Pruebas

bioquímicas
IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA
Pruebas bioquímicas

 Consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a

partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer incorpora o no.

 Se emplean para reconocer de forma clara la presencia o

ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas o de una vía
metabólica completa en uno o más microoorganismos.
 Prueba de catalasa
 Prueba de oxidasa
 Prueba de coagulasa
 Pruebas de PYR
Prueba de catalasa

 La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de

oxígeno en agua y oxígeno

 El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos

finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se
permite que se acumule, resulta letal para la célula bacteriana.
La prueba de catalasa, permite
diferenciar:

Micrococcus o Streptococcus
Staphylococcus
Bacillus Clostridium

Corynebacterium Erysipelothrix

Se usa para diferenciar miembros de la familia Micrococaceae de la

familia Streptococaceae
Catalasa positiva: si hay
presencia de burbujas o
efervescencia
Prueba de oxidasa

 Son un grupo de enzimas, Glucosa-oxidasa

que pertenecen a la
categoría de las oxido
reductasas, llevan a cabo
reacciones redox, utilizan al
oxígeno como el aceptor de Monoamino-oxidasa
electrones; este es reducido
a H2O y H2O2. Su función es
conservar la energía
generando un gradiente de
protones para producir ATP.
Citocromo-oxidasa
 El sistema citocromo, se encuentra en los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos, de modo que la prueba de la
oxidasa es importante para identificar aquellos microorganismos
que carecen de esta enzima (anaerobios obligados)
Prueba de la coagulasa

 Es una enzima producida por

Staphylococcus aureus, permite la
conversión de fibrinógeno en
fibrina. Es relativamente estable al
calor.
 La coagulasa puede unirse al
fibrinógeno y convertirlo en fibrina
insoluble, la cual tiende a formar
depósitos, en la zona donde se
agrega.
Prueba PYR
CULTIVO DIFERENCIAL

TSI LIA MIO

CITRATO
SIM DE KIA
SIMONS

CALDO
UREA
Prueba de Citrato

 Sirve para determinar si

un organismo es capaz de
utilizar citrato como única
fuente de carbono y
compuestos amoniacales
como única fuente de
nitrógeno en su
metabolismo, provocando
una alcalinización del
medio.
 AGAR
Microorganismos Técnica
CITRATO DE SIMMONS

• Enterobacter, • Contiene citrato de • Un tubo con medio

• Klebsiella sodio y fosfato de agar citrato Simmons
• Serratia amonio como fuentes y un cultivo bacteriano
• Citrobacter de carbono y de • Sembrar con un asa
• Algunas especies de nitrógeno de siembra en la
Salmonella. respectivamente superficie inclinada del
• Excepto: Escherichia, • y azul de bromotimol, medio e incubar a 37
• Shigella, Salmonella como indicador de pH ºC
• durante 24-48 horas.
typhi y Salmonella
paratyphi son
incapaces de
• crecer con esos
nutrientes.

Las bacterias capaces de usar el citrato provocarán el cambio de color del medio de
verde a azul intenso, por viraje del indicador de pH, azul de bromotimol, a la vez que se
observa crecimiento en la superficie.
Prueba de la Fenilalanina
Desaminasa
 Determina la capacidad
de un organismo para
desaminar el aminoácido
fenilalanina en ácido
fenilpirúvico por la
actividad de la enzima
fenilalanina desaminasa,
con la consiguiente acidez
resultante.
 El ácido fenilpirúvico
puede detectarse por la
adición de un reactivo
(cloruro férrico al 10%)
 Microorganismos TÉCNICA INTERPRETACIÓN

• Proteus y • Se cultiva el
• del grupo Providencia microorganismo en
• agar • La presencia de
fenilalanina
• Se usa para separar sembrando la ácido fenilpirúvico
ambos géneros de superficie del slant con (prueba positiva)
otras enterobacterias. abundante inóculo e se manifiesta por
incubando durante 24 la aparición de un
horas
• a.37 ºC. Seguidamente color
se añade 4-5 gotas de característico
la solución de cloruro verde oscuro o
férrico al 10% de verde-azulado.
manera que inunde
todo el medio
inclinado.
Prueba del indol

 El indol es uno de los

productos de degradación
del aminoácido triptófano.
La presencia de la enzima
triptofanasa en la bacteria
provoca la hidrólisis del
aminoácido y su
desaminación, produciendo
indol, ácido pirúvico y
amoníaco.

Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y

reactivo de Kovacs.
 Microorganismos TÉCNICA INTERPRETACIÓN
• Aeromonas • Inocular el caldo con • Si la bacteria
• Bacillus alvei el microorganismo e
•
posee la enzima
Citrobacter incubar a 37 ºC
• Edwarsiella spp durante 24-48 horas. triptofanasa, al
• Escherichia coli • Transcurrido ese añadir al medio
• Flavobacterium spp tiempo añadir 4 o 5 las gotas del
• Haemophilus gotas de reactivo reactivo de
influenzae Kovacs, resbalando Kovacs, se
por la pared del tubo
• La mayoría de los
sin agitar.
producirá un anillo
proteus de color rojo
• Klebsiella oxytoca cereza en la
superficie del
caldo y la prueba
• será considerada
positiva.
Prueba de lactosa
Se trata por tanto de una
prueba de gran
 Se usa para diferenciar importancia debido a que
los coliformes se utilizan
entre las enterobacterias en como organismos
general y el grupo de los indicadores de
Coliformes. contaminación fecal en
análisis,
sobre todo, de aguas. En
bacteriología se define el
grupo de organismos
coliformes como los
"bacilos Gram negativos,
aerobios y anaerobios
facultativos, no
formadores de esporas y
que fermentan la lactosa
 Medio de cultivo TÉCNICA INTERPRETACIÓN
• Agar Mc Conkey •
• Selectivo frente a bacterias
Inocular en caja • Las colonias
Petri en agar Mc lactosa (+)
no entéricas, es diferencial Conkey de 24-48
ya que contiene lactosa y un horas. aparecerán de
indicador de pH (rojo neutro) color rojo o
• Las bacterias Gram violeta
positivas ven inhibido su • Coloración
crecimiento debido a la
presencia de sales biliares y amarillenta de
cristal violeta y sólo las colonias
crecerán las lactosa (-).
enterobacterias, pero entre
ellas las que fermenten la
lactosa (coliformes)
liberarán productos ácidos
que producirán un cambio
de pH que se detectará
gracias al rojo neutro.
Manitol-Movilidad-Nitratos

Sirve para detectar si los

gérmenes son capaces de
fermentar el manitol liberando
productos ácidos que serán
detectados gracias al
indicador rojo de fenol que
cambiará a color amarillo.

 Sirve para diferenciar

Staphylococcus aureus (+) de
Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad
Sirve para determinar si un
Las bacterias móviles producirán un
organismo es móvil o inmóvil.
enturbiamiento homogéneo del medio debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos. Por Las bacterias tienen movilidad
el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán por medio de sus flagelos que
en la misma línea de la picadura en que se se encuentran principalmente
sembraron. entre los bacilos aunque
existen algunas formas de
 Entre las enterobacterias, la movilidad cocos móviles.
nos permite diferenciar el género
Klebsiella (-) de las restantes que
suelen ser movilidad (+).
 Dentro del género Bacillus, nos
permite diferenciar B. anthracis (-) de
otras especies generalmente (+).
Prueba de la reducción de nitratos

 Sirve para determinar la

capacidad de un organismo
de reducir el nitrato en
nitritos.
 Las enterobacterias son
generalmente nitratos (+).
Esta prueba se utiliza
principalmente para
diferenciar entre sí
determinadas bacterias de los
géneros Haemophylus y
Neisseria
 Medio de cultivo TÉCNICA INTERPRETACIÓN

•Manitol movilidad •Un cambio de color

• Manitol-movilidad incorpora 1 g/l de nitrato (rojo) dentro de los 30
potásico y para revelar seg indica prueba
la presencia de nitritos completa con resultado
después de su positivo. Si no cambia de
incubación se añaden los color, se agrega
reactivos A y B de directamente al tubo
Griess-Ilosvay en una pizca (unos 20 mg)
cantidades iguales (1ml de polvo de cinc
aprox.). purísimo, totalmente
exento de nitratos o
nitritos, y se observa el
cambio de color durante
otros 30 seg, al cabo de
los cuales se realiza la
interpretación final.
MIO

 Medio MIO es un medio semisólido utilizado para la diferenciación

del grupo de Enterobacterias mediante motilidad, actividad de
ornitina descarboxilasa y producción de indol
 Las peptonas de gelatina y caseína proporcionan nitrógeno, vitaminas,
minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. También
proporcionan triptófano, necesario para la creación de indol. El extracto
de levadura es una fuente de vitaminas, particularmente del grupo B. La
dextrosa es el carbohidrato fermentable que proporciona carbono y
energía. L-ornitina se agrega para testar la presencia de la enzima
ornitina decarboxilasa. Si los organismos poseen tal enzima, se activará
en un ambiente ácido creado por la fermentación inicial de dextrosa.
Una vez que el aminoácido se descarboxila, se produce diamina
putescina. El resultado es una alcalinización del medio, que lo convierte
en azul oscuro. Los organismos sin la enzima, permanecerán ácidos
debido a la fermentación, dando como resultado un color amarillo en el
medio. El púrpura de bromocresol es un indicador de pH para indicar la
actividad descarboxilasa; la baja concentración de agar bacteriológico es
para motilidad.
 Medio de cultivo TÉCNICA INTERPRETACIÓN

•La movilidad está

• MIO • Inocular por punción indicada por la
el medio MIO e nubosidad en los medios
incubar en una o el crecimiento que se
extiende desde la línea
atmósfera aerobia
de inoculación.
durante 18 - 24 horas • La descarboxilación de
a 35 ± 2 ° C. Si la ornitina está indicada por
reacción del indol es un color púrpura en el
negativa, incubar medio.
• - Una reacción de ornitina
• durante 24 horas
negativa produce un color
adicionales. amarillo en el fondo del
• Para la prueba de tubo.
indol agregar el
Reactivo de Kovac 3- 4
gotas y agitar
suavemente el tubo.
Prueba del Rojo de Metilo/y
Voges-Proskauer
 Estas dos pruebas forman parte del IMViC de las colimetrías y
permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del
grupo coli y aerógenes.
 La prueba consiste en comprobar si el microorganismo en estudio
fermenta la glucosa con producción de ácidos o vía ácido mixta.
 Técnica Interpretación
Rojo de Metilo A uno de los tubos se le Se
añade unas gotas (4-5) considera positiva si
de solución indicadora vira al rojo y negativa si
de permanece amarillo
Rojo de Metilo. Se agita
ligeramente para
homogeneizar y se
observa la coloración.
Voges-Proskauer A la otra porción de Si la prueba es positiva,
cultivo se le añade: 0,6 transcurridos 10
ml del Reactivo A de minutos desde la
Voges-Proskauer (α- adición de los reactivos,
naftol al 5% en alcohol aparecerá un color
etílico absoluto). El rosado-violáceo, más o
medio adquiere un menos intenso, que se
aspecto lechoso. 0,2 ml inicia en la parte
del Reactivo B de superior del tubo. El
Voges-Proskauer (KOH cambio de color nos
40%). Desaparece el indica que la acetoína
aspecto lechoso y se se ha oxidado pasando
agita fuertemente. a diacetilo. Si la prueba
es negativa no aparece
coloración alguna.
 Medio de cultivo TÉCNICA INTERPRETACIÓN

• Si la prueba es positiva,
•Para la realización de transcurridos 10 minutos desde la
• Manitol-movilidad estas dos pruebas se adición de los reactivos,
aparecerá un color rosado-
cultiva el violáceo, más o menos intenso,
microorganismo en caldo que se inicia en la parte superior
RM-VP (medio de Clark y del tubo. El cambio de color nos
Lubs) y se incuba a 37 º indica que la acetoína se ha
oxidado pasando a diacetilo. Si la
C durante un periodo 24- prueba es negativa no aparece
48 horas. Pasado este coloración alguna.
tiempo, se separa el
cultivo en dos porciones
de unos 2 a 5 ml que
servirán para cada uno
de los dos ensayos:

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita
ligeramente para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece
amarillo.
Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:
0,6 ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (α-naftol al 5% en alcohol etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto