Unidad N°3.
Herramientas utilizadas
por la genética
molecular humana
La clonación
• La clonación
molecular aisla y
amplifica una
secuencia
específica de
DNA,
transfiriéndola a
microorganismos
que la replican,
generando
grandes
cantidades de
DNA para su
estudio.
Las enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son
proteínas bacterianas que cortan el
DNA en secuencias específicas,
creando extremos romos o cohesivos,
dependiendo de su acción.
Las enzimas de restricción
Ejemplo: EcoRI es una enzima que corta el DNA en una secuencia
específica, 5’-GAATTC-3’
Vectores Plásmidos, virus o cosmídicos.
• Los vectores son
herramientas en
biotecnología que
transportan DNA a células
huésped (bacterianas,
animales o vegetales).
Pueden ser plásmidos, virus
o cosmídicos, y permiten
replicar y expresar genes
insertados, con elementos
para selección y replicación
independiente dentro de la
célula.
Vectores
Genoteca
• Una genoteca es una • La genoteca genómica
colección de clones de se crea al cortar el ADN
DNA que contienen genómico con una
fragmentos únicos de enzima de restricción,
DNA de un organismo. insertando los
Actúa como una fragmentos en
"biblioteca" de secuencias vectores y luego en
genéticas, y con métodos bacterias para
de detección se puede replicarlos, permitiendo
localizar un fragmento su almacenamiento y
específico. análisis eficiente.
La genoteca de cDNA
• La genoteca de cDNA se crea
a partir de mRNA,
convirtiéndolo en cDNA y
luego insertándolo en
vectores. Contiene solo
exones, lo que facilita el
estudio de genes activos, sin
intrones ni secuencias
promotoras.
Genoteca
El cribado de genotecas
• El cribado de genotecas es el proceso de encontrar un clon con
la secuencia de interés usando sondas marcadas que se
hibridan con la secuencia objetivo, facilitando su detección.
Hibridación Fluorescente in Situ
Transferencia Southern
• La transferencia Southern es una técnica para detectar
fragmentos específicos de DNA. Implica aislar y digerir el
DNA, separarlo por tamaño, transferirlo a un filtro,
hibridarlo con una sonda marcada y luego revelar los
fragmentos de interés. Es útil para detectar mutaciones
grandes, como deleciones o inserciones, pero no para
mutaciones pequeñas, a menos que afecten sitios de
restricción.
Aislamiento y digestión del DNA
Separación por tamaño Transferencia a un filtro
Electroforesis en gel de agarosa
Revelado
Hibridación con una sonda
Análisis con sondas ASO
Análisis con sondas de oligonucleótidos con especificidad
de alelo (ASO):
• Análisis con sondas ASO: Detecta mutaciones de una sola
base utilizando oligonucleótidos sintéticos que hibridan con
secuencias normales o mutantes. Es sensible, pero solo analiza
partes específicas del gen.
Transferencia Northern
• Transferencia Northern:
Analiza el tamaño y
abundancia de mRNA
mediante electroforesis y
hibridación con sondas
marcadas. Ha sido
reemplazada en parte por
técnicas más rápidas como
PCR.
La PCR (Reacción en Cadena
de la Polimerasa)
• La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica
que amplifica secuencias específicas de DNA o RNA, generando
millones de copias en pocas horas. Utiliza cebadores
oligonucleotídicos y ciclos de desnaturalización, hibridación y
síntesis enzimática. Se aplica en clonación de genes, análisis
de mutaciones y diagnóstico molecular. La PCR cuantitativa
mide la cantidad de DNA o RNA, siendo útil para cuantificar
pequeñas muestras y comparar resultados con controles.
La RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa) se utiliza cuando se trabaja con RNA
PCR cuantitativa mide la cantidad de una secuencia específica de DNA en una muestra
La tecnología de imágenes
• La tecnología de imágenes permite medir la fluorescencia
en imágenes microscópicas, facilitando estudios del
genoma y transcritos de mRNA mediante micromatrices
multigénicas.
La hibridación in situ
fluorescente (FISH)
• La hibridación in situ fluorescente (FISH) es esencial en
citogenética para identificar aberraciones cromosómicas,
visualizando segmentos específicos de DNA. Técnicas
avanzadas como el cariotipado espectral (SKY).
Hibridación genómica
comparativa (CGH)
La hibridación genómica comparativa (CGH) detectan
reordenamientos cromosómicos y variaciones en DNA, siendo
cruciales para el diagnóstico de cáncer y malformaciones
congénitas.
Las matrices de expresión de
RNA
• Las matrices de expresión de RNA son herramientas efectivas
para analizar la abundancia de múltiples transcritos de RNA en
un solo experimento, superando las limitaciones de técnicas
como la transferencia Northern. Son especialmente útiles en
enfermedades como cáncer y trastornos autoinmunitarios. El
proceso incluye la extracción de RNA, conversión a cDNA y
marcaje con colorantes fluorescentes para hibridar en un
genochip, permitiendo medir la expresión génica y estudiar
alteraciones en la salud. Su aplicación en oncología ayuda a
diferenciar tumores y predecir características clínicas.
El análisis de transferencia
Western
• El análisis de transferencia Western permite estudiar la función
de proteínas codificadas por un gen y cómo los defectos en el
DNA afectan a estas proteínas y a los fenotipos clínicos. La
técnica consiste en separar proteínas por electroforesis,
transferirlas a una membrana y detectarlas con anticuerpos
específicos, siendo clave para entender alteraciones proteicas
en patologías como la distrofia muscular de Duchenne o
Becker.
•END…..
