Realizado por:
Cristina del Rocío Arellano
Tiaguaro
PCR:
PRUEBA DE
REACCIÓN EN
CADENA DE LA Curso: 2-1
POLIMERASA
Introducción
En 1986, Kary Mullis
desarrolló un método de
laboratorio que permite
multiplicar enormemente
el número de moléculas
de ADN de una muestra
desconocida.
PCR
• Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
• Técnica que amplifi ca fragmentos específi cos de moléculas de ADN,
mediante la acción de la enzima Taq Polimerasa.
• Se vale del proceso de Replicación del ADN
Características
• Sintetizar dos fragmentos cortos de ADN complementarios al comienzo
(Primer Forward Fw) y al fi nal (Primer reverse Rv) de la secuencia específi ca
para delimitar la región.
• Repetición cíclica de tres reacciones sucesivas: Desnaturalización,
Hibridación y Polimerización.
• Diferentes tipos de técnicas: PCR Convencional, RT-PCR, qPCR o PCR en
tiempo real y RT-qPCR
• Requiere de un Termociclador que regule la temperatura en cada ciclo.
Etapas del
Proceso
01
1. Desnaturalización
El ADN se calienta a una alta
temperatura (94° – 98°C) de modo
que se rompen los puentes de
Hidrógeno y se separan las dos
hebras. Mientras mayor sea el
contenido de GC mayor debe ser la
temperatura, y mientras mayor sea
el largo de la cadena molde, mayor
debe ser el tiempo de
desnaturalización.
• 94°: máxima temperatura que la
mayoría de enzimas pueden
soportar sin que pierdan su
actividad.
• 30 a 45 segundos.
2. Hibridación o Annealing
La temperatura disminuye
(42° - 78°C) para que las
hebras se enfríen y los
Primers se unan de manera
específi ca a las regiones de
la secuencia deseada.
• Para calcular la
temperatura óptima de
fusión (Tm) de los
Primers se utiliza la
Tmfórmula:
= ((A + T) x 2) + ((C +
G) x 4)
3. Polimerización
La Taq Polimerasa cataliza la síntesis simultánea de las dos cadenas a partir
de cada fragmento que actúa como Primer.
• Temperatura aproximadamente de 68° a 72°C para obtener una actividad
enzimática óptima, y se calcula 1 minuto por cada 1000 pb a amplifi car.
3. Polimerización
• El ciclo se repite
múltiples veces (20 –
30) hasta alcanzar
una cantidad
signifi cativa de
amplicones.
• En cada ciclo, hay
más copias moldes
disponibles,
alcanzando una
amplifi cación
exponencial (34000
millones de copias)
Tipos de
PCR
Inverso, Colonia, Hot Start, Multiplex, In
situ Anidado, Largo, Touchdown,
Transcriptasa reversa (RT-PCR), Band-
stab, Degenerado, Anclado, Ligado-
anclado, Asimétrico, RT-PCR diff erential
02
display, Tiempo real.
[Link] Convencional
Procedimiento regular a las 3
etapas.
Técnica que amplifi ca
segmentos especifi co de ADN
en un determinado laboratorio.
• Se emplea para la detección
cualitativa de la presencia o
ausencia de secuencias
específi cas, después de una
amplifi cación, utilizando
métodos como
electroforesis.
2. RT - PCR
Parte de una muestra de ARN,
por lo que la
Retrotranscriptasa viral MML V-
RT (Moloney Murine Leukemia
Virus) forma un ADNc. Esta
enzima tiene un único
polipéptido con actividad de
ADN Polimerasa dependiente
de ARN y ADN.
• Principales usos:
Diagnóstico molecular
(estudio de genomas de
virus) e investigación
científi ca.
3. PCR en tiempo real / PCR-Cuantitativo /
qPCR
• Permite la cuantifi cación
precisa de la cantidad inicial
de ADN y brinda información
cuantitativa sobre la carga
del material genético.
• La ventaja es que se puede
analizar las curvas de
amplifi cación solo en la fase
exponencial de la reacción.
3. PCR en tiempo real / PCR-Cuantitativo /
qPCR
Emplea ADN molde, Primers específi cos, dNTPs, Buff er de reacción y
Taq Polimerasa en una mezcla, a la que se le adiciona una sustancia
marcada con un fl uoróforo que mida la tasa de generación de 1 o más
productos, y se utiliza un termociclador con sistema de detección.
3. PCR en tiempo real / PCR-Cuantitativo /
qPCR
Para constatar que un único
producto fue amplifi cado se
puede realizar:
• Electroforesis en gel de
agarosa
• Curva de Melting: Se genera
excitando las etiquetas de
fl uorescencia y cuantifi cando
la respuesta mediante la
aplicación de un algoritmo
de software para generar
una curva cuya forma es
diagnóstica.
4. RT-qPCR (PCR – Cuantitativo utilizando la
Retrotranscriptasa)
• Utiliza dos técnicas
moleculares (PCR Y
Retrotranscriptasa) para
poder cuantifi car la
expresión génica, midiendo
la cantidad de una molécula
(ARNm).
• Convierte primero el ARN en
ADNc (cadena
complementaria de ADN) y
luego cuantifi ca la cantidad
durante la PCR en tiempo
real.
4. RT-qPCR (PCR – Cuantitativo utilizando la
Retrotranscriptasa)
En el campo de la investigación, se
utiliza para mediciones
cuantitativas de la transcripción y
expresión génica, determinando
cómo cambia la expresión de un
gen a lo largo del tiempo o en
determinadas condiciones.
• Detección de organismos
genéticamente modifi cados.
• Diagnóstico de enfermedades
infecciones virales (COVID,
Muestras de hisopados)
5. PCR Multiplex
Permite la amplifi cación
simultánea de múltiples
secuencias de ADN en una sola
reacción.
• Por ejemplo: en un paciente
infectado con múltiples
bacterias, se puede
determinar con una sola
reacción la presencia del
material genético, por la
intervención de diversas
variantes de ADN con su
propio Primer, que, al
exponerlo a Electroforesis,
muestra su afi nidad con cada
Factores que afectan la eficiencia
y especificidad de la PCR:
03
PRIMERS POLIMERASA
Típicamente sintetizados como Debe ser termorresistente, por
oligonucleótidos de 15 – 24 pb, ello se usa la Taq Polimerasa,
se recomienda cerciorarse, proveniente de la bacteria
mediante una búsqueda en la Thermus aquaticus, y durante
base de datos apropiadas, de la extensión, sintetiza nuevas
que los Primers de interés no cadenas de ADNc.
amplifi can otra secuencia no
deseada.
CATIONES MG2+
DIVALENTES
Todas las ADN Polimerasas El Mg2+ es esencial en la
termoestables requieren de estabilización de los dNTPs,
cationes divalentes para su infl uye en la estabilidad de la
actividad: Magnesio (en unión entre cebadores y
mayores cantidades) y estabiliza la estructura de la
Manganeso. doble hélice de ADN, facilitando
la desnaturalización.
BUFFER DE DNTPS
REACCIÓN 10X Bloques de construcción,
representan cada uno de los cuatro
Proporciona condiciones
nucleótidos presentes en el ADN (A,
óptimas para la actividad de la
T, C, G) que agrega la Polimerasa.
Taq Polimerasa.
La solución madre de dNTPs debe
ser guardada a -20°C en pequeñas
alícuotas para evitar repetidos
ciclos de congelado-descongelado.
ADN MOLDE O OTRAS
BLANCO (TARGET) CONDICIONES
Preparación de la reacción
(pipeteo), calidad del templado
Es de donde se obtienen las
(presencia de otros organismos
nuevas secuencias de ADN
dentro de las muestras),
presencia de inhibidores
(proteínas) y tamaño del
amplicon (a menos tamaño,
mayor efi ciencia)
Fidelidad de la PCR
04
Fidelidad en PCR
Es una PCR que posee una baja tasa de errores y da como resultado un alto
grado de precisión en la replicación del ADN de interés.
Suele requerirse cuando el resultado del experimento depende de la
secuencia de ADN correcta, como en trabajos de clonación, subclonación del
ADN para la expresión de proteínas y aplicaciones de secuenciación de nueva
generación.
Una mayor fi delidad se puede conseguir de diversas formas:
• Ajustando el pH de la mezcla de la reacción a la enzima con la que se va a
trabajar.
• Ajustando la concentración de Mg2+.
• Utilizando ADN Polimerasas termoestables con actividad correctora
(Polimerasas de Alta Fidelidad)
Fidelidad en PCR
Fidelidad de una Polimerasa
Capacidad de insertar la base
correcta durante la PCR, implicando
subetapas como:
• Lectura de una cadena molde.
• Selección del nucleósido trifosfato
apropiado.
• Inserción del nucleótido correcto
en el extremo 3’ del cebador.
Las ADN Polimerasas que se utilizan
en PCR de alta fi delidad poseen una
actividad de exonucleasa 3’- 5’,
suprime los nucleótidos incorporados
incorrectamente y los reemplaza con
el correcto.
Fidelidad de una Polimerasa
• La DNA polimerasa Gloria
Nova HS es una enzima
ingenierizada con una
estructura única, que ofrece
una alta fi delidad y
velocidad de extensión.
• Su característica de inicio en
caliente mediado por
anticuerpos evita
amplifi caciones no
específi cas.
Sensibilidad, muestras y restricciones
de la PCR
05
Sensibilidad de la PCR
Debido a la amplifi cación
exponencial, la PCR es una
técnica muy sensible, que
permite detectar secuencias
que se encuentran
mínimamente representadas en
una muestra.
• Por ejemplo: es muy útil en
el diagnóstico del ADN,
comprobando la presencia
de un gen o mutación en un
gen específi co.
Muestras de la PCR
Los métodos más comunes son:
• Prueba de sangre: el
profesional de la salud toma
una muestra de sangre de
una vena de un brazo con
una aguja pequeña y la
coloca en un tubo de ensayo
o frasco.
• Hisopado nasal: se toma una
muestra de las narinas
anteriores, también hay
hisopado de cornete medio y
de la nasofaringe, la parte
más alta de la nariz y la
garganta.
Restricciones de la PCR
• Origen de la muestra: si se
quiere determinar Infl uenza,
el lugar apropiado para sacar
la muestra sería la garganta,
más no otros lugares.
• Tipo de muestra: en hisopados
suele contaminarse la muestra
por el moco acumulado,
impidiendo que se analice el
tejido correctamente.
• Medidas de bioseguridad
adecuadas.
• Accesibilidad (costo)
Optimización de la PCR
06
• Las pruebas PCR no son inmunes al
error: los fallos pueden dar lugar a
una sensibilidad o especifi cidad
defi cientes.
• La calidad y pureza de las
muestras es un factor clave, los
fallos pueden requerir tiempo y ser
costosos.
Comprobaciones de rendimiento:
01 Realizar el control de calidad durante
la recogida, transporte y preparación.
02 Utilizar el etiquetado correcto y
códigos de barras legibles al clasificar
las muestras.
03 Asegurarse de que el ADN/ARN son de
la más alta calidad, los reactivos están
bien formulados y los cebadores y
sondas correctamente diseñados.
04 Evitar la contaminación, minimizando
las tareas manuales con
automatización integral.
Aplicaciones de la PCR
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ESTUDIOS DE AISLAMIENTO Y
EVOLUCIÓN CLONADO DE
GENES
Investigación
Forense Diagnóstico de
infecciones como
el COVID.
DIAGNÓSTICO ESTUDIOS DE
DE IDENTIDAD Y
ENFERMEDADE FILIACIÓN
S
HEREDITARIAS
Y CÁNCER Identificación de
huellas genéticas.
PRUEBAS DE
PATERNIDAD
Muchas
GRACIAS
