IUT de Prigueux dpartement gnie biologique S2M6 Biochimie structurale Travaux dirigs

1 Sparation de peptides par lectrophorse

Avant la mise au point des mthodes dHPLC (abrviation anglo-saxonne de Chromatographie Liquide Haute
Pression ) pour la sparation et lanalyse de petits peptides, llectrophorse sur support de papier tait
frquemment utilise. La sparation tait effectue sur la base de la charge que possde un peptide une valeur
donne de pH.
1.1 Reprsenter la structure semi-dveloppe plane des peptides (1) (3) sans se soucier de la charge du radical.
Entourer en rouge les chanes latrales susceptibles dtre charges.
1.2 Prdire la direction de migration pour les 3 peptides, aux valeurs de pH donnes. Utiliser C pour la migration vers
la cathode (ple ngatif), A pour la migration vers lanode (ple positif) et O si les peptides ne migrent pas.
2,0 4,0 6,0 11,0
(1) Lys-Gly-Ala-Gly
(2) His-Gly-Ala-Glu
(3) Glu-Gly-Ala-Glu
pH

1.3 Le peptide (2) est hydrolys et plac sur une lectrophorse sur papier pH = 5. Recopier le schma ci-dessous
et y marquer la position relative des acides amins constituant ce peptide, aprs migration.

Remarque : on ne tiendra pas compte de la masse des acides amins.

2 Retrouver la position des ponts disulfures dans un polypeptide ?

1 Entres quels acides amins stablit un pont disulfure ?
Aprs purification, dtermination de la composition en acides amins et de la squence primaire dune protine,
lexistence et la position de ponts disulfures sont recherches.
Pour cela, partir du polypeptide P purifi natif, on ralise deux expriences indpendantes suivantes (A et B) :
A) Une rduction par du -mercaptothanol : cela libre deux peptides dont les squences sont les suivantes :
Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys et Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys

B) Une hydrolyse enzymatique par la thermolysine. Dans les conditions opratoires choisies, cette enzyme
catalyse lhydrolyse des liaisons peptidiques dans lesquelles un rsidu Leu, Phe, Trp, Tyr ou Val a engag sa
fonction amine. Aprs la digestion enzymatique, on identifie 4 peptides dont la composition en acides
amins est la suivante :
Peptide 1 : Asn, Val et 2 Cys Peptide 3 : Phe, Thr et 2 Lys
TD2 - Protides
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Peptide 2 : Arg, Ala, Trp, Tyr et 2 Cys Peptide 4 : Phe, Thr, 2 Pro et 2 Cys

2 Indiquez laction du -mercaptothanol dans lexprience A.
3 Quelle conclusion tirez-vous de lexprience A, quant la structure du polypeptide P ?
4 En exploitant les rsultats de lexprience B, crire la squence en acides amins du polypeptide P natif en
faisant apparatre les ponts disulfures.
5 A partir de la structure que vous venez de proposer, montrez comment vous retrouvez les rsultats de
lexprience B.
6 Enfin, colorer les acides amins basiques en rouge, acides en bleu, polaires ni-acides ni-basiques en jaune et
polaires hydrophobes en vert.
7 Dessiner une configuration possible du peptide P sachant, que toutes les cystines y forment des ponts
disulfures, que les ponts disulfures ont tous la mme taille, et que certains acides amins se regroupent au
cur du peptide en particulier ici 4 acides amins hydrophobes : Ala, Val, Phe et Pro.

3 Titrage et charge dun acide amin : la glycine

3.1 Ecrire les quilibres acido-basiques de la glycine en dterminant la charge globale de la molcule chaque
tape.
3.2 Calculer le pHi de la glycine. Quel sera ltat dionisation de cet acide amin pH 6 ?
3.3 Reprsenter lallure schmatique dune courbe de titrage par un acide fort de cet acide amin en solution pH
alcalin en prcisant les espces prsentes en solution au cours de ce titrage.

4 Charge de lacide aspartique
En fonction des pK des diffrents groupements chimiques de lacide aspartique, dterminer dans quelle zone de
pH la forme suivante sera majoritaire :




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1 Sparation de peptides par lectrophorse
Avant la mise au point de mthodes dHPLC (abrviation anglo-saxonne de Chromatographie Liquide Haute
Pression ) pour la sparation et lanalyse de petits peptides, llectrophorse sur support de papier tait
frquemment utilise. La sparation tait effectue sur la base de la charge que possde un peptide une valeur
donne de pH.
1.1 Reprsenter la structure semi-dveloppe plane des peptides (1) (3) sans se soucier de la charge du radical.
Entourer en rouge les chanes latrales susceptibles dtre charges.
NH
3
+
CO CH
CH
2
Lysine
(Lys)
CH
2
CH
2
CH
2
NH
2
NH CO CH
H
NH
2
CO CH
CH
3
NH
2
COO- CH
H
Glycine
(Glc)
Alanine
(Ala)
Glycine
(Gly)
NH
3
+
CO CH
CH
2
Histidine (His)
NH CO CH
H
NH
2
CO CH
CH
3
NH
2
COO- CH
CH
2
Glycine
(Glc)
Alanine
(Ala)
Acide
glutamique(Glu)
N
NH
CH
2
COO
-
NH
3
+
CO CH
CH
2
NH CO CH
H
NH
2
CO CH
CH
3
NH
2
COO- CH
CH
2
Glycine
(Glc)
Alanine
(Ala)
CH
2
CH
2
Acide
glutamique(Glu)
Acide
glutamique(Glu)
COO
-
COO
-

1.2 Prdire la direction de migration pour les 3 peptides, aux valeurs de pH donnes. Utiliser C pour la migration vers
la cathode (ple ngatif), A pour la migration vers lanode (ple positif) et O si les peptides ne migrent pas.

2,0 4,0 6,0 11,0
(1) Lys-Gly-Ala-Gly C C C A
(2) His-Gly-Ala-Glu C C O/C A
(3) Glu-Gly-Ala-Glu C O/A A A
pH

TD2 Protides - correction
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pK
GLY COOH/COO-
pK
LYS R NH3+/NH2
2,3 10,5
Gly - COOH/COO
-
0
- -
Lys - NH
3
+
/NH
2
+ + 0
bilan
+ +
+ -
R
LYS(NH3+/NH2)
+
+ 0
pK
LYS NH3+/NH2
9
-
0
+
0
Peptide 1
GLU pK
COOH
pK
R-his
2,2 6
GLU : COOH/COO
-
0 - -
HIS : NH
3
+
/NH
2
+ + +
bilan
+ +
+ -
R
HIS(NH+/N)
+ + 0
pK
R-glu
4,3
-
+
+
0
Peptide 2
pK
NH3+
9,2
- -
R
GLU(COOH/COO-)
0 0 - -
-
0
0
-
pK
COOH
2,2
GLU : COOH/COO
-
0
-
GLU : NH
3
+
/NH
2
+ +
bilan
+
0
R
GLU(COOH/COO-
0 0
pK
R-glu
4,3
-
+
-
- -
Peptide 3
pK
NH3+
9,7
- - -
R
GLU(COOH/COO-)
0 0
-
-
0
-
-

1.3 Le peptide (2) est hydrolys et placer sur une lectrophorse sur papier pH = 5. Recopier le schma ci-dessous
et y marquer la position relative des acides amins constituant ce peptide, aprs migration.
Remarque : on ne tiendra pas compte de la masse des acides amins.


IUT de Prigueux dpartement gnie biologique S2M6 Biochimie structurale Travaux dirigs
pK
COOH
1,8
His: COOH/COO
-
0 -
His: NH
3
+
/NH
2
+ +
bilan + + +
R
HIS(NH+/N)
+ +
pK
R-his
6
-
+
0
0
Histidine
pK
NH3+
9,2
-
-
0
0

pK
COOH
2,2
Glu: COOH/COO
-
0 -
Glu: NH
3
+
/NH
2
+ +
bilan + 0
R
Glu(COOH/COO-)
0 0
pK
R-glu
4,3
-
+
-
-
Acide glutamique
pK
NH3+
9,7
- -
-
0
-

pK
COOH
2,3
Ala : COOH/COO
-
0
Ala : NH
3
+
/NH
2
+
bilan +
-
+
0
Alanine
pK
NH3+
9,7
-
-
0
pK
COOH
2,3
Gly : COOH/COO
-
0
Gly : NH
3
+
/NH
2
+
bilan +
-
+
0
Glycine
pK
NH3+
9,6
-
-
0






IUT de Prigueux dpartement gnie biologique S2M6 Biochimie structurale Travaux dirigs
2 Retrouver la position des ponts disulfures dans un polypeptide ?

1 Entres quels acides amins stablit un pont disulfure ?
Cf. cours
Aprs purification, dtermination de la composition en acides amins et de la squence primaire dune protine,
lexistence et la position de ponts disulfures sont recherches.
Pour cela, partir du polypeptide P purifi natif, on ralise deux expriences indpendantes suivantes (A et B) :
A) Une rduction par du -mercaptothanol : cela libre deux peptides dont les squences sont les suivantes :
Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys et Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys

B) Une hydrolyse enzymatique par la thermolysine. Dans les conditions opratoires choisies, cette enzyme
catalyse lhydrolyse des liaisons peptidiques dans lesquelles un rsidu Leu, Phe, Trp, Tyr ou Val a engag sa
fonction amine. Aprs la digestion enzymatique, on identifie 4 peptides dont la composition en acides
amins est la suivante :
Peptide 1 : Asn, Val et 2 Cys Peptide 3 : Phe, Thr et 2 Lys
Peptide 2 : Arg, Ala, Trp, Tyr et 2 Cys Peptide 4 : Phe, Thr, 2 Pro et 2 Cys

2 Indiquez laction du -mercaptothanol dans lexprience A.
cf. cours
3 Quelle conclusion tirez-vous de lexprience A, quant la structure du polypeptide P ?
4 En exploitant les rsultats de lexprience B, crire la squence en acides amins du polypeptide P natif en
faisant apparatre les ponts disulfures.
5 A partir de la structure que vous venez de proposer, montrez comment vous retrouvez les rsultats de
lexprience B.
6 Enfin, colorer les acides amins basiques en rouge, acides en bleu, polaires ni-acides ni-basiques en jaune et
polaires hydrophobes en vert.
7 Dessiner une configuration possible du peptide P sachant, que toutes les cystines y forment des ponts
disulfures, que les ponts disulfures ont tous la mme taille, et que certains acides amins se regroupent au
cur du peptide en particulier ici 4 acides amins hydrophobes : Ala, Val, Phe et Pro.

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Asn Cys Phe Thr Lys Lys Trp Cys Arg Ala
Cys Thr Pro Tyr Cys Phe Pro Cys
Val Cys
Asn
Cys Phe
Thr
Lys Lys
Trp
Cys
Arg
Ala
Val
Cys
Cys Thr
Pro
Tyr
Cys
Phe Pro Cys


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3 Titrage et charge dun acide amin : la glycine

3.1 Ecrire les quilibres acido-basiques de la glycine en dterminant la charge globale de la molcule chaque
tape.

3.2 Calculer le pHi de la glycine. Quel sera ltat dionisation de cet acide amin pH 6 ?

zwitterion
4.3. Reprsenter lallure schmatique dune courbe de titrage par un acide fort de cet acide amin en solution pH
alcalin en prcisant les espces prsentes en solution au cours de ce titrage.

4 Charge de lacide aspartique
En fonction des pK des diffrents groupements chimiques de lacide aspartique, dterminer dans quelle zone de
pH la forme suivante sera majoritaire :


La forme suivante sera majoritaire pH entre 3,9 et 9,6.