Cuantificación de aminoácidos endógenos y derivados de aminoácidos en orina
mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica y espectrometría de
masas en tándem.
María Azucena Hernández Macea
Saray Andrea Muñoz Madera
Universidad de Córdoba
Programa de Química
2023-II
1. INTRODUCCIÓN
La cuantificación precisa de AA en fluidos biológicos es un desafío debido a la diversidad química
y concentraciones variables. Se han desarrollado varios métodos analíticos, como cromatografía
líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), electroforesis capilar y
cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC).
Este estudio se centra en el desarrollo de un método HILIC-MS/MS para la cuantificación de AA y
sus derivados en muestras de orina humana, con el objetivo de ofrecer una herramienta precisa y
rápida para estudios clínicos y nutricionales. El método se basa en el análisis directo de la muestra
mediante HILIC-MS/MS después de una simple dilución, y se validó según las pautas actuales para
métodos bioanalíticos.
2. METODOLOGÍA
2.1 Preparación de soluciones y muestras de control de calidad.
Se crearon soluciones madre de veinte AA y nueve derivados en metanol y agua en
concentraciones de 1000 a 10000 μg/mL, almacenadas a -80°C. Estas soluciones se dividieron en
cinco grupos según su concentración en orina. Se prepararon soluciones de trabajo estándar antes
del análisis mediante dilución con acetonitrilo y agua.
Se crearon tres series de calibradores, una en (95:5, ACN: H 2O), la segunda en una matriz
auténtica de orina combinada de 20 individuos, y la tercera en orina sintética. La orina sintética se
preparó mezclando componentes específicos en agua.
La validación del método se realizó utilizando muestras de control de calidad, tanto orina
mezclada como orina sintética enriquecida a tres niveles de concentración. Se añadió una solución
de mezcla de AA marcados isotópicamente como estándar interno.
2.2 Condiciones HILIC-MS/MS
La cromatografía se realizó en una columna. El flujo se estableció en 500 μL/min, utilizando un
sistema de fase móvil binaria con 2 concentraciones diferentes.
•A: 5 mM de formiato de amonio (pH 3) en ACN/H2O (95:5,v/v)
•B: 5 mM de formiato de amonio (pH 3) en H2O/ACN (70:30,v/v).
2.3 Recogida y preparación de muestras
La creatinina se determinó mediante un ensayo enzimático y se congeló una alícuota a -20°C hasta el
análisis. A 50 μL de muestra, se añadieron 120 μL de ACN:H20 (95:5, v/v). La muestra diluida se
agitó en vórtex durante 2 min y se centrifugó a 6700 g a 4°C durante 10 min. Luego, se transfirió una
alícuota a un vial de auto muestreador para el análisis LC- MS/MS.
2.4 Desarrollo y validación de métodos .
Dada la variabilidad en las concentraciones
de aminoácidos en la orina, se examinó el
rango de concentración para cada analito.
Los efectos de la matriz se evaluaron
comparando las curvas de calibración en
matriz biológica auténtica con las de
soluciones estándar.
Se evaluó la linealidad, los límites de
detección (LOD) y cuantificación (LOQ), así
como la recuperación de picos y la precisión y
exactitud del método. La incertidumbre se
calculó utilizando. Se utilizaron medidas de
repetibilidad y precisión intermedia mediante
ANOVA unidireccional para estimar la
incertidumbre.
2.5 Selectividad, efectos de arrastre y estabilidad
Se analizaron muestras de matriz sustituta y blancos enriquecidos con mezclas de patrones
internos y analitos puros para evaluar interferencias en los tiempos de retención.
Se estudiaron los efectos de arrastre al inyectar una solución en blanco después del nivel más
alto de calibrador, comparando áreas de picos con el límite inferior de cuantificación.
Se consideraron aceptables los resultados con coeficientes de variación inferiores al 20% para
el analito y al 5% para el estándar interno.
Se evaluó la estabilidad a corto plazo en diferentes niveles de la matriz sustituta enriquecida
y en la muestra biológica de control de calidad.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
3.1. Método HILIC-MS/MS:
Se llevó a cabo detección selectiva de analitos con formas de pico eficientes.
descubriéndose que el uso de una fase móvil ácida mejoraba la simetría de los picos y
la sensibilidad de detección para varios aminoácidos, especialmente aquellos con
cadenas laterales polares.
El gradiente se optimizó para lograr la elución de 29 analitos en 10 minutos sin
interferencias. Se observó que los aminoácidos aromáticos no polares y aquellos con
cadenas laterales polares se eluían primero, seguidos por los de cadenas laterales
neutras, ácidas y básicas.
Se utilizó la ionización positiva en lugar de la negativa para obtener una mayor
respuesta de MS, excepto para la colina.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
ANÁLISIS Y RESULTADOS
ANÁLISIS Y RESULTADOS
3.2. Validación del método:
Dado que todos los analitos objetivo son endógenos y están presentes en orina, la
validación del método se realizó basándose en las directrices existentes para métodos
bioanalíticos con adaptaciones para abordar el caso de los biomarcadores endógenos
[54,55,59,60].
3.2.1. Selectividad y transferencia
Se consiguió una resolución satisfactoria de los analitos isobáricos. Las respuestas en el
mismo tiempo de retención que ISs, en las muestras en blanco no superaron el 5% de la
media de las respuestas IS de los calibrantes.
Las respuestas del analito obtenidas en las muestras en blanco analizadas inmediatamente
después del ULQ no superaron el 15% de la respuesta del LLOQ, lo que indica una
transferencia aceptable.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
3.2.2. Efecto matriz
ANÁLISIS Y RESULTADOS
ANÁLISIS Y RESULTADOS
3.2.3. Calibración
La construcción de las curvas de calibración se realizó mediante un enfoque de "matriz
sustituta", utilizando una matriz de orina sintética compuesta principalmente por sales, urea y
amoníaco en concentraciones fisiológicas. Se agregaron los analitos a nueve niveles de
concentración (n=9) en esta matriz para la preparación de las curvas.
Para los 20 aminoácidos (AA) con IS marcados con isótopos, las curvas de calibración se
basaron en el factor de respuesta (área de analito/área del IS). En el caso de los derivados de
aminoácidos, la calibración se realizó utilizando las áreas de pico de los analitos. Los IS
marcados químicamente relevantes demostraron ser eficaces como sustitutos en casos
específicos, como el piroglutamato, la 3-metilhistidina y la 4-hidroxiprolina.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
ANÁLISIS Y RESULTADOS
3.2.4. Precisión y exactitud
CONCLUSIÓN
El método permite la determinación rápida, precisa y exacta de 29 AA y derivados de AA en la
orina humana, lo que facilita la evaluación rápida de las alteraciones del metabolismo de los AA
para diversas aplicaciones.
Se ha demostró que el método proporciona datos para una población sana analizada como parte
de un estudio de evaluación de la ingesta diaria de AA con fines nutricionales. Las ventajas
notables del método son el potencial de alto rendimiento de la muestra debido a la sencilla
preparación de la muestra, el corto tiempo de análisis y la no necesidad de derivatización debido
a la adopción de una separación cromatográfica HILIC
