SEMANA 07: MICRORGANISMOS QUE

PUEDEN CAUSAR INFECCIONES

GASTROINTESTINALES .
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE EDAS:
SALMONELLA, SHIGELLA, VIBRIO CHOLERAE

Mblga. Rosa Elena Cruz Ojeda.

 ENTEROBACTERIAS
 Son los aislamientos bacterianos que se
encuentran con mayor frecuencia en muestras
clínicas.
 Distribuidos ampliamente en la naturaleza, tierra,
agua, plantas, tubo digestivo de humanos y
animales.
 Antes de la llegada de los antibióticos, se sabía que
los síndromes diarreicos y disentéricos
acompañados por fiebre y septicemia clásicos en
fiebre tifoidea, eran causados por Salmonella y
Shigella
 Los casos típicos de neumonía con esputo color
rojo ladrillo o “en jalea de grosella” eran
causados por el bacilo de Friedlander Klebsiella
pneumoniae.
 Escherichia coli, Proteus y miembros del grupo
Klebsiella-Enterobacter se aislaban con frecuencia
de heridas traumáticas contaminadas.
 CARACTERISTICAS GENERALES
 Bacilos Gramnegativos
 No forman esporas
 Tamaño intermedio (0,3 a 1,0 x 1,0 a 6,0 m)
 Aerobios y anaerobios facultativos
 Algunos móviles: Flagelos peritricos; otros no móviles (Klebsiella o Shigella)
 Muchos son habitantes normales del tracto intestinal del hombre (y de otros
animales)
 Crecimiento entre 18 – 24 horas de incubación en medios selectivos.
 Requerimientos nutricionales: (Vía fermentativa u oxidativa)
o Fermentan la glucosa con producción de ácidos o ácidos y gas
o La capacidad de fermentar la Lactosa se ha utilizado para
diferenciarlos en medios diferenciales como Agar Mac Conkey
o Fermentadores de Lactosa (Lac +): Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Citrobacter y Serratia, colonias rosadas-púrpura)
o No fermentan la lactosa o lo hacen lentamente (Lac -): Proteus,
Morganella, Salmonella, Shigella y especies de Yersinia,
colonias incoloras
 Citocromo oxidasa negativos a excepción de Plesiomonas (importante) los
diferencia de otros bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores
(Vibrio, Pseudomonas)
 Reducen los nitratos a nitritos
 Catalasa positivos
Clasificación de la familia Enterobacteriaceae por
tribus, propuesta por Ewing, en 1986
 ANTÍGENOS Y FACTORES DE VIRULENCIA

Variación de la
fase antigénica: Sistemas de
secreción tipo III
Inhibe muerte por fagocitosis

Adherencia

Endotoxina: Enterotoxina: diarrea

Resistencia
Fiebre
antimicrobiana

Cápsula:

Inhibe unión de complemento

Sideróforos

Citotoxicidad,
Motilidad, adherencia,
hemólisis
inhibe la muerte por
fagocitosis Secuestro de
factores de
crecimiento

Resistencia al efecto bactericida del suero

 Meningitis
Sistema nervioso central
Escherichia
Neumonía
Patógenos oportunistas Tracto respiratorio bajo
Klebsiella
Enterobacter
Escherichia
Sepsis
Torrente sanguíneo
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Diarrea
Alrededor de 28 Tracto gastrointestinal
especies de Salmonella
Shigella
importancia clínica Escherichia
Yersinia
ITU
Tracto urinario
Patógenos obligados Escherichia
Proteus
Klebsiella
Morganella
DX MICROBIOLÓGICO
Secreciones
Esputo
MUESTRA Orina, Heces*, otros
Ex. Directo:
Coloración Gram
Agar Mc Conkey
AISLAMIENTO SS Agar
Otros: DC, XLD, EMB,
etc.

Bioquímica
presuntiva(Medios
IDENTIFICACIÓN diferenciales): TSI, LIA, SIM,
MIO, A. Citrato de Simons,
etc. Serología, otras

Antibiograma (Kirby -
PRUEBA DE Bauer, CMI, Pruebas en
SUSCEPTIBILIDA analizadores
D Automatizados, etc.
 Es un examen de
¿Qué laboratorio para
es? encontrar
organismos en las
Coprocul heces, que puedan
tivo causar
enfermedades y
¿Por Qué síntomas
se gastrointestinales
realiza
?

Se realiza cuando el
paciente muestra
molestias
gastrointestinales y el
 Utilizar envase de boca
En hisopado rectal
ancha, tapa rosca y
utilizar una tórula de
estéril, muestra líquida,
Obtenci en un envase para
algodón estéril
ón De
Materia
La
recolección de orina.

les a
Mues
tra
utilizar
  Debe ser recolectada durante el
periodo agudo de la enfermedad,
antes de iniciar cualquier
tratamiento antimicrobiano.
 Debe ser representativa (Tamaño
de una nuez) 5-10 g si tienen

Obtenci consistencia pastosa, 5 a 10 ml

de heces si son líquidas.

ón De  En adultos, asegurar que

persona defeque en recipiente
la

La limpio, cuidando que la muestra

 no se mezcle
Colocar con orina. en un
la(s) muestra(s)

Muestra  recipiente de boca pueden

El N° de muestras
rosca
3
ancha y ser
evitar que se derrame o
tapa2 o

etapa pre-  mezcle

Una vezcon
h e otras muestras
c h o esto llevar lo
antes posible si
laboratorio, al esto no fuera
analítica posible, refrigerar a 4°C hasta el
momento del análisis
 PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA
DE HECES EN CASO DE SOSPECHA DE DIARREA
EN MENORES DE 1 AÑO

Obtención
De
La
Muestra
  Para realizar la toma, se
sobrepasandoelelhisopo
introduce esfínter anal y se rota
para hacer la toma de las criptas anales,
mantener allí durante 30 segundos para
Hisopa que se absorban los microorganismos y
retirar.
 Posteriormente se introduce en el medio
dos de transporte,
rectale paciente.
se cierraNo bien
mediolosde
es
transporte
rotula
necesario
el
tubos concon el
tubo yrefrigerar
nombre
se
del
s Cary Blair.
etapa pre-
analítica
 ♦ Color ♦ leucocitos
♦ olor fecales

macroscó
Exam

microscó
♦ Consistenc ♦ Hematíes
en ia ♦Tinción
direct ♦ pH azul de

pico
pico♦ Moco metileno
o ♦ Sangre ♦ Gram
Etapa
analítica ♦ Pus ♦Azúcares
♦ reductores
Alimentos ♦ Sangre
MEDIO DE AISLAMIENTO DE SELECTIVIDAD MEDIA

AGAR MAC CONKEY

Selectivo, diferencial
INH: cristal violeta, sales biliares
IND pH: Rojo neutro
CHO: Lactosa
Peptonas
LAC (+)

LAC (-)
MEDIO DE AILAMIENTO DE GRAN SELECTIVIDAD
SS AGAR

Selectivo, diferencial
INH: verde brillante, sales biliares, citrato de sodio
IND pH: Rojo neutro
CHO: Lactosa
Peptonas
Tiosulfato de sodio, citrato férrico
TIOSULFATO DE SODIO

H2S
CITRATO FERRICO
 COPROCULTIVO: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION

Muestra MEDIOS DE ENREQUECIMIENTO

(heces) DC, XLD A. Mc Conkey

Medios de aislamiento
MEDIO DE
TRANSPORTE
Incubar por 18-24 horas, 37°C Incubar 8-12 horas, 37°C
Cary Blair Turbidez
(Stuart) Colonias transparentes
e incoloras Colonias SS Agar Colonias:
rojas y secas transparentes e
incoloras con puntos
negros en el centro

TSI, LIA, Citrato, SIM, etc. Incubar 18-24 horas, 37°C

TSI, LIA, Citrato, SIM, etc.

TSI, LIA, Citrato, SIM, etc.

SEROLOGIA
Salmonella SEROLOGIA: E. coli,
Shigella enteropatógeno
SEROLOGIA
Salmonella
HELICOBACTER PILORI:
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACION
Morfología e Identificación
Aislada en 1983 por Warren y Marshall (ganadores del Premio Nobel 2005)

 H. pylori es una bacteria Gram negativa de forma curva o espiral.

 3 – 5 micras de largo con un diámetro aproximado de unas 0,5 micras.
 Tiene unos 4–6 flagelos.
 Es microaerófila
 Usa hidrógeno y metanogénesis como fuente de energía.
 Oxidasa y catalasa positiva.
 Hidroliza con rapidez la urea
 Principal factor etiológico para el desarrollo de la gastritis crónica, la úlcera péptica y
el adenocarcinoma gástrico
Helicobacter pylori produce proteasa que modifica el moco gástrico y reduce mas la capacidad de
ácido para difundirse a través del moco , También tiene un potente actividad de ureasa , lo que
genera amoniaco y amortigua mas el ácido.
H. pylori es muy móvil incluso en moco y puede abrirse camino hacia la superficie epitelial.

1. H. pylori penetra la capa mucosa

del estómago y se adhiere a la
superficie de la capa mucosa
epitelial gástrica.

2. Produce amoníaco a partir de

la urea para neutralizar el ácido
gástrico.

3. Migración y proliferación de H.
pylori al foco de infección.

4. Se desarrolla la ulceración
gástrica con destrucción de la
mucosa, inflamación y muerte de
las células mucosas.
ANTÍGENOS EN HECES
Las bacterias H. pylori están presentes en las heces de los pacientes
infectados.
Utilizan anticuerpos monoclonales contra antígenos de H. pylori para
evaluar las muestras fecales.
Tiene una precisión superior al 90% en la detección de la erradicación
de la infección tras el tratamiento, equiparable a la histología invasiva y
a la prueba no invasiva de aliento con urea.
Es el método más rentable para evaluar la eficacia terapéutica.
VIBRIO CHOLERAE:
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACION
 CAMPYLOBACTER
JEJUNI AISLAMIENTO E
IDENTIFICACION
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
IDENTIFICACION
BIOQUIMICA
TSI : TRIPLE SUGAR IRON (Agar hierro 3 azúcares
Inoculación por puntura (asa en punta, hilo)
A partir de una colonia aislada en SS Agar o Mc
Conkey

Composición:
Pico de Flauta
Slant
Glucosa 0.1%
Z. AEROBICA
Lactosa 1.0 %
Sacarosa 1.0 %

Rojo de Fenol (indicador pH)

Fondo Peptonas
Bottom
Z. ANAERÓBICA Tiosulfato de sodio
Citrato Férrico
Triple Sugar Iron (TSI) Kliger's Iron Agar (KIA)

El medio Kliger´s iron agar (KIA) contiene caseína, peptonas de carne, rojo de fenol como indicador de pH, 0.1% de glucosa y 1% de lactosa como carbohidratos
fermentables. Los iones férricos o ferrosos y el tiosulfato de sodio están presentes para detectar la producción de ácido sulfhídrico. El medio Triple sugar iron (TSI) es similar
en su formulación pero contiene 1% de sacarosa, que no está incluida en el KIA.
Los organismos que no son fermentadores de lactosa producen un bisel amarillo, debido a la producción de ácido durante la fermentación de glucosa. La pequeña cantidad
de glucosa es agotada rápidamente y el metabolismo oxidativo continúa en el bisel produciendo un pH alcalino por el desdoblamiento de las peptonas; entonces el bisel se
torna rojo. Como no hay penetración de oxígeno en el fondo, no ocurre metabolismo oxidativo y el fondo permanece ácido (amarillo). Los organismos que fermentan lactosa
(y/o sacarosa) continúan produciendo una gran cantidad de ácido en el bisel y en el fondo, por tanto la reacción en ambos permanece amarilla. Si el bisel y el fondo
permanecen neutrales, el organismo no es capaz de fermentar glucosa u otros azúcares.

Procedimiento
Inocule el bisel con una sola colonia del aislamiento. Tape el tubo ligeramente. Incube por 24 horas a 35ºC.

Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 A/A con producción de gas.
Salmonella entérica serovar Typhimurium ATCC 14028 K/A con o sin producción de gas.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 K/K sin producción de gas.

Interpretación
Ácido/Ácido (A/A): Pico de flauta ácido y fondo ácido que indica fermentación de glucosa, lactosa y/o sacarosa
Alcalino/Alcalino (K/K): Reacción típica de los bacilos gramnegativos no fermentadores de glucosa ni lactosa.
Alcalino/Ácido (K/A): Pico de flauta alcalino y fondo ácido característico de un no fermentador de lactosa.
Producción de H2S: Coloración negra a través del medio.
Producción de gas: Burbujas, rupturas o desplazamiento del medio.
Para el reporte de resultados remítase a las tablas para identificación de Enterobacteriaceae.
Agar lisina hierro

La lisina se utiliza para detectar la habilidad de un microorganismo de descarboxilar o desaminar un aminoácido formando una amina. El medio contiene
glucosa como el carbohidrato fermentable, el indicador de pH es el púrpura de bromo cresol y el rojo de cresilo, y la lisina es el aminoácido. Cuando un
organismo fermenta glucosa, se produce ácido y por consiguiente disminuye el pH, resultando en un cambio de color de púrpura hacia amarillo; si ocurre la
descarboxilación del aminoácido se forman aminas que revierten el medio a su color original (púrpura). La desaminación se evidencia porque se produce
ácido a-Ketocarboxílico el cual forma un compuesto de color rojo en el bisel.

Procedimiento
Deje atemperar el medio. Seleccione una colonia de un cultivo fresco e inocule en profundidad y en bisel. Tape el tubo e incube a 35ºC por al menos 18
horas y hasta 7 días.

Control de calidad
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Lisina descarboxilasa positivo.
Enterobacter cloacae ATCC 23355 Lisina descarboxilasa negativo.

Interpretación
Alcalino/Ácido (K/A): Negativo, color amarillo o no cambio de color del medio.
Rojo/Ácido (R/A): Desaminasa positivo, color rojo en el bisel con un fondo amarillo.
Alcalino/Alcalino (K/K): Descarboxilasa positivo, color púrpura.
Interpretaciones antes de 18 a 24 horas pueden llevar a resultados erróneos debido a que la fermentación de glucosa ocurre a las 10-12 horas de
incubación generando un ambiente ácido, y la producción de descarboxilasa sólo se genera cuando el medio se acidifica.
LIA: LISIN IRON AGAR (Agar Lisina Hierro)
Agar citrato de Simmons
El agar citrato es utilizado para evaluar la habilidad de un microorganismo de utilizar el citrato como fuente de energía. Este medio contiene citrato como
única fuente de carbono y sales amonio inorgánico como única fuente de nitrógeno. El crecimiento indica la utilización de citrato, un metabolito
intermedio en el ciclo de Krebs. Cuando la bacteria metaboliza el citrato, las sales de amonio se desdoblan en amoníaco, el cual aumenta la alcalinidad.
El cambio del pH en el medio, produce un cambio del indicador azul de bromo timol de verde hacia azul (en un pH mayor a 7,6). Este medio es
recomendado como parte de la diferenciación de especies de Enterobacteriaceae.

Procedimiento
Seleccione los tubos con agar citrato y permita que alcancen la temperatura ambiente. Tome el centro de una colonia bien aislada y siembre en el bisel
del medio. Tape el tubo ligeramente. Incube aeróbicamente a 37°C, hasta por 4 días.

Control de calidad
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Positivo (Crecimiento, color azul).
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo (No crecimiento o trazos de crecimiento).

Interpretación
Positivo: Cambio de color de verde hacia azul intenso
Negativo: No crecimiento, el bisel permanece verde

Limitaciones
Un crecimiento abundante en el bisel sin cambio de color puede indicar una prueba positiva. Sin embargo, si el agar no vira hacia azul en incubaciones
posteriores, la prueba debe ser repetida
No siembre en profundidad puesto que la utilización de citrato requiere de un ambiente aerobio.
AGAR CITRATO DE SIMMONS
Prueba de indol

Esta prueba evalúa la habilidad de un microorganismo para desdoblar el indol del aminoácido triptófano, a través de la
triptofanasa. Si el indol está presente, se combina con el aldehído para producir un compuesto quinoidal rojo violeta (si se utiliza
el reactivo de Kovac´s), o azul verdoso (reactivo de cinamaldehído). Este ensayo se utiliza en la identificación de cocos y
bacilos gramnegativos.

Procedimiento
La prueba puede ser realizada en el medio SIM (Sulfuro, Indol, Movilidad).
Realice la inoculación en profundidad por el centro del tubo que contiene el medio.
Incube 18 a 24 horas a 37ºC
Adicione 3 gotas del reactivo de Kovac´s

Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 Positivo
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Negativo

Interpretación
Positivo: Desarrollo de un color rojo violeta o púrpura dentro de los 20 segundos después de adicionar el reactivo.
Negativo: Sin cambio en la coloración o un color ligeramente amarillo.
PRUEBA DE INDOL: KOVAC´S
Producción de ácido sulfhídrico

Algunos microorganismos son capaces de liberar el sulfuro enzimáticamente a partir de sulfuro inorgánico como ácido sulfhídrico (H 2S) o de
aminoácidos que contienen sulfuro. La detección de H 2S a partir de sulfuro inorgánico es un proceso de dos pasos donde la bacteria reacciona con
el tiosulfato de sodio del medio para dar lugar a la producción de sulfito y H 2S. El gas H2S es incoloro, y se detecta mediante su reacción con los
iones férricos para formar sulfuro ferroso, que es insoluble y se precipita en el medio. Los indicadores más comunes son el sulfato ferroso, citrato
férrico, sulfato o citrato férrico de amonio. Diferentes medios son útiles para la detección de la producción de H 2S por enterobacterias, como el TSI,
KIA, XLD, Hektoen, agar Salmonella-Shigella y SIM.

Procedimiento
Atempere el medio.
Usando un asa estéril, toque el centro de una colonia bien aislada.
Siembre en profundidad a 3-5 mm del fondo del tubo o por estrías si es en una placa.
Incube aeróbicamente a 37°C por 18 a 24 horas.

Interpretación
Positivo: Producción de H2S,que se identifica por un precipitado negro.
Negativo: No se observa coloración negra en el medio.
Prueba de movilidad

La movilidad es utilizada para detectar la presencia de flagelos en las bacterias que les permiten desplazarse más allá de la línea de
inoculación inicial en el agar. En la prueba en tubo se utiliza un medio semisólido (SIM) que es inoculado de forma vertical en el centro del tubo.
Los organismos móviles migrarán fuera de la línea de inoculación causando la turbidez visible a través del tubo. Los organismos no móviles
crecen sólo a lo largo de la estría de inoculación. Otros sustratos pueden ser adicionados al medio para medir simultáneamente otras
reacciones bioquímicas que ayudan a la identificación del microorganismo.

Procedimiento
Con un asa de chuzo estéril, tome una colonia aislada y punce el medio verticalmente en el centro a una profundidad de aproximadamente 2
cm en tubos pequeños y 3 cm en tubos más largos.
Incube como sigue: A 35°C por 24 horas para Enterobacteriaceae, a 30°C por 24 horas para bacilos gramnegativos no fermentadores. Para
Yersinia y Listeria incube dos tubos uno a 35°C y otro a 25°C.

Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 Movilidad positiva.
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Movilidad negativa.

Interpretación
Positivo: Crecimiento difuso fuera de la línea de siembra o turbidez del medio.
Negativo: Un tubo claro (similar al medio sin inocular) con crecimiento solo a lo largo de la línea de siembra.
MEDIO SIM
(H2S, Indol,
Motilidad)
Prueba de oxidasa

La enzima bacteriana intracelular citocromo oxidasa, en presencia de oxígeno atmosférico, oxida el reactivo de fenilendiamina (un
aceptor de electrones) para formar un compuesto de color púrpura oscuro llamado indol fenol. Esta prueba es útil en la caracterización
inicial de bacterias Gram negativas.

Procedimiento
Coloque un trozo de papel filtro Whatman no.1 en una caja de petri y humedezca con 1 o 2 gotas con reactivo de oxidasa
Coloque un disco seco impregnado o tira de papel en una caja de petri y humedezca con agua desionizada.
Tome una colonia aislada con un palillo y extiéndela en el filtro de papel impregnada con reactivo de oxidasa. (Algunos fabricantes no
requieren que la tira de papel sea humedecida).
Para bacterias de difícil crecimiento, frote un escobillón sobre la colonia y luego sobre el filtro de papel.

Control de calidad
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Oxidasa positiva.
Escherichia coli ATCC 25922 Oxidasa negativa.

Interpretación
Prueba positiva: Desarrollo de color azul o púrpura en los primeros 30 segundos.
El desarrollo de color azul oscuro o púrpura entre 30-60 segundos se considera una reacción débilmente positiva, característica de
Pasteurella spp.
Prueba negativa: No hay cambio de color en 60 segundos.
No use asas de nicromo para recoger la colonia, ni microorganismos aislados de medios con glucosa o colorantes (McConkey o EMB).
Urea (ureasa) – Agar urea

El medio contiene urea y rojo de fenol como indicador de pH. Muchos organismos, especialmente aquellos que infectan el tracto
urinario, tienen la enzima ureasa, la cual es capaz de desdoblar la urea, en presencia de agua, para liberar dos moléculas de amonio
y dióxido de carbón. El amonio se combina con el dióxido de carbón y agua para formar carbonato de amonio el cual vuelve el medio
alcalino, virando el indicador de su color naranja hacia rosado o fucsia brillante. Esta prueba puede ser usada como parte de la
identificación de Enterobacteriaceae, incluyendo Proteus, Klebsiella y algunas especies de Yersinia y Citrobacter.

Procedimiento
Permita que el medio con urea se atempere.
Use un asa estéril, seleccione una colonia e inocule el agar en el bisel.
Incube con la tapa ligeramente cerrada en atmósfera aerobia a 35–37ºC.
Para no fermentadores incube a 30ºC.
Examine cambio de coloración.

Control de calidad
Proteus mirabilis ATCC 12453 Positivo.
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo.

Interpretación
Positivo: Desarrollo de un color intenso magenta o rosa brillante en 24 horas de incubación.
Negativo: No hay cambio de coloración .
GRACIAS