Tema 3

Observación de los microorganismos

• El microscopio óptico.
• Poder de resolución y apertura numérica
• Tipos de microscopía óptica: campo claro, contraste de
fases, campo oscuro, fluorescencia.
• Observación de imágenes tridimensionales.
• El microscopio electrónico: fundamento, tipos y técnicas.
• Colorantes microbiológicos.
• Técnicas de tinción de interés en Microbiología:
Gram, esporas, cápsulas, flagelos, etc.
 El microscopio óptico
• Microscopio simple: 1 sola lente
Se usa como lupas y cristales de aumento
• Microscopio compuesto:
2 lentes o sistemas de lentes
Objetivo y ocular
Aumento total = Aum. objetivo x Aum. ocular
Máximo aumento: x 2.000
Esquema del microscopio
Ocular, objetivos, revólver, platina,
condensador, diafragma, tornillos de
enfoque, estativo, iluminación
 Microscopía de campo claro

• Campo microscópico intensamente iluminado

• Objetos oscuros sobre fondo claro

• Recorrido de los rayos luminosos

• Amplificación 1.000 (ocular x10)

1.500 (ocular x15)

• Amplificación > 1.500 → “aumento ineficaz”

 Aumentos Marcha de los rayos
100, 400, Imagen
1000 visualizada
Ojo

Ocular
10
Imagen intermedia
(invertida)

10, 40, o Objetivo

100 (aceite)
Muestra
Ninguno Condensador

Fuente de
iluminación
Campo claro Contraste de fases Campo oscuro
 Microscopía de campo claro
Poder de resolución
• Capacidad de mostrar distintos y separados 2 puntos muy cercanos
• Ernst Abbé – 1870s – Desarrolla teoría óptica

A mayor PR → mayor definición del objeto

Ecuación de Abbé:
λ de la luz
PR = --------------- AN = n • sen θ
2 • AN
n = índice de refracción del medio
θ = semiángulo cono luz que penetra en el objetivo

• El límite de resolución del microscopio óptico es de unos 0.2 µm

• Distancia de trabajo
— distancia entre la superficie frontal de la lente y
la superficie del cubreobjetos o de la muestra
cuando se encuentra enfocada
 Microscopía de campo claro

Límite de resolución

• Objeto más pequeño que puede verse

• Se consigue empleando λ cortas (500 nm) y
objetivos con máxima AN (1,25)

500 nm
PR = -------------- = 200 nm = 0,2
µm
2 • 1,25
Cuando el aire es reemplazado por aceite de inmersión,
muchos rayos que no entraban en el objetivo debido a reflexión
o refracción, ahora si lo hacen. Esto produce un incremento en
la resolución y apertura numérica.
 Microscopía de campo claro

Profundidad de campo
• Espesor de la preparación enfocada
• A > aumento, menor profundidad de campo
• Con aceite de inmersión es < 1 µm

Área de campo
• Diámetro de la parte de preparación que se está
observando
• A mayor aumento, menor área de campo
 Microscopía de campo claro

La mayoría de los microscopios tienen

• Oculares: x10 x15

• Objetivos: x4 x10 x40 x100
x10: para rastrear al preparación
x40: microorganismos grandes
(algas, hongos, protozoos)
x100: bacterias y eucariotas
pequeños
 Microscopía de campo claro

Aumento Objetivos x10 x40 x100

Apertura numérica 0.25 0.65 1.30

Poder de resolución (µm) 2.0 0.35 0.20
Profundidad de campo 7.0 1.30 0.50
Área de campo (ocular x10) 1.5 0.35 0.17
Distancia de trabajo (mm) 4-8 0.60 0.1
 Microscopía de contraste de fases

• 1936 – Fritz Zernike

• Premio Nobel de Física en 1953
• Observación de células, incluso sin teñir
• Fundamento:
aprovecha la diferencia de índice de
refracción entre las células y el medio que
las rodea para dar mayor contraste
• Si tienen = n, no se ven
• Permite observar muestras vivas y componentes
bacterianos: endosporas, vacuolas…
 Microscopía de contraste de fases

Recorrido de la luz
• Condensador: diafragma anular (disco con anillo transparente)
• Objetivo: anillo de fase en una placa cambiadora de fase
• Los rayos difractados por las células son retrasados en ¼ de su λ.
Estos rayos difractados evitan el anillo de fase del objetivo y se
enfocan para formar la imagen del objeto.
• La luz no difractada (luz directa), al pasar por el anillo de fase del
objetivo, avanza ¼ de su λ
• Las ondas difractadas y no difractadas tendrán una diferencia de
fase de ½ de λ, y se anularán entre sí cuando se junten, formándose
una imagen.
• La luz difractada (retardada), llega al ocular fuera de fase
• El objeto (teñido o no) aparece oscuro y bien definido sobre un
fondo claro (formado por luz no difractada)
Campo claro Contraste de fases Campo oscuro
 Microscopía de contraste de fases

Instrumento de investigación

• Elimina artefactos tinción

• Para detectar componentes bacterianos:

endosporas, flagelos
gránulos (PHB, polifosfato, azufre)
 Microscopía de campo oscuro

• Permite observación de microorganismos vivos sin teñir,

simplemente cambiando la forma de iluminación
• Sistema condensador modificado para dirigir la luz a la
preparación desde los lados.
• Los rayos directos caen fuera del objetivo
• Sólo la luz difractada por las células llega al ocular
• La muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro
• Aplicaciones:
– Células que contrastan débilmente con el medio
– Excelente para observar la movilidad
– Treponema pallidum
Campo claro Contraste de fases Campo oscuro
Treponema pallidum
 Microscopía de fluorescencia

• 1908 – Desarrollado por Köhler y Siedentopf

• Fluorescencia: propiedad de muchas sustancias
químicas de emitir luz visible cuando son
excitadas con luz UV
• Fluorocromos: fluoresceína, rodamina B,
auramina, naranja de acridina, DAPI
• Filtros de excitación y de retención para
bloquear la radiación UV
 Microscopía de fluorescencia

Aplicaciones
• Mycobacterium tuberculosis
• FISH – Hibridación in situ fluorescente
• Muy usada en ecología microbiana para enumerar
bacterias en muestras naturales
• Herramienta esencial en microbiología médica: sondas
marcadas con fluorocromos para identificar patógenos
• Distinción entre células vivas y muertas
• Reacción de inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia
 Protozoo flagelado marcado Micrococcus luteus y Bacillus cereus
con anticuerpos fluorescentes Vivas: verde – Muertas: rojo
 Imágenes tridimensionales

Limitaciones del microscopio óptico

• Imagen poco definida de células completas
• Imposible separar áreas enfocadas de las
que están fuera de foco → imagen borrosa
• Imágenes bidimensionales
• Imposible realizar cortes finos con células
vivas
Microscopía confocal de barrido con laser, (CSLM)

• 1961, Minsky – Utilizado a partir de los 80s

• Microscopio controlado por ordenador que emplea un láser
acoplado a un microscopio de fluorescencia
• Fundamento: eliminar el velo que, en una imagen de
microscopía óptica normal, producen las regiones que se
encuentran fuera del plano de foco
• Usa fluorocromos para hacer más visibles los objetos
• Permite generar imágenes digitales tridimensionales.
• Aplicaciones: análisis filogenéticos de poblaciones y estudio
de comunidades mixtas en biopelículas
• Resolución 0.1m
 El microscopio electrónico

• Utiliza electrones (no rayos de luz) y

electroimanes (no lentes)
• Funcionamiento en vacío
• Resolución: 0.5 nm
• Dos tipos:
– Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
– Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Microscopio electrónico de transmisión

– Lentes electromagnéticas
– El sistema opera en vacío
– Gran amplificación y resolución (0.2 nm)
– Se pueden ver sustancias de tamaño molecular
– La muestra debe ser muy delgada (20-60 nm),
fijada químicamente (glutaraldehido, tetróxido de
osmio) y teñida con metales (Pd, Cr, Au)
 Microscopio electrónico de transmisión

Tinción negativa
• Los metales pesados no
penetran en la muestra
pero la rodean de un
fondo oscuro
• Usada para virus,
vacuolas de gas
bacterianas
 Microscopio electrónico de transmisión

Sombreado
• Recubrir muestra con
fina capa de metal
(Pd, Cr, Au) en un
solo lado
• Usada para ver la
morfología de virus,
flagelos, DNA
 Microscopio electrónico de transmisión

Réplicas de carbono
• Evaporar fina capa de C sobre la superficie celular
• Esta capa se adapta al contorno celular
• Se desprende (fina) y se observa

Criofractura
• La muestra se congela en nitrógeno liquido -196°C
• Se cortan los bloques con cuchillas de diamante
• Se hacen luego réplicas de carbono
• Evita formación de artefactos
Criofractura de la bacteria
Gram –
Thiobacillus kabobis

S – superficie externa
ME – capa externa de la PC
MC – membrana plasmática
C - citoplasma
Microscopio electrónico de barrido

• Para crear la imagen 3D, usa electrones

emitidos por la superficie de la muestra
(en vez de electrones transmitidos)
• Puede determinar la localización actual
in situ de microorganismos en nichos
ecológicos
 Microscopio electrónico de barrido

– La muestra se cubre con una fina película de un metal

pesado (p.e. oro)
– Un cañón de electrones escanea el objeto
– Los electrones dispersados por el oro activan una
pantalla produciendo la imagen
– Pueden observarse objetos muy grandes
– Amplificación: desde 15x a 100.000x
– Resolución: 1 nm
 Colorantes microbiológicos

• Básicos: catiónicos, tiñen estructuras con carga – (núcleo)

Violeta genciana, fuchsina, azul de metileno
• Ácidos: aniónicos, tiñen estructuras con carga + (citoplasma)
Eosina, rosa de bengala
• Soluciones acuosas o hidroalcohólicas < 1%
• Mordientes: aumentan interacción entre la célula y el colorante
Técnica general de tinción

• Extensión
• Desecación
• Fijación: calor o sust. químicas
(etanol, formol)
• Tinción
• Lavado
• Secado
• Observación
I. Extensión

Extender una fina capa de Secar al aire

muestra sobre el portaobjetos

II. Fijar por calor y teñir

Fijación por flameado Añadir colorante;

el portaobjetos lavar y secar

III. Microscopía

Porta Aceite

Colocar una gota de aceite

en el porta y examinar con
objetivo de 100x
 Métodos de tinción

• Tinción simple

• Tinciones diferenciales

– Gram: Christian Gram, 1884

– Ácido-alcohol-resistencia
método de Ziehl-Neelsen →
Mycobacterium tuberculosis
Tinción de ácido-alcohol resistencia

• Particularmente útil para miembros del

género Mycobacterium

Mycobacterium tuberculosis – causa

tuberculosis
Mycobacterium leprae – causa lepra

• gran contenido en lípidos (ácido micólico)

en su pared celular
 Tinción de estructuras específicas
– Tinción de esporas:
• Método de Schaeffer-Fulton:
verde de malaquita + fuchsina

– Tinción de flagelos:
• Método de Leifson: pararosa-anilina
• Método de Gray: fuchsina básica

– Tinción de cápsulas:
• Tinción negativa con tinta china o nigrosina
 Tinción de estructuras específicas

Tinción de esporas:
• Método de Schaeffer-Fulton:
verde de malaquita + fuchsina

Tinción de flagelos:
Método de Leifson: pararosa-anilina
Método de Gray: fuchsina básica

Tinción de cápsulas:
Tinción negativa con tinta china o nigrosina