Microbiología.
Práctica 1.
Microbiología.
Tipificación de bacterias.
Dra. Mary Ponce.
Equipo 6 (201-A).
Mónica Elizabeth Gaitán Santana.
Lizette Fernanda Lobato Guerra.
Paola Hernández González.
Airam Amacalli Venecia Martínez López.
15/04/2016
Introducción.
• La investigación microbiológica con fines epidemiológicos requiere de
métodos de tipificación de cepas. Estos métodos son capaces de discriminar
entre cepas pertenecientes a una misma especie bacteriana en diferentes
líneas clonales, es decir grupos de bacterias originados a partir de un mismo
clon inicial. Basándonos en esta definición de clon bacteriano, distintos
aislamientos bacterianos provenientes de diferentes momentos y
localizaciones que presentan resultados idénticos por un numero de métodos
diferentes de tipificación, muy probablemente pertenecen a una misma línea
clonal. La clonalidad según esta definición implica la alta probabilidad de que
dos aislamientos estén relacionados, siendo la confianza de esta
probabilidad cada vez mayor cuantos mas métodos de tipificación sean
utilizados. Es por esto deseable en investigación epidemiológica utilizar una
variedad de métodos de tipificación.
• Un método de tipificación es aquel que puede ser usado para diferenciar
cepas bacterianas pertenecientes a una misma especie. La esencia del uso
de estos métodos es la de ser capaz de comparar aislamientos y agrupar
cepas con idénticos resultados en un mismo grupo. Cuando dos aislamientos
estudiados rinden resultados diferentes según uno o mas métodos de
tipificación, en general puede concluirse que derivan de diferentes líneas
clonales. Sin embargo, para poder ubicar distintos aislamientos en una
misma línea clonal se requieren resultados coincidentes en más de un
método de tipificación. La obtención de conclusiones epidemiológicamente
válidas se facilita si existe un conocimiento de la distribución de tipos
relevantes en un área geográfica determinada, que permitan sentar las
bases para establecer cuáles resultados de tipificación pueden ser
comparados.
• Los métodos de tipificación deben cumplir tres requisitos esenciales: 1)
poder de tipificación (ser capaces de catalogar cualquier aislamiento en un
tipo determinado); 2) Poder discriminatorio (ser capaces de discriminar entre
aislamientos no relacionados); 3) reproducibilidad (ser capaces de brindar
resultados reproducibles entre diferentes ensayos y estables para una cepa
dada obtenida de diferentes orígenes).
• A la hora de evaluar un método de tipificación, además de considerar estos
requisitos, se considera también la sencillez de realización y de
interpretación de resultados.
• Los métodos de tipificación caen en dos amplias categorías: fenotípicos y
genotípicos. Los primeros son aquellos que caracterizan los productos de la
expresión génica para diferenciar cepas, estudiando propiedades bioquímicas,
191 antigénicas, sensibilidad a fagos, a antimicrobianos, etc. Estas
propiedades, tienen tendencia a variar con las condiciones de cultivo, fase de
crecimiento, ocurrencia de mutaciones espontáneas etc., debido a que son el
resultado de la expresión génica.
• Por otra parte, los métodos genotípicos son aquellos basados en el análisis de
la estructura genética de un organismo, e incluyen polimorfismos en los
patrones de restricción del DNA por endonucleasas, perfiles de amplificación
génica y perfiles plasmídicos. Estos métodos están menos sujetos a variación
natural, aunque pueden afectarse por inserciones o deleciones de DNA en el
cromosoma, ganancia o pérdida de DNA extracromosómico o mutaciones
aleatorias que puedan crear o eliminar por ejemplo sitios de restricción.
• En general, los métodos fenotípicos tienen un poder de tipificación limitado,
debido a que cada uno es aplicable a un número reducido de especies
bacterianas (ej. serotipificación, fagotipificación), mientras que los métodos
genotípicos son en general aplicables a cualquier taxón bacteriano.
• La reproducibilidad de una técnica, puede verse afectada tanto por
variaciones en el método como por variaciones biológicas, que son mas
fácilmente detectables en el caso de los métodos fenotípicos. Con el tiempo
(de semanas a años dependiendo de la cepa), los patrones de tipificación
producidos con métodos basados en DNA presentan en algunos casos
variaciones menores, por lo que a la hora de analizar los resultados es
importante considerar el tiempo transcurrido desde su aislamiento.
• La principal ventaja de los métodos genotípicos respecto a los tradicionales es su
capacidad discriminatoria, logrando en muchos casos diferenciar entre cepas
absolutamente idénticas en términos fenotípicos.
• La sencillez de realización, incluyendo costos, complejidad técnica del método,
dificultades de puesta a punto, entrenamiento de personal, etc., es en general
favorable a los métodos genotípicos, con la desventaja de que implican en general
un costo de inversión en equipamiento, pero éste es aplicable teóricamente a todos
los tipos bacterianos.
• La sencillez de interpretación se relaciona con las dificultades y experiencia
requerida para utilizar un método particular. Hasta el presente la interpretación de
los resultados de los métodos moleculares continúa siendo un área de activa
discusión, aunque varios métodos fenotípicos como la fagotipificación requieren
gran experiencia para realizar e interpretar los resultados y aun así muchas veces
solo permiten obtener resultados ambiguos.
Material y equipo.
• Papel estraza.
• Tijeras.
• Regla.
• Lápiz.
• Pluma.
• Etiquetas.
• Papel arroz.
• Cinta adherente.
• Parafilm.
• Asa bacteriológica.
• Cajas de Petri.
• Aluminio.
• Jeringas.
• Gazas.
• Encendedor
• Mechero de buncen.
• Pizeta.
• Matraz Erlenmeyer.
• Pipeta graduada.
• Base agar sangre.
• Cepillo para tubos de ensayo.
• Varilla.
• Soporte universal.
• Hisopos Estériles.
• Guantes de látex.
• Guantes de tela.
• Cubreboca.
• Porta objetos (laminillas).
• Base para tinciones.
• Autoclave.
• Incubadora.
• Microscópio.
• Lugol.
• Agua.
• Agua destilada.
• Alcohol-Cetona.
• Cristal violeta.
• Aceite de inmersión.
• Sangre bovina.
• Balanza normal.
• Safranina.
• Platito de aluminio.
Procedimientos.
• Día 1.
Durante el primer día realizamos protecciones envolventes de papel estraza
para así poder esterilizar el material que íbamos a ocupar en los días
posteriores.
• Día 2.
Realizamos nuestro agar sangre. Utilizamos en un matraz polvo de base agar
sangre anteriormente pesado y diluimos cierta cantidad en agua destilada para
posteriormente homogenizarla, calentarla y continuamos a introducirlo dentro
del autoclave hasta que llego a 1 atmósfera de presión. Después, procedimos
a sacar nuestro matraz para que se enfriara un poco y así poder agregar la
sangre bovina y mezclamos. Cuando estuvo todo integrado perfectamente
vaciamos el contenido dentro de las cajas de Petri.
• Día 3.
Ya teniendo nuestro agar sangre solidificado, hicimos el exudado faríngeo para
así poder crear nuestros cultivos bacteriológicos. Con un hisopo estéril se tomo la
muestra y se puso con cuidado en una esquina de los agares, después con un
asa bacteriológica esterilizada al fuego del mechero se esparció por todas las
cajas de Petri con mucho cuidado en forma de estrías, se taparon y se sellaron
con parafilm y fueron introducidas en la incubadora. Posteriormente realizamos
otro exudado para así poder contemplar el tipo de microorganismo que crecería
en nuestro cultivo, se volvió a tomar una muestra con otro hisopo y se colocó una
gotita de fijador en un porta objetos, pasamos el exudado delicadamente, se fijó
en el mechero y continuamos a hacer la tinción de Gram explicada al final del
reporte. Observamos con el microscopio y desde ese momento nos dimos cuenta
que en nuestro cultivo habría bacterias tipo Gram positivo.
• Día 4.
En este día vimos los cultivos de nuestras 3 cajas de Petri. Primero
observamos cuantos tipos de colonia había, posteriormente tomamos una
muestra de cada colonia y la colocamos en su respectivo porta objetos para así
poder hacer tinción de Gram y observar que tipo de bacteria creció en cada
una de ellas y así poder tipificar nuestros cultivos.
Resultados.
• Caja de Petri #1.
En este agar se localizaron 2 tipos de colonia. Una color ? y otra ?. Al hacer
tinción de Gram notamos que eran cocos, estafilococos y diplococos Gram
positivos.
• Caja de Petri #2.
En este agar se localizaron otros 2 tipos de colonia. Una color ? y otra ?. Al
hacer tinción de Gram notamos que también eran cocos, estafilococos y
diplococos Gram positivos.
• Caja de Petri #3.
• En este agar se localizaron 3 tipos de colonia. Una color ?, otra ? y una
más ? . Al hacer tinción de Gram notamos que eran cocos, estafilococos y
diplococos Gram positivos.
Conclusión.
Debido a que en la tinción de Gram nuestras bacteria se tornaron de color
morado deducimos que se trataban de Gram positivo, posteriormente por la
forma esférica que tenían supimos que eran cocos. Por su distribución
individual, en pares y en cadenas notamos que eran cocos, diplococos y
estreptococos.
Nuestra conclusión es que el tipo de bacterias que encontramos pueden o no
ser normal encontrarlas en faringe ya que algunos son patógenos estrictos de
origen ambiental y otros forman parte de la microbiota intestinal y del tracto
respiratorio superior.
Tinción de Gram.
• Recoger muestras.
• Hacer el extendido con un palillo de madera.
• Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces aproximadamente).
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
• Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
• Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
• Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte
crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este tinte dejará de
color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
• luego lavar levemente con agua
• Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
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