MICROSCOPIA
DRA. ROSSANA LÓPEZ RODAS
• El estudio detallado de los componentes de células y tejidos requiere el
uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces más la imagen
de las estructuras que los constituyen.
• Para poder observarlos se utiliza un instrumento llamado
MICROSCOPIO
• El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas:
mikrós: significa pequeño
skopéoo: significa observar.
• Se invento hacia 1610 por Galileo según los italianos o
por Jansen según los Holandeses
• La “accademia de Linceii” a la cual pertenecía
Galileo, publicó un trabajo sobre observación
microscópica de una abeja
• Las primeras publicaciones importantes aparecen en
1660-1665 cuando Malpighi observa capilares
sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia
• Antony Van Leenwenhoek en el siglo XVII utilizo microscopios
simples de fabricación propia y describió por primera vez
Protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos
• Este microscopio alcanzaba 260 aumentos
• Ernst abbe en 1877 su teoría del microscopio
• Carl Zeiss mejoró la microscopia de inmersión sustituyendo el
agua por aceite de cedro, lo que permitió obtener 2000
aumentos
ESQUEMA DEL MICROSCOPIO
• Tubo cilíndrico que aloja el sistema óptico ocular/objetivo
• Platina que permite observar las preparaciones que son
iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre
el objeto a estudiar
• Existen dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de
energía para formar imágenes aumentadas y detalladas de objetos que a
simple vista no es posible observar:
• a)Microscopio Óptico simple o lupa
• b)Microscopio Óptico compuesto.
• El microscopio simple o lupa consiste en la utilización de una o más lentes
convergentes en un solo sistema óptico.
• Dependiendo de la curvatura de la superficie de la(s) lente(s), las lupas
pueden ampliar las imágenes de los objetos desde 5, 8,10, 12, 20 y hasta
50 veces.
• Forman una imagen de mayor tamaño, derecha y virtual
• Los microscopios fotónicos compuestos Tienen sus antecesores en los
instrumentos ópticos desarrollados en el periodo comprendido entre 1590 y
1610, por Hans (padre) y Zacarías (hijo) Janssen.
• Se denominan compuestos porque la imagen se forma mediante la
utilización de tres sistemas de lentes, cada uno de ellos constituidos por
lentes convergentes y divergentes.
• Los sistemas de lentes son:
El condensador
Los objetivos
Los oculares.
Componentes del microscopio Optico
• El microscopio Óptico compuesto esta integrado por tres tipos de
componentes:
a) COMPONENTES MECÁNICOS: Son aquellos que sirven de
sostén, movimiento y sujeción de los sistemas ópticos y de
iluminación así como de los objetos que se van a observar.
1. Base o pié. Es un soporte metálico, amplio y sólido en donde se apoyan y
sostienen los otros componentes del microscopio.
2. Brazo, estativo o columna. Permite la sujeción y traslado del microscopio.
Soporta al tubo óptico, a la platina y el revolver.
3. Platina. Superficie plana de posición horizontal que posee una perforación
circular central.
En ella se apoya la preparación (lámina porta objetos que contiene la
muestra que se va a examinar) que se sujeta a la platina mediante pinzaso
con un carrito o charriot que mediante mandos especiales facilitan el
movimiento de la preparación de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás
4. Tubo óptico. Consiste en un cilindro metálico que suele medir 160mm o 170
mm de longitud el cual en un extremo, está conectado al revolver o portaobjetivos
y en el otro se relaciona con el (los) ocular(es).
5. Revolver o portaobjetivos. Es un componente que gira alrededor de un eje con
la finalidad que los objetivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con
la perforación central de la platina. En su superficie inferior posee varios agujeros
donde se atornillan los objetivos.
6.Tornillos macrométrico y micrométrico. Situados en la parte inferior del brazo
o columna. Pueden estar separados o el tornillo micrométrico está
incorporado en la circunferencia del tornillo macrométrico (microscopios
actuales).
Ambos tornillos permiten el desplazamiento de la platina hacia arriba y hacia
abajo con la finalidad de acercar o alejar la preparación hacia los objetivos y
así conseguir un enfoque óptimo de la imagen
El macrométrico produce desplazamientos evidentes y rápidos de la platina,
en cambio el tornillo micrométrico produce movimientos imperceptibles de la
platina y sirve para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen.
7. Engranajes y cremallera. Constituyen mecanismos de desplazamientos
de las diferentes partes del microscopio.
8. Cabezal. Componente situado en relación con el tubo del microscopio
que alberga principalmente prismas o espejos que sirven para acondicionar
en él dos o más oculares, o sistemas mecánicos que soportan cámaras
fotográficas, de vídeo o sistemas de proyección de la imagen.
b) COMPONENTES ÓPTICOS: Son los objetivos, los oculares, el
condensador y los prismas.
Los tres primeros están constituidos por sistemas de lentes positivos y
negativos.
1. Condensador: Es el componente óptico que tiene como función principal
concentrar y regular los rayos luminosos que provienen de la fuente
luminosa.
Está formado por una o dos lentes convergentes que reúnen los rayos
luminosos y los orientan hacia la abertura central de la platina.
También tiene incorporado un diafragma iris que regula la entrada de luz, todo
ello con la finalidad de concentrar la mayor cantidad de rayos luminosos en el
plano donde está situado el objeto a observar.
2. Objetivos. Están considerados los elementos más importantes en la
formación de la imagen microscópica.
Estos sistemas de lentes establecen la calidad de la imagen en cuanto a su
nitidez y la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma (poder
de resolución).
Están constituidos también por un juego de lentes, convergente y divergente,
para eliminar, en la medida de lo posible, una serie de aberraciones que
afectarían la calidad de las imágenes formadas.
• Las lentes en su exterior cuentan con una serie de anotaciones
numéricas que indican
• El aumento propio del objetivo,
• La apertura numérica
• El tipo de material con que están tallados las lentes (de
fluorita o semiapocromáticos)
• La calidad que tendrán las imágenes,
• Algunas aberraciones de las lentes (acromáticos,
apocromáticos, aplanáticos etc.)
• Si se debe usar alguna sustancia de inmersión.
• Los objetivos también se clasifican de acuerdo al medio que existe entre el
objeto examinado y la lente frontal del objetivo.
• De acuerdo a esta característica son secos o de inmersión.
• Son objetivos secos aquellos que entre el objeto observado y el objetivo
solamente existe el aire
• Son Objetivos de inmersión son los que requieren que entre la preparación
y la lente frontal del objetivo se coloque una sustancia líquida, ésta puede
ser agua, glicerina o un “aceite de inmersión”, natural como el “aceite de
cedro” o aceites artificiales.
•
• Otra clasificación de los objetivos se refiere al tipo de corrección al que
deben someterse las lentes con la finalidad de disminuir o anular algunas
aberraciones que se producen en los lentes.
• Dependiendo de las aberraciones corregidas los objetivos pueden ser:
Acromáticos. Estos objetivos corrigen los rayos luminosos azules y rojos
haciéndolos coincidir en un solo plano focal.
Los objetivos de los microscopios “de estudiante” son acromáticos.
Semiapocromáticos. Se les conoce también como objetivos de “fluorita”,
corrigen el espectro secundario dando como resultado imágenes de bordes
más nítidos.
Se les considera como los objetivos ideales para microscopía de
fluorescencia.
Apocromáticos: En estos objetivos se hacen coincidir en un solo plano
los rayos luminosos azules, rojos y verdes, obteniendo así una imagen de
bordes sumamente nítidos
• La corrección de esta aberración trae consigo la acentuación de otra.
(Enfoque en la zona central del campo microscópico y desenfoque de la
zona periférica y viceversa)
Planapocromáticos. Son los objetivos en los cuales se han corregido la
mayor cantidad de aberraciones como la cromática, curvatura de campo,
de esfericidad y de astigmatismo.
Se obtienen imágenes sumamente nítidas y el campo microscópico aparece
totalmente plano, enfocado en toda su extensión
• Los lentes tienen dos propiedades fundamentales
• Distancia focal
• Apertura angular
a) Distancia Focal: Distancia entre el punto medio de la lente y el punto
focal en el que convergen los rayos que atraviesan la lente
b) Apertura numérica (angular): La apertura numérica se define como la medida de la
capacidad para colectar la luz y poder examinar los detalles del espécimen
• Los objetivos con una apertura numérica baja tienen un cono de entrada de luz más
pequeño que los objetivos con una apertura numérica alta.
• Está directamente relacionada con la resolución obtenida por el objetivo.
Apertura numérica Baja Apertura numérica alta
Aumento de un objetivo. Es la capacidad que posee un objetivo de ampliar la
imagen del objeto observado.
Se define como la relación entre el tamaño de la imagen y el objeto, en valores
lineales (largo y ancho).
Un objetivo que tiene grabado en la camiseta la cifra 10x aumentará 10 veces
el tamaño de la imagen del objeto examinado.
• Poder de resolución. Se define así la capacidad de un objetivo de poder
distinguir la distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto
para que se puedan visualizar como dos puntos separados. La calidad de
una imagen, en la que se observe la claridad, nitidez y la riqueza de detalles,
depende del poder de resolución del objetivo
El Poder de resolución depende de:
La longitud de onda
Del rayo luminoso utilizado
La apertura numérica del sistema óptico del objetivo.
3. Ocular. Es otro componente óptico del microscopio, debe su nombre porque
la imagen final se observa a través de él acercando el ojo a la lente “ocular” del
componente.
Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria
que forma el objetivo.
La imagen del ocular es de mayor tamaño, virtual y derecho.
Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces (5x, 8x, 10x,
12x) a la imagen formada por el objetivo.
No añade, por más aumentos propios que posea, ningún detalle a los
generados por el objetivo.
Por lo general, los oculares están construidos por dos lentes convergentes
(planos convexos).
La primera lente se denomina “de campo o frontal”, está situada en la
parte anterior del ocular, y es la encargada de recoger y ampliar la imagen
generada por el sistema de lentes del objetivo.
La lente posterior, en contacto estrecho con el ojo del observador, se
denomina lente “ocular” y es la responsable de aumentar nuevamente la
imagen y orientarla hacia el ojo del observador
4. PRISMAS. En los microscopios modernos monoculares o binoculares, se
requiere el empleo de prismas.
Sirven para desviar los rayos luminosos de la trayectoria rectilínea del eje
óptico del objetivo y dirigirlos hacia el tubo óptico ligeramente inclinado y luego
hacia el ocular.
• c) COMPONENTES DE ILUMINACIÓN: Se consideran dentro de este grupo
a los instrumentos que proporcionan energía luminosa al microscopio.
Las fuentes de energía luminosa son de dos tipos:
Natural
Artificial
La luz natural emitida por el sol, se obtiene de manera indirecta
mediante un espejo que posee una superficie plana y otra cóncava. El espejo
está situado en la superficie superior de la base o pie. Un mecanismo especial
permite orientarlo hacia un lugar iluminado indirectamente por el sol (una
ventana, por ejemplo) y luego dirigir el haz luminoso hacia la lente del
condensador.
• La luz artificial se genera a través de una lámpara de bajo voltaje que,
mediante un reóstato regula la emisión y la intensidad de luz.
Al igual que el espejo, este sistema de iluminación se inserta en la base o pie
del microscopio.
Aumento total del microscopio fotónico El aumento total de la imagen del
microscopio compuesto se obtiene multiplicando el aumento propio del objetivo
por el aumento propio del ocular
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
• La preparación de una muestra para estudiarla al microscopio óptico
es diferente según la naturaleza del material que ha de ser observado,
orgánico o inorgánico, y si es orgánico, según queramos observar
propiedades que sólo se manifiestan en estado vivo, o si queremos
observar morfología y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la
muerte celular.
• ESTUDIO “IN VIVO". El estudio "in vivo" se desarrolló cuando todavía no
se habían inventado la fijación.
La tinción se suelen utilizar para el estudio de protozoos y hongos.
• La observación vital se utiliza principalmente para la investigación de
los caracteres de movilidad bacteriana y morfología (en bacterias que
al secarse se alteran), agrupación y estructuras de resistencia.
• Hay diversas técnicas para la observación vital:
• a) Examen en fresco.
• b) Coloración vital
• La coloración en vivo se puede hacer de dos maneras:
• Por difusión
• Por mezcla
• ESTUDIO “IN VITRO". Consiste en la observación de células y
tejidos muertos.
Para ello se realizan una serie de pasos:
Fijación
Inclusión
Corte
Tinción
Montaje.
1. Fijación: Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más
rápidamente posible, para permitir que se mantengan las propiedades
fisiológicas y morfológicas del organismo vivo.
• La fijación evita que el tejido se pudra y se desintegre.
• 24 horas después se procederá a la inclusión.
Hay diferentes tipos de fijador:
Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).
Químicos: según la base fijadora:
alcohol metílico,
dicromato de potasio
formol 10% tamponado.
2. Inclusión: Para poder cortar la pieza, ésta debe tener una cierta
consistencia.
Para endurecerla, se sumerge en un material que llegue a todas las
estructuras celulares.
Esta debe ser una sustancia con plasticidad como la parafina o la
gelatina.
La inclusión permite conservar la muestra durante largo tiempo.
Lo más utilizado la parafina.
3. Corte: La obtención de cortes para su estudio microscópico
se realiza mediante unos aparatos llamados micrótomos.
Para cortes de células vegetales de un órgano duro se utiliza el
micrótomo de mano o de Ranvier
Para el resto de órganos vegetales y para órganos animales se utiliza el
micrótomo de rotación o de Mino
Los cortes, una vez recogidos y puestos en agua, se tiñen para evitar que se
sequen.
4. Tinción: Hay muchos tipos de tinciones, muchas de ellas específicas
para poder observar determinadas estructuras:
a) Según su origen:
Naturales: proceden de animales o de vegetales: eosina azafrán,
carmín de cochinilla
Artificiales: proceden del carbón mineral.
b) Según su naturaleza:
Ácidos: tiñen lo básico. Ejemplo: eosina
Básicos: tiñen lo ácido. Ejemplo: azul de metileno.
Neutros: tanto la parte anionica como la catiónica son colorantes.
• Existen dos tipos de técnicas de coloración:
Vitales o en vivo: el colorante no provoca la muerte celular.
Ejemplos: azul de metileno, rojo neutro.
Supravitales: los colorantes se aplican cuando el material ya ha
muerto a causa de la fijación.
• 5. Montaje: Hay varios tipos de montaje:
Gota pendiente: Se untan los bordes del cubreobjetos con vaselina
para conseguir adherencia y que no se seque la muestra, si se va a observar
durante más de una hora.
Extensión o frotis: se extiende la gota sobre el portaobjetos con
ayuda de otro portaobjetos, muy rápidamente para que no se dé
coagulación.
El líquido extendido se fija, colorea y monta de manera normal.
Se suele utilizar en el estudio de sangre y de bacterias.
Aplastamiento: es la técnica más común.
Los cortes se depositan en el portaobjetos.
Si no se quiere conservar la preparación, sólo se pone el cubreobjetos,
pero la preparación no durará más de una hora
• 6. Etiquetaje: Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren
conservar o se van a utilizar posteriormente.
En la etiqueta se pone el nombre del material, la especie, la técnica utilizada
y la fecha de realización.
