Introducción a la técnica de

PCR
 En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la
técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa ó
PCR.

 La técnica permite la amplificación enzimática in

vitro de una única o de pocas secuencias
específicas de ADN generando millones de copias.

 Mullis recibió el Premio Nobel de Química en

1993 por este descubrimiento.
5´ 3´
3´ 5´

5´

5´

Ciclo 1
5´ 3´
3´ 5´

5´
5´

5´ 3´
5´
5´
3´ 5´

5´
5´

5´
5´
Ciclo 2
5´ 3´
5´
5´
3´ 5´

5´
5´

5´
5´
5´ 3´
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5´
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5´
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3´ 5´
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5´
5´

5´
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5´
5´
5´
5´
PCR - CONCEPTOS BÁSICOS

 Especificidad
Generación de un único producto de amplificación.

 Fidelidad
Número de errores que comete la ADN polimerasa durante la
copia.

 Sensibilidad
Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una
gran cantidad de copias.
PERFIL BÁSICO DE LA PCR

Los ciclos (30-35) comprenden tres etapas:

Desnaturalización

Apareamiento (annealing)

Extensión
El annealing o apareamiento de los primers con el templado depende de:
 Tiempo
 Temperatura
 Concentración de los primers
 Concentración del templado
 Longitud de los primers
 Composición de bases de los primers

Tm = Melting Temperature (temperatura de fusión)

Tm = 4(G+C) +2 (A+T)
La temperatura a la cual la mitad de los primers están apareados a la secuencia del templado rutinariamente se
calcula para oligonucleótidos de 20 bases de longitud o menos.

La temperatura de annealing esta dada por :

Ta = Tm - 5ºC a 10ºC
PRIMERS
Oligonucleótidos de cadena simple
 Tamaño 15 – 30 pares de bases
 %GC 40 -60 %.
Evitar que tengan tres G o C en fila cerca del extremo 3’para minimizar
el alineamiento no específico.
No deben contener secuencia que permitan la formación de
estructuras secundarias (hairpins) ni tampoco la formación de dímeros.
 No deben tener una diferencia mayor a 5ºC en la Tm.

Un primer debería:
 Formar duplex con el templado.
 No formar duplex con si mismo ( o entre ellos).
 No formar duplex con otra secuencia diferente al templado.
DÍMEROS DE PRIMERS
Un primer puede formar dímeros con si mismo o con el otro primer.
Estos dímeros pueden servir como substratos para la polimerasa.
HORQUILLAS (HAIRPINS)
Un primer puede complementar con si mismo formando una horquilla.
 Baja estabilidad en el 3’OH Alta estabilidad en el 3’OH
(ricos en GC)
3’ OH

5’ 3’ OH

No hay extensión hasta tanto no se hibridice todo

el primer
Comienza la extensión
(Aunque haya un apareamiento
falso comienza la síntesis)
False priming
ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES
FIDELIDAD DE LA COPIA
Las polimerasas con actividad exonucleasa 3’5’
comenten menos errores al copiar ya que pueden
Eliminar un nucleótido mal apareado (proofreading)

Taq no tiene actividad exonucleasa 3’5’

1.2 substituciones/ 10 4 bases
Pfu tiene actividad exonucleasa 3’5’
1,6 substituciones/106 bases
VELOCIDAD DE SÍNTESIS

Taq 2000 nucleótidos /minuto

Pfu 500
nucleótidos /minuto

TERMOESTABILIDAD

Vida media de las enzimas

Taq < 1 hora a 95ºC
Pfu 18- 25 horas a
95ºC
Tm = ((Number of G+C) × 4°C + (Number of A+T) × 2°C)

Tm = 81.5 + 16.6(log10(I)) + 0.41(%G+C) – (600/N)

I concentración de cationes monovalentes

N largo del primer
La Taq tiene actividad terminal transferasa que agrega
una A en el extremo 3’ (3’ overhang).

Pfu carece de esta actividad por lo cual produce extremos

romos (blunt end).
REACTIVOS UTILIZADOS EN LA PCR
 ADN a amplificar: MOLDE o TEMPLADO

 Iniciadores de reacción :PRIMERS

 Deoxinucléotidos :
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

 ADN polimerasa

 Mg++
TEMPLADO
 ADN Simple o Doble Cadena (de sangre, de tejidos, de organismos infecciosos, etc.)

 ARN  ADNc por la transcriptasa reversa

 ADN Plasmídico

 Amplicones

 Las impurezas deben estar diluídas para que no inhiban la PCR

 Las moléculas deben estar intactas para ser amplificadas.
DEOXINUCLEÓTIDOS

 (dNTPs), dATP, dCTP, dGTP, DTTP

 Igual concentración de los 4 nucleótidos

 Concentración óptima entre 10 y 15 micromolar.

 Si la concentración es más alta la fidelidad del proceso será

adversamente afectada, ya que conduce a la ADN polimerasa Taq
a incorporar en forma errónea a una tasa mayor que la normal.

 Mientras que si la concertación es baja afectará la eficiencia de la

PCR.
Mg2+
La concentración de Mg2+ afecta la:
 Unión del primer

 Especificidad del producto

 Actividad de la enzima

 Formación de dímeros de primer

Debe ensayarse la concentración de Mg2+ para cada sistema

Concentración Mg2+

Ausencia de Producto

Amplificación inespecífica
Disminuye fidelidad Taq
KCl

 Concentraciones pequeñas de KCl incrementan la actividad de la ADN Polimerasa en

un 50-60%.

 El nivel óptimo es de 50 mM KCl

 Puede ayudar en el alineamiento primer – templado, aunque en altas

concentraciones esto puede ir demasiado lejos y puede llevar a productos anómalos
a través de la estabilización de cebadores mal apareados a targets no específicos.

CONCENTRACIÓN DE ENZIMA TAQ

 Un exceso de enzima puede provocar artefactos asociados con la actividad
exonucleasa 5′3′ de la enzima.
 Esto provoca bandas chorreadas (smeared bands).

 Óptimo 1–1.25 unidades de Taq.

 ¿Cuántos ciclos usamos?
• El incremento del número de ciclos por encima de ~35 tiene poco
efecto.
¿Cuánto templado necesito?
Si quiero amplificar una secuencia de ADN de 1Kb que esta dentro de un plásmido de 4 KB tengo que la secuencia
blanco 25% del total de ADN.

Si quiero amplificar una secuencia de 1Kb de ADN genómico humano (3.3 × 109 pb), el porcentaje del ADN blanco es
0.00003%.

Regla Usar poco ADN plasmídico

general Usar mucho menos producto de PCR (reamplificación)
Usar más ADN genómico

Poco ADN  Baja producción

Mucho ADN  Amplificación inespecífica

Ideal
Comenzar con 104 copias de la secuencia blanco
Manteniendo la concentración de ADN en la reacción en ≤10ng/μl.

1μg de ADN genómico E coli = 2 × 108 moléculas

1μg de ADN genómico Humano = 3.04 × 105 moléculas
SISTEMA
High specificity in PCR is favored by:

 Optimal concentration of Mg2+, other ions, primers,

dNTPs and DNA polymerase
 Efficient denaturation, high annealing temperatures
and fast ramping rates
 Touchdown PCR;
 Hot-start PCR
 booster PCR
 Limiting the number of cycles and their length
 Thermal cycler efficiency
 PCR additives
 Template quality
¿ ADNc o ADN genómico?
ADNc
Ventajas
No hay intrones
Conocemos la longitud del producto
Desventajas
Difícil de obtener (ARNm)

ADN genómico
Ventajas
Fácil de obtener
Necesario si el gen de interés no se
expresa o lo hace en muy bajas
concentraciones
Desventajas
Intrones( pueden interrumpir los
sitios del primer)
Amplificación de productos muy
largos
ADITIVOS MEJORADORES
La adición de agentes mejoradores de la PCR puede incrementar la producción de los
amplicones esperados ó disminuir la de los inespecíficos.
Betaina reduce la cantidad de energía que se requiere para separar las cadenas del ADN y
la formamida ayudaría de manera similar, interfiriendo con la formación de puentes de
hidrogeno entre las cadenas del ADN.
En algunos casos los agentes estabilizantes tales como la BSA, la gelatina o los detergentes
no iónicos pueden incrementar la estabilidad de la polimerasa y reducir la perdida de
reactivo a través de la adsorción a las paredes del tubo.
La BSA también permite superar el efecto inhibitorio de la melanina.
Los detergentes no iónicos como el Tween 20, el NP40 y Triton x 100 permiten disminuir el
efecto inhibitorio de los detergentes iónicos fuertes (Ejemplo, SDS 0,01%).

 Betaina 1M
 DMSO 1 -10 %
 Formamida 1-10%
 BSA 0,1 mg/ml
 Gelatina 0,1 .- 1%
 Detergentes no iónicos >0- 0,5 %
 Glicerol 5 -20 %
 Polietilenglicol 5- 15%
 Cloruro de Amonio tetrametilo 60 mM
Compounds that have been added to PCR reactions include:
 dimethyl sulfoxide (DMSO), up to 10%
 formamide at 5%
 trimethylammonium chloride 10–100 μM
 betaine (N,N,N-trimethylglycine) 1–1.3 M
 nonionic detergents such as Tween® 20 at 0.1–2.5%
 polyethylene glycol 6000 (PEG) 5–15%
 glycerol 10–15%
 single-stranded DNA binding proteins such as Gene
32 protein
 (Amersham Pharmacia Biotech) added to 1 nM or
E. coli single-stranded DNA binding protein at 5μM
 7 deaza-dGTP to reduce the strength of G–C base
pairs; it is used at 150 μM with 50 μM dGTP as the
G nucleotide mix
Los compuestos que se han agregado a las reacciones de PCR
incluyen:

dimetilsulfóxido (DMSO), hasta 10% (8);

Taq Extender™ (Stratagene) aumenta la capacidad de extensión del ADN

de la polimerasa de ADN Taq,

Perfect Match® PCR Enhancer (Stratagene) aparentemente desestabiliza

los complejos templado/primer cuando varios desajustes cerca del
extremo 3´.

Solución Q (Qiagen) modifica el comportamiento de fusión del ADN

molde, se usa en una concentración.
 DMSO
Disrupts base pairing and is usually added
to 5–10% (v/v).

 Betaine (~1 M)
equalizes contributions of GC and AT base pairs towards duplex
stability. It is advisable to adjust the denaturation, annealing and
extensions temperatures down by perhaps 2°C when using betaine to
adjust conditions for the weakening of the duplex bonding
interactions and enzyme stability.

In an interesting study undertaken by Promega they used NMR to

analyse the constitutents of two commercially available PCR enhancer
solutions and discovered that they were solutions of betaine (see
[Link]
_core.pdf).
Since Mg2+ has a stabilizing effect similar to K+, the recommended MgCl2 concentrations are generally
lower when using a KCl buffer (1.5 ± 0.25 mM) but higher with an (NH4)2SO4 buffer (2.0 ± 0.5 mM). Due to
antagonistic effects of NH 4+ and Mg2+, buffers with (NH )4 SO
2 4offer higher primer specificity over a
broad range of Mg concentrations (Figure 9). It is important to follow buffer recommendations by the
2+

enzyme’s supplier, since the optimal PCR buffer is dependent upon the DNA polymerase used.
[Link] component-
[Link]
[Link] component-
[Link]
HOT START
HOT START
HOT START
CONTROLES
SIEMPRE SE DEBEN INCLUIR CONTROLES

CONTROL NEGATIVO: preferentemente una muestra

que sepamos negativa y que recibió igual protocolo de
extracción de ADN. (en el peor de los casos agua). Para
testear la aparición de falsos positivos.
CONTROL POSITIVO: para saber si todos los
componentes de la mix funcionan.
CONTROLES DE INHIBICIÓN: volver a probar las
muestras negativas incluyendo en ellas amplicones
controles o realizando PCR a partir de diluciones
seriadas de las muestras negativas.
INHIBIDORES
OLIGOS DEGENERADOS – USO DE INOSINA
INOSINA

Los primers degenerados son usados para amplificar regiones donde

solo la secuencia proteica es conocida o cuando se busca amplificar
genes similares de diferentes especies

La inosina es capaz de aparearse con cualquier nucleótido.

Sin embargo no se aparea con todos los nucleótidos con igual afinidad
(I-C > I-A > I-T~I-G).
2’ deoxi inosina