PCR-R FL P
ROJAS GAMEZ KEVIN LEOBARDO.
F R I D A A R VA L LO F E R N A N D A
BREVE INTRODUCCIÓN.
• Polimorfismo de fragmentos de
restricción.
• Es una técnica que explota variaciones
en secuencias de ADN homologas.
• Esto se usa para distinguir individuos,
poblaciones o especies.
FUNDAMENTO.
• Esta basada en la digestión del ADN mediante las enzimas de restricción.
• RFLP son causados por rearreglos del ADN (reinserciones) de nucleótidos o
secuencias únicos esto significa ganancia o perdida de sitios de restricción.
• Esto se puede detectar por diferencias en el peso molecular de los
fragmentos homólogos de restricción del ADN genómico (cuando se hibrida
con la sonda seleccionada).
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
• Son enzimas que dividen en fragmentos el ADN en sitios de restricción.
• Se clasifican en 5 tipos (I,II,III,IV, V).
• Son una clase de endonucleasas.
• En laboratorios su uso principal es la clonación molecular donde son vitales.
EN CUESTIÓN DE
PROCEDIMIENTO.
• Es una técnica de PCR seguida de la digestión por enzimas de restricción.
• Se basa en detectar fragmentos de ADN de distinto peso molecular o de longitudes
diferentes.
• Se hace de forma que al utilizar análisis de los polimorfismos en el tamaño de los
fragmentos de restricción se puede determinar la presencia de la mutación.
METODOLOGÍ
A.
• Se realiza primero la amplificación por PCR.
• Se realiza la digestión del producto
amplificado con enzimas de restricción.
• Electroforesis en gel.
• Transferencia e hibridación con sondas
especificas(situacional).
METODOLOGÍA.
• Se digiere el ADN con una enzima de restricción.
• Los fragmentos resultados son separados mediante electroforesis en geles de agarosa.
• Se transfiere a una membrana de nylon por capilaridad.
• La membrana se hibrida con una sonda (radioactiva o no) y el producto resultante se observa
con una autoradiografía de rayos x ( acorde a pm de la banda).
SONDA DE
HIBRIDACIÓN.
• Es un fragmento de ADN o ARN
(15-10000 nucleótidos).
• Detección de nucleótidos o
secuencias en el ADN o ARN
analizado complementarias a la
secuencia de la sonda misma.
• Primero se desnaturaliza (calor,
NaOH) y después se hibrida con el
DNA objetivo.
• Para detectar la hibridación se
marca la sonda con un marcador
molecular (mol radioactivas o
fluorescentes).
UTILIDADES Y USOS.
• Actualmente esta obsoleta por la aparición de nuevas técnicas de secuenciación de
ADN.
• Entre sus usos anteriores esta el mapeo de genoma, determinación de riesgo de
enfermedad, estudio de enfermedades genéticas, pruebas de paternidad o estudio
de flujo de genes en poblaciones.
• Los usos actuales son principalmente selección asistida por marcadores e
investigación.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS.
Método. Ventajas. Contras. Solución a las
desventajas
PCR-RFLP • Presencia ilimitada de ellos. • Clonación de las sondas. el desarrollo de la técnica no
• No presentan efectos pleiotrópicos. • Detección de RFLP en radioactiva simplifica bastante
• No son afectados por el medio ambiente. membrana. este método.
• Uso de radioactividad.
• Requiere ADN de buena Utilizar otras alternativas en
calidad. caso de ser mucho mas
• Hacen que sea muy idóneos.
laborioso, lento y costoso.
PCR-RAPD • Rapidez en la obtención de resultados. • Inconsistencia de los datos. Se puede manejar con un alto
• Costo. • Pequeñas alteraciones en grado de estandarización de
• No uso de radioactividad. parámetros de las condiciones de reacción y
• Menor inversión en equipos. amplificación dan amplificación.
• Cantidad reducida de ADN requerido resultados diferentes.
• Resultados difíciles de
interpretar.
REFERENCIAS.
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Muchas gracias por su
atención.
