Transcription
BIOL201
Daniel Gautheret
[email protected]
Chapitre 1: Transcription et RNA polymrase
Chapitre 2: Initiation, longation et terminaison
Chapitre 3: Rgulation: lexemple procaryote
Chapitre 4: Maturation de lARN chez les eucaryotes
V. 2012.0
Chapitre 1
Transcription et RNA polymrase
Lintuition de la transcription
Chez les eucaryotes:
ADN dans le noyau
Machinerie de synthse dans
le cytoplasme
Hypothse dun lintermdiaire ARN
Etapes-cl de la dcouverte de
lARN messager
1957: concept dun adaptateur ARN (Crick)
1956-57: Dcouverte progressive dune nouvelle fraction
dARN, polymorphe
1959-60: dcouverte dune ARN polymrase capable
de synthtiser de lARN partir dADN.
1961. Mise au point des techniques dhybridation ADNARN sur filtre de nitrocellulose. -> lARN est
complmentaire dun seul brin dADN
1961. Dmonstration de lexistence dun ARN messager
(Jacob & Monod)
1961. Purification dARN polymrase bactrienne et
synthse in vitro dARN partir de matrice ADN
4
Rappel: diffrences ADN/ARN
ARN
ribose
ADN
dsoxyribose
Bases de lADN et de lARN
Base puriques
ADN: T
ARN: U
Base pyrimidiques
Structure des ARN
O
P
O
H2C
Molcule ordonne
linaire
Oriente 5P->3OH
Grand nombre de
structures secondaires
possibles
Dcodage du gne dans la cellule bactrienne
ADN
ARN polymrase
Ribosome
grande sous-Unit
ribosome
Ribosome
petite sous-Unit
ARNm
Protine
ARNr
ARNt
aminoacides
Membrane cellulaire
Les principaux ARN dans une bactrie
ARN ribosomiques (ARNr)
Grande sous-unit 23S (3000nt) et 5S (120nt)
Petite sous-unit 16S (1500nt)
Composition en bases: 25%A 21%U 32%G 22%C
ARN de transfert (ARNt)
4S (70nt)
ARN messager (ARNm)
Instable (demi-vie courte)
Grande varit de molcules
Entre 300 et 5000 nt
Taux de synthse lev
Dcodage du gne dans la cellule eucaryote
ADN
ARNr
ARNt
ARN polymrase
Pr-ARNm
Maturation
ARNm
ribosome
Protine
Membrane cellulaire
10
Distribution des ARN dans une cellule
eucaryote
Cytoplasme
ARN ribosomiques (ARNr)
Grande sous-unit 28S et 5,8S
Petite sous-unit 18S
ARN de transfert (ARNt)
4S
Noyau
Distribution diffrente du
cytoplasme
ARN gants (10000 100000nt)
Turn-over rapide
ARN messager (ARNm)
Plus stables quARNm bactriens
Grande varit de molcules
Entre 300 et 5000 nt
Ide dARN prcurseurs prsents dans le noyau
11
ARN prsents dans une cellule typique de
mammifre (fibroblaste de souris en culture)
ARN cellulaire
total (%)
lquilibre
ARN
Synthse
totale (%)
Prcurseurs nuclaires dARNr
39
ARNr cytoplasmique
Pr-ARNm
71
7
58
ARNm cytoplasmique
Petits ARN stables (surtout ARNt)
3 !
15
Toute la varit des ARNm est comprise dans ces 3% !
12
Comparaison transcription/rplication:
copie des 2 brins dADN au cours de la rplication
From Wikipedia: DNA replication
13
Comme pour la rplication: polymrase synthtise de 5 vers 3
5
ARN synthtis
Matrice ADN
14
Copie dun seul brin dADN par lARN
polymrase
5
3
5
3
A G
A G
G A
5
T
A G
G G
G A
G G
G A
G G
G
A
T
3
5
A AC C GG T
U
T G C
C
A
G
Brin matrice =
brin transcrit
U A C A
A T G
G
C
3
5
bulle
15
Les gnes peuvent rsider sur un brin ou
lautre de lADN
Exemple de transcription dans une rgion gnomique: il y a des gnes
sur les deux brins.
Sens de la transcription sur le brin matrice
ADN 5
ATG
3
5
AUG
Sens de la transcription sur le brin matrice
16
Les tapes de la transcription
Site de terminaison
Site dinitiation
Initiation
Elongation
Terminaison
17
Structure de lARN polymerase de T7
18
Structure de lARN polymerase bactrienne
bulle
19
Structure de lARN polymrase dE. coli
Core enzyme
Coeur (Core)
Complet (Holo)
Holoenzyme
7000 molcules/cellule
alpha rpoA
36500
beta
rpoB
151000 site catalytique
beta
rpoC
155000 liaison
omega rpoZ
11000 assemblage du core
sigma rpoD
70000 interaction avec promoteur
20
Les 3 ARN polymrases eucaryotes
21
Activits des 3 ARN polymrases
eucaryotes
Pol I: la plus active. Synthtise les ARNr sauf 5S.
Dans le nuclole.
Pol II. Synthtise les prcurseurs dARNm. Dans le
noyau.
Pol III. Activit faible. Synthtise les ARNt et
autres petits ARN nuclaires (snRNA), et ARNr 5S.
Dans le noyau
22
Les 3 ARN polymrases de Saccharomyces cerevisiae
>
>
>
>
23
24
Pour la structure de la RNA
polymrase II de levure en cours
de transcription
25
RNA POLYMERASE II de Saccharomyces cerevisiae
26
27
Structure de lARN polymrase II :
Longueur considrable
du domaine C-terminal (queue CTD)
CTD: rptition dune cinquantaine de squences
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
28
Initiation
Dbut de transcription
ARN polymrase
La polymrase se fixe au
promoteur sur lADN duplex
promoteur
La polymrase dnature le
duplex. Formation de la bulle
de transcription
La polymrase catalyse la
liaison phosphodiester des
deux premiers rNTP
29
Zone hybride ADN/ARN
Elongation
La polymrase avance 3>5 sur
le brin matrice en dnaturant le
duplex et en ajoutant des rNTP
lARN
5
ARN natif
Terminaison
Fin de transcription
Au site darrt de transcription,
la polymrase relargue lARN
termin et se dissocie de lADN
ARN termin
30
Chapitre 2:
Initiation, Elongation et
Terminaison de la transcription
31
Initiation
Dbut de transcription
ARN polymrase
La polymrase se fixe au
promoteur sur lADN duplex
promoteur
La polymrase dnature le
duplex. Formation de la bulle
de transcription
La polymrase catalyse la
liaison phosphodiester des
deux premiers rNTP
32
Initiation chez les bactries
33
Structure dun promoteur bactrien
Promoteur
-35
Squence
consensus
-10
TTGACA
C
C
N
N
N17
TATAAT
Rgion transcrite
N5-9 A/G
-35
-10
Reconnaissance du promoteur par le facteur sigma
34
Caractrisation de la rgion promotrice
(Modification des bases, Mutations des paires de bases)
Modification
empchant
la liaison de
la RNA pol
-35
-10
Start
Modification
vite en
prsence de
RNA pol
Mutation
nuisant
lactivit du
promoteur
Points de
contact
dduits
La plupart des points de contacts se trouvent sur la mme face de lADN
35
Reconnaissance dun promoteur par lARN polymmase:
Affinits relatives du core enzyme et de lholoenzyme pour lADN
Initiation
Elongation
terminaison
Holoenzyme
Core
Core+fact term
Core + sigma
Fixation au promoteur
Abandon promoteur
Dcrochage de lADN
Recyclage
36
Exemples de facteurs sigma
chez E. coli
37
Initiation chez les eucaryotes
38
RNA Pol-I
La synthse du
prcurseur des ARN
ribosomaux
a lieu dans le
nuclole
39
Initiation de la transcription par la RNA pol I
(synthse des ARN ribosomiques)
Les ARN pol. eucaryotes ne se fixent jamais seules: facteurs de transcription
Un core factor constitu
de nombreux facteurs
Core Factor
TBP
+ pol I et Rrn3p
Rrn3p
Complexe dinitiation
Pol I
40
ARN pol III: le gne 5S nest pas contrl par un
promoteur en amont
Mise en vidence dune rgion interne de contrle de la transcription
activit
dltions
+
+
+
+
+
+
-
ICR=Internal control region
+1
+40
+80
+120
gne ARN 5S
Mais comment la polymrase
Peut-elle se placer correctement?
dltions
+
+
+
+
activit
41
Explication: le complexe dinitiation de la
transcription de la pol-III
TFIIIC
TFIIIB
Gne tRNA
Pol III
TFIIIB
Gne ARNr 5S
Pol III
TFIIIC
TFIIIA
C
42
Squence de la rgion ICR du gne codant pour lARN5S de Xenopus
laevis et structure du facteur de
transcription TFIIIA qui se fixe sur la rgion ICR
Rgion ICR
TFIIIA
12 acides amins
43
Trois familles de doigts de zinc
44
Reprsentation schmatique de linteraction de lADN
avec les doigts de Zinc en tandem contenus dans le facteur TFIIIA
45
La RNA pol. II
46
Dtermination de la rgion promoteur dun gne dpendant de lARN polymrase II
Les rgions
sont dltes
47
Identification de 3 Rgions ncessaires linitiation de la
transcription, en amont du gne codant pour la -Globine
Expriences de mutations ponctuelles
Boite
GC
Boite
CAAT
Boite
TATA
48
Les promoteurs utiliss par la pol-II sont des combinaisons
varies de courtes squences consensus
49
Formation du complexe de
dmarrage pol-II
Complexe prinitiation
TATA
+ TBP
+ TFIIH
Transcription basale
Sans activation
+ TFIIB
Pol II
+
+ TFIIE
TFIIF
CTD
50
Elments de contrle du promoteur pol-II :
les lments distants
enhancers
promoteur
gne
enhancers
UAS= upstream
activating sequence
51
Comment fonctionne un enhancer?
Modle simplifi dactivation de la transcription
Enhancer
Boucle dADN
Activateur de transcription
TBP
TATA box
RNA Pol
Site dinit.
52
TBP peut sassocier des facteurs (les TAF)
et former le complexe TFII-D:
Activation de la transcription
TAF250
TAF80
TAF110
TAF60
TAF40
TAF30
TBP
TATA
TAF30
TAF150
Initiateur
TAF: TBP-Associated Factors : ouvrent la chromatine, acetylent histones etc.
53
Niveau basal / Niveau activ
interactions
TBP
promoteur
Transcription
basale
Activateurs
TAF250
TAF80
TAF110
TAF60
TAF30TAF30
TAF40
TAF150
TBP
promoteur
Transcription
active
54
TBP est ncessaire linitiation de
la transcription par chacune des 3
polymrases eucaryotes
TBP
TBP
Pol III
Pol II
TBP
Pol I
55
Structure de la TBP de levure en
complexe avec une boite TATA
Structure en selle de cheval
Fixation dans sillon mineur
56
Un mlange
dinteractions:
- non-spcifiques
(coller lADN sur les
groupements P)
- spcifiques
(reconnatre la
squence TATA)
57
Torsion de la double hlice dADN
58
Elongation de la transcription:
ncessit de quitter la rgion du promoteur
TFII B/D/E/F/J
Pol II
TATA
Chez les bactries :
relarguage du facteur
sigma
Chez les eucaryotes :
phosphorylation de la
queue CTD par TFIIH
CTD
phosphorylation de la
queue CTD
TFII B/D/E/F/J
TATA
Pol II
P
CTD P P P P
Complexe
dlongation
59
Elongation de la transcription
RNA pol
A
5
3
A G
A AC C GG T
U
T G C
C
A
G
Matrice ADN
= brin non-codant
T
G
bulle
A
T
3OH
A
T
U A C A
A T G
G
C
G
C
G A
G G
NTP suivant
60
Procaryotes:
la terminaison rho-indpendante
ADN
ARN
dissociation
From: www.vetmed.iastate.edu/departments/vmpm/
61
Procaryotes: la
terminaison rhodpendante
(modle)
Blocage du ribosome sur
codon Stop permet la fixation
de la protine Rho sur un site
Rho utilization site
La fixation de Rho cause le
dcrochage de la polymrase
62
Terminaison chez les eucaryotes
Arrt caus par la polyadenylation (voir
dernier cours).
Aprs arrt: maturation de lARN
63
Chapitre 3:
Rgulation de la transcription:
le modle procaryote
64
La rgulation de lexpression
Pourquoi lexpression des gnes doit-elle
tre rgule?
Division cellulaire
Diffrentiation
Rponses lenvironnement
65
Induction / Repression
Induction/rpression: rponses lapparition
dun substrat particulier
Induction:
En absence de lactose: pas besoin denzyme de
mtabolisme du lactose
En prsence de lactose: induction. Lenzyme est
produite
Rpression
Une enzyme dE.coli synthtise le tryptophane
En prsence de Trp dans le milieu: pas besoin
denzyme: rpression
66
Mtabolisme du lactose
67
Au dpart: deux gnes connus
Annes 50
Gne z (lac Z) : gal
Gne i:
Souche inductible: i+
Souche constitutive: ii+
gal
z+
inducteur
i-
gal
gal
z+
inducteur
gal
68
Inducteur=lactose ou analogue
Lexprience Pajama*
(*Pardee, Jacob, Monod, 1959)
F
Donneur: bactrie F (pili)
donneur
receveur
Receveur: bactrie F-
i+
z+
X
i-
z69
Lexprience Pajama
IPTG: inducteur analogue du lactose qui
contrairement au lactose nest pas reconnu par
beta-gal. Donc reste dans la cellule.
donneur
receveur
i+
z+
Ajout IPTG
X
i-
z-
Interprtation:
1- introduction du gne z+ dans receveur i- > fabrication Bgal
2- introduction i+ > bloque synthse de gal (i est un rpresseur)
3- en prsence dinducteur, le rpresseur ne fonctionne plus
70
Jacob, Monod, 1961:
Fonctionnement de lopron (1)
71
Fonctionnement de lopron (2)
72
Les mutants qui ont permis
dtablir le modle dopron:
Genotype
Noninduit
induit
I+,Z+
Sauvage
I-,Z+
Pas de rpression
I-,Z+ / F I+,Z+
Restauration rpression par action trans
Is,Z+
Is: represseur insensible linduction
Is,Z+ / F I+,Z+
Is agit encore en trans
Oc,Z+
Oc: oprateur constitutif. Ne reconnait pas I
O+,Z- / F Oc,Z+
O+ ne rpare pas Oc: action en cis
Is,O+,Z+ /F I+,Oc,Z+
Oc dominant sur Is
73
Leffet de linducteur sur le rpresseur
nest pas absolu
Rpresseur
oprateur
2 x 1013
Rpresseur +inducteur
2 x 1010
Affinit
autre DNA
Spcificit
2 x 106
107
2 x 106
104
Diffrence
daffinit
74
Symtrie de la squence de loprateur
de lopron lactose
Mutations rendant constitutive lexpression de lopron:
5 TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT 3
3 ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAA 5
Oc
mutations
A TGTTA
T ACAAT
C
G
T
A
75
Structure du complexe rpresseur lac /oprateur
Le rpresseur est un
homodimre
Chaque sous-unit est
reprsente par une couleur
diffrente.
76
77
Encombrement de lARN polymrase bactrienne, de
lADN et du rpresseur du phage
78
La rpression catabolique
Le glucose (un catabolite) rprime la synthse de gal
Glucose
ATP
cAMP
CAP
cAMP
CAP
En absence de glucose: augmentation du taux dAMPc qui forme un complexe
avec la protine CAP et lactive.
En prsence de glucose: baisse du taux dAMPc: empche lactivation de CAP
79
une rgulation positive
80
Site de fixation du complexe
CAP-cAMP sur le promoteur
GTGAGTTAGCTCAC
CACTCAATCGAGTG
Promoteur
lacI
Site CAP
+1
lacZ
Fixation rpresseur
Fixation RNA-polymrase
81
Conditions de rgulation
82
Principes de rgulation positive et ngative
83
La rgulation de la synthse du
tryptophane chez coli
1.Contrle au niveau de linitiation de la
transcription
2.Contrle au niveau de la terminaison de la
transcription
84
Trp: contrle de linitiation
Un rpresseur, trpR se fixe sur 3 oprateurs et
contrle la transcription :
De lopron trpEDBCA qui code pour les enzymes de la
voie de bioysynthse du tryptophane partir du
chorismate
Du gne aroH qui code pour un enzyme impliqu dans
la premire tape de la voie de synthse des acides
amins aromatiques
De son propre gne trpR (autocontrle)
aroH GCCGAATGTACTAGAGAACTAGTGCATTAGGCTTATTTTTTTGTTATGATGCTAA
Trp AATCATCGAACTAGTTAACTAAGTACGCA
trpR TGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACC
85
Contrle au niveau de linitiation de la transcription
par le rpresseur TrpR
86
Trp: contrle de la terminaison
La transcription de lopron peut sarrter
prcocment aprs la synthse dune squence leader
qui prcde les rgions codant pour trpEDBCA:
mcanisme dattnuation
87
Le modle dattnuation
Peptide leader avec 2 codons trp
En prsence de trp:
Passage du ribosome
Formation dune structure
terminatrice
Blocage transcription
En absence de trp:
Blocage du ribosome
Formation dune structure
anti-terminatrice
Poursuite de la transcription
88
trp trp
Vue densemble de lopron tryptophane d E. coli
ARNm de lopron Trp
ARNm du leader de Trp
promoteur
attnuateur
oprateur
Site dinitiation de
la Tp
Terminaison
de la Tp
Composant I
anthranilate
synthtase
Composant II
anthranilate
synthtase
Anthranilate
isomrase
Tryptophane
synthase
Tryptophane
synthase
Xie et al. Genome Biology, 2001:3
Terminaison
de la Tp
89
Et les eucaryotes?
90
Stratgies de rgulation de la
transcription chez les eucaryotes
Stratgies plus complexes que chez les
procaryotes
Transport des protines cytoplasme>noyau
Modification/activation des protines
Glycosylation, actylation, etc
ADN non nu:
Chromatine ouverte / ferme
Maturation variable des ARNm
Un prARNm peut donner des ARNm diffrents
91
Chapitre 4:
Maturation des ARN chez les
eucaryotes
Expression des gnes : eucaryotes et procaryotes
Eucaryotes
Procaryotes
cytoplasme
noyau
intron
exon
ADN
ADN
Transcription
Transcription
ARNm
Pre-ARNm
Coiffe 5 et queue polyA
coiffe
Traduction
AAAAAA
Epissage
AAAAAA
ARNm
Export
AAAAAA
Traduction
93
Boucles formes par hybridation dun ARN messager
eucaryote avec lADN gnomique
Les deux tapes de la raction
catalytique dpissage
Pr-ARNm
Exon 1
Intron
AG GUAUGU
Site 5
Exon 2
UACUAAC
Site de
branchement
YAG G
Site 3
Etape 1
Etape 2
Exon 1
AG
Exon 2
A AG G
G
U
lasso
intermdiaire
ARNm mature
Exon 2
Exon 1
AG G
A AG
G
U
lasso final
Epissage in vitro dun
ARN: Mise en vidence
sur gel des produits
intermdiaires
Produits intermdiaires obtenus
au cours de la maturation des
ARN
Les deux ractions de transestrification
GU du site 5 intron
A du site de branchement
Lasso
Lpissage est ralis
par un complexe
ribonucloprotique:
le spliceosome
Ux=snRNP
=snRNA+Protines
FORMATION ET RECYCLAGE DU
SPLICEOSOME
Catalyse et epissage par le complexe des
snRNP U1,U2,U5,U4/U6
Retour sur les squences consensus des
introns spliceosome
Pourquoi une telle conservation dans tous les gnes
eucaryotes?
Les snRNA U1 et U2 intragissent avec
les squences consensus
(reference missing)
Mutation: blocage pissage
Mutation compensatoire:
restauration de lpissage
Autoepissage des introns de groupe I et de
groupe II
(GMP
exterieur)
Comparaison entre la structure des introns de
groupe II et les snRNA du spliceosome
Epissage alternatif
3 gnes de dtermination du sexe chez la drosophile,
pisss diffremment chez les males et les femelles:
Lpissage est
co-trancriptionnel
Facteurs dpissage
Coiffe de
lextrmit 5 du
pr-ARNm
La Coiffe est mise en place ds le dbut de
la transcription
Ajout coiffe
Mise en place de la queue poly-A
en 3 du messager
Polyadenylation et terminaison
Les transcrits sont
clivs et
polyadnyls.
CTD et Terminaison
Facteurs dpissage
(protine SR, snRNP)
Pr-mRNA
Cleavage/polyadenylation
factors (CPSF, CstF)
Facteurs dlongation
CTD
Pol II
Elongation
Etapes de
transcription et
maturation Complexe de coiffe +
facteurs dpissage
(SF) sur queue CTD
Preinitiation complex
capping complex
spliceosome
spliceosome
ARNm mature
+ protines fixes
LARNm est en permanence recouvert
de protines
(heteronuclear
RiboNucleoProtein
complex)
L export nuclaire par les pores
Importance de coiffe et queue poly-A pour le
dmarrage de la traduction
Ribosome
elF3: facteur dinitiation
-> dmarrage traduction
Maturation des ARN
ribosomiques et
assemblage des
petites et grandes
sous-units du
ribosome
Eucaryotes: ribosome =
5.8S+5S+28S+18S
+protines
