PCR
jvillarreal
Reacción en Cadena de la Polimerasa para el
diagnostico molecular.
La reacción en cadena de la polimerasa fue
descrita por primera vez en 1971 por Kepple
(31) y posteriormente por Kary Mullis en 1990
(32).
31. K. Kleppe, E. Ohtsuka., R. Kleppe, I. Molineux, and H.G. Khorana. 1971. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short
synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. BioI. 56: 341-361.
32. Mullis, K., B. 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci. Am. 262(4): 56 -61, 64 – 65.
Para realizar las amplificaciones, se empleaba
el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I
de Escherichia coli (33).
33. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Erlich, H. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the
polymerase chain reaction. Biotechnology. 24: 17 – 27.
Posteriormente se aisló y caracterizó una
enzima con la capacidad mantener su
actividad de ADN polimerasa a elevadas
temperaturas (34).
34. Chien, A., Edgar, D. B. and Trela, J. M. 1976. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile thermus aquaticus. J.
Bacteriol. 127: 1550-.
Esta técnica es simple, reproducible, rápida y
flexible. Desde entonces ha sido modificada y
se han publicado muchas variantes de este
método.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)
es una técnica cuyo objetivo principal es la
multiplicación in Vitro de uno o varios
segmentos de ADN, por acción una enzima
ADN polimerasa, ADN dependiente
termoestable (34, 35)
34. Chien, A., Edgar, D. B. and Trela, J. M. 1976. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile thermus aquaticus. J.
Bacteriol. 127: 1550.
35. Kaledin, A. S., Sliusarenko, A. G. and Gorodetskii, S. I. 1980. Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic
bacteria Thermus acuaticus YT-1. Biokhimiia. 45: 644-
El ADN bicatenario debe estar desnaturalizado
para formar cadenas lineales en presencia de
altas concentraciones de oligonucleótidos y
cloruro de Magnesio, entonces dos cadenas
nuevas del dúplex original deben ser formadas
(31).
31. K. Kleppe, E. Ohtsuka., R. Kleppe, I. Molineux, and H.G. Khorana. 1971. Studies on polynucleotides.
XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. BioI. 56: 341-
361.
Reactivos necesarios
– Oligonucleotidos.
– dNTPs (desoxinucleotidos trifosfatos)
– Buffer de reacción adecuado.
– Enzima ADN polimerasa termoestable
TABLA DE AMPLIFICACIÓN DE PCR
Componentes Maxter Mix Vol X NÚMERO DE
[ ] REQUERIDA MUESTRA (μL) REACCIONES
Buffer 10X 1x
Primer F 10 mM 0.1-0.5 μM (6 x 1012) 0.25 μL
moléculas
Primer R 10 mM 0.1-0.5 μM (6 x 1012 ) 0.25 μL
moléculas
dNTP`s 200 μM 1 μL
Mg+2 25 mM 1.5 mM
Taq ADN pol 0.5 U/25 μL
(5 U/ μL)
Agua
ADN problema 5 μL
ADNds, ss, plasmidial
1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng
de bacteriano o 1 pg of plasmídico
25 μL μL
Equipos necesarios
Termociclador
El termociclador es un equipo, un tanto
costoso, cuya función principal es aumentar o
bajar la temperatura consecutivamente un
número de veces determinado (ciclos).
MODIFICACIONES
• RT-PCR
• PCR TIEMPO REAL. (qPCR)
• PCR MULTIPLE.
• PCR anidada.
Biología Molecular
Ensayo de selectividad de los oligonucleótidos 139-141. Línea 1: Marcador de peso molecular 100 pb DNA Ladder. Línea 2:
S. typhi. Línea 3: S. paratyphi. Línea 4: S. typhimurium. Línea 5: K. oxytoca. Línea 6: K. pneumoniae. Línea 7: M. morganii.
Línea 8: blanco. Línea 9: control negativo (ADN humano). Línea 10, control positivo (ADN S. typhi, muestra clínica).
Generación de una señal
por sonda Incorporación del SYBR
Para conseguir la completa separación de las
hebras de toda la muestra esta temperatura
debe mantenerse unos minutos (en el
termociclador).
Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente
este tenderá a renaturalizarse rápidamente,
evitando así una eficiente hibridación de los
oligonucleotidos (primer) al igual que una
posterior extensión.
CONDICIONES DE LA MUESTRA
Integridad del ADN: este no puede estar
fragmentado en trozos más pequeños de lo
que queremos amplificar.
CONDICIONES DE LA MUESTRA
Origen de la muestra y proceso de extracción:
la muestra no debe llevar agentes quelantes
(EDTA) o heparina que reducen la
concentración de iones de Mg, tampoco debe
haber determinados factores sanguíneos,
fenol, detergentes que inhibirían la actividad
de la polimerasa.
CONDICIONES DE LA MUESTRA
• Cantidad de la muestra: si se dispone de
suficiente cantidad para la amplificación de
ADN genómico de copia única se usan
cantidades de 100-500ng en el caso de zonas
repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-
50ng. El mínimo oscila entre 10-100ng y el
máximo entre 400-500ng
Polimerasas
Taq Thermus aquaticus,
Pwo Pyrococcus woesei,
Pfu Pyrococcus furiosus,
Tli Thermococcus littoralis
Pasos de la PCR
Desnaturalización.
Para que comience la reacción es necesario
que el ADN molde se encuentre en forma de
cadena sencilla esto se consigue aplicando
temperaturas de 94 a 95°C que produce la
ruptura de los puentes de hidrógeno
intercatenarios y por lo tanto la separación de
ambas cadenas.
La PCR se lleva a cabo en una serie de ciclos
cada uno de los cuales incluye tres fases o
pasos:
Hibridación.
Esta fase se denomina también fase de
annealing o de emparejamiento. Una vez que
el ADN esta desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido
entre los 40 a 60°C.
Esto es necesario para que se pueda producir
la unión de los primer a las secuencias
flanqueantes del fragmento que se va a
amplificar.
La temperatura optima de hibridación (Tm)
depende de varios factores y es relativamente
especifica para cada primer.
La longitud de los primer y la secuencia son
criticas en la designación de los parámetros de
una amplificación; una formula simple para
calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Extension
Durante este paso la taq polimerasa
incorpora nucleótidos en el extremo 3’ del
primer utilizando como molde la cadena de
ADN previamente desnaturalizada.
La temperatura a la que se lleva a cabo este
paso suele ser 72 +/- 5°C ya que es a este
rango de temperatura en que la taq
polimerasa alcanza su máxima actividad.
PRODUCTOS INDESEABLES DE LA
PCR
Los dimeros de primer son fragmentos de
doble cadena cuya longitud es muy próxima a
la suma de los primer y se producen cuando
un primer es extendido a continuación del
otro, el mecanismo por el cual se producen
estos dimeros no esta completamente
determinado.
Algunas polimerasas incluida la taq polimerasa
han mostrado una débil actividad
polimerizadora no regida por un ADN patrón,
la cual puede unir nucleótidos adicionales al
doble extremo apareado.
si esta actividad puede producirse sobre una
hebra sencilla de oligonucleotidos, resultaría
una buena oportunidad para que la extensión
formara un corto solapamiento en el extremo
3’ con el otro primer, suficiente para
promover la formación del dímero.
