/M lnilJ
1.6-10 cu/M (JJ]]
l'ensemble des cas de listérioses humaines recensés sur la même période 10.1-13.8 c u / H -
alors que cette souche n'était responsable que de quelques cas sporadiques
antérieurement (2 à 9% selon les années). Depuis le mois de septembre, le
nombre de cas a diminué régulièrement (fig. 1). Seuls 2 cas ont été identifiés
en décembre. Depuis le 1er janvier 1993, aucun cas n'a été recensé. L'épidé-
mie semble donc terminée.

Figure 1. - Épidémie de listériose : distribution hebdomadaire des cas

(lysovar épidémique)

18 -
i
16 -
,,...:
1

12 ~

10 l Étape
1
+

.
8
i L'objectif de l'enquête cas-témoin était de rechercher une association entre
6 T
la consommation d'un aliment et la maladie. Pour chaque malade, 2 témoins
"
1
étaient appariés sur le terrain (grossesse, cancer, diabète ... ), le lieu d'habita-
1
tion, l'âge, et le sexe. Ne disposant pas d'emblée d'éléments d'orientation, le
2 + champ d'investigation était très large. Le questionnaire a été élaboré en pre-
1
nant en compte tous les produits pouvant être le véhicule de cette épidémie
Jan.92 fév jutl1 juiJ août s.ect oct déc Jan.93 c'est-à-dire essentiellement les produits laitiers et carnés. 228 malades ont
été interrogés (soit 82 %) et 324 témoins. L'interrogatoire n'a pu être mené
Dans 92 cas (33 %), il s'agissait d'une femme enceinte ou d'un nouveau-né. auprès de certains malades dans le coma ou décédés. Pour la plupart des
22 femmes ont eu un avortement. Sur les 73 nouveau-nés (3 grossesses produits, il a été impossible de connaître les marques achetées par les
gémellaires). 7 sont décédés, soit un taux de létalité de 9,6 %. malades.
Parmi les 187 autres cas (5 enfants et 182 adultes), 61 %avait une patholo- L'enquête a été complète dans 144 cas (interrogatoire du malade et de
gie sous-jacente connue. Des signes de méningite ont été signalés pour 2 témoins). Les taux de consommation de ces 144 malades ne différant pas
53% des cas. La létalité a été beaucoup plus forte chez les malades fragilisés de ceux obtenus chez les 228 malades, l'analyse statistique a été effectuée
(36 %i que chez les autres ( 18 %). Au total, cette épidémie aura entraîné sur ces 144 triplets (ta bi. 1 ). Elle n'a pu identifier, de faç:on significative, d'ali-
directement ou indirectement 63 décès et 22 avortements. ments consommés plus fréquemment par les malades que les témoins. Tou-
Les cas étaient répartis dans 79 départements métropolitains (fig. 2) avec tefois, la proportion de personnes ayant consommé de la charcuterie était
une prédominance dans les régions Limousin, Alsace et Rhône- Alpes. Cette
dispersion des cas a compliqué l'enquête et a nécessité la mise en place d'un
Réseau de Santé publique lhôpilal national de Saint-Maurice.
dispositif exceptionnel. •• Direct1on générale de la Santë.
Institut Pasteur (Paris).
2.2. Enquête cas-témoin Faculté de médecine (Nantes). \
Direction générale de !'alimentation.
Le dispositif était basé sur la collaboration des services extérieurs de Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la
3 ministères (Santé [D.G.S.], Consommation [D.G.C.C.R.F.], Agriculture répression des fraudes.
 -387-

Tableau 1. - Enquête cas-témoin 1 stade de la distribution. Les souches de Listeria monocytogenes isolées à
partir des prélèvements de langue de porc en gelée ont le même profil
Analyse statistique (cas appariés) génomique que 93 % des souches humaines du lysovar épidémique.
Au cours de l'enquête, la souche épidémique a été isolée sur différents ali-
Malades Témoins M1ntai-Hznzel ments vendus dans un même rayon de vente à la coupe ainsi que sur des
n= 144 n = 288 p ustensiles servant à trancher ces produits. Ceci suggère la possibilité de
contamination croisée entre différents produits vendus dans le même rayon.
o/o o/o
Les malades ont donc pu se contaminer en ingérant soit des produits conta-
Charcuterie .. . ... . . .. 97,9 94,8 0,26 minés à la production, soit des produits secondairement contaminés lors de
Charcuterie à la coupe . . . . . . .. 89,5 84,7 0,17 manipulation à la distribution.
Pâte . . . . . . . . ... . . . . . .. 63,2 54,2 0,07
Rillettes. . . . ... .. 26,6 27.1 0,91 3. MESURES DE PRÉVENTION MISES EN ŒUVRE DANS LE CADRE
Jambon. . . . .. . . .. 92,3 90,6 0,56 DE CElTE ÉPIDÉMIE

Fromage . . . . ... 93,8 94,1 0,58 Des recommandations d'hygiène alimentaire tenant compte des résultats de
Pâte molle, croûte fleurie. .. 70,1 80,9 0,02 cette investigation ont été diffusées, à plusieurs reprises, à l'attention des
Pàte molle, croûte lavée .... .. 21,5 26,4 0.26 consommateurs à risque. De la même façon, les organisations profession-
Pâte pressée non cuite . . .. .. 42,4 38,5 0,44 nelles des différents secteurs de la production et de la distribution ont été
Pâta pressée cuite. . . . .. 79,2 82,6 0,38 alertés sur le risque « Listeria » et sur la nécessité de le prendre en compte
Pâte persillée . . . . .. .. 43,8 51,0 0,15 dans le cadre de leurs auto-contrôles. Ainsi, plus de 2 000 établissements
laitiers et plus de 1 000 établissements de charcuterie ont fait l'objet d'in-
plus élevée chez les malades que chez les témoins alors que les témoins vestigations poussées (révision des plans d'hygiène, validation des procédés
étaient plus fréquemment des consommateurs de fromage. Les résultats de de fabrication). Les D.D.C.C.R.F. ont opéré 800 interventions dans les centres
cette enquête cas-témoin n'ont pas permis d'incriminer un aliment particu- de distribution. À cette occasion, les bonnes pratiques d'hygiène dans les
lier mais ont permis d'orienter l'enquête vers les produits de charcuterie. rayons à la coupe ont été rappelées aux responsables des magasins.

Étape 2 4. CONCLUSION
La souche épidémique a été isolée dans plusieurs aliments prélevés à la Malgré la dispersion géographique de l'épidémie, l'alerte a pu être donnée
distribution. Il s'agissait principalement de produits de charcuterie vendus à grâce à la sensibilié du système de surveillance. Cela a permis aux pouvoirs
la coupe. Devant les résultats de l'enquête cas-témoin et ceux de l'enquête publics de mettre rapidement au point un dispositif d'investigation et
microbiologique, un nouvel interrogatoire des cas et des témoins a été d'émettre des recommandations auprès de la population à risque. Grâce à la
effectué. mobilisation des différents partenaires en particulier (es médecins de
Un interrogatoire, basé sur une liste détaillée de tous les produits de charcu- D.D.A.S.S., les vétérinaires des D.S.V. et les agents des D.D.C.C.R.F ..
terie pouvant être tranchés à l'étal, a été mené chez 140 malades et l'enquête a pu aboutir à la maîtrise de cette épidémie. L'enquête cas-témoin
164 témoins. Le pourcentage de malades consommant de la langue en gelée a montré son efficacité en identifiant un produit suspect d'être à l'origine de
(46,5 %) était significativement plus élevé que celui des témoins (8,4 %). près de la moitié des cas de cette épidémie. Les prélèvements effectués dans
L'association épidémiologique entre listériose et consommation de langue des magasins identifiés par l'interrogatoire des malades ont été décisifs dans
de porc en gelée, est élevée (Odds ratio: 9,2; I.C.: 3,8-22.4). Cette associa- cette enquête. En repérant les produits contaminés à la distribution, ils ont
tion est plus forte dans le groupe des femmes enceintes (tabl. 2). L'analyse perm.is de prendre des mesures à la production. Ces mesures ont dû être
des résultats au cours du temps met en évidence une association entre déterminantes puisque depuis leur mi~e en œuvre, l'épidémie s'est arrêtée.
consommation de langue en gelée et infection avec la souche épidémique de Pour éviter qu'une telle situation ne se reproduise et pour limiter les cas spo-
Listeria monocytogenes pendant toute la durée de l'épidémie. radiques, il faut que le « risque Lister/a" soit pris en compte par les produc-
teurs de façon permanente en mettant en place au sein de leur entreprise des
Tableau 2. - Enquête cas-témoin 2 systèmes de contrôle efficaces. Les distributeurs doivent veiller à ce que
l'hygiène des rayons à la coupe soit revue en tenant compte du risque de
Analyse stratifilie selon la forme de listériose contamination croisée. Le consommateur doit lui aussi veiller à respecter
quelques règles d'hygiène élémentaire en évitant la contamination des ali-
langue de porc Man toi· Odds ratio ments entre eux dans le réfrigérateur et en évitant de conserver longtemps
en gelée Hznzel avec appariement des aliments qui seront consommés sans recuisson ultérieure. Même en
dehors d'un contexte épidémique, le risque de listériose sporadique
Malades Tâmoins p O.R. I.C. demeure, aussi il est souhaitable que les personnes à risque continuent de
suivre ies recommandations émises par le ministère de la Santé (tabl. 3).
N o/o N %
Forme maternelle/néonatale .... 60 60.0 82 6.1 < 0.00001 16.8 (3,8-73.7) Tableau 3. - Recommandations pour la prévention
Autres formes : des cas de listériose chez les femmes enceintes,
Total . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 37.5 82 11.0 < 0.0001 5 (1.6·15.9) les patients immunodéprimés et les personnes âgées
Sans pathologie saus-jacente . ... 44 50.0 52 9,6 < 0.0001 9.5 (2.1·45.01
Avec pathologie sous-jacente . ... 36 22.2 30 13.3 0.35 1.4 (0.2·1 0.01
• Pour les achats de produits de charcuterie consommés en l'état {pâté,
rillettes. produits an gelée. jambon ... ) preferer las produits preamballes
2.3. Prélèvements alimentaires aux produits vendus a
la coupe; si ces produits sont achetés a la coupe,
ils devront être consommés rapidement après leur achat.
Dans le cadre de cette investigation, plus de 1 2 000 souches de Usteria • Êviter la consommation de lait cru et de produits a base de lait cru.
monocytogenes ont été isolées dans les aliments. Toutes ces souches ont été • Cuire soigneusement les aliments crus d'origine animale.
adressées à l'Institut Pasteur pour lysotypie. 203 aliments contaminés par le
• Laver soigneusement les légumes crus et les herbes aromatiques.
lysovar épidémique ont été ainsi identifiés. Il s'agissait principalement de
jambons, pâtés, produits en gelée et de quelques fromages. Une sensibilisa- • Les restes alimentaires et les plats cuisinés doivent ëtre r8chauHâs
soigneusement avant consommation immediate.
tion de l'ensemble des professionnels concernés (producteurs et distribu-
• Conserver les aliments crus (viande, IBgumes, etc.) séparément des
teurs) a été réalisée à plusieurs reprises au cours de l'enquête. Une investiga-
aliments cuits. ou prêts à être consommés.
tion a été faite chez tous les fabricants de produits où la souche épidémique
• Se laver les mains. nettoyer les ustensiles de cuisine après la manipulation
a été retrouvée. Dans ces établissements, les procédés de fabrication ont été d'aliments non cuits.
revus et des mesures de désinfection ont été prises.
• Nettoyer fréquemment (2 fois par mois), et dêsinfecter ensuite avec
La langue de porc en gelée faisait partie des produits contaminés par la de l'eau javellisée votre réfrigérateur.
souche du lysovar épidémique, avec un niveau de contamination élevé au
 -388-

ANNEXE V:

Identification sérologique des Listeria.

DOMAINE D'UTILISATION
Les sérums anti-Listeria 0 Types 1, 4 et Poly sont recommandés
pour 1 'identification de Listeria monocytogenes par la technique
d'agglutination sur lame et en tube.
Les anticorps fluorescents Listeria Poly sont utilisés en
technique directe d'immunofluorescence, pour 1 'identification de
Listeria monocytogenes, de sérotypes 1 ou 4. Ces conjugués
permettent la détection des Listeria dans 98% des cas.
RESUME/PRINCIPE OU TEST
Dès 1910, Helphers pensait que L.monocytogenes pouvait être
pathogène pour 1 'animal [1]. En 1924, Murray, Webb et Swann [2]
confirmèrent cette observation. En 1929, Nyfeldt isola
L.monocytogenes chez 1 'homme et la listériose est encore
considérée comme la dernière infection humaine reconnue [3]. De
nombreuses infections à Listeria étaient alors attribuées à
d'autres microorganismes. Des échantillons contenant Listeria
monocytogenes étaient souvent considérés comme négatifs et quand
une croissance était observée, elle était, en général, attribuée
à des contaminants du laboratoire.

Gray [4] constata que, chez 1 'animal comme chez l'homme, les
listérioses se manifestaient sous différentes formes, telles que
les méningites, les septicémies, les bactériémies, les
avortements, les endocardites et les conjonctivites. Winn, Cherry
et King [5] notèrent une augmentation du nombre de cas de
listérioses recensés, simultanément à la mise en évidence de la
pathogénicité potentielle de L.monocytogenes. Selon Hood [6], i 1
est important que les laboratoires restent vigilants concernant
ces infections.
"
Les Listeria sont de petits bacilles mobiles, à Gram positif,
asporulés et non~capsulés. Leur mobilité est plus prononcée à
+20"C. Ce sont des germes microaérophiles qui par conséquent, se
développent mieux sous une tension réduite en oxygène. Listeria
monocytogenes a été retrouvée chez la plupart des animaux à sang
chaud (domestiques ou sauvages), 1ors d'états infectieux ou
asymptomatiques. Les Listeria sont largement répandues dans la
nature [7]. L'identification des Lister-ia repose sur leur
isolement, leur caractérisation biochimique suivie d'une
confirmation sérologique.
 -389-

Il existe 4 types connus de Listeria monocytogenes, numérotés de

1 à 4, suivant les antigènes somatiques. L'analyse sérologique
effectuée par Gray [4] aux USA indiqua que 32,8% des
L.monocytogenes étaient du type 1, 65,3% du type 4 et que les
types 2 et 3 représentaient moins de 1%.
La culture des Listeria est souvent délicate et lente, surtout
lors d'un isolement primaire. Des isolements directs réalisés à
partir d'un échantillon positif, peuvent parfois échouer. La
croissance peut être facilitée après une pré- incubation à 4'C.
Cette technique requiert plusieurs semaines, voire plusieurs
mois, avec des repiquages hebdomadaires ou mensuels, avant
d'obtenir une culture positive. Cependant, la gravité de la
Listériose nécessite une identification rapide du germe. Pour
cela, la technique directe par immunofluorescence est
particulièrement intéressante. Des frottis réalisés à partir du
liquide céphalorachidien ou des tissus, peuvent être examinés
directement grâce à cette technique. De plus, elle permet de
détecter directement les micro-organismes non-viables ou de
mettre en évidence des germes à partir d'un échantillon dont la
culture est impossible.
REACTIFS
Test en tube et test rapide sur lame:
-Les sérums anti-Listeria 0 Types 1,4 et Poly sont des
antiglobulines de lapin, de titre élevé, stables et
déshydratées. Ils ont été préparés selon la méthode recommandée
par Gray [8) et Eveland [9].
Les sérums anti-Listeria 0 Types 1 et 4 sont spécifiques de ces
sérotypes tandis que le Poly contient les agglutinines des
sérotypes 1 et 4 de Listeria monocytogenes.
Pour réhydrater les antisérums, ajouter 1 ml d'eau distillée
stérile dans chaque flacon et agiter doucement par rotation
jusqu'à dissolution complète. Conservés entre 2 et s·c, ils
sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur
l'étiquette.
- Les antigènes Listeria 0 Types 1 et 4, pour tests en tube ou
sur lame, sont des suspensions de Listeria monocytogenes, de
sérotypes correspondants, ajustées au pH et à la densité
recommandés [10]. Ils sont utilisés comme contrOles positifs
pour le test en tube ou pour le test rapide sur lame.
- Le tampon déshydraté IF pH 7,2 est un tampon phosphate dont le
pH est égal à 7,2. Réhydraté, il est utilisé pour préparer une
suspension de l'antigène.
Pour réhydrater le tampon, additionner le contenu d'un flacon
de 10 g à 1 litre d'eau distillée ou le contenu d'un flacon de
100 g à 10 litres d'eau distillée. Agiter jusqu'à dissolution
complète. Conserver le tampon réhydraté entre 2 et s·c. Ne pas
utiliser une solution trouble ou contaminée.
 -390-

Technique directe d'Immunofluorescence:

- Les anticorps fluorescents Listeria Poly sont des
antiglobulines Listeria de lapin, stables, déshydratées, de
titre élevé et conjuguées à la fluoresceïne, comme recommandé
par Eveland [11 ,12]. Conservés entre 2 et a·c, les anticorps, à
1 'état déshydraté, sont stables jusqu'à la date d'expiration
indiquée sur 1 'étiquette.
Pour réhydrater les anticorps conjugués, ajouter 5 ml d'eau
distillée stérile dans chaque flacon et agiter doucement
jusqu'à dissolution complète. Conserver entre 2 et a·c. Les
anticorps sont prêts à 1 'emploi et ne nécessitent aucune
dilution.
- L'anti-globuline fluorescente de lapin est utilisée comme
contrôle dans la technique directe d'immunofluorescence. Ce
conjugué permet de détecter le marquage non spécifique
de microorganismes tels que Staphylococcus.
Pour réhydrater ce conjugué, ajouter 5 ml d'eau distillée dans
un flacon et agiter doucement jusqu'à dissolution complète.
Préparer seulement la quantité suffisante d'anti-globulines
nécessaire pour une journée.
- Tampon déshydraté IF pH 7,2 voir paragraphe précédent.
- Le Milieu de montage est un réactif à gradient de glycérine
standardisé, de pH 7,2. Conservé entre 15 et 30"C, celui-ci
reste stable jusqu'à la date d'expiration indiquée sur
l'étiquette.
PRECAUTIONS
Usage in vitro
L'utilisateur doit être familiarisé avec les techniques d'immune-
fluorescence. Pour plus d'informations sur les avantages et les
inconvénients de la technique d'immonofluorescence, sur les
différentes techniques de marquage et sur les précautions
générales à prendre, demander la Fiche INFO 0173 "Méthode
d'immunofluorescence".
 -391 -

PREPARATION DES ECHANTILLONS

Le schéma suivant montre les méthodes d'iso 1ement et
d'identification des Listeria.

MODE D'ISOlEMENT DE LISTERIA MONOCYTOGENES 1

Echantillons cliniques

Tissus Liquide Ecouvi lion

1
·U
Faire macérer dans
un bouillon tryptosé

Test directe IF Inoculer Conserver 1e reste

Bouillon ou gélose tryptosé de l'échantillon A 4°C
Gélose McBride Listeria
Incuber 24 heures A 37°C. Si la culture est
Observer les colonies négative. ré-ensemencer
bleues-vertes. A l'aide d'un périodiquement. tous
microscope ou d'une loupe les deux ou trois mois.
binoculaire et faire une
nouvelle culture sur une gélose
tryptosée.
Tests de fermentation dans un
bouillon au Rouge de Phénol
+ 0, 11 du sucre A tester
Faire une étude sérologique
 -392-

Après l'isolement des Listeria, il est préférable de réaliser des

tests biochimiques, en suivant le protocole type indiqué
ci-dessous [10].

Fer-mentation en Fermentation plus Pas de

24-48 heures avec tardive ou négative fermentation
production de gaz

glucose arabinose dulcitol

lévulose galactose inositol
maltose glycérol inuline
salacine sorbitol mannitol
tréhalose saccharose raffinose

Nitrate Catalase +
M.R. généralement + Gélatine -
VP + Amidon
Indole - Uréase

Macrotechnique en tube
1. Réaliser une culture de l'échantillon à tester dans un
bouillon ou sur une gélose tryptosée.
2. Faire une suspension du m1croorganisme à tester dans du tampon
déshydraté IF pH 7,2 réhydraté et contenant 0,3% de
formaldéhyde.
3. Ajuster à une densité approchant celle d'une solution de
Sulfate de Barium standardisée n"3 de McFarland.
Technique rapide sur lame
1. Réaliser une culture de 1 'échantillon à tester dans un
bouillon ou sur une gélose tryptosée.
2. Faire une suspension du microorganisme à tester dans du tampon
déshydraté IF pH 7,2.
3. Chauffer cette suspension à ao·c au bain-marie pendant 1
heure. ·
4. Centrifuger la suspension et éliminer grossièrement le
surnageant.
5. Remettre en suspension les microorganismes dans le
surnageant résiduel.
 -393-

TECHNIQUE D'AGGLUTINATION EN TUBE OU SUR LAME

A) Macrotechnigue en tube
Matériel fourni
-Sérums anti-Listeria 0 Types 1,4 et Poly
- Ant1gènes Listeria 0 Types 1 et 4 (pour test en tube)
- Tampon déshydraté IF pH 7,2
Matériel nécessaire mais non fourni
- Tubes de Kahn et portoir
- Pipette sérologique
- Bain-marie à 50"C
- Réfrigérateur 2-a·c
Technique
1. Préparer une rangée de 9 tubes sérologiques de Kahn. sur un
portoir, pour chacune des suspensions à tester. Ajouter 0,9 ml
de tampon contenant du formaldéhyde, dans le premier tube et
0,5 ml dans les autres tubes. A 1 'aide d'une pipette de 1 ml,
ajouter dans le premier tube 0,1 ml de sérum anti-Listeria 0
Types 1,4 ou Poly réhydraté et mélanger doucement. Transférer
0,5 ml du tube 1 dans . le tube 2 et mélanger doucement.
Procéder de la même façon jusqu'au tube 8 et jeter les 0,5 ml
prélevés du tube 8 après avoir mélangé. Le tube 9 sert de
contrôle négatif.
2. Ajouter 0,5 ml de la suspension d'antigène (échantillon ou
contrôle) dans les 9 tubes et agiter le oortoir pour bien
mélanger. Après addition de l'antigène, les dilutions finales
de 1 'antisérum vont du 1/20 au 1/2560, du tube au tube 8
respectivement.
3. Incuber dans un bain-marie à 50"C pendant 2 heures. Laisser
les tubes toute une nuit au réfrigérateur entre 2 et 8'C.
4. Relever les résultats comme suit:
4+ 100% de cellules agglutinées
3+ 75% de cellules agglutinées
2+ 50% de cellules agglutinées
1+ 25% de cellules agglutinées
0% de cellules agglutinées
Contrôle
Contrôle positif Antigène Listeria 0 avec l'antisérum
correspondant.
Contrôle négatif 1 tube contenant du tampon phosphate réhydraté
avec une suspension du microorganisme à
tester (tube 9).
Pour la méthode, se référer au chapitre précédent: "Technique".
 -394-

Résultats
Le contrôle négatif (tube 9) ne doit pas donner d'agglutination.
Dans le cas contraire, 1 'antigène n'est pas satisfaisant. Avec le
sérum anti-Listéria 0, aucune agglutination ne doit être observée
pour des dilutions supérieures au 1/640.
B) Test rapide sur lame
Matériel fourni
- Sérums Anti-Listeria 0 Types 1,4 et Poly
-Antigènes Listeria 0 Types 1 et 4 (pour test sur lame)
-Tampon déshydraté IF pH 7,2
Matériel nécessaire mais non fourni
- Lame en verre
- Compte-gouttes
- Bain-marie à 80"C
Technique
1. Mélanger 1 goutte de la suspension de microorganismes chauffée
avec 1 goutte d'antisérum dilué au 1/20 dans une solution
saline, sur une lame en verre et agiter pendant 1 à 2 minutes
en exerçant un mouvement d'avant en arrière.
2. De même, mélanger sur une lame de verre, 1 goutte de la
suspension de bactéries avec 1 goutte de tampon contenant 0,3%
de formaldéhyde. Mélanger pendant 1 à 2 minutes. Lire
1 'agglutination.

ContrOle
Contrôle positif Sérum anti-Listeria 0 avec l'antigène
correspondant sur lame.
Contrôle négatif Tampon phosphate IF pH 7,2 contenant 0,3% de
formaldéhyde, avec 1 goutte de la suspension
de microorganismes.
Résultats
La suspension de bactéries dans le tampon ne doit pas donner
d'agglutination alors qu'avec l'antisérum correspondant, une
agglutination doit être observée.
TECHNIQUE DIRECTE D'IMMUNOFLUORESCENCE
La technique directe d'immunofluorescence peut se réaliser à
partir de frottis tissulaires, de cultures isolées, de liquide
céphalorachidien, ou de méconium.
Dans le cas d'un frottis tissulaire, il est recommandé de colorer
les lames avec du Noir d'Eriochrome.
 -395-

Matériel fourni
- Anticorps fluorescents Listeria 0 Poly
- Milieu de montage
- Tampon déshydraté IF pH 7,2
- Anti-globuline fluorescente de lapin
- Noir d'Eriochrome
Matériel nécessaire mais non fourni
- Lames de microscope
- Bâtonnets applicateurs
- Chambre humide
- Papier buvard
- Lamelles
- Microscope à fluorescence
Technigue
1. Préparer des frottis de 1 'échantillon sur une lame, ou
déposer une goutte de la culture mise en suspension dans du
tampon phosphate IF pH 7,2. Eviter d'utiliser une solution
sal1ne pour diluer les cultures de Listeria.
2. Laisser sécher à 1 'air libre.
3. Fixer le frottis, par immersion de la lame dans une solution
d'éthanol à 95%, pendant 1 minute.
4. Sur un frott1s réalisé à partir de l'échantillon et sur un
frottis réalisé à partir d'une souche connue, déposer
quelques gouttes d'anticorps conjugué.
5. AJouter plusieurs gouttes d'anti-globulines fluorescentes de
lapin sur un second frottis de l'échantillon.
6. Répartir le conjugué sur toute la surface du frottis à l'aide
d'un bâtonnet applicateur, sans abimer le frottis.
7. Incuber les lames 30 minutes à température ambiante, dans une
chambre humide. Pour quelques lames seulement, il est
poss1ble d'utiliser une boîte de Pétri contenant un papier
filtre humide et de retourner cette boîte sur les lames.
9. Eliminer l'excès de conjugué et immerger les lames dans du
tampon phosphate pendant 10 minutes, en renouvelant le tampon
2 fois. Rincer les lames dans l'eau distillée.
10. Sécher les lames doucement à 1 'aide d'un papier buvard.
Laisser sécher à 1 'air libre.
11. Ajouter une petite goutte de Milieu de montage au centre de
la zone marquée et poser la lamelle.
12. Examiner chaque frottis et noter l'intensité ou l'absence de
fluorescence.
Résultats
Une fluorescence importante doit être observée avec le contrôle
positif. Pour le frottis avec l'anti-globuline fluorescente de
lapin, la fluorescence observée doit être faible voire nulle.
Dans le cas de résultats ident1ques pour les contrôles positifs
et négatifs, le test est invalide car le marquage a été non
spécifique.
 -396-

Il est préférable de colorer l'échantillon au Noir d'Eriochrome,

si 1e marquage de cet échantillon par l'anti-globuline
fluorescente de lapin n'est pas interprétable en raison du bruit
de fond.

Technique de coloration en contraste

Il est recommandé de colorer en contraste, au Noir d'Eriochrome,
les frottis tissulaires marqués ou contenant des matières
étrangères en excès (Hall et Hansen [13] ).
Après addition de l'anticorps fluorescent Listeria sur le
frott~s. rincer la lame avec une solution de Noir d'Eriochrome
diluée au 1/10 et laisser colorer pendant 10 à 15 secondes.
Réaliser la dilution à l'aide du tampon phosphate. Cette solution
doit être utilisée le jour même. Eliminer l'excès de colorant,
sécher la lame, déposer une goutte de Milieu de montage et
déposer la lamelle. La lame est alors prête pour 1 'observation.
Les tissus et les matières étrangères sont colorés en rose-rouge
ce qui contraste avec la couleur jaune-verte de la fluorescence
spécifique.
LIMITES DE LA TECHNIQUE
Les techniques sérologiques utilisant les antisérums Listeria
pour l'identification de L.monocytogenes, permettent de mettre en
évidence 1 'agent étiologique de l'infection. Une identification
complète de la bactérie ne peut être faite sans prendre en compte
les caractéristiques morphologiques, sérologiques et
bioch1miques. La technique directe d'IF ne permet qu'une
:dentification présomptive de L.monocytogenes. Les résultats
obtenus par cette méthode doivent être confirmés par un isolement
à partir d'une culture pure et par une étude des caractères
b1och1miques.
REFERENCES

1 Svenk. Vet. Tidskr., 2:265,1911

2J. Path. & Bact., 29:407,1926
3 Gray, M.L. and Killinger, H.H., Ba ct. Revs., 30:309·
382,1966
"'Second Symposium on Listeric Infection, Montana
State Coll., 1962
SAnnals N.Y. Acad. Sei., 70:624,1958
'Am. J. Clin. Path., 28:18,1957
7 Paper presented APHA, 1961
8 Persona! Communication, 1963
~' Personal Communication, 1964
lo Listeriosis, Hafner Publ. Co., N .Y., 1961
u Paper presented APHA, 1963
11 Paper presented APHA, 1964
13 Zbl. Bakt. Para. lnf. & Hyg., 184:548,1962
 -397-

ANNEXE VI:

Listeria agglutinotest® Tetrakit.

PRESENTA110N DES REACTIFS

1• Flacon de 2 mt·d'anUgène quantité suffisante pour 50 réaction&. .

2. Flacon de 1 ml de aotullon adsorbe.ote (exttait antigénique de 8taphylocxx>cu&
aureua). ·
$. FlllCOn de 1 ml de sérum de contrôle positif.
4, Flflcon dv 1 ml de sérum de contrôle négatif.
5. Flacon de 30 rnl de &Oiutlon tampon à pH 8,2. A utlllser pout la dilution d88 sérums.

AVER'nSSEMENn Conserver à ·4+8 "C. Ne pas congeler. Avant l'emploi porter les
réactlfa à température ambiante (22-25 •C) et bien agiter rantlgètl'J pour obtenir une
suspen&îDn homogène.

A) METHODE QUALITATIVE

1. Mettre sur la lame une goutte du sérum à contr61er et une goutta d'amloène latex, ·.
2. Mélanger .-.vec un bAtonnet en bols et agiter tolgneusement la lame.
3. Si le aérum est positif, dan& le& 5 mlnutN Il hra ob&ervé un& agglutination.
<4. Pour la confirmation cie la positivité mettre sur la lame une goutte du sérum A
contrôler. àjouter une goutte de solution adaorbante (4ilxlralt antlg6nlqua de
&taphylococcua aureU$) et bien mélanger pendant 30 s&tAmdes. .
5. Ajouter une goutte d'antigène latex et continuer oomm• pour la réaction préc:édente.
6. Après 6 minutes lire le résultat en considérant qlUt;
a} Si après rad&Oiptlon on observe encore une agglutination évlderrte, le eérum l
contrOier PftUl 6tre con&ldefé positif spécifique pour la Uaterta;
b) Au contraire al aucune poslllvi16 n'eal djmontrée, l$ &érum doit •tre eiU&é
comme négatif.

B)M~EQUANnTA~VE

la lfK:hnique pour le tett quantitatif est ta même que pour le t$St qualitatif. tt l'exception
près que l'agglutination est faite il partir d'une série de dllulion du sérum. ··

INTERPRETATION DES RESULTAT$

L'Agglutlnotest Uaterla est constitué par une $Uapenslon atabillaée dt particules de

latex de polyatyrène jur leflquelle& sont ad&Otbés les détennlnanta •ntlgéf'llqU(ta le$
plus algnltk:attts du genre Llaterla c'eat-è-dùe le& antigènes 1, somatique (O) et
flagellaile (H) et 4. somatique (0) et flagellaire (H).
Un réaulhU po$ÎW tignlfie que Je IUjet poaùde un niveau significatif .d'anticorps antl
Usteria (corr&$p0ndanl à un tllre aup6rleur è 1 :160 dana la . .roagolutlnatlon an
éprowetttt); donc P~nl une ltlf8clion en cours. On CDnMilte àe conlllmer le
dl-.gnostic par une reohel'che &l'l culture.
Le rapport de litraa éMwés anu U.terla devrait ttre conu61é avec one tutptnlliOn .-
Sr..phyJocoocua iiiUreu. (1) (2) en répétant le tett IIP'è• une adlolpUôn prëltmlnalfe du
Sérum A contr61er.
Il est lntérHMnt de " rappeler que pendant la groueue 11nftlctlon par u.teria peut
paaaer ab5olument asymptomatique Jusqu'Il l'avonament ou avec uM gNtatton è
lerma au avec la n.-..noe d'un nouveau·n6 atteint de teptom6nlngl... DMa quelque&
cu d'avon.mont Oll a pu vraiment démontrar un Utre 61ovt d'antloorpe avec une
recherche en culture négative (3) m6me al souvent une telle r8CMrche donne dea
réau!UIIe potldta (4). . .
Vue '- poulbiHtt d'exécuter un tr.altm•nt IUltlbloUque et le rétabll...,....nt lrnm6dlat de
la poaaiblll*'. d'une groaene à terme, le déplat*Ue de& cas d'infection ~ devenir
rol.ltlnler (5).

818UOGRAPHIE

(1) Neter E., Angral H., Gorzynsld E.A., Proc.' SOc. Exp. BJol. Med. 105 131 1980.
(2) Seatiger H.P.R., Utlerlosa .cl 2 New York 1961 HafMr Publ. Co.
(3) Roat H.F., Paul H .• Seeliger H.P.A•• DeUUICh Med. Wachr 8319831958.
(4) R~ F., Roblnovlt% M., Toaf R., Krochlk N., u.ncet 1 1273 1980.
(S) Toal R., Krochlck R., RObinovîtz M., Lancet 2 482 1962
 -398-

ANNEXE VIl

Galerie APl 50 CH.

PRINCIPE

La galene APl 50 CH permet l'étude du métabolisme • Le coHret APl 50 CH (' 5 030 0) permet la realisation
des hydrates de carbone des m1croorgan1smes. Elle est de 10 tests. Il se compose de:
constituée de 50 m1crotubes APl comportant chacun une
zone d'anaérobiose (le tube), pour les études de fermen- - 10 galeries APl 50 CH
tation, et une zone d'aérobiose (la cupule), pour les - 10 boites d'incubation
études d'oxydation et d'assimilation. - 10 feuilles de résultats
- 1 notice technique APl 50 CH
Le prem1er tube. sans pnncipe actif, sert de témom néga-
tif. Les tubes suivants contiennent chacun une quantité
définie de substrat déshydraté. appartenant à la famille
• Pour utiliser les gal enes APISO CH, il est nécessaire de
des hydrates de carbone et dérivés (hétérosides. polyal- disposer de ·
cools, acides uraniques)
-Milleu d'inoculation
APl 50 CHE M.clium ( • 5 040 0),
Ces substrats peuvent être métabolisés par plusieurs APl 50 CHL M.clium ( • 5 041 0),
voies APl 50 CHS Medium (• 5 042 0),
APl 50 CHB M.clium ( • 5 043 0),
-L'ASSIMILATION se tradUit par une CROISSANCE du ou autre milieu adapté.
microorganiSme dans la CUPULE quand le substrat est -HuMe da poroft'ine ( • 7 010 0)
utilisé comme seule source de car.bone présente - Portolr à ompoul.. ( • 7 020 0)
-l'OXYDATION se traduit par un changement de COU- - Pipett.. Pasteur stiril .. ( • 9 756 0) ou
LEUR dans la CUPULE, dû à une production d'acide en PSipettas ( • 7 025 0)
aérobiose révélée par l'indicateur de pH du milieu - McFanand Standard ( • 7 090 0)
choisi - Ecouvllons stéril .. ( • 7 061 0)

-la FERMENTATION se tradUit par un changement de Plus le matériel de laboratoire

COULEUR dans le TUBE, dû à une production d'acide -étuve
en anaérobiose révélée par l'indicateur de pH du milieu -bec Bunsen
ChOISi
-crayon marqueur
-réfrigérateur(+ 2°C + 8°C)

NOTE La galene APl 50 CH peut être utilisée pour étudier

l'une de ces trois voies. Le milieu employé pour l'inocula-
CONSERVATION
tion de ces gal enes d01t être cho1s1 en fonct10n du méta-
bolisme étudié, et des exigences du groupe microbien Les galeries APl 50 CH se conservent à 2-8°C jusqu'à la
étudié date de péremption indiquée sur l'emballage.

MODE OPERATOIRE

VCIIf egalement la méthodologie recommandée pour

ut'''sat1on des m111eux APl 50 CHL Medium, APl 50 CHB
Medium. APl 50 CHE Medium, APl 50 CHS Medium

Préparation de l'inocutum.
3 Inoculation
• cu:t,ver le microorganisme sur un m1l1eu adapté a sa
Cf01SSance • Répart1r la suspension bacténenne à l'a1de d'une
• Ver1fler l<1 purete de la souche pipette stérile dans les 50 tubes de la galene en se
• Récolter cette culture par écouvtllonnage d'un milieu conformant aux précautions su1vantes
solide. ou par centnfugat1on d'un mllteu liQUide
• Preparer l'moculum dans le m1l1eu appropné - lncl1ner légèrement vers l'avant la boite d'mcuba-
tJon
- T en1r la pomte de la p1pette contre le bord de la
2 Preparation de la galerie cupule à la Jonction du tube et de la cupule
- Lorsque le tube seul doit être maculé. ne pas dépas-
::::haqup galene est constituee de 5 bandes (N°1 a 5) ser la 11m1te supéneure du tube afm de conserver
·:)mprenant chacune 10 tubes numérotés une bonne anaérobiose
• prP.D<Her une boite d'1ncubat1on (fond et couvercle) - Lorsque le tube et la cupule do1vent être complète-
• 1nscnre la reference de la souche sur la languette la té- ment remplis. év1ter la formation d'un ménisque
rille concave ou convexe.
• reoart1r env1ron 10 ml d·eau dans les alvéoles du fond - Incuber les galenes â la température optimum de
• s0rt1r unE> galene de son emballage. et la déposer dans croissance du groupe de m1croorgamsmes 8tud1és
•e t.:1nd de la boite d'1ncubat1on 25°C. 30°C.37°C
 -399-

BANDE n'- 1 BANDE n°2 BANDE n°3 BANDE n°4 BANDE n°5
tube: substrat tt•be/ substrat tube/ substrat tube/ substrat tube/ substrat

TEMOIN 10 GALactose 20 :x-Methyi-D 30 MELtbJDse 40 D TURanose

Mannoside

GL Ycerot 11 GLUcose 21 ~-Methyi-D 31 SACcharose/ 41 D L YXose

Glucostde Sucrose

:? ERYthntol 12 FRUctose 22 N Acetyl 32 TREhalose 42 D TAGatose

Glucosamme

'3 0 ARAb~nose 13 MaNnosE 23 AMYgdaline 33 INUline 43 D FUCose

.j A RAb• nase 14 SorBosE 24 ARButine 34 M eleZitose 44 l FUCose

':l RIBose 15 RHArnnuse 25 ESCul111e 35 RAFf111ose 45 D ARab1toL

b 0 XYLose 16 DULcttol 26 SALicine 36 AMiDon 46 l ARabitoL

:' L XYLose 17 INOsitol 27 CELiobiose 37 GLycoGene 47 GlucoNaTe

8 ADOnttol 18 MANnttol 28 MALtose 38 XyliTol 48 2 Keto

Gluconate

9 Il Methyi-D 19 SORbitol 29 LACtose 39 GENt1obiose 49 5 Keto

Xylf)SidE Gluconate

4. Lecture de la galerie Interprétation des résultats

• Deux paramètres comptent pour la lecture des réac- Ce Profil Biochimique peut servir
tions observées
- à l'ident1f1cat1on du microorganisme par comparai-
-l'intensité (croissance ou actdification) son à des profils types
-la vitesse d'appantron. -au typage éptdém10logique de ce m1croorgan1sme
• La lecture des galeries doit se faire s'li a été montré que des biotypes éptdém10lagiques
existaient.
-à des temps d'Incubation définis (3 H. 6 H. 24 H.48 H
- à l'analyse taxonomique d'un groupe de microorga-
par exemple). dépendant du mtcroorganrsme et du
nismes.
type de rêactton étudH~ (fermentation ou asstmtla-
tion) -à la classtficat1on d'une population bactenenne
Inconnue en groupes homogènes
-de façon semt-quantttattve. On donne la note 0 aux
réacttons négattves et 5 aux réactions posit1ves
6 Contrôle
d'intensité maximale. Les notes 1, 2, 3. ou 4 sont
données aux réactions mterméd1a1res {3. 4 et 5 sont Les m111eux et galenes font l'objet de contrôles de qua-
considérées comme pos1t1vesl ltté systématiques aux différentes etapes de leur fabnca-
-Les résultats sont notés sur les feuilles de résultats tlon Un contrôle bacténolog1que est de plus rèal1sab1e au
comme Indique dans l'exemple Ils constituent le laboratotre avec les souches su1vantes
profil b1ochim1que du m1croorgan1sme
On peut auss1 no1rc1r la colonne de la feu1lle de
a
réponse correspondant chaque caractère à part1r
7 Elimination du matériel usagé
de l"heure ou une note pos111ve (~3) est enregis-
tree Après utillsat1on. ampoules. boites, pipettes el galenes
doivent être incinérees ou décontammees par autocla-
!' 1 . l i'(
vage ou 1mmers1on dans de l'eau de Javel avant d'être
jetées

APPLICATIONS

Pour certames bactéries. des méthodologies et des

J.)"-...
.. ;..:., bases de données sont proposées
~E:~·,~.~::::~~- ~ Enterobacténes et autres bac11!es Gram négat1f
APl 50 CHE Medium ( ,. 5 040 01
- Bactértes lactiques APl 50 CHL Medium (" 5 041 01
- Streptocoques APl 50 CHS Medium (" 5 042 Dl
- Bac1llus APl 50 CHB Medium (" 5 043 01
Pour les autres appiJcations. voir la b1b110graphle

1 Streptococcus avwm ATCC 35 665 (avec APl 50 CHS Medium)

2 Lactobacmus casei var alactosus NCFB 206 (avec APl 50 CHL Medium)
3 Bactl/us polymyxa ATCC 43 865 (avec APl 50 CHB Medium)
4 Proteus mtrabi/is ATCC 35 659 (avec APl 50 CHE Medium)
• react1on pos1t1ve X réact1on variable
 -400-

ANNEXE VIII :

Galerie APl Listeria.

Mode opératoire

1. Sélection des colonies

APl LISTERIA est un système dïdentificatton des
Listeria utilisant des tests standardtsés et - Vérifier l'appartenance de la souche à étudier
miniaturisés, ainsi qu'une base de données spé- au genre Listeria (courts bacilles à Gram
cifique. Il permet également la caractérisation postttf. polymorphes, mobiles à 25" C mats
du genre Listeria par élimination des espèces pas a 37 C. catalase positive et oxydase
n'appartenant pas au genre Listeria. négative).
- Les prélèvements contenant souvent des
mélanges de plusieurs espèces de Listeria, il
Principe est préférable de réaliser une subculture sur
a
gélose au sang parttr d'une colonie bien iso-
La galerie APl liSTEAIA comporte 10 microtubes a
lée. Incuber la boîte 24 heures 35-3Jû C.
contenant des substrats sous forme déshydra-
NOTE· les milteux sutvants peuvent être utilisés
tée, qui permettent la réalisation de tests enzy-
matiques ou des fermentattons de sucres. pour prélever les colonies avant utilisation de la
galerte APl LISTEAIA :
Les réactions produites durant l'a période d'in-
- milieux gélosés au sang non sélectifs, à base
cubation se traduisent par des changements de
Columbia ou TSA. avec ou sans antibiotiques
coloration spontanés ou révélés par l'addition
de réactif. Après incubation 18-24 heures à - milieux sélectifs pour Listeria à l'exception du
35-37° C. la lecture des réactions est realtsée milieu McBride qui inhibe l'expression enzy-
visuellement avec le Tableau de Lecture et matique des bactéries sur la galerie APl
l'identification obtenue grâce â la Liste des Pro- LISTERIA. Si ce milieu est employé pour l'isole-
fils de la Notice Technique. ment, réaliser une subculture sur gélose au
• Le coffret APiliSTERIA permet de réaltser 10 sang.
tests. Il se compose de : 2. Préparation de la galerie
- 10 galeries RPI liSTERIA
- 10 ampoules de Suspension Medium, 2 ml - Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incu-
- 1 réactif ZYM B bation et répartir environ 5 ml d'eau dans les
- 10 boîtes d'incubation alvéoles du fond pour créer une atmosphère
- 10 fiches de résultats humide.
- 1 notice technique - Inscrire la référence de la souche sur la lan-
guette latérale de la boite.
• Pour utiliser APiliSTERIA. il faut en outre dis- - Sortir la galerie de son emballage individuel.
poser de - Placer la galerie dans la boîte d'incubation
- Mcfarlond Standard(# 70 900). pot nt 0.5 ou - Jeter le sachet déshydratant.
Densitomètre ATB Expression ( # 15 500)
- Pipettes(# 97 560) ou PSipettes (# 70 250) 3. Préparation de l'inoculum
- Portoir pour ampoules (# 70 200) - Ouvrir une ampoule de Suspension Medium,
Et également le matériel de laboratoire: étuve a 2 ml (ou eau dtstillée stérile sans additif).
37° C. réfrigérateur. bec Bunsen, crayon mar- - A l'aide d'une Pipette ou d'une PSipette. prele-
queur. ver quelques colon tes bten isolées et réaliser
une suspension d'opactté égale a celle de
Conservation l'étalon 0.5 de McFarland
- Observer le type de hémolyse et le noter sur
la ftche de résultats, ce caractère constituant
Les galeries, le réactif ZYM B se conservent a un test addittonnel.
2-8" C et les milieux de suspension entre 2 et
30' C.Jusqu·à la date limite d'utilisation indiquée 4. Inoculation de la galerie
sur remballage.
Répartir la suspension bacterienne précé-
Le réactif ZYM B est sensible à la lumière: entou- dente dans les cupules en évitant de faire des
rer les flacons d'une feuille d'aluminium. Toute bulles (pour cela, incltner la boîte d'incuba-
teinte rose traduit son altération. Ne sortir ce tion vers l'avant et placer la Pipette ou la
réactif que le temps de son utilisation et ne pas PSipette sur le côté de la cupule)
le laisser longtemps sur la paillasse.
• Remplir tube et cupule du test/DIM/ (1 00 pl
environ, soit 2 gouttes de pipette Pasteur ou
Composition des milieux et réactifs 5 gouttes de PSipette). en veillant à ne pas
créer un ménisque convexe.
• Suspension Medium
Eau distillée stérile 2 • Remplir uniquement la partie tube des tests
ml
ESC a TAG (50 111 environ. soit 1 goutte de
• Réactif ZYM B pipette Pasteur ou 2 gouttes de PSipette).
Fast Blue BB 0,35 g
N.B. : La qualité du remplissage est très impor-
2-méthoxy-ethanol qsp 100 ml tante: des tubes insuffisamment ou trop remplis
sont source de résultats faussement posttifs ou
négatifs.
- Refermer la boîte d'incubation.
- Incuber 18-24 heures à 35-37" C en atmos-
phère aérobie.
 - 401 -

5. Lecture de la galerie
METHODOLOGIE 1 PROCEDURE
- Ajouter 1 goutte de réactif ZYM Bau testl OlMI
- Lire dans les 3 minutes toutes les réactions
en se référant au Tableau de Lecture de la
Notice Technique.
- Noter les réactions en +1- sur la fiche de
résultats. INOCULUM
- Noter également le type d'hémolyse.

6. Interprétation
- Coder les réactions obtenues en un profil
numérique sur la fiche de résultats. les tests
sont séparés par groupes de trois et une
valeur 1, 2 or 4 est Indiquée pour chacun. En .------- --,
i
additionnant à l'inténeur de chaque groupe 1
0.5 Mcf i
les valeurs correspondant des réactions a ··------ ..J
positives. un profil numénque 4 chiffres est a
obtenu.
- L'identification est obtenue en recherchant le
profil numérique dans la Liste des Profils de la
Notice Technique.
. . . .-• -. .

-
INOCULATION
'
,_,k=-·t..:.1'•=.. .... ,,~-=--·~_j"-..' 1. _.
-~ ~~

-·~
·_·2_ ~· :... -~ ·~-: _:_ 2 ::_ . .:.

651 0 Listeria monocytogenes

[ :~ i1
l'.
..
7. Elimination du matériel utilisé
Après utilisation. ampoules. pipettes et galenes
doivent être incinérées ou décontaminées, par ~ ---~
autoclavage ou tmmersion dans l'eau de javel.
avant d'être jetées.

Limitations
INCUBATION
Le système APl LISTEAIA est destiné à l'identifi·
cation des bactéries du genre Listeria, et à elles
seules. J
L'interprétation des résultats de la galerie doit
être faite par un biologiste compétent qui pren-
dra en compte l'origine du prélèvement. les LECTURE 1 READING
aspects m1cro et macroscopiques et éventuel-

;
lement les tests additionnels réalisés.
1
'H.' 1 ZYM 13
APl LI'> TER1f1

i
+ INTERPRETA Tl ON

1 • : • ) ' ' ; ' ~ • :

•/::

.-apl LISTEAIA
• TABLEAU DE LECTURE

RESULTATS
TESTS REACTIONS
NEGATIF POSITIF
Z'fM B <3 mn
IDIMI Différenciation orange pâle
L. innocua/L. monocytogenes rose beige orange
gris beige
ESC ESCuline (Hydrolyse) Jaune pâle no1r
a:MAN :x -MANnosidase incolore Jaune
DARL D-ARabitoL (Acidification)
XYL D-XYLose (Acidification)
RHA RHArnnose (Acidification) rouge jaune
MDG x -Méthyi-D-Giucoside (Acidification) rouge orangé Jaune orangé
RIB RIBose (Acidification)
G1P Glucose-1-Phosphate (Acidification)
TAG D-TAGatose (Acidification)
 -402-
TABLEAU D'IDENTIFICATION/IDENTIFICATION TABLE

•
~ap1 LISTE RIA (V1.0)
~ ESC "'" OARL m
""' MDC
"' "" ""
Listeria grayi/murrayl 99 100 99 100 1 16 33 100 0 0
Listena monocytogenes 0 100 96 97 1 98 100 1 5 0
Ustena innocua 99 100 98 100 2 66 98 1 0 0
Listeria seeligeri 97 100 5 99 99 0 99 1 0 0
Listeria ivanovii 88 100 0 99 97 4 99 33 91 0
L1stena welsh1men 90 100 96 100 96 76 99 1 0 97

%de réactions positives après 18-24 heures il 35-37" C

%of positive reactions after 18-24 hours at 35-37" C

LISTE DES PROFILS NUMERIOUES/NUMERICAL PROFILE LIST

2 150 Listeria ivanovii 3 750 Llsteria rvanovir

2 170 Liste ria ivanovii 3 770 Listerra ivanovir
2 250 Listeria ivanovii 6 010 Listeria monocytogenes
2 310 Listeria seeligeri/ivanovii 6 110 Liste ria monocytogenes/innocua
2 311 Listeria welshimeri 6 120 Listeria grayi/murrayi'
2 330 Listeria ivanovii 6 130 Listeria grayi/murrayi'
2 340 Listeria ivanovii 6 150 Listeria monocytogenes
2 350 Listeria ivanovii 6 310 Liste ria seeligeri/welshimerr
2 370 Listeria ivanovii 6 311 Lrsteria welshrrneri
2 410 Listeria monocytogenes 6 410 Llsteria monocytogenes
2 510 Listeria monocytogenes 6 450 Lrsteria monocytogenes
2 550 Listeria monocytogenes/ivanovii 6 51 0 Listerra monocytogenes
2 711 Listeria welshimeri 6 520 Lrsteria grayi/murrayi*
2 750 Listeria ivanovii 6 550 Lister'ra rnonocytogenes
2 770 Listeria ivanovii 6 701 Listeria welshrmeri
3 110 Listeria seeligeri/innocua/ivanovii 6 711 Listeria welshimeri
3 120 Listeria grayi/murrayi* 7 110 Listeria in noe ua
3 130 Listeria grayi/murrayi/ivanovii 7 111 Listeria welshimeri
3 150 Listeria ivanovii 7 120 Listeria grayi/murrayi*
3 170 Listeria ivanovii 7 130 l.rsteria grayi/murrayi*
3 210 Listeria seeligeri/ivanovii 7 301 Listeria welshirnerr
3 250 Listeria ivanovii 7 310 Lrsteria seeligerr/welshimerilinnocua
3 270 Listeria ivanovii 7 311 Listeria welshimeri
3 300 Listeria seeligeri/ivanovii 7 320 Listeria grayi/murrayr'
3 31 0 Listeria seeligeri 7 330 Listeria grayi/murrayi*
3 311 Listeria welshimeri 7 500 Listeria innocua
3 330 Listeria ivanovii 7 510 Listeria innocua
3 340 Listeria ivanovii 7 511 Listeria welshimeri
3 350 Listeria ivanovii 7 520 Listeria grayi/murrayi'
3 360 Listeria ivanovii 7 530 Listeria grayi/murrayi'
3 370 Listeria ivanovii 7 701 Listeria welshimeri

.LISTERIA
3 510 Liste ria in noe ua 7 710 Listeria welshimeri/innocua
3 520 Listeria grayi/murrayi* 7 711 Listeria welshimeri
3 711 Listeria welshimeri 7 720 Listeria grayi/murrayi*
3 730 Listeria ivanovii
*Listeria grayi nitrate (·)
Listeria murrayi nrtrate (+)
'·
~ap1 _,_,_
REF.

Origine/ Source/Herkunft/ Origen/ Pre/ievo

r---,

8~888888@8
1 1
1 1
1

1DIM 1 ESC a: MAN DARL XYL RHA MDG RIB B HEM

l--1-----o~·o
Autres tests/ Other tests/Weitere Tests/ Altri tests/ Otros tests ldent.

BIO MÉRIEUX SA 1 69280 Marcy-l'Etoile 1 France

 Schéma d'identification des espèces Listeria avec la galerie APl Listeria.

Listeria Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria ivanovii Listeria ivanovii Liste ria Listeria grayi
Tests monocytogenes spp. ivanovii spp. welshimeri
londoniensis
v
1

DIM - + + v v +
Hydrolyse de
l'esculine + + + + + + +
v
~
a.-Mannosidase + + - - - + 0
(;.)

Acidification de :
D-Arabitol + + + + + + +
-
i
D-Xylose - - + + + +
L-Rhamnose + v - - - v -
a.-Méthyl-0-
glucoside + + + + + + v 1

D-ribose - - - + - - +
Glucose-1-
phosphate - - - + v - -
D-Tagatose - - - - - + -
 -404-

1. DIM Différenciation L.innocua/L.monocytogenes

Ce test enzymatique met en évidence une arylamidase.

1. PRINCIPE CHIMIQUE

a) Activité enzymatique

Le test est fondé sur l'hydrolyse d'un substrat naphtylamide par une arylamidase.
L'arylamidase dégrade un composé amino-acide-f)-naphtylamide, par la reconnaissance de la liaison
CO-NH2 et libére un acide aminé et une molécule de f)-naphtylamine.

réaction générale :

E
R-f)-naphtylamide ----------> ~-naphtylamide +R

R =radical amino-acide
E =ar . lamidase

NH 20 NH 2 0
1 Il 1 Il
R-C-C-N R_C_C_QH
1 1 1
H H H

Amino Acide f)-naphtylamide Acide Aminé libre f)-naphtylamine

b) Détection

La f)-naphtylamine libérée est non chromogénique. Sa présence est révélée par un sel de diazonium,
le Fast Violet BB (réactif ZYM B) pour former un composé azoïque coloré en orange.

il. INTERET

Ce test original breveté permet de séparer L. monocytogenes (-) deL. innocua (+), ou des autres
Listerin (+) ou V.
 -405-

2. ESC Esculine

Le test esculine permet d'étudier la capacité d'un germe à hydrolyser l'esculine en esculétine sous
l'action de la ~ glucosidase.

1. PRINCIPE CHIMIQUE

a) Activité enzymatique
L'esculine est un glucoside composé d'une partie non glucidique ou aglycone (esculétine) et de
glucose, fixé par une liaison beta. Sous l'action de la ~ glucosidase, l'esculine est hydrolysée en
esculétine et en glucose.

Esculine D-glucose + Esculétine

(6- ~-Glucosidohydroxycoumarine) (6, 7 dihydroxycoumarine)
+
Fe+++
b) Détection
L'esculétine réagit avec le sel de fer présent dans la cupule pour former un complexe marron foncé à noir.

Il. INTERET

Toutes les Listeria sont ESC ( +).

Ce test permet de confirmer l'appartenance des bactéries étudiées au genre Listeria.
 -406-

3. aMAN alpha mannosidase

Ce test met en évidence une osidase.

PRINCIPE CHIMIQUE

a) Activité enzymatique

Il s'agit d'un test chromogénique fondé sur l'hydrolyse d'un substrat osidique, le mannoside couplé à
un radical nitrophénol, la liaison entre le radical mannose et le p-nitrophénol, ainsi que le mannose
sont reconnus spécifiquement par l'a mannosidase correspondAnte.

para-nitrophény 1aD-mannopyranoside aD-mannose para-nitrophénol

b) Détection

L'a mannosidase hydrolyse le substrat pour libérer du p-nitrophénol, spontanément coloré en jaune,
sans addition de réactif.
 -407-

4. DARL D-Arabitol
5. XYL D-Xylose
6. RHA Rhamnose
7. MDG alpha méthyi-D-glucoside
8. RIB Ribose
9. G1P Glucose-1-Phosphate
10. TAG D-Tagatose

Sept substrats glucidiques sont testés en fermentation.

1. PRINCIPE CHIMIQUE

a) Activité enzymatique

La fermentation se déroule en anaérobiose et entraîne une série de clivages glycolytiques

enzymatiques. Les sucres sont transformés en 1, 2, 3 ou 4 composés carbonés. Le pyruvate est
l'intermédiaire central entre les hydrates de carbone et les produits finaux du métabolisme. Il peut
également être un précurseur de l'acide lactique ou d'autres produits de fermentation tels que l'éthanol
ou le butanediol.
L'acide lactique est le produit final de la fermentation du glucose associé à de petites quantités
d'éthanol et de gaz carbonique.
La séquence chimique est connue sous le nom de voie d'Embden et Meyerhof :

Hydrate de carbone--------------> dihydroxyacétone phosphate

Voie de Embden Meyerhof +

glycéraldéhyde ---------> acide pyruvique --------> acide lactique

b) Détection

La formation de produits acides fait virer l'indicateur de pH (rouge de phénol).

li. INTERET

Les Listeria sont DARL ( +).

Ce test permet de confirmer l'appartenance des bactéries étudiées au genre Listeria.
Elles sont également MDG (+)(seules L. grayi et L. murrayi sont variables pour ce test).
 -408-

ANNEXE IX:

MICRO-ID Listeria.

1. PRINCIPE DU TEST

Le Micro-ID listeria contient des disques de papier fùtre imprégnés par les réactifs qui permettent
de détecter la présence d'enzymes spécifiques et/ou des produits du métabolisme de Listeria permet
tant une rapide différenciation d!l genre Listeria au niveau des espèces.
Les réactifs incluent les substrats qui réagissent avec les enzymes bactériennes et le système de
détection qui réagit avec les produit<; terminaux du métabolisme formés au cours de l'incubation,
pour produire un changement de couleur iacik:menr lisible. Les quantités de réacùfs som appliquées
de telle sorte que les matériaux incompatibles soient séparés jusqu'à ce que la galerie soit inoculée.
Les réactions chimiques du Micro-ID sont données par le tableau suivant.

TEST REACTION CHIMIQUE

VP Le glucose et le pymvate sont convertis en acétylmé -

Vosges-Proskauer thylcarbinol (AMC Acétoine), lequel est oxydé en
Production d'acétoine diacétyl avec KOH. Il constitue un complexe coloré
avec l'arginine et l'alpha-naphtol (rose à rouge).

N Le nitrate est réduit en nitrite formant un complexe

Nitrate réductase avec l'acide sulfanilique, celui-çi s'associe avec un
dérivé de l'alpha-naphtyl-amine pour constituer un
cornplexe culoré (roug·~).

PD La phénylalanine est désaminée en phénylpyruvate,

Phénylalanine désaminase lequel se colore en présence d'ions ferriques (vert).

H2S Le thiosulfate de sodium est réduit en H2S lequel

Sulfure d'hydrogène réagit avec l'acétate de plomb pour produire un
sulfure de plomb de coloration noire. (*)

(*)Toute coloration brune de la partie supérieure du disque indique une réaction positive.
Cette réaction peut être assez faible pour Micro-ID Listeria.
 -409-

1 Le tryptophane est métabolisé en indole, lequel

Indole forme un complexe coloré avec le P-Diméthyl-
aminebenzaldéhyde (rose à rouge).

OD L' ornithine est décarboxylée en putrescine,

Ornithine Décarboxyla&e laquelle augmente le pH de la suspension et
change la couleur de l'indicateur, le pourpre de
bromocrésol (pourpre à rouge).

LD La lysine est décarboxylée en cadavérine,

Lysine Décarboxylase laquelle augmente le pH de la suspension et
change la couleur de l'indicateur, le pourpre de
bromocrésol (pourpre à rouge).

M Le malonate est oxydé en produits alcalins,lesquels

Utilisation du malonate changent la couleur de l'indicateur , le bleu de
bromothymol (vert bleu).

u L' urée est hydrolysée en ammonium et dioxyde de

Uréase carbone. Ceci entraîne une augmentation du pH
qui modifie la couleur de l'indicateur, le rouge cré-
sol (orange à pourpre).

E L' esculine est hydrolysée en glucose et esculétine.

Hydrolyse de l'esculine L'esculétine réagit avec l'ion ferrique pour donner
une coloration noire. ·

ONPG L' o-nitrophényl-béta-0-galactosidase est hydro-

Béta-galactosidase lysée par la béta-galactos1dase en béta-0-galacto
se et en o-niu·ophénol, de couleur jaune ou jaune
pâle.

XYL L'acidité produite par la fermentation du xylose

Fermentation du xylose change la couleur de l' indicateur, le pourpre
de bromocrésol (jaune).

RHAM L'acidité produite par la fermentation du rhamnose

Fermentation du rhamnose change la couleur de l'indicateur, le poupre de
de bromocrésol (jaune).

MANN L'acidité produite par la fetmentation du mannitol

Fetmentation du mannitol change la couleur de l'indicateur, le pourpre de
de bromocrésol. (jaune).

SORB L'acidité produite par la fermentation du sorbitol

Fetmentation du sorbitol change la couleur de l' indicateur, le pourpre de
de bromocrésol (jaune).
 - 410-

Il. PROCEDURE

1. Sélectionner une colonie suspecte isolée et l'ensemencer en stries sur milieu TSA-YE pour
confirmer la pureté. Incuber le TSA-YE à 37°C pendant 24 heures ou jusqu'à ce que la croissance
soit satisfaisante. ·
2. Quand une culture pure est obtenue, effectuer les tests Gram, oxydase et catalase. Seules les
bacéries Gram positif, oxydase négative, catalase positive doivent être testées sur le Micro-ID.
3. Mettre en suspension les colonies dans 4,6 ml de solution saline stérile dans un tube à essai.
Les bactéries en suspension doivent avoir une turbidité égale au standart n° 1 de Macfarland.
Utiliser cet inoculum pour le CAMP test et pour l'inoculation de l'unité de Micro-ID Listeria.
4. Ouvrir l'emballage métallisé et placer l'unité de Micro-ID Listeria à plat sur la paillasse.
ll ne faut pas enlever la bande plastique couvrant les puits.
5. Inscrire le numéro d' échantillon sur l'espace prévu sur le coté droit du couvercle.
6. Ouvrir le couvercle et pipeter approximativement 0,3 nù de la suspension bactérienne dans
chaque puits d' inoculation (puits supérieurs).
7. Fermer le couvercle et placer la galerie verticalement sur son support. S'assurer que les bactéries
en suspension soient en contact avec les disques de substrat et ne pas coucher la galerie ( les
disques de détection doivent rester secs).
8. Incuber à 35-37°C.
9. Après 4 heures, noter les réactions de l'esculine (E) et du rharnnose (RHAM). Si les deux sont
positives, L. monocytogenes est suspecté et la galerie doit être incubée pendant 20 heures
supplémentaires. Si ces tests sont négatifs, la bactérie n' est pas L. monocytogenes
10. Après 24 heures d'incubation, placer l'unité à plat sur la paillasse, ouvrir le couvercle et ajouter
deux gouttes (0, 1 ml à peu près ) de KOH à 20% dans le puits d'inoculation du test de VP
uniquement. Ne pas ajouter de KOH dans les autres puits d'inoculation.
11. Fermer le couvercle et mettre la galerie en position verticale. ll faut être sûr que le KOH a
coulé dans la solution du test VP. Ensuite faire tourner l'unité de Micro-ID Listeria de 90° dans
le sens des aiguilles d'une montre de telle sorte que les disques dans les cinq premiers puits
soient humidifiés.
Remettre la galerie en position verticale et s'assurer par tapotement que la solution n'est pas
piégée sous les disques d'identification.
12. Lire toutes les réactions immédiatement à l'exception du test VP (Laisser la couleur se
développer pendant 10 minutes approximativement dans le puits et, ensuite, lire le résultat).
Lire la couleur des di~ques supérieurs pour les 5 premiers tests et la couleur des suspensions
pour les 10 tests resta.JL

Effectuer un CAMP test avec S. aureus béta-hémolytique et R. equi et un test d'hémolyse sur gélose
au sang
 - 411 -

Ill. IDENTIFICATION

La différenciariotl des espèces du genre Listeri.a est basée sur un code à 8 chiffres (octal code).

1. Reporter les résultats du test (positif ou négatif) dans les espaces appropriés sur la feuille de
résultat. Les chiffres pour chaque test positif sont indiqués au dessus de "test result".
Dans chaque groupe de 3 tests, les chiffres pour une réaction positive sont de 4 pour le coté
gauche, 2 pour la position centrale et 1 à droite.
Le chiffre pour un test négatif est 0 quelque soit la position.

2. Additjonner ks chiffres po11r chaque groupe de 3 tests r.:.t noter la somme dans J'espace approprié
snr " S~.J-111 0f po<;:{t\ves '?éli ues. "

Oct~l Cod~ QAMP R~actiQn ID a-hemol~sis

S. aureus R. equi
Art. 04044 + L. monocytogenes +
44040 L. innocua
44041 L. innocua
44042 L. murrayi or L. grayi
44043 L. murrayi or L. grayi
44044 + L. monocytogenes +
44044 L. innocua
44045 + L.monocytogenes +
44045 L. innocua
44046 L. murrayi
44047 L. murrayi
44050 + L. ivanovii +++
44050 L. welshimeri
44050 + L. seeligeri +
44050 L. seeligeri +
44051 + L. seefigeri +
44051 L welshimeri
44051 + L. ivanovii +++
44054 L. welshimeri
44055 L. welshimeri
44064 + L. monocytogenes +
44065 + L. monocytogenes +
 Résultats du test MICRO-ID.

Souches CAMP CAMP Hé mo- VP N PD H2S 1 00 LD M u E ONPG XYL RHAM MANN SORS
Sa Re lyse

L. monocytogenes + - + + - - + - - - - - + v - + - v
L. seeligeri + - + + - - + - - - - - + - + - - v À
-loo

v
1\.)
L. ivanovii - + + + - - + - - - - - + - + - -
L. grayi - - - + - - + - - - - - + - - - + v
L. murrayi - - - + - - + - - - - - + - - v + v
L. welshimeri - - - + - - + - - - - - + - + v - v
L. innocua - - - + - - + - - - - - + - - v - v
 - 413-

ANNEXE X:

AutoMicrobic.

Tests biochimiques de la fiche d'identification Gram-positif en microaérophilie

Contrôle de la croissance Urée Tréhalose

Bacitracine Rouge de tétrazolium Arabinose
Opticine Novobiocine Pullulane
Hémicellulose Dextrose Pyruvate
NaCI6% Lactose Inuline
Bile 10% Mannitol Mélibiose
Bile 40% Raffinose Mélézitose
Esculine Sali cine Cellobiose
Arginine contrôle négatif Sorbitol Ribose
Arginine Saccharose Xylose

Tests biochimiques de la fiche d'identification Gram-négatif

Aérobie Microaérophilie
DP-300 (2, 4, 4'-Trichloro-2'-hydroxydiphényl Raffinose
éther)
Glucose (voie oxydative) Sorbitol
Contrôle de la croissance Saccharose
Acétamide lnositol
Esculine Adonitol
"Plant indican" Acide para-coumarique
Urée H2S
Citrate ONPG
Malonate Rhamnose
Tryptophane Arabinose
Polymyxine B Glucose (voie fermentative)
Lactose/Lactose 1 0 % Arginine
Maltose Lysine
Mannitol Contrôle de base
Xylose Ornithine
 -414-

ANNEXE Xl:
Schéma d'analyse des produits carnés.

Enrichissement 25g d'échantillon dans 225ml de UVM

+ la solution d'acriflavine
incubation 24H à 30'c

Enrichissement secondaire

O,lml de UVM

..;;:- 10 ml de FRASER

incubation 24H à 30'c

Isolement étalement sur gélose Oxford

incubation 24-48H à 37'c

Repiquage des colonies suspectes sur TSA + YE

incubation 24H à 30'c

Examen des colonies en lumière oblique suivant la technique d'HENRY

Repiquage d'une colonie suspecte dans un bouillon TSB + YE

incubation 24H à 37'c

Réaction de confirmation coloration de Gram

catalase
mobilité
épreuve de CAMP
attaque des hydrates de carbone
 \
- 415-

ANNEXE Xli:

Schéma d'analyse des produits laitiers.

DIAGRAMME DU MODE OPERATOIRE

Enrichissement: 25 g ou 25 ml dans 225 ml de bouillon EB

incuber à 30°C pendant 48 h en général
24 h et 48 h pour l~lait cru,
48 h et 7 jours pour les fromages

Isolement: gélose Ox, ou PALCAM ou MOx

J,
confirmation : sélectionner 5 colonies typiques
isoler sur gélose TSAou TSA+YE
incuber à 30°C pendant 24 h
identification des colonies

Echantillon de fromage : Prise d'essai

La recherche de listeria monocytogenes est effectuée sur un échantillon moyen de 25 g de

fromage. Il s'obtient en prélevant sur chacun des 5 fromages d'une fabrication identique, une
prise d'essai de 5 g. La prise d'essai de 5 g est réalisée de la manière suivante :
Déballer le fromage, puis à l'aide d'une sonde à fromage de préférence, prélever
aseptiquement sans éliminer la croute ; le rapport pâte - croute doit être d'environ 2/3 - 113.
Rassembler les 5 prises d'essai de 5 g dans le bol stérile d'un agitateur rotatif ou dans un sac
plastique stérile (cas du Stomacher).
Transférer aseptiquement 225 ml du bouillon d'enrichissement sélectif. Puis homogénéiser
pendant 2 min.
Si nécessair~, transférer aseptiquement dans nn récipient st..:lile de capacité appropïiée.
Incuber à 30oC pendant 48 h ~;t 7 jours.
 - 416-

ANNEXE Xlii :

Méthode pour la recherche de Listeria monocytogenes du 24 Juin 1993.

1 Domaine d'application

La pn!se:ue norme décrit le protocole pour la recherche de Listeria monocyrogenes dans tous les produits destiné::
il la consommation humaine ou à l'alime."ltation animale, par enrichissement, isolement sur milieux sélecriÏs puis
identification des colonies.
Cene méthode est la méthode bactériologique préconisée dans le cadre des contrôles officiels et des autccom:ê!::~.
(noce l) .

2 Définitions

Lisuma spp : Microorganisme formant des colonies typiques sur un milieu sélec::if solide et présentant les
c:lr.lctéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques décrites ci-après lorsque les essais sont effecn:.~s
conformément à. la présente méthode.

Usrerra monocycogenes : Espec:: de Liste na considéré= comme pathogene et qui peut .être différenciée des autr:!s
c!Spec::s non pathogènes pour l'homme gric:: i ses c::J.rac~::-es biochimiques spécifiques.(note 2)

Rcc!-lerche de Lisreria monocytogenes : Déœ:-:ninarion de !a présence ou de l'J.bsenc:: de c:: rnicroorgJ.nisme dans

un:: :n;15se ou un volume déterminé, en effec:uant les essais par la présente méthode .

.3 Principe

L:. de Listerra monocytogenes néc=ssite !es phases suivantes (vair également !e diagr.:unme annexe
.. rec!J~rche e:1
·"' 1 .

.3.1 Enrichiss.:'ment primaire e."l milieu sélec:if liquide .

.-\JOUter 1:1. prise d'essai dans le bouillon Frase:-de:ni. de façon i obte:ür un rapport prise d'essai 1 milie-.1
d'emichissc:ncnt égal i lJlO (masse i volume ou volume i volume). Puis incubation à 30°C penà:J.nt 18h i 24 h.

3.1 l salement de l'enrichissement primaire, SU[:.U"- mi,lieu sélectif gé.losé

A p:lmr d~ !::1. culture obte.'1Ue en (3 .1 ), ensen1e.'1Ciment d'une des deux geloses suivanteS : Oxford au pALC.-\i\1.
Incuber. i .37°C pendant-10 .
h ~•...•.
,2~.~ si nécessaire 48 h.
Jfr'~· a. .••.•., ••• •

J.J Enrichissement secondaire en milieu sëlecrifliquidc

Ré::J.!isation d'une subculture par inoculation de 0, 1 mi de la culture obtenue en (3 .1) dans 10 ml de bouillon
Fr=.scr. Incuber i 37°C pendant 18 h à 24 h puis réincuber de nouveau 18 h à 24 h.

J.-+ Isolement de l'enrichissement secondaire

A p::1mr des cultures obtenues en (3.3), a la fin de chacune des 2 periodes d'incubation, ensemencement de l'un dJ)
deux milieux selectifs gêlosés suivomt : Oxford ou PA:LCAM.

3..5 Identification
Ex:l.lTlcn des milieux d'isolement apri:s 20 h i 24 h et, si nécessaire 40 h à 48 h, d'incubation afin de détecter !a
prcscnc:: de colonies caractéristiques, presumees ~trc des Lisrena spp.
Rl!piquagc sur une gdose nan sélective, par exemple tr:--ptom: soja agar cxtrnit de levure (TSA YE) puis
tr.lcnuric:.Lion i l'aide de tests marphologiques.physJOlagiqucs ct biochimiques. (note 2)

! ~~~ •n::~hodcs "dites raptdcS" validé:s par I'A.FNOR pc~vcm :lUSSI ~~re :.Jlllisè::s.(voir la note de servie::
!JG ..:..L ::DH.-VNo~053 du 9 mars 1993)
 - 417-

4. Diluant, Milieux de culture et Réactifs

q.l Généralités
Pour les pratiques èourantes de laboratoire, voir NF V 08-D02
Pour améliorer la reproductibilité des resultats, il est recommandé d'utiliser, pour la préparation des milieux de
:ulrure, des composants de b~e deshydrates ou des milieux complets déshydratés. De la même façon les rrùlieux
prêts i l'emploi, les préparations commerciales de réactifS peuvent être utilisés. Les prescriptions du fubric:mt
doivent être suivies scrupuleusement.

4.2 Diluant
Voir NF V 08-010 et la norme spécifique traitant du produit à examiner.

4.2 Milieux de culture

4.2.1 BOUILLON D'ENRICHI.SSE.'vŒNT SEr "~="CTIF

-+.2.1.1 Bouillon d'enrichissement oour Listeria !formule Fraser-demi)

Composition
Proteose peptone 5,0 g
Tryptone 5,0 g
Extrait de levure 5,0 g
Extrait de viande 5,0 g
Chlorure de sodium 20,0 g
Hydrogénophosphatc disoàique dihydr.ué 12,0 g
d.ihydrogénophosphatc de potassium 1.35 g
Esculine 1,0 g
Citrate de fer ill ammoniad 0,500 g
chlorure de lithium 3,0 g
Acrii1avine (chlomydr.ne) 0,0125 g
Acide nalid.ixique (sel de sodium} 0,010g
1 000 ml

Préparation
Suivre les inciic:uions du flbric:mt pour les milieux complets deshydr.ués, du commc:c:.
Mélanger tous les composants, sauf l'acide naliciixique, l'acriflavi.cc et le citrate de fe:, avec l'cu, ct c.:Uuffe:
madéréntentjusqu'à dissolution complëte. Ajusu:r le pH de sone qu'après stérilisation il soit de i,2. R..:pmir e.-:1
fl:1cons à r.llson d'un volwne V = 9 fois la masse ou le volwne de la prise d'essai. Stériliser le milieu i 121 oc
pend:l.nt 15 min.
Après refroidissemc::nt et juste avant l'utilisation ajouter les trois derniers composants sous forme de soiutions
stérilisées par filtration, par exemple pour l 000 ml de base,
5 ml d'une solution aqueuse de chlorhydrate d'ac:ülavine i 0,25%
5 ml d'une solution aqueuse i 0,2% de sei de sodium de l'acide nalid.ixique
10 ml d'une solution aqueuse i 5% de citrate de fer rn munoniac:ù
Rem:l.l'que:
Seul l'acide naiid.ixiquc peut être ajouté en même temps que les composants de l_a base ct ::wtoc!avé.
Dans le c:lS où la solution stock est conservée à +4°C, dissoudre lesci de sodium de l'acide na.Eixique dans une
solution d'hydroxyde de sodium 0,05 M
 -418-
.+.2.1.2 bouillon d'enrichissement pour Listeria (formule de Fraser)
Composition (selon Fraser J.A. et Sperber V.H., 1988, J. Food Protect; modifié par Mc Clain D et LEE W.H.,
!989, USDA- FSIS Microbiology communication n°57)
Protcose peptone 5,0 g
Tryptone 5,0 g
Extrait de levure 5,0 g
Extrnit de viande 5,0 g
Chlorure de sodium 20,0 g
Hydrogénophosphate disodique d.ihydraté 12,0 g
dihydrogénophosphate de potassium 1,35 g
Esculine 1,0 g
chlorure de lithium 3,0 g
Acriflavine (chlorhydrate) 0,025 g .
Acide nalidixique (sel de sodium) 0,020 g
Citrate de fer III anunoniacal 0,500 g
Eau 1 000 ml

Préparation
Suivre les indications du fabricant pour les milieux complets déshydratés, du commerce.
Mélanger tous les composants à l'exception de l'acriflavine, de l'acide nalid.ixique et du citrnte de fer avec l'~u. et
chauffer modérément jusqu'à dissolution complète. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,2.
Répartir en tubes à raison de 10 ml. Stériliser le milieu à 121°C penc:bnt 15 min.
Aprës refroidissement et juste avant l'utilisation., ajouter à 10 ml
0,1 ml d'une solution aqueuse à 0,2% de sel de sodium de l'acide nalidix.ique stérilisée par filtration
• 0,1 ml d'une solution aqueuse d'acriflavinc à 0,25% stérilisée par filtration .
• 0, 1 ml d'une solution aqueuse de citrate de fer III arrunoniac::d à 5%
Remarque:
Sc:ul l'acide nalidix.ique peut être ajouté en même temps que les composants de la base et autoclavé.
Dans le cas où la solution-stock est conservée à +4°C, dissoudre le sel de sodium de l'acide nald.ix.ique cbns une
solution d'hydroxyde de sodium 0,05 M

4 2 2 1 Gélose sélective pour Listerra (fonnule Oxford)

4.2.2.2 Gélose sélective pour Listena (fonnule PAL CAM)

4.2.3 M.n..lEUX D'IDENTIFICATION

4.2.3.1 Gélose trytone soya extrait de levure (T.S.A.Y.E.)

4.2.3.2 Gélose au sang

Les géloses au sang prêtes à l'emploi peuvent être utilisées ; ou utiliser la gélose décrite ci-dessous

Milieu de base : blood agar base n° 2. soit :

proteose peptone 15 g/1
hydrolysat de foie 2,5 gll
extrait de levure 5gll
chlorure de sodium 5gll
Agar agar 12 g/1

milieu complet : blood agar base n° 2 4g

e:J.U lOOml
suspension d'hématies 5 à 7 ml
ou sang de mouton ou cheval défibriné

Prép:HJ.tlon
Pour préparer le milieu complet. au choix utiliser du sang dé.fibriné ou une suspension d'hématies.
Pn.:parauon de la suspension d'hématies : recueillir du sang d'un animal sain (mouton, bovin ou cheval) cians des
cond1uons sténlcs dans des rubes contenant un liquide stérile de composition suivante :
 -419-
ac1de citrique 29 g
citr.J.te trisodique 80 g
glucose 180 g
eau 840 ml
Mélanger 50 ml de ce liquide à"l litre de sang. Centrifuger a 900 g (g = 9,31 rnJs2) pendant 30 min.
Eliminer le plasma stérilemen(et resuspendre les hématies dans un volwne équivalent au volume initial d'une
solution de chlorure de sodium isotonique (0,85%). Faire deux lavages au moins.

Dissoudre les composants de base dans l'e:J.u en po.rt:lnt à ébullition. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation ii
soit de 7,0 .
Ajoutér au milieu de base fondu et refroidi à 45°C environ, le sang de mouton ou de cheval défibriné stérile ou la
suspension d'hématies. Mélanger com·enablement et couler en boîte de Pétri stérile à raison de 12 ml à 20 ml.

4.2.3.3 Gélose mobilité

L'un deux milieux suivants peut être utilisés
* milie:J. SIM

* milieu mobilité
composition
Peptone de caséine 20,0 g
Peptone de viande 6,1 g
Agar agar 3,5 g
E:1u 1 000 ml

PrépJ.ration
Mélanger les composants déshydntés ou le miiieu complet déshydraté avec l'e:J.u, e~ chauffer modérément jusqu'i
dissolution complète. Ajuster le pH de sone qu'::1près stériiisation il soit de ï ,3. Ré;:J:J.rtir en tubes i r.llson de 5ml
p::u tube. Stériliser à 121 oc pendant 15 min.

4.2.3 .4 iviilieux pour la ferment:ltion des hydr::nes de c:u-bone.

Milieu de base (purple broth b~e)

Composants
Proteose peptone 10,0 g
Extrait de viande 1,0 g
chlorure de sod.iwn 5,0 g
Pourpre de bromocresol 0,02 g
E:w 1 000 ml

Préparation
Mél::LI1ger les composants déshydr:l.tés ou le milieu complet déshydraté avec l'eau, et chauffer modérément jusqu'à
dissolution complète. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 6,8. Répartir en rubcs de sorte qu'après
stérilisation ils contiennent 9ml dans Je cas d'ajout de solution, 10 ml lors d'utilisation de disques imprégnés
d'hydrate de c:u-bone. Stériliser à 121 °C pencbnt 15 min.

Solution d'hvdrare de c::J.rbone

Composition
Hydrate de carbone (xylase au Rhamnose) 5g
E:1u 100 ml

Préparation
Dissoudre séparenunent les hydr:l.ces de C.:lrbone dans J'eau et stériliser par filtration en utilisant une membrane de
porosité 0,45 )lm.

Milieu comolct
Préparer des milieux dont la concentr:l.tion finale en xylosc ou rh.amnose est de 0,5-p. 100 soit par adjonction de 1
mJ de solution.de xylose ou rhamnose à 9 mi de :ruiieu de base, soit par addition d'un disque à 10 ml de milieu de
base.
 -420-
4.2.3.5 C.A.M.P. (test de Christie, At.kins, Munch-Paterson)
Gd ose
voir 4.2.3.2

Souches test
Une souche de Staphylococci; au reus fortement bêta-hémolytique par exemple CIP 5710 (Collection de l'Institut
P:lSteur de Paris)
Une souche de Rhodococcus equi, par exemple CIP 5869.
fi est recomm:mdé de détenir des souches de Lisreria des différentes espèces.
Entretenir les cultures par exemple sur des géloses inclinées TSA YE incubées à 37°C pendant 24 à 48 h et
stockées à 4°C. Repiquer les souches régulièrement (au moins une fois par mois).

5 Mode opératoire

5.1 P:-ised'essai
Il est import:mt que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du tr:msport et de l'entreposage.
Pour la préïJaration de l'échantillon et la prise d'essai, voir la nonne ISO 6887 et les normes concem:mt pour le
produit à examiner.
?our b ÇJréparation de la suspension-mère, utiliser comme diluant le milieu d'enrichissement préconisé pour la
ph::tSe primaire de l'enrichissement.

5.1 rh:lse d'enrichissement

• ., 1 . • • •
: .. - .. c~nncmssemenc pnmatre

Introduire !.l!le quantite (x) de prise d'essai (masse ou volun1e) d:J.IJs un volume du prernie:- bouillon d'enrichis-
sc:m:::t. formule Fraser-demi (4.2.1.1 ), de façon à obte:ur un rapport prise d'essai 1 milieu d'enrichissement de
l/10 (r.lpport masse/volume ou volume/volume).
::Ic'...!~i!r à 30°( p~:::±lnt 18h i 24h.

5.2.2 t: nrichisser.-.ent secondaire

P~c!:.:\·cr 0,1 ml du bouillon Fraser-demi incubé obtenu en (5.2.1). i!t maculer 10 ml de bouillon d'enrichissement
fcnnulc Fraser (4.2.1.2).
!nctibcr i 37°C pencblc 18 h à 24 h et reincuber jusqu'à 42 h - 48 h.

5.3. Isolement de Listeria spp

Par écha.!1tillon, 3 géloses au moins sont ensemencées :

.\ Q:l!1ir de l'enrichissement primaire

Pré!c·:cr i l'aide d'une anse bouclée un aliquot du bouillon demi-Fraser incubé (5 .2.1) et isoler sur une gélose
Oxford. ou PALCA!vf.
incuber i noe pendant 20 hi 24 h et si nééessaire 48 h.

.!. c~rtir de l'enrichissement secondaire

Proc~d.::r comme ci -<lessus à partir du bouillon d'enrichissement formule Fraser incubé 18 h à 24 h (5 .2.2)ct
renouvekr l'opér.J.tion à partir du même bouillon incube 42 h à 48 h.

5.4 tdcnt:f:c::ltion

5 ..;..l ldcntific::nion présomptive de Listerra son · observauon des géloses d'isolement

E:~;;unmer chacune des 3 géloses d'isolement (5.3) apn!s 20 h à 24 h et. si nécessaire 48 h d'incubation.
• sur ;;dose séiecuve pour Lisrerra formule Oxford. les !tsrcrra forment en 24 h des colonies grises ou gris-
•:~.::-d~:r-..:s !uïS:J.IJtes. d'environ 1 mm de di:::unctre, entourees d'un halo brun-nmr ; après 48 h d'incubation. les
 - 421 -

colonies typiques ont un diamètre d'environ 2 mm, sont inci'llStées dans la gélose e: présentent une dépression
c,entr;ale.
* sur gélose sélective pour List ena formule P.A.LCA.M, les colonies ont le même aspe::: mais sont de
couleur verdâtre.

Sélectionner 5 colonies typiques sur chaque boîte. S'il y en a moins àe 5, les retenir toutes.

5.4.2 Identification du genre et de l'espèce

L'tm des protocoles cités ci-dessous peut être suivi :

• La technique classique consiste à purifier la colonie puis à l'identifier à l'aide de tests morphologiques,
physiologiques et biochimiques (méthode classique en tubes ou méthode par galerie miniaturisée).
• Une technique alternative consiste à identifier Listeria monocytogenes par la mise en évidcnc:: d'une séqueneo;
spécifique de son ADN (par exemple i l'aide de. sonde par hybridation ou par PCR).

Seule la méthode dite classique est décrite ci-desssous.

5.4.2.1 Isolement des coloniès sélectionnées sur TSAYE.

Incuber à Joac ou à. 37°C pendant au moins 24 h.
Les colonies de Lisreria mesurent environ 1 mm de diamètre, sone tr.mslucides, non pigmentées ; soumises à un
éclairage de Henry, elles apparaissent bleuâtres avec une suriace gr.muleuse.

5.4.2.2 Tests de confirmation du genre

réaction de la catalasc

coloration de Gram.

ex:unen de la mobilité :
L'e.:umen de la mobilite est n:::llisë soit au microscope sur un état frais ( 1). soit e.'1 milieu gélose (2).
(1) Préparer un éta.lemcnt d'une su.speru-ion d'une colonie en solution saline :i 0.85o/... Ex:uniner au microscope; les
Listt!ria présentent une mùbilité en pirouette ::::u-acté;:;.mque à 25°C - J0°C.
(2) Sur w1~ gélose mobilité inoculé: par piqün: cenuale et incubée 48 ha zsoc. lc::s Listt!ria poussent autour de la p1q~e
et présentc:m le plus souvent une: pousse rypique dite en ombrelle.

Sélectionner les souches c:;J.I.J.Iase (+), Gram(+) et mobile

5.4.2.3 Tests d'identifica.tion de l'espece, Lisreria monocyrogenes

• C.AlvfP test
• Hémolyse
• Fermentation du xylose et du rhamnose

5.4.2.4 Résumé des teStS d'identifica.tion

Lmonocyrogenes est Gram(+), cata.lase (+),mobile, C.A.MPIR. equi (-), CAMP/S.a.ureus (+), D-xylose (-),
rharnnose(+).
 -422-

ANNEXE A 1: Schéma du mode opératoire

Enrichissement : 1 ère phase

X go~ X ml dans un volume (9X) de la base du bouillon "Fraser-demi"

u
incuber i 30°C

u
pendant 18 h à 24 h Isolement sur Oxford ou PAL CAM

2ème ph:lSe

0.1 ml du bouillon "Fraser-demi" dans 10 nù de bouillon "Fr.J.Ser"

Incuber à 37°C

18 h à 24 H isolement sur Oxford ou PAL CAM

u
42 hi 48 h isolement sur Oxford ou PALCMf

Identification :

par des tests morpillogiquc:s, physiologi4ues e~ biodumiques (galerie de rubes ou galerie mini:l.rurisé:)
isolement des colonies c:Ll"aCtéristiques sur TSAYE
idcntific::Won du genre : Gr.un., c:::u.alase., mobilité
idenri.ficuion de l'espece: CAMP, hémolyse, xylose, rhamnose

ou par toutes autres methodes donnant des resultats équivalents

ANNEXEA2 Identific::Won des r:spè.ces de Listeria

Espécc hémolyse CAMP- Test D->eylose L-rhamnose mannitol reduction des

R. ecui S. aureus Nitrates
L monocytogenc:s + + +
L. innocua v
L ivanovii + + +
L. wc:Jshimc:ri + v
L. seeiigeri + + +
L. grayi +
L. murrm•i + +
 -423-

ANNEXE XIV:

Méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes dans les produits végétaux

ou d'origine végétale.

4. Principes
Conform~ment à l'article 2 de l'arrèté du 13 mar~ 1992 relatif au
(OI\1rôle microbiologlciuc de' produits végétaux ou d'origine végé- 4.1. Ensemencement en surface de tnilieux de culture sélectifs détcr-
tninés, coulés en boîte de Pétri, avec une quantité définie de
tale, les laboratoires chargés de concourir à 1'applica.tion de la régie. l' éch~ntillon pour essai, si le produit est· liquide, ou de la sus-
mentation concernant la répr.:.~sion des fraudes sont tenus d'utiliser pensu;m mère pour les autres produits. Le comptage des
la méthode mentionnee ci-dessous pour effectuer le dénombrement colomes sera effectué sur un des trois milieux sélectifs men-
de Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d'origine tionnés en 5.3.
végétale.
Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions
décimales obtenues à parur de l'échantillon pour essai ou de la
suspension mère.
MICROBIOLOGIE- MÉTHODE DE Dl'>NOMBREMENT DES LISTE!I.IA 4.2. Incubation de ces boîtes en aérobiose à 37 oc pendant
MONOCYTOGENES ·TECHNIQUE PAR COMPTAGE DES 24 heures et/ou 48 heures.
COLONIES À 37 •C.
4.3. Repéx:a~e et ~Omi;Jtage ~es colonies caractéristiques obten:Js mr
les m1heux selectifs, pms confirmation par les tests morph. lo·
1. Objet et domaine d'application giques et biochimiques.
La présente méthode donne les directives pour le dénombrement 4.4. C~l~~l du ~ombr~ de Listeria monocyrogtne.r par gramme ou par
des Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d'origine mtll!htre d échanUllon, à partir du nombre de colonies obtenues
végétale destinés â la consommation humaine par comptage des dans des boites choisies aux niveaux de dilution donnant un
résultat significatif.
colonies â 37 oC.

2. Références 5. MJIJeux de culture et dilaaat

NF V 08-010 : 1982 (ISO 6887) - Microbiologie • Directives géné- 5.1. Composants de base:
rales pour la préparation des dilutions en vue de l'examen microbio- Pour amC:Iiorer la reproductibilité des résultats il est recom·
logique. mandé d'utiliser, pour la préparation du milieu de culture, des
NF V 08-002 : 1985 (ISO 7218) • Microbiologie • Directives géné- composants de base déshydratés ou un milieu complet déshy-
rales pour les examens microbiologiques. draté. Les prescriptions du fabricant doivent être suivie.s scru.,u·
lcusement.
. Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analy·
3. Définitions uque reconnue.
L'eau utilis6e doit être distillée ou déioniséc exempte de
Dans le cadre de la présente méthode, les définitions suivantes substances susceptibles d'inhiber la croissance des' Listeria dan.l
sont applicables. les conditions de l'essai.
3.1. Listeria spp : micro-organismes formant des colonies caractéris- Les mesures du pH doivent être effectuées au moyen d'un pH
tiques à la surface de tnilieux de culture sélectifs ct possédant mètre à compensation de température.
les propriétés morphologiques et biochimiques décrites lorsque Si 1~ dilu~nt ct les milieux ne sont pas utilisés extemporané·
l'essai est exécuté selon la présente méthode. ment, 1ls dotvent, sauf spécifications contraires être conservés i
3.2.. - Listeria monocytogenes : Lisuria spp. considérées comme l'obscurité entre 0 et 5 oC pendant un mois a~ maximuw. dan.l
pathogènes et qui donnent des réactions de confirmation spéci- des conditions évitant toute modification de leur composition.
fiques positives quand ces essais sont exécutés selon la présente 5.2. Diluant :
méthode. . Se reporter à la .norme NFV 08-010 (ISO 6887) et à la norme
mternauonalc spéc1fiquc du produit à examiner.
5.3. Milieux utilisés pour le dénombrement de Listeria monocyb-
genes.
 -424-

5.3.1. Milieu d'isolement d'Oxford Curtis (1): Chlorure de lithium : 15,00 g ;

Rouge de phénol : 0,09 g ;
5.3.1.1. Milieu de: base: Agar agar: 12 à 18,00 g (2) ;
Composition : : · Eau : 1 000 ml.
Mélange spécial de peptones : 23,0 g ;
Amidon de mals: 1,0 g ;·
Chlorure de sodium : 5,0 g ; (1) Van Nettcn P~ Van de Ven A., Peralca 1 and Moseel D.A.A. (1988). A
Esculine: 1,0 g; selective and diagnostic medium for use in the enumeration of Listeria son
Citrate ferrique ammoniacal : 0,5 g ; in fonds. lot. J. Food Microbiol. 6.187-198.
Chlorure de lithium : 15,0 g ; (2) Selon les prescriptions du fabricant.
Agar agar: 12,0 à 18,0 g (2) ;
Eau : 1 000 ml.
Préparation :
Dissoudre des composants de base ou le milieu complet
(1) ,::artis G.D.W., Mitchell M.G., !Gng A.F. and Griffin EJ. (1988, l'er- déshydraté dans l'eau en portant à l'ébullition.
sonnai Communication, John Radcliffe Hospital, Oxford, U.K.)
(2) Selon les prescriptions du fabricant.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il
soit de 7,2.
Répartir le milieu de base gélosé dans des récipients appro-
priés, stériliser à 121 •C ~ndant 15 mn.
Préparation :
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydratés 5.3.3.2. Supplément poùr 1 1 de mélange :
dans l'eau, en portant à ébullition. Acriflavine HCl: 5,0 mg;
Si n>!:cessaire, ajuster le pH, de sorte qu'après stérilisation il Ceftazidime : 20,0 mg ;
soit de 7,2. Sulfate de· Polymyxine B : 10,0 mg ;
Répartir le milieu gélosé dans des récipie:1ts appropriés. Stéri- Eau ·stérile : 10 ml.
liser à 121 •C pendant 15 mn. Dissoudre aseptiquement les composants dans l'cau.
5.3.1.2. Supplément pour 1 1 du milieu de base : 5.3.3.3. Milieu complet.
Cycloheximidc : 400 mg ; idem 5.3.2.3.
Colistinc sulfate : 20 mg ; 5.4. Milieux de confirmation :
Acriflavine HCl : 5 mg ; 5.4.1. T.S.A. Y.E.:
Cefotetan : 2 mg :
Composition :
Fosfomycine : 10 mg ;
Ethanol : 5 ml ; Trypticase: 17,0 g;
Eau stérile : 5 ml. Soytone : 3,0 g ;
Dissoudre dans le mélange eau/éthanol. Extrait de levure : 6,0 g;
Chlorure de lithium : 5,0 g ;
5.3.1 .3. Milieu complet : ajouter la quantité de supplément appro-
priée au milieu de base fondu et refroidi à environ 45 oC, bien Phosphate bipotassique : 2,5 g ;
homogénéiser, et couler en boites de Pétri stériles. Glucose : 2,5 g ;
Les. boites ainsi préparées peuvent être stockées quinze jours Agar agar: 12,0 à 18,0 g (1) ;
entre 0 et SoC à l'abri de la déshydratation (boite à l'endroit en Eau : 1 000 ml.
sac plastique fermé hermétiquement).
s.: !. ~-1ilieu d'isolement de Mox (1) (Oxford modifié au Moxa- (1) Selon les prescriptions du fabricant.
lactam).
5.3.2. L Milieu de base :
Composition : Dissoudre les composants dc base ou le milieu ~X~mplct
Gélose columbia modifiée : 38,1 g ; deshydraté dans l'eau à l'ébuUition, si nécessaire, ajuster le pH
Esculine : 1,0 g ; de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,3.
Citrate ferrique ammoniacal : 0,5 g ; Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
Chlorure de lithium : 15,0 g ; 121 •C ~ndant 15 mn.
Colistine: 0,01 g; Conserver entre 0 ct 5 oC, un mois maximum. en évitant toute
déshydratation du milieu surtout s'il est coulé en boite de Pétri.
Eau : 1 000 ml.
5.4.2. Gélose au sang :
Milieu base : milieu 5.4.1.
(1) MacClain and ue, May 24, 1989, FSIS method for isolation and iden- Milieu complet : ajouter au milieu de base fondu et refroidi à
tification of Listtri4 monocytogtmes from processed meat and poultry pro- 45 oC environ, 7 p. 100 de sang de mouton défibriné stérile.
dur.ts, ~boratory communication n• 51, Microbiology Division, Food safecy Mélanger convenablement et couler en boite de Pétri stérile.
an> inspection service U.S. Departement of Agriculture, Beltsville, Md.
Conservation entre 0 et 5 oC, un mois maximum.
5.4.3. Gélose mobilité (milieu SIM) :
Préparation : E:~.trait de viande 3 g. - Extrait de levure 6 g. - Peptone
Dissoudre les composants de base ou le milieu complet 10 g. - Chlorure de sodium 5 g. - Agar agar 3 g à 6 g. - Eau
déshydraté dans !'eau en portant à l'ébullition. 1 000 ml. - pH 7,4.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il Répartir ~ raison de 6 ml dans des tubes de 16 x 160 mm.
soit de 7. Stériliser à 121 oC pendant 15 mn.
Répartir le milieu de base gélosé dan.• des récipients appro- 5.4.4. Milieu pour la fermentation du ~ylose et du rhamnose.
priés, stériliser à 121 •C pendant 15 mn. Milieu de base : géiyutc 10 g. - Chlomre de sodium S g. -
5.3.2.2. Supplément pour 1 ~ de milieu de base : Pourpre de bromvcrésol 0,02 g. - Eau 1 000 ml. - pH 6,8.
Moxalactam : 0,02 g : Répartir à raison de 10 ml en tubes de 16 x 160 mm, lors de
Eau stérile : 2 ml. l'emploi de gluci-discs ou 9 ml si on ajoute la solution de sucre.
Dissoudre aseptiquement ie moxalactam dans l'eau ou fiitrer. Stériliser à 121 oC pendant !S mn. Les solutions de D. xylose,
L. rhamncne (voir ci-dessous) peuvent être remplacées par des
5.3.2.3. Milieu complet : . gluci-discs Biomérieux.
Ajouter la quantité de supplément appropriée au milieu de Pour les deux hydrates de carbone, préparer des solutions à
base ·fondu et refroidi à environ 45 •C, bien homogénéiser et S p. 100 en eau distillée. Stériliser par filtration en utilisant une
couler en boites de Pétri stériles. Les boites ainsi préparées peu- membrane de porosité 0,45 (.Lill.
vent être conservées quinze jours environ entre 0 et 5 oC (voir
5.3.1.3). Ajouter 1 ml de solution de xylose ou de rbamnose à 9 ml de
"milieu base,. ;ûm d'obtenir une concentration tinale a
5.3.3. Milieu de Palcam (1) : 0,5 p. 100 d"hydrate de carbone.
S.3.J.l. Milieu de base:
5.4.5. Eau oxygén~e:_
Composition : Solution à 3 p. 100.
Mélange spécial de peptones : 23,00 g ;
Amidon de mals: 1,00 g;
Chlorure de sodium : 5,00 g ;
Jlucose : 0,50 g ; 6. Apparelllare et Yerrerle
Aannitol : 10,00 g ;
2sculine : 0,80 g ; l.,e matériel courant du laboratoire de microbiologie ct un dis~
Citrate ferrique ammoniacal : 0,50 g ; sitif pour le test d'illumination d'Henry. ··
 -425-
Observation directe

Faisceau de lumière blanche

l bo~ 1-c..

~ ...
mille..u..

~5· Trépied

Miroir plat

EXAMEN DES BOITES li'OUR LE REPÉRAGE renfermant entre 15 et 150 colonies caractéristiques. Choisir, en
DES COLONIES SUSPECTES vue de la confirmation, 5 cclonies caractéristiques à partir de
chaque boite.
Test d'illumination d'Henry
S'il y a moiru de 15 colonies caractéristiques sur les boîtes
Pour la source lumineuse, vous pouvez utiliser « Bausch and ensemencées avec le produit liquide non dilué ou avec la dilu-
Lamb Nicholas Illuminator, cat. no 31-33-05-28, voir FiSher 86 tion la plus faible po12r les autres produits, il est possible de
catalog p. 1036 11. faire une estimation comme décrit·daru la norme Staphylococa.is
R6f: Listeriosis H.P.R- Seeweer, Hafner publishing Co., New au= (NFY 08-014: 1934).
York, 1961, p. 2 Aspect des colonies caractéristiques.
Après vingt-quatre L~ures d'incubation, les souches de LiS
teria développent des t:olonies noires verdâtres associees a Ln
7. EclwstillOIIJla&e noircissement du milieu. Après quarante-huit heures, les
colonies noires, au ccr:tre déprimé de 1 à 2 mm de diamètre,
Effectuer l'échantillonnage conformément à la norme internatio-
sont cernées d'un .halo brun noir.
nale spécifique du produit concerné.
S'il n'y .a pas de norme internationale spécifique disponible, il est
recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce l O. Confirmation
sujet. 1O. L Prelever le nombre de colonies suspectes requis et isoler en
stries à la surface de la gélose TSA...YE (5.4.1) coulée en boites
8. Préparation de l'édwltilloo poar essai de Pétri et séchée, pour purification. Incuber à 37 <>C pendant
vir;gt-quatre heu~es ou jusqu'à ce que la croissance soit satisfai-
Voir la norme internationale sp6cifique du produit concerné. sante.
S'il n'y a pas de norme internationale s~cifique disponible, il est Examiner les boîtes de Pétri et repérer les colonies suspectes
recommandé que les parties concernées se mettent ·d'accord à ce à l'aide d'un faisceau lumineux blanc suffisamment puit.sa1t
sujet. pour illuminer ·convenablement la boite en le dirigean-t :le
manière à atteindre le fond de la boite sous un angle de 45 •C.
Lorsque l'on examine sous ·cette lumière transmise en oblique et
9. Mode opé~tolre
en position perpendiculaire au-dessus de la boite, les Listeria
9 .1. Prise d'essai, su!pension mere et dilutions. présentent des· surfaces « bl-eues-grises 11 (voir appareillage). Si
les boites de TSA.YE ne présentent pas un grand nombre ~e
Se reporter à la norme NFV08-0IO (ISO 6887) et à la norme
colonies typiques convenablement isolées, réisoler une colon1e
intemstiona.lc spécifiqt:e du produit à examiner.
typique puis procéder de la manière suivante :
9 .2. En.<emencemcnt. Les colonies typiques sont soumises à l'épreuve de la catalase
9.2.1. Transférer, avec une pipette stérile, 0,1 ml de l'échantillon et à la coloration de Gram. Si la c-~lture présente des petits
pour essai s'il est liquide ou 0,1 ml de la suspension mère pour bacilles Gram positif et une catalase positive, poursuivre les
les autres produits à la surface d'une boite de milieu épreuves pour identifier Lisuria monocytogrnes.
gébsé (5.3.1) préalablement séché et/ou le milieu 5.3.2 et/ou le
milieu 5.3.3. Répéter l'opération avec la dilution 10'' et les dilu- Fermentation du xylose et du rhamnose.
tiow suivantes si nécessaire. Inoculer les deux milieux liquides et les incuber à 37 •C pe!l·
9.2.2. Etaler l'inoculum le plus rapidement possible à la surface du dant sept jours, bien que la plupart des réactions~itive~ pu.s-
milieu gélosé en essayant de ne pas toucher les bords de la sent appara.ltre en vingt-quatre et quarante-huit heures.
boite avec l'étaleur en verre. Utiliser un étaleur en verre stérile
pour chaque boite. Laisser sécher les boites avec leur couvercle Epreuve du Camp :
durant environ 15 mn à la température ambiante. Utiliser pour cette épreuve une _Mjp_~~~Jll,l ~~an8. de. _I!IQ..U~~?
(5.4.2) préalablement séchée.
9.3. InoJbation :
Cette épreuve facilite l'appréciation du pouvoir bèta:
Retourner les boites préparées selon 9.2.2 et les faire incuber
durant vingt-quatre et quarante-huit heures dans !''étuve réglée hémolytique des espéces L. mortOcytog~nes et surtout L suligm.
à 37 ± 1 oC. Il est recommandé d'utiliser une souche de S. aur~ ayant une
zone de bêta-hémolyse importante et une souche de RhodC:
9 .4. Sélection des boites et interprétation : coccus equi qui en exaltant !.a bêta-hémolyse de L ivanovii la fa1t
Après vingt-quatre heures d'incubation, repérer les C<J!onies paraître sous un aspect caractéristique en forme de pelle .. Les
caractéristiques éventuellement présentes. deux souches sont disponibles au Laboratoire central d'hygiène
Incuber à nou~eau les boites à 37 ± 1 •C durant vingt-quatre alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris.
heures supplémentaires, et repérer les nouvelles colonies caracté· Prélever une C<Jlonie typique et faire une préparation pour un
ristiques. examen à J'etat frais. Sur une lame porte-objet, émulsionner a
Ne r(;tenir pour le dénombrement que les boites (9.2.1 et 9.4) colonie dans une solution à 0,85 p. 100 de chlorure de sodiut71 ;
 -426-

recouvrir avec une lamelle et examiner au microscope en L. monocytogenes. Si la culture est présumée positive, appliquer
contraste de phase avec un objectif a immersion. l'é:pr~uvesuivante.
L. monocytogenes se présente sous la forme de bacilles La mobilité peut être confirmée par ensemencement en piqûre
minces, courts animés de legers mouvements rotatifs ou d'une de milieu SIM (5.4.3).
mobilit~ en oi;ouet1es. Il se peut que la mobilité 'oit réduite ou Incuber à 30 oC pendant quarante-huit heures et examiner la
absente, ceci étant dû à la température d'incubation de 37 oC de croissance autour de la piqûre. La croissance autour de la
la boite. Il y a lieu d'avoir toujours pour comparaison une piqûre peut être faible ; si elle est négative, observer après
culture de contrôle positive. us coccibacillcs épais ou bacilles cinq jours en laissant la culture à température ambiante (20 à
animés d'une mobilité extrémement rapide ne sont pas des 25 oC) (mobilité en parapluie).

INOCULATI-ON DES BOÎTES DE CAMP. TEST

Souche de L mococyt. témoin

f3 h&molyse faible

souche de
Rhodococcus equi ----......t._ souche de Staphylococcus aursus
hémolytique

Hémolyse en « pelle •

souches à tester

Gélose sang

Les. souches sont ens.emen~ en stries « en échelle '' ; avec un espacement d'environ 1 cm entre les stries horizontales (Listeria) et
d'environ 1 à 2 mm entre chaque strie horizontale et les deux stries verticales (R. equi et S. aureus).
A la suite d'un cenain nombre d'essais et afin d'éviter des problèmes d'interprétation, il s'avère que certains résultats de l'épreuve de Camp
mentionnés dans le tableau 3 du protocole FDA peuvent donner les réactions suivantes :

RHODOCOCCUS EQU/
ESPËCES S. AUREUS XYLOSE RHAM.
FDA LCHA

t ~~~~x~~~~~~.:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
L innocuB .........................................................
+
- (•) +
+
+ +
+
v
L welshimeri .................................................. . + v
L seeligeri........................................................ +faible +faible +
(") Pouvoir hemolytique positif mais non axalto.
- Sérogroupage. - Lysotypie.

Toutes les souches présentant un pouvoir hémoly1ique (L monocytogenes, L ivanovii et L. seeligen) doivent être expédiées à :
Centre national de référence des Listeria, professeur Courlieu, Laboratoire de microbiologie et hygiène, U.F.R. de médecine;, B.P. IG24
44035 NANTES CEDEX 01.

Il. Expressloa des résuluts

Mode de calcul (consulter la nonne NF V 08-014 : !984. - Directives génl:rales pour le dénombrement de Staphylococcus aureus. Méthode

ANNEXE

DIAGRAMME DU MODE OPÉRATOIRE

Prise d'essai + diluant
Homogénéisation

Etalement de 0, l ml de S. M. à la surface de milieux sélectifs (si possible : Oxford + Mo x ou Pal cam + Mox) (1)

Incubation à 37 •C pendant 48 heures

Sélection de cinq colonies caractéristiques

Ensemencement sur TSYEA

Incubation à 37 oC pendant 24 heures

(ou davantage si nécessaire) Examens complémentaires

(!) La stlcctivitb ± grande des milieux (Palcam surtout) depend de l'origine C<Jmmerciale. Utiliser, de prHI:rence, deux milieux de sélectivité différ:ntr
compte tenu des norC$ competitives. .
 - 427-

ANNEXE XV:

Listeria-Tek ELISA.

LISTE RIA-TEK
Dépistage qualitatif des Listeria par méthode ELISA*
L1steria est un petit bacille Gram positif mobile el non sporulé. Leur particularité est
la production d'une catalase qui intervient dans la décomposition des aliments. Leur
croissance peut se produire en présence ou en absence d'oxygène, elle n'est pas
perturbée par des variations de température, y compris par la réfrigération.
Ses possibilités multiples de croissance, couplées à sa pathogénicité, font ~e Listeria
un germe fréquemment rencontré dans les aliments.

Les Listeria pathogènes ou non pathogènes sont retrouvés dans la nature,

essentiellement dans la terre, la végétation et l'eau. L'infection par Listeria résulte
de l'mgestion d'aliments ou d'eau contenant de nombreuses bactéries Listeria
pathogènes. Les manifestations cliniques se traduisent par des affections comme la
grippe, une méningite, une pneumonie, une septicémie ou une endocardite. Elles
peuvent provoquer un avortement spontané ou une naissance prématurée.

Bien que la majorité des infections à Listeria soit retrouvée chez les nouveaux-nés,
!es femmes enceintes, les patients immunodéprimés et âgés, certains cas
occasionnels ont été décrits chez des sujets apparemment soins.

Caractéristiques Principe du test Présentation Référence : 52100

• Rapide Des anticorps monoclonaux anti Listerio -- Kit pour 96 déterminations
Résultats en 48 heures sont fixés ou fond des cupules de - Présence d'un contrôle positif et
polystyrène. Les antigènes présents d'un contrôle négatif
• Sensible et spécifique
dans l'échantillon à analyser forment - Réactifs prêts à l'emploi
Utilisation d'un mélange d'anticorps
monoclonaux pour le Coating et le
un complexe immunologique avec les - Stable, si conservé entre + 2°( et
Conjugué
anticorps monoclonaux liés à la + 8°C, environ 12 mois après la
plaque micro ELISA. Le Conjugué dote de fabrication. Se référer à la
• Simple d'utilisation composé d'un anticorps monoclonal dote limite d'utilisation indiquée sur
Méthode ELISA en un temps marqué par une enzyme reconnaît, chaque coffret.
Réactifs prêts à l'emploi selon une réaction de type «Sandwich»
l'antigène du complexe
• Sûre
immunologique formé précédemment.
La technique ELISA ne nécessite aucune
Après une étape de lavage, le substrat
précaution particulière d'aseptie, seuls
(TMB) est ajouté et réagit
les échantillons subissent un traitement
spécifiquement avec l'enzyme du
par chauffage au préalable.
Conjugué, en développant une
• Economique coloration bleue, directement
-- Date de péremption longue proportionnelle au taux d'antigène
-· Adaptation aux séries de dosage Listeria présent dans l'échantillon
par 8 barettes sécables de étudié.
12 cupules chacune La réaction colorée est stoppée par
- 1 nterprétation fiable et rapide une solution d'acide fort et vire du
permettant une réelle diminution bleu au jaune. L'absorption est
du coût de fonctionnement par déterminée en point final à 450 nm.
rapport aux méthodes manuelles.

Principle

[R+
; :)'~ose Lis feria Anti L1steria! Chromo genie Co/or
:•·'.-! :srena in sam pie Enzyme substrate
coniugate
 -428-

1.
l r-------t
1
l 00 f.ll
1
DISTRIBUTION
-Préparer les témoins (1 ).

~u
-Distribuer 100 ~tl de témoins, d'échanrillon(s) dans
les cupules respectives selon la disposition
suivante : témoin négatif, témoin positif, échantil-
lon A, échantillon B, etc ... témoin négatif.
+
échantillon échantillon yyy

lOO f.ll

l l
M
Il

---
....{
·~
2.
-1
CONJUGUE
'if•

conjugué
- Préparer le conjugué (2).
. .f ·._.?'
YY -Distribuer 100 pl de conjugué dans chaque cupule.
- Incuber 60 minutes à 37°C.
-Préparer le substrat (3) et le tampon de lavage (4).
- Laver chaque cupule 6 fois avec le tampon de lavage.
lOO f.ll
3.
! l
M
Il SUBSTRAT
- Distribuer 100 pl de substrat TMB, dans chaque cupule.
- Incuber 30 minutes à température ambiante.
<0> V\) "' f"'t!)
4.
tti TMB
substrat y y'·'('
LECTURE
-Distribuer lOO pl d'acide sulfurique 2 N,
dans chaque cupule, pour arrêter la réaction.
- Lire en point final, l'absorption de chaque cupule
avec un spectrophotomètre Microelisa muni
lOO f.il d'un filtre à 450 nm.

! Il
l
B
- ....,
,..... ,.....
5. INTERPRETATION
-
- N : absorption moyenne des témoins négatifs.

+ H2 S04
N<0,300

- p : absorption du témoin positif.

u w

P>0,700

-s : absorption de l'échantillon à tester.

- Résultats qualitatifs

* Listeria : un échantillon est positif si :

S~Nt0,150

6. CONFIRMATION
5i S~Nt0,150, l'échantillon
est présumé contElnir des Listeria. La confirmation
et l'identification peuvent être réalisées en 4 heures
avec le kit Micro ID Listeria.
 -429-

PROTOCOLE D'ENRICHISSEMENT LISTER/A

25 g Produit + 225 ml FRASER BROTH MODIFIED

BBL 12395 Supplement BBL 12401

1
24 • 26 heures à 30° C

·-·-··--·-----·J·-·----·
0,1 ml + 10 ml Bouillon Enrichissement LISTERIA

AEB 140542 Tamponné par

- 9,6 g 11 Na 2HP04 - 1,35 g 11 KH2P04

l ml ALIQUOT

Porté à ébullition pendant 20 minutes

Refroidir à tempélture ambiante

Listeria • Tek ELISA

 -430-

CONTENU

1 portoi.r Barrettes de Microelisa - huit par supp01t, chacune

contenant 12 puits avec des anticorps monoclonaux anti
Listeria (Souris); contenu dans une boîte métallisée avec
du gel de silicate aux propriétés deséchantes.
1 flacon Témoin négatif- Antigène lyophilisé non réactif pour
l'espèce Listeria. Il contient du sulfate de gentarnicine
comme conservateur.
1 flacon Témoin positif- Antigène Listeria lyophilisé; réactif avec
des anticorps an ti -Listeria. Il contient du sulfate de
gentamicine comme conservateur.
2 flacons Diluant du conjugué- Sérum de souris et Tween-20 dans
une solution saline de phosphate tamponnée; il contient du
sulfate de gentamicine et de l'aldéhyde cinnarnique
comme conservateur et du FD&C rouge n° 2 comme agent
colorant.
2 flacons (6 ml) Conjugué (Souris ) - Péroxydase lyophilisée conjuguée
avec l'anticorps a.nti-Li steria.
1 flacon (1 ml) Solution A de substrat TMB-
3, 3', 5, 5'- Tétraméthylbenzidine.
1 flacon (6 ml) Solution B de substrat TMB -
Péroxyde d'hydrogène.
1 flacon (10 ml) Solution de lavage concentrée - 50X - 2,5 % de surfactant.
1 flacon (12 ml) Solution d' arrêt - Acide sulfurique 2N.
10 feuilles Bande adhésive.

MATERIEL SUPPLEMENTAIRE NECESSAIRE

*Aspirateur 1système de lavage connecté à un système d'évacuation et à une pompe à vide.

* Lecteur de rnicroplaques ou de barrettes. Longueur d'onde 450 nm.
*Incubateur à 30- 37°C.
* Pipette multicanaux, 50-200 ~1.

* Pipette simple, 50-200 ~1

* Embouts de micropipettes
* Milieux déshydratés pour la préparation des bouillons d'enrichissement.
* Plaque chauffante ou bain-marie d'eau bouillante.
* Tubes de culture boucht:s vis .
*Récipients appropriés de stockage et d'enlèvement ou destmction de matériel potentiellement
contaminé par des agents infectieux.
* Fiche d'enregistrement.
 - 431 -

L PREPARATION DES REACTIFS

Préparer avec attention les réactifs, avant de commencer la procédure d'essai. Les réactifs doivent
être à température ambiante (20-25°C) avant de commencer le test et peuvent rester à cette tempéra-
ture pendant le test.
Remettre les réactifs à 2-8°C après utilisation.

Ql.~Hl.Gl.LE.
1. Reconstituer le conjugué en ajoutant le contenu d'un des diluants dans un flacon du conjugué
lyophilisé. Mélanger doucement en inversant le flacon plusieurs fois.
2.La solution reste stable 30 jours à 4°C après reconstitution.

ANTIGENE DE CONIROLE
1. Reconstituer le témoin négatif en ajoutant 2 ml d'eau distillée stérile au flacon.
2. Reconstituer le témoin positif en ajoutant 1 ml d'eau distillée stérile au flacon.
3. Ajouter 60 jours à la date de préparation pour déterminer la date d'expiration. Les témoins
inutilisés doivent être gardés à 2-8°C.

LE SUBSTRAT TMB
l. Calculer la quantité totale (ml) de substrat TMB nécessaire, en multipliant le nombre de puits
utilisés par 0,12 ou utiliser la table de préparation du substrat.
2. Mélanger dans un tubt: ct à volume égal les so1utions A et B pour obtenir cette quantité.

AVERTISSEMENT
Préparer le substrat TMB juste avant de l'utiliser. Jeter ce qui n'est pas utilisé.

SOLUTION DE LAVAGE
Diluer au cinquantième la solution de lavage avec de l'eau distillée ou de l'eau déminéralisée (10
ml de solution de lavage concentrée dans 490 ml d'eau). Cette solution est stable pendant 60 jours
à 2-8°C.

.sD.l{.!.LI!QN..ωRKEI
Eviter le contact avec la peau. Si un contact se fait, iaver la zone avec de reau.
 -432-

TMB- TABLE DE PREPARATION DU SUBSTRAT

No of wells TMB solution A TMB solution B Total Volume

to be used TMB substrate

'1 0.06 0.06 o. '12

2 o. '12 o. '12 0.24
3 0.'18 0.18 0.36
4 0.24 0.24 0.48
5 0.30 0.30 0.60
6 0.36 o:36 0.72
7 0.42 0.42 0.84
8 0.48 0.48 0.96
9 0.54 0.54 1.08
10 0.60 0.60 1.20
15 0.90 0.90 1.80
20 1.20 '1.20 2.40
25 1.50 1~50 3.00
30 1.80 1.80 3.60
35 2. '10 2.10 4.20
40 2.40 2.40 4.80
45 2.70 2.70 5.40
50 3.00 3.00 6.00
55 3.30 3.30 6.60
60 3.60 3.60 7.20
65 3.90 3.90 7.80
70 ('( 4.20 4.20 8.40
75 . 4.50 4.50 9.00
80 4.80 4.80 9.60
85 5.10 5.10 10.20
90 5.40 5.40 10.80
95 5.70 5.70 11.40
96 5.76 5.76 11.52
 -433-

II. PROCEDURE DU TESTLISTERIATEK

A. Préparer le portoir avec le nombre nécessaire de rangées de puits.

Prévoir un puits pour chaque échantillon et ajouter 3 puits pour les témoins.
B. Pipeter 100 111 d'échantillon et 100 111 des témoins et les introduire dans les puits correspon-
dants.
Inclure deux témoins négatifs et un témoin positif par portoir de barettes dans l'ordre suivant :
- témoin négatif, témoin positif, échantillon 1, échantillon 2, échantillon 3... échantillon X,
échantillon Y, échantillon Z, témoin négatif
C. Pipeter 100 111 de conjugué dans chaque puits contenant les échantillons ou les témoins.

REMARQUE
Il ne faut pas que l'extrémité de la pipette touche le contenu du puits.

D. Couvrir les rangées avec les bandes adhésives.

Mélanger le contenu des puits en agitant doucement la plaque. Incuber à 37 °C pendant une heu
re.
E. Enlever les languettes adhésives des puits. Laver chaque puits six fois avec la solution de lavage.
F. Pipeter 100 111 de solution de substrat TMB fraîchement préparée dans chaque puits.
Incuber à température ambiante (20-25°C) pendant 30 minutes.
G. Pipeter 100111 de solution d'arrêt dans chaque puits.
Les microplaques doivent être lues dans un délai de 10 à 15 minutes.
H. Faire le blanc du lecteur sur l'air et ensuite lire l'absorbance des solutions dans chaque puits à
450 nm.
1. Fermer bien hermétiquement et remettre tous les réactifs non utilisés à 2-8°C.
 -434-

EXPRESSION DES RESULTATS

REMARQUE
Les calculs doivent être réalisés pour chaque test .

.Validation des valeurs témoins

Calculer la valeur moyenne (NCX) des deux témoins négatifs (NC). Cette valeur doit être
inférieure à 0,300. La valeur du témoin positif (PC) doit être supérieure à 0,700 (cette valeur peut
être hors échelle).
Tous les témoins doivent être compris dans les limites données ci dessus, dans le cas contraire
le test doit être répété.
Les deux valeurs des témoins négatifs doivent être inférieures à 0,300.
Des valeurs supérieures ou égales à {1,300 indiqueront un défam de manipulation lors du lavage.

. Seuil de positivité
NCX +0,150
. Interprétation des résultats
Si l'absorbance de l'échantillon est supérieure ou égale à la valeur du seuil de positivité, on
admet la présence de LISTERIA.
Le résultat peut être confirmé et l'espèce définie après culture à partir du milieu
d'enrichissement StXOI)d.:{ire.

Continuer avec des identifications biochimiques et sérologiques après isolement des listéria,
en utilisant les procédures standards ou les galeries Micro-ID Listéria.
Si le test ELISA est négatif (absorbance de l'échantillon inférieure à la valeur seuil de
positivité), l'échantillon n'a pas un niveau détectable d'antigènes par cette méthode, et aucun
autre test n'est nécessaire.
 -435-

FICHE D'ENREGISTREMENT

Kit: Date d'expiration:

Effectuée par: Le:
 -436-

ANNEXE XVI:

Listeria-Tecra ELISA.

Produits carnés

Milieu UVM
(acriflavine à 12 mg/1)
24 h à 28°C - 30°C

Dilution 1/100 ème

en Fraser
24 h à 28°C - 30°C

Ajouter 50 ~1 de complément
à 1 ml de bouillon puis thermiser
15 min à 100°C

TECRA TM 2h

ret kr!antillons
t•mo•ns

1 1 '
1 ! 1 cv ( COnJugue

............ 1 1 1 , 1

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kfwkbdc.J
---·-·· ·
_..
Lecture Pl'l<nOmalricue
A.
 -437-

ANNEXE XVII :

TRANSIA.

Le test s'effectue sur une partie aliquote stérilisée (100 ~1) du milieu liquide d'enrichissement
pour Listeria inoculé 48 heures auparavant avec l'échantillon du produit à contrôler.

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1 - 1\f !' \R Il il! l'\ l 1} i 1.1. fi.\ '\TfLU J'\
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1 Distribuer 100 ~1 d'échantillon enrichi dans un
puits sensibilisé de la microplaque de réaction .
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o_ -- 0.-- 0,_- Ajouter dans le puits correspondant 100 ~1

- ·-- -- ;~li­
.i -:.: d'anticorps conjugués.
:: Laisser incuber 60 minutes à 37° C.
..'·· -·-
\

1
: . Î \ \ i.\ ;. ;

•••
Laver les puits six fois de suite avec 200 ~1 de
solution de lavage .

-
'•·;·
.; -l{l. \Î ·~ lt•'\ J '-•.l\ \l \ l l!Jl E
['~

•••
Ajouter 100 ~1 de substrat enzymatique dans le
puits .
"'
Laisser incuber 30 minutes à 20° C.

:-- \1\H.!T DL l. \ l<J -\CliO'\

v v v
•••
Ajouter 100 ~1 de solution d'arrêt dans le puits.
Le résultat est obtenu par lecture de la densité
optique des puits à 450 nm, à l'aide d'un lecteur
calorimétrique ElA de microplaques.
LEGENDE
Anticorps monoclonal fixé sur les parois du puits .
• Antigènes de Listeria.
(> Antigènes microbiens autres que Listeria.
Anticorps monoclonal conjugué à la péroxydase.
Substrat enzymatique.
,çr. Substrat enzymatique coloré par la péroxydase. 1
 -438-

ANNEXE XVIII :

VIDAS Listeria (LIS).

VIDAS Listeria !LISl Diagnostic in Vitro

Test immunoenzymatique pour la détection des Listeria dans les produits alimentaires et l'environnement par
technique ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)

PRINCIPE
VIDAS Listeria est un test automatisé sur le système Toutes les étapes de la réaction sont gérées par
VIDAS, permettant la détection après enrichissement l'instrument. Le cône à usage unique sert à la fois de
des Listeria contaminant les aliments ou phase solide et de système de pipetage. les autres
l'environnement Ce test associe une technique réactifs sont répartis dans la cartouche.
immunoenzymatique directe de type "sandwich" à
une lecture en point final d'une fluorescence (ELFA).

REACTIFS
Conservation à 2 - 8 °C. Ne pas congeler les réactifs.
la date d'expiration est indiquée sur le conditionnement.

Composition du coffret (60 tests) :

60 cartouches LIS Prêtes à l'emploi

2 x 30 cônes LIS Prêts à l'emploi.
Cônes sensibilisés avec des anticorps (souris) spécifiques des antigènes de
surface des Listeria. Ne sortir du sachet que le nombre de cônes
nécessaire.
Bien refermer le sachet après ouverture.
Contrôle positif LIS Antigène purifié et inactivé de listeria monocytogenes
1 x 6 ml (liquide) + azoture de sodium: 0,1 %.
+ stabilisant protéique
Contrôle négatif US TRIS- NaCI -Tween 150 mmof/1
1 x 6 ml (liquide) + azoture de sodium : 0,1 %.

Calibrateur LIS Antigène purifié et inactivé de listeria monocytogenes

1 x 3 ml (liquide) + azoture de sodium: 0,1 %.
+ stabilisant protéique

Description de la cartouche
Puits Réactifs
1 Puits échantillon
2 Tampon de prélavage (400pl) -TRIS NaCI Tween 150 mmol/1
+ azoture de sodium 0,1 %
3-4-5-7-8-9 Tampon de lavage (600,ul) - TRIS NaCI Tween 150 mmol/1
+ azoture de sodium 0,1 %
6 Conjugué (400 pl : anti listeria fgG (mouton) marqués à la phosphatase
alcaline
+ azoture de sodium 0,1 % )
10 Cuvette de lecture (300 pl)
Substrat : 4 méthyl-ombefliféryl phosphate
+ azoture de sodium 0,1 %

l'identification du test, le numéro de lot et la date d'expiration sont inscrits sur la cartouche et repris par le code
barre.
 -439-

MATERIEL NON FOURNI MODE OPERATOIRE

Pipette à embout jetable permettant la distribution de 1 . Taper sur le clavier les données correspondantes
500 pl. Bain marie (1 00° C) ou système équivalent. aux références des échantillons et au test LIS afin
de créer "une liste de travail", selon le manuel
PRECAUTIONS D'UTILISATION d'utilisation VIDAS.
1. Ne pas mélanger les réactifs de lots différents. 2. Déposer dans le 1er puits de la cartouche 500 pl
2. Sortir les réactifs à la température du laboratoire d'échantillon, de calibrateur ou de contrôles.
avant emploi, au moins 30 minutes avant leur Remarque : A chaque réception d'un nouveau lot
introduction dans le VIDAS. de réactif et tous les 14 jours, procéder à une
calibration (voir manuel chapitre "Menu
3.S'assurer que le déshydratant contenu dans le calibration") à l'aide du calibrateur testé en double.
sachet des cônes n'a pas changé de couleur
(passage du bleu au rose). 3. Placer dans le VIDAS le cône et la cartouche dans
les positions indiquées.
4.Bien homogénéiser le calibrateur, les contrôfes et
4. Suivre le protocole conformément aux instructions
les échantillons pour une meilleure reproductibilité
des résultats. du manuel d'utilisation VIDAS. Les résultats sont
obtenus en 45 minutes environ.
5. Veiller à ne pas toucher la cuvette de lecture.
CONTROLE DE QUALITE
ECHANTILLONS
Vérifier périodiquement la validité des résultats à
l'aide des contrôles.
· Les protocoles suivants sont recommandés pour la Les valeurs attendues pour les contrôles sont
préparation des échantillons (après validation par le données ci-dessous :
laboratoire, d'autres protocoles peuvent être utilisés
si l'enrichissement final est incubé à 30 °C) : Valeur de Fluorescence Valeur du
Relative (RFV) Test
1.Produits laitiers. Utiliser la procédure de la FDA Contrôle positif 1500- 3500 0,5- 1,2
(Food and Drug Administration) modifiée : ajouter
Contrôle négatif 5- 150 <0,1
aseptiquement 25 g (ou 25 ml) d'échantillon à 225
ml de bouillon LEB tamponné. Homogénéiser et
incuber 22-24 heures à 30 °C. Après incubation, RESULTATS
transférer 1 ml de la suspension dans 9 ml de Dès le test terminé, les résultats sont analysés
bcui!lcn FRASER et incuber à nouveau 22-24 automatiquement et la valeur du test (rapport de la
heures à 30 °C (pour les produits laitiers non RFV obtenue pour l'échantillon et de celle obtenue ou
pasteurisés, le CNEVA/LCHA recommande mémorisée pour le calibrateur) est calculée par le
d'ensemencer le bouillon FRASER avec 0,1 ml de VIDAS.
bouillon LEB).
Autres produits alimentaires. Ex : viandes crues, Seuil et interprétation des résultats
produits de la pêche, charcuterie ... Utiliser le
Valeur test Interprétation
protocole de I'USDA : ajouter aseptiquement 25 g
(ou 25 ml) d'échantillon à 225 ml de bouillon s.. 0,1 Négatif
UVM1. Homogénéiser et incuber 22-24 heures à 30
>0,1 Positif
°C. Après incubation, transférer 0,1 ml de
suspension dans 10 ml de bouillon FRASER. Incuber Un résultat positif doit être confirmé en suivant la
22-24 heures à 30 °C.
procédure officielle à partir du bouillon
Contrôle d'environnement (écouvillonnage). Placer d'enrichissement conservé au réfrigérateur.
l'écouvillon dans 10 ml de bouillon UVM1. Agiter
puis incuber 40-48 heures à 30 ° C. Dans le cas de PERFORMANCES
l'utilisation d'une éponge pour les prélèvements de
Les six espèces de Listeria : monocytogenes,
surface, placer celle-ci dans 100 ml de bouillon
innocua, seeligeri, ivanovii, welshimeri et grayi sont
UVM1. Agiter puis incuber 40-48 heures à 30 °C.
détectées par le kit VIDAS Usteria.
2 Après incubation, prélever 1 ml du bouillon, le
placer dans un tube et chauffer au bain-marie 1 5 L'utilisation d'anticorps spécifiques n'a pas permis de
minutes à 100°C. noter de réactions croisées avec d'autres espèces
bactériennes.
3.Conserver _le reste de la culture à 4°C pour
confirmation en cas de résultat positif.
 PH01'(}('0J.J;_;S lJ'HNHICIJ/SSE2t.1ENT RECll~1lt.1ANIJES POUR LA DE1'k'C1101V
JJES LL't1'k'RIA PAR LE SYSTEAIE ~1lh1S

PRODUITS DE LA MER PRODUITS LAITIERS PRODUITS CARNES

PRELEVEMENTS CRUS ET
PRODUITS LAITIERS PLATS PREPAIU~S D'ENVIRONNEMENT TRANSFORMES
NON PASTEURISES
VOLAILLE

Milieu LER Milieu LER Milieu UVI\11

22 + 1- 2 h à 300(' 22 + 1- 2h à 30"C Milieu UVI\11 22 + 1- 2 h à 300C

À
À
0
0, 1 ml LEB dans 1 ml LEB dans 40 à 48 h à 30°C 0,1 ml d'UVMI
10 ml FRASER 10 ml FRASER dans 10 ml DE FRASER

22 + 1- 2 h à 30"C 22 +/- 2 h à 30''C 22+/-2 h à 300C

Ac conjugué
à la phosphatase alcélliJw
------- 1
CHAUFFAGE 15 MIN- 100 oc
1
i
1

umlwllilt>J'\I 0.5 1\lL DANS LA BARRETTE VIDAS LIS

.-\c fixr ptwspila t;, l
Iii luant

1 RESIILTATS EN 45 MIN ~
 -441 -

ANNEXE XIX·

Listeria monocytogenes et produits alimentaires

"zéro tolérance ou moins de ... "
Patrick DEHAUMONT
Direction générale de l'alimentation, sous-direction de l'Hygiène alimentaire {mai 1992)

La survenue de quelques foyers d'intoxications alimentaires mettant en À l'évidence, la question est d'une grande complexité et la solution ne sera
cause Listeria monocytogenes durant la décennie 80, fortement amplifiée par sûrement pas manichéenne.
les médias, a généré de façon tout à fait légitime l'inquiétude de nombreux Cette solution, fondée sur des bases scientifiques solides, doit considérer
consommateurs et a eu des conséquences importantes sur les flux commer- que, compte tenu de sa présence dans J'environnement, il est techniquement
ciaux de différents produits alimentaires. impossible de garantir l'absence totale de Listeria monocytogenes dans les
aliments (à moins de leur faire subir un traitement listéricide après condition-
En effet, s'il est clair que la listériose humaine est une maladie dont l'inci- nement ou avant conditionnement aseptique). Ce point de vue a d'ailleurs été
dence est très faible (0,2 à 7 cas/million d'habitants), sa létalité très élevée énoncé par l'Organisation mondiale de la Santé en 1988.
(17 à 33 %) justifie que des mesures de prévention rigoureuse soient mises
en œuvre, afin de garantir la salubrité des aliments offerts au consommateur, Toutefois, l'enjeu sanitaire majeur justifie pleinement que tout soit mis en
même si le rôle de J'alimentation est rarement établi avec certitude lors de œuvre.pour que le niveau de contamination des aliments soit le plus bas pos-
l'apparition de cas de listériose humaine. sible. A cette fin, les professionnels de l'agro-alimentaire, outre le strict res-
pect des dispositions réglementaires, doivent mettre tout en œuvre pour
Ce double enjeu sanitaire et économique a conduit les Services vétérinaires limiter la contamination par Listeria monocytogenes et éviter sa multiplication
du ministère de l'Agriculture et de la Forêt à mettre en place, depuis plusieurs (utilisation de systèmes d'analyse et de maîtrise des risques ou de guides de
années, des protocoles de contrôle et de qualification des établissements bonnes pratiques, par exemple).
fabriquant des produits sensibles d'une part, et des études permettant d'éva- Mais attention, dire que le niveau de contamination doit être le plus bas pos-
luer l'importance de la contamination de certains de nos aliments, d'autre sible ne signifie pas «zéro tolérance». Il s'agit, au contraire, en fonction du
part. niveau de risque d'un produit donné (possibilité de contamination et aptitude
de ce produit à assurer la multiplication du germe) d'envisager des niveaux
S'agissant du contrôle et de la qualification, il existe pour certains produits de tolérance permettant une action graduée.
laitiers tels que les fromages à pâte molle par exemple, un protocole de qua- Ce mode de raisonnement peut être résumé selon le logigramme suivant :
lification Listeria. Il s'agit, grâce à la réalisation d'analyses sur des échantil-
lons prélevés chaque semaine, de s'assurer que l'entreprise maîtrise les pro- Produit pour lequel il est possible de garantir l'absence
cédés de fabrication et est ainsi à même d'offrir des produits ne présentant de listeria monocytouenes
pas de risque pour le consommateur. Les prélèvements sont faits par l'entre-
prise et analysés par un laboratoire agréé. À côté de ces autocontrôles un
contrôle officiel est réalisé chaque mois par les services vétérinaires départe-
mentaux. Lorsqu'un des contrôle est positif (présence de Listeria, quelle que
Non
_____-J----_. Oui
soit la quantité, dans 25 grammes d'aliment), le lot est retiré de la consom-
mation, la qualification Listeria de l'entreprise suspendue et l'agrément à
l'exportation arrêté. La qualification Listeria et l'agrément à l'exportation ne ~
Produit Produit Produit destiné
1
1
sont rétablis que lorsque 3 contrôles officiels à moins de 15 jours d'intervalle
et au moins 20 autocontrôles consécutifs sont négatifs pour la recherche de à faible risque à haut risque à des populations 1
Listeria. Parallèlement, les actions correctives d'assainissement sont mises 1 1 à risque 1
en place dans l'entreprise sous le contrôle de la D.S.V.
1 1 1 ~
d'acceptabilité~
Ce dispositif permet aux services officiels de s'assurer de la salubrité des Retrait de la consommation
produits mis à la consommation sur le territoire national et de garantir Actions correctives
vis-à-vis de nos partenaires étrangers la sécurité des produits exportés. • Critè:e 1 Rappel des lots contaminés
• Actions correctives quel que soit
Les études sur les niveaux de contam'1nation de nos aliments constituent, Je niveau de contamination
quant à elles, un élément fondamental pour une prise en compte raisonnée et • Rappel des lots à partir d'un certain niveau
raisonnable du risque Listeria. En effet, au-delà des risques sanitaires (qui de contamination
sont réels), l'apparition de quelques accidents isolés a conduit les autorités
sanitaires des différents pays à adopter des attitudes très disparates, liées le Une telle démarche est à l'étude au sein de la sous-direction de l'Hygiène ali-
plus souvent à leur vocation de pays importateur ou exportateur. Pour mentaire qui définira prochainement des lignes directrices, s'inspirant de ce
certains d'entre eux, il est ainsi apparu beaucoup plus simple d'imposer le logigramme à l'intention de ses agents chargés des contrôles officiels. Mais
principe de « zéro tolérance » sans se préoccuper de la faisabilité de tels il s'agira bien de lignes directrices, envisageant l'établissement de tolérances
critères. et, en aucun cas, de critères réglementaires. En effet, les critères en tant que
tels n'ont que peu d'intérêt. Ils apportent, par contre, des informations
Ainsi, la plus grande hétérogénéité existe au niveau international fondamentales sur le niveau de régularité de la maîtrise des procédés dans
U.S.A. .................. Zéro tolérance; l'entreprise.
Canada . . . . . . . . . . . . . . . . . Tolérance relative; Dans cette perspective, des lignes directrices seront d'un usage beaucoup
Pays scandinaves ......... Zéro tolérance irréaliste et importance de plus sûr en permettant aux services officiels d'appréhender le risque
J'autocontrôle; sanitaire, entreprise par entreprise, le mode d'évaluation devant néces-
Allemagne ............... Tolérance, avec définition de critères pour sairement évoluer quant à lui au même rythme que les connaissances
différentes catégories de produits. épidémiologiques et scientifiques.
 -442-

ANNEXE XX:

Réglementation.

CONSEIL SUPERIEUR D'HYGIENE PUBLIQUE

DE FRANCE
SECTION ALIMENTATION

Séance du 8 septembre 1992

AV1S RELATIF A L1STERL'i M.ONaaTQGENES. ET AUME!\TTfATION

* Can.ddérant que :
Diverses enquêtes épidémiologiques ont montré que la listériose humaine connaît en
général une ori.e;i~e alimentaire.

Listeria monocytogenes est un germe ubiquistc, largement répandu dans

l'cnviruuncment naturel (sol, eaux, végétation naturelle, prairies ct cultures) et qu'il
existe un portage asymptomatique chez l'homme ct l'animal.

Il est, de ce fait, à Pheure actuelle, technlquem~.;nt im~iblc de garantir Pabse.nce

totale de Listeria monocytogenes dans les denrées animales ou végétales brutes ainsi
que <Ùln$ les produits manipulés ou transformés, à l'exception des produits
alimentaires ayant subi un traitement d'assainissement dans leur conditionnement
définitif ou conditionnés ascptiquemcnt après traitement.

Des règles d'hygiène appropriées et scrupuleusement appliquées tout au long de la

chaîne ati..'llcntairc: pennettent r:.éanmoins d'éviter, ou de réduire à un très faible
niveau, la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments.

"' Considérant par ailleurs que :

Il résulte de l'observation mentionnée dans le 2ème considérant des contacts fréguculs

de la population humaine avec ·te germe.
La listeriose humaine évolue essentiellement sous forme de cas sporadiques parfois
amplifié.s de petites bouffées épidémiques voire de véritables épidémies. L'incidence
de la maladie est faible (évaluée à lU à 15 cas par milliuu d'habitants en FrililCC par
an) mais le taux de létalité est élevé (20 à 30 %).
 -443-

.. +·Considérant enfin que :

Les données épidémiologiqucs montrent que certaines catégories de consommateurs

~ont particull~n:mc:ut :scn:sible~ : il s'agit en particulier des femmes enceintes, des
nouveaux-nés, des personnes âgées, des personnes immunoèéprimées
(transplantations d'organes, cancers, sida). des personnes atteintes d'::~f.fcctions
intercurrentes (diabète, maladies hépatiques ·chroniques, maladies vasculaires et
collagtnoses, défaut d'acidité gastrique).
\

'* La ~ction Alimentation du Conseil Supérieur d'Hygiène Publique de France est d'avis que :
De-~ m(':sures de. prévention rigoureuses doivent exister à tous les stades Je ~..:hayue
filière agro-alimentaire afin de réduire ttincidence de la listériose humaine et de
tendre pour l'ensemble des denrées alimentaires vers une absence de Listeria
monocytogenes.

A cc titre, chaque opérateur de la chaîne alimentaire, à chaque stade depuis la culture

ou Pélevagc, la collèctc ou l'abattage, la transformation, l'entreposage, le transport,
la rcstauratjou, la ùi:mibutîon, jusqu'à l'utilisation domestique des aliments par le
consommateur final, doit prendre toutes mesures appropriées, cohérentes avec la
nature des produits alimentaires concernés, pom ~vite.r la contamination des climents
par Listeria monocytogenes, en prévenir la multiplication, voire en assurer la
destruction.

Dans ce but, outre les dispositions que doivent prendre les consommateurs, chaque
opérateur doit respecter scrupuleusement les exigences réelem~ntaires en vigue1.:r
reiativcs à la sécurité alimentaire et pour ce qui le concerne en propre ainsi que de
façon concertée avec les autres partenaires de la filière, identifier les procédés
c.<:.,entiels à. la sécurité des produits ct assurer la détt:llllÎnation, la mise en oeuvn:, le
suivi et la vérification des procédures de sécurité appropriées (système AACCP ou
tout système équivalent). Des guides de bonnes pratiques hygiéniques devraient r.tœ
conçus pour faciliter cette démarche dans chacun des secteurs concernés.

Lorsque le~ possibilités actuelles reconnues ct utilisables ù'in(ervention technique sur

les produits et leur environnement permettent d'aboutir à l'absence de Listeria
moMcytogenes, il y a Heu de retirer de la consommation humaine en l'état les
pruùuits qui sc révèlcraient contaminés. Entrent dans cette catégorie les aliments
spécialement destinés à la consommation de populations à risque (aliments pour
nourrissons ou certains aliments spéciaux à usage médical par excmph:), <iin~i que
les aliments ayant fait l'objet d'un traitement assainissant dans leur conditionnement
définitif ou conditionnés aseptiquement après traitement. Cette attitude devrait
également conccmc;;r le::; aliments ayant subi un traitement d'assainissement et
susceptibles d'être rccontaminés après traitement.
 -444-

Pour les autres produits où la': contamination ne pc11t être, .à l'heure actuelle, év1tée ct
pour le~yuels il n'est pas possibte de garantir totalement l'absence de LL~teria
monocytogenes, il y a lieu d'interpréter la découverte de Listeria monocytogenes fi
partir de l'ens.emblc d~~ données épidémiologiques, scientifiques, techniques, qui s'y
réfèrent. Il y a lieu également de graduer les mesures prises à t'égard des produits en
fonction notamment de leur nature, du stade de prélèvement, de leur mode
d'utilisation ct ùc .·leur implication dans des accidents liés à leur consommation, du
taux rencontré de Listeria monocytogenes ct de leurs possibilités de développement
dans les produits concemé.s, des conditiom; générales d'hygiène de leur
environnement. Pour ces produits, en tenant compte du fait que les données publiées
dans la littérature scientifique montrent que dans la très grande': majorité des cas, il
n';:~ pas été constaté ùe listériose humaine liée à la consommation d'aliments
renfermant moins de 100 Listeria monocytogenes/g, on considérera cette valeur
comme le scuH maximum admissihlc: au stade de la com;ummation ; lorsque des
contaminations seront mises en évidence, des mesures correctives pouvant aller
jusqu 'au retraH de la consommation en l'état des produits cont:.minés seront
immédiateme.nt misês en plaœ.

L'appUcation de cette tolérance doit être accompag.•"léc par l'obse1 vaüon pennanente
de sc:-; consëquences sur l'évolution de l'incidence de la listériose humaine afin de
réviser le principe ou. les modalités d1application si nécessaire.

Dans tous les cas, 11 y a lieu de rappeler que I'e~istence de cette tolérance ne doit en
aucun cas entraîner une diminution de la vigilanœ de chacun des opérareurs
concernés t:1 que cette tolérance ne saurait, en aucune façon, libérer les opérateurs
conc~rnés de l'application des dispositions juridiques relatives à l obligation générale
1

de sécurité ct à la respC>nsabilité du fuit des pLuùuiis défectueux.

Par- aillcursr il est souligné que l'information des catégories de consommateurs ~

risque est indispcusable er qu'elle doit être effectuée systématigue..-nent, par
l'intermédiaire des professions de santé à l'usage desquelles des infonnations adaptées
doivent être élaborées ct diffusées.
 -445-

LIGNES DIRECIRICES PROVISOIRES RELATIVES A U\ o:::N:UITE

A TENIR VIS 'A VIS DE PiU:XT.LTS IAITIERS PANS LE$ClJEI.S
LISTElU'A. ~ A E'I'E lSOLEE.

A-'PROIUITS PASTEl.lRISES :

1) Jiu stade de La fabricatiDn :

cri:tère d' acc:eptaticn de œs p.tOduits p:)UI: lesquels la matière première

I.e
a lrubi un tra.i t:arent
assainissant est eotuellanent "ir'rlêœlable dena 25 gn • En
~ les lots de prcxiuits qui se révèlent c:x:ntarn:in3s doivent itre sai sis (et
~letœ!nt après saisie destinés A une utilisaticn particulière tella que fente,
po.ldre. da lait, sous CXJUVert d'un lai:ssaz-passer sanitaire) •

2) Au stade as la dist.ribu.tion :
2
critère d 1acoept:atic:n àe œs prcrluits est filté à titre transitoil:e à 10
Le
(plan à 2 classes,n•S)

En 1' abserYE œ i:rx.lt tra.itsrent assainissant, · la QUal.ité sanitaire àe œs

prcduits est étroit:arent liée A la qualité de la ma-t;;Lèra pran:Lke utilisée et à
1 1 impo.rtance des cx:::ntaminaticns tout au loog du prcx:ESS.

Les différentes 91'X1Uêtes rial.is:êes jusqu' è œ jo.rr (plan de surveillarx:la,

~fiques dans le cache da l'êpidân:l.e) rocutxent
erx:J.l,lêtes clairement qua oertaines
fab:d.catirns peuvent ~tre c:x:rrtaminêes avec une fréQuenœl non négligeable.

Toutefois, œs cx:ntaminations qui s'axpliQ\.a'lt par les ra:i.salS évtx;tuées ci-

dessus, eont dans la rnajorité des cas peu élevées, et en tout état Cie cause l.ergeaent
inférieures A la c:ontam.inaticn ré::essaire t;:lOI.lr ocx::.asià'lner une listériose chez un
irrlividu en l:x:Jn état de santé.

En cx:nséquerY::a, et o:xrpte tenu des .in:format.icns déjà largerœnt diffusées

aupris des perscl"liES à risq:ue par les autorités sanitaires, i l a été décidé dans le
crrrt:axta ac:tue1 de l' épidanie d 1 swliQuer les 1~ direc:trioes suiventes lXJ.1t:' les
p:rdluits au lait CtU, qui ~ util&ment vous guider dans vos déci s:fCXlS

1) Au stade às la fabrication :

critërel; : " :indécelable d!!ms 25 g"

Pour les produits très se.~"'~.sibles (type St Neota:L.""'e, Reblod'cn, MJ.nst-...er1
V~, Brie... etx::) et à titœ transitoire, le critère
"disi:::r:'ih.rtirn" sera applicable sur les produits cxntrOlés en fin
d 1 affinage.

2) Au stsd8 àe la distribution :

Critères : n = 5 C .. 1
2
rn "" 10

~ l:MPORl'AmE : lors de 1' interprétation des résultats d 1 anal~, i l c:x;nvi.errlra

de prendre èi'J. ccrnpte les erreurs liées à 1' .i.rx:lertitudè de 1 1 analyse et du node de
œlcul de la I1l.lllération.
 -446-

PROCEDURE DE QW\LIFICATICN - LISTERIA

I - CHAMP D'APPLICATICN

Pour l'application de cette note de service, on considérera deux

catégories distinctes de fromages.

A) - Fromages appartenant aux types de fabrication suivants

Produits fabriqués et commercialisés sur le mardhé national ou

international quelle que soit l'origine du lait (vadhe, chèvre, brebis ou mélange).

1 o) Fromages soumis à la procédure générale de qualification

- Fromage à pâte molle : toutes catégories.

- Fromage à pâte persillée, à affinage inférieur à 4 semaines.

2°) -Fromages soumis à la procédure spécifique:

Fromage à pâte persillée à affinag~ supérieur à quatre semaines

exemple
- Bleu d'Auvergne,
- Bleu des Causses,
- Bleu de Gex ou du Haut Jura ou Bleu de Septmo
- Fourmes d'Ambert et de Montbrison,
- Roquefort.

- Fromage à pâte pressée demi cuite ou non cuite à affinage de

surface.

Fromages sUbissant de fréquentes manipulations au cours de

l'affinage (lavage- frottage). On incluera dans cette catégorie
tous les franages de type "Tomme". (à exclure : Cantal; Salers
et Laguiole) •

B) - Fromages e~rtés autres gué ceux du paragraphe A dont

Fromage ~ ~te fr~Îdhe

Fromage a pate culte
Fromage à pressée demi-cuite ou non cuite sUbissant peu
ou pas de nanipulations pendant l'affinage ("grattage"
en fin d'affinage admis pour parfaire la présentation,
fromages à croûte plastifée et fromage de type Cantal,
Salers et Laguiole).

La procédure de qualification - de ces établissements est identique à

la procédure de qualification prévue pour les fromages soumis à la procédure
spécifique (cf. II 2.2.2).

N.B Les franages fondus sont exclus du dhamp d'application de la présente note de
service.

II - <J]ALIFICATION "LISTERIA" DES ETABLISSEMENTS

Pour être titulaire d'une qualification "Listeria" les établissements

doivent obligatoirement remplir les conditions suivantes :

2-l. Dispositions générales:

-Respect des dispositions de l'Arrêté du 15 mai 1974 relatif aux conditions

d'hygiene dans les établissements de collecte et de transformation des produits
laitiers.
 -447-
-Mise en place des procédures d'autooontrôles et de contrôles officiels

par le fabricant selon les procédures décrites dans les paragraphes II et III.

-Conformité des résultats d'analyses officielles et des résultats

d'autooontrÔles

Les fromages doivent satisfaire au critère microbiologique suivant

Listeria Monœytogenes : absence dans 25 gramrœs.

Pour une lecture à 7 jours après le début de l'analyse.

N.B.: Indépendamment, de la procédure de qualification "Listeria", les établisserœnts

~rtateurs de fromages doivent également répondre aux dispositions, autres que celles
relatives ~ la Listeria, et être agréés selon les procédures prévues par :

l'Arrêté du 18 juin 1984 et des instructions prises en application en ce qui

concerne les fromages à pâte molle.
Note de Service N° 8.056 du 27 t1ars 1986
- Lettre Circulaire No 4.267 du 7 Octobre 1986
- Lettre Circulaire N° 4.442 du ll Septembre 1987

-l'Arrêté du 22 janvier 1987 et des textes pris en application en ce qui

concerne les autres catégories de fromages.
- Note de Service N° 8.076 du 9 Juin 1987

2.2 - Prélèvements
Deux types de procédure de prélèvements pour la qualification "Listeria" sont à
distinguer

2.2.1 - Procédure "générale"

Sont concernés : - Froma.ges à pâte molle,

Froma.ge à pâte persillée à affinage inférieur
à quatre semaines.

Les prélèvements sont effectués au moment du conditionnement (en moyenne

12 jours après l'emprésurage pour les produits élab:Jrés au lait de vache, rrais varie
entre 5 et 15 jours pour les produits au lait de dhèvre) pour tenir compte de toutes
les possibilités de contamination des produits et notamment pour les fromages à
"croûtes lavées".

Procéder au prélèvement de trois séries de dix fromages réalisées à

15 jours d'intervalle, fabriqués le même jour, pour chaque technologie et pour chaque
chaîne de fabrication :

Pour chaque série

5 fromages seront analysés dans les délais les plus rapides ;

5 fromages seront conservés à+ 4°C dans l'établissement pour être analysés
au bout de 4 semaines (la multiplication de Listeria monocytogenes à + 4°C étant plus
marquée que celle des autres bactéries).

Lorsqu'il s'agit de fromages d'un poids unitaire élevé (plus d'Ùn Kg)
des portions d'au moins 500 g pourront être prélevées au lieu de fromages entiers.
Dans ce cas on pourra conserver les parties de fromages restantes pour l'anayse 4
semaines plus tard.

Les prélèvements seront transportés sous régime du froid (ma.is non

congelés) à une température n'excédant pas + 6 oc.
 -448-

3.1.2 - Fromage à durée d'affinage inférieure à 4 semaines.

On réalise sur un même lot, deux prélèvement de 5 fromages (ou portions

de fromage).

- 5 fromages seront analysés à J + 5 (J + 4, J + 7)

- 5 fromages seront analysés à J + 12 (J + 10 à J + 14)

Toutefois, si l'entreprise conserve la maîtrise de ses produits jusqu'à

la lecture de l'analyse, une seule analyse à J + 12 (J + 10 à J + 14) est possible.

3.1.3 - Fromage à durée d'affinage supérieure ou égale à 4 semaines.

On effectuera le jour du conditionneiœnt, le prélèveiœnt d'~e série de

5 fromages d'un même lot, ce prélèvement ne pourra pas être effectué au-delà de
J' - 15 afin que le résultat de l'analyse concernant le lot prélevé parvienne à
l'usine avant pan expédition.

3.2 - Autocontrôles

LBs autocontrôles seront effectués sous la responsabilité des chefs

d'établisseiœnt. I l seront nwnérotés et portés dans l'ordre, sans omission, sur un
registre dont les pages auront été ~énurnérotées. Ils seront effectués suivant la même
méthode d'analyse que celle utilisée pour la qualification "Listeria" et décritedans
l'annexe I.

REMARQUE : la liste des lal:x::>ratoires des Services Vétérinaires e.:::fectuant des analyses
pour les contrôles officiels en ce qui concerne la recherche de Listeria monoçytogenes
en annexe II est en cours de modification.

3.2.1 - Autocontrôles procédure générale

Sont ëoncernés les établissements qualifiés selon la procédure

générale pour les catégories de fromages suivants

- Fromage à pâte molle

Fromage à pâte persillée à affinage inférieùr à
quatre semaines.

- Poot toute chaîne de fabrication :

1ère Période :Chaque jour, prélèvement de cinq framages répartis sur un rrêrne lot
de fabricat1on (par chaÎne de production et par type de fromage). Réalisation d'une
analyse par joor sur l'échantillon COI.lpOSé depuis les cin::J fr amage s.

2èrne Période : Après 20 résultats négatifs consécutifs (20 jours ouvrables), la

fréquence d'échantillonnage sera réduite à trois analyses par semaines (par chaîne
de production et par type de fromage). Chaque analyse sera réalisée sur l'éChantillon
composé depuis les cinq fromages prélevés sur un même lot.

3èrne Période : Après 24 résultats négatifs co~sécutifs '40 jours ouvrables), la

frequence d'échantillonnage sera réduite à une analyse par semaine (par chaîne
de production et par type de fromage) pratiquée sur l'échantillon conp::lSé depuis
les cinq fromages prélevés sur un même lot.

Par la suite, les autooontrôles de rootine s'établissent selon les

modalités définies dans la 3ème période : soit l analyse par semaine.

REMARQUE : Les protocoles de ~élèvements décrits ci-dessus concernent uniquement

les nouveaux agréments. Les établisseiœnts déjà agréés passent directement à une
analyse par semaine sur l'échantillon corrposê depuis les 5 fromages prélevés sur
un rnêiœ lot.
 -449-
2.2.2 - Procédure "spécifique"
Sont concernés : - Fromage à pâte persillée à affinage supérieur à
quatre semaines,
- Fromages à pâte pressée demi-cuite ou non cuite à
affinage de surface,
- Tous les fromages exportés non concernés par la
procédure générale ou n'appartenant pas aux catégories
énoncées ci-dessus (sauf les fromages fondus).

On procèdera à 3 séries consécutives de prélèverœnts de 5 fromages

fabriqués le même jour (pour Chaque teChnologie et dhaque Chaîne de fabrication),
réalisées à environ 15 jours d'intervalle, au rroment du candi tionnerrent. L'analyse
sera réalisée dans les meilleurs délais sur un eChantillon compose a partir des 5
fromages prélevés.

2 •3 - ~1éthoded'analyse
Voir annexe II (note de service n°804l du 16 mars 1987) et annexe II de la
présente note.

2.4 - Notification de qualification "Listeria"

La qualification "Listeria" est accordée par l'Administration Centrale

Bureau : Lait, Produits Laitiers sur avis motivé de Monsieur le Directeur Des Services
Vétérinaires établi sur la base des points de conformité suivants :

1°)- Conformité à l'Arrêté du 15 Mai 1974.

2°)- Conformité des autocontrôles (suivi E't résultats).

3°) -Conformité des analyses officielles effectuées dans le cadre de

l'obtention de la qualification "Listeria"

Chaque qualification "Listeria", sera notifié par la Direction Générale

de l'Alimentation, sous couvert de Monsieur le Directeur des Services Vétérinaires.

Les établissements déjà titulaires d'un agrément à l'exportation

délivré sur la base des procédures définies dans la note de service 8041 du 16 mars
1987 relative à la redherèhe de Listeria monocytogenes : agrément à l'exportation sont
dispensés du renouvellement de cet agrément sous réserve que les résultats d'analyses
tant en contrôles officiels qu'en autocontrôles, se soient révélés conformes depuis le
ler août 1987.

III - Contrôle de la qualification "Listeria"

La qualification "Listeria" une fois accordée, le contrôle de cette

qualification selon de nouvelles modalités de prélèvements s'effectuera sous forme
d'autocontrôles d'une part et de contrôles officiels d'autre part.

3.1 - Modalités de prélèvement

3.1.1 -Définitions

On appellera J : le jour d' emprésurage.

J' : date d' expédition.
Notion de lot

Les nouvelles dispositions oonduiront,en cas d'analyse révèlant la

présence d 'nne Listeria nonocytogenes, à la saisie du lot incriminé. Eh cons~uence il
convient, que dhaque fromage soit identifié comme appartenant à un lot.
 -450-
Le rythme des autooontrôles sera défini en fonction de la capacité de
production de l'établissement.:

La taille d'un lot est laissée à l'appréciation de chaque fabricant,

cependant, celle-ci ne peut excéder la fabrication d'une journée.
3.2.2 - Autooontrôles Procédure spécifique

Sont concernés les Fromages selon la procédure spécifique

- Fromage à pâte persillée à affinage supérieur à

quatre semaines,
- Fromage à pâte pressée demi-cuite ou non cuite à affinage
de surface.

1ère Période : Echantillonnage pendant deux rrois à raison d'une fois par semaine
de cinq fromages (par chaîne de fabrication et type de fromage). Chaque analyse
est réalisée sur l'échantillon composé à partir de cinq fromages prélevés sur un
un mêrœ lot.

2ème Période : Après douze résultats négatifs consécutifs (sur une période de
trois rrois) la fréquence d'échantillonnage sera réduite à une analyse par rrois
(par maine de fabrication et type de fromage) pratiquée sur l'échantillon
à partir de cinq fromages prélevés sur un mêrœ lot.
Les autocontrôles de routine sont ensuite effectués 1 fois par rrois
selon les modalités prévues au cours de la 2èrœ période.

3.2.3 - Autocontrôles des produits e;portés visés au paragraphe l B.

Une analyse par rrois sera effectuée sur un échantillonnage réalisé à

partir de cinq fromages prélevés le rrême jour sur un lot défini par chaîne de fabrica-
tion et type de fromage.

3.3 - Contrôles officiels

A ces occasions, les registres d'autocontrôles des entreprises seront

consultés afin de vérifier leur bonne réalisation.

Les analyses seront réalisées dans un laboratoire choisi par le

Directeur des Services Vétérinaires, sur la liste figurant en annexe III de la note de
service N°8041 du 16 août 1987. Une liste révisée sera publiée ultérieurement.

Ils seront analysés suivant la méthode décrite en annexe II.

Pour les fromages au lait pasteurisé, l'activité phosphatasique doit

être négative et sera vérifiée systématique~œnt sur au rroins l'un des fromages
prélevés (sauf pour les fromages à pâte persillée).

Dans un souci de cohérence les analyses bactériologiques prévues dan~

le cadre de la Note de Service du 27 t-1a.rs 1986, de la Lettre Circulaire du 7 Octobre
1986 et de la Lettre Circulaire No 4.442 du 11 Septembre 1987, seront réalisées à
partir des prélèvements effectués pour la recherdhe de Listeria.

3.3.1 -Contrôle officiels de routine des produits visés au paragraphe I A.

Les contrôles seront effectués une fois par mois, sur des fromages
prélevés conformément aux dispositions du paragraphe III - 3.1.

3.3.2 - Contrôle officiel de routine des produits visés au paragraphe II B.

Les contrôles seront effectués une fois tous les deux rrois sur des
-F.,..,.,m">noc: nn~lPv~c:;rnnformèrœnt aux disJX)Sitions du paragraphe III - 3.1.3.
 -451 -

3.4 - Sanctions découlant des mesures de contrôle

Les résultats des contrôles officiels seront transmis, au fur et à

mesure de leur obtention, aux usines intéressées. L'ensemble des résultats obtenus
sera adressé à l'Administration Centrale sous forme de récapitulatif dont les modéles
vous seront adressés ultérieurement.

N.B. : Pour les établissements agréés à l'exportation, les résultats concernant la

recherche des germes autres que la Listeria devront être également portés à la
connaissance des intéressés.

3.4.1 - Résultats non conformes

a) - Procédure administrative

L'obtention d'un résultat non conforme à un contrôle officiel (présence

de Listeria monocytogenes) sera immédiatement signalée par téléphone au Bureau Lait,
Produits Laitiers à la Direction Generale de l'Alimentation.

plus, le Bureau Lait et Produits Laitiers notifiera immédiatement la

De
suspension de la qualification "Listeria" de la ligne de fabrication, ainsi que son
agrément à l'exportation si l'établissement est agréé. Un contrôle, lot par lot de
toutes les fabrications, sera alors mis en place par l'établissement producteur.

b) - Conduite à tenir vis-à-vis des produits :

Qu'il s'agisse d'autocontrôles ou de contrôles officiels, la procédure

suivante devra être appliquée au lot incriminé

pour un résultat obtenu avant le départ usine le lot ne sera pas

mis en commercialisation ;
pour un résultat obtenu après le départ usine le fabricant
mettra tout en oeuvre pour tenter de retirer le lot du commerce
lequel sera saisi.

3.4.2 - Requalification

La requalification sera accordée aprés

- 3 séries de contrôles officiels conformes effectués à 15 jours

d'intervalle, la première série étant diligentée dans les meilleurs délais après la
suspension de la qualification.

-une série d'au moins 20 autocontrôles consécutifs négatifs réalisés

sur les produits finis, du groupe I Al, cu une série d'au moins 12 autocontrôles
consécutifs négatifs réalisés sur les produits finis du groupe I A2.

-dans l'un et l'autre cas, les autocontrôles se poursuivront

ensuite selon le rythme prévu à la troisième période pour les fromages relevant de la
procédure générale (cf.parag. 3.2.1) et selon le rythlœ prévu à la deuxième période
pour les fromages relevant de la procédure spécifique (cf.parag. 3.2.2).

- par ailleurs, les entreprises devront :

• renforcer les procédures qui consistent à nettoyer et désin-

fecter tout le matériel entrant en contact avec le lait et les ~oduits laitiers ;

• et s'attacher à reChercher, aux différents stade de la fabri-

cation- et notamment aux points critiques, au moyen d'analyses, l'origine de la
contamination- et mettre en place des dispositifs propres à la faire disparaître.
 -452-

IV - ETIQUETAGE

Les fromages, quelle que soit leur destination, doivent être, à tous
les stades de la commercialisation, facilement identifiables, quant à l'établissement
d'origine et au lot de fabrication, selon les dispositions énoncées ci-aprés.

4.1 - Identification de l'établissement de fabrication

Le numéro de code de l'établissement tel qu'il figure dans la liste des

usines agréés pour l'exportation vers tous les pays (soit numéro minéralogique du
département d'origine suivi d'une ou deux lettres, soit numéro d'agrément = code
officiel géographique de la commune accompagné éventuellement d'une lettre d'ordre
qui remplacera à terme le précédent) devra figurer en clair sur

- les caisses (carton ru oois) d'expédition

-les emballages unitaires de dhaque fromage (soit sur l'étiquette),
-soit sur la ooîte elle-même, en carton ru oois).
-sur le papier d'emballage du fromage (perforations).

Pour les fromages préemballés, le code d'identification reste celui

imposé par la réglementation.

Cependant, pour les produits à marques de distributeur uniquement, rien

ne s'oppose à ce que le producteur ajoute au code d'usine réglementairement défini un
code supplémentaire à usage comrrercial (de 01 à 99) lui permettant de personnaliser
ses expéditions par importateur, sur l'emballage unitaire de dhaque fromage (étiquette
ou boÎte). Ce code ne devra apparaître ni sur les caisses d'expédition, ni sur le
papier d'emballage du fromage.

N.B. : dans le cas des fromages de grande taille destinés à être décrupés, il est
recomrrandé de faire figurer sur la "collerette" le nwrero de code de l'établissement
de fabrication autant de fois que de parts prévues.

4.2 - Identification du lot de fabrication

Un lot correspond au plus à une journée de fabrication pour une techno-

logie donnée.

Le numéro d'identification du lot constitué par le numéro de code de

l'établissement de fabrication suivi de la date de conditionnement en quantième de
l'année doit être indiqué sur le papier d'emballage des fromages par perforations
pour la date, impression ou perforation pour le code usine) ainsi que sur les
bulletins d'analyses, certificats et tous documents d'accompagnement des cargaisons.

r::ans tous les cas, i l est trés vivement recOlT\lffindé aux

REf'.1ARQUE IMroRI'ANTE :
fabricants d'inscrire une date limite d'utilisation optimale (D.L.U.O) sur les
emballages afin d'éviter des consommations trop tardives de ces produits. Celle-ci
indiquée au noyen de la mention "à consorruner de préférence avant le ••• ".
 -453-
CONDUITE ATENIR LORS DE L'ISOLEMENT DE LlSTERIA MOHOCYTOGEHES DANS LES PRODUITS DE CHARCUTERIE
Visés par la Lettre Circulaire N'2755 DU 2~.06.92

·.
l~r con~r6le official
et1 applic:a.tion de :t.-
Lmttre dù l9 1uin 92

. '
+
'
~t
!
A•I!JoupU.s.semilnt 4u meliu.:· ~loe§;e des p;g4ui~§ a un •utQOOnt~6la lot
re. poaa~1e apr•• 3 auto .~:- lot, aux trais de l •1.nduatr1e.l, se.:-a
~ntr61•• al.& IIIO;(ns ~ da en plaa. av410 lllice tm 6vidanee t:lanS
Uft• p4:oi~e m:1.nilll.&le da 2S g de t..~enu .-t: n=ln~ion ·.
~ ce.t~aines

- 1' <100 L.monocytogenQ&/a

le• p:r:odui·tlr fiO\I..T;"J;'Ol'I'C 6tl;'• COIIIIMII:'O"ioi-
1!•6• mais soua la ra~ponsabilit' d&
l'~nduatriel, Le eas êë~éant une D~
~souplissamcnt da• ma.ure• pgasib~e
plu• court• sera ap~os6• sur le p~oduit
a~~l• 3 autocent~6l~ nigati:fa sur una en tenant com~te da aa nature, d* aon
~iod• miniauùa da z aem&.il'\a• et 1'H •t de •• t$111~~ratux•a cie coruse1:'V!IItior
l con~~Ole off~Qial n6gatif
~· >lOO L.monocytogen••lg
~e~rait de la con•~•t~on : ~4t~rmine·
~ion •v•ntuella d'util~sationa particu·
li~~•• auxquelles d~~eurent p~o~r•• les
danr••• qui, •Gns •tre in$alub~e•, na
peuvent •tl."& lJ.vr;êtU en l'état: à h oor
· so~nt~~ation. hunsaina, 6tant donni J.as ~1•~
que• de multiplication du germQ pendant
l01o diat:rJ.bution.

NI • • ll. o:onviandra 101 • e~ruu.r l•a :sou<:he.a ~ t..mQn<:><::!(tt:-9ane.c .1. l ' lns1:1tu'C P"teUl;' d• Pe.d~ pour lytsotyp:i
Dans le cas -ou la aouch• appartient au lys~va:r ipid.bique .il. ç:onv.h:ndl:'& de prend~• ~ntaat tlVIIIIQ
l'~dmin~st~ation ~•ntrole ~mise en plao• dea m~•urea #p4eitiques. ,
 -454-

ANNEXE XXI:

Mesures proposées par la F.I.C.

CATEGORIE MESURES A PRENDRE EN FONCfiON DU NIVEAU DE CONTAMINATION

DU
PRODUIT f< 102 Lm./g de 102 à 104 Lm./g > 104 Lm./g

1. PRODUITS CRUS

Examen de confirmation de 5 unités (1)

Si une ou plusieurs Si une ou plusieurs

unités ont unités ont
Il. PRQDl!ITS TRAITES > 102 Lm./g: > Io4 Lm.jg:
PAR LA CHALEUR

Ill. Remanipulés
après traitement R~visiQn d~s R~tr1lit d~1 IQt '1
procédures (2) RévisiQn des
prQç~Qur~s (2)

11.2. Traités par la Le critère est: absence de Listeria monocytogenes.

chaleur dans Ce r~sultat D~ ~~l.lt ~tr~ ~QDlrOI~ Ql.!'~n ~·assuriln1 Q~ l'çfficaçi1~
l'emballage list~ridd~ du trait~m~nt th~rrillQu~ pour le produit comidéré
(conception et maintenance des équipements, définition du
barème approprié). .

(1) Dans certains cas l'examen de confirmation peut être supprimé, par exemple, s'il
entraîne un.retard intolérable eu égard au ruveau de risque pressenti.

(2) au niveau de la fabrication (y compris les matières premières) et éventuellement

de la distribution.

N.B. : On prélèvera d~ un même lot de fabrication un échantillon pour contrôle

constitué de six unités :

-La première unité servira à l'examen de routine

- Les cinq autr.çs unités seront utilisées en cas de déviation par rapport au critère
"guide" de lif Lm /g
 i
(

A UT 0 R I S AT I 0 N D I MP R E S S I 0 N
1

-------------------------------------------------

De la Thèse dont l intitulé est :

1

LES LISTERIOSES
Diagnostic, physiopathologie, prophylaxie

CANDIDAT Mademoiselle Olivia LEGALLANT

VU Le
GRENOBLE, 1e 3 r1a i 1994

vu Le Président de 1•universit-

Sciences.
GRENOBLE, 1e
[Données à caractère personnel]