Trabajo publicado en www.ilustrados.

com

La mayor Comunidad de difusión del conocimiento

Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E.

Daleth Guedea Fernández
[email protected]
 Introduccion
• En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policíacas o de
médicos donde se hacen análisis a pequeñas muestras para
averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la “víctima” o
con el “malo”, o si cierta sustancia puede afectar a la salud,
etc.., entonces uno ve que los investigadores hacen una serie
de estudios con las muestras, que en ocasiones son muy
pequeñas, y dan resultados; en la vida real sucede algo
similar; cuando se tiene en el laboratorio, en una solución,
presencia de color, o cuando se sabe que hay ciertas
cantidades de algún elemento pero no se sabe cuanto, se
genera la inquietud de saber que elemento es, en que cantidad
está y es entonces que se producen una serie de preguntas,
tales como: ¿COMO LO MIDO? y otras más, entre ellas pueden
estar: ¿Qué es la luz?, ¿qué es longitud de onda, ¿cómo se
mide?, ¿que relación hay entre luz y color?; ¿para que sirve
esto?, ¿de qué manera se mide una solución coloreada?.
• En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla,
sobre este tema tratando de dar una idea fundamental de las
preguntas anteriores y otras más que se hacen en torno al tema
que se está presentando; espero este trabajo sea útil tanto a
profesores como alumnos para orientarse y poder entender más
acerca de la espectrofotometría a nivel laboratorio de ciencias
biológicas.
Espectroscopía
• Características de la Luz
• Colores
• ¡Qué es longitud de Onda?
• Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de
onda
• Absorción / Absorbitividad
• Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometría
 Colorimetría y Espectrofotometría como
procedimientos analíticos
Fotocolorímetro
ESPECROFOTÓMETRO
Curva Patrón

Referencias e Imágenes
La espectroscopia es el estudio del
espectro de la luz que emiten los cuerpos,
sustancias y elementos.

De este estudio se puede conocer la

composición, temperatura, densidad,
velocidad de desplazamiento y otros
factores que les son propios y componen a
estos cuerpos, sustancias o elementos
La luz tiene una naturaleza dual:
•Como onda
•Como una corriente de partículas o
paquetes de energía (fotones)
Albert Einstein desarrolló en 1905 la teoría
de que la luz estaba compuesta de unas
partículas denominadas fotones, cuya
energía era inversamente proporcional a la
longitud de
onda de la luz.
 3
1

Foton

2
La teoría electromagnética de la luz propuesta por
Maxwell: La perturbación que se propaga como ondas
de luz está formada por fuerzas eléctricas y
magnéticas, y la perturbación se produce en cargas
eléctricas en movimiento.
“Efecto de la emisión electromagnética”
El efecto fotoeléctrico demuestra el
comportamiento de la luz como partícula (gránulos
o corpúsculos)
La naturaleza corpuscular de la luz se
observa en fotos de objetos iluminados
muy débilmente.
La imagen se forma punto a punto, y
muestra que la luz llega a la película
fotográfica por unidades separadas que
los producen.
Estos descubrimientos dieron origen a toda la
tecnología moderna de telecomunicaciones
como la televisión
 En estas
imágenes se
puede apreciar,
debido a la toma
fotográfica los
elementos
“puntuales “ que
apoyan a esta
teoría
Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos
una amplia gama de colores que, por lo general, se
deben a la mezcla de luces de diferentes longitudes
de onda. Se conoce como color puro al color de la luz
con una única longitud de onda o una banda
estrecha de ellas.
Cuanto más larga la longitud de onda de la luz
visible
tanto más rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta están en la
zona violeta del espectro.
Así todos los elementos existentes poseen
un espectro ***
Hay varios tipos de espectros, los más comunes
son los espectros continuos,
continuos espectros de
emisión y los espectros de absorción.
absorción
Si es colocado frente al espectroscopio se podrá ver,
un elemento:
En situaciones en las que se le somete altas
temperaturas y presiones y no se presentan líneas
obscuras se trata de un espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas líneas
de colores frente a un fondo negro, se trata de un
espectro de emisión.
Y por último si sucede la primer situación y entre el
elemento afectado y el espectroscopio se coloca un
elemento a menor temperatura que el primero, se
obtiene el espectro de absorción
 La luz blanca produce al descomponerla
lo que se llama un espectro continuo, que
contiene el conjunto de colores que
corresponde a la gama de longitudes de
onda que la integran.
 Todos los elementos poseen un espectro
propio, que se puede medir al someterse a
temperaturas elevadas ya que producen
espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla periódica buscar en esta

página
http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **
La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda
se llama longitud de onda (λ = lambda).

λ
CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS

nodo
 La longitud y la frecuencia de onda
son inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente
ecuación
 U.V.
La luz visible es
X
L sólo una pequeña
GAMMA
u parte del espectro
350 nm electromagnético
z
con longitudes de
v onda que van
i aproximadamente
s de 350
i nanómetros hasta
b unos 750
l nanómetros
750 nm
e Infrarrojo
<nanómetro, nm =
milmillonésimas de metro>.
Microondas
Radio
La luz blanca está compuesta de ondas de diversas
frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un
prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda
 Así la luz blanca es una mezcla de todas las
longitudes de onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de
onda se manifiestan como diferencias de color.
 La distribución de los colores se determina
por la longitud de onda de cada uno de ellos.
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se
les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el
violeta, ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

 UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR

4000 A Espectro Visible 7500 A
 Relación entre frecuencia,
velocidad y longitud de onda*
Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene
una 'frecuencia natural',
(vibración en ausencia de
perturbación).
frecuencia es el Número de vibraciones por
segundo

Así Frecuencia, es número de veces

que la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

¿Quién es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemán

que construyó un dispositivo para generar y detectar
en un laboratorio ondas electromagnéticas,
demostrando su existencia así como, se reflejan
estas ondas, se refractan y se comportan como las
ondas de luz

Estimó que la frecuencia f de la onda era de

alrededor de 3 x 107 Hz. Y determinó que su
longitud l era de 10 m. Con estos valores estableció
que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

 1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u
oscilación por segundo. (1 Hertz =
1 ciclo/seg)

Un kilohercio (kHz) = mil de

ciclos por segundo

Un megahercio (MHz) = un millon

de ciclos por segundo

Un gigahercio (GHz) = mil

millones de ciclos por segundo
Un péndulo de 1 m de longitud
presenta una frecuencia de 0,5 Hz,
es decir que el péndulo va y vuelve
una vez cada 2 segundos.
Longitud de onda = velocidad de propagación /
frecuencia
 c 
= c / 
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c =  (m s ) -1 -1

=c/l
 Frec = Vel / 
Como la luz viaja a una
velocidad de
3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz
Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo
Relación entre Medidas en valores Hertz y
Metros
Las ondas electromagnéticas de
frecuencias extremadamente
elevadas, como la luz o los rayos X,
suelen describirse mediante sus
longitudes de onda, que
frecuentemente se expresan en
nanómetros.
Un ejemplo es: Una onda
electromagnética con una longitud de
onda de 1 nm tiene,
aproximadamente una frecuencia de
300 millones de GHz.
 vel / 
El sonido se propaga a una velocidad de 340 m
cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz

= 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m
• 4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)
• 7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)
 Algunas equivalencias

1 0.001 mm 10-6 m

nm = m 0.001
10-9 m

1Å 0.0001
nm 10-10 m
Comparación de las mediciones de las
longitudes de onda con la luz visible.
El color de un cuerpo depende de la luz
que recibe, refleja o transmite. Por
ejemplo, el color rojo se dá cuando
absorbe en casi su totalidad, todas las
radiaciones menos las rojas, las cuales
refleja o deja pasar dependiendo su
estructura (sólida o transparente).
La energía UV es mayor
que, cualquier color del
espectro visible. Sin
embargo los rayos X son
más energéticos que la
luz UV, como se puede
apreciar por su longitud
de onda.
Con base a lo anterior
se puede entender
que existe una
relación inversa entre
la longitud de onda y
la energía del fotón
correspondiente.
Entonces, las energías en el rango
ultravioleta-visible excitan los electrones a
niveles de energía superiores dentro de las
moléculas y las energías infrarrojas provocan
solo vibraciones moleculares
El color percibido de una solución depende
de la combinación de colores
complementarios que la atraviesan
 Proceso de Absorción

La energía de excitación a una molécula

proveniente de un fotón durante el proceso de
absorción se representa así:

A + hn  A*  A + calor
donde:
A es el absorbente en su estado de energía
bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de
excitación energética
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente
• La energía del fotón incidente posee
una longitud de onda ()

• A* es inestable y rápidamente revierte

a su estado energético más bajo,
perdiendo así la energía térmica
correspondiente.

• La absorción de determinadas
longitudes de onda depende de la
estructura de la molécula absorbente
(absortividad, “a”)
Cuando un rayo de luz monocromática con una
intensidad I0 pasa a través de una solución, parte de
la luz es absorbida resultando que la luz emergente I
es menor que I0
Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a=
absortividad
I0
I
c = concentración.
(número de partículas por

b cm3)

Longitud del medio

absorbente o ancho de la
celda
 Absortividad (a)

a es una constante de
proporcionalidad que comprende
las características químicas de cada
compuesto, o molécula y su
magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.
Cuando se expresa la concentración en
moles por litro y la trayectoria a través de
la celda en centímetros, la absortividad se
denomina absortividad molar y se
representa con el símbolo e .
En consecuencia cuando b se expresa en
centímetros y c en moles por litro.
A = e bc
Donde A representa la absorbancia del
compuesto
Las leyes de Lambert y Beer *

o
los fundam
entos de la
de la l u z q interrelació
ue se abso n
rbe y la qu
transmite e se
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ab

I0 I I0 I I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática
pasa a través de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que la
concentración del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la
Ley de Beer-Lambert donde la fracción de luz
incidente que es absorbida por una solución es
proporcional a la concentración de soluto y al espesor
de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre
la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la
cantidad de radiación que ha sido absorbida por la
muestra.
 Ley de lambert Beer:

I = I 0e
-abc

Si despejamos: I/I0 = e -abc

 Al cociente de las intensidades se denomina
Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relación
entre la intensidad de luz transmitida
por una muestra problema (I) con la
intensidad de luz incidente sobre la
muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente
proporcional a la longitud del recorrido
b a través de la solución y la
concentración c del color absorbente.
Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

• A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro,

entonces la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.
 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución
LUZ
A
B
S Luz transmitida
O

I0 R
B I
I
D T = I/I0
A
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
 Absorbancia

De loA anterior se desprende que la Absorbancia (A) o

luz que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo
en base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien
al -log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro
o (“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

mg
La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente
de concentraciones es la siguiente:

Concent
ración
Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores
de Absorbancia

Con base en la relación: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresión anterior
log10 %T = -abc log 10
10 + log10 100

Invirtiendo términos
log %T = log10 100 -abc log 10
10 = 2 – abc * 1

log10 %T = 2 – abc
Como abc = Absorbancia = A
 log10 %T = 2 – A.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en
% T?

Log10 % T = 2 – 0.6 = 1.4

Log10 % T = 1.4

%T = 1 / Log10101.4

Aplicando antilog. a

1.4 = 15 % de transmitancia
Obtención de absorbancia a partir de un valor de
% de transmitancia
RECORDANDO:
A = log10 1/T
Ejemplo de cálculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia
Se le llama espectrofotometría a la
medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un conjunto de
elementos o un elemento en su estado
puro, en función de la longitud de onda de
la radiación lumínica y a las mediciones a
una determinada longitud de onda.

* Arco iris en
Marte
¿Cómo se puede medir la radiación que
emiten o absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de
una radiación, es decir, de separar la
radiación en sus componentes, se llama un
espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se
llama un espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata
de un espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la
intensidad de la radiación, se llama
Espectroscopi 1817
o

Espectógrafo
 Espectómetro

De fluorescencia Imagen de Marte vista con

ayuda de espectómetro de
rayos Gamma

De Emisión
Óptica
Para metales
 Colorimetría y
Espectrofotometría
como
procedimientos
analíticos *
Las técnicas colorimétricas se
fundamentan con la medición de la
absorción de radiación visible por
sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a

determinar no posee coloración, es
necesario llevar a cabo un tratamiento
de color empleando substancias que
que reaccionen de forma proporcional
con el compuesto de interés
Las diferentes sustancias se analizan mediante
reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la
concentración de la sustancia a analizar mayor es
el color de la reacción.
También es posible que la muestra pueda
ser “leída” cuando su espectro de
absorción se encuentra en las regiones no
visibles del espectro, como las referentes
a las regiones de UV o infrarroja

Visón de las abejas

Orbitas de TITAN
Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo
La diferencia entre colorimetría y
espectrofotometría consiste en el tipo de
instrumental empleado:

El colorímetro es un aparato en los que la longitud

de onda se selecciona por medio de filtros ópticos
que son insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es

seleccionada mediante dispositivos
monocromadores los cuales están integrados a la
máquina.
Algunos de los procedimientos
colorimétricos o espectrofotométricos con
los que se cuenta para precisar la
concentración de una sustancia en solución
son los siguientes:

Referencia de color
Colorímetro Klett
Espectrofotómetro
 M.C.I/2005

FOTOCOLORÍMETRO KLETT / SUMMERSON

Fundamento de colorímetro Klett
Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y
el azul con la combinación de estos dará un color
verde.

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Rojo

}
Verde
Amarillo Amarillo
Azul Azul
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo
método para precisar con cual filtro podríamos
leer una solución dependiendo el color de esta

Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar

un filtro de color rojo porque justamente ese es el
color que no absorbe.

En relación a esto, en el manual del

fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que
se puede utilizar para determinar que filtro se debe
emplear de acuerdo al color de la solución a
estudiar:
Color del filtro Rango Soluciones
espectral coloreadas

Azul 400-465 Roja, Naranja,

Amarilla,
Verde, Turbias
Verde 500-570 Roja, Amarilla,
Violeta,
Naranja, Azul

Rojo 640-700 Azul, Verde,

Amarilla
colores” para facilitar el recordar la elección del
color de filtro para lectura colorimétrica. Para
soluciones de color azul verde y amarilla
correspondería un filtro rojo. Para soluciones de
color rojo, naranja o amarrillo seleccionaríamos un
filtro color azul. Finalmente para soluciones con
color verde, azul o amarilla elegiríamos un filtro
rojo.
 Manejo del
Fotocolorímetro
1. Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre
dentro del portafiltros (B) y este en su lugar (C)
2. Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el
centro, en cero; si no es así ajuste a cero con la perilla
(E) que se localiza en la parte superior; siempre y
cuando la lámpara se encuentre apagada

C
D E

M.C.I/2005
3. La lámpara (F) se enciende con el apagador (G), deje
calentar entre 5 y 10 minutos.
4. Ajuste la escala del potenciómetro (H) con la perilla
correspondiente (I) a cero
5. Coloque la cubeta (limpia) (J) con el “blanco”, en su
sitio (K) y encienda con el interruptor (L)

F G

H
K

I
L

J
M.C.I/2005
6. Mediante la perilla (M) del galvanómetro , se acopla la
lectura a cero , lo que implica que la aguja (D) y la escala
(H) deben estar en cero.
7. Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la
cubeta el “blanco” y colocar la solución problema, la aguja
(D) se desviará de su posición , es necesario nuevamente
ajustar (con I) a cero, la lectura que proporcione la escala
(H) es la correspondiente al “problema “

M
D

M.C.I/2005
• Las lecturas se
realizan en U.K. • U.K / 500 =
(unidades Klett)
Absorbancia
• Las lecturas que
se mayores a 500
U.K y las menores • U.K. X 500 =
a 25 U.K., no se
Transmitancia
usaran para
calcular
concentraciones
CUIDADO
S
• Las muestras no
deben tener burbujas, • No se deben derramar
encontrarse turbias o líquidos, sobre todo
con precipitados. solventes, ácidos o
• El volumen de la álcalis; dentro del
muestra no debe ser contenedor de la
excesivo para evitar cubeta, se puede
que se desborde, en dañar parte del
caso de que mecanismo
sucediera, se debe • El fotocolorímetro
limpiar con un paño nunca se debe
limpio o papel encender sin filtro.
absorbente suave, • No deje que se
para evitar rayarla. sobrecaliente,
• La cantidad a mantenga apagado si
adicionar es, máximo, no lo utiliza.
hasta ¾ partes de la
cubeta
Un espectrofotómetro es un
instrumento que descompone un
haz de luz (haz de radiación
electromagnético), separándolo en
bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro
atravesado por numerosas líneas
oscuras y claras, semejante a un
código de barras del objeto, con el
propósito de identificar, calificar y
cuantificar su energía
Distribución de la luz en el
espectrofotómetro
Espectrofotómetro Mecanismo Interno
 Met.Cient. I
COLOR LONGITUD DE ONDA ()
Rojo (R) 700 nm
Verde (G) 546.1 nm
435.8 nm
Azul (B)
Es usual que al seguir una “receta” para la
determinación de la concentración de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda
(específicaa la que hay que leer con el
colorímetro o espectrofotómetro.

¿Porque leer a diferentes  (longitudes de onda)

compuestos parecidos pero diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada

producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro
de absorción característico

Absorbancia


Las longitudes de onda con mayor absorción (picos)
corresponderán de forma general a aquellas con las que se
leerá la muestra para determinar su concentración
Absorbancia


La relación entre la absorbancia por una sustancia a una
determinada y su concentración es directamente
proporcional es decir: a mayor concentración mayor
proporción de luz absorbida.
Absorbanci
a Conc.
Así, el espectro de absorción de la clorofila es:
Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

Espectro de Absorción (línea contínua) y Espectro de

Transmisión (línea discontínua).
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismática
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual
se vierte la solución a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente
presenta un comportamiento constante ante la
variación de la longitud de onda es común que las
celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de
este material .
 Curva Patrón

El razonamiento para el proceso de

determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
 CURVA PATRÓN

0.6

0.5

A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3
B
A
0.2
N
C Interpolación
I
0.1
A

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación
lineal con la concentración, se comprende la existencia
de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia
y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración
conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar
Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Ejemplo de curva patrón para la determinación de
safranina; donde se solubiliza este colorante
únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el
tubo blanco o de referencia para la calibración del
equipo (colorímetro o espectrofotómetro)
Stock de Agua Destilada
TUBO Safranina ml
(3 x10 -4 g/ml) ml

1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
 En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la
preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se
incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0)
contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin
de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

1
Compuesto (blanc 2 3 4 5 6 7
o)

Glucosa 0,1
0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
mg/ml (mL)
Agua destilada
1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0
(mL)
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfúrico
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
(mL)
RESULTADO de la curva patrón anterior
Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

Tubo Absorbanci Curva de calibración de glucosa

s a
1
1 0 0.8
2 0.135 0.6

Absorbancia
3 0.253 0.4

0.2
4 0.417
0
5 0.658 1 2 3 4 5 6 7

6 0.574 Tubos

7 0.768
Un aspecto importante de la evaluación
espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los

espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos

(RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH),
l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a
absorciones intensas en la región del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.
 Absorciones máximas (picos de absorción) de
algunos compuestos que absorben en la región
ultravioleta:
Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región
del infrarojo
Tipos de Espectrofotómetro
Existen en la actualidad
diversos tipos de aparatos
con los mismos principios
los hay mecánicos y
digitales; unos miden solo
la luz visible, otros son más
precisos y miden también
luz U.V. , Infrarroja, de
absorción atómica (AA),
flurescencia de rayos-X de
emisión de plasma (ICP),,
multipropósitos (para medir
directamente la solución
con suspensión, muestras
sólidas y biológicas),
acoplado a masas,etc..
 MCI MCI
Para medir Luz Para medir Luz Visible y U.V.
Visible

MCI
Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotómetros

Spectronic 20 D Spectrónic 20
Partes del Spectronic 20 D
 Manejo de espectrofotómetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el

manejo el espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.
Manejo de espectrofotómetro
• Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse,
se activará la luz roja de encendido (b).
• Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).
• Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa
cerrada y sin muestra.
• Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).
b

d
c

a
• Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
• Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra
problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.
• La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se
lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia

e
CUIDADOS
• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse
turbias o con precipitados.
• El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de
que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o
papel absorbente suave, para evitar rayarla.
• La cubeta se sujeta por los lados opacos.
• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes
de la cubeta
• No se deben derramar líquidos, sobre todo
solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor
de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo
• Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y
libre de humedad
 Referencias e Imágenes de:
• ciencianet.com/ espectros.html
• http://es.wikipedia.org/wiki/Color
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iss010e18585.jpg
•Martín Dutra http://astroplaneta.metropoliglobal.com
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www.tayabeixo.org/ portadas/casiopea_a.htm
• * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F.
Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., “
Fundamentos de colorimetría y espectrometría”
Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología ,
FES Iztacala UNAM. Sin publicar
• ***Imagenes proporcionadas por Carlos S.
Chinea [email protected]

• Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas

en el 2005 de los aparatos que se encuentran en
el Laboratorio de Metodología Científica I de la
Carrera de Biología en la Facultad de Estudios
Superiores Iztacaca UNAM México.
AUTOR
• Maestra en Ciencias de la Educación
Guadalupe Eugenia Daleth Guedea
Fernández. México 2006

• Correo:
[email protected]
[email protected] y/o
[email protected]