DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
POR EL MÉTODO DE KJELDAHL
INTRODUCCIÓN
El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido
proteico total de los alimentos, aunque dicho contenido esté
conformado por una mezcla compleja de proteínas. Actualmente
todos los métodos para determinar el contenido proteico total de los
alimentos son de naturaleza empírica.
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el proceso
básico del conocido método actual de análisis de proteínas por el
método Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico.
En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes
orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en
presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total es convertido
en sulfato de amonio.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD A
CONSIDERAR PARA ESTE PROCEDIMENTO
Siempre utiliza bata.
Zapato cerrado en caso de un derrame de ácido ya que los
que se utilizan son muy corrosivos .
Utilizar una careta de acríloco para proteger ojos y cara
para evitar algún contacto del ácido con los ojos y/o boca.
Utilizar un cubrebocas para evitar ingerir directamente los
gases que se producen durante la digestión.
Utilizar guantes térmicos para evitar una quemadura al
momento de girar el matraz.
FUNDAMENTO
Se caracteriza por el uso de ebullición de ácido sulfúrico
concentrado que efectúa la destrucción oxidativa de la
materia orgánica de la muestra y la reducción del
nitrógeno orgánico a amoníaco, el amonio es retenido
como bisulfato de amonio y puede ser
determinado mediante una destilación alcalina y
titulación.
a) Ácido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el
exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en
presencia de rojo de metilo.
b) Ácido bórico formándose borato de amonio el que se
valora con ácido clorhídrico.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL
Aplicable a todo tipo de alimentos.
Método simple.
Preciso.
Es el método eficaz y confiable para medir
el contenido de proteína cruda.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
Mide el nitrógeno orgánico total, no sólo el
nitrógeno proteico.
Pérdida de nitrógeno durante la digestión.
Consume mucho tiempo (al menos 2 horas para
completarse).
Uso de reactivos corrosivos y altamente tóxicos.
DIFICULTADES QUÍMICAS Y PRÁCTICAS
Digestión prolongada.
Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoníaco.
Espumosidad excesiva.
Acción corrosiva de ácido sulfúrico sobre el sistema de
extracción de humos.
Consideraciones ambientales respecto a descarga de
humos y contaminación de aguas con catalizadores
metálicos.
PROCEDIMIENTO
1.- Pese exactamente aproximadamente 0.15g de la muestra analizar (previamente
secada) en un matraz de micro-Kjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las
parédes o al cuello del matraz.
2.- Añada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullición y aproximadamente 1.0 g de
mezcla catalizadora.
3.- Someta a digestión la muestra en el aparato de micro Kjeldahl bajo una campana
de extracción, con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y
aumentando el calor a medida que procede la digestión, rotando los matraces de vez
en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestión terminará
cuando el color de la muestra sea azúl-verde claro. El proceso tomará
aproximadamente 90 minutos.
4.- Enfríe el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al solidificarse
la muestra.
5.- Añada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida. Mezcle y
permítale enfriarse.
DESTILACIÓN
6.- Encienda la unidad destiladora.
7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilación a aproximadamente 5
ml. por minuto
8.- Abra la llave del agua para tener H2O circulando por el refrigerante
todo el tiempo.
9.- Añada la muestra a la cámara de ebullición por medio de un embudo
(para recuperar las perlas de ebullición) y enjuague el matraz con
aproximadamente 5ml. de H2O destilada.
10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de ácido bórico y 2 gotas de
indicador bajo la salida de destilación.
11.- Añada aproximadamente 10 ml. de la solución de NaOH a la
cámara de ebullición LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornará
oscura (azúl-gris o café oscuro). Si no cambia de color añada más
NaOH.
12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El
destilado estará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz
receptor.
14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora
enjuagando la cámara de ebullición varias veces con agua destilada.
Cada vez que se añada agua destilada hasta llenar la copita superior de
la unidad destiladora para el enjuague deje que ésta hierva primero.
Luego abra la llave de la parte que permite salir las muestras hacia fuera
de la unidad destiladora. Una vez vacía la parte en donde se procesa la
muestra asegúrese de que esté bien vacía. Si queda todavía un poco de
agua en el fondo permita que hierva para que se vaya toda hacia esa
segunda parte de la unidad destiladora. El matraz estará listo para
recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la unidad
destiladora. Esta operación se repite al menos unas 4 veces.
TITULACIÓN
15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta
indica el punto final de la titulación. Compárese este color
con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado
corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de
N en la muestra original. El peso del N en mg está dado
por miliequivalentes del ácido X 14 (el peso equivalente del
N).
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
% N = NHCl x Volumen de ácido corregido x 14 g N x 100
g de muestra mol
En donde:
NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.
Volumen del ácido corregido = (ml. del ácido estandarizado para la
muestra) (ml. de ácido estandarizado para el blanco).
14 = Peso atómico del nitrógeno.
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de
proteína cruda. El porcentaje de N en proteína para el harina de
trigo es de 18% y su factor de conversión es de 5.70.
